Projet ANR-06-PCVI-0012 – siRNAplus : Cell-permeable small interfering RNAs: siRNAplus
Programme : Physique et Chimie du Vivant (PCV) (PCV) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : UNIVERSITE DE STRASBOURG (UNIVERSITE DE STRASBOURG)
Partenaires : Université de Strasbourg
Montant : 120000.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 24 mois
Résumé : 1.  Les siRNA (small interfering RNAs) sont des oligonucléotides d'ARN double-brin de 19 à 25 paires de bases, qui ont des propriétés d'extinction sélective et efficace de gènes. Les siRNA sont potentiellement des outils très puissants dans le domaine de la génomique fonctionnelle et pourraient devenir une classe efficace de nouveaux médicaments. Actuellement, deux problèmes majeurs s'opposent à leur utilisation : 1) leur faible perméance au niveau des membranes plasmiques 2) leur faible stabilité vis-à-vis des dégradations enzymatiques et chimiques. Récemment, nous avons développé une technique très efficace de synthèse d'oligonucléotides d'ADN conjugués à des oligocations, laquelle est basée sur des ajouts répétitifs de synthons cationiques protégés. Nous étudions actuellement leurs avantages sélectifs dans les domaines d'application des oligonucléotides. Dans une approche similaire, nous allons synthétiser des siRNA qui seront couplés à des polycations, afin d'étudier leur potentiel à rejoindre le cytoplasme de cellules eucaryotes, ceci sans les vectoriser. En tant que laboratoire étant spécialisé dans le développement d'outils de transfert de gènes, nous possédons les capacités à tester ces hypothèses. De plus, des études récentes ont montré que des conjugués oligonucléotide-oligocations montrent des capacités de biodistribution intéressantes.  2. Ce projet va se dérouler en quatre étapes, chacune nécessitant des technologies de pointe bien établies : 1) La synthèse chimique d'un synthon phosphoramidite de l'oligocation. 2) La synthèse automatisée d'un oligonucléotide de RNA. 3) Les études physico-chimiques et biophysiques des conjugués siRNA-oligocations. 4) Les études biologiques in vitro. 1) Synthèse du synthon spermine-phosphoramidite : la synthèse de ce synthon nécessite sept étapes. Comme de nombreux synthons cationiques doivent être incorporés, il est nécessaire de les synthétiser à l'échelle de plusieurs grammes. Leur synthèse doit donc être optimisée. 2) Conjugués oligonucléotide d'ARN-oligocation : des techniques classiques de synthèse de RNA devraient être compatibles avec la synthèse de nos conjugués. Le problème majeur pourrait provenir de la purification des composés finaux. 3) Etudes physico-chimiques et biophysiques des conjugués de siRNA : ces propriétés (Tm, dégradation chimique et enzymatique, taille en solution et potentiel Zêta) seront mesurées par des techniques de routine au laboratoire. 4) Extinction de gènes in vitro : Nous allons mesurer deux paramètres. L'internalisation cellulaire des siRNA cationiques sera quantifiée par cytométrie en fliux, en utilisant des conjugués fluorescents. Les études d'extinction de l'expression génique se feront tout d'abord avec le gène de la luciférase, dans des lignées cellulaires exprimant ce gène de manière stable. En cas de succès, nous allons utiliser un système plus biologique et plus spécifique, qui consiste à éteindre l'expression d'un gène constitutif de toutes les cellules eucaryotes, celui de la lamine A/C. Ces expériences seront révélées par immunofluorescence et imagées par microscopie confocale. Les deux techniques exposées sont utilisées en routine dans notre laboratoire.  3.  Les siRNA cationiques devraient entrer dans les cellules sans besoin de les vectoriser. Ils devraient diffuser plus facilement que des particules dans l'environnement extra-cellulaire et par conséquent, avoir une meilleure biodistribution. Les interactions électrostatiques intramoléculaires et la protection terminale par les oligocations devraient protéger les siRNA modifiés des dégradations enzymatiques et chimiques. Ceux-ci devraient également se lier aux membranes plasmiques anioniques et être endocytés. Leur échappement des endosomes et de la voie dégradative des lysosomes devrait être facilité par l'effet 'proton sponge' et donc favoriser leur accumulation dans le cytoplasme, leur site d'action. Enfin, en tant que molécules cationiques, ils devraient de lier à leur séquence