Projet ANR-10-JCJC-1503 – SterTrans : Bases moléculaires du transport vectoriel de stérol
Programme : JCJC : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (JCJC SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Guillaume DRIN (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE COTE D'AZUR)
Partenaires : Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
Montant : 270000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Mécanisme du transport de stérol dans les cellules eucaryotesLe stérol est un lipide clé qui participe à l’architecture et à la rigidité des membranes cellulaires. Au sein d’une cellule, des routes moléculaires acheminent le stérol entre différentes zones. Nous voulions déterminer si certaines protéines sont capables de prendre du stérol au bon endroit pour le délivrer ensuite avec précision dans un autre compartiment.
Déterminer le fonctionnement des transporteurs de stérolLe stérol est un lipide essentiel de la biologie. Une des questions majeures est de savoir comment les flux et niveaux de stérol sont régulés à l’échelle de l’organisme entier mais aussi au niveau cellulaire. Des défauts majeurs de transport de stérol dans les cellules peuvent conduire par exemple à l’absence de synthèse d’hormones stéroïdiennes. Le trafic de stérol a été essentiellement observé de manière globale dans la cellule. Il est admis que des protéines solubles acheminent du stérol entre les différents compartiments cellulaires, chaque type de compartiment étant délimité par une membrane lipidique avec une composition, une identité moléculaire prédéfinie. Nous travaillons à un niveau très fin, au niveau structurale et mécanistique, sur une question : il y a t-il véritablement des protéines « intelligentes » qui savent reconnaitre un compartiment cellulaire comme l’endroit où doit être capté du stérol pour aller ensuite à un autre endroit y délivrer ce lipide. Notre objectif est entre autres de décortiquer les mécanismes par lesquels des protéines appelées Osh/Orp pourraient jouer un rôle de navette entre le lieu de synthèse du stérol et la bordure externe de la cellule, là où le stérol doit être accumulé pour en assurer la rigidité et l’intégrité. Pour cela nous reconstituons un système minimal in vitro pour voir si certaines protéines Osh/ORP sont capables de prélever efficacement du stérol d’une membrane de lipides mimant un compartiment cellulaire pour le délivrer à une autre membrane de composition différente, mimant un deuxième compartiment.
Mesure in vitro du transport de stérol par les protéines Osh/OrpNous étudions dans le tube à essai si certaines protéines Osh/Orp, préalablement purifiées, transportent du stérol entre deux populations de liposomes (des vésicules de lipides), l’une et l’autre constituant respectivement le point de départ et d’arrivée du transport. Nous avons créé des protocoles originaux pour mesurer les diverses étapes de ce transport et nous regardons comment la nature des membranes en gouverne la direction et l’efficacité.
Résumé de la soumission : Notre projet concerne une large famille de transporteurs et senseurs de stérol pour laquelle il manque des explications en terme mécanistique. Nous savons qu’une distribution correcte de stérol dans les cellules est essentielle à sa viabilité. Une donnée clé est que le stérol est rare dans le réticulum endoplasmique (RE) mais beaucoup plus concentré dans le trans-Golgi et la membrane plasmique. Les protéines ORP/OSH sont devenues récemment les candidats les plus crédibles pour assurer un transport non-vésiculaire de stérol. Par des approches in vitro, nous voulons en comprendre les mécanismes d’action et répondre à une question clef en biologie cellulaire : comment assurer un routage vectoriel de lipides d’une organelle à l’autre avec une protéine.	Nous étudierons Kes1p/Osh4p, protéine ORP/OSH de référence de structure connue. Kes1p serait un convoyeur cytoplasmique de stérol participant à la création d’un gradient de stérol chez la levure. Kes1P assure probablement une ligne unique de transport. Laquelle ? Nous pensons que la structure de Kes1p encode une capacité à garantir un transport unidirectionnel d’ergostérol du RE au trans-Golgi. Tout d’abord, Kes1p a une sensibilité à la courbure membranaire adéquate pour cibler le RE fortement tubulé et extraire du stérol de son lieu de synthèse. Une fois extrait, le stérol est bloqué dans Kes1p par un couvercle moléculaire. Nous mesurons que Kes1p délivre du stérol au contact du PI(4)P. Ce lipide singulier marque le trans-Golgi : il forcerai donc Kes1p à délivrer du stérol à cet organelle. Un couvercle contrôlé par le PI(4)P serait avantageux pour interdire le retour du stérol au RE, donc pour assurer un transport vectoriel. En d’autres mots, nous avons avec Kes1p un modèle remarquable pour étudier comment une protéine est structurellement adaptée pour assurer un transport unidirectionnel. Deuxièmement, nous aurons aussi la possibilité de reproduire un transport vectoriel avec des compositions membranaires les plus réalistes. Notamment, nous regarderons si des lipides clés, les  sphingolipides, en séquestrant du stérol dans des liposomes géant mimant le trans-Golgi, aide Kes1p à assurer un routage unidirectionnel.	En parallèle, nous voulons démontrer avec ORP9L et OSBP l’interdépendance d’une capacité à connecter des membranes avec celle de lier ou transporter du stérol. Dans les cellules eucaryotes, des zones de contact existent entre trans-Golgi et RE. Diverses protéines transfèrent via cet espace étroit entre membrane des lipides et ajustent la composition lipidique du trans-Golgi. Dans ce contexte, l’architecture d’OSBP et d’ORP9L est fascinante. Avec un domaine de liaison au stérol comme Kes1p, elles ont deux domaines additionnels, un pour résider sur le trans-Golgi, l’autre pour lier le RE. Si des études cellulaires donnent des indications précieuses sur OSBP, elles ne révèlent ni son mode d’action, ni même sa fonction réelle. Une hypothèse est qu’OSBP ponte la membrane du Golgi avec celle du RE en réponse à un stérol de signalisation. Nous voulons le démontrer. Ceci indiquera si OSBP aide à positionner d’autres transporteurs de lipide pouvant eux-aussi s’associer au deux compartiments. A l’opposé, ORP9L serait un vrai transporteur. Nous étudierons si ORP9L, doit connecter en permanence deux membranes pour assurer un transport efficace et vectoriel de stérol. L’attachement membranaire est-il avantageux pour un transport de lipides ?  En corrélant in vitro une activité d’attachement membranaire à une capacité de liaison au stérol,  nous espérons répondre à ces questions clefs qui sont apparues récemment sur ces protéines.	Enfin, les protéines OSH/ORP semblent coupler divers processus cellulaires à l’homéostasie du stérol. Ce sont d’évidentes cibles pharmacologiques. Par modélisation moléculaire avec l’aide de nos outils expérimentaux et de notre travail autour de la structure de Kes1p, nous souhaitons proposer des molécules interférant avec les  protéines OSH/ORP.
Résultats : Les premiers résultats obtenus ont montré que la protéine Osh4p, considérée comme l’archétype des protéines Osh/Orp, avait un design moléculaire lui permettant de prélever du stérol de son lieu de synthèse pour l’échanger, avec un lipide très particulier, le PI(4)P, qui joue le rôle d’étiquette moléculaire sur un compartiment appelé l’appareil de Golgi. Ce mécanisme d’échange entre ces deux lipides n’avait jamais été décrit. Nous proposons ainsi un mécanisme inattendu qui permet de diriger une route de transport vers un compartiment cible en couplant directement le transport de stérol à celui d’un lipide de signalisation.  L’identification de ce mécanisme permet une ré-interprétation de nombreuses observations faites dans les 20 dernières années sur certains mécanismes cellulaires par la communauté des biologistes qui s’intéresse au métabolisme et au transport des lipides. Ces résultats vont remodeler nos idées sur le transport de stérol et de manière très directe la suite de notre projet ANR. Les résultats, publiés, nous ont permis d’acquérir une visibilité dans ce domaine et nous ont ouvert plusieurs collaborations en France et à l’étranger.
Perspectives : Le mécanisme que nous avons identifié est sans doute extrapolable aux autres membres de la famille Osh/Orp : ceci redéfinit en profondeur la fonction de ces protéines et ouvre de nouvelles pistes de recherche. La suite du projet SterTrans est d’étudier des protéines, beaucoup plus complexes que Osh4p, dont on pense qu’elles pourraient transporter de stérol entre deux membranes, mais aussi attacher ces deux membranes afin de réduire la route qui les sépare. Ces protéines pourraient de fait transférer du stérol plus efficacement et plus rapidement. A terme, ces protéines étant impliquées dans différents processus cellulaires et potentiellement liées à des problématiques biomédicales, nos résultats peuvent ouvrir de nouvelles perspectives de recherche ainsi que des idées de ciblage pharmacologique
Publications et brevets : Nous avons publié fin 2011 un article dans un journal international de référence The Journal of Cell Biology  intitulé  “Osh4p exchanges sterols for phosphatidylinositol 4-phosphate between lipid bilayers” décrivant notre travail sur Osh4p . Notre article a fait l’objet d’un commentaire dans ce même journal écrit par un spécialiste du domaine intitulé « Lipid traffic: Osh4p makes an unexpected exchange »  qui met en exergue la nouveauté des résultats obtenus et leur retombée. Depuis plusieurs articles qui font le point sur le transport de stérol ont cité notre travail. Nous avons acquis une visibilité dans le domaine qui nous permet d’écrire maintenant des articles de synthèse sur le sujet et une légitimité que nous essaierons d’asseoir en publiant d’autres résultats issus du projet SterTrans. Un des vollet de ce projet est  aussi d’identifier des molécules inhibitrices des protéines Osh/Orp avec à la clef de possibles brevets.