Projet ANR-10-BLAN-1536 – PROTOTYPE NOX : Caractérisation moléculaire de l’assemblage et du fonctionnement enzymatique d’un complexe membranaire: la NADPH-oxydase
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5) 2010
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Laura BACIOU (Laboratoire de Chimie Physique)
Partenaires : Institut de Biologie Structurale; Laboratoire de Chimie Physique
Montant : 420000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 48 mois
Résumé : La NADPH-oxydase est un complexe multiprotéique essentiel de la défense immunitaire innée présent dans les cellules phagocytaires. La NADPH-oxydase est devenu le prototype d’une famille d’homologues décelés récemment dans d’autres types cellulaires. Inactive dans la cellule au repos, cette enzyme a pour fonction de produire des anions superoxydes (O2.-) en réponse à divers stimuli de signalisation intercellulaire et en particulier à une infection bactérienne. Son activité est finement contrôlée par une dynamique d’assemblage de quatre protéines cytosoliques vers leur partenaire membranaire, le flavocytochrome b558 (Cytb558 ). Le Cytb558  est la composante catalytique de l’enzyme. Cet assemblage entraîne le transfert d'électron du substrat, le NADPH, à l'accepteur final, l'oxygène pour produire O2.- via une flavine et deux hème de type b. L’absence ou le dysfonctionnement de la NADPH-oxydase sont associés à de nombreuses pathologies. 
	Notre objectif est de mieux comprendre le fonctionnement complexe de cette enzyme qui associe des transferts d’électrons (et de protons) à une dynamique protéique, en utilisant une double approche structurale et fonctionnelle et des outils physico-chimiques, menée sur un système acellulaire (in vitro). De nombreuses questions sur son mode d’activation restent encore obscures en raison d’une régulation complexe (signalisation cellulaire, interactions protéiques multiples, implication de molécules activatrices..). Le facteur limitant majeur actuel pour son étude in vitro est lié à la composante membranaire catalytique de l’enzyme, le Cytb558 , qui reste difficile à obtenir en quantité suffisante. Nous avons levé récemment ce verrou important en mettant au point l’expression du Cytb558 recombinant dans la levure. Associé aux protéines cytosoliques recombinantes, le complexe forme un système modèle d’étude in vitro de la NADPH-oxydase. Notre objectif est donc de tirer profit de ce nouvel outil, affranchi des contraintes de signalisations cellulaires pour aborder plus aisément l’étude de la relation structure-fonction de cet enzyme tant au niveau des processus de son assemblage, la localisation de ses sites actifs ou bien des mécanismes qui contrôlent son activité. Ce projet met en jeu un large éventail de compétences et d’approches expérimentales (génie génétique, biochimie, biologie structurale, spectroscopie d’absorption et de fluorescence, radiobiologie), qui pour certaines n’ont pas encore été appliquées à l’étude de la NADPH-oxydase et devraient ainsi apporter des résultats très novateurs sur les éléments clefs modulant l’activation de l’enzyme. Les techniques de spectroscopie résolue en temps (technique de stopped-flow et radiolyse pulsée) seront utilisées pour déterminer finement la structure des intermédiaires réactionnels et caractériser les interactions substrat-protéine qui sont encore imprécises. L’influence de l’environnement physico-chimique sur ces mécanismes sera étudiée pour apporter des éléments de compréhension aux mécanismes d’activation ou d’inhibition de l’enzyme et aux interactions protéine-protéine. Ces résultats seront combinés aux données d'assemblage macromoléculaires obtenues à partir des études de fluorescence (stationnaire et dynamique),  hydrodynamiques et de basse résolution (Biacore et ultracentrifugation analytique).
	Enfin, nous avancerons vers la détermination structurale de la composante membranaire catalytique en prenant avantage des plateformes performantes disponibles. La connaissance de la structure tridimensionnelle de la composante catalytique de l’enzyme associée aux informations mécanistiques de son activation, sera déterminante pour définir des stratégies pharmacologiques permettant un meilleur contrôle dans les cas pathologiques de fonctionnement aberrant de la NADPH-oxydase. A terme, ce système pourra être extrapolé et exploité pour l’étude des NADPH-oxydases présentes dans les autres types tissulaires et beaucoup moins aisées à étudier.