Projet ANR-10-BLAN-1612 – kB-Regs : Identification de Nouveaux Régulateurs de la Voie NF-kB par Crible Génétique à l’Echelle Génomique
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Gilles COURTOIS (INSERM )
Partenaires : Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 664560.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : Identification de Nouveaux Régulateurs de la Voie NF- ?B par Crible Génétique à l’Echelle GénomiqueDissection moléculaire des voies de signalisation activant NF-?B, un facteur de transcription inductible qui joue un rôle-clé dans l'inflammation, l'immunité et le développement tumoral.
Identification de cibles potentielles pour combattre les infections et le cancerIl est proposé ici d'identifier de nouveaux régulateurs (positifs ou négatifs) de la voie NF-?B. Plus particulièrement nous rechercherons ceux qui sont impliqués dans la réponse immunitaire innée qui combat l'infection, ceux qui participent à la réponse aux agents chimiothérapeutique, atténuée par l'activation de NF-?B, et ceux qui sont nécessaires aux processus de transformation induits par les oncogènes. Dans tous les cas la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques est attendu.
Crible génétique avec banques d'ARN interferants et d'ADN complémentairesUtilisation d'une lignée cellulaire qui meurt quand NF-?B est activé. Cette cellule sera transduite par des banques d'ARN interferants ou d'ADN complémentaire qui inhibent ou activent un large nombre de protéines. Les cellules survivantes après stimulation seront récupérés et la protéine ayant permis la survie identifiée.
Résumé de la soumission : Les facteurs de transcription de la famille NF-kB jouent un rôle crucial dans la régulation de nombreux processus physiologiques tels que l’inflammation, la réponse immunitaire, la carcinogenèse ou l’apoptose. Cette famille inclus les protéines RelA, RelB, c-Rel, p50 et p52, qui toutes contiennent un domaine conservé, dénommé le domaine Rel, qui est requis pour leur localisation nucléaire, leur fixation à l’ADN et leur homo- ou hétéro-dimérisation. Une caractéristique unique des protéines p50 et p52 est leur synthèse sous forme des précurseurs p105 et p100, respectivement.Dans la cellule au repos, les dimères NF-kB sont localisés dans le cytoplasme, associés à des protéines inhibitrices de la famille IkB. En réponse à une large variété de stimuli, parmi lesquels des cytokines, des facteurs de croissance ou des pathogènes microbiens, des signaux émis à partir de la surface cellulaire ou de senseurs intracellulaires convergent vers un complexe multi-protéique à activité kinase dénommé IKK, qui est composé de deux sous-unités similaires à activité catalytique, IKK1/IKKa et IKK2/IKKb, d’une sous-unité régulatrice NEMO/IKK et d’autres sous-unités moins bien caractérisées. L’activation de IKK, dépendante de NEMO, se traduit par la phosphorylation des IkBs, conduisant à leur polyubiquitination et à leur dégradation par le protéasome (Voie canonique). Les molécules NF-kB ainsi libérées rejoignent le noyau où elles régulent la transcription d’une grande variété de gènes-cibles. Une autre voie de signalisation conduisant à l’activation de NF-kB (Voie non-canonique) existe également. Dans ce cas, p100 est phosphorylé et génère des complexes NF-kB actifs contenant p52. Ce processus requiert la kinase NIK qui phosphoryle IKK1, alors que NEMO et IKK2 ne sont pas impliquées.Comme indiqué ci-dessus, IKK/NF-kB peuvent être activés par une large collection de stimuli. Bien que dans quelques cas les composants impliqués soient assez bien définis, tels que dans les voies de signalisation répondant au TNF-a ou à l’IL-1b et au récepteur TLR4, de nombreuses voies de stimulation restent mal caractérisées. De plus, la régulation fine des voies de signalisation conduisant à l’activation de NF-kB nécessite des mécanismes de contrôle négatif et comprendre ces mécanismes va nécessiter la caractérisation des composants impliqués. Dans ce projet, nous proposons d’utiliser une stratégie génétique non biaisée pour identifier de nouveaux participants au processus d’activation de NF-kB. La première étape de cette stratégie va consister en la préparation de clones cellulaires, dérivés de HEK293T et de THP-1, exprimant une protéine léthale (RevC3, qui est une forme modifiée de Caspase 3) sous contrôle de NF-kB. Dans un second temps, ces cellules seront transduites par des banques d’ARNsh ou d’ADNc insérées dans des vecteurs lentiviraux ou retroviraux, produisant des banques cellulaires qui seront congelées. Durant l’étape suivante, ces banques cellulaires seront stimulées et les clones survivants récupérés. Leur contenu en ARNsh/ADNc sera déterminé par séquençage ou hybridation pour identifier des régulateurs positifs ou négatifs du processus d’activation de NF-kB. Finalement, les régulateurs potentiels seront étudiés individuellement avec les techniques standards d’analyse de transduction du signal.Nous concentrerons notre recherche sur 1) des composants jouant un rôle dans la réponse immunitaire innée, 2) des régulateurs de l’activation de NF-B par des oncogènes et 3) des éléments de la réponse aux agents endommageant l’ADN qui, en induisant NF-kB, atténuent les effets pro-apoptotiques des agents chimiothérapeutiques. Ce travail devrait permettre de mieux caractériser des voies de signalisation activant NF-kB et d’identifier de nouvelles cibles potentielles pour traiter des pathologies causées par un dysfonctionnement de la voie NF-kB telles que des maladies inflammatoires, des immunodéficiences, des syndromes auto-immunitaires ou des cancers.
Résultats : La mise en place du système cellulaire pour le criblage est en voie d'achèvement. Nous améliorons sa sensibilité. Nous allons maintenant réaliser l'étape de transduction par des banques d'ARN interférants et d'ADN complémentaire.
Perspectives : Progresser dans la compréhension moléculaire des voies de signalisation induisant NF-?B et utilisation cette compréhension à des fins thérapeutiques
Publications et brevets : Publication du système cellulaire dans un futur proche