Projet ANR-12-BSV5-0005 – CaPeBlE : Implémentation de Peptides Cagés pour Bloquer l'Endocytose (ImPeCaBle)
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur David Perrais (Centre National de la Recherche Scientifique)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique
Montant : 300000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : Développement de molécules activables par la lumière pour bloquer l’endocytoseL’endocytose, internalisation de vésicules à partir de la membrane plasmique des cellules, est un processus fondamental de la biologie des cellules eucaryotes. Pour étudier ses mécanismes moléculaires et son rôle dans la biologie des cellules, nous proposons de développer des molécules pour visualiser et bloquer sélectivement l’endocytose dans les cellules vivantes.
Développement de molécules activables par la lumière pour bloquer l’endocytoseL’endocytose, internalisation de vésicules à partir de la membrane plasmique des cellules, est un processus fondamental de la biologie des cellules eucaryotes. Pour étudier ses mécanismes moléculaires et son rôle dans la biologie des cellules, nous proposons de développer des molécules pour visualiser et bloquer sélectivement l’endocytose dans les cellules vivantes.
Visualisation par microcopie de l’endocytose et synthèse de molécules photoactivablesPour visualiser la formation des vésicules d’endocytose, nous utilisons la microscopie de fluorescence et des protocoles développés pour distinguer les récepteurs internalisés de ceux qui sont restés sur la membrane plasmique. Nous synthétisons des peptides candidats que nous validons par des tests in vitro avant de les introduire dans les cellules vivantes par une pipette de patch-clamp et d’observer leurs effets sur l’endocytose.
Résumé de la soumission : L'interaction d'une cellule avec son environnement se produit par l’intermédiaire de sa membrane plasmique. Pour adapter la forme et la composition de leur membrane plasmique, et intégrer les éléments nutritifs et les facteurs de signalisation, les cellules eucaryotes utilisent l’endocytose, la formation de vésicules à partir de la membrane plasmique. L’endocytose dépendante de la clathrine (EDC) est la forme la plus largement utilisée de l'endocytose. La dynamique et les mécanismes moléculaires de l’EDC, et son rôle dans un certain nombre de fonctions cellulaires, ont fait l'objet d'études approfondies. Un grand nombre de protéines et d’interactions impliquées dans ce processus ont été identifiés, mais la dynamique de ces interactions est largement inconnue. Notre équipe interdisciplinaire de biologistes et de chimistes va développer de nouveaux outils pour visualiser et interférer avec des interactions clés menant à la formation des vésicules recouvertes de clathrine (VRC). Premièrement, nous développerons des peptides photoactivables, ou cagés, pour bloquer l'interaction entre le domaine riche en proline de la dynamine,  une protéine essentielle de l’EDC, et le domain SH3 (Src Homology 3) de ses partenaires, comme l’amphiphysine. Ceci va nous permettre de bloquer l’EDC dans les cellules vivantes d'une façon contrôlée spatialement et temporellement, ce que nous testerons par des techniques de microscopie de fluorescence sur les cellules vivantes permettant de détecter la formation des VRC. Deuxièmement, nous construirons des couples de protéines d'endocytose fusionnées avec des protéines fluorescentes pour visualiser leur interaction par imagerie de Förster Resonance Energy Transfer-Fluorescence Lifetime Microsopy (FRET-FLIM) dans des cellules vivantes. Nous ferons le parallèle entre ces interactions et les étapes de la création des vésicules d'endocytose. Cet ensemble d'expériences fourniront un niveau de détail sans précédent sur la dynamique des mécanismes moléculaires de l’EDC.  De plus, les peptides cagés développés dans ce projet seront utilisables dans de nombreux contextes cellulaires. En particulier, l’EDC est essentielle pour l'expression de la dépression synaptique à long terme (DLT), un substrat neuronal de certaines formes d'apprentissage et de mémoire. Nous allons effectuer des expériences d'électrophysiologie de patch clamp pour déterminer avec le peptide cagé où et quand l’EDC est nécessaire pour la DLT, et si l'endocytose contribue à la spécificité synaptique de la DLT. Nous prévoyons que ces outils, une fois mis à la disposition de la communauté scientifique, permettront de clarifier la participation de l’EDC dans de nombreuses fonctions cellulaires.
Résultats : Nous avons adapté la méthode de détection de la formation de vésicules d’endocytose aux neurones en culture (manuscrit en préparation).
Nous terminons la validation de la méthode permettant la visualisation de la formation des vésicules d’endocytose dans les cellules vivantes pendant la dialyse de la cellule par une pipette de patch-clamp pour introduire des peptides bloquant l’endocytose. 
En parallèle, nous avons synthétisé une bibliothèque de peptides simples et modifiés (peptides dimériques ou branchés) dont nous testons les propriétés par des tests in vitro : liaison avec les protéines cibles mesurée par tests biophysiques (anisotropie de fluorescence, résonance plasmon de surface, peptide pull-down). Ces tests vont nous permettre de définir le meilleur candidat pour tester dans les cellules.
Perspectives : Le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de l’endocytose, étape cruciale pour aboutir à une description quantitative de ce processus, et de son rôle dans la biologie des cellules. D’autre part, les outils photoactivables permettront de bloquer l’endocytose à des temps et moments choisis, ce qui permettra de définir le rôle de l’endocytose dans l’établissement de la polarité cellulaire, la chemotaxie ou le trafic des récepteurs, notamment dans les neurones. Ces outils pourront faire l’objet de brevets ou de licences pour leur production et leur mise à disposition pour la communauté scientifique.
Publications et brevets : Un manuscrit en préparation sur la technique de visualisation des vésicules d’endocytose dans les neurones en culture.