Projet ANR-10-BLAN-1509 – ReceptOrient : Observation de l'activation du récepteur des lymphocytes T (TCR) en temps réel: suivi des orientations dynamiques du domaine intracellulaire du complexe récepteur dans les cellules vivantes par imagerie en fluorescence polarisée résolue de temps
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Hai-Tao HE (CNRS - DELEGATION REGIONALE PROVENCE)
Partenaires : Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy; Institut Fourier
Montant : 515000.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Observation de l'activation du récepteur des cellues T en temps réelSuivi des orientations dynamiques du domaine intracellulaire du récepteur de cellule T (TCR) dans les cellules vivantes par imagerie en fluorescence polarisée résolue de temps
ReceptOrient : franchir une étape importante dans notre compréhension sur le mécanisme d'activation de lymphocyte TNous étudierons le processus d'activation du TCR – initiation de cascades signalisation intracellulaire suite à l'engagement du récepteur par son ligand pMHC. Les études récentes dans les systèmes modèles suggèrent qu'une étape essentiel et le plus précoce dans l’activation du TCR est le changement conformationel /re-orientation des sous-unités CD3epsilon et CD3zeta du complexe TCR/CD3, permettant ainsi leur phosphorylation. Dans le projet de ReceptOrient, nous avons l'intention de tester et d’investiguer davantage sur ce modèle en analysant l'orientation moléculaire et la diffusion rotationnelle pour les composantes du complexe TCR/CD3 dans la membrane des lymphocytes T vivantes
Visualiser l'activation du récepteur des cellules T par P-SMT et P-FCSNous mettrons d'abord en place les techniques de l’imagerie en fluorescence polarisée résolue de temps tell que la suivie de molécule unique polarisée (P-SMT) et la spectroscopie de corrélation de fluorescence polarisé (P-FCS). En parallèle, nous développerons des sondes fluorescents via de l’ingénierie génétique moléculaire qui sont conçus spécialement pour les expériences de l’imagerie de fluorescence polarisée pour les composantes du TCR/CD3. Après ces premières stades expérimentaux, nous accomplirons alors des mesures d'orientation moléculaire et de diffusion rotationnelle pour les composantes du TCR/CD3, aussi bien avant et qu’après la stimulation du TCR par pMHC
Résumé de la soumission : ReceptOrient est un projet interdisciplinaire dont l'ambition est de réaliser de réelles innovations tant conceptuelles que technologiques dans le domaine de la biologie grâce à une étroite collaboration entre biologistes et physiciens. ReceptOrient vise à suivre en temps réel au sein même de la membrane plasmique de lymphocytes T vivants, les changements d’orientation de divers constituants du complexe moléculaire du récepteur T (TCR) suite à son engagement par un ligand membranaire (peptide-CMH). Pour cela, nous mettrons en œuvre des techniques d’imagerie de molécule unique en fluorescence polarisée à l’état de l’art. ReceptOrient devrait permettre d’avoir une réelle compréhension des mécanismes moléculaires initiaux conduisant à une activation de la cellule par le TCR. En dépit des progrès spectaculaires des recherches en génomique, notre compréhension de fonctionnement de système immunitaire reste toujours limitée comme le montre les lents progrès réalisés en immunothérapie des cancers ou bien pour la fabrication de vaccins. Une raison majeure à cela résulte du fait que la plupart des scénarios mécanistes proposés, incluant ceux décrivant les processus d’activation des cellules T, restent encore non démontrés voir même totalement spéculatifs. Pour cela, il devient essentiel d’essayer de suivre les événements moléculaires au sien même de cellules vivantes, avec une résolution spatio-temporelle suffisante et ceci grâce à l'utilisation de méthodologies biophotoniques à l’état de l’art.La reconnaissance des cellules T s’effectue par le TCR qui, après avoir détecté la présence d'antigènes, est capable de transmettre des signaux à travers la membrane plasmique induisant une réponse cellulaire appropriée. Actuellement, la base moléculaire de ce processus de transduction est toujours incomprise. Des études récentes réalisées dans des systèmes modèles suggèrent que l’étape initiale est produite par une réorientation majeure des sous-unités CD3epsilon et CD3zeta du complexe TCR/CD3. Cette réorientation autoriserait alors la phosphorylation des motifs ITAMs de différents constituants du complexe TCR/CD3 et enclencherait la cascade de signalisation. Cependant, et à cause de limitations méthodologiques, aucune observation expérimentale directe n’a été rapportée  à ce jour.Afin d’investiguer ce modèle in vivo dans les cellules T, nous proposons de mesurer l'orientation moléculaire et la diffusion rotationnelle des constituants du complexe TCR/CD3 par des techniques de l’imagerie en fluorescence polarisée résolue de temps qui seront développées à l’état de l’art. Alors que l’anisotropie de fluorescence est une technique bien établie en mesure moyennée, ces mesures sont encore largement sous exploitées au niveau d’une molécule individuelle pour résoudre des questions biologiques. Deux approches biophotoniques complémentaires basées sur l’analyse de la polarisation, le suivi de molécule unique par fluorescence polarisée et la spectroscopie de corrélation de fluorescence en mode polarisé, seront combinées à un microscope équipé de pince optique holographique. Dans le même temps, nous élaborerons des chimères fluorescentes des différents composants du complexe TCR/CD3 afin de les adapter à l’imagerie de fluorescence polarisée. Les différentes mesures seront réalisées avant et après stimulation du TCR.ReceptOrient vise à élucider des questions des plus fondamentales, mais non encore résolues en immunité adaptative, à savoir comment l'activation d’une cellule T médiée par son récepteur antigénique est initiée. Les résultats attendus contribueront non seulement à une meilleure compréhension des mécanismes de fonctionnement du système immunitaire, mais également à ouvrir de nouvelles perspectives permettant de moduler à façon dans différentes stratégies thérapeutiques la réponse lymphocytaire T.
Résultats : En dépit des progrès spectaculaires des recherches en génomique, notre compréhension de fonctionnement de système immunitaire reste toujours limitée comme le montre les lents progrès réalisés en immunothérapie des cancers ou bien pour la fabrication de vaccins. Une raison majeure à cela résulte du fait que la plupart des scénarios mécanistes proposés, incluant ceux décrivant les processus d’activation des cellules T, restent encore non démontrés voir même totalement spéculatifs. Pour cela, il devient essentiel d’essayer de suivre les événements moléculaires au sien même de cellules vivantes, avec une résolution spatio-temporelle suffisante et ceci grâce à l'utilisation de méthodologies biophotoniques à l’état de l’art. ReceptOrient vise à élucider des questions des plus fondamentales, mais non encore résolues en immunité adaptative, à savoir comment l'activation d’une cellule T médiée par son récepteur antigénique est initiée
Perspectives : Les résultats attendus contribueront non seulement à une meilleure compréhension des mécanismes de fonctionnement du système immunitaire, mais également à développer de nouvelles stratégies contre des maladies infectieuses. Cette nouvelle compréhension du système immunitaire devrait fournir les moyens d’être plus efficaces pour lutter contre l'émergence de nouvelles souches bactériennes résistantes aux antibiotiques ainsi que de nouveaux types d’agents pathogènes. ReceptOrient trouve aussi une pertinence pour les maladies auto-immunes, aussi bien en diagnostique qu’en développement d’approches thérapeutiques. Enfin, ReceptOrient devrait contribuer également à des avancées dans d’autres domaines (fabrication de vaccins, immunothérapie anti-cancer)
Publications et brevets : 1.	Kress A, Ferrand P, Rigneault H, Trombik T, He HT, Marguet D, Brasselet S
Probing Orientational Behavior of MHC Class I Protein and Lipid Probes in Cell Membranes by Fluorescence Polarization-Resolved Imaging
Biophysical Journal (2011) 101:468-76
2.	He HT, Bongrand P
Membrane dynamics shape TCR-generated signaling
Frontiers in immunology (2012) 3:90