Projet ANR-13-ISV8-0001 – HTRNAMod : Technologie à haut débit pour la détection des nucléotides modifiés des ARN
Programme : Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SVSE 8) 2013
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Iouri MOTORINE (Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire (IMoPA) UMR 7365)
Partenaires : Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire; Johannes Gutenberg-Universität Mainz Institute of Pharmacy and Biochemistry
Montant : 270000.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 36 mois
Résumé : Les ARN cellulaires matures contiennent de nombreux nucléotides modifiés qui sont tous formés de manière post-transcriptionnelle, par l’action spécifique d’enzymes de modifications. Notre connaissance actuelle sur les modifications des ARN est limitée aux ARN stables et abondants tels que les ARNt, ARNr et snRNA, très peu d’informations sont disponibles sur la présence et la localisation précise de ces modifications au sein d’autres ARN cellulaires comme les snoRNAs, les petits ARN régulateurs et les ARNm.
Les développements récents ont apporté une dimension nouvelle dans la compréhension des rôles et des fonctions cellulaires des nucléotides modifiés des ARN en impliquant un caractère épigénétique des modifications. Ces développements remettent en question le concept de modification covalente stable, durable et constante durant toute la vie des molécules d’ARN. Au contraire, de fortes indications renforcent l’idée que les modifications des ARN seraient transitoires et régulées, potentiellement d’importance égale à l’épissage alternatif ou à l’édition A en I. Des publications récentes de très haut niveau ont clairement mis en évidence la présence de modifications dynamiques et hautement régulées  qui sont utilisées entre autre pour l’adaptation à certaines conditions de croissance. Ce phénomène a été reporté pas seulement pour les ARNm, mais également pour les ARNt, dont les modifications ont toujours été considérées comme définitives, et une extension de ce concept aux ARN régulateurs est facilement concevable. Malgré l’importance primordiale de ces modifications dans la régulation du métabolisme cellulaire, leur présence et leur localisation précise dans différents ARN cellulaires n'est pas connus. Cependant, des progrès technologiques dans le domaine, bien que limités à certaines modifications d’ARN, ont été possibles grâce à l’utilisation du séquençage à haut-débit ou à la spectrométrie de masse.
Les limitations existantes sont : (i) l’élucidation de la structure chimique précise des nucléotides modifiés dans un ARN donné et (ii) la cartographie précise de leur position exacte. Actuellement, l’analyse de molécules d’ARN individuelles est difficile et laborieuse, et est limitée par des quantités importantes de matériel de départ pour une analyse complète.
Afin de combler ces lacunes, nous proposons de développer des technologies innovantes permettant l’analyse des modifications des ARN utilisant la combinaison des technologies à haut-débit et la spectrométrie de masse.
Comme stratégie principale, nous allons combiner les 2 principes actuellement utilisés pour la détection des modifications à haut débit, à savoir la transformation chimique sélective et l’arrêt de l’élongation d’amorce par la transcriptase inverse. Des préparations d’ARN dont le profil de modification est connu seront traitées avec de nombreux agents chimiques décrits ou proposés comme réagissant spécifiquement avec les nucléotides modifiés pour altérer le comportement de la transcriptase inverse.
Ce comportement modifié sera utilisé pour définir une signature de la transcriptase inverse détectable par une analyse à haut débit sur le transcriptome entier pour identifier les sites potentiels au sein des ARN candidats. Pour la validation, les espèces ARN renfermant ces sites putatifs seront isolés par une technologie assistée par un robot en quantité suffisante pour l’analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Cette dernière sera ensuite appliquée pour prouver sans ambiguïté l’existence et la présence des modifications aux sites prédits.
L’objectif majeur de ce projet est de développer des outils modernes et efficaces pour l’analyse des modifications des ARN à l’échelle du transcriptome entier, avec des applications pour analyser le changement du profil des modifications des ARN dans le développement normal et pathologique.