Projet ANR-15-CE07-0022 – EasyMiniProt : Outils chimiques innovants pour la synthèse de peptides riche en ponts disulfure , une classe émergente de molécules d'intêrêt thérapeutique
Programme : Chimie Durable, produits, procédés associés (DS0304) 2015
Année de financement : 2015
Coordinateur du projet : Monsieur Vincent AUCAGNE (Centre National de la Recherche Scientifique-Centre de Biophysique Moléculaire)
Partenaires : Laboratoire public; Laboratoire public; Laboratoire public
Montant : 498231.0 euros
Date de début : 2015
Durée : 42 mois
Résumé : Les peptides riches en ponts disulfure (DRPs) forment un groupe incroyablement diversifié de produits naturels bioactifs (des millions de séquences). Ces peptides polycycliques à conformation contrainte sont composés de 10 à 90 acides aminés (aa) dont plus de 10% de cystéines impliquées dans des ponts disulfure. Beaucoup de ces miniprotéines ont été identifiées comme ligands puissants et sélectifs de récepteurs étant des cibles majeures pour des applications thérapeutiques ou diagnostiques. Un nombre croissant de DRPs, d'origine naturelle ou obtenus par ingénierie, sont actuellement en essais cliniques ou sont récemment entrés sur le marché. 
Si les DRPs de petite taille (<30 aa) peuvent être synthétisés par synthèse peptidique en phase solide (SPPS) classique, la synthèse de DRPs plus longs représente encore un réel défi. La plupart des efforts actuels se concentrent sur leur production par synthèse convergente en phase liquide, via des couplages chimiosélectifs de segments peptidiques non protégés par la réaction de ligation chimique native (NCL). Mais ces approches n’ont qu’un très faible débit et sont compliquée par de nombreuses étapes de purification chromatographique. Cela limite et ralentit les études pharmacologiques et les applications.
Ce projet est centré sur le développement de technologies pour la synthèse de DRPs à un débit beaucoup plus élevé que les méthodes existantes. Un aspect clé pour intensifier les procédés actuels repose sur la réalisation des couplages chimiosélectifs des segments peptidiques sur un support solide, afin de considérablement réduire le nombre d'étapes intermédiaires de purification par HPLC. L'assemblage des miniprotéines dans la direction opposée à celle de la SPPS présente un avantage additionnel d’"auto-purification", permettant l'utilisation de segments peptidiques bruts. Nous allons évaluer plusieurs méthodes en parallèle sur un ensemble de DRPs représentatifs:
(1) Une méthode entièrement basée sur NCL. Cela implique une stratégie pour masquer temporairement la réactivité du thioester pour empêcher la cyclisation ou l’oligomérisation des segments. Cette approche offre l'avantage de n’utiliser que deux types de réactions, la NCL et le démasquage, ce qui est particulièrement intéressant pour une automatisation future du processus. Le principal goulot d'étranglement de la NCL est la synthèse des partenaires peptides thioesters. Nous avons développé une méthodologie très simple et efficace qui sera utilisée tout au long du projet. 
(2) Afin de minimiser le nombre d'étapes synthétiques en supprimant la nécessité de masquage, nous exploiterons une combinaison de trois réactions chimiosélectives différentes utilisées en alternance: NCL, cycloaddition azoture / alcyne promue par tension de cycle (SPAAC) ou catalysée par le cuivre (CuAAC).  Ces réactions seront utilisées pour greffer le premier segment sur un support solide puis pour l’élongation par ligation. Nous mettrons en œuvre notre approche originale de ligation triazole peptidomimétique (PTL) exploitant le triazole produit par la CuAAC comme mime de liaison amide.
(3) Le repliement oxydatif pour former régiosélectivement les ponts SS peut être un facteur limitant: si les DRPs d’origine naturelle peuvent la plupart du temps être replié sous contrôle thermodynamique, ceci implique l'utilisation de conditions très diluées. Nous allons exploiter le support solide utilisé pour leur synthèse pour cette étape de repliement. Une approche originale basée sur des fragments avec SS préformés sera également mis en œuvre.
Enfin, les méthodes développées seront appliqués à la génération à haut débit d'un grand nombre de variants diversifiés d'un DRP, la toxine muscarinique 7 du venin de mamba, qui est particulièrement prometteuse d'un point de vue thérapeutique. En particulier, nous allons utiliser une approche innovante de combinaison par fragments. Nous nous attendons à identifier plusieurs variants avec des profils pharmacologiques inédits.