Projet ANR-06-BLAN-0404 – RMN PDZ/E6 : Etude RMN des bases structurales de l'interférence de l'oncoprotéine E6 avec les interactions cellulaires médiées par les domaines PDZ.
Programme : Programme blanc (BLANC) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : GIE CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE (GIE CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE)
Partenaires : TPE; CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE
Montant : 340000.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 36 mois
Résumé : 1- Contexte scientifique et objectifs du projet L'oncoprotéine E6 est produite par les papillomavirus humains (HPVs) génitaux à haut risque responsables des cancers du col de l'utérus. E6 reconnaît et provoque la dégradation cellulaire de plusieurs domaines PDZ impliqués dans le contrôle de la signalisation et des contacts intercellulaires. Cette perturbation d'un réseau d'interactions cellulaires médiées par les protéines ciblées apparaît comme un évènement clé de l'oncogénèse induite par HPV. Les PDZ reconnaissent des motifs spécifiques à l'extrémité C-terminale de leurs partenaires cellulaires. Alors que les caractéristiques génériques de l'interaction PDZ-peptide ont fait l'objet de nombreux travaux, des information concernant la structure et l'activité de laiison des PDZ ciblés par E6 ne sont pas disponibles. Nous proposons une étude structurale exhaustive des interactions de cette famille de domaines PDZ avec une série de protéines E6 oncogènes.  Le projet s'appuie sur des résultats récents décrits dans la littérature, ainsi que sur les expertises acquises par chacune des deux équipes partenaires. L'interaction entre E6 et le domaine PDZ de la protéine MAGI-1 est bien caractérisée du point de vue biochimique et fonctionnel. De plus, nous avons récemment résolu par RMN la structure du domaine C-terminal de E6 de la souche HPV16 E6. Nous avons d'ores et déjà produit des échantillons marqués au 13C et au 15N d'échantillons du PDZ de MAGI-1 après surexpression dans le système bactériens. La dispersion des pics observée sur les premiers spectres de ce domaine enregistrés par spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire, montrent que ce domaine adopte une structure repliée. Par ailleurs, les résultats préliminaires obtenus par RMN sur le complexe E6 / PDZ de MAGI-1 indiquent que le complexe se situe dans un régime d'échange lent avec une affinité de l'ordre du micro-molaire, rendant possible son étude par RMN. Enfin, nous avons d'ores et déjà élaboré un protocole expérimental sur le Biacore permettant de mesurer les paramètres d'affinité et de cinétiques de l'interaction entre une protéine et une série de peptides de fusion (E6  peptides de l'ubuitine-ligase E6-AP).  2- Description du projet, méthodologie : Un criblage par Phage Display sera réalisé afin de sélectionner des ligands peptidiques liant des domaines PDZ. Ces séquences alimenteront la banque de séquences déterminées à partir des protéines connues pour lier E6. Ces ligands apporteront des informations sur la fonction potentielle de ces motifs PDZ, et plus généralement des protéines qui en disposent. Nous clonerons ensuite tous les domaines PDZ connus pour lier E6, ainsi qu'un ensemble de peptides correspondant aux extrémités C-terminales issues soit de protéines E6 oncogènes (protéines humaines répertoriées en tant que partenaires des mêmes domaines PDZ), soit des ligands peptidiques déterminés par la technique du Phage Display. Pour tous les complexes possibles entre ces deux séries de partenaires, nous chercherons à déterminer rapidement les informations de thermodynamiques, d'affinités et de cinétiques par Biacore, ainsi que les informations structurales par RMN. A cette étape, le projet se base principalement sur deux progrès méthodologiques récemment accomplis par nos équipes : d'une part, une méthode de marquage isotopique de protéines à bas coût en cyanobactéries photosynthétiques ; d'autre part, un programme d'attribution rapide des spectres RMN de protéines marquées. Les cyanobactéries seront utilisées pour produire à bas coût, plusieurs échantillons marqués sélectivement sur certains résidus pour chaque domaine PDZ. Cette étape facilitera l'attribution des spectres enregistrés par RMN, et accélérera ainsi l'interprétation des données d'interaction. Ces données seront ensuite comparées et analysées à la lumière des résultats obtenues par les autres techniques utilisées au laboratoire, telles que le Biacore et le Phage Display. Enfin, en parallèle à cett.