Projet ANR-13-JSV7-0007 – RHIZORG : Organisation de la communauté microbienne et devenir des polluants dans la rhizosphère
Programme : JCJC - SVSE 7 - Biodiversité, évolution, écologie et agronomie (JCJC SVSE 7)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Madame Aurélie Cébron (Laboratoire Interdisciplinaire des Environnements Continentaux)
Partenaires : Laboratoire Interdisciplinaire des Environnements Continentaux
Montant : 227000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : Rôle structurant des racines sur la biodégradation bactérienne des hydrocarbures.Le type de plante induit des modifications spatiales au cours de leur croissance au niveau de la rhizosphère (zone de sol autour des racines). Une structuration de la diversité des communautés bactériennes apparaît en profondeur le long des racines. Toutefois la biodégradation des hydrocarbures, bien que variant selon la présence ou non de plante ou le type de plante, n’est pas influencée spatialement par l’activité racinaire.
Dynamique spatio-temporelle de la biodégradation des hydrocarbures et des communautés bactériennes dans la rhizosphère.Les pollutions organiques (hydrocarbures) peuvent être traitées par l’action conjointe des plantes et des microorganismes rhizosphériques. Toutefois, ce procédé de phytoremédiation a montré des niveaux d’efficacité contrastés. Notre hypothèse est que la forte variabilité spatio-temporelle des processus au sein de la rhizosphère induit des résultats très variables selon le type de plante, le stade de croissance, le temps de contact entre la plante et le sol pollué, etc… En vu d’optimiser ces procédés de remédiation, il est essentiel de mieux comprendre : 1) la variabilité spatiale dans la rhizosphère à l’échelle centimétrique, distance d’influence des racines sur les processus microbiens, 2) l’évolution temporelle de la diversité microbienne et de la biodégradation des hydrocarbures au cours de la croissance des plantes, 3) la diversité et l’activité des populations impliquées dans la biodégradation des hydrocarbures sous l’influence ou non de plantes.
Combinaison originale d’outils de microbiologie, biologie moléculaire, d’isotopie, de microspectroscopie et de géostatistiques.Des rhizotrons et microcosmes à compartiments ont été développés pour observer le développement racinaire, échantillonner le sol sans destructuration et mettre en contact les racines avec du sol pollué pendant différents temps. A partir des ADN et ARN extraits de nos sols et grâce au séquençage haut débit de gènes marqueurs spécifiques, nous accédons à la structure et diversité des communautés microbiennes. Ainsi une modélisation géostatistique en 2D a été réalisée sur de nombreux paramètres physico-chimiques et biologiques. Les microorganismes impliqués dans la biodégradation des hydrocarbures ont été : 1) isolés en culture pure pour étudier leur capacité métaboliques et leur physiologie par microspectroscopie Raman ; 2) identifiés et caractérisés au niveau génomique grâce à l’utilisation d’hydrocarbures marqués au 13C.
Résumé de la soumission : La rhizoremediation (bioremédiation assistée par les plantes) semble être une technique intéressante sur le long terme pour des sols de friches industrielles fortement contaminés en polluants organiques, tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP). La littérature montre cependant des résultats contrastés, la biodégradation des HAP dans la rhizosphère est dans certains cas activée et dans d’autres cas inhibée. Des variations spatiales et temporelles pourraient engendrer de tels résultats contrastés. Un sol est hétérogène de part : ses propriétés intrinsèques, la répartition des polluants et des microorganismes et la présence de plantes qui modifie les conditions autour de leurs racines (effet rhizosphère). Il est donc essentiel de prendre en compte les variations spatiales pour mieux comprendre le devenir des polluants dans les sols en présence de plantes. Dans le projet RHIZORG, toutes les expériences seront menées sur un sol largement étudié par les membres du GISFI (www.gisfi.fr; friche industrielle de l’ancienne cokerie de Neuves-Maisons, 54, France). Le sol sera re-contaminé avec un mélange complexe de polluants (extrait organique issu du même sol) afin d’accroître la biodisponibilité et biodégradation des HAP. Le ray-grass sera choisi comme plante de référence car pousse correctement sur des sols fortement contaminés et a été utilisé dans beaucoup d’études de phytoremédiation. Le projet s’articulera autour d’analyses des polluants organiques (HAPs et composés aromatiques polaires CAPs) et d’analyses de la communauté microbienne dans la rhizosphère. Les 3 objectifs du projet RHIZORG sont de : 1) Déterminer les variations spatio-temporelles de la communauté microbienne et des polluants au cours de la croissance des plantes et du développement racinaire à une échelle centimétrique ; 2) Identifier les microorganismes impliqués dans la biodégradation des HAP et les voies métaboliques mises en jeu en présence ou en absence de plantes ; 3) Observer l’organisation des microorganismes et des polluants à proximité des racines à une échelle micrométrique. Une tâche scientifique dédiée permettra de répondre à chacun des 3 objectifs. Le projet RHIZORG va focaliser sur la diversité bactérienne taxonomique et fonctionnelle en utilisant des méthodes complémentaires : dépendant de la mise en culture (plaques Biolog® MT à développer pour faire des profils métaboliques de dégradation des polluants organiques), méthodes moléculaires (extraction des ADN, empreintes moléculaires TTGE, qPCR, pyroséquençage d’amplicons d’ADNr 16S, métagénomique), microspectroscopie (épifluorescence, confocale, Raman). Pour atteindre nos objectifs, de nouveaux dispositifs expérimentaux seront développés. Pour répondre au 1er objectif, un rhizotron original sera développé, il comportera des ouvertures pour échantillonner à différents temps. Une stratégie d’échantillonnage multiple calibrée spatialement sera utilisée pour collecter et analyser suffisamment d’échantillons pour réaliser une cartographie géostatistique des données (biomasse racinaire, concentrations en polluants, indices de diversités des communautés bactériennes, abondance des gènes fonctionnels). Pour étudier les acteurs de la biodégradation des HAP, des dispositifs en pots seront développés pour combiner l’utilisation d’un HAP marqué au 13C (Stable Isotope Probing SIP) avec la croissance des plantes. La diversité et le métagénome des populations actives seront identifiés par pyroséquençage. La troisième tâche aura pour objectif de décrire l’organisation spatiale à micro-échelle des microorganismes et des polluants à proximité des racines grâce à des observations microscopiques de sections fines de sol non déstructuré pour in fine extrapoler cette organisation à tout le système racinaire. La technique de Fluorescent in situ Hybridization (FISH) sera adaptée et le système racinaire sera décrit en tomographie aux rayons-X.
Résultats : Les outils de géostatistiques ont permis de visualiser des gradients racinaires en fonction de la profondeur, et de modéliser les différences créées par les différentes plantes à l’échelle centimétrique. La diversité bactérienne est influencée par : le type de plante, la présence ou non de plante et des gradients rhizosphériques en profondeur. Ces gradients de biomasse racinaire, de pH et de nature des exsudats expliquent la structuration spatiale des assemblages microbiens mais pas la structuration hétérogène des hydrocarbures. 
Sur une cinétique de 10 jours, la biodégradation des hydrocarbures est ralentie en présence de plante, mais sur une période de plus d’1 mois, elle est quasiment identique avec ou sans plante et peu importe le type de plante. Grâce à l’utilisation d’hydrocarbure marqué au 13C les espèces bactériennes impliquées dans leur biodégradation ont été identifiées par séquençage de leur métagénome. De plus certaines de ces bactéries ont été isolées en cultures pures et leur physiologie en présence ou non d’hydrocarbure et dans différents milieux plus ou moins complexes est étudiée.
Perspectives : A l’issus du projet l’ensemble de ces données conduiront à une meilleure compréhension de l’organisation spatiale et de l’évolution temporelle des communautés microbiennes et du processus de biodégradation des hydrocarbures dans la rhizosphère. Nous connaitrons mieux les bactéries impliquées dans la biodégradation des hydrocarbures in situ, ainsi que leur capacité métaboliques et leur physiologie dans des écosystèmes complexes. Nous pourrions alors élargir nos conclusions à d’autres sols, d’autres types de plantes et à d’autres polluants.
Publications et brevets : - Participation à 7 congrès internationaux (dont 4 présentations orales et 6 posters)
- Participation à 4 congrès nationaux (dont 1 présentation orale et 4 posters)
- Publications dans des revues de Rang A :
- Bourceret A, Cébron A, Tisserant E, poupin P, Bauda P, Beguiristain T, Leyval C (2016) The bacterial and fungal diversity of an aged PAH- and heavy metal-contaminated soil is affected by plant cover and edaphic parameters. Microbial Ecology. 71(3), 711-724. DOI: 10.1007/s00248-015-0682-8 
- Thomas F, Lorgeoux C, Faure P, Billet D, Cébron A (2015) Isolation and substrate screening of polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria from soil with long history of contamination. International Biodeterioration & Biodegradation. DOI: 10.1016/j.ibiod.2015.11.004 
- Bourceret A, Leyval C, de Fouquet C, Cébron A (2015) Mapping the centimeter-scale spatial variability of PAHs and microbial populations in the rhizosphere of two plants. PlosONE. 10(11): e0142851. 
- Thomas F, Cébron A (2016) Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. DOI: 10.3389/fmicb.2016.00092