Projet ANR-13-BSV3-0005 – SmallRhose : Modulation du couplage transcription-traduction par les petits ARN bactériens: implication du facteur Rho
Programme : Blanc - SVSE 3 - Microbiologie, immunologie, infectiologie (Blanc SVSE 3) 2013
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Madame Nara FIGUEROA-BOSSI (Centre de Génétique Moléculaire du CNRS)
Partenaires : Centre de Génétique Moléculaire; Centre de Biophysique Moléculaire; Institut de Génétique et Microbiologie
Montant : 600000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 48 mois
Résumé : Les petits ARNs non-codants forment une famille importante de régulateurs ubiquitaires. Chez les eucaryotes supérieurs, les microARNs participent à de nombreux processus biologiques liés au développement, au vieillissement et au cancer. Chez les procaryotes, les petits ARNs (sRNAs) sont impliqués dans des mécanismes d’adaptation aux changements environnementaux ou au stress. Un groupe majeur de sRNAs bactériens agit après la synthèse de leur ARNm cibles en modulant leur traduction ou stabilité. Par leur capacité à réguler plusieurs cibles à la fois, certains sRNAs occupent des positions nodales au sein de réseaux de régulation et jouent des rôles clés dans la reprogrammation adaptative de l’expression génique.
Le présent projet découle de notre découverte d’un nouveau mécanisme de régulation sRNA-dépendante. En étudiant comment un sRNA régule négativement la partie distale d’un opéron bicistronique chez Salmonella enterica, nous avons découvert que ce sRNA induit une terminaison Rho-dépendante de la transcription dans la région amont de l’opéron. En prévalant sur le ribosome pour se fixer à l’ARNm naissant, le sRNA découple transcription et traduction et rend la machinerie transcriptionnelle sensible à la terminaison Rho-dépendante. Ces observations soulèvent plusieurs questions essentielles: ce mécanisme est-il fréquent/général? Contribue-t-il à la répression coordonnée des gènes des ARNs polycistroniques? Y a-t-il des éléments spécifiques ou des cofacteurs requis pour le recrutement de Rho par le sRNA? Existe-t-il des cas où sRNA et Rho sont concurrents pour se fixer à l’ARN? Répondre à ces questions importantes est l’objectif de ce projet.
Une part essentielle du projet vise à identifier d’autres cas de mécanismes sRNA-dépendants impliquant Rho. Des tests préliminaires de loci identifiés par analyses prédictives sont très prometteurs. L’implication de Rho dans la régulation de ces loci sera étudiée en détail par des approches de mutagenèse, de tests fonctionnels in vivo, d’enzymologie, et de transcription in vitro. Parallèlement, nous mènerons une étude systématique, à l’échelle du génome, de l’impact de l’activité de Rho sur la régulation sRNA-dépendante chez Salmonella. Cette étude par séquençage ARN haut-débit, couplé ou non à une purification préalable de complexes ARN-protéines par photopontage/immunoprécipitation (approche CLIP-seq), sera calibrée pour évaluer les réponses négatives et positives à l’inhibition de Rho et les contributions de cofacteurs pertinents comme Hfq. Les nouveaux loci identifiés par cette étude globale seront également caractérisés en détail in vivo et in vitro.
En complément de ces expériences, nous poursuivrons l’analyse du mécanisme de terminaison Rho-dépendante induite par un sRNA pour le locus où ce mécanisme a été découvert: l’opéron chiPQ. Nous avons démontré la participation de NusG pour ce site et caractériserons son rôle en détail par des approches génétiques et biochimiques. L’implication d’autres effecteurs du couplage transcription/traduction comme NusA ou la protéine ribosomale S10 (NusE) sera également explorée. Enfin, nous utiliserons des techniques d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour analyser la composition du complexe d’élongation le long du gène chiP lorsque la traduction de l’ARNm chiPQ est normale, réprimée par son sRNA ou terminée prématurément par un codon Stop. Nous espérons ainsi révéler des facettes nouvelles de la transcription procaryote et du couplage traduction/transcription.
Les deux années écoulées ont vu l’intérêt pour Rho décuplé par la découverte de nouveaux rôles biologiques importants. Nos travaux ont contribué à cet inventaire et nous anticipons que notre programme continuera d’alimenter avantageusement cette thématique en procurant une vision exhaustive des interactions fonctionnelles entre Rho et sRNAs. En prime, notre programme offrira le premier catalogue des sites de terminaison Rho-dépendante chez le pathogène modèle Salmonella.