Projet ANR-10-ALIA-0016 – SURFING : Starter SURFace against INFlammation of the Gut : Rôle des protéines de surface de Lactobacillus delbrueckii et Propionibacterium freudenreichii dans la modulation de l’inflammation intestinale.
Programme : Alimentation et industries alimentaires (ALIA)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Gwénaël JAN (INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - CENTRE DE RECHERCHE DE RENNES)
Partenaires : Actilait ACTILAIT; Centre National Interprofessionnel de l'Économie Laitière; Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé Humaine; Mathématique, Informatique et Génome; Science et Technologie du Lait et de l'Oeuf; Centre d'Infection et d'Immunité de Lille; LABORATOIRES STANDA
Montant : 587381.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Les bactéries des produits laitiers fermentés pour combattre les maladies inflammatoires de l’intestin ?Les bactéries consommées abondamment dans les fromages et les yaourts révèlent un potentiel bénéfique anti-inflammatoire. Le but du projet est de comprendre (et à terme d’exploiter) leurs effets. Un élément de réponse au problème croissant des maladies digestives inflammatoires ?
Repérer dans les ferments des produits laitiers fermentés des bactéries capables de combattre les MICI, et comprendre ce qui les distingue des bactéries n'ayant pas ces propriétés.Les maladies inflammatoires chroniques de l’Intestin (MICI) constituent un problème de santé publique émergent dans les pays industrialisés. Elles sont liées à certaines prédispositions génétiques, au style de vie et à l’alimentation. Elles peuvent être en partie traitées par l’ingestion de bactéries probiotiques, sélectionnées pour leurs propriétés immunomodulatrices anti-inflammatoires. Dans ce contexte, l’effet des principales bactéries probiotiques commercialisées a été largement étudié. Propionibacterium freudenreichii (Pf) et Lactobacillus delbrueckii (Ld) sont deux espèces largement consommées dans les produits laitiers (fromages et laits fermentés) qui, elles aussi, ont un potentiel anti-inflammatoire, encore très peu connu.  Le projet SURFING vise à étudier chez ces dernières bactéries la biodiversité des protéines de surface, et à expliquer la biodiversité des propriétés immunomodulatrices. Pour répondre à cette question, les objectifs de notre projet sont les suivants :i) Montrer que l’ingestion de certains ferments Pf et Ld peut avoir un impact anti-inflammatoire dans le contexte des MICI ;ii) Identifier les protéines de surface responsables des propriétés immunomodulatrices ; iii) Identifier les supports moléculaires de la biodiversité par une approche intégrative ; iv) Décrire les mécanismes moléculaires de la réponse immunitaire induite ; v) Vérifier la présence de ces protéines bactériennes de surface aux propriétés immunomodulatrices dans les ferments et les produits laitiers ; vi) Etablir et communiquer un savoir précieux et aujourd’hui peu documenté sur les propriétés santé de souches de ferments auprès de PME et acteurs Industriels de la filière lait, via le centre interprofessionnel CNIEL.
Rechercher des protéines bactériennes immunomodulatrices et s’assurer de leur expression dans des produits laitiers sélectionnésLa démarche suivie dans SURFING repose sur une approche intégrative, de la molécule à l’aliment fonctionnel.Les propriétés immunomodulatrices de souches appartenant aux 2 espèces sont quantifiées et classées in vitro sur 2 modèles, leucocytes humains (PBMC) et cellules épithéliales coliques (HT-29), par quantification des cytokines immunomodulatrices et par suivi de l’activation de la voie NF?B, respectivement. Pour chaque espèce huit génomes ont été totalement séquencés et annotés. Les gènes potentiellement responsables des effets immunomodulateurs sont identifiés par une approche de génomique, transcriptomique et protéomique comparative (nombre, nature et abondance). En particulier, les protéines de surface de ces souches sont identifiées par des approches de protéomique et bioinformatique combinées. Les protéines de surface potentiellement impliquées sont analysées par comparaison de l’effet immunomodulateur in vitro de fractions enrichies, et de mutants de délétion ou de surexpression des gènes correspondants. Les propriétés immunomodulatrices des souches sont validées dans un contexte de colite expérimentale induite chez la souris. L’expression des gènes clés est vérifiée au sein de fromages et de laits fermentés modèles par une approche transcriptomique et protéomique mise au point par les partenaires sur différentes matrices laitières. Les propriétés anti-inflammatoires des souches, apportées dans une matrice laitière, fromage ou lait fermenté, étudiées in vivo, valideront la preuve de concept dans une matrice complexe.
Résumé de la soumission : Les maladies inflammatoires chroniques de l’Intestin (MICI) constituent l’un des problèmes majeurs de santé publique émergents dans les pays industrialisés. Elles touchent aujourd’hui 1% de la population dans ces pays. Elles sont liées, au-delà de certaines prédispositions génétiques, au style de vie et à l’alimentation. Elles ont pour cause un dérèglement du système immunitaire aboutissant à un déséquilibre entre la protection contre les pathogènes et la tolérance vis-à-vis des bactéries commensales de l’intestin. L’inflammation intestinale, facteur clé des MICI, peut être en partie traitée par l’ingestion de souches bactériennes sélectionnées pour leurs propriétés immunomodulatrices anti-inflammatoires. Dans ce contexte, l’effet des principales bactéries commercialisées dans ce but, appartenant aux genres Bifidobacterium et Lactobacillus, a été largement étudié. Mais dans peu de cas seulement les mécanismes liés aux propriétés anti inflammatoires ont été élucidés.   Propionibacterium freudenreichii (Pf) et Lactobacillus delbrueckii (Ld) sont deux espèces bactériennes largement employées comme ferments dans les produits laitiers. Malgré cette utilisation importante,  le potentiel anti-inflammatoire de ces deux espèces est très peu connu. Pf est massivement ingéré via la consommation de fromages à pâte pressée cuite (FPPC) et d’un nombre croissant d’autres fromages dans lesquels ce ferment est utilisé pour améliorer les qualités organoleptiques. Ld est très abondant dans les produits laitiers fermentés. La sous-espèce lactis est de plus en plus utilisée dans les FPPC pour ses propriétés acidifiantes. Par exemple, un gramme d’Emmental apporte 108 à 1010 cellules de Pf et 103 à 109 cellules de Ld, qui sont potentiellement immunomodulatrices. La sous-espèce bulgaricus de Ld est également abondamment consommée dans les divers laits fermentés, dont le yaourt. Dans le projet « SURFING » nous nous intéresserons aux propriétés immunomodulatrices de ces deux  ferments. En effet, les fromages et laits fermentés déjà sur le marché apportent des quantités importantes de Pf et de Ld. Ces bactéries peuvent donc contribuer à traiter les MICI, notamment via des composés de surface spécifiques aux propriétés anti-inflammatoires diverses qu’il est essentiel de caractériser. Nos résultats préliminaires ont révélé des propriétés anti-inflammatoires très souche-dépendantes chez Pf et Ld. Une souche de chaque espèce a été testée dans un modèle de colite expérimentale chez la souris et a révélé un effet protecteur prometteur. Les objectifs auxquels « SURFING » répond sont : i) montrer que l’ingestion de Propionibacterium freudenreichii  et Lactobacillus delbrueckii peut avoir un impact anti-inflammatoire dans le contexte des MICI, ii) identifier les protéines de surface responsables des propriétés immunomodulatrices chez les deux espèces, iii) étudier les mécanismes moléculaires de  la réponse immunitaire in vitro  et in vivo induits chez la cellule épithéliale humaine et enfin iv) vérifier la présence des protéines de surface aux propriétés immunomodulatrices en conditions réelles dans des fabrications de ferments et de produits laitiers avec Pf et Ld comme ferment. Pour mener à bien ces objectifs, nous nous appuierons sur les résultats obtenus dans le cadre de programmes AIP BioRessources 2009, où nous avons séquencé le génome de 7 souches de Pf,  (1 génome de Pf étant déjà disponible par ailleurs) et 6 de Ld (2 génomes de Ld étant disponibles par ailleurs). Ces données génomiques constituent la base génétique nécessaire pour l’étude d’une telle biodiversité fonctionnelle. Différentes approches seront menées en parallèle : bioinformatique, biologie moléculaire, protéomique, transcriptomique, et immunologique dans le but d’identifier des composés de surface impliqués dans les propriétés anti-inflammatoire des deux espèces.
Résultats : Les premiers résultats in vitro montrent une grande variabilité entre les souches de ces deux bactéries laitières, avec pour certaines un effet immunomodulateur supérieur ou égal à celui de bactéries probiotiques reconnues. Cette variabilité concerne les propriétés immunomodulatrices observées in vitro, la nature et la quantité de protéines exposées en surface, mais aussi les gènes codant pour ces protéines. Chez Pf, les souches possédant un polysaccharide de surface sont faiblement anti-inflammatoires. Une analyse statistique en cours recherche les corrélations entre la présence de protéines clés et les profils immunomodulateurs les plus anti-inflammatoires. Les premiers résultats ont montré que 13 gènes sont corrélés positivement ou négativement au phénotype et 6 gènes sont corrélés à la présence/ absence de protéines en surface de la bactérie. Une puce ADN pangénomique a été créée pour le projet. Elle va permettre de trouver les gènes différentiellement exprimés selon le profil immunomodulateur des souches de Pf et de Ld. La suite du projet a pour objectif de confirmer le lien entre certaines protéines clés et le potentiel immunomodulateur, in vitro et in vivo. Pour cela, la performance protectrice de 5 souches de Pf ainsi que de 5 souches de Ld, sélectionnées selon leur diversité immunologique, a été analysée dans 2 modèles distincts de colite expérimentale chez la souris. Enfin, des produits laitiers fermentés seront développés et leurs effets anti-inflammatoires recherchés in vivo dans ces contextes de colite, intégrant ainsi la notion associée de matrice laitière aux propriétés intrinsèques des souches.
Un site internet assurant l’interface entre la Recherche, les Industriels et le Grand Public est en cours d’élaboration pour communiquer les faits marquants du projet.
Perspectives : Les perspectives, à long terme, sont des études précliniques et cliniques visant à tester l’effet immunomodulateur, non pas de préparations probiotiques séchées, mais de produits laitiers frais fermentés obtenus à l’aide de souches bactériennes aux propriétés bioactives que nous aurons démontrées.
Pour les scientifiques, les retombées attendues sont une meilleure compréhension des molécules bactériennes impliquées dans l’interaction avec l’hôte. Pour les professionnels de la filière laitière, il s’agit de sélectionner des souches bioactives et de mieux connaitre leurs levains. Pour le publique, la communication autour du projet SURFING visera à renforcer la conscience des bénéfices liés à la consommation de produits laitiers fermentés.
Publications et brevets : Le projet SURFING a été annoncé et décrit dans des congrès internationaux :
International Probiotic Conference 2011, Kosice, Slovaquie, Juin 2011 ; Probiotech 2011, Milano, Italia ; FEMS 2011, 4th Congress of European microbiologists, Geneva, Switzerland, 26-30 June 2011 ; Microbes for health symposium, Paris, France, 1-2 December 2011 ; INRA-Rowett Symposium on Gut Microbiology, Clermont-Ferrand, France, 17-20 June 2012 ; JOBIM 2012, Rennes, Le Maréchal et al. Combination of in silico and proteomic approaches to identify candidate genes responsible for the immunomodulatory properties of Propionibacterium freudenreichii.
Les premiers résultats ont été publiés dans des journaux internationaux :
Deutsch et al. 2012. Appl. Environ. Microbiol. ; Cousin et al. 2012. Food Microbiol. ; Van de Guchte et al. 2012 Curr. Opin. Microbiol.