Projet ANR-06-BLAN-0290 – IRES function : Investigation into the molecular determinants that control IRES-mediated translation in higher Eukaryotes
Programme : Programme blanc (BLANC) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : INSTITUT NATIONALE DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE ADR5 LYON (INSTITUT NATIONALE DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE ADR5 LYON)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 450000.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 36 mois
Résumé : Chez les eucaryotes, la traduction est l'une des dernières étapes du contrôle de l'expression génique et joue un rôle majeur dans de nombreux processus du métabolisme cellulaire tels que la croissance, la prolifération et le développement. La synthèse des protéines peut être divisée en trois grandes étapes: l'initiation, l'élongation et la terminaison avec un contrôle particulièrement stringent de la phase d'initiation. Ce contrôle s'exerce en cis par l'architecture même de l'ARN messager (présence de structures secondaires, tertiaires, séquences IRES) et/ou en trans par le jeux des facteurs d'initiation (eIF). Ces protéines sont nécessaires pour permettre: (i) l'ancrage du tRNA initiateur sur la petite sous-unite du ribosome (grâce a eIF2); (ii) l'attachement du ribosome sur l'ARN (catalysé par eIF4F et eIF3) et (iii) la progression du ribosome jusqu'au codon d'initiation (par le biais de eIF1 et eIF4F).   Le projet que nous souhaitons réaliser consiste à étudier les trois étapes décrites ci-dessus en prenant comme modèle d'étude des ARN qui utilisent le mécanisme d'initiation classique ou IRES-dépendant. D'un point de vue technique, différentes conditions seront créées in vitro et in vivo et les techniques employées feront appel à des systèmes de traduction en lysat et en cellules, à des tests biochimiques d'interaction entre ARN-ARN et/ou ARN/protéines, des ARN interférents ainsi que des modélisations structurelles par empreintes enzymatiques et chimiques.  Les parties 1 et 2 se concentreront sur le rôle des acteurs protéiques: facteurs d'initiation et protéines chaperonnes cellulaires alors que les parties 3 et 4 seront centrées sur l'influence des structures d'ARN dans le processus d'entrée interne du ribosome.  De manière très synthétique, les 4 différentes étapes de ce travail sont résumées comme suit:  1- Une partie très technique du projet consistera à mettre en place un système in vitro d'initiation de la traduction reconstitué à partir de ribosomes, tRNA et facteurs d'initiation purifiés ou recombinants.  Nous nous attacherons ensuite à étudier particulièrement les implications de eIF4E et eIF4G et leur rôle au cours de l'étape d'attachement et de progression du ribosome sur l'ARN, que ceci soit réalisé par le biais d'une séquence IRES ou par entrée au niveau de la coiffe.   2- Etude du rôle des protéines chaperonnes sur la traduction. Ces protéines cellulaires ubiquitaires ne sont pas des facteurs d'initiation mais sont impliquées dans diverses étapes du métabolisme de l'ARN. En règle générale, elles présentent une haute affinité pour les acides ribonucléiques et permettent d'assister leur repliement dans l'espace d'où le terme de chaperonnes. Parmi les composants de la famille chaperonne, on trouve la forme cellulaire de la protéine du prion (PrPc), la protéine du syndrome du X fragile (FMRP) et des facteurs d'épissage comme ASF/SF2; tous ces polypeptides présentent des caractéristiques biochimiques communes mais leur rôle putatif au niveau de la traduction (coiffe et IRES) reste à definir.  3- Les caractéristiques traductionnelles uniques du rétrovirus endogène Gypsy de D.melanogaster font de cet élément un excellent paradigme pour l'étude du mécanisme d'entrée interne du ribosome. En effet, l'ARN génomique de Gypsy possède deux séquences IRES contigües mais néanmoins indépendantes dont l'une (IRES D1) n'est pas exprimée en culture de cellules. De manière interessante, D1 possède un motif décanucléotidique qui est répété 12 fois au sein de la séquence D1. De fait, nous émettons l'hypothèse que cette empreinte puisse être impliquée dans la régulation traductionnelle de Gypsy soit par la fixation d'un répresseur, soit par la structure d'ARN qu'il engendre.   4- Finalement, le rôle des structures d'ARN dans le mécanisme d'entrée interne du ribosome sera étudié en construisant un système d'IRES composite. Pour cela, une séquence IRES bien caractérisée au niveau structural (comme EMCV) sera scindée en deux parties ...