Projet ANR-13-BSV7-0013 – BugsInACell : Accommodation intracellulaire des bactéries symbiotiques fixatrices d’azote
Programme : Blanc - SVSE 7 - Biodiversité, évolution, écologie et agronomie (Blanc SVSE 7)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Peter MERGAERT (Institut des Sciences du Végétal)
Partenaires : Génomique Métabolique; Écologie Microbienne; Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes; Institut des Sciences du Végétal
Montant : 500507.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : Accommodation intracellulaire des bactéries endosymbiotiques dans les cellules végétales.Rôle de peptides antimicrobiens dans les symbioses plantes-bactéries, dans la différenciation bactérienne et les échanges trophiques
Rôle des peptides antimicrobiens dans la symbiose.Les symbioses racinaires fixatrices d'azote des plantes légumineuses avec les rhizobia et des plantes actinorhiziennes avec Frankia constituent une entrée majeure d'azote combiné dans la biosphère. Ces endosymbioses dépendent du contact étroit entre des milliers de bacteries intracellulaires et les cellules hôtes dans les nodules racinaires de la plante. L'étude du rôle des peptides antimicrobiens produits par l'hôte dans le maintien  d'une large population bacterienne et leur fonctionnement sont les objectifs de BugsInACell.
Approches multidisciplinaires in vivo et in vitro pour l'étude de l'impact des peptides antimicrobiens sur les bactéries symbiotiques.Le rôle in vivo des peptides de l'hôte est étudié en utilisant une combinaison d'approches de biologie cellulaire et de transcriptomique, proteomique et métabolomique ainsi que par le suivi de paramètres physiologiques.Les études in vitro sont basées sur l'utilisation de peptides synthétiques ainsi que des techniques de biologie cellulaire, physiologie et microbiologie classique pour définir leur impact sur le fonctionnement bactérien.Nous utilisons des approches de génétique bactérienne pour identifier les adaptations bactériennes nécessaires pour répondre à ces peptides produits par la plante-hôte.
Résumé de la soumission : Les symbioses fixatrices d'azote entre les légumineuses et rhizobia ainsi qu’entre les plantes actinorhiziennes et Frankia ont un impact écologique et agronomique majeur. Elles permettent d’enrichir la biosphère en azote combiné, elles sont pionnières des successions écologiques et leurs cultures ne nécessitent pas ou peu d’engrais azoté. Ces symbioses se traduisent par la formation d’un nouvel organe sur les racines, le nodule, qui abrite les bactéries fixatrices d’azote. Les progrès récents réalisés sur la génétique et la biologie du développement du nodule relance la perspective de transférer cette capacité symbiotique vers des céréales. Toutefois, l’efficacité de la fixation d’azote par les légumineuses et les plantes actinorhiziennes repose sur une interaction étroite entre des milliers de bactéries intracellulaires et les cellules de la plante hôte. La compréhension des mécanismes qui permettent à une cellule eucaryote de maintenir une si grande population bactérienne ou à une bactérie d'infecter chroniquement une cellule végétale demeure extrêmement limitée. Une meilleure connaissance de cette phase symbiotique conditionne le succès du transfert de la capacité fixatrice d’azote à des plantes cultivées.Les rhizobiums retrouvés dans les cellules du nodule (les bactéroïdes) sont des bactéries différenciées avec un métabolisme spécifique adapté pour fixer l'azote. Pour de nombreuses légumineuses, cette étape de différentiation est accompagnée d’une transformation morphologique de la bactérie, imposée par la plante. Chez Medicago, ce contrôle est exercé par des peptides antimicrobiens, appelés NCR, synthétisés spécifiquement dans le nodule. Chez les légumineuses qui aboutissent à d’autres morphotypes de bactéroïde, ces mécanismes de différentiation demeurent méconnus. De manière analogue, durant la symbiose actinorhizienne, les Frankia se différencient en vésicules sous l’influence de facteurs synthétisés par la plante hôte dont la nature est inconnue. Dans ce projet, nous étudierons un système modèle constitué de souches de Bradyrhizobium dont les bactéroïdes présentent 3 morphotypes différents suivant la plante hôte (Aeschynomene evenia, A. afraspera et soja). Afin d’identifier les programmes génétiques et les voies métaboliques impliqués dans chacun des morphotypes, nous réaliserons une analyse comparative du transcriptome, protéome et métabolome des bactéroïdes couplée à une analyse de leur capacité à fixer l’azote. Ces données nous indiqueront notamment si un morphotype particulier confère un avantage spécifique pour la plante hôte comme le suggèrent  des études préliminaires. Un deuxième objectif est l’identification par des approches de génétique et de transcriptomique des fonctions bactériennes impliquées dans la différenciation du bactéroïde. Une étude fonctionnelle de gènes candidats sera réalisée de manière approfondie.Troisièmement, nous proposons d’identifier les effecteurs de plantes qui contrôlent la différenciation du bactéroïde dans les nodules d’Aeschynomene. Des essais biologiques basés sur le changement de morphologie des bactéries ou l'activation de gènes spécifiquement surexprimés durant la morphogenèse du bactéroïde seront développés. En parallèle, des effecteurs candidats (NCRs) seront étudiés par des approches de biologie cellulaire et de biochimie.Finalement, nous analyserons si les mécanismes identifiés chez les légumineuses sont conservés lors de la symbiose actinorhizienne. Des peptides antimicrobiens nodule-spécifiques ont été identifiés chez Alnus glutinosa et Casuarina glauca. La fonction de ces peptides dans la formation des vésicules sera analysée par des approches in vivo et in vitro.Ce projet améliorera nos connaissances sur les mécanismes d’adaptation intracellulaire des bactéries lors de la symbiose avec les légumineuses ou les plantes actinorhiziennes, ce qui constituera une étape essentielle vers le transfert de la capacité symbiotique aux plantes cultivées non fixatrices d'azote.
Résultats : Nous avons montré que des peptides antimicrobiens sont utilisés dans les interactions symbiotiques bactérie-plantes aussi diverses que celles impliquant les légumineuses et les plantes actinorhiziennes. Ceci suggère que de tels peptides sont répandus dans les interactions symbiotiques et qu'ils constituent des outils efficaces pour gérer de fortes populations endosymbiotiques.
Ces peptides peuvent avoir des fonctions différentes et des effets variés sur les bactéries symbiotiques. Dans les légumineuses, ces peptides induisent chez les bactéries un état de différentiation terminal qui se trouve aussi être plus efficace en terme de physiologie symbiotique. Chez les plantes actinorhiziennes, ces peptides semblent promouvoir les échanges métaboliques entre cellules the bactériennes et les cellules de l'hôte en particulier la libération par la bactérie des acides aminés glutamate et glutamine. Cet effet trophique des peptides améliore probablement l'efficacité de la symbiose.
Enfin, nous avons identifié plusieurs fonctions bactériennes requises pour la réponse aux peptides produits par l'hôte.
Perspectives : Ce projet améliore nos connaissances sur les mécanismes d’accommodation intracellulaire nécessaires du côté bactérien dans les symbioses légumineuses et actinorhiziennes. La caractérisation détaillée du rôle de ces peptides produits par l'hôte peut ouvrir des pistes pour des approches innovantes de biotechnologie pour améliorer la fixation biologique de l'azote dans les systèmes symbiotiques existants qui sont importants agronomiquement mais qui fonctionnent de façon sub-optimale. Notre travail constitue aussi une étape essentielle vers le transfert de la symbiose fixatrice d'azote à des plantes agronomiques dépourvues de la capacité à établir des relations symbiotiques, qui constitue un objectif poursuivi activement dans différents laboratoires dans le monde.
Publications et brevets : 1.	Carro L, Pujic P, Alloisio N, Fournier P, Boubakri H, Hay AE, Poly F, François P, Hocher V, Mergaert P, Balmand S, Rey M, Heddi A & Normand P. 2015. Alnus peptides modify membrane porosity and induce the release of N-rich metabolites from nitrogen fixing Frankia. ISME J. doi:10.1038/ismej.2014.257.
(this article was published in the best microbial ecology journal (IF 2013 9.24)).
2.	Silipo A, Vitiello G, Gully D, Sturiale L, Chaintreuil C, Fardoux J, Gargani D, Lee HI, Kulkarni G, Busset N, Marchetti R, Palmigiano A, Moll H, Engel R, Lanzetta R, Paduano L, Parrilli M, Chang WS, Holst O, Newman DK, Garozzo D, D'Errico G, Giraud E*, Molinaro A*. (2014) Covalently linked hopanoid-lipid A improves outer-membrane resistance of a Bradyrhizobium symbiont of legumes. Nat Commun 5:5106. * Co-senior authors (IF 10.742)
3.	Mardirossian, M., Grzela, R., Giglione, C., Meinnel, T., Gennaro, R., Mergaert, P., and Scocchi, M. (2014) The host antimicrobial peptide Bac71-35 binds to bacterial ribosomal proteins and inhibits protein synthesis. Chem. Biol. 21, 1639–1647. (IF 6.586)
4.	Guefrachi, I., Nagymihaly, M., Pislariu, C.I., Van de Velde, W., Ratet, P., Mars, M., Udvardi, M.K., Kondorosi, E., Mergaert*, P., and Alunni, B. (2014). Extreme specificity of NCR gene expression in Medicago truncatula. BMC Genomics 15, 712. (IF 4.04)