Projet ANR-10-BLAN-0713 – Bio-ssNMR : Développements de la RMN du solide pour les protéines et les complexes de protéines.
Programme : Sciences de l'information, de la matière et de l'ingénierie :  Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Anne LESAGE (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-AUVERGNE)
Partenaires : Centre Européen de Résonance Magnétique Nucléaire à Très Hauts Champs de Lyon
Montant : 325000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : De nouvelles approches spectroscopiques pour l’étude d’assemblages de protéinesDes méthodes innovantes en Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) pour la caractérisation à l'échelle de l'atome de la structure d'assemblages biologiques complexes.
Obtenir des informations clés sur la structure d’assemblages de protéines complexes par spectroscopie RMN à l'état solideLa machinerie cellulaire repose sur d’innombrables partenaires biologiques formés d’assemblages supramoléculaires complexes de protéines. Un portrait complet de la biochimie cellulaire nécessite cependant une compréhension fine des interactions entre les différents acteurs. La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) parce qu’elle permet de déterminer le repliement et la dynamique des protéines à l’échelle de l’atome, mais également les interactions entre les biomolécules, est une approche clé pour une compréhension en profondeur des processus chimiques impliqués dans la biologie des systèmes cellulaires. En particulier, la RMN en phase solide est particulièrement bien adaptée pour l’étude d’assemblages macromoléculaires qui, en raison de leur taille et/ou de leur flexibilité, sont souvent difficiles à caractériser par d'autres techniques. Plusieurs verrous restent cependant à résoudre avant que cette technique puisse véritablement s’attaquer à la caractérisation structurale d’assemblages biologiques complexes et de nombreux développements méthodologiques sont attendus dans ce domaine en pleine évolution.
Des techniques spectroscopiques poussées et des stratégies de calcul innovantesLe projet de recherche a concerné la mise en œuvre de nouvelles méthodologies RMN à l'état solide pour la caractérisation structurale et dynamique d’assemblages biologiques complexes. Nous avons suivi trois voies principales pour relever les défis de ce projet de recherche. La première a consisté à développer de nouvelles expériences de RMN à l’état de l’art de la méthodologie et de l’instrumentation pour repousser les verrous actuels en termes de résolution spectrale et de sensibilité. Cette partie du projet s’est appuyée sur des équipements de RMN à la pointe de la technologie, et notamment sur le premier spectromètre au monde fonctionnant à une fréquence de  1 GHz (et installé à Lyon en 2009). La deuxième approche a concerné le développement de nouveaux protocoles d'analyse automatique des données pour attribuer les spectres et en extraire des contraintes de structure précises, ce qui représente encore aujourd’hui une étape critique dans la détermination de la structure des protéines solides. L’étude structurale d’assemblages de protéines de grande taille du réplisome de l’ADN a enfin été abordé en appliquant les méthodes expérimentales et informatiques développés précédemment.
Résumé de la soumission : La RMN du solide s’est récemment imposée comme une méthode d’analyse structurale complémentaire à la RMN en solution ou à la cristallographie des rayons X. Des progrès méthodologiques continus, couplés à des avancées techniques considérables dans le domaine des équipements RMN, ont permis la mise en place de stratégies d’attribution des résonances et de mesures de contraintes structurales (distance, angles de liaison) extrêmement performantes. Ces développements ont ouvert la voie aux premières structures haute résolution d’une large gamme d’échantillons à l’état solide allant des matériaux inorganiques, aux catalyseurs hétérogènes ou aux protéines membranaires et fibrillaires.Parce qu’elle ne souffre pas des mêmes limitations en terme de poids moléculaire que son analogue en solution, et parce qu’elle peut être appliquée sur des échantillons non cristallins, la spectroscopie RMN du solide se positionne comme une technique particulièrement adaptée à l’étude de la structure d’assemblages supramoléculaires complexes. Dans ce contexte, de nombreux problèmes méthodologiques restent cependant à résoudre. L’objectif global de notre projet est le développement de méthodes expérimentales innovantes en RMN du solide haute résolution et leur application à l’étude structurale de protéines et de complexes de protéines difficiles à étudier par d’autres méthodes, mais présentant un intérêt biologique fort.Nous proposons tout d’abord de poursuivre un certain nombre de développements méthodologiques en RMN du solide afin notamment d’améliorer la qualité des spectres en terme de résolution et de sensibilité spectrales et d’accéder à l’étude de molécules de plus en plus complexes. L’une des étapes essentielles dans la caractérisation de l’architecture d’assemblages biologiques étant l’étude des interfaces protéine protéine, des méthodes de RMN innovantes seront également développées afin de sonder l’accessibilité de la surface au solvant et la détermination des contacts intermoléculaires.Bien que les structures 3D d’un petit nombre de biomolécules, cristallines ou non, aient été décrites dans la littérature, il n’existe pas encore de protocole standard pour déterminer la structure d’une protéine à l’état solide. Des méthodes de bioinformatique de pointe seront développées pour l’attribution automatique et l’interprétation des spectres RMN du solide ainsi que pour le calcul de structure. Les développement expérimentaux et informatiques seront réalisés sur des protéines microcristallines modèles disponibles au laboratoire (GB1, l’ubiquitine et SOD), avant d’être appliqués à des assemblages de protéines plus complexes.Le but ultime de ce projet est l’application de la spectroscopie de RMN du solide, et des développements méthodologiques décrits précédemment, à l’étude de la structure d’un complexe macromoléculaire de grande taille (161 kDa), l’assemblage fonctionnel alpha:epsilon:theta de l’ADN polymerase III de E-coli. Ce complexe contient le cœur catalytique de l’enzyme et ne peut être étudié à l’échelle atomique par d’autres techniques. Il sera reconstitué à partir de ses différentes sous-unités, surexprimées et purifiées indépendamment. La préparation des échantillons se fera en collaboration avec le groupe du prof. Dixon (Australie), un expert de la réplication de l’ADN. Des domaines, à la fois uniformément et sélectivement marqués en 13C et 15N en des positions stratégiques seront préparés. Plusieurs protocoles expérimentaux seront étudiés pour obtenir des échantillons solides d’une qualité suffisante pour permettre les études par RMN. L’acquisition des spectres et l’attribution des résonances seront réalisées sur les domaines isolés ainsi que sur les sous-assemblages de protéines. Dans une toute dernière étape, les interactions entre les différentes sous-unités de protéines seront étudiées en appliquant différentes méthodologies, telles que le suivi des déplacements chimiques, afin d’obtenir d’éventuels modèles structuraux.
Résultats : Nous avons élaboré de nouvelles expériences de RMN à l'état solide pour améliorer la résolution et la sensibilité des spectres de protéines. En particulier, nous avons démontré que l'utilisation de champs magnétiques élevés (800 et 1000 MHz) combinée à la rotation très rapide de l’échantillon à l'angle magique (60 kHz) permet d’obtenir des largeurs de raie 1H extrêmement fines et d’accéder à l’étude de protéines de grande taille entièrement protonées. Nous avons également rassemblé des informations clés sur les interactions protéine-protéine dans le réplisome, une machine moléculaire responsable de la réplication de l'ADN.
Perspectives : D'un point de vue méthodologique, les résultats obtenus dans cette ANR ont permis de repousser un certain nombre de verrous clés dans le domaine de la RMN solide haute résolution des protéines. Ils permettront d'étendre le domaine d'application de cette spectroscopie à des assemblages biologiques de plus en plus complexes et de taille toujours plus importante. Le projet sur le réplisome a permis d'obtenir des donnés structurales inédites et essentielles pour en comprendre le fonctionnement. En l'absence d'une structure complète de cette machine moléculaire, ces données auront des implications fortes par exemple dans le développement de nouvelles cibles pour des agents anti-bactériens.
Publications et brevets : Ce projet a eu un succès considérable, qui a conduit à la publication de 10 articles dans des revues de chimie de haut niveau (plus 2 autres soumises, et 1 en préparation), 3 chapitres de livres, 12 conférences invitées et 16 conférences promues dans des congrès internationaux.