Projet ANR-11-BSV5-0002 – NeoLect : Neolectines: Lectines synthétiques à valence et spécificité contrôlées pour la biologie cellulaire et la biotechnologie
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Anne imberty (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES)
Partenaires : Centre de Recherches sur les Macromolécules Végétales; Centre de Recherche en Cancérologie Nantes - Angers
Montant : 314944.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Néolectines : des protéines modifiées pour décoder les glycannes humainsDes néolectines de valence et spécificité modulables seront conçues et produites afin de servir d’outil pour l’étude des glycannes présents sur les tissus humains.
Conception et production de néolectines pour l’étude du glycome humainLes interactions entre protéines et glycannes sont impliquées dans de nombreuses fonctions biologiques telles que la signalisation, la migration cellulaire, la reconnaissance immunitaire et l’interaction hôte-pathogène. Cependant, en raison des difficultés d’analyse des glycannes, la Glycomique n’a pas encore atteint l’importance de la Génomique et de la Protéomique. Les lectines sont des protéines qui reconnaissent réversiblement et de manière spécifique les glucides présents sur les surfaces cellulaires, et qui peuvent identifier de manière rapide les altérations de glycosylation corrélées à de nombreuses pathologies. Nous proposons de modéliser, concevoir et produire des néolectines modulables pour leur valence et leur spécificité. Les néolectines de valence controlée seront des outils de choix pour étudier la dynamique de la membrane plasmique lors de l’interaction avec des toxines ou des virus. Les néolectines ayant de nouvelles spécificités seront testées  sur des collections d’échantillons biologiques humains phénotypés tels que les salives et les puces de tissus et échantillons de tissus cancéreux.
Modélisation moléculaire et évolution dirigée pour la conception de néolectinesLa modélisation moléculaire permet de déterminer les acides aminés impliqués dans la reconnaissance du ligand glucidique. Des mutations  ponctuelles dans certains sites  sont effectuées  pour créer des néolectines présentant des valences  variées.  L’obtention de nouvelles spécificités se fera par une approche d’évolution dirigée.
Résumé de la soumission : Les interactions entre protéines et glycanne sont impliquées dans de nombreuses fonctions biologiques telles que la signalisation, la migration cellulaire, la reconnaissance immunitaire et l’interaction hôte-pathogène.  Cependant, en raison des difficultés d’analyse des glycannes,  la Glycomique n’a pas encore atteint l’importance de la Génomique et de la Protéomique.  Les lectines sont des protéines qui reconnaissent réversiblement et de manière spécifique les glucides présents sur les surfaces cellulaires. Elles sont couramment utilisées dans la caractérisation des glycannes et ont des applications biotechnologique en diagnostic car elles peuvent identifier de manière rapide les altérations de glycosylation corrélées à de nombreuses pathologies. Au cours des dernières années, des efforts importants ont été faits afin d’identifier de nouvelles lectines et de progresser dans la compréhension de leur fonction et des bases de leur interactions avec leur ligand glycannique.  La production de lectines synthétiques présentant des propriétés nouvelles est un nouveau domaine de recherche qui stimule un fort intérêt.Nous proposons de modéliser, concevoir et produire  des néolectines modulables pour leur valence et leur spécificité et basées sur une architecture en beta-propeller. Ce repliement protéique consiste en la répétition de 4 à 7 modules, ou lames,  d’environ 40 acides aminés. Parmi les quelques lectines en beta-propeller, la lectine à fucose de Ralstonia solanacearum (RSL) est produite sous forme recombinante et a une forte affinité pour des oligosaccharides fucosylés humains.  Une autre lectine en beta-propeller d’origine fongique,  (PVL from Psathyrella velutina), est également intéressante en raison de sa faible affinité les oligosaccharides sialylés.Les néolectines à valence contrôlée seront conçues à partir du beta-propeller à 6 lames de RSL qui est formée par la trimérisation d’un peptide à 2 lames (6 sites fucose). La mutation des acides aminés du site de reconnaissance et la répétition de séquence seront utilisées pour créer des néolectines présentant des valences et des topologies variées. Ces néolectines seront des outils de choix pour étudier la dynamique de la membrane plasmique lors de l’interaction avec des toxines ou des virus. Le recrutement de glycosphingolipides et la formation d’invagination et de tubules seront analysés sur des cellules vivantes et sur des vésicules géantes unilamellaires.  Le but sera de déterminer l’influence du nombre de sites de liaisons et de leur arrangement spatial dans la formation des tubules et le trafic intracellulaire des néolectines.Des néolectines présentant une spécificité contrôlée seront conçues en utilisant une combinaison de modélisation moléculaire, mutagénèse dirigée et évolution dirigée, tout en gardant les avantages de l’architecture modulaire des beta-propellers. Les néoRSLs seront modifiées afin d’obtenir des spécificités pour différentes oligosaccharides fucosylés, en particurlier pour  les épitopes Lewis X et Lewis Y qui sont surexprimés dans certains cancers. Les néoPVLs seront modifiées par ingénierie pour obtenir une haute affinité pour les oligosaccharides sialylés car les lectines à acide sialique ont des applications directes pour le diagnostic des carcinomes. L’ensemble de ces protéines seront testées sur des collections d’échantillons biologiques humains phénotypés tels que les salives et les  puces de tissus.  Enfin les néolectines présentant des spécificités pour les altérations de glycosylation observées dans certains carcinomes seront sélectionnées pour leur application possible en diagnostic.
Résultats : Résultats préliminaires après les premiers 6 mois : Des modifications de la symétrie de l'architecture en b-propeller de la lectine de Ralstonia solanacearum (RSL) ont été effectuées pour produire une neoRSLs (nRSLs) de valence contrôlée. La caractérisation de mutants a mis en évidence leur très grande stabilité. Des études ITC ont également été réalisées, elles ont mis en évidence que les mutations réduisent la stœchiométrie de six ligands à 3 ligands  La structure 3D du complexe protéine/sucre met en évidence que le mutant R17A est trivalente. En présence de vésicules géantes unilamellaires (GUVs) présentant du fucose, toutes les nécolectines se fixent sur les GUVs mais seule la lectine de valence six induit des invaginations de la membrane. En présence de cellules HeLa, les lectines mutées montrent une cinétique plus lente d'endocytose, ce qui démontre un effet important du degré de polyvalence sur la dynamique des membranes sur l’internalisation. En parallèle, une série de nouvelles lectines bactériennes ont été testées pour leur spécificité pour des tissus sains et cancéreux.
Perspectives : Dans les prochains mois, les néoRSLs seront ciblées contre les épitopes principalement retrouvés sur les cellules tumorales (SLex, SLea…).  La détermination des « hot spots » et des « tepid spots » par modélisation nous indiquera les acides aminés à muter. Une stratégie d’évolution dirigée sera mise en place pour obtenir des mutants de RSL spécifiques pour certaines épitopes cancéreux et leur intérêt diagnostic sera évalué avec le partenaire nantais. Une deuxième lectine en beta-propeller (PVL du champignon Psathyrella velutina) a été clonée et servira d’outil de base pour la recherche de nouvelles spécificités.
Publications et brevets : Les résultats préliminaires de recherche de lectines d’intérêt biotechnologique chez les bactéries opportunistes ont permis d’identifier une lectine en beta-propeller chez Burkholderia ambifaria. 
Audfray A., Claudinon J., Abounit S., Ruvoën-Clouet N., Larson G., Smith D. F., Wimmerová M., Le Pendu J., Römer W., Varrot A. & Imberty A. The fucose-binding lectin from opportunistic pathogen Burkholderia ambifaria binds to both plant and human oligosaccharidic epitopes. J. Biol. Chem. 287, 4335-4347, 2012