Projet ANR-11-BSV8-0022 – Epistruct : Biologie structurale de la modification et de l l'assemblage de la chromatine
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Daniel PANNE (EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY LABORATORY (EMBL))
Partenaires : European Molecular Biology Laboratory; Laboratoire public; Laboratoire public; Laboratoire public
Montant : 230000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Biologie structurale de l'assemblage de la chromatine et son modificationCe projet porte sur l'émergence du concept que les acetyltransferases et les chaperon d'histones agissent en synergie pour moduler la structure de la chromatine. On va étudier le rôle de l'acétylation des histones dans la mobilisation des histones et l'hypothèse selon laquelle des chaperons d'histones régulent les acétyltransférases. Nous allons étudier le rôle des domaines lecteur de la chromatine dans la reconnaissance multivalente et dans la régulation des acétyltransférases.
Role de CBP/p300 et Nap1 dans la reconnaissance et remodelage de la chromatineCe projet a pour but de comprendre l'intégration des signaux sur les promoteurs et comment ces signaux conduisent à une modification de la chromatine, son remodelage et, finalement, à l'activation des gènes. Les mécanismes qui mènent à l'activation des gènes sont à la base des circuits complexes. Ils réalisent cette complexité en utilisant l’assemblage coopératif des facteurs de transcription ‘génériques’ dans des superstructures spécifiques. Nous avons déterminé, par analyse cristallographique, la structure à haute résolution de l'interféron-bêta-enhanceosome. Cette structure nous donne la première image complète a résolution atomique d'un enhanceosome. Même si les domaines de liaison sur l'ADN sont densément disposés, leur association n'est pas coopératif. Coopérativité fonctionnelle (synergie) est fourni à un niveau différent, eg. par l'interaction avec les coactivateurs multivalent comme CBP/p300. Le enhanceosome est assemblé dans la région du enhancer qui ne contient pas de nucléosomes et le recrutement de CBP/p300 conduit à la modification et le remodelage d'un nucléosome inhibitrice positionné sur la boîte TATA et le site de départ de la transcription. CBP/p300 sont connus pour interagir avec plus de 400 facteurs de transcription et il est probable que l'interaction multivalente de ces coactivateurs est le principe général selon lequel l'intégration des signaux de l'activation de gènes est coordonnée. Notre modèle actuel est que le enhanceosome recrute plusieurs copies de CBP/p300. ‘Trans-autoacetylation’ par CBP/p300 conduit à l'activation de ces acétyltransférases sur le site de recrutement et à l'acétylation des nucléosomes. Des données récentes indiquent que le chaperon de nucléosomes Nap1 est impliqué dans le déassemblage des nucléosome par CBP/p300. Nous cherchons a comprendre en détail le rôle de autoacetylation dans l’activation de CBP/p300, ses site de fixation sur la chromatine, et son rôle dans le remodelage de la chromatine en fonction de Nap1.
Les approches utilisées pour des études structurales et fonctionnellesNous allons étudier la reconnaissance mulivalente de la chromatine par le domaine BP. Nous allons déterminer la spécificité de substrat du domaine bivalent BP de p300 et de déterminer la structure de co-cristaux de BP avec les substrats. Nous avons utilisé des étalages peptidiques qui contiennent des modifications des histones peptidiques afin de dépister une spécificité de substrat BP. Nous avons trouvé que les modifications qui sont associés à la chromatine transcriptionnellement actif tels que H3K14K18 acétylé et H3K27 sont liés par le domaine BP. Nous envisageons maintenant de confirmer la spécificité de substrat par le ITC.
Résumé de la soumission : Le remodelage de la chromatine non permissive est une caractéristique de l'expression des gènes eukaryotes. Le remodelage nécessite des enzymes de modification des histones telles que les histones acétyltransférases (HAT) et les protéines chaperons d'histones. Les enzymes HAT acétylent de façon post-traductionnelle certains résidus lysine des histones et d'autres protéines. Bien que le lien entre la modification des histones, le remodelage de la chromatine et la régulation des gènes ait été établi, les mécanismes biochimiques restent controversés. À ce jour, il ya deux modèles qui expliquent comment les modifications des histones conduisent à l'activation de la chromatine. Dans le premier modèle, les modifications des histones induisent des changements dans les propriétés physiques du nucléosome qui conduisent à une fibre de chromatine plus détendue. Dans le second modèle, les modifications covalentes des histones agissent comme des « marques » permettant le recrutement de différents complexes de modification de la chromatine. Ensemble, ces modèles sont à la base de l'hypothèse du «code histone». Celui-ci postule que les multiples modifications covalentes des queues des histones agissent de façon combinatoire pour moduler la structure de la chromatine et également pour entraîner le recrutement de différentes classes des protéines dont certains domaines distincts reconnaissent ces « marques » épigénétiques. Les chaperons d'histones constituent une classe extrêmement diversifiée de protéines acides qui jouent un rôle dans la fixation des histones et dans l'assemblage et le désassemblage des nucléosomes. Ce projet porte sur ce nouveau concept, à savoir que les activités des chaperons d'histones et des enzymes HAT agissent en synergie pour moduler la structure de la chromatine. Nous souhaiterions savoir si le transfert des histones par des chaperons nécessite l'acétylation des histones et si les enzymes HAT régulent l’activité des chaperons d'histones. Par ailleurs, nous proposons d'étudier le rôle des « domaines lecteurs de la chromatine » de certaines protéines effectrices dans la reconnaissance multivalente de la chromatine ainsi que dans la régulation des enzymes HAT. Nous allons examiner l'hypothèse que la fixation multivalente de la chromatine modifiée est au cœur du «code histone ». Les expériences de cette proposition donnent un aperçu de l'interconnexion entre l'acétylation des histones, l'assemblage et le désassemblage des nucléosomes et de contrôle épigénétique de la transcription des gènes.
Résultats : Nous avons trouvé que le module BP se lie préférentiellement à des queues d'histones diacétylés. Nous avons réussi de cristalliser le module BP dans la présence de peptides d'histones mais les résultats préliminaires montrent que ces cristaux diffractent seulement a 15A. Nous avons également commencé à enquêter sur la spécificité de substrat du module BP in vivo. Nous avons conçu des mutants dans la p300 et analysé la localisation des GFP-p300 mutants par microscopie à fluorescence. Nous avons également mis en place un test pour l’activité de la p300 in vivo. On a constaté que nous pouvons utiliser ce test pour contrôler l'effet de p300 mutants in vivo.
Perspectives : Personnel pour ce projet a été recruté et en collaboration avec d'autres membres du laboratoire a produit d'importants résultats préliminaires. Nous avons fait du progrès important avec la structure du ‘noyau’ de la p300 et la majorité de nos efforts sont maintenant dirigés vers l'analyse fonctionnelle. Ces résultats seront également importants pour la conception de nouveaux inhibiteurs avec une variété d'applications potentielles. Des mutations dans CBP/p300 sont associées à un certain nombre de pathologies, y compris le syndrome de Rubinstein-Taybi et les tumeurs hématopoïétiques et épithéliales. La grande majorité de ces mutations sont localisées dans le noyau catalytique de CBP/p300 et affectent l'activité de l’acétyltransférase et le ciblage de la chromatine. Nos données structurelles ouvriront des possibilités pour la conception de médicaments soit par inhibition du ciblage de la chromatine (Bromodomain, PHD domain) ou en inhibant l'activité de l’acétyltransférase.
Publications et brevets : Nous sommes en train de préparer deux manuscrits différents l'un sur la structure et la régulation de p300 et un autre sur l'assemblage des complexes Nap1/histone. Le dernier manuscrit comprend des données de la microscopie électronique (Guy Schoehn) et de la spectrométrie de masse non-dénaturant (Carol Robinson). Le document sera rédigé conjointement.