Projet ANR-13-JS07-0004 – GAG-Sorting : Exploration des mécanismes de bifurcation des GAGs par synthèse chimique de substrats/inhibiteurs des glycosaminyltransférases
Programme : JCJC - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (JCJC SIMI 7)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Madame Chrystel LOPIN-BON (Institut de Chimie Organique et Analytique)
Partenaires : Institut de Chimie Organique et Analytique
Montant : 174720.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 48 mois
Résumé : Synthèse de nouvelles molécules complexes à visée thérapeutique : étude des enzymes impliquées dans la biosynthèse des protéoglycanesLes protéoglycanes sont des macromolécules impliquées dans de nombreux processus biologiques naturels mais également dans la pathogénèse de plusieurs maladies tels que l’arthrose, la maladie d’Alzheimer et le cancer. Nous nous proposons de synthétiser de nouvelles molécules afin de mieux comprendre les enzymes et plus particulièrement les glycosaminyltransférases impliquées dans la biosynthèse des protéoglycanes.
Synthèse d'une large collection d'oligosaccharides en tant que substrats potentiels des deux enzymes EXTL3 et CSGalNAcT-1Bien que la plupart des enzymes impliquées dans la biosynthèse des protéoglycanes aient été identifiées, leur mécanisme d’action moléculaire reste obscure. Nous allons cibler notre étude sur deux glycosaminyltransférases humaines qui interviennent dans la biosynthèse : EXTL3 et CSGalNAcT-1. A cette fin, nous proposons de mettre au point de nouvelles méthodes de synthèse efficaces afin d'accéder à de nouveaux oligosaccharides sulfatés ou non comme substrats potentiels des enzymes ciblées. De plus, une large collection d'oligosaccharides diversement substitués sera synthétisée comme inhibiteurs spécifiques potentiels de EXTL3 et CSGalNAcT-1. Les nouveaux composés obtenus seront ensuite testés par nos partenaires biologistes. Une meilleure compréhension des mécanismes d'action des enzymes permettra non seulement de fournir un aperçu du processus biologique fondamental mais constituera également un pas en avant vers le développement de nouvelles thérapies à base d’oligosaccharides.
Développement de nouvelles voies de synthèses chimiques ou chimioenzymatiques d'oligosaccharides diversement substituésUne première partie du projet est basée sur la synthèse de nouveaux oligosaccharides sulfatés ou non. L'accès à ces composés se fera par voies chimiques classiques en utilisant des techniques de protection/déprotection, de glycosylation ainsi que de sulfatations. Le développement de nouvelles voies d'accès incluant notamment des synthèses chimio-enzymatiques à l’aide de sulfatases est également visé.La synthèse totale de toutes les possibilités d'oligosaccharides sulfatés devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle des sulfatations sur la spécificité de substrats de ces enzymes.Dans une deuxième partie du projet, nous envisageons de synthétiser une collection d'oligosaccharides modifiés (par des fluor, des méthoxy....) en tant qu'inhibiteurs potentiels des enzymes ciblées. Parallèlement à l’aspect synthétique du projet, de nouveaux outils et méthodes seront développés pour produire les enzymes EXTL3 and CSGalNAcT-1 humaines et évaluer leur activité enzymatique vis-à-vis des nouveaux oligosaccharides synthétisés.
Résumé de la soumission : Les proteoglycanes (PGs) sont une famille de macromolécules complexes caractérisées par la présence de chaînes de glycosaminoglycanes (GAG) liées de façon covalente à une protéine porteuse. Les GAGs jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques tels que la croissance et la prolifération cellulaires, le développement embryonnaire et la cascade de coagulation. Ils sont aussi impliqués dans  la pathogénèse de plusieurs maladies incluant l’arthrose, la maladie d’Alzheimer et le cancer. La biosynthèse des chaînes de PG-GAG implique l’action séquentielle de glycosyltransférases (GTs) responsable de la formation d’une séquence tétrasaccharidique GlcA-ß-1,3-Gal-ß-1,3-Gal-ß-1,4-Xyl-ß-O- liée à un résidu L-sérine de la protéine porteuse. Cette zone de liaison sert d’amorce pour la polymérisation des deux types de chaînes de GAG : l’heparine/sulfates d’héparane (Hep/HS) et les sulfates de chondroitine/sulfates de dermatane (CS/DS). Au cours de l’élongation, les chaînes de GAG sont modifiées par l’action coopérative de multiples sulfotransférases et épimérases pour conduire à la structure glycosaminoglycanique complexe finale. Il a été montré que la zone de liaison pouvait être modifiée par sulfatation ou phosphorylation mais le rôle exact de ces substitutions n’a pas encore été totalement élucidé et il a été suggéré que les groupements phosphate et/ou sulfate présents sur la zone de liaison pouvaient représenter un signal biosynthétique de tri contrôlant la maturation et la croissance des chaînes de GAG. Bien que la plupart des GTs impliquées aient été identifiées, leur mécanisme d’action moléculaire reste obscur. L’objectif principal du projet est d’accroitre notre connaissance sur les voies de biosynthèse des GAGs et plus particulièrement sur le mécanisme catalytique des GTs impliquées. Nous allons cibler notre étude sur deux GTs humaine : EXTL3 et CSGalNAcT-1 qui orientent la biosynthèse vers respectivement les Hep/HS ou les CS/DS. A cette fin, nous proposons de mettre au point de nouvelles méthodes de synthèse efficaces, incluant notamment des synthèses chimio-enzymatiques à l’aide de sulfotransférases, afin de synthétiser de nouveaux trisaccharides sulfatés ou non de la zone de liaison comme substrats potentiels des GTs cibles. La synthèse totale de toutes les sulfoformes possibles des oligosaccharides devrait nous permettre de mieux comprendre le mécanisme des GTs impliquées lors de l’orientation des chaînes de GAG et d’éclaircir le rôle des sulfatations sur la spécificité de substrats de ces GTs. De plus, une large collection de disaccharides de la zone de liaison diversement modifiés sera synthétisée comme inhibiteurs spécifiques potentiels de EXTL3 ou de CSGalNAcT-1. Parallèlement à l’aspect synthétique du projet, de nouveaux outils et méthodes seront développés pour (i) produire les enzymes humaines recombinantes EXTL3 et CSGalNAcT-1 et (ii) évaluer leur activité enzymatique vis-à-vis des nouveaux oligosaccharides synthétisés. Une meilleure compréhension des mécanismes à la base de la bifurcation du processus de synthèse vers l’un ou l’autre type de GAG permettra non seulement de fournir un aperçu du processus biologique fondamental mais constituera également un pas en avant vers le développement de nouvelles thérapies à base d’oligosaccharides.
Résultats : A ce jour, plusieurs trisaccharides et tétrasaccharides sulfatés ont été synthétisés et sont en cours de test sur CSGalNAcT-1 qui a été exprimée et isolée par nos partenaires biologistes. La synthèse de disaccharides est également en cours afin d'étudier l'influence de la longueur de chaîne sur l'activité enzymatique.
Nous avons également initié la synthèse d'oligosaccharides modifiés et avons notamment isolé un disaccharide 6-désoxy.
Perspectives : Nous envisageons de compléter la collection d'oligosaccharides sulfatés ou modifiés afin d'étudier l'influence des sulfatations et des modifications sur l'activité enzymatique. L'introduction d'un atome de fluor ou d'un  groupement méthoxy est actuellement en cours d'étude.
Le développement de nouvelles voies de synthèse est également envisagé notamment avec l'utilisation de sulfatases qui pourraient nous permettre d'accéder à des motifs sulfatés de façon efficace et régiosélective.
Publications et brevets : Listes des communications liées au projet :
1. Conférence invitée : Lopin-Bon, C. ; Fournel-Gigleux, S.  25ième journée Journées du Groupe Français des Glucides, Mai 2014 – Paris
2. Conférence invitée : Lopin-Bon, C.  Novembre 2014 - Amiens
3. Communication orale : Ayela, B.; Poisson, T. ; Pannecoucke, X. ; Lopin-Bon, C. Journées de la Section Régionale Centre-Ouest de la Société Française de Chimie, Février 2015 - Orléans.
4. Poster : Ayela, B. Poisson, T. ; Pannecoucke, X. ; Lopin-Bon, C. 25ième journée Journées du Groupe Français des Glucides, Mai 2014 – Paris 
5. Poster : Ayela, B.; Poisson, T. ; Pannecoucke, X. ; Lopin-Bon, C.  Symposium de Chimie Organique en Centre-Auvergne-Limousin (SyCOCAL IX), Septembre 2014 – Tours
6. Poster : Ayela, B.; Poisson, T. ; Pannecoucke, X. ; Lopin-Bon, C.  16th Tetrahedron Symposium, Juin 2015 – Berlin
7. Poster : Ledru, H.; Lopin-Bon, C. 16th Tetrahedron Symposium, Juin 2015 – Berlin
8. Poster : Lopin-Bon, C.; Dahbi, S.; Ayela, B.; Ledru, H. 19th European Symposium on Organic Chemistry, Juillet 2015 - Lisbonne