Projet ANR-11-ECOT-0009 – COMBITOX : COnception d’un instrument pour la Mesure BIologique  multiparamètrique en continu de TOXiques
Programme : Production durable et technologies de l'environnement (ECOTECH)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur David PIGNOL (COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES (C.E.A.) - CENTRE D'ETUDE NUCLEAIRE DE CADARACHE)
Partenaires : AP2E; Association pour la recherche et le développement des méthodes et processus industriels; Laboratoire de Chimie Bactérienne; Modèles et Simulations pour l'Architecture et le Patrimoine; Divers public
Montant : 999677.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Conception d’un prototype de mesure en ligne pour la détection biologique de toxiques et de pathogènes sur des réseaux d’eau (potable et usée)La surveillance des réseaux d’eau (potable et usée) est au centre de ce projet : notre outil propose la détection par des senseurs biologiques de composés toxiques biodisponibles ainsi que de micro-organismes pouvant impacter la santé humaine via les réseaux d’eau potable, affecter les eaux des élevages d'animaux (aquaculture...), l’environnement ou encore l’écologie des étages biologiques des stations d’épuration.
Développement d’un automate fonctionnant comme une station d’alerte sur le réseau lorsqu’un seuil de pollution est franchi.Le montant des sommes consacrées à la surveillance de l’environnement et à l’effet sur la santé humaine des polluants a évolué très fortement. Les prescripteurs se posent des questions quant au retour sur investissement, à la qualité des données communiquées (parfois après un laps de temps important) par les laboratoires de contrôle, celles-ci n’étant que très parcellaires (détection de coliformes totaux comme traceurs de contaminations fécales par exemple) et nettement insuffisante dans certains cas. Il existe de ce fait une réelle demande de nouvelles méthodes complémentaires aux méthodes analytiques de référence souvent longues, délicates à mettre en œuvre et non adaptées à une utilisation rapide sur le terrain. C’est donc un secteur en pleine expansion qui doit être à la pointe de l’innovation afin de proposer des solutions technologiques répondant aux exigences réglementaires et économiques. Ainsi, il devient indispensable d’élaborer des méthodes innovantes à faible coût, permettant d’obtenir des résultats sur sites, équivalents et/ou complémentaires à ceux donnés par les méthodes normalisées. Ces méthodes pourront permettre un diagnostic sur site pour une aide à la décision permettant aux industriels d’élaborer un choix stratégique de gestion. Dans ce contexte, nous proposons un système intégré et transportable permettant la détection rapide de multiples polluants par des non-spécialistes. Plus précisément, l'approche consiste en une mesure chimioluminescente ou fluorescente d'une interaction biologique ou biochimique générée entre un contaminant et un élément de reconnaissance biologique (ERB). L'objectif est de permettre le contrôle de la présence de ces contaminants «n'importe où, n'importe quand et par n'importe qui«.
Developpement de biodétecteurs sensibles et spécifiquesLa technologie de base que nous proposons repose sur l’utilisation de bio-détecteurs. L'International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) définit comme biodétecteur (biosensor en anglais), tout «dispositif utilisant des réactions biochimiques spécifiques, mises en œuvre par des enzymes isolées, des anticorps, des organites ou des cellules entières, afin de détecter des composés chimiques, généralement via des signaux électriques, thermiques ou optiques«. L'architecture de base d'un biodétecteur est donc constituée d'un élément de reconnaissance biologique spécifique et d'un transducteur physique. Trois types de système de bio-reconnaissance seront exploités dans le projet COMBITOX, présentant chacun la capacité de détecter des toxiques différents : (i) les bio-détecteurs bactériens, basés sur la réponse spécifique de certains micro-organismes face aux toxiques et construits selon la technique du gène rapporteur par fusion transcriptionnelle d’un promoteur induit et d’un gène rapporteur. Ces biodétecteurs sont parfaitement adaptés à la reconnaissance de toxiques métalliques.(ii) les immuno-détecteurs basés sur l’interaction spécifique toxiques/anticorps. Ces systèmes sont adaptés à la reconnaissance de composés organiques ou de type toxine.(iii) les détecteurs phagiques, outils de choix pour la détection de souches bactériennes pathogènes.La réponse biologique sera couplée à une détection par chimioluminescence. Celle-ci a été choisie pour sa simplicité, sa spécificité et la possibilité d’utiliser un appareil transportable pour la lecture mettant en œuvre des technologies plus qu’éprouvées.
Résumé de la soumission : ? L’objectif de ce projet réside dans la conception d’un instrument de mesure multi-paramètres en ligne et en continu: COMBITOX, pour COnception d’un instrument de Mesure BIologique multiparamètriques en continu de TOXiques. Il vise à développer et à optimiser des modules de biodétection à partir de technologies maitrisées dans nos laboratoires de recherche académique et de les transférer vers un dispositif de mesure en ligne en collaboration avec la société AP2E. Un prototype sera ainsi installé sur le terrain, au niveau de la station de pompage du réseau d’eau du Sud Luberon. Une étude de marché permettra d’adapter les performances de cet outil aux besoins des différents acteurs de l’eau. ? Cet outil permettra la bio-détection de composés toxiques biodisponibles ainsi que de micro-organismes pouvant impacter la santé humaine via les réseaux d’eau potable, affecter les eaux des élevages d'animaux (aquaculture...), l’environnement ou encore l’écologie des étages biologiques des stations d’épuration. La surveillance des réseaux d’eaux (potables et usées) est au centre de ce projet. Nous envisageons notamment le déploiement de ce système dans le cadre de la surveillance liée aux menaces émergentes telles que le bio-terrorisme. Nous avons retenu 3 familles «d’objets» à détecter: les métaux (cadmium, mercure, arsenic, nickel etc..), les toxines environnementales et/ou alimentaires et les micro-organismes pathogènes. La sélectivité et la sensibilité des systèmes biologiques sont mises à profit pour la conception de tels bio-capteurs. La détection est basée sur la technique du gène rapporteur sous le contrôle d’un promoteur inductible (pour les métaux par exemple), de l’interaction antigène-anticorps pour les toxines et les micro-organismes, et de l’infection spécifique par un bactériophage pour les bactéries. Dans tous les cas, le signal détecté est photochimique (fluorescence, bio-luminescence ou chimio-luminescence), gage de sensibilité de la mesure, et permettant une uniformité du dispositif technologique avec la conception d’une tête de lecture unique intégrant les différents signaux.? Notre consortium implique plusieurs laboratoires de recherche académiques appartenant au CNRS, à l’INSA, au CEA et à l’Ecole des Mines d’Alès ainsi qu’un industriel, la société AP2E, basée à Aix-en-Provence et spécialisée dans la conception d’instruments pour la métrologie de l’environnement. Les laboratoires académiques ont en charge la recherche amont (identification des gènes signatures, caractérisation des couples antigènes-anticorps, isolement de phages adaptés aux cibles), du développement et de la mise au point de la bio-détection (mise au point de molécules anticorps-like). L’industriel est responsable de l’étude technologique (échantillonnage, mesure du signal, conditionnement des consommables) et de l’intégration des composants dans un prototype qui sera testé sur site. Le soutien de divers acteurs de la qualité des eaux/environnement souligne la nécessité de développer un tel projet (lettres de soutien jointes au projet). L’avancée du projet sera gérée par l’intermédiaire d’un comité de suivi qui impliquera l’ensemble de ces partenaires. Nous concevons notre projet comme un cahier des charges menant à une application industrielle, intégrant donc les notions de coût, d'ergonomie, de praticabilité et de contraintes réglementaires.
Résultats : Nous avons pu  à ce jour développer plusieurs biodétecteurs fonctionnels en laboratoire. Ainsi, par la technique du gène rapporteur, nous disposons à ce jour de bactéries permettant la biodétection spécifique de différents métaux (Hg, As, Co et Ni) à faible concentration. Nous avons pu également mettre au point un système original de détection des coliformes basé sur leur infection par des phages modifiés. Enfin, nous disposons d’un immunodétecteur répondant à la présence de toxines alimentaires. L’ensemble de ces modules répond spécifiquement à la présence des toxiques à faible concentration via une émission de lumière. Un effort tout particulier est en cours pour permettre la calibration, la conservation dans le temps et l’adaptation de ces modules biologiques hors des murs du laboratoire, pour leur utilisation fiable sur le terrain. En parallèle, nous avons démarré la conception du prototype permettant d’accueillir ces systèmes biologiques sur le terrain. Ce prototype comporte des systèmes d’hébergement adaptés aux contraintes de chaque système de biodétection (bactéries entières, phages et immunodétecteur) et  ainsi qu’un module commun de mesure du signal. Cet automate sera installé chez un hébergeur (station de potabilité) dans les prochains mois afin de pouvoir tester l’ensemble des systèmes en condition réelle.
Perspectives : La stratégie utilisée vise à développer un système d’instrumentation intégré permettant un suivi et une mesure en  ligne de façon séquentielle et à bas coûts de polluants et de toxiques. Ce procédé permettrait de réduire significativement le coût des mesures et des analyses réalisées à ce jour; il permettrait aussi d’obtenir des mesures plus rapidement, sur site, autorisant des prises de décision rapides et préventives. De plus, la validation d’un tel concept pourrait permettre dans l’avenir son utilisation pour la détection de substances qui ne sont pas encore incluses dans la réglementation ou tout simplement que l’on ne sait pas encore détecter.
Publications et brevets : COMBITOX est un projet partenarial qui a démarré en janvier 2012. Le projet avance à un bon rythme et débouchera sur des actions de valorisation mais plus probablement dans la dernière année du projet. Plusieurs articles seront vraisemblablement soumis en 2013 et 2014, que ce soit par exemple sur la mise au point de systèmes bactériens et phagiques ou le développement original de modules de transduction du signal dont l’étude a particulièrement bien avancé. Courant 2012/2013, nous avons cependant dors et déjà présenté le projet  et les résultats préliminaires à un certain nombre de congrès nationaux et internationaux.