Projet ANR-14-CE13-0019 – Nicopto : Pharmacologie optogénétique pour le contrôle biochimique précis de la neuromodulation cholinergique
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401)
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Monsieur Alexandre Mourot (Institut neuroscience Paris Seine)
Partenaires : Laboratoire public
Montant : 324648.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 48 mois
Résumé : Contrôler les récepteurs nicotiniques du cerveau avec la lumière.Le projet Nicopto propose de développer des techniques permettant de contrôler à distance et avec une précision millimétrique des récepteurs neuronaux endogènes chez l’animal. Ces techniques novatrices permettraient, à terme, de réaliser des avancées majeures dans la compréhension du rôle de ces récepteurs dans le traitement de l’information neuronale.
Implémentation in vivo de techniques de pharmacologie optogénétique.L’optogénétique est une technique moderne, qui est en train de révolutionner les neurosciences, en permettant d’activer ou d’inhiber spécifiquement certains neurones à l’aide de la lumière. La grande majorité des développements technologiques en optogénétique sont basés sur l’utilisation de protéines bactériennes, qui permettent d’induire ou d’inhiber optiquement l’activité électrique d’un réseau neuronal. L’approche que nous développons est différente. Au lieu d’introduire des protéines bactériennes photosensibles dans les neurones de souris, nous rendons photosensibles les protéines (récepteurs) qui y sont naturellement présentes. Notre technique, appelée pharmacologie optogénétique, a pour but de contrôler avec une spécificité et une résolution temporelle sans précédant un récepteur particulier, et de comprendre ainsi le rôle de ce récepteur dans une voie neuronale donnée. A terme, l’idée serait de pouvoir induire ou inhiber un comportement chez l’animal, juste en jouant avec la lumière. La pharmacologie optogénétique a principalement été utilisée ex vivo dans des préparations neuronales « simples ». Le but de ce projet est de déployer des stratégies permettant d’utiliser cette technique chez l’animal in vivo, et d’utiliser cette technique afin d’établir un lien causal entre l’activité des récepteurs nicotiniques (lesquels, dans quels neurones ?) et la mise en place de comportements addictifs chez l’animal. Pouvoir contrôler   optiquement l’activité de récepteurs naturellement présents dans les neurones a un intérêt retentissant non seulement en neurosciences mais aussi en biotechnologies et en sciences médicales.
Contrôle optique des récepteurs nicotiniques impliqués dans la voie de l’addiction.Pour pouvoir implémenter la pharmacologie optogénétique chez l’animal in vivo, il nous faut remplir certaines conditions expérimentales. En premier lieu il nous faut amener le gène qui encode pour le récepteur modifié génétiquement. Pour ce faire nous utilisons des virus. Il faut ensuite amener l’interrupteur chimique qui va s’ancrer sur le récepteur modifié, et véritablement permettre de le rendre photosensible. Nous effectuons des injections locales d’interrupteur chimique, dans le cerveau des souris. Enfin il nous faut amener la lumière et une électrode pour enregistrer l’activité des neurones sous différentes conditions lumineuses. Nous avons mis au point un système nous permettant d’illuminer le neurone enregistré.
Résumé de la soumission : Les neuromodulateurs tels que la dopamine (DA), la sérotonine ou l’acétylcholine (ACh) ont un décours spatio-temporel très précis, tonique ou phasique selon le contexte. Ces neuromodulations sont fondamentales au développement et à l’adaptation du système nerveux, et sont à la base de fonctions supérieures telles que l’apprentissage et la mémoire. Un neuromodulateur produit différents effets physiologiques suivant le récepteur sur lequel il se lie. Il existe en effet de nombreux types et sous-types de récepteurs qui sont couplés à différentes voies de signalisation intracellulaires. La neuromodulation dépend donc autant du neurotransmetteur relargué à la synapse que du type de récepteur sur lequel il se lie. Il n’y a actuellement aucune méthode permettant une activation/inhibition rapide, aigüe d’un récepteur spécifique dans un neurone donné et chez l’animal vivant. Les agents pharmacologiques traditionnels, même sélectifs, activent ou inhibent indifféremment tous les neurones avec lesquels ils sont en contact. Les techniques génétiques produisent des phénotypes où des compensations développementales peuvent se superposer aux effets de délétion du récepteur. Les outils optogénétiques actuels (opsines microbiennes) ne permettent pas de répliquer la nature complexe des neuromodulations. Pouvoir activer ou inhiber un récepteur spécifique dans un type de neurone donné permettrait d’améliorer considérablement notre compréhension des fonctions neuromodulatrices dans le traitement de l’information et la plasticité neuronale. A cette fin, nous avons développé une méthode opto-chimique  versatile permettant de photocontrôler des récepteurs pharmacologiques. L’idée est d’attacher covalemment un ligand photosensible sur un récepteur génétiquement ingénierée, permettant ainsi de contrôler ce récepteur de manière rapide et spécifique avec la lumière. Dans ce projet, nous implémenterons cette technique dans le cerveau de souris in vivo. Nous nous focaliserons sur le neuromodulateur acétylcholine (ACh) et son récepteur canal (nAChR). Les nAChR neuronaux sont impliqués dans un grand nombre de processus physiologiques. Par ailleurs, des perturbations de la neurotransmission cholinergiques peuvent conduire à des états pathologiques tels que la maladie d’Alzheimer ou de Parkinson, la schizophrénie, ou l’addiction à la nicotine. Les neuromodulateurs  tels que l’ACh ont des effets diffus, à distance et à long terme, ce qui nécessite de les étudier in vivo. Dans un premier temps, nous développerons de nouveaux récepteurs nicotiniques photorégulable (LinAChRs) et nous optimiserons ces outils pour les applications in vivo (But no 1). Notre but sera ensuite d’enregistrer les patrons de décharge d’un seul neurone in vivo, tout en photorégulant l’activité de nAChRs présents à sa surface.  Pour ce faire, nous développerons des stratégies permettant 1) de cibler génétiquement des régions et des types neuronaux spécifiques ; 2) de bio-conjguer le photoswitch chimique sur le récepteur ré-ingénieré et 3) d’amener la lumière dans l’animal vivant, tout en enregistrant l’activité électrique d’un seul neurone (But no 2). Enfin, nous utiliserons ces nouvelles techniques in vivo pour comprendre comment la sous-unité ß2 du nAChR module finement le système dopaminergique dans les premières étapes de l’addiction à la nicotine (But no 3). Notre projet portera sur le récepteur nicotinique et son rôle dans la modulation d’un noyau dopaminergique particulier: l’aire tegmentale ventrale (ATV). Néanmoins, nous sommes persuadés que les stratégies développées ici seront adaptables par les neurobiologistes et les chimistes à des récepteurs (muscarinique, dopaminergique…), types cellulaires, circuits neuronaux ou modèles animaux extrêmement variés.  Atteindre ce but pourrait révolutionner notre compréhension de la physiologie et de la plasticité neuronales, et permettrait des avancées majeures dans l’étiologie et le traitement des maladies neuropsychiatriques.
Résultats : Les neurones qui synthétisent la dopamine (ou neurones dopaminergiques) sont impliqués dans les processus de récompenses naturelles, mais leur activité est détournée par les drogues qui créent une dépendance, telle que la nicotine. La nicotine agit sur les récepteurs nicotiniques qui sont localisés sur ces neurones. Grâce à la précision du stimulus lumineux, nous avons pu inhiber sélectivement les récepteurs nicotiniques des neurones dopaminergiques, sans toucher aux récepteurs nicotiniques des autres zones du cerveau. Nous avons pu montrer que l’activité de ces neurones est modulée par ces récepteurs. De plus, nous avons pu photo-inhiber l’action de la nicotine sur ces neurones. Ces expériences ont été réalisées sur animal anesthésié. Néanmoins, si nous réussissons à développer ces mêmes techniques chez l’animal éveillé, il est envisageable de pouvoir utiliser la lumière afin d’inverser le coté renforçant de la nicotine.
Perspectives : Pouvoir contrôler des récepteurs neuronaux endogènes avec la lumière est un véritable défi technologique que nous essayons de relever dans ce projet. Atteindre ce but permettrait d’avoir une meilleure compréhension, au niveau moléculaire, des mécanismes de fonctionnement du cerveau, à la fois au niveau physiologique mais aussi pathologique. Nous concentrons nos efforts sur les récepteurs nicotiniques et leurs rôles dans l’addiction à la nicotine. Néanmoins les techniques que nous développons ici seront adaptables à d’autres récepteurs, circuits neuronaux et animaux modèles.
Publications et brevets : Nous venons de publier un article de méthode sur le développement de récepteurs nicotiniques neuronaux photo-contrôlables. Le premier auteur est le post-doctorant financé par l’ANR; le deuxième auteur est le doctorant travaillant sur le même projet:
Lemoine D, Durand-de Cuttoli R, Mourot A. «Optogenetic Control of Mammalian Ion Channels with Chemical Photoswitches.» Methods Mol Biol. 2016;1408:177-93.
Romain Durand de Cuttoli a également présenté ses résultats sous forme de poster au congrès de la Société de Neurosciences, Chicago, octobre 2015.
Par ailleurs j’ai publié en co-auteur un article sur le rôle des récepteurs nicotiniques dans la curiosité (Naudé et al., Nat Neurosci. 2016 Mar;19(3):471-8.). Voir la revue de presse du CNRS : http://www2.cnrs.fr/presse/communique/4381.htm