Projet ANR-12-BS10-0009 – Opt-Spect-HS-AFM : Intégration de la microscopie optique avec la microscopie à forces atomiques à haute vitesse et développement de la spectroscopie moléculaire de forces à haute vitesse
Programme : Blanc - SIMI 10 - Nanosciences (Blanc SIMI 10)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Simon Scheuring (Structure and Assembly of Membrane Proteins in Native Membranes by Atomic Force Microscopy)
Partenaires : Bio Atomic Force Microscopy Laboratory; Bio Atomic Force Microscopy Laboratory
Montant : 429993.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Opt-Spect-HS-AFMIntégration de la microscopie optique avec la microscopie à forces atomiques à haute vitesse et développement de la spectroscopie moléculaire de forces à haute vitesse
Objectifs: Rapport T0+06- Single membrane proteins on eukaryotic cells visualized with a high-speed atomic force microscope - optical microscope hybrid setup.- Greffage électrostatique de nanocristaux de diamant.
Méthodes: Rapport T0+06- Integration of an optical microscopy (OM) path into HS-AFM, allowing bright field and fluorescence microscopy, without loss of HS-AFM performance- HS-AFM imaging on cells- Choix du polymère et des nanocristaux de diamant- Optimisation et reproductibilité du procédé de greffage par voie électrostatique- Mise au point d’une technique d’auto-assemblage de nanocristaux de diamant
Résumé de la soumission : La microscopie à force atomique AFM possède des capacités uniques pour l'imagerie haute résolution de biomolécules dans des conditions natives (solution physiologique, température ambiante, pression atmosphérique) et par conséquent, c'est un outil idéal pour la caractérisation de la dynamique de biomolécules. Pour répondre aux besoins des AFMs pour l'observation de mouvements moléculaires, une nouvelle génération d’AFM à haute vitesse (HS-AFM) a été développée qui présentent des vitesses de balayage trois ordres de grandeur supérieurs aux précédents AFM tout en conservant la résolution de molécules individuelles.L’INSERM U1006 développe l’imagerie HS-AFM en biologie (1,2). Au niveau international, seul une douzaine de laboratoires développent cette technique. Pourtant, l’imagerie HS-AFM est une technique très jeune et reste encore limitée aux échantillons biologiques hautement purifiés et contrôlés. Pour parvenir à étudier des échantillons plus natifs et les cellules vivantes, il est indispensable d’améliorer les capacités de (i) reconnaissance moléculaire, (ii) placement de la pointe, et (iii) reproductibilité de la méthode d'imagerie HS-AFM. Dans ce projet, ces problèmes sont visés pour des études plus poussées et obtenir ainsi une plus grande pertinence des études biologiques et médicales.Une des premières actions du projet consistera à développer une nouvelle procédure pour obtenir des pointes d’AFM à très faible rayon de courbure local afin d'améliorer la reproductibilité des images à haute résolution obtenues par HS-AFM. Nous avons développé un nouveau concept pour fabriquer les meilleures pointes possibles avec un apex pointu au dessus d'une pointe de forme globulaire. L’apex pointu assurera la haute résolution, tandis que la pointe globulaire permettra un contrôle précis des forces électrostatiques entre la pointe et l’échantillon afin d’éviter son endommagement. Ces pointes sont idéales pour imager des protéines membranaires (3), qui sont impliquées dans les mécanismes les plus courants de la vie comme la génération d’énergie, la transduction de signaux, le transport de métabolites, et le ciblage de médicaments (4).Ce projet vise également le développement d’un couplage de la microscopie de fluorescence avec le HS-AFM afin d'augmenter ces capacités de reconnaissance moléculaire. L'intégration de la microscopie optique ne devra pas altérer les performances de vitesse et de résolution du microscope HS-AFM. Des travaux importants seront donc menés sur la réalisation de composants optiques sophistiqués. A termes, ce système permettra d'étudier les protéines membranaires directement dans les cellules vivantes, y compris les lignées cellulaires pathologiques.De plus, le microscope HS-AFM sera développé comme outil d’étude du pliement de protéines. En effet, le levier court du microscope HS-AFM présent un bas bruit vibrationnel. L'objectif est de mettre à profit la haute vitesse de réponse du HS-AFM pour caractériser, pour la première fois, des états transitoires et vibrationnels de repliement de protéines (5) et certaines autres interactions (6) dans la gamme de la microseconde. L’étude du repliement de protéines est un défit de recherche fondamental mais intervient également dans de nombreuses pathologies (7).En résumé, ce projet vise à réaliser d'importantes améliorations sur un microscope HS-AFM qui ouvriront la porte à l’acquisition de nouvelles données auparavant inaccessibles sur la structure, la dynamique et l'assemblage de protéines et sur les cellules. L'expertise du laboratoire U1006 INSERM dans l'imagerie de membranes cellulaires par AFM sera mise à profit. Le sous-traitant Fichou optique travaillera pour le développement des composants optiques dédiés au couplage du HS-AFM et de la microscopie optique. Le Laboratoire Capteurs Diamant du CEA  développera  une nouvelle génération de pointes basée sur le dépôt de nanocristaux de diamant sur des pointes AFM afin d'obtenir de hautes résolutions d'imagerie.
Résultats : -Successful development of hybrid HS-AFM / OM setup.
-Imaging on cells ~1000 times faster than conventional AFM/OM setups.
-Optimisation de la reproductibilité du dépot de nanocristaux.
-Utilisation des substrats de silicium de 10x10 mm2 avec une solution de nanocristaux de type SYNDIA à une concentration de nanocristaux à 0,005%.
-Immersions contrôlées avec un dip-coater (ultérieurement remplacé par un système de micromanipulation pour les pointes AFM).
Perspectives : -Development of a small cantilever atomic force microscope to perform high-speed single molecule force spectroscopy (HS-SMFS), with a cantilever of 1MHz resonance frequency.
-Greffage électrostatique de nanocristaux sur pointes AFM
-Premiers essais auto-assemblage sur pointe AFM
-Fixation par voie plasma & optimisation du procédé plasma
-Nucléation et croissance par voie plasma : essais sur pointes AFM
Publications et brevets : A hybrid high-speed atomic force-optical microscope for visualising single membrane proteins on eukaryotic cells
Nature Communications, 2013, 4: 2155, DOI:10.1038/ncomms3155
Adai Colom, Ignacio Casuso, Felix Rico & Simon Scheuring*
High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations
Science, 2013, 342 (6159): 741-743
Felix Rico, Laura Gonzalez, Ignacio Casuso, Manel Puig & Simon Scheuring*