Projet ANR-10-BLAN-1225 – NucExp : Etudes structurales et fonctionnelles du facteur d’export nucléaire CRM1: coopérativité, régulation et inhibition
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Carlo Petosa (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES)
Partenaires : Institut de Biologie Structurale; Institut des Sciences Moléculaires de Marseille
Montant : 429764.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Comment sortir du noyau?Ce projet étudie la structure et la fonction d'une protéine humaine qui permet à des protéines cellulaires et virales de sortir du noyau de la cellule.  Il étudie également une classe de molécules qui inhibent l'activité de cette protéine.
Objectifs du projetLa protéine CRM1 joue un rôle clé dans la cellule car elle est responsable du transport de centaines de protéines du noyau vers le cytoplasme. Cette activité, appelée «export nucléaire», est fondamentale pour toute cellule eucaryote, y compris les cellules humaines.  Cependant, la manière précise dont CRM1 exporte des protéines (nommées «cargaison») du noyau est mal connue.  Par exemple, CRM1 a besoin de s'associer avec une protéine partenaire appelée Ran afin de pouvoir lier et exporter sa cargaison, mais la façon dont Ran permet à CRM1 de reconnaître la cargaison n'est pas claire.  L'activité de CRM1 est également modifiée par un deuxième partenaire, RanBP3, qui change la sélectivité de CRM1 pour ses cargaisons, mais la base moléculaire de cet effet n'est pas connue. De plus, certains composés naturels, appelés «leptomycines», interagissent avec CRM1 et inhibent son activité d'export.  Ces composés sont d'intérêt biomédical puisqu'ils pourraient permettre le développement de nouveaux médicaments contre certains cancers et d'autres pathologies.  Cependant, la manière précise dont les leptomycines interagissent avec CRM1 n'est pas encore connue.  Les objectifs du projet NucExp sont de mieux comprendre la structure et la fonction de CRM1, de caractériser ses interactions avec Ran et RanBP3, et  d'élucider en détail la capacité des leptomycines à se lier à CRM1 et à inhiber son activité.
Approches utiliséesLa stratégie utilisée pour étudier CRM1 et ses partenaires implique une combinaison de biochimie, de biologie structurale, de biologie moléculaire et de chimie organique de synthèse. D'abord nous utilisons des méthodes biochimiques afin d'isoler et de purifier les trois protéines d'intérêt, CRM1, Ran et RanBP3.  Ensuite nous utilisons la cristallographie à rayons X pour étudier la structure tridimensionnelle de CRM1 isolée et en complexe avec ses deux partenaires Ran et RanBP3.  Ces études structurales nous permettent de formuler des hypothèses spécifiques concernant le mécanisme moléculaire par lequel ces protéines agissent.  Nous pouvons vérifier ces hypothèses en introduisant des mutations dans les protéines et en comparant l'activité de la protéine originale à celle mutée dans des essais biochimiques et biophysiques. Par des méthodes de chimie organique nous synthétisons différentes leptomycines et des analogues de ces composés afin d'étudier la manière dont ces molécules interagissent avec CRM1 et inhibent son activité d'export.
Résumé de la soumission : La protéine CRM1/Exportine1 joue le rôle de transporteur dans l’export nucléaire de protéines contenant un signal d’export nucléaire (NES), une séquence spécifique riche en leucines. Dans le noyau CRM1 s’associe de manière coopérative avec son substrat contenant le NES et la GTPase Ran, formant ainsi un complexe ternaire qui est dirigé vers le cytosol et qui ensuite se dissocie lors de l’hydrolyse du GTP. Trois des aspects principaux de l’export nucléaire réalisé par CRM1 suscitent l’intérêt :1. La nature coopérative de la formation du complexe d’export. La présence soit de Ran, soit du cargo augmente l’affinité de CRM1 pour ses autres partenaires. La publication récente de deux structures cristallines de CRM1 associée à un substrat, en présence et en absence de Ran, a permis d’observer la façon dont CRM1 reconnaît la séquence NES et interagit avec Ran. Cependant le mécanisme sous-jacent de cette association coopérative n’est toujours pas clair.2. La régulation de CRM1 par RanBP3.RanBP3 est un co-facteur de CRM1 qui peut fortement augmenter l’export de certains substrats contenant une séquence NES, ou bien au contraire diminuer l’export d’autres substrats. La manière dont RanBP3 régule la sélectivité de CRM1 envers ses différents substrats est encore inconnue.3. L’inhibition de CRM1 par la leptomycine B (LMB).La LMB et ses analogues sont des antibiotiques actifs fortement spécifiques de CRM1. Ces composés forment un adduit spécifique avec une cystéine présente dans le site de fixation du NES dans CRM1, inhibant de façon stérique la fixation du substrat. Ces composés sont donc d’un intérêt biomédical important du fait de leur utilisation potentielle dans le traitement de divers cancers et maladies inflammatoires. Cependant, le mécanisme exact d’interaction de ces composés est actuellement inconnu, entravant ainsi la conception de nouveaux composés ayant des propriétés thérapeutiques accrues.Nous présentons ici une nouvelle collaboration internationale impliquant trois groupes de recherche basés à Grenoble, Marseille et Amsterdam, ayant pour vocation d’étudier :1.	De quelle manière la coopérativité est obtenue lors de la formation du complexe ternaire CRM1/Ran/NES.2.	Comment RanBP3 régule l’activité de CRM1.3.	Le mécanisme d’interaction de la leptomycine B et de ses analogues avec CRM1.Ce travail prévoit une étude complète et détaillée grâce à la conjugaison d’expertises en biologie structurale, biochimie, biologie cellulaire et en synthèse de chimie organique. Ce projet va nous permettre d’accroître considérablement notre compréhension de l’export nucléaire opéré par CRM1, ainsi que d’accélérer le développement de nouveaux agents thérapeutiques dérivés de la leptomycine B.
Résultats : A ce jour nous avons réussi à déterminer la structure cristallographique d'un domaine de RanBP3 qui nous a permis de mieux comprendre comment cette protéine régule l'activité de CRM1 en modulant sa sélectivité pour ses différents cargaisons.  Ce travail a donné lieu à une publication dans une revue à comité de lecture.  Nous avons également déterminé la structure d'un important fragment de CRM1 qui a suggéré le mécanisme moléculaire par lequel Ran augmente l'affinité de CRM1 pour ses substrats.  Nous avons pu confirmer ce mécanisme en construisant plusieurs mutants de CRM1 et en vérifiant leur capacité à s'associer avec différents substrats et à les exporter du noyau. Nous avons également mis à point une nouvelle méthodologie pour synthétiser des fragments d'un des membres des leptomycines appelé Callystatine A.  Nous avons réussi à produire ces fragments à une échelle suffisante pour tester leur capacité à fixer CRM1 et à inhiber son activité d'export.
Perspectives : Ce projet de recherche fondamentale nous permettra de mieux comprendre une activité primordiale de toute cellule humaine: le transport des protéines du noyau au cytoplasme. 
CRM1 est responsable de l'export nucléaire de centaines de protéines cellulaires et virales, y compris des protéines impliquées dans des cancers et des maladies infectieuses. Comprendre  précisément les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'export nucléaire est essentiel pour mieux comprendre les pathologies associées aux protéines exportées par CRM1. De plus, ce projet vise à déterminer, à l'échelle atomique, comment les leptomycines interagissent avec CRM1 et bloquent son activité d'export nucléaire.  Ces études devraient faciliter le développement d'une nouvelle classe de médicaments utiles à combattre différentes pathologies.
Publications et brevets : 1. Langer K, Dian C, Rybin V, Müller CW, Petosa C.  (2011) Insights into the function of the CRM1 co-factor RanBP3 from the structure of its Ran-binding domain. PLoS ONE 6(2):e17011.
Les résultats décrits dans cet article ont clarifié comment une protéine partenaire de CRM1 appelée RanBP3 facilite l'export nucléaire de certains protéines.
2. Petosa C. Ran. In Encyclopedia of Signaling Molecules. Choi S. ed. Springer. New York. Sous presse.  
Cet article résume les différents rôles que joue la protéine Ran dans la cellule, y compris son rôle dans l'export nucléaire et ses interactions avec CRM1.