Projet ANR-11-BSV8-0015 – Hsp90assembly.com : La machinerie Hsp90-R2TP et l’assemblage de complexes macromoléculaires : rôle dans la biogenèse des RNP.
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Philippe MEYER (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS B)
Partenaires : Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien; Institut de Biologie Physico-Chimique; Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier; Arn, Rnp, Structure-Fonction-Maturation, Enzymologie Moléculaire et Structurale
Montant : 550000.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Architecture du système chaperon Hsp90-R2TP : une cible thérapeutique en cancérologie.Nous souhaitons comprendre le mécanisme d’action d’une nouvelle cible thérapeutique, le système chaperon moléculaire Hsp90-R2TP, dans la  biogenèse des machineries cellulaires qui contrôlent des phénomènes importants en cancérologie tels que la croissance cellulaire ou la réparation de l’ADN.
Comprendre l’organisation spatiale du système Hsp90-R2TP pour éclairer son fonctionnement.Le chaperon moléculaire Hsp90 et son complexe cochaperon R2TP forment un système d’assemblage et de maturation de machines moléculaires d’une grande complexité qui sont essentielles à la vie de la cellule.Pour éclaircir le mode d’action du système Hsp90-R2TP, nous analyserons son architecture et les interactions qu’il forme lors de l'assemblage de machineries cellulaires telles que les snoRNP. Nos objectifs principaux sont : la cartographie des interactions entre protéines au sein du système et en particulier la caractérisation des interactions régulées par l’ATP des protéines Rvb1 et Rvb2 ; la détermination des structures tridimensionnelles du complexe chaperon Hsp90-Tah1-Pih1 et des complexes précurseurs des machines snoRNP. Ces résultats nous permettront alors de proposer un modèle structural global du système chaperon qui explique son fonctionnement lors de l’assemblage des snoRNP.Ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes d'assemblage des machines cellulaires par le système Hsp90-R2TP. Étant donnée l'importance du système dans  de nombreuses maladies humaines dont le cancer, ces informations devraient aider au développement de nouvelles approches thérapeutiques.
Une approche multidisciplinaire couplant analyses structurales, fonctionnelles et modélisation.Pour obtenir une cartographie des interactions entre protéines, nous utilisons la mutagenèse aléatoire couplée à une analyse de génétique moléculaire chez la levure.Les structures tridimensionnelles des complexes chaperons et des précurseurs des machines cellulaires sont obtenues par un ensemble d’approches mêlant la biochimie, la biophysique, la spectrométrie de masse, cristallographie aux rayons X et la résonance magnétique nucléaire.Le modèle structural et fonctionnel global du système chaperon lors de l’assemblage des machines cellulaires snoRNP sera obtenu par modélisation à l’aide de l’ensemble des contraintes disponibles précédemment établies (carte des interactions, structures par cristallographie ou résonance magnétique nucléaire et spectrométrie de masse).?
Résumé de la soumission : La chaperone HSP90 est responsable du repliement et de l'activation conformationelle de protéines jouant des rôles essentiels dans la signalisation cellulaire. La plupart de ces protéines clientes contrôlent des fonctions impliquées dans la transformation maligne comme la prolifération cellulaire, l'immortalisation, l'angiogenèse et l'apoptose. Parce que l'inhibition de Hsp90 résulte dans la dégradation spécifique de ces protéines oncogéniques par le protéasome, cette chaperone a attirée un énorme intérêt comme cible anti-cancéreuse.	Depuis, des approches globales ont démontrée un bien plus grand rôle cellulaire de Hsp90, avec peut-être des centaines de processus ciblés et un rôle majeur dans la dynamique de nombreux assemblages macro-moléculaires. Cependant, au contraire des autres chaperones, la fonction moléculaire de Hsp90 n'a toujours pas été élucidée. En effet, Hsp90 lie ses clientes à une étape tardive de leur repliement, lorsqu'elles sont dans une structure quasi-native, ce qui ouvre de nombreuses questions sur le mécanisme de leur reconnaissance. La découverte de nouvelles co-chaperones a donné un premier niveau d'explication. Ces protéines pourraient jouer un rôle important dans la sélectivité de Hsp90 pour ces clients. Ainsi des co-chaperones spécifiques pourraient délivrer des familles spécifiques de protéines vers Hsp90. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués ne sont pas bien connus.	Hsp90 et sa cochaperone R2TP ont récemment émergés comme des acteurs centraux de l'assemblage des machines cellulaires de grande taille. Nous avons montré qu'ils sont essentiels pour l'assemblage des snoRNP et des ARN polymérases, et d'autres groupes ont montré leur implication dans la biogenèse des PIKKs comme mTOR, ATM et la DNA-PK. Le complexe R2TP est composé des cochaperones Tah1, Pih1, et des AAA+ ATPases Rvb1 et Rvb2. Nous avons montré que le complexe Tah1-Pih1 bloque l'activité ATPase de Hsp90 afin de charger des protéines clientes. Ceci et d'autre données préliminaires nous ont permis de proposer un mécanisme pour le système Hsp90/R2TP, dans lequel le transfert de protéines clientes sur des complexes cibles dépend d'interactions dynamiques et régulées de manière coordonnées par les activités ATPase de Hsp90 et Rvb1/2. Pour comprendre comment le système Hsp90/R2TP fonctionne, nous utiliserons une approche structurale couplée à des études fonctionnelles, et nous focaliserons notre attention sur l'assemblage des snoRNP.Nos objectifs principaux sont:	1-La cartographie précise de toutes les interactions protéine-protéine impliquées, en utilisant une approche de mutagenèse par transposon couplée à du double-hybride. L'utilisation de la génétique moléculaire de levure pour analyser in vivo l'importance de ces interactions.	2-La résolution de la structure du complexe Hsp90-Tah1-Pih1 par cristallographie, RMN, et des approches biochimiques et biophysiques.	3-La résolution de la structure du complexe précurseur de snoRNP Rsa1-Snu13-Hit1, avec ou sans Nop58, et les liens de ce complexe avec Pih1. Nous utiliserons des approches de RMN couplées à de la modélisation.	4-La caractérisation des interactions ATP-dépendantes de Rvb1 et Rvb2 avec les protéines des snoRNP et leurs facteurs d'assemblage, et la cartographie précise des interactions.	5-La construction d'un modèle structural de la chaperone en complexe avec un pré-snoRNP, par des approches d'assemblage in vitro et in vivo couplées à de la modélisation structurale, en utilisant les contraintes disponibles (sites d'interactions, cristallographie, SAXS, spectrométrie de masse native).Ce projet devrait donner une compréhension importante des mécanismes d'assemblage de complexes multi-moléculaires par le système Hsp90/R2TP. Etant donné l'importance des complexes clients dans des maladies dont le cancer, les structures que nous nous proposons de résoudre devraient donner de nouvelles pistes pour des approches thérapeutiques plus spécifiques ciblant Hsp90.
Résultats : Nous avons récemment déterminé les structures tridimensionnelles à haute résolution par résonance magnétique nucléaire de la protéine Tah1 libre et liée à l’extrémité du chaperon moléculaire Hsp90. Ces structures, réalisées en partenariat avec l’ETH de Zürich (Suisse), permettent de décrire les premiers détails du mécanisme de recrutement du complexe R2TP sur le chaperon moléculaire Hsp90.
Perspectives : La structure tridimensionnelle du complexe entre Hsp90 et Tah1 nous donnera des informations précieuses sur le chemin vers un modèle global du système chaperon Hsp90-R2TP. Ces informations structurales détaillées aideront aussi à la conception rationnelle d’inhibiteurs à visée thérapeutique. Ce nouveau type d’inhibiteurs pourrait bloquer la formation du système chaperon Hsp90-R2TP indispensable à l’assemblage de machines cellulaires et pourrait ainsi avoir des applications potentielles en cancérologie.
Publications et brevets : publication soumise