Projet ANR-10-JCJC-1405 – PathoVisu3Dyn : Développement de nouvelles modalités d'imagerie préclinique pour étudier la dynamique des interactions cellulaires dans deux modèles de pathologie du CNS
Programme : JCJC : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Neurosciences (JCJC SVSE 4)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Franck Debarbieux (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE PROVENCE CORSE)
Partenaires : Institut de Biologie du Développement de Marseille
Montant : 251445.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Nouvelles modalités d’imagerie pre-clinique du système nerveux central pathologiqueMise en place d’outils d’imagerie et des modèles animaux dédiés pour réaliser sur un même sujet les études de dynamiques cellulaires qu’il n’était jusqu’alors pas possible de réaliser avec les méthodologies existantes.
Mieux comprendre le vivant  grâce à l’observationDe nombreux types cellulaires interagissent séquentiellement dans le système nerveux central et contrôlent de façon synergique l’évolution des pathologies. La dynamique de ces interactions ainsi que leurs conséquences sont encore peu connues, en raison du manque de méthodes d’imagerie non invasives résolutives. Mon objectif a été de démontrer qu’il est possible d’imager, de caractériser et de quantifier, dans l’animal vivant, les interactions entre plusieurs populations cellulaires d’intérêt, dans le système nerveux central normal et pathologique. Mon projet a comporté un volet de biologie fondamentale et un volet technologique qui sont complémentaires. J’ai intégré des développements innovants des domaines de la physique, de la chimie et de la génétique afin de les mettre en œuvre dans des approches d’imagerie sur l’animal vivant.  J’ai produit les souris transgéniques fluorescentes et établi les modèles de pathologies dans le système nerveux central pour permettre l’imagerie par microscopie biphotonique spectrale. Nous sommes désormais en mesure de suivre simultanément jusqu'à 5 populations cellulaires d’intérêt sur un même animal. Par ailleurs, une nouvelle technique de tomodensitométrie spectrale à rayons X permettra de visualiser dans le corps entier de la souris la biodistribution de cellules d’intérêt marquées de façon exogène par des particules d’or ou d’argent ainsi que de localiser d’éventuelles anomalies vasculaires induites par la pathologie. Ces observations permettent non seulement de mieux comprendre le vivant mais aussi de proposer et tester de nouvelles approches thérapeutiques pour aider le cerveau malade à rétablir ses relations cellulaires symbiotiques.
Développement de deux méthodes d’imagerie dynamique intravitaleAfin de pouvoir visualiser les cellules nerveuses, les cellules immunitaires ainsi que les vaisseaux sanguins dans des modèles murins de pathologies du système nerveux central, nous avons mis en place deux stratégies d’imagerie in vivo avec différentes échelles de résolution spatiale : la tomodensitométrie (TDM) à rayon X et la microscopie 2-photons spectrale (2P). La maîtrise de l’imagerie 2-P in vivo combinée à l’utilisation de modèles de souris transgéniques dont les différentes populations cellulaires peuvent être marquées de couleurs différentes, permet de réaliser un nombre illimité d’observations du même champ d’observation. Ceci ouvre la voie à une analyse quantitative et corrélative de la distribution ainsi que les interactions cellulaires dans un environnement véritablement physiologique. En collaboration avec des physiciens, nous avons validé une technique de tomodensitométrie spectrale (scanner micro-CT), basée sur une nouvelle génération de détecteurs à pixels hybrides (HPD), et fait la preuve de l’intérêt de notre brevet sur les pixels composites pour faire de l’imagerie multicouleur sur l’animal vivant. Bien que de moins bonne résolution que la microscopie 2P, le scanner présente l’avantage complémentaire de pouvoir explorer le corps en entier et d’être directement transférable aux applications cliniques.
Résumé de la soumission : Notre projet est interdisciplinaire et  adresse des questions relatives à des développements pertinents pour la compréhension et le traitement de pathologies (lésions de moelle épinière et glioblastomes) du système nerveux central (SNC). Une meilleure compréhension et traitement de pathologies du SNC  impose des progrès dans l’imagerie non invasive pour suivre leur évolution.  Dans ce but, les techniques d'imageries doivent progresser dans deux directions: l’amélioration de leur résolution spatiale et de leur sensibilité afin de suivre plus finement les phénomènes, et le multiplexage des informations pour mesurer simultanément et corréler l'évolution de plusieurs paramètres issus d'un même sujet. A ce jour, certaines techniques offrent  la résolution spatiale au détriment du champ d'exploration, d'autres, l'acquisition en couleur de plusieurs canaux multiplexés au détriment de la sensibilité. Notre effort est porté sur le développement et la validation de deux modalités d’imagerie complémentaires,  la microscopie biphotonique (2P) in vivo et la tomographie à rayon X (CT-scan), combinées à l’utilisation de souris transgéniques exprimant des sous populations cellulaires fluorescentes ou à des agents de contraste présentant différentes signatures spectroscopiques.Contexte:         J’ai récemment développé la microscopie 2P à l’IBDML et participé, en collaboration avec les physiciens du Centre de Physique des Particules (CPPM) au développement et à la validation d’un prototype de CT scan basé sur des détecteurs à pixels hybrides (Delpierre  et al., 2007,  Debarbieux et al., 2010). J’ai pu imager en 2P, dans des fenêtres temporelles allant de quelques heures à plus d’un mois, le CNS de souris adultes. J’ai ainsi examiné (a) l’interaction entre axones lésés et système vasculaire dans la moelle épinière de souris Thy1-GFP-M dans lesquelles les vaisseaux sanguins étaient révélés par injection de Rhodamine dextran ((Dray et al., 2009) ainsi que (b)  le comportement de cellules de glioblastome (GBM) dans un modèle de greffe orthotopique (Stanchi et al., 2009 and non publié).  Projet:         1) Une première série d’expériences  est  destinée à implémenter nos équipements et protocoles pour l’imagerie multicouleur. Pour l'magerie  2P,  ceci implique la préparation de lignées de souris “multicolores” (au moins 3 populations cellulaires exprimant des marqueurs fluorescents différents) par croisements de lignées existantes. Pour le CT scan,  nous tirerons partie des spécificités du détecteur à pixels hybrides qui réside dans la possibilité exclusive de faire une analyse de la teneur en agents de contraste présentant différentes signatures spectroscopiques en utilisant une source X polychromatique.         2) Une seconde série d’expériences est destinée à décrire de façon quantitative les séquences des réponses vasculaires et immunitaires impliquées dans la dégénération/régénération axonale post-traumatique ou dans la prolifération tumorale et l'envahissement métastatique. Les mêmes animaux et les mêmes régions de ces animaux seront examinés par 2P et CT scan.         3) L'angiogenèse tout comme l'inflammation peuvent avoir des effets délétères ou bénéfiques selon la pathologie considérée ou leur état d'évolution.  Dans une troisième série d'expériences,  nous tirerons profit des modèles animaux et des technologies développées ainsi que des résultats acquis en 1 &  2 pour tester l'effet de la manipulation de l'angiogenèse ou de l'inflammation.  Pour l'angiogenèse,  nous administrerons du VEGF ou bloquerons sa fonction à l'aide d'anticorps; pour l'inflammation, nous la stimulerons avec du LPS ou administrerons des agents anti-inflammatoires. Les données de cette série d'expériences constitueront une première étape vers la définition de thérapies combinatoires  en vue de traiter les lésions de moelle épinière ou les GBM chez les patients.
Résultats : 1) Nous avons produit les souris et les cellules fluorescentes nécessaires et établi trois modèles de pathologies dans les régions superficielles du système nerveux central pour permettre l’imagerie par microscocopie biphotonique. Ces trois modèles permettent d’aborder la neuroinflammation dans un contexte pathologique (a) à évolution non maitrisée et fatale (glioblastome), (b) présentant des épisodes de rémission partielle (sclérose en plaque) et (c) évoluant vers une stabilisation (traumatisme de moelle).  
2)Nous avons adapté le microscope biphotonique et mis au point la méthodologie pour un repositionnement micrométrique de la souris au cours des 3 à 30 sessions d’imagerie réalisées sur deux à  trois mois. Nous sommes désormais en mesure de suivre simultanément jusqu'à 5 populations cellulaires d’intérêt sur un même animal.
3) Nous avons décrit de manière spatio-temporelle l’interaction des cellules neurales avec l’angiogenèse dans le contexte des glioblastomes et des lésions de la moelle épinière. Nous avons mis en évidence le fait que la croissance tumorale n’est pas directement corrélée à la densité de vaisseaux sanguins. L’effet transitoire de thérapies anti-angiogéniques, observé dans notre modèle, comme chez les patients, devrait plutôt être attribué à leur effet sur le microenvironnement. En revanche, dans les lésions de moelle nous avons observé que la régénération des axones se produit toujours dans le voisinage de vaisseaux angiogéniques et observé en temps réel  l’effet d’interactions entre cellules inflammatoires et axones.
4) J’ai établi des collaborations avec des cliniciens et immunologistes intéressés par les possibilités nouvelles de ces techniques d’imagerie. Je suis co-inventeur d’un brevet exploité sur les dispositifs d’imagerie par rayons X à source polychromatique et co-fondateur de la société ImXPAD pour valoriser les détecteurs à pixels hybride XPAD.
Perspectives : En ligne avec les résultats obtenus, mon attention se concentre plus spécifiquement sur les interactions entre les systèmes nerveux, vasculaire et immunitaire. L’objectif spécifique est d’identifier le phénotype des populations cellulaires jouant un rôle pivot dans l’amplification ou la rémission des déficits fonctionnels associés à nos modèles de pathologie pour proposer ensuite des moyens de les manipuler pharmacologiquement dans des fenêtres de temps pré-définies. Enfin, les avancées technologiques et méthodologiques issues de ce projet permettent d’envisager un transfert de compétence vers l’industrie. Ce transfert a  été initié par des interactions étroites avec les départements de recherche et développement de grandes sociétés de microscopie ou de lasers, des manifestations d’intérêt de biotech pharmaceutique ou  grâce à la création de la startup ImXPAD.
Publications et brevets : 16 publications internationales dont:
Fenrich KK, Weber P, Hocine M, Zalc M, Rougon G, Debarbieux F. (2012) Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol.; 590:3665-75.
Fenrich K.K., Weber P., Rougon G, Debarbieux F. (2013) Long and short term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury J Physiol. 591: 4895-4902
Ricard C., Stanchi F., Rodriguez T., Amoureux M.C., Rougon G., Debarbieux F. (2013) Dynamic quantitative intravital imaging of glioblastoma progression reveals a lack of correlation between tumor growth and blood vessel density PLoS One 8(9):e72655;
Cassol Brunner F., Dupont M., Meessen C., Bouriser Y., Ouamara H., Bonissent A., Kronland-Martinet C., Clemens J.C., Debarbieux F., Morel C. (2013) First K-edge imaging with a micro-CT based on the XPAD3 hybrid pixel detector. , IEEE Trans. Nucl. Sci. 60 (1), pp.103-108 ISSN: 0018-9499
Ricard C., Debarbieux F. (2014) Six-color intravital two-photon imaging of brain tumors and their dynamic microenvironment. Frontiers in Cellular Neuroscience. ISSN: 1662-5102