Projet ANR-11-ASTR-0007 – FRANthracis : Bacillus anthracis en France : relations évolutives à l'échelle locale, régionale, nationale, et implications pour les études de criminalistique et de suivi de dissémination.
Programme : Accompagnement Spécifique de Travaux de Recherches et d'Innovation Défense (ASTRID)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Nora MADANI (AGENCE NATIONALE DE SECURITE SANITAIRE DE L'ALIMENTATION, DE L'ENVIRONNEMENT ET DU TRAVAIL (ANSES))
Partenaires : Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail; Université Paris-Sud
Montant : 244296.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Bacillus anthracis : Diversité et typage moléculaire de l’agent numéro un de la menace bioterroristeAméliorer les moyens d’investigation des foyers de charbon est indispensable pour pouvoir caractériser finement les souches de Bacillus anthracis et retracer l’origine et l’historique d’une contamination, qu’elle soit naturelle ou criminelle. Le projet Franthracis vise à acquérir par des approches de séquençage global ce savoir-faire.
Développement d’outils de typage moléculaire de haute résolution spécifiques à B. anthracisLa fièvre charbonneuse est une maladie zoonotique de répartition mondiale causée par une bactérie sporulée redoutable, Bacillus anthracis. En France, cette zoonose apparaît de façon sporadique chaque année. B. anthracis est également considéré comme représentant l’une des principales menaces en termes de bioterrorisme. Répondant à des préoccupations tant civiles que militaires, ce projet propose d’acquérir par des approches de séquençage global une meilleure connaissance de la diversité existant en Europe au sein de l’espèce B. anthracis. Le séquençage de 200 souches (au lieu des 50 initialement prévues) et l’analyse bioinformatique comparative qui en résultera devraient permettre l’identification de marqueurs génétiques rares, des signatures ADN indispensables pour caractériser finement ce pathogène clonal. Un outil de typage moléculaire robuste et précis sera développé. Il permettra de reconstituer les relations phylogénétiques existantes entre souches à l’échelle locale ou mondiale. Les compétences qui seront développées dans le cadre de ce projet donneront à la France des capacités de réaction rapide face à une demande d'attribution d'une souche d'origine inconnue. Distinguer suffisamment de différences entre deux souches de façon à déterminer avec certitude qu’une souche particulière est à l’origine d’une infection naturelle ou d’un acte de malveillance est très important pour la conduite d’études épidémiologiques ou d'enquêtes criminalistiques qui suivraient une attaque avérée ou supposée. D'autre part, il est raisonnable de penser que la démonstration par un pays de sa capacité à identifier l'éventuel agresseur et ses soutiens aura un effet dissuasif sur les éventuels promoteurs de telles agressions. 
Analyse pangénomique des souches européennes et développement d’outils technologiques de détectionLe défi majeur pour développer une méthode de typage de haute résolution pour une espèce comme B. anthracis réside en l’identification de caractères ou d’une combinaison de caractères uniques à chaque souche. Une connaissance préalable exhaustive des variations génétiques spécifiques que l’on peut rencontrer chez divers isolats (insertion ou délétions, mutations ponctuelles, variations de séquences répétées en tandem) est donc nécessaire, que seul le séquençage de génomes complets permet d’aborder. Les progrès technologiques rendent désormais le séquençage d’une centaine de souches accessible à un coût raisonnable.Le coût élevé des systèmes de typage actuellement utilisés pour détecter des marqueurs polymorphiques ponctuels reste également un frein important au développement de ces analyses dans beaucoup de laboratoires. Les outils développés au cours du projet mettront à profit des technologies récentes particulièrement intéressantes pour l’analyse rapide et peu coûteuse de ces signatures ADN. La fusion haute résolution (HRM), une technique post-PCR, sera utilisée pour valider les signatures ADN mises en évidence in silico. Une technologie de puces en suspension capable de détecter simultanément jusqu’à 100 marqueurs pourrait également être évaluée.
Résumé de la soumission : La fièvre charbonneuse ou charbon bactéridien est une maladie zoonotique de répartition mondiale causée par une bactérie sporulée, Bacillus anthracis. En France, cette zoonose apparaît de façon sporadique d’une année sur l’autre dans des zones ayant déjà connu par le passé des épisodes charbonneux, et il n’est pas exceptionnel que des épisodes plus conséquents se produisent. B. anthracis est une bactérie redoutable du fait du caractère extrêmement résistant de ses spores, de sa large répartition dans le monde, et de son pouvoir pathogène. Pour ces raisons, B. anthracis est généralement considéré comme représentant la principale menace en termes de bioterrorisme. Différentes stratégies sont envisagées pour lutter contre cette menace. Ce projet vise à rendre moins attractif l'utilisation d'une telle arme, en renforçant nos moyens dans le domaine de la criminalistique et de l'identification de l'origine d'une souche.B. anthracis forme au sein du groupe Bacillus cereus une lignée très monomorphe qui ne présente qu’une très faible variation moléculaire au sein de sa population. Du fait de cette homogénéité, seule la combinaison de techniques de typage moléculaire présentant un fort pouvoir discriminant comme la MLVA (Multilocus variable-number tandem repeat analysis), l’analyse de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) sur l’ensemble du génome, l’analyse de SNRs (Single Nucleotide Repeat), voire le séquençage complet, s’avère capable de discriminer certaines souches entre elles. Les technologies disponibles depuis peu permettent désormais d'envisager d'utiliser le séquençage complet de façon beaucoup plus systématique, en particulier s'agissant d'un pathogène à la fois d'importance majeure et d'occurrence modeste. L’objectif de ce projet est d’acquérir par des approches de séquençage global une meilleure connaissance de la diversité existante en France au sein de l’espèce afin de développer un savoir-faire et des outils de typage moléculaire de haute résolution capables de distinguer tout isolat spécifique. Le séquençage de 50 souches françaises de B. anthracis et l’analyse bioinformatique comparative qui en résultera devraient permettre l’identification de marqueurs génétique rares, comme les SNPs. Ces signatures ADN sont indispensables pour une identification fine de ce pathogène. Surtout les compétences qui seront développées dans le cadre de ce projet donneront à la France des capacités de réaction rapide face à une demande d'attribution d'une souche d'origine inconnue.La technologie de fusion haute résolution (HRM) sera utilisée pour caractériser sur les souches de la collection ANSES les SNPs qui seront mis en évidence in silico. Cette étude permettra de valider des signatures ADN spécifiques aux isolats français ou aux sous-groupes auxquels ils appartiennent, ainsi que des marqueurs discriminant ces souches entre elles. La capacité de la HRM à détecter et distinguer des polymorphismes de type SNR sera également évaluée. Ces marqueurs pourraient fournir une résolution supplémentaire à intégrer dans le développement d’un outil de typage de haute résolution utilisable en routine et basé sur cette technologie. L’outil de typage qui sera développé aura des retombées directes pour le diagnostic et l’épidémiologie des foyers de fièvre charbonneuse en France mais également pour l’expertise d’échantillons suspects dans le cadre du réseau Biotox-Piratox. Il sera notamment mis à profit pour (1) caractériser la diversité présente au sein des 3 sous-lignées de B. anthracis présentes en France (A.Br.008/009, A.Br.001/002 et B.Br.CNEVA), (2) reconstituer les relations phylogénétiques de ces isolats avec ceux retrouvés dans le reste du monde et (3) étudier les épisodes importants de fièvre charbonneuse qui ont eu lieu récemment en France :  en 2008 dans le Doubs (impliquant des souches du sous-groupe A.Br.001/002) et en 2009 dans les Alpes (impliquant des souches de la sous-lignée B.Br.CNEVA).
Résultats : Le séquençage et l’analyse génomique comparative de 123 souches françaises de B. anthracis a permis d’identifier les rares polymorphismes présents au sein de ces génomes, dont 3306 SNP chromosomiques discriminant clairement les 3 sous-lignées présentes en France (B.Br.CNEVA, A.Br.011/009 et A.Br.001/002). La résolution obtenue est telle que l’on peut définir des signatures ADN spécifiques pour presque toutes les souches. 
561 SNP caractérisent la sous-lignée majoritaire B.Br CNEVA. Un clustering géographique en 3-4 grands sous-groupes est obtenu : Alpes, Pyrénées, Massif Central et un sous-cluster Saône-et-Loire au sein de ce dernier. Cinq SNP représentatifs de ces groupes ont été sélectionnés et validés. Un regroupement géographique moins apparent est également observé sur base des 841 SNP identifiés au sein du sous-groupe A.Br.011/009. Le sous-groupe A.Br.001/002, minoritaire en France, nécessitera une analyse comparative de souches étrangères pour mettre en évidence des signatures ADN uniques. Le séquençage de 80 souches isolées en Europe, issues de collaborations nouées avec 9 laboratoires ou instituts européens, est en cours de réalisation à cette fin. 
L’identification de marqueurs génétiques de type SNP se traduira par le développement d’outils de typage moléculaire précis, rapides et peu coûteux. Ces outils auront des retombées directes pour le diagnostic et l’épidémiologie des foyers de charbon en France mais également pour la sécurité intérieure en cas de diffusion accidentelle. Plus fondamentalement, la production de masse de données génomiques apportera une meilleure connaissance de la biodiversité des souches de B. anthracis présentes en Europe.
Au vu des résultats déjà obtenus, et du succès des échanges mis en place avec nos homologues européens, il nous semble que le projet ira largement au-delà de ce qui était initialement prévu.
Perspectives : Ce projet permettra de disposer en France d’un savoir faire rare dans le monde en termes de génomique comparative au sein de l’espèce B. anthracis, ainsi que de données et d’un état des lieux sans équivalent en Europe de la diversité de l’agent numéro 1 en termes de menace bioterroriste. Ce projet ambitionne de produire une cartographie quasi définitive de la distribution naturelle des souches de B. anthracis sur le territoire français. Il ouvre la voie à la conduite d’approches comparables à l’échelle européenne voire mondiale, grâce aux réseaux de partenaires étrangers.
Une banque de données reprenant l’ensemble des profils établis sera conçue. Elle participera à la traçabilité des collections de souches et à l'amélioration des moyens d'investigation des cas de charbon. L’outil de typage moléculaire qui sera développé permettra d’identifier le plus précocement possible l’origine probable d’une contamination et fournira des informations importantes pour orienter les investigations.
Publications et brevets : Genotyping of French Bacillus anthracis strains based on 30-loci Multi Locus VNTR analysis : epidemiology, marker evaluation, and update of the internet genotype database (soumis)