Projet ANR-13-BSV8-0009 – HeliDEAD : Les ARN hélicases à boite DEAD: quels sont leurs rôles, leurs partenaires, leurs substrats ARN et comment elles fonctionnent.
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8) 2013
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur N. Kyle TANNER (Expression Génétique Microbienne)
Partenaires : Expression Génétique Microbienne; Biologie Moléculaire et Cellulaire des Eucaryotes; Laboratoire de Physique Statistique de l'ENS
Montant : 300000.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 36 mois
Résumé : La famille des hélicases à ARN à boite DEAD sont des protéines ubiquitaires présentent dans tous les règnes du vivant et qui sont associées à tous les processus cellulaires impliquant l’ARN, de la transcription à la dégradation de l’ARN. Ces protéines, impliquées dans des processus cellulaires très spécifiques, sont très souvent essentielles, rarement interchangeables, et elles peuvent être impliquées dans certaines pathologies. Cependant, les protéines purifiées ne montrent que peu ou pas de spécificité de substrat in vitro. Elles ont besoin à la fois de l’ATP pour lier leur substrat ARN, et de l’ARN pour hydrolyser l’ATP. De nombreuses hélicases sont capables de dissocier les duplex d’ARN in vitro, mais elles sont très peu efficaces. Elles sont aussi capables de remodeler des structures secondaires et tertiaires, et d’assembler ou de modifier des complexes ribonucléoprotéiques. Mais, très peu de choses sont connues quant aux mécanismes d’action de ces protéines et en général, on ne connait pas leur vrai substrat. Ce sont certainement leurs partenaires qui leurs apportent la spécificité et qui permettent la régulation des processus physiologiques au sein de la cellule. Nous avons donc pour objectifs de:
-	identifier les partenaires 
-	identifier les authentiques substrats ARN 
-	reconstituer le(s) complexe(s) nucléoprotéique(s) in vitro
-	élucider leur(s) rôle(s) 
-	utiliser des approches de type “molécule unique” pour disséquer et comprendre les mécanismes moléculaires utilisés par ces protéines.
La protéine de levure Ded1 a été choisie comme hélicase modèle pour réaliser ce projet, car c’est une protéine essentielle in vivo qui possède de très bonnes activités enzymatiques in vitro. Ainsi, nous avons pu développer pour la première fois un essai pour mesurer les effets des hélicases à boite DEAD sur le déroulement des duplex d’ARN, en utilisant des pinces magnétiques en molécule unique. Cet essai, développé par Vincent Croquette, nous permettra de mesurer les vitesses de déplacement d’un oligonucléotide ARN, les constantes d’affinité et de regarder les effets des cofacteurs. Nous pouvons également purifier les complexes associés à Ded1, et analyser leur composition protéique par immunodétection et par spectrométrie de masse. Ceci nous a déjà permis d’identifier plusieurs complexes et certains des partenaires de Ded1. Nous pourrons reconstituer ces complexes in vitro et utiliser des extraits cellulaires pour analyser les fonctions de Ded1. Les ARN associés seront aussi isolés et analysés entre autre par la technique du CRAC. Une approche génétique est également en cours pour identifier et caractériser d’autres partenaires potentiels, que nous pourrons ensuite analyser par des approches biochimiques et enzymatiques. Enfin, en collaboration avec une biologiste cellulaire, Naima Belgareh-Touzé, nous pouvons examiner la localisation cellulaire de la protéine dans différentes conditions de croissance. Ainsi, nous avons été les premiers à montrer la localisation nucléaire de Ded1. En combinant toutes ces données, nous espérons surtout comprendre quel est le rôle biologique de Ded1.
Ce projet regroupant 3 laboratoires avec chacun des expertises différentes mais complémentaires, devrait créer une synergie suffisante pour pouvoir mener à bien ce projet et comprendre comment les hélicases à ARN à boite DEAD fonctionnent et pourquoi elles sont si importantes (essentielles) dans l'expression génétique et la régulation cellulaire.