Projet ANR-12-BSV8-0016 – SAFAPOLYA : Analyse Structure/Fonction des Facteurs requis pour la Polyadénylation des ARNm chez la levure
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Lionel MINVIELLE-SEBASTIA (Institut Européen de Chimie et Biologie)
Partenaires : Centre de Biochimie Structurale; Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets; Institut Européen de Chimie et Biologie; Institut Européen de Chimie et Biologie; Institut Européen de Chimie et Biologie
Montant : 550000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 48 mois
Résumé : Approche multi-disciplinaire de l'étude d'un processus essentiel de l'expression des gènes : la polyadénylationLa polyadénylation est une étape essentielle de la maturation des ARN messagers. Son étude représente un aspect fondamental de la biologie. Elle pourra permettre à terme de participer à l'amélioration des conditions de vie et des besoins fondamentaux en santé humaine.
Architecture et fonction d'un facteur essentiel de la maturation des ARNmLa polyadénylation est un processus indispensable à la maturation des ARN messagers. Cette modification est couplée à la terminaison de la transcription par l'ARN polymérase II, et en tant que telle, la queue poly(A) permet aux ARNm d'être exportés du noyau de la cellule jusqu'au cytoplasme. La traduction de l'ARNm en protéine et la stabilité de la molécule sont dépendants de cette polyadénylation. Au cours de l'évolution, de la simple levure de boulangerie, organisme modèle d'étude de nombreux processus fondamentaux, à l'homme, les cellules ont conservé cette modification essentielle des ARNm. Son importance est soulignée par le fait que la cause de quelques pathologies a été attribuée à des défauts touchant cette réaction de maturation. Les quelques vingt dernières années ont permis d'identifier les acteurs de cette maturation, montrant ainsi que la polyadénylation est réalisée par un complexe protéique d'une étonnante complexité. Nous voulons comprendre dans ce projet comment les éléments de cette machinerie opèrent de manière orchestrée lors de la synthèse de la queue poly(A) et dans le processus couplé de terminaison de la transcription. Nos approches sont originales dans le sens où elles mettent à contribution plusieurs domaines de compétences, de la biologie structurale à la génétique moléculaire, travaillant en étroite collaboration. Ainsi, nous espérons pouvoir apporter de nouvelles réponses quant au fonctionnement de certains facteurs de la polyadénylation, en liaison avec leur architecture tri-dimensionnelle et la structure atomique de leurs sous-unités.
Approches structurale et fonctionnelle de l'étude du complexe de polyadénylationLe facteur que nous nous proposons d'étudier en détail possède de nombreuses caractéristiques essentielles: il est capable de se fixer de manière spécifique sur l'ARNm, il interagit physiquement avec l'ARN polymérase responsable de la synthèse de cette molécule, il fixe le nucléotide ATP, et enfin, il réalise de nombreuses interactions directes avec l'autre grand facteur de la machinerie de polyadénylation. Un niveau de complexité encore plus grand est atteint par la dimérisation de deux des quatre sous-unités qui le composent. Pour arriver à comprendre pourquoi un tel échafaudage moléculaire est nécessaire, nous associons des approches scientifiques et technologiques qui permettront d'atteindre par cryo-microscopie électronique une structure à basse résolution du complexe dans laquelle les données acquises à haute résolution, par résonance magnétique nucléaire et cristallographie aux rayons X, pourront trouver leur place. Dans une approche simultanée, une analyse fonctionnelle, in vivo et in vitro, des sous-unités du facteur par génétique moléculaire sera développée, utilisant les données connues ou obtenues par l'approche structurale, et inversement, lorsque des mutants déjà isolés seront analysés par des méthodes structurales qui amèneront à comprendre le défaut de ces mutants. Ces études de l'architecture du complexe seront complétées par l'utilisation de la spectrométrie de masse, outil puissant et précis de l'analyse des protéines.
Résumé de la soumission : La maturation co-transcriptionnelle des précurseurs des ARNm regroupe un ensemble d'évènements qui contribuent à l'exactitude et à l'efficacité de l'expression des gènes. L'une de ces différentes étapes, la maturation en 3' des pré-ARNm, est une modification essentielle.La polyadénylation a lieu dans le noyau de la cellule eucaryote. Elle est étroitement couplée à la terminaison de la transcription par l'ARN polymérase II. De plus, la queue poly(A) est requise pour l'export vers le cytoplasme de l'ARNm, pour sa traduction en protéine, et enfin pour sa demi-vie.La polyadénylation résulte de deux réactions couplées. Le pré-ARNm est d'abord clivé en un site spécifique situé dans la partie 3' non codante du gène, réaction suivie par l'élongation de la queue poly(A). Chez la levure S. cerevisiae, modèle adapté à l'étude des processus nucléaires essentiels de maturation présents chez tous les eucaryotes (épissage, ajout de la coiffe, modifications de bases, et donc polyadénylation...), les facteurs requis ont été identifiés par des méthodes complémentaires apportées par la génétique et la biochimie. Ces facteurs s'organisent principalement en deux complexes multimériques, appelés CF I et CPF (Facteur de Clivage I et Facteur de Clivage et de Polyadénylation, respectivement). Un grand nombre d'homologues de ces sous-unités sont présents dans les complexes de polyadénylation d'eucaryotes supérieurs. D'autres protéines essentielles viennent compléter cette machinerie chez la levure. Elles sont nécessaires à la spécificité du choix du site de clivage et au contrôle de la longueur des queues poly(A).Il existe un système d'étude in vitro de la réaction de maturation en 3' chez la levure. Un haut niveau d'affinement et d'efficacité a été atteint grâce à l'utilisation de procédés de purification native des facteurs sous forme native, comme le TAP-tagging chez la levure ou la production chez E. coli de protéines recombinantes. Il n'en reste pas moins évident que la fonction de beaucoup de ces polypeptides constituant cette imposante machinerie (pas moins de 20 protéines différentes identifiées à ce jour chez la levure) reste encore inconnue. De plus, si l'on possède quelques données structurales sur certaines sous-unités, pour la plupart faites à partir de domaines isolés, une vue globale des complexes eux-mêmes et de leur organisation en rapport avec leur fonction est inconnue.Pour mieux comprendre la polyadénylation chez la levure, nous combinerons différentes approches. Nous appliquerons les techniques complémentaires de la biologie structurale et analytique (RMN, diffraction aux rayons X, SAXS, SANS, cryo-microscopie électronique, spectrométrie de masse) et les associerons aux analyses fonctionnelles des souches sauvages et mutantes (phénotypes et essais in vitro). Ces mutants seront générés par mutagénèse aléatoire ou dirigée, grâce aux informations issues de l'analyse structurale. Nous tenterons de résoudre la structure de certaines protéines indiquées dans le projet, faisant partie du facteur CF IA, ainsi que du facteur lui-même. Nous pouvons espérer la reconstitution tri-dimensionnelle des facteurs CF I et CPF à des résolutions subnanométriques, atteintes grâce aux images venant de la microscopie électronique et des techniques complémentaires de SAXS et SANS. Les informations structurales de haute résolution déjà connues ou en projet seront adaptées à l'intérieur des enveloppes formées par ces structures 3D. Les techniques d'étiquetage ou de marquage des sous-unités seront appliquées individuellement pour localiser ces composants dans le modèle 3D. Enfin, les informations sur la fonction des sous-unités seront combinées aux données structurales afin de construire un modèle le plus précis possible du fonctionnement de cette machine moléculaire lors de la reconnaissance des séquences sur l'ARNm.Ce travail devrait aboutir à la première description tri-dimensionnelle de l'architecture du complexe de polyadénylation chez la levure.
Résultats : Les approches structurales et fonctionnelles mises en œuvre pour l'étude du complexe de polyadénylation nous ont permis après six mois de démarrage du projet d'obtenir des informations sur deux domaines de deux sous-unités du complexe. Pour l'une d'entre elle, la fixation d'ATP n'est pas un pré-requis à sa fonction dans la polyadénylation. Ceci a été confirmé par la structure cristalline d'un mutant dépourvu d'ATP mais qui reste viable. Ce résultat lance le débat sur la conservation au cours de l'évolution du domaine de fixation, voire d'hydrolyse, de l'ATP. Pour l'autre, la découverte d'un nouveau domaine structuré et essentiel de la protéine met en évidence un mécanisme plus complexe que prévu du couplage entre polyadénylation et terminaison de la transcription. Enfin, l'approche de la complexité structurale du complexe par spectrométrie de masse a d'autre part amené à utiliser des techniques sophistiquées toujours en cours de développement.
Perspectives : Les nouvelles découvertes faites lors de la période concernée ont mené principalement à la publication d'articles dans des revues scientifiques internationales ainsi qu'à la dissémination par voie de séminaires, participations aux congrès scientifiques et conférences. Les applications directes, sociétales ou environnementales, autres que celles intéressant directement la communauté internationale, sont difficiles à évaluer à cette étape précoce du projet.
Publications et brevets : Dupin, A. F. and S. Fribourg (2014). «Structural basis for ATP loss by Clp1p in a G135R mutant protein.« Biochimie.
La résolution de la structure d'un mutant d'une sous-unité du facteur de polyadénylation a fait l'objet cette année d'une publication par l'un des partenaires. Elle étend les connaissances actuelles et apporte une vérification à l'échelle atomique du phénotype de ce mutant isolé il y a deux ans.