Projet ANR-13-BSV4-0012 – Traumep : Cerveau post-traumatique et épilepsie
Programme : Blanc - SVSE 4 - Neurosciences (Blanc SVSE 4)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Claudio RIVERA (INSTITUT DE NEUROBIOLOGIE DE LA MEDITERRANNEE)
Partenaires : Institut de Neurobiologie de la Méditerranée; Institut de Neurobiologie de la Méditerranée
Montant : 441064.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : Comment un cerveau sain se transforme en cerveau épileptique après un status epilepticus.L’épilepsie du lobe temporal est un des types d’épilepsies les plus fréquentes chez l’adulte et qui est souvent pharmaco-résistante. Ce type d’épilepsie est associé à des réorganisations du réseau neuronal dans l’hippocampe. L’enjeu du projet est d’élucider les mécanismes cellulaires impliqués dans la réorganisation du réseau neuronal pour mieux comprendre l’épileptogenèse.
Comprendre le fonctionnement du cerveau en condition pathologique et proposer une nouvelle piste thérapeutique.Dans cette application, nous unissons nos forces et notre savoir-faire dans la physiologie et la biologie moléculaire de l'homéostasie des ions chlorures et des facteurs trophiques ainsi que l'expertise dans la neuropathologie de l'épilepsie pour étudier davantage les mécanismes physiopathologiques moléculaires et cellulaires, le projet a trois objectifs spécifiques:1) élucider la traduction et les mécanismes post-traductionnelles régulant l'expression fonctionnelle et la distribution de KCC2 et NKCC1 dans les tissus post-traumatiques.2) élucider le lien entre l'expression fonctionnelle de la KCC2, NKCC1 et les changements moléculaires dans l'expression et l'activation fonctionnelle des proNTFs, les facteurs neurotrophiques et p75NTR dans les conditions neuropathologiques.3) Déterminer le rôle de l'homéostasie du chlore et sa relation avec les neurotrophines dans l'hyperexcitabilité post-traumatique et l'épileptogenèse dans un modèle in vivo de TBI.L'originalité de la première et la deuxième parties du projet réside en l'élucidation de nouveaux mécanismes de régulation des cations-chlorure-cotransporteurs (CCC) et p75NTR tant au niveau de la transcription que des modifications post- traductionnelles. Dans ces parties du projet, nous allons créer de nouveaux outils qui permettront de définir le rôle de l'interaction entre CCC et NTFS dans le recâblage neuronal  du cerveau post-traumatique.Le mécanisme de base est définie en utilisant des modèles in vivo d'épilepsie, en utilisant en partenariat des enregistrements EEG télémétriques, infusion de minipompes osmotiques ainsi que des approches électrophysiologiques. L'intérêt thérapeutique des voies de signalisation décrites seront évaluées dans des modèles de TBI chez le rongeur (rats et souris). L'objectif final du projet est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la neuroprotection et la prévention de l'épilepsie post-traumatique.
Modèle animal d'épilepsie du lobe temporal et traumatismes cérébrauxPour étudier l'épilepsie du lobe temporal, nous avons utilisé différentes techniques permettant la quantification des ARN messagers et des protéines par immunohistochimie afin d' évaluer la localisation des protéines. Puis l'activité neuronale est monitorée à deux niveaux différents, d'abord ex vivo en utilisant le paradigme des tranches aiguës puis enfin in vivo grâce à des enregistrements électroencéphalographiques sur animaux éveillés. Enfin, l'effet thérapeutique de bumétanide a été quantifiée en infusant directement dans le cerveau pendant 3 jours en utilisant un mini système de pompe. Brièvement des rats mâles de six semaines sont été traités à la pilocarpine, un agent convulsivant. Après 3h d'état de mal épileptique les convulsions sont stoppées par le diazépam. Après un tel protocole, les animaux entrent dans une phase dite silencieuse qui peut durer de 2 à 10 semaines, puis ils entrent dans une phase chronique dans laquelle des crises spontanées et récurrentes se produisent.Des Western blot et PCR quantitative ont été effectuées afin de quantifier l'expression des protéines, puis de lier l'expression et la fonction; nous avons effectué des protocoles d'immunohistochimie sur des tranches de cerveau pour étudier la localisation de la protéine d'intérêt. Enfin l'activité cérébrale a été mesurée à deux niveaux différents d'abord dans l'hippocampe en tranches aiguës puis in vivo par une approche électroencéphalographique. Enfin, la pertinence clinique de bumétanide a été confirmée par l'utilisation de mini-pompe. Fondamentalement, mini-pompes osmotiques et canules ont été implantés sous la peau sur le dos et permettent de délivrer focalement et continuellement de la bumétanide dans l'hippocampe dorsal et le gyrus denté (le taux de livraison est 0.5µl / heure ± 0,05 pi à la température du corps pendant 3 jours).
Résumé de la soumission : La neurodégénérescence, comme celle observée lors d’une lésion cérébrale traumatique, est une séquelle dévastatrice et commune à nombre de pathologies neurologiques. Dans de nombreux cas, la lésion cérébrale traumatique induit une épilepsie (épilepsie pos-traumatique). L’idée communément acceptée est que le cerveau réagit aux traumatismes en activant des programmes développementaux pour la survie. Par exemple, après un traumatisme, les neurones du système nerveux central deviennent dépendants de la neurotrophine BDNF pour leur survie. Les raisons de cette dépendance sont pour l’heure très peu étudiées. Dans nos travaux récents nous décrivions un nouveau mécanisme pour expliquer l’action neuroprotectrice du BDNF en condition post traumatique: a) la modification de fonction du récepteur GABAA qui est dépendante à la fois, de la modification d’expression du co-transporteur potassium-chlore KCC2 et de l’expression du co-transporteur sodium-potassium-chlore NKCC1; b) la dépolarisation créée par le récepteur GABAA induit un augmentation de l’expression de p75NTR qui en retour induit un signal de mort cellulaire; c) la neurotrophine BDNF contrebalance ces effets et elle exerce pour sa part une action neuroprotectrice. Cependant les mécanismes sous-jacents à l’inhibition de KCC2, la dépendance au BDNF pour la survie cellulaire et les conséquences sur la réorganisation des réseaux neuronaux restent inconnus.Dans cette application, nous unissons nos forces et notre expertise dans le domaine des facteurs trophiques, de l'homéostasie du chlore et de la physiopathologiques de l'épilepsie dans le but de poursuivre l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires physiopathologiques activés lors de lésions cérébrales avec un accent particulier sur la lésion cérébrale traumatique.Le projet a trois objectifs principaux: élucider 1) le mécanisme de translation et de régulation post-traductionnelle de l'expression fonctionnelle et la distribution de KCC2 et NKCC1 neuronaux en post-traumatique (Taks 1A-B). 2) Le lien entre l'expression fonctionnelle des KCC2, NKCC1 et les changements moléculaires dans l'expression et l'activation fonctionnelle de proNTFs (les facteurs neurotrophiques NTFs) et p75NTR dans les conditions neuropathologiques (tâche 1C). 3) le rôle de l'homéostasie du chlore et des NTFs dans l’hyper-excitabilité neuronale et l’épileptogenèse dans le modèle in vivo de lésion cérébrale traumatique (Tâche 2).L'originalité des première et deuxième parties du projet seront dans l'élucidation des mécanismes de régulation des co-transporteurs cations-chlore (CCC) et du p75NTR à la fois au niveau transcriptionnel et post-traduction. Dans ces parties du projet, nous allons créer de nouveaux outils qui permettront de définir les interactions entre les CCC et les NTFs dans le re-câblage neuronale après un trauma cérébrale. La preuve de concept pour la majorité de ces outils a déjà donné des résultats positifs.Le projet sera réalisé en utilisant des modèles in vitro et ex vivo de lésions neuronales (cultures primaires et organotypique ainsi que la préparation aiguë hippocampe de rat et / ou souris). En utilisant une combinaison d’approches telles que les enregistrements EEG télémétriques, l’infusion de composés par des mini-pompes osmotiques et la stimulation optique in vitro et in vivo, nous évaluerons la pertinence thérapeutique de voies de signalisation dans le modèle de lésion cérébrale traumatique chez les rats et les souris. L'objectif final du projet est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la neuroprotection et l'épilepsie post-traumatique.
Résultats : The NKCC1 protein expression was significantly increased to around 45% and around 70% of control level at d1pSE and d5pSE respectively with no significant alteration at d14pSE. In contrast, KCC2 protein expression was significantly reduced to around 60% of the control level at d5pSE. In order to investigate whether network reorganization occurs in parallel to KCC2 and NKCC1 expression changes, we asked whether ectopic MF sprouting is already established at d5pSE, visualization of synaptoporin (SPO) staining revealed a marked ectopic band on top of the granular cell layer at d5pSE, interestingly, after bumetanide application, we observed around 45% decrease in SPO fluorescence. In order to find out whether this sprouting is functional as early as d5pSE we used the antidromic stimulation of the mossy fibers pathway in the CA3b, we found that vehicle-treated epileptic rat harbor recurrent MF network-driven bursts at d5pSE. In order to establish if p75NTR upregulation is involved the formation of ectopic MF sprouting and that bumetanide reduced this sprouting by acting on p75NTR expression we infused intrahippocampally a p75NTR functionally blocking antibody (p75NTR Fc) from d2 to d5pSE.
Interestingly, we found that p75NTR Fc antibody reduced ectopic MF sprouting at d5pSE. Indeed, SPO staining revealed significantly decreased fluorescence intensity in p75NTR Fc treated compared to vehicle-treated rats at d5pSE. Altogether these results suggest that bumetanide functionally reduced ectopic MF sprouting by blocking p75NTR upregulation in vivo at d5pSE in the pilocarpine model of TLE.
To assess long term effect of bumetanide on ectopic MF sprouting of granule cell, we investigate animals two months after SE, we show that SPO intensity is significantly reduced in bumetanide-treated rats as well as seizure activity. The number of ictal events was robustly reduced in bumetanide-treated group (by around 50%), without significant change in their duration.
Perspectives : Nous avons démontré avec succès que le bumétanide pourrait être un agent efficace dans le traitement de l'épilepsie du lobe temporal. Jusqu'ici, nous avons montré que le point de temps critique de la maladie survient dans les premiers jours en tant que protéine change avec les modifications de l'activité neuronale se déroulent déjà 5 jours après l'épisode initial. Merci à ces résultats puissants que nous avons appliquées à un brevet de transfert soutenu par l'Inserm.
Dans le temps restant de la subvention nous allons nous concentrer sur un autre type de traumatisme qui conduit également à la décantation jusqu'à des crises d'épilepsie. Au total, nos résultats mettent en évidence l'importance de la plasticité réactive des cellules neuronales et son importance dans l'étiologie de l'épilepsie. Nous avons ainsi commencer autre expérience vérifier la pertinence thérapeutique de bumétanide sur les facteurs de comorbidité de traumatisme cérébral tels que la dépression.
Publications et brevets : Notre production scientifique pourrait être facilement séparé en trois axes principaux. D'abord la publication d'un importante étude sur le rôle de chlorure homéostasie dans des cas pathologiques (Medina et al., 2014), la deuxième un document soumis à la «Nature Medicine» en explorant l'action de bumétanide et son rôle dans la prévention / réduction des épilepsies secondaires tels que épilepsie du lobe temporal. une autre papier en phase d'écriture concernant un traumatisme pénétrant du cerveau et des modifications précoces de l'activité du cerveau menant à l'épilepsie et la dépression. La troisième partie est la demande de brevet en progrès avec Inserm Transfert. Cette volonté nous amène à proposer bumétanide comme prophylaxic l'agent visant à réduire premiers événements ayant lieu après une état de mal épileptique initiale et menant à récurrentes et des crises spontanées.