Projet ANR-13-RPIB-0009 – RSignal : Développement d'essais innovants pour la découverte de ligands biaisés des RCPG
Programme : Recherches Partenariales et Innovation Biomédicale (RPIB)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Jean-Philippe Pin (Institut de Génomique Fonctionnelle)
Partenaires : Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille; CISBIO BIOASSAYS; Institut de Génomique Fonctionnelle
Montant : 791010.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 48 mois
Résumé : Nouveuax essais pour l'étude des RCPG natifsAvec la découverte des ligands biaisés des RCPG, de nouvelles pistes prometteuses sont ouvertes pour le développement de molécules bioactives plus spécifiques. Il est maintenant nécéssaire de pouvoir étudier précisément toutes les voies de transductions possibles des RCPG dans leur cellules natives. L'objectif de ce projet est de mettre en place des essais compatibles avec ce type d'analyse.
Nouveuax essais pour l'étude des RCPG natifsLe projet vise au développement et à la validation d'outils permettant la détection des formes actives de divers effecteurs des RCPG.Ces outils seront utilisés pour la mise en place d'essais compatibles pour des analyse à haut débit.De tels essais sont très attendus dans l'industrie pour la validation rapide des touches issues du criblage.
Nouveuax essais pour l'étude des RCPG natifsLes essais seront basés sur l'utilisation de deux types d'intéracteurs des cibles: des intéracteurs généraux, capables d'intéragir avec la cible quelque soit sont état d'activité, et des intéracteurs spécifiques des formes actives. La présence de fluorophores compatibles pour des mesure de FRET en temps résolu permettra la détection des formes actives par HTRF(R).
Résumé de la soumission : Le principal objectif de ce projet est de développer de nouvelles technologies et de nouveaux produits pour mesurer les différentes voies de signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) directement au niveau des protéines G (changement de conformation de la protéine G) et des beta-arrestines (mesure de leur recrutement au récepteur) pour du criblage à haut débit. Les RCPG jouent un rôle fondamental dans la communication intercellulaire. Ils représentent la plus grande famille de récepteurs chez l'homme, et chaque type de cellules exprime plusieurs d'entre eux. Ce sont des cibles thérapeutiques importantes avec plus de 30% des médicaments qui se lient sur ces récepteurs. Cependant, malgré une recherche intense, très peu de nouvelles molécules ont été commercialisées ces dernières années. Une difficulté réside dans le fait d'être sûr que ces molécules produisent l'effet attendu dans les tissus natifs. En effet, il a été démontré que les RCPG ont des propriétés de signalisation différentes selon le ligand utilisé pour les activer, un nouveau concept appelé "sélectivité fonctionnelle". Ce concept ouvre de nouvelles perspectives pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques qui vont agir sélectivement sur la voie de signalisation responsable de l'effet thérapeutique de la drogue. Il est donc essentiel de mesurer l'action de ligands sur son récepteur dans un environnement natif.Le but de ce projet est de développer des tests simples et compatibles avec une utilisation à haut débit pour mesurer les propriétés de couplage des RCPG dans des cellules primaires. Nous nous concentrerons en priorité sur les deux voies de signalisation pour lesquelles il n'existe pas de tests simples utilisables en culture primaire: l'activation des protéines Gi/o et le recrutement des beta-arrestines. L'objectif est de développer deux types d'anticorps: des anticorps qui reconnaissent Gi/o et les beta-arrestines dans n'importe quel état conformationnel, et des anticorps qui sont spécifiques de la forme active de ces protéines. Pour augmenter notre chance de succès, nous développerons deux types d'anticorps: des nanobodies à partir de lamas, et des anticorps monoclonaux de souris classiques. Les nanobodies correspondent au domaine variable des anticorps de camélidés, et leur petite taille (13 kDa) leur confère la propriété de reconnaître des régions de l'antigène non accessible par les anticorps classiques. L'ensemble de ces anticorps sera marqué par des fluorophores compatibles avec des mesures de FRET en temps résolu (HTRF) et utilisés pour détecter spécifiquement la forme active de ces protéines dans des cellules native lysées, après action de ligands du GPCR ciblé. Après validation des tests, des kits seront commercialisés, augmentant ainsi le portfolio de CisBio Bioassays.Le programme implique trois équipes de recherche.- Le groupe de JP Pin (IGF, Montpellier), leader international dans le domaine des RCPG, qui possède une forte expérience dans la purification des récepteurs, des protéines G, et des arrestines. Cette équipe est très active dans le développement d'essais innovants, et elle sera en charge de la production de protéines pour l'immunisation et le développement des tests HTRF.- Le groupe de D Baty (CRCM, Marseille) a une forte reconnaissance et expertise dans le développement d'anticorps de lamas. Il sera en charge de la préparation des bibliothèques de nanobodies par "phage display" et l'identification de nanobodies spécifiques des cibles.- CisBio Bioassays est leader international dans le domaine des tests pour les RCPGs avec le développement de nombreux kits pour détecter des réponses cellulaires par HTRF, et beaucoup sont basés sur le développement d'anticorps monoclonaux. Cisbio developpera les tests HTRF jusqu'à leur commercialisation.
Résultats : 3 types d'interacteurs ont été identifiés et validés pour reconnaitre les formes actives d'une de nos cibles. Des intéracteurs ont été aussi isolés pour une deuxième cible. Tous ces outils ont été validés sur les cibles purifiées.
Perspectives : Nos prochains objectifs sont de valider l'utilisation de ces outils sur des membranes cellulaires. Parallelement nous allons développer d'autres outils similaires sur une troisième cible des RCPG.
Publications et brevets : Outre l'objectif scientifique d'avoir acces à des outils pour l'étude des ligands biaisés dans des système natifs, les outils développés visent à la mise en place de kits commerciaux. Des brevets sont prévus, et en conséquence aucune communication n'a été faite sur nos résultats.