Projet ANR-14-CE09-0013 – PBODYSTRUC : Structure et assemblage des P-bodies
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401) 2014
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Madame Dominique WEIL (UMR7622-Laboratoire de Biologie du Développement)
Partenaires : Laboratoire public; Laboratoire de Biologie et Pharmacologie Appliquée; Laboratoire public; Rétrovirus Endogènes et Éléments Rétroides des Eucaryotes Supérieurs
Montant : 474964.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 60 mois
Résumé : L'expression des gènes dépend non seulement de leur transcription dans le noyau, mais aussi d'événements post-transcriptionnels dans le cytoplasme : dégradation des ARNm, stockage des ARNm et traduction. Ceux-ci dépendent des protéines qui sont liées aux ARNm et de leur organisation en complexes, parfois associés à des localisations particulières dans des granules ribonucléoprotéiques découverts récemment, comme les P-bodies. Ces granules, dépourvus de membrane, contiennent des milliers d'ARNm associés à des complexes protéiques (RNP). D'après leurs composants, les P-bodies jouent un rôle dans la dégradation des ARNm, la répression de la traduction et l'interférence ARN. Pourtant, ils ne semblent pas nécessaires pour ces processus,  et le rôle de cette compartimentation en granules reste flou. Néanmoins, ils sont présents chez tous les eucaryotes, animaux et végétaux, des Trypanosomes aux mammifères. Ce projet propose d'aborder la question en déterminant la composition des P-bodies, leur architecture et leur mécanisme d'assemblage.
Les P-bodies et leurs composants seront étudiés en utilisant des stratégies multi-échelles, grâce à la participation de quatre partenaires d'expertise distincte et complémentaire. La coordinatrice, Dominique Weil, étudiera les P-bodies dans leur contexte cellulaire, en utilisant des approches de biochimie, de protéomique et de transcriptomique. Eric Deprez se focalisera sur une protéine essentielle à l'assemblage des P-bodies, et étudiera la conformation des complexes qu'elle forme in vitro et in vivo avec l'ARN, par des techniques de biophotonique. Philippe Andrey générera un modèle mathématique des P-bodies, basé sur des données expérimentales de microscopie électronique obtenues par Gérard Pierron.
Une partie du projet vise à caractériser les RNP présents dans les P-bodies. La protéine à DEAD-box Rck/p54 étant essentielle pour l'assemblage des P-bodies chez les mammifères, il s'agira de caractériser ses protéines associées, pour savoir comment elle se distribue entre complexes de dégradation, de répression de la traduction, d'interférence ARN, ou autres. Nous déterminerons aussi l'importance de ces protéines pour l'assemblage des P-bodies. D'autre part, les P-bodies seront purifiés pour identifier leurs composants protéiques et ARN. Ils pourraient contenir tous les types de complexe Rck/p54 ou certains seulement, et éventuellement de nouveaux composants.  Et nous saurons enfin si le ciblage des ARN dans les P-bodies est sélectif ou pas.
Une autre partie du projet consistera à caractériser les complexes [Rck/p54 – RNA] in vitro et in vivo. La liaison de Rck/p54 aux ARN défait leurs structures secondaires in vitro (unfolding). Cette conformation relaxée pourrait jouer un rôle central dans l'architecture des P-bodies. De plus, Rck/p54 tend à former des oligomères, ce qui pourrait aussi participer  à l'assemblage des granules. Nous déterminerons le statut oligomérique de la protéine quand elle est liée à l'ARN, et nous étudierons son activité de "unfolding", seule ou en présence de ses partenaires principaux.
La dernière partie du projet est de chercher à comprendre l'architecture des P-bodies en modélisant un P-body avec de l'ARN et des protéines comme briques élémentaires, et en tenant compte des résultats obtenus ci-dessus. Le modèle in silico sera ajusté en utilisant des images de microscopie électronique des P-bodies dans leur contexte cellulaire, et des outils d'analyse statistique spatiale adaptés ou créés pour cette étude.
Cette étude devrait apporter de nouvelles connaissances sur l'architecture et la fonction des P-bodies, notamment sur leur contenu en ARN. Ceci est intéressant non seulement pour les P-bodies, mais aussi pour des granules apparentés présents dans des conditions particulières (granules de stress) ou dans des cellules particulières (cellules germinales, neurones).