Projet ANR-11-BSV5-0028 – ANTIBIO-T : Développement de nouveaux agents antibactériens et antiparasitaires ayant pour cible la métalloenzyme GcpE
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Myriam SEEMANN (UNIVERSITE DE STRASBOURG)
Partenaires : Institut de Biologie Structurale; Institut de Chimie Moléculaire de Reims; Institut Charles Sadron; Institut de Chimie de Strasbourg
Montant : 459999.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 48 mois
Résumé : Concevoir de nouveaux médicaments en bloquant une enzyme.Élucider et bloquer le mécanisme catalytique de GcpE, une enzyme absente chez les humains mais présente chez de nombreuses bactéries et chez certains parasites.
Une nouvelle solution pour contrer les bactéries résistantes aux antibiotiques.La résistance de certaines souches bactériennes aux antibiotiques est une menace très sérieuse et il est urgent de trouver de nouveaux médicaments. Ainsi, l'élucidation de nouvelles voies biosynthétiques indispensables à la survie des bactéries peut représenter une solution à ce problème très préoccupant. La connaissance des mécanismes utilisés par les enzymes impliquées dans ces voies de biosynthèse peut aider les chimistes et les biochimistes à développer de nouveaux inhibiteurs qui conduiront à des antibiotiques d'un type nouveau. Chez la plupart des bactéries pathogènes (dont Mycobacterium tuberculosis, pathogène responsable de la tuberculose) et des bactéries opportunistes (Pseudomonas, Escherichia coli, etc) ainsi que chez le parasite Plasmodium falciparum responsable de la malaria, la synthèse de molécules appelées ‘terpénoïdes’, indispensables à la survie de ces microorganismes, est réalisée selon la voie du méthylérythritol phosphate (MEP). Comme l’être humain n’utilise pas la voie du MEP, on peut envisager de bloquer cette voie dans le but de synthétiser de nouveaux agents antibactériens et antiparasitaires.L'objectif de ce projet est d’élucider le mécanisme d’action de GcpE, l’avant dernière enzyme de la voie du MEP, et de concevoir des ‘inhibiteurs’, molécules capables de bloquer cette enzyme. GcpE est une métalloenzyme à centre fer/soufre c'est-à-dire qu’elle contient un cube présentant un atome de fer et un atome de soufre en alternance sur chaque sommet. Cette enzyme catalyse grâce à ce centre fer/soufre, le transfert de deux électrons et l’élimination d’une molécule d’eau. Un mécanisme réactionnel hypothétique a été écrit et nous nous proposons de le vérifier. Des molécules capables d’empêcher le bon déroulement de ce mécanisme seront également synthétisées.
Validation du mécanisme d’action de GcpE en utilisant les outils de la chimie, de la biochimie et de la physique.Des molécules qui ressemblent au substrat de GcpE seront synthétisées et leur action sur GcpE sera testée. Comme GcpE est sensible à l’oxygène, ces tests sont réalisés dans un dispositif spécial appelé ‘boîte à gants’ qui assure la stabilisation de la quantité d’oxygène à 2 ppm maximum. L’interaction de ces molécules avec le centre Fe/S de GcpE, sera vérifiée en utilisant différentes spectroscopies comme par exemple la spectroscopie Mössbauer qui est spécifique au fer. La diffraction aux rayons X permettra d’accéder à la structure tridimensionnelle de GcpE en présence de ces molécules.
Résumé de la soumission : Dans la plupart des bactéries pathogènes (dont Mycobacterium tuberculosis, pathogène responsable de la tuberculose) et des bactéries opportunistes (Pseudomonas spp, Citrobacter spp, Escherichia coli, etc) ainsi que chez le parasite Plasmodium falciparum responsable de la malaria et dans les plastides de plantes, les précurseurs pour la synthèse de terpénoïdes essentiels sont synthétisés selon la voie du méthylérythritol phosphate (MEP). Cette voie est absente chez l’être humain et représente donc une cible pour de nouveaux agents antibactériens et antiparasitaires.La fosmidomycine, un antibiotique naturel, est un bon inhibiteur de la 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, la première enzyme de la voie du MEP. En effet, des patients atteints par P. falciparum (forme non compliquée) ont été traités avec succès par la fosmidomycine mais pour certains le parasite est réapparu après le traitement. Ce premier résultat démontre le potentiel prometteur de l’utilisation des enzymes de la voie du MEP comme cibles pour des médicaments et montre également la nécessité de trouver des inhibiteurs plus efficaces. Une façon d'améliorer l'efficacité consiste à utiliser une combinaison de médicaments. Cet objectif pourrait être atteint par le blocage de plusieurs enzymes de la voie du MEP.L’avant dernière étape de la voie du MEP est catalysée par GcpE, une métalloenzyme contenant un centre [4Fe-4S] très sensible à l’oxygène. Le but ultime de ce projet est d'élucider le mécanisme d’action de GcpE, et d'utiliser les connaissances acquises pour concevoir de nouveaux médicaments.Le mécanisme catalysé par GcpE nécessite un double transfert d’un électron mettant en jeu des intermédiaires radicalaires. D’après le mécanisme proposé, il existerait une interaction entre un atome de fer du cluster [4Fe-4S] et le substrat. Des analogues de substrat seront synthétisés et utilisés comme outils moléculaires dans l’élucidation du mécanisme. Après avoir évalué le pouvoir inhibiteur de ces analogues de substrat sur GcpE, des expériences de spectroscopies RPE et Mössbauer seront effectuées dans le but de tenter d’identifier les intermédiaires radicalaires et d'enquêter sur le mode de liaison de ces analogues de substrat avec le cluster [4Fe-4S] du site actif. La spectroscopie différentielle IRTF, la spectroscopie Raman et l’électrochimie seront également utilisées afin d’obtenir des informations complémentaires sur le mécanisme de GcpE.Dans le but d'obtenir une meilleure idée du site actif, nous allons tenter de résoudre la structure tridimensionnelle de GcpE. L'importance des acides aminés identifiés dans la structure sera confirmée par mutagenese dirigée. Plusieurs protéines mutées de façon ponctuelle seront construites. Les paramètres cinétiques de chaque mutant seront déterminées afin de caractériser l’effet de la mutation. La structure tridimensionnelle de chaque enzyme sera utilisée comme cible lors d’un criblage virtuel de chimiothèque dans le but d’accéder aux premiers médicaments in silico. Ces molécules seront alors synthétisées et testés in vitro (relation structure/activité).Enfin, nous proposons de réaliser un criblage à haut-débit en utilisant la chimiothèque Prestwick (1200 médicaments qui ne sont plus sous brevet) et d’une souche d’E. coli modifiée dans le but d’identifier des agents antibactériens et/ou antiparasitaires.
Résultats : Les résultats issus de ce travail permettront d'élucider le mécanisme d’action de GcpE, et d'utiliser les connaissances acquises pour concevoir de nouveaux médicaments.
Les conditions indispensables pour mener à bien ce projet sont l’obtention de l’enzyme GcpE sous forme soluble, stable, homogène, non agrégée en quantité suffisante (plusieurs milligrammes) et la disponibilité des molécules à tester. 
Un verrou de ce projet était l’obtention de GcpE pure contenant un centre [4Fe-4S] par molécule de protéine. L’enzyme GcpE de la bactérie Escherichia coli a été clonée et nous venons de mettre au point sa production en grande quantité avec un centre Fe/S par molécule.
Certaines molécules analogues au substrat de GcpE sont en cours de synthèse. Une méthode de synthèse du substrat de GcpE vient d’être validée.
Nous avons également mis au point un protocole d’expression et de purification de l’enzyme GcpE issue d’une autre bactérie. Les premiers essais de cristallogenèse effectués à l'aide d'un robot de cristallisation placé dans une boite à gants ont permis d'identifier plusieurs conditions dans lesquelles GcpE forme des cristaux. A partir d’un de ces cristaux, la structure tridimensionnelle d’un homologue de GcpE d’E. coli a été résolu.
Plusieurs mutants de GcpE ont  été construits par mutagénèse dirigée. L'évaluation de leur activité est en cours.
Perspectives : Les molécules présentant les plus forts potentiels d’inhibition de GcpE seront testées sur des bactéries pour savoir si elles diminuent leur viabilité. Viendront ensuite les essais cliniques suivis éventuellement de la mise sur le marché d’un nouveau médicament.
Publications et brevets : Les résultats issus de ces travaux ont déjà été exposés dans des congrès et lors de conférences. Ils donneront également lieu à des publications.