Projet ANR-08-BLAN-0336 – Mobigene : Transposition : a new family of prokaryotic transposons
Programme : Blanc (BLANC) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE MIDI-PYRENEES (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE MIDI-PYRENEES)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 420000.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 36 mois
Résumé : Nos analyses bioinformatiques ont identifié une très grande famille de séquences d'insertion, IS200/IS605, chez les eubactéries et archaea ainsi que chez quelques virus géants d'eucaryotes. Les membres possèdent une structure et une organisation tout à fait nouvelle [Ton-Hoang, et al. (2005) EMBO J. 24:3325-38]. Nous avons démontré que la séquence d'insertion IS608, membre de cette famille, se transpose par un mécanisme inédit avec, comme substrat, l'ADN simple brin et une chimie totalement différente de celle des IS classiques [Guynet (2008) Mol. Cell 29: 302-312]. La transposase (TnpA; 155 aa) est une des plus petites connues, elle ressemble aux relaxases (transfert conjugatif) et aux réplicases dites "en cercle roulant" (bactériophages, plasmides et virus eucaryotes). TnpA remplace également les endonucleases d'introns bactériens de type I. Ces IS représentent un carrefour évolutif important. Leur distribution extrêmement large témoigne de leur rôle dans la plasticité de génome. Nos résultats démontrent une structure de TnpA très particulière [Ronning et al., (2005) Mol Cell. 2005 20:143-54] conduisant à un modèle original [Barabas et al., Cell (2008) 132: 208-220] qui explique la reconnaissance des sites cibles et suggère une liaison intime entre transposition et réplication/réparation. IS608 représente donc un nouveau paradigme de transposition. Le projet a pour but de déterminer le mécanisme de transposition de ces éléments en détail. Nous avons démontré que: IS608 s’excise sous forme de molécule d’ADN circulaire; la séquence flanquante est précisément reconstituée; et le transposon circulaire peut s’intégrer dans une cible. Après irradiation, au cours du processus de réparation des cassures de l’ADN, qui génère une quantité considérable d’ADN simple brin, la transposition d’un autre membre de la famille, ISDra2 (D. radiodurans) est fortement induite. Nous travaillerons sur IS608 et ISDra2 comme modèles d’études afin de définir les propriétés communes à la famille, ainsi que pour explorer leur diversité dans la régulation et l’interaction avec l'hôte. Pour IS608, nous étudierons : les interactions de TnpA avec l’ADN, la dynamique de ce processus et les changements conformationnels des partenaires ADN (les extrémités d’IS608 riches en structures secondaires) et protéiques conduisant au clivage et à la recombinaison. TnpA montre une forte affinité pour un ADN simple brin et clive un seul brin des extrémités en formant un lien covalent Tyr-5’P. Nous avons développé un système de transposition in vitro et emploierons une combinaison d'approches (génétique, biochimique et biophysique) pour étudier les éléments séquence/structure nécessaires à la reconnaissance de l'ADN, la formation et l’évolution des complexes ADN-protéine indispensables à l’excision et l’intégration. TnpA forme un dimère dans lequel chaque site catalytique est partagé par deux monomères. Nous sonderons la structure secondaire inhérente des extrémités d'ADN en présence ou absence de TnpA et emploierons des analyses biophysiques pour visualiser des changements conformationnels lors des étapes clés de la réaction. Nous étudierons également la transposition d’ISDra2 in vitro (pour fournir un panorama de la transposition de famille IS200/IS605) et in vivo. Les études in vivo concerneront: l’induction de la transposition par irradiation, l’analyse fine grâce à un système rapporteur des étapes d’excision et d’insertion et, par mutagenèse, nous chercherons des facteurs de l’hôte impliqués dans la transposition d’ ISDra2. Une question importante est la source des substrats d’ADN simple brin exigés pour la transposition. Nous analyserons pour IS608 et ISDra2, la manière dont l’ADN simple brin devient disponible (effet de ralentissement des fourches de réplication sur l'excision et l'intégration, conjugaison, endommagement de l’ADN…). En second lieu, nous étudierons la régulation de l’expression de TnpA. Nous effectuerons également une analyse bioinformatique de la di