Projet ANR-11-JSV3-0004 – PlasmoPiggyBac : Mutagénèse mediée par des transposons comme approche de genomique fonctionnelle pour l’étude de la régulation des gènes de virulence chez Plasmodium falciparum
Programme : JCJC - SVSE 3 - Microbiologie, immunologie, infectiologie (JCJC SVSE 3)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Jose-Juan Lopez-Rubio (CNRS DR LANGUEDOC ROUSSILLON)
Partenaires : Laboratoire public; Institut Pasteur
Montant : 320000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Mutagénèse mediée par des transposons comme approche de genomique fonctionnelle pour l’étude de la régulation des gènes de virulence chez Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum est un parasite qui infecte près de 300 millions de personnes et est responsable de plus de deux millions de morts par an. PfEMP1 est un facteur de virulence majeur  responsable du paludisme sévère codé par la famille multigènique var. Afin d’établir une infection permanente, P. falciparum emploie comme stratégie la variation antigénique. L’objectif de ce projet est l’identification des facteurs associés à l’expression mono-allélique des gènes var.
Mutagenèse, identification des gènes candidats et investigation de leur rôleMalgré les efforts déployés, le mécanisme moléculaire qui contrôle la variation antigénique chez P. falciparum reste un problème non résolu du fait de la complexité de ce parasite. Il a été démontré que différents facteurs jouent un rôle important dans l’expression monoallélique des gènes var (éléments génétiques des gènes var eux-mêmes, la structure de la chromatine et l’organisation nucléaire des chromosomes). Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent ce phénomène sont encore énigmatiques et des études fonctionnelles manquent. De plus, une large majorité des gènes de P. falciparum codent pour des protéines hypothétiques sans aucune homologie avec des protéines d’autres organismes eucaryotes. Ceci suggère que P. falciparum pourrait utiliser des facteurs inédits pour contrôler l’expression des gènes de virulence. Il est donc évident que des études par analogie aux autres organismes modèles diminuent les chances d’identifier les mécanismes spécifiques à ce parasite. Pour cette raison, nous avons choisi de suivre une approche empirique combinée à un screen génétique qui permettra d’identifier de nouveaux mutants pour lesquels la régulation des gènes var est affectée. Afin d’identifier les mécanismes impliqués dans la variation antigénique chez le parasite P. falciparum, l’approche suivie a été divisée en trois objectifs majeurs : Objectif 1: Développer un système de mutagenèse aléatoire du génome entier et un screen génétique qui permet d’identifier les facteurs impliqués dans l’activation, la répression ou le “switching”. Objectif 2: Identifier les gènes impliqués dans l’activation, la répression ou le “switching” en utilisant l’approche développée décrite plus haut.Objectif 3: Analyse des gènes candidats et étude du rôle qu’ils jouent dans la variation antigénique. 
Mutagénèse mediée par des transposons comme approche de genomique fonctionnelleConstruction de la librairie de mutantsLa mutagènèse médiée par transposon a été utilisée précédemment pour différentes analyses génétiques chez Drosophila et de nombreuses lignées de cellules mammifères et a permis de mieux comprendre l’expression complexe de gènes chez ces organismes. L’insertion du transposon piggyBac dans le génome de  P. falciparum sont entrain d’être obtenus par co-transfection des parasites intra-erythrocytaires avec le plasmide qui porte le transposon et un deuxième  qui exprime la transposase. Le plasmide portant le transposon porte une cassette de résistance flanquées des deux sites de recombinaison ITR1 et ITR2 de l’élément piggyBac. Les sites ITR sont orientés de manière à ce qu’une fois la reaction de transposition a lieu, la cassette de résistance sera insérée dans le génome de Plasmodium. Une fois les parasites transfectés avec ces deux plasmides, une population de parasites résistants à l’antibiotique est obtenue et des clones indépendants sont obtenus par dilution-limite.Screen génétique pour l’identification des génes impliqués dans l’activation, la répression et le “switching” des genes varConcernant le screen génétique, nous avons conçu un test qui nous permet d’identifier facilement des mutants qui sont affectés dans la regulation des genes var.  Nous utilisons une souche transgénique dans laquelle le promoteur de l’un des genes var contrôle l’expression d’un marqueur de résistance à un antibiotique. Identification et étude des facteurs candidatsLes candidates les plus promettants seront choisis pour une analyse plus profonde. La distribution génomique, la localisation cellulaire, l’association avec des ARN non codants et d’autres protéines seront étudiées si les facteurs identifies sont des protéines. Les méthodes et outils nécessaires à celà sont parfaitement maitrisés dans notre laboratoire.
Résumé de la soumission : Les pathogènes ont développé des mesures défensives pour éviter la clairance immunitaire et prolonger la période d’infection chez leurs hôtes vertébrés.  Le type et le degré des stratégies d’évasion immunitaire dépendent du « style de vie » in vivo que le pathogène a adopté. Les parasites protozoaires utilisent différentes stratégies pour coordonner l’expression de leur variation phénotypique, qui est souvent utilisée pour tromper le système immunitaire ou pour parvenir à envahir de nouvelles cellules chez l’hôte.  Des travaux récents, utilisant des techniques modernes de biologie moléculaire, montrent que ceci s’accomplit via l’action coordonnée de différents facteurs génétiques et/ou épigénétiques.Le pathogène protozoaire Plasmodium falciparum, qui infecte près de 300 millions de personnes  et est responsable de plus de deux millions de morts par an, emploie la variation antigénique comme stratégie pour établir une infection permanente dans le sang.  Plusieurs familles de gènes variables sont impliquées dans la variation antigénique de P. falciparum , leurs produits étant exprimés à la surface des hématies parasitées durant le stade érythrocytaire de l’infection. La famille des gènes var (60 copies par génome) encode un facteur de virulence majeur (une molécule de surface et d’adhésion impliquée dans la séquestration des hématies parasitées dans différents organes, notamment le cerveau) responsable du paludisme sévère. L’expression alternative de ces 60 gènes var permet au parasite d’échapper à la réponse immunitaire et de prolonger la période d’infection favorisant ainsi la transmission au moustique.Le premier évènement qui amorce l’expression mutuellement exclusive d’une famille de gènes variables reste mystérieux et représente le Sacré Graal dans le domaine de la variation antigénique des pathogènes, ainsi que dans d’autres domaines de recherche.  La transcription d’un seul gène var se produit au niveau d’un site d’expression périnucléaire unique.  L’objectif de ce projet est l’identification des facteurs associés à l’expression mono-allélique (protéines, éléments « enhancer » d’ADN ou ARN non-codant) en utilisant une stratégie novatrice. Pour atteindre cet objectif ambitieux, nous allons créer, à l’aide de transposons, une collection de mutants dans une lignée de parasites transgéniques qui nous permettra d’identifier efficacement les mutants affectés au niveau de la régulation des gènes de virulence.  Les molécules candidates identifiées seront validées en utilisant des méthodes ultra-modernes pour les parasites du paludisme, dont plusieurs ont été développées dans notre laboratoire, afin de décrypter les mécanismes nucléaires qui contrôlent la régulation épigénétique de la variation antigénique.  Nous espérons pouvoir ainsi comprendre les principes sous-jacents du « comptage génique » des familles de gènes de virulence, ainsi que d’autres aspects moléculaires importants de la variation antigénique.  Une mise en application réussie de l’approche ci-dessus ouvrira de nouvelles voies dans le domaine de la régulation génique chez les parasites responsables du paludisme.  Ce projet va sans doute révéler un maillon faible dans la stratégie d’évasion immunitaire du parasite, qui pourra être utilisé comme cible pour développer de nouveaux agents thérapeutiques.
Résultats : Une efficacité élevée de transfection est nécessaire pour le succés du projet. Même si cette technologie est parfaitement maitrisée dans notre laboratoire, nous avons essayé de l’améliorer en utilisant un protocole appris pendant ma visite au laboratoire de Dr. Adam´s (laboratoire dans lequel a été développée la technique de transposition médiée par piggyBac) et d’autres protocols alternatifs. Nous avons généré près de 100 clones mutants et nous sommes actuellement entrain d’utiliser le screen génétique afin d’identifier ceux dont la regulation des génes var est touchée.
L’objectif majeur de ce projet est d’identifier des facteurs impliquées dans la regulation des genes var. Dans le but de simplifier l’étape de screening, nous avons créé la librairie de mutants dans la souche transgénique pour laquelle le promoteur de l’un des génes var contrôle l’expression d’un géne de résistance à un antibiotique. Dans le but de simplifier encore plus l’étape de screen, nous sommes entrain de générer une souche de parasite où deux promoteurs de deux genes différents contrôlent l’expression de deux génes de resistances différents. Vu que dans le cas où la régulation des génes var est intacte un seul géne est exprimé,  les clones mutants capables de résister aux deux antibiotiques ont probablement une dérégulation de l’expression monoallélique des génes var. Cette amélioration du systéme permettra d’identifier plus facilement les mutants intéressents (culture en présence des deux antibiotiques).
Perspectives : 1) Nous utilisons une méthode de transfection hautement efficace mais nous pensons que nous pouvons l’améliorer. Nous prévoyons donc d’apporter des changements à la technique.
2) Nous avons rencontré Dr. Marcelo Jacobs-Lorena, de l’institut Johns Hopkings Bloomberg School of Public Health à Baltimore. Nous avons bénéficié de son expérience dans la mutagénése médiée par transposon vu qu’il a déjà appliqué cette approche avec succés dans le but d’identifier des génes impliqués dans la formation de gametocytes chez P. falciparum. L’insertion de 
piggyBac dans le génome de P. falciparum sont obtenus par co-transfection avec le plasmide transposon et le plasmide portant la transposase. . Dr. Jacobs-Lorena nous a gracieusement donné des versions améliorées de ces plasmides. Nous allons utiliser ces plasmides pour les transfections futures.
3) Une fois les génes identifiés pour lesquels une perte de fonction ou un gain de fonction permet la dérégulation de la variation antigénique, nous allons les caractértiser et nous allons étudier leur rôle exact dans la régulation de la famille des génes var.  L’ ensemble des experiences approriés sera different dans chaque cas mais plusieurs strategies seront appliqués. L’organisation de la chromatine et l’organisation ,ucléaire de la familles des génes var sont des facteurs importants dans la régulation des génes var. Nous alolns donc analyser ces deux aspects dans les clones mutants afin d’identifier la différence avec le parasite sauvage. 
Des expériences de chromatine immunoprécipitation nous permettront d’identifier l’état d’enrichissement des modifications particulières des protéines histones associées Des experiences de  fluorescence in situ nous permetterons d’étudier l’organisation nucléaire des génes var.
Publications et brevets : Apres 6 mois; nous n'avons pas encore publié.