Projet ANR-12-BSV8-0017 – TransDis : Transcription et Maladies Génétiques
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Jean-Marc EGLY (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire)
Partenaires : Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire
Montant : 400000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 48 mois
Résumé : Transcription et Maladies génétiques.L'objectif de ce projet est de:- mieux comprendre les rôles joués par le complexe TFIIH, le Médiateur et les facteurs de réparation NER lors de la transcription des gènes.- déterminer comment des mutations au sein de ces différents facteurs perturbent la transcription des gènes et conduisent à diverses maladies génétiques.
Objectifs et caractère ambitieux du projetLes propriétés d'une cellule sont déterminées par l'information codée par son génome. Comprendre comment cette information est gérée en fonction du type cellulaire et de l’état de différenciation est un défi majeur pour la biologie moléculaire moderne. En ce sens, notre travail s’est cristallisé sur l’étude de la fonction du complexe TFIIH lors de la transcription et de la réparation de lésion au sein de l'ADN. Nos travaux ont permis de déterminer que des phénotypes observés chez des patients portant des mutations au sein de TFIIH proviennent de défauts lors de la transcription. Cependant, les bases moléculaires de tels défauts restent à ce jour incomprises. En outre, de récents travaux indiquent que la transcription et le maintien de l'intégrité génomique sont deux mécanismes profondément liés. Nos derniers résultats suggèrent que des facteurs de réparation de l'ADN (notamment les facteurs dits NER) sont impliqués, en association avec TFIIH, dans la transcription des gènes. De manière remarquable, des mutations au sein des facteurs NER sont également responsables de maladies génétiques comparables à celles associées à des mutations au sein de TFIIH.Nous aimerions donc mieux comprendre le rôle joué par TFIIH et les facteurs NER lors de la transcription. Par ailleurs, nous avons comme objectif de mieux appréhender le rôle du Médiateur lors de la transcription, un complexe connu pour interagir avec TFIIH et pour être à l’origine de différentes maladies génétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l'expression des gènes codant pour des protéines (ce qui correspond à l’aspect fondamental du projet) mais aussi de mieux appréhender l’étiologie de diverses pathologies, en ayant comme finalité de prévenir et guérir (l’aspect clinique du projet).
Méthodologie mise en oeuvreAfin de réaliser ce projet, nous étudierons tout particulièrement différents modèles de souris trangéniques portant des mutations soit dans TFIIH (souris d’ores et déjà établies dans notre laboratoire) soit dans le Médiateur. En effet, des souris portant différentes mutations dans le Médiateur (Med12/R961W, Med17/L371P, Med23/R617Q) sont actuellement générées. Ces modèles nous permettront de réaliser dans un contexte physiologique des analyses de l’expression des gènes (RT-PCR quantitative, microarrays), de recrutement de facteurs sur les promoteurs (expériences de ChIP), ainsi que des approches macroscopiques, histologiques (colorations H&E, Oil-red-O…) et biochimiques (immunoprécitpitations, western blots, purification de protéines…). En parallèle, diverses approches moléculaires et biochimiques seront réalisées à partir de cellules de patients portant différentes mutations au sein de TFIIH, du Médiateur ou des facteurs NER. Ces cellules nous permettront notamment d’étudier le rôle joué par les facteurs NER lors de la transcription et plus particulièrement lors de la formation des boucles de chromatine au niveau des promoteurs des gènes. Des immunoprécipitations de chromatine ainsi que de captures de conformation de chromatine seront entreprises. Par ailleurs, à partir de cellules de patients, nous génèrerons des cellules souches à pluripotence induite (hiPS) qui nous permettront d’étudier dans un contexte cellulaire donné les effets de différentes mutations. Le développement des hIPS est un travail en soi puisque cette technologie innovante doit être mise en place dans notre laboratoire.
Résumé de la soumission : Notre projet a pour objectif de mieux appréhender les mécanismes de régulation de l’expression des gènes codant pour des protéines. Jusqu’à ce jour, notre attention s’était particulièrement focalisée sur le complexe TFIIH, connu pour intervenir dans la transcription ainsi que dans la réparation de lésions au sein de l’ADN. Plusieurs maladies rares, comme le xeroderma pigmentosum (XP, parfois associé au syndrome de Cockayne XP/CS) et la trichothiodystrophie (TTD), sont associées à des mutations dans TFIIH. Ces maladies, que l’on retrouve chez des patients portant des mutations dans d’autres facteurs de réparation (XPC, XPA, RPA, XPG, XPF, CSB, soit les facteurs de réparation par excision resyntnèse de nucléotides NER) furent initialement définies comme étant des maladies de la réparation. Cependant, un certain nombre de phénotypes (stérilité, lipodystrophie, anomalies squelettiques) semble bien plus s’expliquer par un défaut d’action des hormones à l’échelle transcriptionnelle. Nous avons ainsi entrepris plusieurs travaux, et avons pu démontrer que des mutations au sein de TFIIH affectent le processus de transactivation médié par différents récepteurs nucléaires. De manière inattendue, de tels défauts ont été retrouvés dans des cellules provenant de patients portant des mutations au sein de facteurs de réparations, ce qui suggère que ces facteurs jouent un rôle (à ce jour inconnu) durant la transcription. De manière intéressante, diverses maladies génétiques résultent de mutations au sein d’autres partenaires transcriptionnels de TFIIH. C’est le cas notamment de mutations au sein d’un large complexe appelé Médiateur. Ces mutations conduisent à diverses pathologies, tel que le syndrome d’Opitz-Kaveggia (associé notamment à la mutation MED12/R961W), une atrophie cérébelleuse (associée à la mutation MED17/L371P) ou une déficience intellectuelle non syndromique (associée à la mutation MED23/R617Q). Bien que ces mutations soient clairement identifiées, leurs conséquences durant la transcription restent à ce jour incomprises.Le but de ce projet est donc :- de mieux comprendre le rôle que peut jouer TFIIH, les facteurs NER et le Médiateur durant la transcription.- de comprendre comment des mutations au sein de TFIIH ou l’un de ses partenaires perturbent la transcription des gènes et conduisent à diverses pathologies.De nombreuses approches expérimentales seront entreprises afin de répondre à de telles questions. Ce projet ambitieux, ayant un impact certain en santé humaine, impliquera notamment l’étude de différentes souris transgéniques. Par ailleurs seront générées des cellules souches pluripotentes humaines induites (iPS) à partir de différentes cellules provenant de patients portant des mutations au sein des facteurs d’intérêt. En fonction des phénotypes développés par les patients, ces cellules seront alors redifférenciées, ce qui nous permettra de définir dans un contexte cellulaire précis l’impact que pourrait avoir chaque mutation étudiée. In fine, ce travail nous permettra de mieux définir l’étiologie des pathologies résultant de mutations au sein de TFIIH ou de l’un de ses partenaires transcriptionnels. Ces travaux auront comme corollaire de contribuer à atténuer voire corriger les phénotypes de ces patients.
Résultats : Pour l'heure, le projet s'est développé depuis six mois avec la mise en place de différents outils biologiques, comme l'obtention de cellules hiPS et le suivi de la réalisation des nouveaux animaux transgéniques. En parallèle, nos premiers travaux sur les animaux transgéniques portant des mutations au sein de TFIIH ont révélé que le métabolisme osseux est différemment perturbé selon la nature des mutations. Les premiers travaux sur les facteurs NER ont permis de confirmer le rôle, notamment de XPC, dans la structure de la chromatine. Enfin, pour ce qui est du Médiateur, nos premiers travaux à partir de cellules de patients révèlent que le processus de transcription semble être différemment perturbé selon la nature des mutations.
Perspectives : Nous avons comme perspective de poursuivre ce projet (...), en apportant une attention toute particulière au développement des hiPS et des animaux transgéniques. En parallèle, diverses approches expérimentales (spectrométrie de masse, RT-PCR, ChIP, 3C…) seront entreprises selon le calendrier des tâches proposé dans notre projet.
Publications et brevets : Après 6 mois, aucune publication scientifique ou brevet n'a été obtenu.