Projet ANR-10-BLAN-1221 – INSULa : Rôles des Insulateurs et co-facteurs associés dans le Positionement des Nuclésomes et les Foyers Nucléaires
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Olivier CUVIER (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE MIDI-PYRENEES)
Partenaires : Centre de Biochimie Structurale; Centre de Biochimie Structurale; Laboratoire de Biologie Moléculaire des Eucaryotes
Montant : 600045.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 48 mois
Résumé : Aux Frontières des ChromosomesNotre projet vise à identifier les facteurs qui définissent les Frontières des chromosomes et à disséquer leur mode opératoire, afin de préserver ces frontières essentielles à l‘identité des cellules et leur devenir/reprogrammation.
Mécanismes et Facteurs des Barrières ChromosomiquesLa division des cellules est finement contrôlée par l’organisation du génome en chromatine. Deux concepts émergeants dans ce domaine de la biologie sont a) le positionnement spécifique des nucléosomes pour la régulation de l‘accessibilité à l’information génétique (1-3) et b) les ‘boucles’ d’ADN qui médient des contacts entre des sites situés à longue distances (4,5). Ces deux phénomènes sont à l’origine de mécanismes de contrôles essentiels pour la pluripotence des cellules, leur division, la protection contre les cassures chromosomiques et la stabilité génomique (6,7). Néanmoins, les mécanismes de contrôle de positionnement des nucléosomes et des boucles d’ADN restent très mal connus. Bien qu’il ait été suggéré que la séquence de l’ADN, ou la transcription, pourrait influencer ce positionnement, des données très récentes montrent que des facteurs se liant à des séquences spécifiques pourraient eux-même jouer un rôle clé dans ces niveaux d’organisation de la chromatine (2,3,8), mettant en évidence la nécessité de disséquer les mécanismes du positionnement des nucléosomes et des boucles d’ADN. Les protéines insulatrices telles que BEAF, sont les meilleurs candidats pour la régulation de ces mécanismes, via des facteurs qui apparaissent conservés chez tous les eukaryotes tels que CP190 (4,8,9). Nous avons ainsi pu montrer que BEAF, en interagissant avec ses sites de liaisons appelés ‘Nucleosome-Associated cis Regulatory Elements’(NACREs), communs à de nombreux facteurs (3) et où le positionnent des motifs de liaison de BEAF est très spécifique par rapport à celui des nucléosomes voisin. Aussi, nos résultats montrent que BEAF régule le positionnement de nucléosomes in vivo (unpublished), en amont de la liaison de la polymérase II censée être le facteur clé du positionnement. Ainsi, nos données suggèrent plutôt un nouveau mécanisme clé dans la régulation du positionnement des nucléosomes qui potentialiserait la chromatine pour sa transcription. 
Approches Biochimiques/Biophysiques des InsulateursNous avons identifiés >30 cofacteurs associés aux complexes BEAF et entreprendrons des analyses permettant de révéler le rôle des co-facteurs, spécifiques aux insulateurs BEAF ou communs avec les insulateurs CTCF, dans le positionnement des nucléosomes. Pour cela, nous réaliserons des expériences à haut débit afin de mesurer le positionnement des nucléosomes dans le génome après déplétion des facteurs associés, et réaliseront des expériences de smFRET afin de disséquer ces mécanismes. D’autre part, nous combinerons des expériences d’immunofluorescence avec des ces déplétions afin de déterminer le rôles de ces facteurs dans le regroupement des insulateurs en foyers. Pour disséquer ces mécanismes qui impliquent la formation de boucles d’ADN, nous entreprendrons des analyses par microscopie ‘super-resolution’ et par manipulations de molécule unique (10). Ces techniques ‘en temps réel’ apparaissent comme idéales pour étudier la formation des boucles d’ADN. Nos analyses interdisciplinaires permettrons de révéler des mécanismes fondamentaux de l’organisation de la chromatine, et notamment du positionnement des nucléosomes et des foyers nucléaires.1. Mavrich, T. N. et al. Nature 453, 358-62 (2008).2. Corpet A, Almouzni G. Trends Cell Biol. 1, 29-41. (2009).3. Kaplan, N. et al. Nature 458, 362-6 (2009).4. Dekker, J., Cuvier, O. & Chang, H. Y. EMBO rep in press (2009).5. Miele, A. & Dekker, J. Mol Biol 464, 105-21 (2009).6. Barski, A. et al. Cell 129, 823-37 (2007).7. Schones, D. E. et al. Cell 132, 887-98 (2008).8. Emberly, E. et al. PLoS Biol 6, 2896-910 (2008).9. Bushey et al. Genes Dev. 23:1338-50 (2009).10. Nollmann, M. et al. Nat Struct Mol Biol 14, 264-71 (2007).
Résumé de la soumission : La division des cellules est finement controlée par l’organisation du génome en chromatine. Deux concepts émergeants dans ce domaine de la biologie sont a) le positionement spécifique des nucléosomes pour la régulation de l‘accessibilité à l’information génétique (1-3) et b) les ‘boucles’ d’ADN qui médient des contacts entre des sites situés à longue distances (4,5). Ces deux phénomènes sont à l’origine de mécanismes de controls essentiels pour la pluripotence des cellules, leur division, la protection contre les cassures chromosomiques et la stabilité génomique (6,7). Néanmoins, les mécanismes de control de positionement des nucléosomes et des boucles d’ADN restent très mal connus. Bien qu’il ait été suggéré que la séquence de l’ADN, ou la transcription, pourrait influencer ce positionnement, des données très récentes montrent que des facteurs se liant à des séquences spécifiques pourraient eux-même jouer un rôle clé dans ces niveaux d’organisation de la chromatine (2,3,8), mettant en évidence la nécéssité de disséquer les mécanismes du positionnement des nucléosomes et des boucles d’ADN.	Les protéines insulatrices telles que BEAF, sont les meilleurs candidats pour la régulation de ces mécanismes, via des facteurs qui apparaissent conservés chez tous les eukaryotes tels que CP190 (4,8,9). Nous avons ainsi pu montrer que BEAF, en interagissant avec ses sites de liaisons appelés ‘Nucleosome-Associated cis Regulatory Elements’(NACREs), communs à de nombreux facteurs (3) et où le positionnent des motifs de liaison de BEAF est très spécifique par rapport à celui des nucleosomes voisin. Aussi, nos résultats montrent que BEAF régule le positionnement de nucléosomes in vivo (unpublished), en amont de la liaison de la polymerase II censée être le facteur clé du positionnement. Ainsi, nos données suggérent plutôt un nouveau mécanisme clé dans la régulation du positionnement des nucléosomes qui potentialiserait la chromatine pour sa transcription. 	Nous avons identifiés >30 cofacteurs associés aux complexes BEAF et entreprendrons des analyses permettant de révéler le rôle des co-facteurs, spécifiques aux insulateurs BEAF ou communs avec les insulateurs CTCF, dans le positionnement des nucléosomes. Pour cela, nous réaliserons des éxpériences à haut débit afin de mesurer le positionnement des nucléosomes dans le génome après déplétion des facteurs associés, et réaliseront des éxperiences de smFRET afin de disséquer ces mécanismes.	D’autre part, nous combinerons des éxperiences d’immunofluorescence avec des ces déplétions afin de déterminer le rôles de ces facteurs dans le regroupement des insulateurs en foyers. Pour disséquer ces mécanismes qui impliquent la formation de boucles d’ADN, nous entreprendrons des analyses par microscopie ‘super-resolution’ et par manipulations de molécule unique (10). Ces techniques ‘en temps réel’ apparaissent comme idéales pour étudier la formation des boucles d’ADN. Nos analyses interdisciplinaires permettrons de révéler des mécanismes fondamentaux de l’organisation de la chromatine, et notament du positionnement des nucléosomes et des foyers nucléaires.1. Mavrich, T. N. et al. Nature 453, 358-62 (2008).2. Corpet A, Almouzni G. Trends Cell Biol. 1, 29-41. (2009).3. Kaplan, N. et al. Nature 458, 362-6 (2009).4. Dekker, J., Cuvier, O. & Chang, H. Y. EMBO rep in press (2009).5. Miele, A. & Dekker, J. Mol Biol 464, 105-21 (2009).6. Barski, A. et al. Cell 129, 823-37 (2007).7. Schones, D. E. et al. Cell 132, 887-98 (2008).8. Emberly, E. et al. PLoS Biol 6, 2896-910 (2008).9. Bushey et al. Three subclasses of a Drosophila insulator show distinct and cell type-specific genomic distributions. Genes Dev. 23:1338-50 (2009).10. Nollmann, M. et al. Nat Struct Mol Biol 14, 264-71 (2007).
Résultats : Nos résultats récents montrent que plusieurs facteurs sont requis dans l’établissement de barrières épigénétiques, c’est à dire dont la cellule garde la mémoire. Ces facteurs sont en cours de caractérisation.
De plus, nous nous penchons sur les mécanismes qui sont à la base des activités barrières, c’est à dire de la segmentation fonctionnelle du chromosomes. De façon intéressante, les barrières chromosomiques apparaissent comme flexibles et ‘recyclables’ , au lieu de constituer des structures rigides. 
Enfin, nos résultats indiquent que les barrières contrôlent l’expression de gènes distants, impliquant des régulations liées à la conformation spatiale des chromosomes (Liang et al., MS in prep).
Perspectives : Nos résultats pourraient permettre de mieux comprendre l’origine de la structuration des chromosomes, à la base de l’identité cellulaire et de la reprogrammation.
Publications et brevets : Jun Liang+, Adrien Gamot+, Suresh Cuppadrah^*, Laurent Lacroix+, Sophie Queille+, Magali Hennion +*, Pauline Morillon+, Krim Belhocine, Jutta Vögelmann$, Serge Urbach^, Marcelo Nöllmann$, Keji Zhao^, Eldon Emberly# and Olivier Cuvier+@. A Regulatory Network among the Beaf-32/GAF/dCTCF/CP190 Insulator-Binding Proteins control RNAPII Pausing through Long-range Interactions. Manuscript in prep.
Magali Hennion +*, Suresh Cuppadrah^*, Adrien Gamot+*, Pauline Morillon+, Sophie Queille+, Dany Severac~, Christelle Dantec~, Keji Zhao^, Eldon Emberly#@ and Olivier Cuvier+@ Insulator-mediated Regulation of Gene Expression through Transcriptional Pausing. EMBO J., under revision
Jutta Vogelmann1, Alessandro Valeri1, Emmanuelle Guillou2, Olivier Cuvier2, Marcelo Nollmann1 (2011). Roles of chromatin insulator proteins in higher-order chromatin organization and transcription regulation. Nucleus, review.