Projet ANR-06-PCVI-0025 – FonFlon : Relation fonction/fluctuation structurale chez les protéines
Programme : Physique et Chimie du Vivant (PCV) (PCV) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : CNRS DELEGATION REGIONALE PARIS B (CNRS DELEGATION REGIONALE PARIS B)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 300000.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 36 mois
Résumé : Comprendre la relation entre la structure d'une protéine et sa fonction et prédire la première à partir de la séquence connue de ses acides aminés reste un des problèmes majeurs de la Biologie dans l'ère Post-génomique. Cette question est particulièrement difficile à résoudre à cause du grand nombre d'états métastables accessibles lors du repliement d'une protéine. Ces états caractérisent peut-être aussi le paysage énergétique de l'état fonctionnel natif des protéines. En effet si comme le suggèrent différents modèles, le repliement des protéines est un problème où des contraintes de frustration jouent un rôle fondamental, on peut s'attendre à ce que l'état fondamental soit complexe et caractérisé par un grand nombre d'états métastables d'énergie voisine. De fait, certains résultats expérimentaux utilisant la FCS ou d'autres techniques fluorescentes (Xie et al., Edman et al.)  suggèrent que l'état fondamental d'une enzyme n'est pas unique et que la protéine passe son temps entre divers états fonctionnellement différents mais d'énergie similaire. Un nombre croissant d'expériences montre que la flexibilité structurale peut être essentielle au bon fonctionnement d'une protéine, soit en permettant les déformations nécessaires à son activité catalytique (dans le cas d'une enzyme) soit en lui permettant de s'associer avec son substrat par un mécanisme d'ajustement induit (induced fit).  Le but de ce projet est de comprendre la relation entre les fluctuations structurales d'une enzyme et son activité catalytique. Dans cette optique, nous utiliserons une double approche à la fois expérimentale et théorique. D'un point de vue théorique, si la prédiction de la structure d'une protéine à partir de sa séquence est un problème trop complexe pour les meilleurs ordinateurs actuels, l'étude des fluctuations conformationnelles d'une protéine au voisinage de sa structure cristallographique est tout à fait réalisable. Nous utiliserons cette information pour aborder les possibles déformations structurales d'une protéine prés de cet état. Cette étude nous renseignera sur les modes de déformation de la protéine et l'existence possible d'états métastables voisins.  Nous utiliserons cette étude théorique afin de comparer et d'interpréter une série d'expériences sur les fluctuations fonctionnelles d'une enzyme dans différentes conditions de solution, de température, de tension mécanique, etc. Le suivi de l'activité biologique se fera à l'aide d'enzymes dont le produit de réaction est fluorescent. Ainsi par la mesure des bouffées de fluorescence lors de manipulations sur molécule unique, nous serons capable de suivre le cycle enzymatique pas à pas et d'étudier son taux d'activité, ses corrélations, son affinité, etc. en fonction du temps et des différentes contraintes imposées, la première de celles-ci étant la température. Pour cela nous immobiliserons une enzyme à très faible concentration dans un gel très mince et nous suivrons son activité catalytique comme décrit précédemment. La deuxième contrainte sera une contrainte mécanique imposée à la protéine par deux voies possibles. Soit en ancrant un ségment d'ADN en deux sites de la protéine (suivant une technique développée par G. Zocchi) soit en ancrant l'enzyme à une surface et en tirant dessus à l'aide de pinces magnétiques grâce à un ADN ancré à l'enzyme à une extrémité et à une bille magnétique à l'autre.  Nous espérons observer une corrélation de l'activité enzymatique à temps court et une décorrélation pour des temps plus long, indiquant l'existence de plusieurs états fonctionnels. Nous nous attendons à ce que le nombre d'états possibles varie avec la température, la tension ou la provenance de l'enzyme. L'activité de différents mutants ou variants (psychrophile, mésophile ou thermophile) sera étudiée. Ces résultats seront comparés avec des simulations numériques des fluctuations structurales de la protéine en fonction de la température et de la tension au voisinage de sa structure connue. Ce..