Projet ANR-13-BSV7-0001 – ChloroRNP : Expression du génome chloroplastique: protéines OPR et complexes ribonucléoprotéiques.
Programme : Blanc - SVSE 7 - Biodiversité, évolution, écologie et agronomie (Blanc SVSE 7)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Francis André WOLLMAN (UMR 7141 (CNRS - Université Paris 6))
Partenaires : Physiologie Membranaire et Moléculaire du Chloroplaste
Montant : 345670.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 48 mois
Résumé : Expression du génome chloroplastiqueIl y a 1.5 milliards d'années, l'endosymbiose d'une cyanobactérie a créé le chloroplaste. Le génome chloroplastique a depuis perdu son autonomie. Ce projet vise à comprendre le réseau des gènes nucléaires qui contrôlent l'expression des gènes chloroplastique à trois niveau: la stabilisation des ARNm, leur traduction, leur dégradation.
Comprendre le mécanisme d’action des ROGESLe projet ChloroRNP vise à approfondir, chez l'organisme modèle Chlamydomonas reinhardtii, la connaissance des mécanismes coordonnant l'expression génétique dans les compartiments nucléo-cytosolique et chloroplastique (cp). Toutes les étapes post-transcriptionnelles de l'expression des gènes cp (stabilité, activation traductionnelle, stockage et dégradation des transcrits) sont régulées de manière gène-spécifique par des régulateurs de l’expression génétique (acronyme anglais ROGEs), codés par le noyau. La plupart des ROGEs contiennent des motifs répétés de 34 (TPR), 35 (PPR) ou 38 (OPR) acides aminés, susceptibles de former des paires d'hélices ? antiparallèles qui interagissent avec les séquences 5'UTR d'un messager cible. Le projet est divisé en quatre tâches, chacune relative à un aspect peu compris de l'expression génétique cp. Les tâches 1&2 ont pour but d'étudier comment sont générés les transcrits cp matures ainsi que les modalités de leur stabilisation et dégradation. Les tâches 3&4 s'intéressent au mode d'action moléculaire des ROGEs, notamment de ceux contenant des OPRs.
Transcriptome chloroplastique par séquençage à haut débit, Etiquetage de gènes, Déchiffrage de codeLa tâche 1 vise à établir le transcriptome chloroplastique par des techniques de séquençage à haut-débit. Nous cherchons à identifier les ribonucléases intervenant dans la maturation, la stabilité et la dégradation des transcrits chloroplastiques (tâche 2) et les complexes ribonucléoprotéique (RNP) de haut poids moléculaire, en générant des versions étiquetées de ROGEs connus et en cherchant de nouveaux interactants à grande échelle (tache 3). Les ROGEs de Chlamydomonas étant en majorité des protéines OPRs, la tâche 4 vise au déchiffrage du «code OPR«, reliant la séquence des répétions OPRs à celle de leur cible ARN.
Résumé de la soumission : Le projet ChloroRNP vise à approfondir, chez l'organisme model Chlamydomonas reinhardtii, les connaissances des mécanismes coordonnés qui existent entre les compartiment nucléo-cytosolique et chloroplastique (cp), dans l'expression génétique de ce dernier. Toutes les étapes post-transcriptionnelles de l'expression des gènes cp, telles que la stabilité des transcrits, leur activation traductionnelle ou leur stockage sous forme non-traduite peuvent être régulées de manière gène-spécifique par des "Regulators of Organelle Gene Expression" (ROGEs), codés par le noyau. La plupart des ROGEs contiennent des motifs répétés de 34 (TPR), 35 (PPR) ou 38 (OPR) amino-acides, susceptibles de former des paires antiparallèles d'hélices-alpha, et interagissent avec les séquences 5'UTR d'un messager cible afin de contrôler sa stabilité (facteurs M) ou son activation traductionnelle (facteur T). Le projet est divisé en quatre tâches, chacune relative à un aspect peu compris de l'expression génétique cp. Les tâches 1&2 ont pour but d'étudier comment sont générés les transcrits cp matures ainsi que les modalités de leur stabilisation et dégradation. Les tâches 3&4 s'intéressent au mode d'action moléculaire des ROGEs, notamment de ceux contenant des OPRs.La tâche 1 étudiera le transcriptome cp par des techniques de séquençage à haut-débit (SHD). Les transcrits cp seront quantifiés dans une souche sauvage et dans des mutants dépourvus de ROGEs spécifiques par RNA-Seq, ainsi que leur 5' exact déterminés. En outre, nous effectuerons des SHD de petits ARNs dans ces mêmes souches dans le but d'identifier des empreintes laissé par des complexes spécifiques transcrit/ROGE. La tâche 2 aura pour but d'identifier les ribonucléases intervenant dans la maturation, la stabilité et la dégradation des transcrits chloroplastiques, ribonucléases qui sont à ce jour encore inconnues. Un bon candidat pour intervenir dans ce processus est la RNAse J que nous avons récemment identifiée chez Chlamydomonas, et que nous étudierons plus particulièrement. Nous développerons également des cribles génétiques afin de découvrir d'autres RNases impliquées dans ces processus.La majorité des ROGEs connus sont trouvés dans des complexes ribonucléoprotéique (RNP) de haut poids moléculaire, pouvant aller de 300 kDa à plusieurs MDa, qui seront étudiés en détail dans la tâche 3. Bien que ces RNPs aient été détectés de manières répétée par des équipes de recherche indépendantes, leur composition exacte ainsi  et leur rôle fonctionnel ne sont que peu compris. Nous analyserons leur composition et leur rôle, notamment en générant des versions étiquetées de ROGE connus et en cherchant de nouveaux interactants à grande échelle. Étant donné qu'une majorité de ROGEs connus chez Chlamydomonas appartient à la famille des OPRs, la tâche 4 s'attèlera au déchiffrage du "code OPR", c.à.d. le code qui relie la séquence en amino-acides des répétions OPRs à leur séquences nucléotidiques cible dans l'ARN correspondant. Le projet ChloroRNP permettra d'approfondir nos connaissance sur les modalités d'expression des gènes cp, avec des implications qui vont au-delà de Chlamydomonas. Comme les domaines OPR (et RAP) sont trouvés dans tous les organismes photosynthétiques, mais aussi chez les protistes et les mitochondries animales, l'élucidation du code OPR sera bénéfique pour l'ensemble des domaines de la génétique des organites au sens large. Une débouchée majeure du projet sera une description analytique du réseau complexe des interactions ROGEs/ARNm, qui régulent la balance entre transcrits traduits, stockés ou dégradés. Le projet ChloroRNP sera mené au "Laboratoire de Physiologie Moléculaire et Membranaire du Chloroplaste" (UMR 7141 CNRS-UPMC) sur une période de 48 mois, incluant 163,2 hommes.mois de chercheurs non-ANR ainsi que la demande de financement d'un "CDD chercheur" de 36 -, et d'un poste d'Ingénieur Technique de 12 hommes.mois. Le coût total de l'aide demandée est de 405 670,72 €.
Résultats : Nous avons analysé les ARNs des organites de Chlamydomonas par séquençage à haut débit des transcrits (RNA-Seq) et des petits ARNs. Nous identifions ainsi les sites de démarrage et de maturation des ARNm. Parmi les petits ARN, nous identifions un certain nombre d'«empreintes«, protégées de la dégradation par la liaison de ROGEs. Nous corrélons certaines empreintes avec le code OPR que nous avons commencé à déchiffrer.
Perspectives : Cette description du transcriptome chloroplastique de Chlamydomonas permet des expériences de mutagenèse dirigées destinées à compléter et valider le code OPR
Publications et brevets : Boulouis A, Drapier D, Razafimanantsoa H, Wostrikoff K, Tourasse NJ, Pascal K, Girard-Bascou J, Vallon O, Wollman FA, Choquet Y. (2015) Spontaneous Dominant Mutations in Chlamydomonas Highlight Ongoing Evolution by Gene Diversification., Plant Cell, pii: tpc.15.00010. PMID:25804537