Projet ANR-11-BS07-0024 – CATHYMETOXY : Nouveaux catalyseurs hybrides métalloprotéiques d’oxydation sélective par le dioxygène.
Programme : Blanc - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur MAHY Jean-Pierre (UNIVERSITE DE PARIS XI [PARIS- SUD])
Partenaires : Laboratoire public; Laboratoire de Sciences, Philosophie, Histoire; Université Paris-Sud; Université Paris-Sud; Université de Strasbourg
Montant : 680000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 48 mois
Résumé : Nouveaux catalyseurs hybrides métalloprotéiques d’oxydation sélective par le dioxygèneÉlaboration de nouvelles métalloprotéines hybrides par insertion de complexes métalliques synthétiques dans une protéine (xylanase), capables d’utiliser le dioxygène comme oxydant dans des conditions écocompatibles, et qui constitue un nouveau procédé d’oxydation sélective applicable pour l’oxydation des hydrocarbures, pour la chimie fine et la dépollution.
Oxydations douces par O2 catalysées par des modèles synthétiques de métalloprotéines à fer.Catalyser des réactions d’oxydation dans des conditions efficaces et respectueuses de l'environnement constitue un défi qui ne peut être résolu par des moyens conventionnels. La mise en commun de savoir-faire complémentaires est indispensable. Les 20 dernières années ont permis de mettre en évidence le rôle crucial des biomolécules pour catalyser des réactions d’oxydation de première importance, de mieux cerner la complexité des structures et le rôle des environnements protéiques. Ces matrices protéiques servent à assurer la protection des sites actifs, mais aussi à induire des sélectivités. De manière concomitante, l’approche chimique fondée sur la synthèse d’analogues synthétiques a connu une explosion. Ces deux approches, biochimiques et chimiques se sont avérées limitées dans leur application pour des raisons liées à la nature des catalyseurs mis en jeu : les bioconversions sont difficilement transposables à l’échelle préparative, les catalyseurs synthétiques mettent en jeu des processus polluants et souffrant d'un manque de sélectivité. La combinaison de ces approches doit permettre d'observer leur synergie afin de réaliser des réactions d'oxydation efficaces et sélectives dans des conditions douces. Notre objectif est d'insérer des complexes métalliques dans une protéine selon plusieurs approches, covalente ou ionique, et d'utiliser ces métalloprotéines hybrides pour dégrader des petites molécules organiques. L'objectif affiché est d'utiliser l'oxygène moléculaire comme oxydant, ce qui nécessite de fournir des électrons au site actif pour l'activer. Le contrôle du transfert d'électrons est crucial de manière à ce que les entités oxydantes générées au centre métallique soient efficaces pour la réaction cible, et non réduits par le dispositif électronique. Ce projet vise à améliorer notre compréhension du mécanisme de l'activation réductrice du dioxygène, et à terme, à appliquer ces systèmes dans des réactions de dépollution ou de chimie fine par exemple.
Métalloprotéines synthétiques et systèmes électrocatalytiquesLa dualité des approches, biochimique et chimique, se retrouve dans les technologies utilisées pour mener à bien le projet. Ainsi, la préparation des briques nécessaires à la construction de la métalloenzyme artificielle nécessitera tout d’abord de la synthèse chimique: complexes métalliques héminiques et non-héminiques, dotés de fonctionnalités permettant leur ancrage sur une protéine d’une part et sur une électrode d’autre part, et synthèse de fils moléculaires pour l’accrochage de ces complexes sur une électrode, et de la biochimie associée à la biologie moléculaire pour la production et la purification de la protéine (xylanase) mutée ou non. L’assemblage des différents éléments fil moléculaire-complexe métallique-protéine s’appuiera sur des méthodologies empruntées aux couplages protéiques : chimie peptidique, création de liaisons carbone-soufre (des cystéines), ou aux méthodes modernes de la chimie : chimie  click. À ce niveau des études cristallographiques seront utilisées pour établir la structure 3D des hybrides obtenus, donnant toute sa place à la biologie structurale. L’accrochage de l’ensemble sur une électrode empruntera des méthodes chères à l’élaboration de matériaux hybrides : élaboration de monocouches de thiol fonctionnalisés auto assemblées, ancrage covalent sur du carbone graphite. Enfin les tests d’activité catalytique se feront en premier en catalyse homogène avec H2O2 comme oxydant, puis en milieu hétérogène : avec O2 comme oxydant et les électrons fournis par une électrode (électrochimie). Des substrats simples (alcanes, alcènes) seront d’abord utilisés puis les meilleurs hybrides seront utilisés pour l’oxydation de composés d’intérêt en chimie fine, pétrochimie et dépollution. Au final, il s’agit d’un projet exigeant très pluridisciplinaire, impliquant des compétences multiples rassemblées dans le consortium.
Résumé de la soumission : Ce projet vise à la préparation et à l’étude d’une classe de nouveaux biocatalyseurs d’oxydation sélective permettant : 1) d’opérer dans des conditions variées, en particulier des conditions douces ;2) d’utiliser l’oxygène moléculaire comme oxydant. Ces deux propriétés s’inscrivent parfaitement dans le cadre du développement de la « chimie verte », dans un contexte global de contribution au développement durable. En effet, à l’heure actuelle, la plupart des processus mis en oeuvre en chimie d’oxydation demeurent coûteux et dangereux de part leur nature (températures et pressions élevées, utilisation de catalyseurs onéreux et toxiques). Dans le contexte global actuel, la question de la sauvegarde de nos ressources énergétiques et du travail dans des conditions propres devient de plus en plus préoccupante. La chimie est concernée en premier lieu, et compte tenu du fait qu’elle est bien souvent en amont et au service des autres industries, on comprend l’effort indispensable à réaliser pour cadrer au concept de « développement durable ».La caractéristique de ce projet est qu’il associe des équipes de provenances différentes et de compétences complémentaires pour travailler à la conception, préparation, et étude de dérivés originaux. Il s’agit ici d’une approche pluridisciplinaire, puisque les catalyseurs sont constitués de complexes synthétiques de métaux de transition (métalloporphyrines ou complexes métalliques des ligands multidentes azotés), en association intime avec des protéines. Ces biocatalyseurs constituent en eux-mêmes des nouveaux objets moléculaires bien définis, combinant les avantages des catalyseurs synthétiques avec ceux des biomolécules au sein d’une même structure moléculaire. Ils seront obtenus par insertion de manière covalente ou non dans des protéines (xylanase et mutants), de complexes de fer synthétiques (ligands porphyrine, multidente à motif aminométhyl-pyridyle ou …). Les composés protéine-complexe métallique seront utilisés en présence d’oxydants propres comme, dans un premier temps H2O2, puis, dans un second temps O2. Dans ce cas, il sera nécessaire d’adjoindre un système capable de délivrer au centre métallique les électrons nécessaires pour activer O2. Ceci sera réalisé grâce à un dispositif électrochimique et les électrons seront acheminés vers le centre métallique soit par un médiateur redox soluble, soit par un fil moléculaire qui devra être attaché de manière covalente d’une part au ligand du complexe métallique et, d’autre part à l’électrode. Dans ces composés, le rôle de la protéine est multiple : la matrice doit en principe fournir une stabilité opérationnelle et une certaine sélectivité. On peut raisonnablement s’attendre à ce qu’une activité originale et efficace soit observée dans ce type de composés.La mise en oeuvre de ce projet s’appuie sur le savoir faire et l’expertise de chacun des groupes concernés : chimie des protéines et des enzymes modifiées ; chimie biomimétique inorganique de synthèse et spectroscopie ; cristallochimie des protéines ; électrochimie des métalloprotéines, réactivité des métalloprotéines et de leurs analogues synthétiques en chimie d’oxydation.Les métalloprotéines hybrides obtenues trouveront leurs applications dans des processus d’oxydation présentant un potentiel économique considérable, là où les besoins en terme d’oxydation propre et en conditions douces se font sentir: décontamination et détoxification des rejets industriels, ou chimie d’oxydation fine de molécules d’intérêt pharmaceutique.
Résultats : 3 mutants cystéine de la xylanase ont été produits et sont disponibles pour le greffage des complexes métalliques.
La synthèse des SAM est maitrisée et différents complexes mononucléaires de fer non-héminiques ont été greffés par polarisation de la surface ou par simple immersion. Les études par voltamétrie cyclique n’ont jusqu’à maintenant pas permis de mettre en évidence une activité catalytique significative, le rapport surface/volume étant extrêmement défavorable. Une amélioration de ce rapport est en cours, en adaptant la cellule électrochimique ainsi que la méthode de détection. 
Parallèlement l’activation du dioxygène par des porphyrines de fer est étudiée. Une étude préliminaire en solution homogène a révélé des espèces intermédiaires non encore observés par des techniques électrochimiques. Leur identification est en cours. Les SAMs porphyriniques sont maintenant étudiés.
Un complexe mononucléaire de fer [(L52maleimide)FeCl](PF6), a été greffé dans une protéine commerciale, la béta-lactoglobuline. Après optimisation, le couplage via la fonction maléimide sur la béta-lactoglobuline a permis d’obtenir une métalloenzyme artificielle capable de catalyser l’oxydation des sulfures par H2O2.
La synthèse a été réalisée également par le part. 1 à partir du complexe à pince dibromée. Le couplage est bien effectif, mais l’analyse par spectrométrie de masse suggère que l’atome métallique pourrait avoir été éjecté lors du couplage à la protéine. Des études analogues ont débuté en utilisant l'un des mutants de la Xylanase, Ser212C, préparé lors d'une tâche initiale. Dans le but d'améliorer la stabilité de l’assemblage hôte-invité, des complexes à ligands bis-acides carboxyliques sont préparés par le part. 2
Les conditions d'oxydation par H2O2 de divers substrats (sulfure, alcane, alcène…) catalysée par les biohybrides de la béta-lactoglobuline sont en cours d’optimisation (pH, nature du tampon …) et la détection des intermédiaires réactionnels est réalisée par RPE.
Perspectives : Les questions d’oxydation en conditions douces sont cruciales dans le contexte actuel. Avec le développement à grande échelle des procédés de liquéfaction des hydrocarbures, les alcanes lourds deviennent de plus en plus accessibles, et l’utilisation de ces ressources dépend du développement de catalyseurs d’oxydation actifs, sélectifs et stables. Par ailleurs, la chimie d’oxydation permet également de dégrader des dérivés toxiques, permettant la mise au point de processus de décontamination et détoxification de déchets particuliers. En se substituant aux oxydants toxiques communément employés, les démarches telles que celles que nous présentons doivent conduire à une amélioration de l’environnement s’inscrivant véritablement dans les préoccupations majeures du moment.
Publications et brevets : 8 publications:
Photoassisted Generation of a dinuclear Iron(III) peroxo species and oxygen atom transfer. Avenier F. et al.  Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2013, 52, 3634
Neocarzinostatin-based hybrid biocatalysts for oxidation reactions. Sansiaume-Dagousset E. et al. Dalton trans. 2014, 43, 8344 
Various strategies for obtaining oxidative artificial hemoproteins with a catalytic oxidative activity… J-P. Mahy* et al. J. Porphyrins Phthalocyanins 2014, 18, 1063 
Electrochemical study of a nonheme Fe(II) complex in the presence of dioxygen… N. Ségaud et al. Chemical Science 2015, 6, 639
From “hemoabzymes” to “hemozymes”: towards new biocatalysts for selective oxidations. J-P. Mahy et al.  Chem. Commun. 2015, 51, 2476 
Steric Congestion and Adequate Positioning at a Ferrous Centre Leads to Hydration of alpha-Nitrile Substituents Forming Coordinated Carboxamides N. K. Thallaj et al. Inorg. Chem. 2014, 53, 7824. 
An artificial enzyme made by covalent grafting of an Fe(II) complex in ß-lactoglobulin… C. Buron et al. Chem. Eur. J. 2015, 21, 12188.
Single step synthesis of an ethynylferrocenyl-[4]-ferrocenophane. A. Serra-Muns et al. Tetrahedron Lett., 2015, 56, 4537
3 thèses:
David JUNG, Univ. Paris Diderot, 19/12/2013: Synthèse de cofacteurs métalliques pour l’élaboration de nouvelles enzymes artificielles. Catalyse d’oxydation en solution homogène et construction de systèmes modèles immobilisés à la surface d’électrodes d’or. 
Nathalie Ségaud, Univ. Paris Sud, 13/12/2013. Etude de l’activation réductrice du dioxygène par un complexe de Fe(II) et nouveaux complexes hétérodinucléaires : contributions pour le développement de catalyseurs d’oxydation bioinspirés.
Charlotte Buron, Univ. Paris Sud, 17/07/2015. “Développement de nouveaux catalyseurs d’oxydation bioinspirés : greffage de complexes de fer(II) non héminiques sur électrodes d’or ou dans la beta-lactoglobuline“.
3 conférences et 5 communications orales à des congrès internationaux