Projet ANR-15-CE11-0006 – PICO2 : Les interactions biomoleculaires révélées par la fluorescence PICOseconde dans des PICOlitres
Programme : Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire (DS0401) 2015
Année de financement : 2015
Coordinateur du projet : Monsieur Jérémie Léonard (Institut de Physique et Chimie des Matériaux de Strasbourg)
Partenaires : Laboratoire public; Laboratoire public; Laboratoire public
Montant : 491700.0 euros
Date de début : 2015
Durée : 48 mois
Résumé : Les interactions biomoléculaires se caractérisent par une grande hétérogénéité structurale (coexistence de plusieurs conformères) et dynamique structurale (de la picoseconde à plusieurs minutes). La compréhension détaillée des mécanismes moléculaires sous-jacents est d’un intérêt essentiel pour la conception de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement ces interactions. Dans ce projet, nous combinons l’expertise de 3 partenaires dans une approche pluridisciplinaire pour développer l’utilisation de la fluorescence résolue en temps (FRT) de biomolécules marquées par des sondes fluorescentes sensibles à leur environnement local, pour étudier/détecter les interactions biomoléculaires. 
Un premier volet fondamental (tâche 2) consiste à appliquer un nouveau concept expérimental combinant FRT et microfluidique de gouttes (DmF) pour l’étude d’interactions au sein de systèmes biomoléculaires hors-équilibre. La FRT, dans des mesures d’ensemble, révèle des distributions de durées de vie de fluorescence représentatives de l’hétérogénéité structurale des biomolécules. Simultanément, la DmF sert à produire des complexes biomoléculaires hors-équilibre (mélange rapide). Dans un travail préliminaire, le Partenaire 1 (IPCMS, Strasbourg) a suivi la cinétique de relaxation conformationelle de systèmes moléculaires structurellement hétérogènes sur des centaines de ms, le long du parcours de gouttes dans un canal microfluidique, à l’aide d’une caméra à balayage de fente (CBF) conventionnelle. L’objectif est d’appliquer cette approche expérimentale innovante pour étudier le mécanisme de l’activité chaperonne (i.e. promotion de changements structuraux fonctionnels d’ADN) de la protéine NCp7 du VIH (expertise du Partenaire 3, LBP, Illkirch), étudiée ici comme système modèle pour les interactions dynamiques entre acides nucléiques et protéines. L’étude portera en particulier sur l’activation par NCp7 de 2 réactions d’hybridation de brins complémentaires d’ADN et/ou ARN, essentielles au cycle de réplication du virus.
Un second volet, technologique (Tâche 3), consiste à développer la mesure de FRT par comptage de photons uniques corrélés en temps (TCSPC) pour le criblage à haut débit (HD) d’interactions biomoléculaires. A la différence de la mesure de fluorescence en intensité, abondamment utilisée dans les biotechnologies HD, la FRT est une mesure intrinsèque, donc plus fiable, de l’interaction de biomolécules fluorescentes. Les Partenaires 1 et 2 (ICube, Strasbourg) ont fait la démonstration de principe que le comptage de photons uniques peut être implémenté afin de mesurer la durée de vie de fluorescence de microgouttelettes dans des conditions HD avec une précision suffisante pour une détection binaire (« positif » vs « négatif ») fiable d’interactions biomoléculaires. L’objectif est donc de développer la technologie (microélectronique CMOS) pour la détection et l’analyse en temps réel des signaux de TCSPC, permettant la mise en œuvre effective de  cytométrie en flux et criblage à HD, selon un brevet déjà déposé par les Partenaires 1 et 2. Un prototype sera produit et validé par une démonstration de criblage de quelques inhibiteurs connus de la protéine NCp7. 
Un dernier volet (Tâche 4) purement technologique permettra de décupler la cadence d’acquisition et de traitement des signaux de TCSPC. Cela permettra d’augmenter d’autant la cadence de mesure de FRT par TCSPC, ou de concevoir un détecteur linéaire multicanal, constitué d’une ligne de pixels, c’est-à-dire une caméra à balayage de fente intégrée en technologie CMOS.
Au cours de ce projet, des applications innovantes de la FRT pour l’étude des interactions biomoléculaires vont améliorer 1) la connaissance fondamentale des mécanismes moléculaires sous-jacents et 2) la technologie disponible pour l’application de la FRT aux biotechnologies. L’émergence de nouvelles directions de recherche et la valorisation des technologies sont parmi les objectifs du projet.