Projet ANR-10-BLAN-1501 – CyDiPepS : Etude des synthases de cyclodipeptides (CDPS), une nouvelle famille d'enzymes utilisant des ARNt aminoacylés pour former des liaisons peptidiques
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Muriel Gondry (CEA - CENTRE D'ETUDES NUCLEAIRES SACLAY)
Partenaires : Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives; Centre national de la recherche scientifique; Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Université Pierre et Marie Curie
Montant : 529839.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : Etude des synthases de cyclodipeptides (CDPS), une nouvelle famille d’enzymes utilisant des ARNt aminoacylés pour former des liaisons peptidiquesLes CDPS constituent une nouvelle famille d’enzymes qui détournent des ARNt aminoacylés pour les utiliser comme substrats et former les liaisons peptidiques de cyclodipeptides variés
Bases Moléculaires de l’interaction des CDPS avec les ARNt aminoacylés et mécanisme catalytique emprunté par ces enzymesLes CDPS détournent les ARNt aminoacylés, des molécules dévolues à la synthèse protéique ribosomale, pour les utiliser comme substrats et catalyser la formation des liaisons peptidiques de différents cyclodipeptides. Ce sont des enzymes originales qui ne sont apparentées ni aux aminoacyl-ARNt protéine transférases et aux aminoacyl-transférases de type Fem qui utilisent également des ARNt aminoacylés comme substrats, ni à des synthétases non ribosomales de peptides (NRPS), la seule autre famille d’enzymes qui synthétise des cyclodipeptides.Le projet consiste à comprendre les bases moléculaires de l’interaction des CDPS avec leurs substrats et à élucider le mécanisme que ces enzymes empruntent pour former des cyclodipeptides. Les retombées attendues de ce projet sont d’accroître nos connaissances fondamentales sur les CDPS, connaissances indispensables à acquérir avant d’envisager d’utiliser ces enzymes pour générer de nouvelles molécules biologiquement actives.
Compréhension du fonctionnement des CDPS par une approche multidisciplinaireUne approche multidisciplinaire est engagée. Elle consiste à utiliser des méthodes classiques de biologie moléculaire et de biochimie des protéines et également à effectuer une ingénierie des CDPS. La biologie structurale (cristallographie) est également utilisée pour déterminer des structures de CDPS. Par ailleurs, des ARNt aminoacylés et des analogues choisis de ces substrats des CDPS sont produits par une méthode semi-synthétique faisant appel à la synthèse chimique des nucléotides.
Résumé de la soumission : Les cyclodipeptide synthases (CDPS) constituent une nouvelle famille d’enzymes récemment mise en évidence par deux des partenaires du présent appel d’offre (Gondry et al., Nature Chem. Biol. 2009, 5, 414). Ces enzymes utilisent deux ARN de transfert aminoacylés (aa-ARNt) pour catalyser la formation de deux liaisons peptidiques et ainsi synthétiser un cyclodipeptide, structure qui forme le cœur de nombreux produits naturels doués d’activités biologiques intéressantes. Les CDPS sont des enzymes particulièrement originales qui ne sont apparentées ni aux synthétases non ribosomales de peptides (NRPS), la seule autre famille d’enzymes qui synthétise des cyclodipeptides, ni à aucune autre enzyme caractérisée fonctionnellement. Par ailleurs, les CDPS revêtent un intérêt notable du fait même des substrats qu’elles utilisent (Von Dohren, News and Views in Nature Chem Biol, 2009, 5, 374). En effet, les aa-ARNt sont des molécules essentiellement dévolues à la synthèse ribosomale des protéines et peu d’enzymes les utilisant comme substrats dans d’autres processus cellulaires sont décrites à ce jour. Parmi ces enzymes, les aminoacyl-ARNt protéine transférases et les aminoacyl transférases de type Fem, qui appartiennent à une même famille structurale (les protéines possédant un repliement GNAT), catalysent également la formation de liaisons peptidiques. Cependant, elles se distinguent des CDPS car elles n’utilisent qu’un seul aa-ARNt pour transférer l’acide aminé ainsi activé sur un peptide ou une protéine.Dans ce contexte, notre projet consiste à déterminer comment fonctionnent les CDPSs, notamment à identifier les bases moléculaires de leur interaction avec des aa-ARNt et à élucider le mécanisme catalytique qu’elles empruntent pour former des liaisons peptidiques. Pour mener à bien cette étude, nous allons bénéficier de résultats que nous avons acquis récemment. Ainsi, le partenaire 1 de ce projet vient de résoudre la structure tridimensionnelle d’une des CDPS. Ces données structurales, outre le fait qu’elles nous permettent de confirmer l’originalité des CDPS car ces enzymes ne présentent pas un repliement de type GNAT, nous ont permis de mettre en évidence une similitude structurale entre les CDPS et une autre famille d’enzymes, qui du fait de son importance biologique, est très documentée dans la littérature. L’exploitation de cette similitude nous donne des atouts considérables pour atteindre nos objectifs. Par ailleurs, notre étude va également bénéficier du fait que nous allons pouvoir utiliser des approches expérimentales variées grâce à l’extrême complémentarité des quatre partenaires impliqués dans le projet. Ainsi, le partenaire 1 fera l’étude enzymologique des CDPS mais il prendra également en charge l’étude des interactions des enzymes et de leurs ligands, notamment grâce à ses compétences en biologie structurale. Ces études seront alimentées par le travail des partenaires 2 et 3 qui auront en charge la conception et la synthèse d’analogues d’aa-ARNt pertinents. Les compétences de ces partenaires qui sont habitués à travailler avec de telles molécules sont donc particulièrement précieuses pour l’avancée du projet. Quant au partenaire 4, il sera en charge de la recherche de nouveaux membres de la famille des CDPS et de la détermination des cyclodipeptides qu’elles produisent. Ces données permettront de mieux cerner les déterminants de la spécificité des CDPS et d’apporter des informations supplémentaires sur les résidus impliqués dans la catalyse. Le projet ainsi organisé permettra sans nul doute de caractériser et de documenter une nouvelle famille d’enzymes qui se révèle tout à fait originale.
Résultats : Le résultat majeur de ce projet est la publication d’un article décrivant la structure cristallographique d’une CDPS et donnant les premiers éléments sur les bases moléculaires de l’interaction des CDPS avec leurs substrats.
Un autre résultat important est la publication d’un article montrant que les membres de la famille des CDPS ne sont pas retrouvés uniquement chez des bactéries. En effet, nous avons pu montrer l’existence d’une CDPS chez un animal primitif : cette CDPS est la première enzyme d’origine animale caractérisée qui est impliquée dans la synthèse peptidique non ribosomale.
Perspectives : Les retombées attendues de ce projet sont d’accroître nos connaissances fondamentales sur les CDPS, connaissances indispensables à acquérir avant d’envisager d’utiliser ces enzymes pour générer de nouvelles molécules biologiquement actives.
Publications et brevets : - Sauguet et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39, 4475 : article décrivant la structure cristallographique d’une CDPS et donnant des premiers éléments sur le fonctionnement de ces enzymes
- Seguin, Moutiez et al. (2011) Chem. Biol. 18, 1362 : article mettant en évidence une CDPS chez Nematostella vectensis, un animal primitif 
- Belin, Moutiez et al. (2012) Nat. Prod. Rep. 29, 961 : revue recensant les connaissances sur les CDPS