Projet ANR-15-CE11-0029 – NEWOPTOGENETICSTOOLS : Nouveaux canaux et transporteurs régulés par la lumière pour l'optogénétique
Programme : Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire (DS0401) 2015
Année de financement : 2015
Coordinateur du projet : Monsieur michel vivaudou (Institut de Biologie Structurale)
Montant : 508995.0 euros
Date de début : 2016
Durée : 36 mois
Résumé : L’optogénétique est une avancée technologique majeure qui révolutionne notre capacité à étudier les processus neuronaux, promettant de nouvelles approches pour le traitement de différentes maladies et handicaps. Les outils de base de l’optogénétique sont les opsines, protéines membranaires contrôlées par la lumière. Malheureusement, peu d’opsines sont utilisables. Il s’agit essentiellement du canal non sélectif channelrhodopsine ChR2 (découvert par le partenaire MPI) utilisé pour dépolariser et ainsi activer les neurones, et de la pompe à chlorure halorhodopsine NPHR et la pompe à protons archaerhodopsine ArCH3, toutes deux utilisées pour hyperpolariser et ainsi inactiver les neurones.
Une voie pour faire progresser l’optogénétique est d'identifier et/ou concevoir de nouvelles protéines photosensibles avec de nouvelles propriétés, comme des canaux et des transporteurs ayant une forte sélectivité et conductivité pour certains ions. Les ions Na+, K+, Ca2+, pertinents pour la fonction neuronale, n’ont, jusqu’à présent, pas été conciliables avec les rhodopsines microbiennes. En particulier, un pompe K+ serait souhaitable, car K+ est l'ion utilisé principalement pour la re- et hyper-polarisation neuronale.
Notre projet se compose de 2 parties complémentaires.
La 1ere partie, la production de nouvelles pompes photoactivables, est basée sur les travaux récents de membres de notre consortium. La structure de l'état basal de la seule pompe Na+ connue, Krokinobacter eikastus rhodopsine 2 (KR2), a été résolue à haute résolution. Elle a révélé la voie de translocation des ions et a permis de concevoir une pompe K+ photosensible [Gushchin et al, Nat Struct Mol Biol, 2015; Demande de brevet européen par Gordeliy, Bamberg et al, 2015]. Ces données constituent une première étape. Nous proposons d’optimiser ces pompes en améliorant l'expression dans les neurones de KR2 et de ses variants sélectifs pour le K+. En outre, à partir de banques génomiques, nous rechercherons et caractériserons de nouvelles pompes Na+ ayant des propriétés différentes de KR2 afin d'identifier les meilleurs candidats pour l’optogénétique. Ces candidats serviront à concevoir de nouvelles pompes K+ dont le potentiel en optogénétique sera évalué in vitro et in vivo. Pour comprendre le mécanisme du transport d’ions, une connaissance atomique des états intermédiaires du photocycle est nécessaire. Nous résoudrons les structures des états intermédiaires de KR2 et de la pompe K+ dérivée. Ces informations structurales permettront la conception rationnelle de pompes optimisées, et seront aussi utilisées pour élaborer une pompe Ca2+ photoactivable.
La 2ème partie porte sur les canaux. Les tentatives pour altérer la sélectivité cationique de ChR2 ont connu un succès limité. Une raison est que le mécanisme de perméation est encore mal compris. Nous combinerons biologie structurale et biologie computationnelle pour décrire le processus de perméation et sélectivité, et définir une stratégie pour la conception de canaux sélectifs. Une étape importante sera l’obtention de structures des états intermédiaires de ChR2.
Le consortium de 3 équipes françaises et 3 équipes allemandes intègre des pionniers de l’étude des protéines photosensibles et de l’optogénétique. Il réunit des compétences complémentaires couvrant l’essentiel des techniques actuelles, des plus élémentaires - production de protéines photosensibles, analyse fonctionnelle et structurale, caractérisation biophysique, conception rationnelle – aux plus appliquées – utilisation de protéines photoactivables en neuroscience, des cellules en culture au nématode C. elegans.
Nos ambitions sont (1) d'établir une plate-forme à haut débit pour l’étude des pompes et canaux photosensibles, facilitant ainsi la sélection et la conception de nouveaux outils optogénétiques, (2) d'élargir nos connaissances des mécanismes des rhodopsines, et (3) de proposer un ensemble de nouvelles protéines photosensibles nécessaires à l’essor de l’optogénétique.