Projet ANR-14-CE10-0014 – CLEANMD : Mécanismes moléculaires et impact de la voie de dégradation des ARNm nonsense (NMD) sur le transcriptome eucaryote.
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401) 2014
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Monsieur Alain JACQUIER (INSTITUT PASTEUR - Unité Génétique des Interactions Macromoléculaires - UMR3525)
Partenaires : Laboratoire public; Fondation de recherche; Laboratoire de Physique des Solides
Montant : 498957.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 60 mois
Résumé : Différents mécanismes contrôlent la capacité des ARNm à être correctement traduits. Le “Nonsense mRNA Mediated Decay” (NMD) est un mécanisme qui dégrade les ARNm comportant des codons STOP prématurés (PTC, pour "premature termination codons"). Le NMD constitue une cible thérapeutique intéressante. En effet, il a été estimé que les mutations nonsense, qui introduisent des PTC dans les ARNm, sont présentes dans près de 11% des maladies héréditaires chez l’homme. Bien que les mécanismes fondamentaux du NMD demeurent inconnus, des médicaments ont pu être isolés qui contrecarrent les effets délétères de ces mutations en inhibant le NMD et en permettant une translecture partielle des PTC.
Malgré des différences entre espèces, les acteurs principaux de ce processus, Upf1, 2, 3 et la machinerie de traduction, sont très conservés. Il est donc probable que les mécanismes fondamentaux du NMD soient similaires de la levure aux métazoaires. Deux questions clés restent non résolues : comment un PTC est-il reconnu et par quels mécanismes la reconnaissance d’un PTC déclenche la dégradation de l’ARN ? Enfin, l’effet du NMD sur les transcriptomes des eucaryotes n’a été que très partiellement étudié. Des avancées récentes obtenues dans chacun de nos laboratoires permettent de proposer de nouvelles hypothèses et méthodes pour aborder ces questions.
Selon les modèles actuels, les ARN sont reconnus comme substrats du NMD quand un PTC est suivi d’un long 3’-UTR auquel Upf1 se fixe. De plus, chez les métazoaires, la présence, en aval d’un PTC, d’un "exon-junction complex se lequel Upf1 peut-être recruté, déclenche le NMD. Nous avons récemment montré que chez la levure, les ANRm avec de longues ORF sont relativement insensible au NMD, même en présence d’un long 3’-UTR portant Upf1 (Decourty et al., 2014). Cette observation, inexpliquée par les modèles actuels, suggère de nouvelles hypothèses que nous voulons étudier dans le cadre de ce projet. Nous proposons en particulier de développer des méthodes permettant d’identifier les facteurs spécifiquement associés aux ribosomes engagés dans le NMD aux PTC ainsi que d’identifier de manière exhaustive les facteurs interagissant avec Upf1 de levure (yUpf1). Ces analyses bénéficierons des progrès récents permettant des analyses en spectrométrie de masse à la fois très sensibles et quantitatives.
Upf1 possède une activité hélicase essentielle pour le NMD. En combinant des analyses biochimiques et sur molécules uniques, nous avons établi que Upf1 humaine (hUpf1) est une translocase hautement processive (manuscrit en préparation), dont l’activité est régulée par son interaction avec Upf2 et potentiellement d’autres facteurs. Upf1 pourrait utiliser ces propriétés pour remodeler les mRNPs portant un PTC et déclencher la dégradation de l’ARN. Nous voulons valider et étendre ces observations chez la levure. En l’absence de test in vitro du NMD, cette approche sur molécule unique constituera une opportunité unique d’analyser le rôle des facteurs interagissant avec yUpf1 dans la modulation de son activité.
La découverte que le NMD chez la levure est principalement efficace sur les ARN portant de petites ORF coïncide avec la découverte que les substrats naturel du NMD chez cet organisme sont beaucoup plus abondants qu’estimé auparavant. Cette population de transcrits éliminés par le NMD résulte de la faible spécificité de l’initiation de la transcription (manuscrit soumis). Nous voulons étendre aux cellules humaines cette analyse, rendue possible par la mise au point d’une technique très sensible et spécifique de cartographie des sites d’initiation de la transcription.
En combinant les expertises extrêmement complémentaires de nos trois laboratoires, nous proposons ainsi une approche très intégrée pour étudier les mécanismes fondamentaux du NMD, conservés de la levure à l’homme, par des analyses allant de l’échelle génomique aux molécules uniques.