Projet ANR-12-BSV6-0003 – RETROGENO : Complexes de rétrotransposition du LINE-1 humain et instabilité génomique
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Nicolas  GILBERT (Institut de Medecibe Regenerative et biothérapie)
Partenaires : Institut de Génétique Humaine; Institut de Génétique Humaine; Institut de Génomique Fonctionnelle; Laboratoire public; Universidad de Granada Junta de Andalucía Centre for Genomics and Oncological Research (GENYO)
Montant : 374000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Instabilité génétique induite par les éléments mobilesLes éléments mobiles sont des agents mutagènes endogènes actifs dans notre génome. La compréhension du mécanisme de mobilité ainsi que l’identification des facteurs cellulaires impliqués sont indispensables pour la compréhension de la variabilité structurale de notre patrimoine génétique.
Facteurs cellulaires impliqués dans la mobilité du LINE-1 et instabilité génomiqueLes éléments mobiles, tels que LINE-1, contribuent à l'instabilité de nos génomes. Malgré cela, de nombreuses étapes de la mobilité sont encore méconnues. L’objectif de notre projet est de mieux caractériser le mécanisme de rétrotransposition dans les cellules humaines en identifiant les facteurs qui participent activement ou régulent la mobilité. Nous développons un nouveau système afin d’étudier la mobilité de LINE-1 dans des cellules pluripotentes induite, nous raprochant ainsi d’un contexte cellulaire plus physiologique. La compréhension des étapes de la rétrotransposition ainsi que l’identification de ces facteurs devraient nous fournir des connaissances sur la régulation de la rétrotransposition afin de maintenir l’intégrité génomique.Un second objectif de notre recherche est d’attribuer au rétrotransposon LINE-1, un site spécifique d’insertion. Cela dans le but d’analyser à grande échelle la rétrotransposition au niveau de la chromatine.
Caractérisation des partenaires cellulaires de la rétrotransposition et signature génomique de la mobilité de LINE-1Nous avons développé depuis quelques années de nouveaux outils moléculaires basés sur les éléments LINE-1 actifs. Grâce à ces outils ainsi qu’aux multiples techniques de biologie moléculaires, cellulaires et biochimiques nous voulons identifier les partenaires cellulaires de la rétrotransposition. Nous utiliserons aussi les techniques de séquençage de nouvelle génération afin d’évaluer l’impact de l’insertion des éléments LINE-1 sur la chromatine.
Résumé de la soumission : La rétrotransposition est un mécanisme commun à tous les génomes eucaryotes. Il a largement contribué à l’évolution et à la plasticité des génomes. Chez l’homme les rétrotransposons LINE-1 (Long Interspersed Nucleotidic Elements-1) représentent plus de 17% de notre génome. Il est le seul élément mobile autonome actif et est responsable de l’amplification de rétrotransposons non autonomes tels que les séquences Alu et les rétropseudogènes. Ainsi, au cours de l’évolution, LINE-1 a contribué à la formation de près d’un tiers de la masse de notre génome.Malgré cette importance, et le fait que ces séquences soient connues depuis environ 40 ans, peu de choses sont encore comprises sur le mécanisme impliqué dans l’amplification des LINE-1.Ce projet a pour but d’éclaircir certaines étapes du mécanisme de rétrotransposition dans des cellules humaines en culture. De façon plus concrète, nous désirons identifier les facteurs de la cellule hôte qui participent au processus d’amplification. Dans des travaux récents, nous avons développé de nouveaux outils moléculaires qui nous ont permis d’identifier le complexe basal de rétrotransposition du LINE-1. Ce complexe est constitué des deux protéines du LINE-1, ORF1p et ORF2p, et de son ARN. Dans une cellule où LINE-1 est surexprimé, ce complexe est accumulé dans le cytoplasme et forme des foci. Nous envisageons maintenant de purifier ce complexe ribonucléoprotéique (RNP) dans des conditions non dénaturantes et d’identifier les partenaires par spectrométrie de masse.Dans un deuxième temps, nous envisageons de déterminer les partenaires du complexe de rétrotransposition présents dans le noyau. Pour réaliser cette partie du projet, nous allons développer de nouveaux outils moléculaires qui permettraient d’attribuer au rétrotransposon LINE-1, un site spécifique d’intégration. Le fait de pouvoir cibler un site particulier de l’ADN nous permettra d’étudier LINE-1 dans son processus d’insertion. Finalement, pour être transmise à la génération suivante, la rétrotransposition doit avoir lieu dans les cellules germinales ou au tout début de l’embryogénèse. Nous avons donc décidé de mettre au point un système d’étude de la rétrotransposition dans les cellules embryonnaires humaines (hESC) ou dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ce nouveau système permettra l’étude de ces mécanismes dans des conditions proches des conditions physiologiques. De plus, il permettra d’étudier les mécanismes impliqués dans la variabilité structurale du génome observée récemment dans les iPSC. En effet, il a été observé que la reprogrammation des iPSC est associée à une instabilité génomique et à la dérégulation du LINE-1. Ce projet vise à développer nos connaissances sur un mécanisme majeur impliqué dans l’instabilité génétique qui participe à la variabilité structurale et phénotypique des génomes, ainsi qu'au au développement de certains cancers.
Résultats : A l’aide d’une analyse bioinformatique, nous avons établi que LINE-1 pouvait mobiliser les petits ARN non codants grâce à différents mécanismes, suggérant notamment un recrutement nucléaire des ARN par le complexe de rétrotransposition. Une analyse élargie sur l’ensemble des génomes mammifères faisant l’objet d’un programme de séquençage nous a aussi permis de mettre en évidence la grande variabilité de la dynamique de rétrotransposition des LINE-1 en fonction des génomes.
Après avoir testé plusieurs approches afin d’attribuer un site spécifique d’insertion au LINE-1 et grâce à une stratégie de séquençage à haut débit pour identifier un grand nombre d’insertion, nous avons pu constater qu’aucune approche testée ne permet pour le moment de diriger l’insertion à un site particulier. 
Malgré cette impossibilité de contrôler l’insertion du LINE-1, les stratégies de séquençage à haut débit ainsi que l'utilisation des bases de données de ENCODE, nous allons pouvoir établir une identité fine de la chromatine au site d’insertion.
Nous avons identifié une signature spécifique de modification du timing de réplication qui pourrait être corrélé à la présence/absence d’éléments L1 au cours du stress réplicatif lié au vieillissement physiologique ou pathologique.
Perspectives : Les perspectives de ce projet sont de transférer nos connaissances acquises sur l’impact de la rétrotransposition sur la variabilité du génome vers l’utilisation potentielle de cellules pluripotentes induite pour la thérapie cellulaire. En effet, lors de l’induction de cellule pluripotentes a lieu une dérégulation des éléments mobile ainsi qu’une observation de grande variabilité structurale du génome. Il est donc primordial de comprendre les mécanismes et les facteurs impliqué dans cette instabilité génétique.
Publications et brevets : 1.	Doucet AJ, Droc G, Siol O, Audoux J, Gilbert N. (2015). U6 snRNA Pseudogenes: Markers of Retrotransposition Dynamics in Mammals. Mol Biol Evol. 32(7):1815-32. 
Les copies génomiques des petits ARN cellulaires sont des marqueurs de la dynamique et da la variabilité génomique.
2.	Doucet AJ,  Basyuk E, and Gilbert N. Cellular localization of engineered human LINE-1 RNA and Proteins. Methods Molecular Biology, soumis
Manuscrit détaillant les techniques pour suivre les intermédiaires de rétrotransposition
3.	Juan Carlos Rivera-Mulia, Hélène Schwerer, Jiao Sima, Emilie Besnard, David M. Gilbert and Jean-Marc Lemaitre. Specific replication timing signatures of aging and Hutchinson–Gilford progeria syndrome can be reset. Soumis
Signature spécifique de modification du timing de réplication au cours du stress réplicatif lié au vieillissement physiologique ou pathologique.
4.	Haiqing Fu, Emilie Besnard, Romain Desprat, Michael Ryan, Malik Kahli, Jean-marc Lemaitre and Mirit Aladjem (2014). Mapping Replication Origin Sequences in Eukaryotic Chromosomes Curr. Protoc. Cell Biol.
Protocole de séquençage des origines de réplication.