Projet ANR-11-JSV8-0003 – PKS-PPIs : Les polykétide synthases (PKS) de type ‘trans AT’ : Etude des modes d’interactions entre les ‘acyl carrier’ protéines et leur différents partenaires enzymatiques (en cis/trans)
Programme : JCJC - SVSE 8 - Biochime, biologie moléculaire et structurale (JCJC SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Kira WEISSMAN (UNIVERSITE DE NANCY I [HENRY POINCARE])
Partenaires : Arn, Rnp, Structure-Fonction-Maturation, Enzymologie Moléculaire et Structurale
Montant : 290000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Etude des interactions entre les « ouvriers » des chaînes d’assemblage moléculairesDes chaines d’assemblage protéique, appelées « polykétides synthases » ou PKS, sont responsables chez les bactéries de la synthèse de nombreuses molécules (« polykétides ») d’intérêt thérapeutique. Notre objectif est de comprendre de manière détaillée le fonctionnement de ces ‘usines moléculaires’ en nous concentrant sur la façon dont les « ouvriers » protéiques interagissent les uns avec les autres.
Décryptage du fonctionnement des PKS pour faciliter leur modification par ingénierie génétiqueUne approche pour produire de nouvelles structures des polykétides est de modifier les enzymes complexes responsables de leur synthèse, les polykétides synthases. Cependant, pour être capables de modifier efficacement ces protéines, il faut d’abord approfondir nos connaissances sur leur fonctionnement au niveau moléculaire. Par conséquent, notre objectif est de répondre à une question clé concernant la voie de synthèse – comment les différents catalyseurs (les « ouvriers » protéiques) arrivent à communiquer entre eux, au sein de la chaine de montage – pour pouvoir préserver ces contacts essentiels au fonctionnement dans les PKS modifiées. Notre stratégie est de recréer l’ensemble de ces interactions in-vitro, pour pouvoir les étudier par une gamme complète de techniques biophysiques, et principalement la résonance magnétique nucléaire. Ayant choisi deux systèmes modèles PKS qui synthétisent des antibiotiques actuellement commercialisés, nos résultats devraient nous permettre d’améliorer les propriétés antibiotiques de ces molécules dans le traitement d’infections bactériennes chez l’Homme et l’animal.
Utilisation de techniques biophysiques de pointe pour décrypter les interactions dans les systèmes PKSNotre stratégie expérimentale se base sur le clonage et la surexpression des « ouvriers » catalytiques sous forme recombinante chez la bactérie Escherichia coli, en employant les outils standards de la biologie moléculaire, et des techniques chromatographiques pour la purification des protéines. Ensuite, les interactions protéiques sont étudiées en utilisant une variété de techniques biophysiques, telles que la résonance plasmonique de surface (SPR), la calorimétrie isotherme à titration (ITC) et la résonance magnétique nucléaire (NMR). Ainsi, on peut arriver à une description à l’échelle moléculaire de la façon dont les multiples partenaires de la voie de synthèse communiquent entre eux. Par l’étude des interactions qui ont lieu lors de la synthèse des polykétides, nous améliorerons notre capacité à modifier les PKS en préservant les contacts essentiels au bon fonctionnement de la machinerie.
Résumé de la soumission : Les polykétides et leurs dérivés, sont des molécules de structures chimiques complexes, très utilisées comme médicaments en tant qu’antibiotiques telle que l’érythromycine A, immunosuppresseurs comme la rapamycine, agents antiparasitaires comme l’avermectine ou anticancéreux comme l’épothilone. Ces molécules sont synthétisées par les polykétide synthases (PKS). Ce sont des systèmes multiprotéiques modulaires ayant une « acyl carrier » protéine et plusieurs activités enzymatiques portées par une même chaîne polypeptidique. Cette organisation multimodulaire a conduit au développement d’une approche d’ingénierie génétique (dite « biosynthèse combinatoire ») visant à générer des variants présentant des propriétés améliorées ou nouvelles. Cette strategie a abouti à la production de plusieurs centaines de nouveaux polykétides. Ceci étant, malgré les programmes de recherche intensifs de ces 20 dernières années, une utilisation optimale de cette approche nécessite 1) une meilleure connaissance du mécanisme d’action de chaque domaine enzymatique tant au niveau de son mécanisme que des facteurs structuraux impliqués dans la reconnaissance structurale; et 2) de décrypter les interactions entre les partenaires protéiques, et donc d’avoir à disposition leurs structures tridimensionnelles et celles des modules. Cette nécessité s’applique non seulement aux PKS dites « cis AT » (le domaine acyl transférase faisant partie de la chaîne polypeptidique) mais encore plus aux AT PKS  « trans » qui ont été récemment découvertes. Ces PKS trans AT synthétisent des antibiotiques comme la mupirocine, utilisée contre les Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline ou la virginiamycine, dont le dérivé hémi-synthétique dalfopristine agit sur des souches d’Enterocccus faecium résistant à la vancomycine. Ces PKS ont une organisation multimodulaire différente des PKS cis avec comme principales caractéristiques une activité acyl transférase en trans, la présence de domaines dupliqués ou nouveau, un ordre d’arrangement des modules différent et des modules où les domaines catalytiques peuvent appartenir à des chaînes polypeptidiques différentes. L’existence de ces deux famillies semble être la consequence d’une evolution convergente.L’objectif majeur du projet est de caractériser le mode d’interactions entre les domaines catalytiques des PKS trans et les différents substrats chargés sur les « acyl carrier » protéines qui sont à la base de la sélectivité des interactions interdomaines. Acquérir ce type d’informations est essentiel non seulement en vue de faire de l’ingénierie sur les systèmes trans mais de façon plus générale également sur les systèmes cis. Deux PKS trans ont été choisies comme support d’études : l’une impliquée dans la synthèse de l’antibiotique virginiamycine utilisée en médecine humaine et l’autre la lankacidine utilisée en médecine vétérinaire. Le projet, de type interdisplinaire, s’appuiera sur l’approche RMN, en vue d’élucider d’un côté, la structure des « acyl carrier » protéines chargées et en corrolaire leur dynamique moléculaire et de l’autre, de décrypter les interactions avec les partenaires enzymatiques associés. La RMN est, en effet, l’outil de référence pour appréhender les interactions protéines/protéines « faibles » et la dynamique des protéines. Les informations serviront de support, à moyen terme, pour générer de nouveaux antibiotiques.
Résultats : Lors des sept dernier mois, nous avons réussi à cloner et purifier plusieurs partenaires protéiques de nos deux systèmes modèles, et nous avons également entamé l’étude de leurs interactions. Nous essayons également de déterminer leurs structures tridimensionnelles par cristallographie, afin de comprendre au niveau atomique les mécanismes catalytiques et les modalités de reconnaissance de leur substrat, etc.
Perspectives : Nous espérons qu’une meilleure compréhension de nos deux systèmes modèles nous permettrons de modifier ces complexes protéiques plus efficacement afin de générer de nouveaux polykétides antibiotiques. En effet, nous comprenons déjà de façon détaillée comment ces molécules interagissent avec le ribosome, qui est leur cible commune chez les bactéries, ce qui permet de déterminer les portions des polykétides à modifier afin d’améliorer leurs propriétés antibiotiques. Notre objectif est de poursuivre des recherches appliquées en collaboration avec des compagnies pharmaceutiques.
Publications et brevets : Aucune production à ce jour