Projet ANR-10-BLAN-1609 – repinsCFS : Réplication et instabilité des sites fragiles communs
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Michelle DEBATISSE (INSTITUT CURIE - SECTION DE RECHERCHE)
Partenaires : Dynamique de l'Information Génétique : Bases Fondamentales et Cancer; Dynamique de l'Information Génétique : Bases Fondamentales et Cancer
Montant : 524875.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : Mécanismes moléculaires responsables de l'instabilité de certaines régions du génome humainCertaines régions des chromosomes humains (les «sites fragiles«) sont particulièrement instables et sont à l'origine d'anomalies chromosomiques impliquées dans l'apparition de cellules tumorales. Les mécanismes moléculaires responsables de cette instabilité n'étaient pas connus lorsque ce projet à démarré.
Rôle des processus de duplication de l'ADN dans l'instabilité des sites fragilesUn certain nombre d'arguments suggéraient que la façon dont se duplique l'ADN au niveau de ces sites fragiles au cours de la division de la cellule (la réplication) pourrait présenter des particularités qui expliqueraient leur fragilité. Nous avons donc étudié en détail la réplication de l'ADN au niveau de ces sites.
Méthodes moléculaires d'étude des chromosomes et de l'ADNDes sondes fluorescentes permettant de marquer des régions spécifiques des chromosomes ou de l'ADN ainsi que la technique de peignage moléculaire de l'ADN qui permet d'obtenir des molécules d'ADN régulièrement étirées sur une lame ont été utilisées. Des méthodes à haut débit, permettant de déterminer la chronologie de réplication de toutes les régions du génome, ont également été mises à contribution. Ces techniques ont permis de visualiser en détail comment se réplique l'ADN au niveau des sites fragiles.
Résumé de la soumission : Nos projets visent à analyser la régulation de la réplication de l’ADN et ses relations avec l’instabilité chromosomique dans les cellules de mammifères, notamment au niveau des sites fragiles communs (SFCs). Ces sites, qui s’étendent sur des milliers de kilo bases, sont fréquemment associés aux réarrangements chromosomiques identifiés dans un certain nombre de maladies héréditaires affectant le système nerveux et dans les cellules des tumeurs. Ces réarrangements résultent de la réparation imparfaite des cassures qui surviennent de façon récurrente au niveau des SFCs lorsque les cellules sont soumises à des stress réplicatifs. Cette relation entre perturbation de la réplication et activation des sites suggère que les SFC constituent des séquences intrinsèquement difficiles à répliquer. Cependant, les bases moléculaires de leur susceptibilité aux perturbations de la réplication ne sont pas connues. Nous proposons ici de nous appuyer sur les compétences techniques et les acquis fondamentaux obtenus par le partenaire 1 dans le domaine de l’analyse de la réplication pour élucider les mécanismes conduisant à la fragilité des SFCs.La position des SFCs est bien documentée au niveau cytogénétique mais très mal au niveau moléculaire. En nous basant sur une observation originale faite récemment au laboratoire, nous utiliserons une technique de séquençage à haut débit pour déterminer, pratiquement au niveau nucléotidique, la position des SFCs du génome humain. Il a été proposé, mais jamais démontré que la séquence nucléotidique des SFC pourrait favoriser la formation de structures secondaires susceptibles de ralentir et/ou de bloquer la progression des fourches de réplication. Nous analyserons par peignage moléculaire la dynamique de la réplication au niveau de deux SFC du génome humain (FRA3B et FRA8CD) dans des lymphocytes et des fibroblastes. En effet, il est connu que la fragilité de la plupart des SFC est plus grande dans les lymphocytes que dans les fibroblastes. Nos premiers résultats montrent que, dans ces deux types cellulaires, la région la plus instable de FRA3B ne diffère du reste du génome ni pour la vitesse de progression des fourches ni pour l’existence de sites de pause. Par contre, nous avons montré que les sites d’initiation sont régulièrement distribués le long du site dans les fibroblastes alors qu’une grande zone de 800 kb apparaît dépourvue d’origines dans les lymphocytes. Nous déterminerons si cette différence de pattern d’initiation est liée au niveau d’expression du très grand gène FHIT qui niche dans ce site, niveau qui est plus élevé chez les lymphocytes que chez les fibroblastes. Ce point sera abordé par l’obtention d’hybrides cellulaires lymphocytes-fibroblastes. Par ailleurs, nous avons précédemment montré que, chez des cellules de hamster, l’efficacité des origines corrèle avec la taille des boucles de chromatine, laquelle dépend au moins en partie de l’activité transcriptionnelle de la région. Nous déterminerons donc l’organisation des boucles de la chromatine au niveau de FRA3B dans les deux types cellulaires. Par ailleurs, nous avons des résultats préliminaires suggérant (i) que les initiations détectées chez les fibroblastes dans la région de 800 kb pourraient correspondre à des origines « de sauvetage » très tardives qui ne se déclencheraient pas chez les lymphocytes et (ii) que le point de contrôle de la réplication serait moins efficace chez ces derniers que chez les fibroblastes. Plusieurs approches expérimentales sont proposées pour confirmer ces deux points. Ces analyses seront étendues au site FRA8CD. L'ensemble des résultats escomptés devrait permettre de déterminer les particularités de la réplication des SFC, de comprendre comment ces particularités peuvent rendre compte de leur fragilité et de déterminer quel rôle joue le point de contrôle de la réplication dans l'expression de leur fragilité.
Résultats : Nous avons démontré que, contrairement à une idée largement rependue, les sites fragiles ne sont pas les mêmes dans différents types cellulaires (lymphocytes, fibroblastes, cellules épithéliales). Leur présence (ou absence) ne dépend donc de séquences particulières de l'ADN mais est déterminée par la façon dont est empaqueté l'ADN par les protéines chromatiniennes c'est-à-dire épigénétiquement. De plus, nous avons montré que cette organisation de la chromatine s'accompagne d'une distribution différente des endroits où démarre la réplication dans le site selon le type cellulaire. Ceci permet d'expliquer pourquoi le site est fragile dans un type cellulaire et non dans un autre: une raréfaction des points de démarrage de la réplication dans un type cellulaire particulier a pour conséquence un risque accru que la réplication du site ne soit pas terminée lorsque la cellule entrera en division, ce qui provoquera des cassures de l'ADN et donc une instabilité de ce site dans ces cellules.
Perspectives : Il reste maintenant à comprendre comment l'organisation de la chromatine dicte la position des points de démarrage de la réplication en fonction du type cellulaire.
Publications et brevets : Letessier et al. (2011) Cell-type specific replication initiation programs set fragility of the FRA3B fragile site. Nature, 470, 120-123.
Première démonstration qu'une distribution particulière des points de démarrage de la réplication permet de rendre compte de la fragilité du site FRA3B dans les lymphocytes et premiers résultats indiquant que les sites fragiles diffèrent selon le type cellulaire.
Le Tallec B.et al. (2011) Molecular profiling of common fragile sites in human fibroblasts. Nature Struct. Mol. Biol.,  18, 1421-1423.
Démonstration que la position des sites fragiles diffère extensivement entre lymphocytes et fibroblastes humains et confirmation et extension à plusieurs sites du rôle de la distribution particulière des points de démarrage de la réplication dans leur fragilité.