Projet ANR-06-PCVI-0021 – AFM-MB-PROT : Structural Analysis of non Crystalline Transmembrane Proteins by Atomic Force Microscopy after Reconstitution in In-Plane Membranes
Programme : Physique et Chimie du Vivant (PCV) (PCV) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : CNRS DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC ROUSSILLON (CNRS DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC ROUSSILLON)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Institut Curie
Montant : 460000.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 36 mois
Résumé : 1-Contexte scientifique et objectifs du projet : Environ 25% des cadres de lecture ouverts du génome humain codent des protéines membranaires qui sont impliquées dans la majorité des processus physiologiques. Malgré leur importance en biologie, en santé humaine et en nanobiotechnologie, leur connaissance au niveau moléculaire est réduite à une centaine de structures résolues, état significatif des obstacles de surexpression et de cristallisation 2D et 3D. Dans un contexte internationalement compétitif, la Microscopie à Force Atomique (AFM) est une approche structurale puissante grâce à son exceptionnel rapport signal sur bruit qui permet l'analyse structurale en tampon physiologique de protéines non cristallisées reconstituées en membrane. Le but de projet est de développer les outils permettant d'analyser par AFM haute résolution en milieu physiologique tout type de protéines membranaires disponibles en très faible quantités, en particulier eucaryotes, et de l'appliquer à l'analyse de la structure et des changements conformationels de protéines membranaires d'intérêt majeur. Ceci passe par: i) le développement de nouvelles stratégies de reconstitution de protéines membranaires dans des bicouches lipidiques planes; ii) l'obtention de données structurales à une résolution sub-nanométrique de protéines non cristallines en membrane; iii) le développement de l'imagerie AFM haute résolution permettant notamment d'étudier des protéines présentant de larges domaines extramembranaires. 2-Description du projet, méthodologie : L'incorporation de protéines transmembranaires sera réalisée en utilisant deux stratégies, originales et récemment développées par les membres de ce PCV, qui consomment quelques picomoles de protéines. La première technique consiste à incorporer directement des protéines solubilisées en détergent dans des bicouches lipidiques supportées par du mica et préalablement déstabilisées par des détergents glycosidiques. La deuxième stratégie consiste à reconstituer les protéines solubilisées portant une étiquette poly-His dans une bicouche lipidique après une étape de fixation à des lipides ligands fonctionnalisés. Après incorporation, les protéines sont imagées par AFM dans un tampon physiologique. Cette plate-forme sera appliquée à 2 familles de protéines transmembranaires, les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) et les transporteurs présentant une cassette de liaison à l'ATP (transporteurs ABC). Les GPCRs sont des récepteurs à 7 domaines transmembranaires qui sont exprimées de façon ubiquitaire chez les eucaryotes et impliqués dans les communications intercellulaires et la perception de signaux sensoriels. A ce jour, une seule structure est disponible limitant l'établissement de relations structure-fonction pour d'autres GPRCs. Notre objectif est de produire un membre de cette famille (le récepteur à la vasopressine V2) sous forme fonctionnelle, et d'analyser par AFM son état d'oligomérisation impliquée dans son activation, en présence de différents effecteurs. Les transporteurs ABC sont impliqués dans le transport vectoriel d'une multitude de substances à travers la membrane et responsable de la résistance pléiotrophique aux drogues. Seules deux structures d'ABC transporteurs bactériens sont disponibles. Notre objectif est une analyse structurale des transporteurs bactériens BmrA et humain MRP1, incluant les changements conformationels associés au transport de drogues.  L'étude de ces protéines par AFM est associée à des développements méthodologiques pour l'AFM en milieu liquide. Un accent sera mis sur le mode oscillant, notamment le mode non-contact, pour l'imagerie haute résolution de protéines membranaires. Ce mode d'imagerie est une alternative intéressante au mode contact puisqu'il permet de mieux préserver l'échantillon et de visualiser des protéines possédant un large domaine extramembranaire. La microscopie à force acoustique sera également testée dans le contexte des protéines transmembranaires. 3-R..