Projet ANR-11-BSV8-0019 – ArenaBunya-L : Structures, mecanismes, et conception d’inhibiteurs des protéines L des Bunyavirus et Arenavirus
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur François FERRON (UNIVERSITE AIX-MARSEILLE II  [DE LA MEDITERRANEE])
Partenaires : Laboratoire public; Laboratoire public
Montant : 350000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Structure et mécanism des polymérases des Arenaviridae et BunyaviridaeLes Arenaviridae, Bunyaviridae et Orthomyxoviridae sont les principales familles de virus à génome ARN simple brin segmenté. Elles comptent un grand nombre de virus pathogènes pour l’homme tels que le virus Lassa, le virus responsable de la fièvre hémorragique Crimée Congo ou le virus de la grippe. Chez les aréna- et bunyavirus, la transcription et la réplication sont prises en charge par la protéine L, qui porte notamment l’activité ARN polymérase ARN dépendante (RdRP).
Objectif du projétNotre but est la détermination de la structure atomique de la polymérases pour comprendre les mécanismes de transcription et réplication de l'ARN virale.
MéthodesNous proposent de mettre en œuvre les techniques de pointe de biologie structurale (production de protéines et domaines recombinants, cristallographie aux rayons X, micorscopie électronique)  pour résoudre la structure des domaines fonctionnels de la protéine L d’aréna et bunyavirus en complexe avec l’ARN viral. Les données structurales permettront d’initier une étude fonctionnelle de ces domaines in vitro sur test enzymatique, ou in vivo en système réplicatif ou infectieux.
Résumé de la soumission : Les Arenaviridae, Bunyaviridae et Orthomyxoviridae sont les principales familles de virus à génome ARN simple brin segmenté. Elles comptent un grand nombre de virus pathogènes pour l’homme tels que le virus Lassa, le virus responsable de la fièvre hémorragique Crimée Congo ou le virus de la grippe. Chez les aréna- et bunyavirus, la transcription et la réplication sont prises en charge par la protéine L, qui porte notamment l’activité ARN polymérase ARN dépendante (RdRP). Cette protéine possède, à elle seule, de grandes similarités avec le complexe hétérotrimérique de réplication du virus de la grippe. On retrouve chez ces virus deux caractéristiques communes : i) leurs RdRPs interagissent avec les régions 3’ et 5’ complémentaires  non traduites des ARN viraux ii) les ARNm viraux sont modifiés à leur extrémité 5’ par ajout de coiffes « volées » aux ARNm cellulaires (mécanisme appelé « cap snatching »). Durant des années, le mécanisme de ces évènements est resté inconnu malgré de gros efforts notamment sur le virus la grippe. Récemment, la détermination de structures à haute résolution de domaines du virus de la grippe, puis d’aréna- et bunyavirus a été réalisée par les deux partenaires de ce projet. L’analyse de ses données a permis de renforcer l’hypothèse qu’il existe un système réplicatif similaire chez les virus à génome ARN segmenté. Afin de conforter cette hypothèse, les deux partenaires se proposent de mettre en œuvre les techniques de pointe de biologie structurale (production de protéines et domaines recombinants, cristallographie aux rayons X, micorscopie électronique)  pour résoudre la structure des domaines fonctionnels de la protéine L d’aréna et bunyavirus en complexe avec l’ARN viral. Les données structurales permettront d’initier une étude fonctionnelle de ces domaines in vitro sur test enzymatique, ou in vivo en système réplicatif ou infectieux. A plus long terme, l’objectif serait de proposer un modèle moléculaire impliquant la protéine L avec la protéine N et l’ARN viral et qui décrirait les mécanismes de transcription impliquant le « cap snatching » (production d’ARNm viraux) et de réplication (copies du génome viral). Ce modèle permettrait de présenter le mode de régulation entre transcription et réplication. Les résultats préliminaires sur l’identification des domaines à exprimer, ou la production de protéine L complète de bunyavirus pour de la microscopie électronique suggèrent que les modèles aréna- et bunyavirus peuvent être plus facile à étudier que le virus de la grippe. Par ailleurs, la stratégie consistant à travailler sur deux familles de virus à la fois divergentes mais probablement  reliées mécanistiquement permettra d’augmenter les chances de succès et l’échange de données d’un modèle à l’autre. Enfin, les données existantes des domaines endonucléase impliqués dans le « cap snatching » - ou d’autres domaines fonctionnels caractérisés lors du projet - seront exploitées pour initier une approche antivirale à partir de familles d’inhibiteurs connues pour être actives notamment contre l’endonucléase du virus de la grippe. Cette dernière activité prend notamment son sens dans un contexte mondial actuel ou les aréna- et bunyavirus, largement transmis par les rongeurs, chauves souris ou les insectes, ont un grand potentiel d’émergence.
Résultats : Les résultats préliminaires sur l’identification des domaines à exprimer, ou la production de protéine L complète de bunyavirus pour de la microscopie électronique suggèrent que les modèles aréna- et bunyavirus peuvent être plus facile à étudier que le virus de la grippe.
Perspectives : A plus long terme, l’objectif serait de proposer un modèle moléculaire impliquant la protéine L avec la protéine N et l’ARN viral et qui décrirait les mécanismes de transcription impliquant le « cap snatching » (production d’ARNm viraux) et de réplication (copies du génome viral). Ce modèle permettrait de présenter le mode de régulation entre transcription et réplication. Enfin, les données sur des domaines endonucléase impliqués dans le « cap snatching » - ou d’autres domaines fonctionnels caractérisés lors du projet - seront exploitées pour initier une approche antivirale à partir de familles d’inhibiteurs connues pour être actives notamment contre l’endonucléase du virus de la grippe.
Publications et brevets : Des résultats préliminaires sur l'endonucléase de Lassa et le nucleoprotéine de LACV sont tres prometteurs. Nous avons reussi a resoudre las structure de la nucleoprotéine de LACV en complexe avec ssRNA qui permit de proposer un modele de la ribonucleoprotéine virale qui corespond a des images de microscopie electronique.. Publication: 
Structural basis for encapsidation of genomic RNA by La Crosse Orthobunyavirus nucleoprotein. Reguera J, Malet H, Weber F, Cusack S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013.