Projet ANR-10-BLAN-1417 – ParaHP : Activité Paracrine et Translocation des Homeoproteines
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Neurosciences (Blanc SVSE 4)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Alain JOLIOT (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS A)
Partenaires : Laboratoire des Biomolécules; Collège de France; Centre national de la recherche scientifique; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Laboratoire des Biomolécules; Laboratoire des Biomolécules
Montant : 834199.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Des protéines passe-murailles : voyage au travers des membranes cellulairesComprendre les langages utilisés par les cellules pour communiquer entre elles est un enjeu majeur, tant pour la physiologie que la pathologie. Notre objectif est de décortiquer les mécanismes et les fonctions d’un nouveau mode de communication basé sur le transfert direct de protéines entre 2 cellules.
Mécanisme et fonction du transfert intercellulaire des homéoprotéinesLes homéoprotéines sont une famille de protéines de nature similaire initialement identifiées pour leur rôle organisateur du développement des embryons, en régulant l’expression de gènes. Ces mêmes protéines exercent d’autres fonctions chez l’adulte et leur mutation est souvent associée à des pathologies. Récemment, un nouveau mode d’action de ces protéines a été mis en évidence, impliquant leur capacité surprenante à passer entre 2 cellules. Grâce à ce passage, une cellule exprimant une homéoprotéine est capable d’instruire des cellules voisines dépourvues de cette même protéine et donc d’influencer leur destin. Notre objectif est de décortiquer ce mode de communication qui soulève plusieurs questions et bouscule certains dogmes de la biologie. En effet, le transfert d’une protéine entre 2 cellules implique son passage au travers de membranes cellulaires dont la fonction première est de constituer un rempart vis-à-vis du milieu extérieur. Un deuxième aspect de notre étude s’intéresse aux conséquences fonctionnelles de ce transfert. Si il est maintenant avéré que la propriété de transfert intercellulaire est une composante essentielle à la fonction des homéoprotéines, l’étendue de ce mode de communication et celle de ses effets au sein de la cellule receveuse restent à déterminer.
Franchir des membranes cellulaires ? De la molécule à la physiologieL’étude du transfert intercellulaire des homéoprotéines comporte plusieurs niveaux d’analyse afférents à la physique, la chimie et la biologie, qui ne peuvent être abordés que par une approche transdisciplinaire. Par des approches physico-chimiques, nous analysons la manière dont les homéoprotéines interagissent avec chacun des constituants de la membrane cellulaire afin de comprendre comment ces molécules hydrophiles (solubles dans l’eau) parviennent à franchir la barrière hydrophobe (insoluble dans l’eau) de la membrane cellulaire, composée de lipides. En complément, la fonction de ces interactions dans le processus de transfert des homéoprotéines est analysée dans un contexte biologique simplifié de cellules en culture. L’étude des effets biologiques résultants du transfert des homéoprotéines nécessite quant à elle l’utilisation de modèles animaux où la protéine est placée dans son contexte naturel physiologique.
Résumé de la soumission : Les Homeoprotéines (HPs) on des fonctions autonomes cellulaires importantes au cours du développement. Nombre d’entre elles sont exprimées chez l’adulte suggérant qu’elles jouent aussi un rôle physiologique. En plus de leurs fonctions transcriptionnelles, plusieurs HP régulent la traduction and sont capables de transfert intercellulaire in vitro and in vivo. Le transfert des HP implique leur sécrétion et internalisation par des mécanismes non entièrement élucidés. Pour nous limiter à l’internalisation, la structure principale est l’hélice 3 (16 acides aminés) du domaine de fixation à l’ADN ou Homéodomaine (HD). l’homéodomaine (60 acides aminés) et son hélice 3 (Penetratin) ont été largement utilisés comme vecteurs pour l’adressage intracellulaire d’agents hydrophiles. Plusieurs fonctions non autonomes cellulaires des HP ont été récemment identifiées. Elles incluent, la segmentation du neuroépithelium, le guidage des axones et la régulation de la période critique au cours de la maturation post-natales du cortex visuel. Ce projet explorera quelques aspects de l’activité des HP entant qu’entité de signalisation. Il rassemble des chimistes, des biologistes cellulaires, des biologistes du développement et des physiologistes qui ont une très grande expérience du domaine. La plupart des expériences seront menées sur Engrailed1 (En1), une HP principalement exprimée dans le mésencéphale en développement and dans les neurones dopaminergiques (mDA) mésencéphaliques adultes. Du fait de la forte conservation des séquences de transfert et du grand nombre d’HP capables de transfert, il est attendu que plusieurs des résultats obtenus sur En1 soient généralisables à d’autres HPs.La première tache consiste à utiliser En1 HD pour vérifier si l’internalisation modifie sa structure à travers son association avec d’autres molécules, en priorité des lipides ou des sucres complexes qui seront identifiés. Ce travail impliquera des études de NMR in vitro et en cellules vivantes. De telles modifications permettraient aux cellules de to distinguer entre HP « autonomes » et HP « importées ». Une fois identifiés les résidus impliqués dans ces interactions, ils seront mutés et les variants de En1 seront testés dans deux systèmes physiologiques. La deuxième tache correspond à une stratégie biochimique d’identification de partenaires d’ En1. Cette recherche impliquera des expériences de « pull-down » complétées par la spectrométrie de masse ou par des technologies d’identification biochimiques des lipides et sucres. Les sites d’interaction d’En1 et des ses partenaires seront identifiés et mutés pour produire des variants de En1 qui seront testés physiologiquement. Des expériences de perte et gain de fonction des principaux partenaires permettront d’évaluer leurs importance physiologique. Des variants de En1 déficients pour la traduction ou et l’internalisation déjà identifiés seront testés sans attendre. Il en sera de même pour l’analyse de l’importance des sucres complexes.la troisième tache  décrits les test physiologiques. Un premier test est le collapse des cônes de croissance des axones des neurones rétiniens (RGC) temporaux en présence d’En1. Ce collapse est régulé par l’internalisation d’En1 et est traduction-dépendant. des résultats  préliminaires démontrent que l’addition d’En1 est immédiatement suivie d’une augmentation de l’ATP extracellulaire, nécessaire au collapse et impliquant les récepteurs purinergiques AR1. Un second test repose sur des enregistrements en patch-clamp associés à de la « fast-cycling » voltamétrie sur des tranches de cerveau. Les neurones mDA mésencéphaliques seront nos premiers objets d’étude mais des expériences impliquant Otx2 and et le cortex seront aussi développées (voit texte principal). Nous avons observé (expériences préliminaires) qu’En1 induit une augmentation significative des courants calcium « T-type » sur des neurones mDA identifiés.
Résultats : Nous avons démontré au cours de travaux antérieurs que le domaine commun à toutes les homéoprotéines (l'homéodomaine) a un rôle essentiel pour le franchissement des membranes cellulaires. Nous montrons maintenant que la structure de ce domaine est fortement modifiée au contact d'un environnement hydrophobe mimant celui des membranes cellulaires. Nous avons par ailleurs identifié des interactions préférentielles de l'homéodomaine ou de ses dérivés avec des composants spécifiques de la membrane tels que certains types de lipides ou de longues chaînes uniquement composées de sucres appelées glycosaminoglycanes. Ces dernières sont abondantes à la surface des cellules mais présentent une grande diversité dans leur composition précise. Au cours de l'étude de la fonction physiologique des homéoprotéines, nous avons démontré qu'une homéoprotéine donnée n'interagit qu'avec un type de chaîne glycosaminoglycane, lui permettant ainsi de restreindre son action qu'aux cellules présentent ce motif de sucres.
Perspectives : Au delà de notre compréhension du mécanisme de transfert homéoprotéines et des fonctions qui en résultent, ce projet ouvre la voie à des perspectives plus larges, en particulier à visée thérapeutique. En effet, le milieu intracellulaire constitue une source inépuisable de cibles thérapeutiques mais l'accès à ces cibles, donc le franchissement des membranes cellulaires,  est un obstacle majeur au développement de nouveaux médicaments. Nos travaux pourraient aboutir à de nouvelles stratégies permettant des franchir ces barrières cellulaires. Notons que par leur capacité à pénétrer les cellules, les homéoprotéines elles même pourraient être utilisées comme agent thérapeutique par addition directe de la protéine dans le milieu extracellulaire.
Publications et brevets : 1.	Tryptophan within basic peptide sequences triggers glycosaminoglycan-dependent endocytosis. Bechara C, Pallerla M, Zalstman Y, Burlina F, Alves ID, Lequin O, Sagan S, FASEBJ (sous presse). Cette étude met en évidence les modalités et le rôle des interactions entre des fragments d'homéoprotéines responsables du franchissement des membranes et les motifs de sucres présent à la surface des cellules
2.	Dupras G., Bernard C., Perrot A., Cattiaux L., Prochiantz A., Lortat-Jacob H., Mallet J.-M. Toward libraries of biotinylated chondroitin sulfate analogs: from synthesis to in vivo studies. Chemitry a European Journal., in press. Cette étude décrit la caractérisation des motifs de sucres interagissant spécifiquement avec une homéoprotéine donnée.