Projet ANR-11-BS07-0019 – IBEF : Inhibition des Pompes d’Efflux Bactériennes
Programme : Blanc - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Jean-Marie PAGES (UNIVERSITE AIX-MARSEILLE II  [DE LA MEDITERRANEE])
Partenaires : Laboratoire de Cristallographie et RMN Biologiques; Interaction et Modulateurs de Réponses; Transporteurs Membranaires, Chimiorésistance et Drug-Design; Laboratoire public
Montant : 452920.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Dissection et inhibition des mécanismes d’expulsion des antibiotiques chez les bactéries résistantesComprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le transport des antibiotiques chez les bactéries à Gram-négatif et développer des molécules capables d’inhiber les transporteurs membranaires qui expulsent les antibiotiques et contribuent à la résistance bactérienne.
Anticiper et bloquer la résistance aux antibiotiques chez les bactéries MDRChez les bactéries à Gram négatif, les pompes d'efflux sont impliquées dans le phénotype de Multi-Drug-Resistance (MDR). Elles expulsent les antibiotiques et les biocides et favorisent également l'acquisition de mécanismes de résistance additionnels comme la mutation de cible ou l'altération de l'antibiotique. La pompe d’efflux AcrAB-TolC est active chez les isolats cliniques MDR d'entérobactéries. Notre projet consiste à étudier l'activité fonctionnelle de la pompe AcrB d'E. aerogenes, sa sélectivité pour divers substrats, la structure 3D et les sites d’affinités de la pompe pour les antibiotiques, l'identification des pharmacophores et la synthèse dirigée de molécules originales inhibant la pompe d’efflux. Ce programme de recherche devrait identifier les paramètres clés des pompes d’efflux et ainsi produire des molécules afin de bloquer ce mécanisme de résistance, ce qui permettrait de restaurer l’activité des antibiotiques sur les bactéries MDR. A un moment où aucune nouvelle famille d’antibiotiques n’est disponible en clinique, le développement de ce type de molécules capables de bloquer les mécanismes de résistance permettrait de développer une stratégie de lutte contre les bactéries MDR et leur dissémination.
Approches multidisciplinaires des pompes d’effluxPour atteindre les objectifs du programme, nous allons développer quatre axes expérimentaux: - l’analyse biologique et fonctionnelle de la pompe d’efflux (EP): cette partie comprend la détermination de l’activité de EP dans le niveau de résistance et sa détection dans les isolats MDR, l'identification de la sélectivité de la pompe (ß-lactamines, quinolones, etc), et la caractérisation des nouveaux inhibiteurs. - l’étude de modélisation et de dynamique moléculaire : nous utiliserons diverses méthodes (docking, dynamique libre ou dirigée) afin de générer un modèle pour le flux d'antibiotique dans AcrB. Ce modèle permettra d'étudier les sites possibles d'interactions dans la pompe. - l’analyse structurale de la pompe : la détermination de la structure de AcrB d'E. aerogenes (seule ou en complexe) déterminera les sites d'affinité. L’analyse en « modes normaux » (NMA) et la structure combinée permettront d'affiner le modèle pour les sites d’affinité. - l’analyse structure-activité (QSAR) et synthèse dirigée : les caractéristiques de molécules inhibitrices seront définies en utilisant les résultats de modélisation et de structure associés à l'analyse QSAR. La synthèse dirigée sera alors réalisée en adaptant les voies de synthèse chimiques développées précédemment par le partenaire.Ces diverses méthodes représentent une approche multi-disciplinaire de la bactériologie à la chimie de synthèse intégrant l’aspect structure, activité d’un mécanisme clé en biologie.
Résumé de la soumission : Chez les bactéries à Gram négatif, la surproduction des pompes d'efflux est impliquée dans le phénotype de Multi-Drug-Resistance (MDR). Les pompes d’efflux expulsent une large gamme de molécules dont les antibiotiques et les biocides. Elles favorisent également l'acquisition de mécanismes de résistance additionnels comme la mutation de cible ou l'altération de l'antibiotique. Une pompe d’efflux majeure, AcrAB-TolC appartenant à la famille des transporteurs RND, est active chez les isolats cliniques MDR d'entérobactéries et contribue à un niveau significatif de résistance. Notre projet associe des aspects biophysiques et structuraux, biochimiques, chimiques et microbiologiques à des expertises multidisciplinaires et complémentaires afin de déchiffrer les bases moléculaires du transport des antibiotiques. Dans ce programme, des points spécifiques seront ainsi étudiés : l'activité fonctionnelle de la pompe AcrB d'E. aerogenes, sa sélectivité pour divers substrats, la structure 3D des domaines d’affinités de la pompe pour les substrats, la modélisation de l’efflux des antibiotiques, l'identification des pharmacophores et la synthèse dirigée de molécules originales inhibant la pompe. Pour atteindre ces objectifs, nous allons développer quatre axes : - une analyse biologique et fonctionnelle de la pompe d’efflux (EP): cette partie comprend la détermination de l’activité de EP dans le niveau de résistance et sa détection dans les isolats MDR, l'identification de la sélectivité de la pompe (ß-lactamines, quinolones, etc), et la caractérisation des nouveaux inhibiteurs. - une approche de modélisation et de dynamique moléculaire : nous utiliserons diverses méthodes (docking, dynamique libre ou dirigée) afin de générer un modèle pour le flux d'antibiotique dans AcrB. Ce modèle permettra d'étudier les sites possibles d'interactions dans EP. - une analyse structurale de la pompe : la détermination de la structure de AcrB d'E. aerogenes (seule ou en complexe) déterminera les sites d'affinité. L’analyse NMA et la structure combinée permettront d'affiner le modèle proposé pour les sites d’affinité. - QSAR et synthèse dirigée : les caractéristiques de molécules inhibitrices seront définies en utilisant les résultats de modélisation et de structure associés à l'analyse QSAR. La synthèse dirigée sera alors réalisée en adaptant les voies de synthèse chimiques développées précédemment. L'activité de ces molécules sera évaluée sur la collection de souches caractérisées dans l'axe 1. Ce programme de recherche devrait déterminer: - les caractéristiques fonctionnelles, moléculaires et structurales de l'efflux des antibiotiques - les paramètres de nouvelles cibles localisées dans la pompe d'efflux impliquée dans les isolats MDR - la synthèse de nouvelles molécules capable de bloquer l'activité des pompes d’efflux. Une donnée majeure concerne la dynamique et le mécanisme de l’efflux: l'identification des pharmacophores est une donnée clé pour le design de molécules, e.g. la modification de groupes chimiques ayant une forte affinité pour les sites de la pompe (inhibiteur), ou la diminution de l'affinité induisant un défaut dans l'efflux (mauvais substrat) qui augmente la concentration en antibiotique. Les résultats obtenus sur les transporteurs représentent un gain important pour le biologiste, le physico-chimiste et le pharmaco-chimiste car un très petit nombre de données sont actuellement disponibles sur les protéines membranaires bactériennes (2 pompes RND seulement ont été cristallisées).
Résultats : Une analyse QSAR a été réalisée pour plusieurs séries de molécules synthétisées et testées pour leur activité biologique ; pour le groupe quinazolinone, nous avons pu déterminer plusieurs pharmacophores qui sont utilisés actuellement lors de synthèse rationnelle afin d’obtenir de nouvelles molécules potentiellement plus actives.
Le renforcement de la plateforme d’analyse biologique permet maintenant de préciser l’activité des molécules sur les pompes d’efflux en temps réel et d’évaluer leur impact sur les membranes biologiques. 
L’expression de AcrB et les premières étapes de purifications ont été engagées; les premiers problèmes rencontrés sont associés à des problèmes de dégradation et de présence de formes dégradées ont été surmontés et nous sommes maintenant passés à un stade de production de quantité plus importante afin de pouvoir fournir suffisamment de matériel pour les études de cristallisation.
Plusieurs de ces concepts/méthodologies originaux ont été présentées lors de la dernière Gordon research Conference sur « Multi-Drug Efflux Systems » Ventura, USA 2013.
Ces résultats feront l’objet de prochaines publications rassemblant les données synthèse, structure, activité et modélisation de ces premières séries de nouveaux chimio-réversants actifs sur des bactéries MDR.
Perspectives : L’émergence des bactéries MDR pose un problème crucial en santé publique (rapports ECDC et DG-SANCO, >25000 morts par an). Dans le même temps, le nombre de nouveaux antibiotiques disponibles et de nouvelles molécules étudiées est dramatiquement insuffisant. Ce projet doit permettre de renforcer notre arsenal thérapeutique mis en échec par les agents infectieux MDR et le manque actuel de nouvelles molécules originales. Avec les résultats acquis par les partenaires et l’utilisation actuelle des inhibiteurs de ß-lactamases, à la fois en clinique (antibiothérapie) et en diagnostic (des ß-lactamases), la conception d’inhibiteurs d’efflux s’adressera à plusieurs familles d’antibiotiques et à plusieurs pathogènes bactériens MDR.
Publications et brevets : Publications
•	Handzlik J, Szymanska E, Alibert S, Chevalier J, Otrebska E, Pekala E, Pagès J.-M, Kiec-Kononowicz K. Search for new tools to combat Gram-negative resistant bacteria among amine derivatives of 5-arylidenehydantoin. Bioorgan. Med. Chem., 2013, 21:135-45
•	Masi M, Pagès J.-M. Structure, function and regulation of outer membrane proteins involved in drug transport in Enterobactericeae: the OmpF/C – TolC case. The Open Microbiology Journal , 2013, 7: 1-12.
•	Valade E, Davin-Regli A, Bolla Jm, Pagès J.-M. Bacterial membrane, a key for controlling drug influx and efflux. Antibiotics - Targets, Mechanims and Resistance, Wiley Publications, 2013, pp217-240.
•	Pagès J.-M., Monlezun L, Broutin I, Davin-Regli A. Les mécanismes d’efflux et la résistance chez P. aeruginosa. Revue Francophone des Laboratoires, 2011, 435, 63-72.
•	Otrebska-Machaj E, Chevalier J, Handzlik J, Szymanska E,  Mazurkiewicz J, Boyer G, Bolla J.M, Kiec-Kononowicz K,  Pagès J.-M, Alibert S. Efflux pump blockers in Gram-negative bacteria: new hydantoin based modulators to improve antibiotic activity. En correction pour soumission.