Projet ANR-13-IS07-0003 – thermoTK : Ingénierie d’une transcétolase thermostable par évolution dirigée : nouvelle stréosélectivité, nouvelle spécificité de substrat, nouveau champ d’application
Programme : Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SIMI 7) 2013
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Madame Laurence HECQUET (Institut de Chmie de Clermont Ferrand)
Partenaires : Institut de Chimie de Clermont-Ferrand; TU Darmstadt
Montant : 269360.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 42 mois
Résumé : Dans le domaine des polyols chiraux et de la chimie des glucides, les problèmes inhérents à la régiosélectivité, stéréosélectivité chimiosélectivité sont un défi pour les chimistes, obligeant à appliquer des stratégies sophistiquées de protection alors qu'à l'inverse, la biocatalyse rend les groupes protecteurs inutiles. Ainsi  dans de nombreux cas, l’utilisation d’enzymes permet de réduire le nombre d'étapes et de réaliser les réactions dans des conditions douces.
Ce projet concerne, la transcétolase (TK), appartenant à la famille des enzymes à thiamine pyrophosphate. La TK catalyse la formation d’une liaison C-C conduisant en une seule étape à des polyols chiraux, D-thréo cétoses (3S, 4R). La TK est hautement spécifique du substrat donneur de type cétol, stéréospécifique et énantiosélective.
L'objectif de ce projet est de développer de nouvelles TK optimisées pour de nouvelles applications synthétiques dans quatre directions :
(i) modification de la stéréosélectivité 
(Ii) modification de la spécificité vis-à-vis du donneur 
(Iii) modification de la spécificité vis-à-vis de l’accepteur 
(Iv) développement de nouvelles réactions enzymatiques en cascade pour la synthèse de nouveaux produits chiraux.
Tout le projet sera axé sur une nouvelle TK thermostable de G.sterathermophilus (TKgst), découverte récemment par les partenaires. Les propriétés de cette nouvelle TK promettent d'offrir des avantages importants pour des applications en biocatalyse par rapport aux sources actuelles (plus grande tolérance aux milieux non conventionnels et aux facteurs déstabilisants utilisés en mutagénèse).
Les TKgst mutées adaptées à nos objectifs seront obtenues par différentes techniques de mutagenèse au niveau du site actif. Nos résultats contribueront à enrichir la base des connaissances dans le choix des méthodes appropriées à l'ingénierie des protéines, en particulier dans le domaine encore peu exploré de la carboligation enzymatique.
Le screening des banques de TK mutées sera mené en trois étapes. Premièrement, les nouvelles activités catalytiques seront détectées selon un test colorimétrique pH-dépendent à haut débit conjointement élaboré et validé par les deux partenaires. Deuxièmement, l'activité des TK mutées sera évaluée à plus faible débit  par CCM/ HPLC / GC. À un troisième niveau, les TK identifiées comme les plus actives seront étudiées pour leur stéréosélectivité par des méthodes appropriées (RMN, HPLC ou GC chirales).
Les objectifs finaux de ce projet visent à développer de stratégies innovantes basées sur des réactions enzymatiques en cascade. Le couplage in situ de la réaction catalysée par la TKgst avec la synthèse du substrat donneur et la modification du produit sera envisagée. Notamment, le cétose sera isomérisé en aldose par la glucose isomérase, stratégie particulièrement prometteuse car les isomérases  sont généralement des enzymes qui ont une plus forte activité à température élevée, propriété compatible avec la thermostabilité de la TKgst. 
Ce projet est multidisciplinaire et comprend différents aspects allant de la synthèse asymétrique à l'analyse chirale, la biologie moléculaire, la microbiologie. La coordination des tâches est basée sur l'expertise complémentaire du partenaire français en enzymologie / chimie analytique/ mutagenèse et du partenaire allemand dans la caractérisation des enzymes en fonction de leur stéréosélectivité et le développement d'applications en synthèse pour les molécules sélectionnées. L'efficacité de ce consortium a déjà été démontrée dans un projet antérieur ANR / DFG (deo TK).
Au-delà de l'expertise des partenaires, les réactions catalysées par les TKgst mutées les plus performantes seront optimisées en collaboration avec des experts européens (immobilisation des enzymes, développement de procédés avec des cellules entières, mise en oeuvre des réactions en bioréacteur).