Projet ANR-12-BSV8-0024 – F1Fo-Struct : Déterminants structuraux du canal à protons et de l’interface de dimérisation de la F1Fo-ATP synthase mitochondriale de levure.
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame Marie-France GIRAUD (Institut de Biochimie et de Génétique Cellulaires)
Partenaires : Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets; Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires; Institut de Biologie Structurale; Institut de Génétique et Développement de Rennes; Max Planck Max Planck Institut für Biophysik
Montant : 450000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : F1Fo-StructDéterminants structuraux du canal à protons et de l’interfacede dimérisation de la F1Fo-ATP synthase mitochondriale delevure.
Comprendre les mécanismes de translocation des protons et de dimérisation de l'ATP-synthase.L'ATP est la molécule énergétique universelle. La F1Fo-ATP synthase est une enzyme clé du métabolisme énergique puisqu'elle est responsable de la plupart de la synthèse cellulaire de l'ATP. Ce complexe de 600 kDa est composé, chez la levure, de 17 sous-unités distinctes. Il utilise l'énergie d'un gradient électrochimique en protons pour synthétiser ATP. Quand les protons sont conduits à travers sa région membranaire, cette conduction induit la rotation de la partie «rotor« de l'enzyme. Cette partie rotor se prolonge dans le secteur catalytique et provoque les changements conformationnels nécessaires à la synthèse d'ATP. L'enzyme de levure, comme les ATP synthases de mammifères, est non seulement impliquée dans la synthèse ATP, mais aussi dans l'organisation de la membrane mitochondriale interne : les dimères d'ATP synthase forment de larges oligomères qui sont impliqués dans la morphologie des crêtes mitochondriales.Trois sous-unités de l'ATP-synthase sont essentielles pour la dimerisation de l'ATP-synthase: su g, su e et l'extrémité de N-terminale de sous-unité 4 comportant deux segments transmembranaires (S4T).Malgré la somme colossale des travaux structuraux entrepris sur ce complexe, seules les structures 3D de sous-complexes ont été résolues et les données structurales font toujours défaut sur la région translocatrice des protons, constituée par la sous-unité 6 et un anneau de 10 sous-unités 9. De plus, aucune information n'a été obtenue sur la structure et l'organisation des petites sous-unités hydrophobes e, g et la partie de N-terminale de sous-unité 4 (S4T) qui réalisent les interfaces pour l'oligomérisation de l'ATP synthase.
Combinaison d'approches récentes et variées pour démasquer les secrets de l'ATP-synthase.Ce projet est divisé en deux axes principaux:- le premier a pour objectif d'obtenir d'obtenir des données structurales sur la région translocatrice des protons du complexe ATP-synthase. Deux approches seront menées en cristallisant soit le complexe entier de l'enzyme en phase éponge ou en bicelles ou bien en réalisant des techniques classiques de cristallisation 2D/3D  pour obtenir des cristaux mais à partir d'un sous-complexe que nous avons purifié et qui comporte toute la partie translocatrice (sous-unité 6 + l'anneau de 10 sous-unités 9) et la sous-unité i.- Le deuxième axe du projet se focalisera sur les petites sous-unités hydrophobes impliquées dans la dimérisation de l'ATP-synthase. La production de ces protéines, avec ou sans marquage isotopique sera réalisée grâce à différents modes de production in vitro (mode précipité, en présence de détergents, en présence de lipides). Après avoir déterminé quel mode de production est le plus approprié et quels détergents et lipides sont les mieux adaptés à une étude structurale, des spectres RMN seront acquis pour rassembler des données tridimensionnelles sur ces protéines mais aussi sur leurs interactions dynamiques. En combinaison à ce travail structural et aux études, par RMN, de la dynamique d'interaction entre les sous-unités interfaciales, nous localiserons chaque sous-unité dans le volume d'un dimère d'ATP-synthase. Ceci sera réalisé en générant tout d'abord un volume précis  d'un dimère d'ATP-synthases par cryo-microscopie puis en positionnant ces sous-unités dans ce volume à l'aide d'un marquage spécifique faisant intervenir des nanoparticules d'or. Les modèles structuraux des différentes sous-unités, des sous-complexes ou de l'enzyme monomérique entière seront ensuite replacés dans ce volume.
Résumé de la soumission : La F1Fo ATP-synthase est un enzyme clé du métabolisme énergétique puisqu'il assure la plupart de la synthèse de l'ATP cellulaire. Ce complexe de 600 kDa, composé chez la levure de 17 sous-unités, utilise l'énergie d'un gradient électrochimique en protons pour synthétiser l'ATP. Le transfert des protons à travers la région membranaire engendre la rotation de la partie rotor de l'enzyme. Se prolongeant dans le secteur hydrophile, ce rotor induit des changements conformationnels sur les sites catalytiques conduisant à la synthèse de l'ATP. L'enzyme de levure, comme celui des mammifères, joue non seulement un rôle dans la synthèse d'ATP mais aussi dans l'organisation de la membrane mitochondriale interne: l'enzyme forme des dimères qui constituent les briques élémentaires de larges oligomères impliqués dans la morphologie des crêtes mitochondriales. Trois sous-unités de l'ATP-synthase permettent la stabilisation des espèces dimériques. Il s'agit de su g, su e et de la partie C-terminale de la sous-unité 4 (Nter 4). Des structures 3D de sous-complexes ont été établies mais la structure de la partie canal à protons, composée par la sous-unité 6 et un anneau de dix sous-unités 9, font défaut. Ainsi la conduction des protons reste un mystère. De plus aucune information n'est disponible sur la structure et l'organisation des petites sous-unités hydrophobes stabilisant les dimères.Ce projet sera divisé en deux axes. Le premier aura pour objectif d'acquérir des données structurales par diffraction des rayons X sur la partie canal à protons soit en cristallisant le complexe entier par de nouvelles techniques comme la cristallisation en phase éponge ou en bicelles ou en obtenant des cristaux par des méthodes classiques sur un sous-complexe 6+9(10)+i que nous avons isolé. Le deuxième axe se focalisera sur l'étude des sous-unités hydrophobes associées à la dimérisation (su e, su g Nter 4). Leur production sera réalisée en système acellulaire, en présence ou non d'acides aminés marqués isotopiquement. Après avoir déterminé le meilleur mode d'expression et les détergents ou les lipides les plus appropriés à leur solubilisation, différents spectres RMN seront acquis pour chaque protéine ou pour des complexes de ces protéines, afin de rassembler des informations structurales mais aussi des données sur la dynamique des interactions entre ces différentes protéines. Par cryo-EM, nous générerons une enveloppe précise des dimères d'ATP-synthase et localiserons su e et su g dans cette enveloppe grâce à des étiquettes poly-histidine et des billes d'or interagissant avec ces étiquettes.Ce projet fera appel à un grand nombre de techniques complémentaires qui sont indispensables si l'on veut comprendre le mécanisme de conduction des protons et donc le couplage énergétique réalisé par ce fantastique nanomoteur. Les données structurales sur les sous-unités impliquées dans la dimérisation permettront d'appréhender comment les unités élémentaires essentielles à la morphologie mitochondriale sont stabilisées.
Résultats : Dans le cadre de l'étude de la structure tridimensionnelle de certaines sous-unités membranaires de l'ATP-synthase de levure, leur expression in vitro a été réalisée en mode «précipité«. Les spectres RMN 1H-obtenus sur les sous-unités i, e, et le domaine transmembranaire de la sous-unité 4 (S4T)  après leur solubilisation en micelle de 1-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] montrent que leur étude structurale par RMN est réalisable. Nous nous sommes focalisés, pour le début de ce projet, sur la partie membranaire de la sous-unité 4 de l'ATP-synthase de levure. Cette protéine a ainsi été produite in vitro et marquée uniformément en 13C et 15N. Plusieurs types d'expériences de RMN multidimensionnelles ont permis d'attribuer les résonances des atomes de la chaîne principale. 
La structure secondaire de la protéine S4T a pu être dérivée à partir des valeurs de deplacements chimiques des carbones de chaque résidu. Ces valeurs permettent de déterminer un indice par residu et le profil de l'indice en fonction de la séquence permet d'identifier trois hélices. Les valeurs de déplacements chimiques dépendent également de la structure tertiaire de la protéine. Elles ont été utilisées comme contraintes pour établir un modèle structural de S4T. Le modèle généré présente une structure en épingle a cheveux pour les hélices H2 et H3 en accord avec les données topologiques obtenues par des expériences d'accessibilité, de mutagenèse et de pontages chimiques.
De nouveaux algorithmes ont été utilisés pour améliorer la résolution du volume du dimère d'ATP-synthase obtenu par cryo-microscopie éléctronique. Le résolution actuelle se situe autour de 27 Å.
Perspectives : L'étude par RMN de la structure de la partie membranaire de la sous-unité 4 et les spectres 1H obtenus sur les protéines membranaires de l'interface valident la démarche choisie pour l'étude des protéines impliquées dans la dimérisation de l'ATP-synthase. 
Les algorithmes employés pour améliorer le volume du dimère d'ATP-synthase ont permis d'affiner celui-ci. Même si la résolution de ce volume peut encore être accrue, elle est déjà suffisante pour y placer l'enzyme monomérique entière, dont la structure devrait être générée grâce à la cristallisation du monomère en phase éponge. Alternativement, il sera également possible d'y positionner les sous-complexes de la région translocatrice des protons, mais aussi les structures, établies par RMN, des différentes protéines à l'interface de dimérisation. Pour faciliter cette tâche, un marquage de ces sous-unités avec des particules d'or sera réalisé et combiné à une étude en cryo-microscopie. 
Ainsi nous comprendrons mieux  le processus de dimérisation de l'ATP-synthase, processus indispensable à une morphologie mitochondriale normale.
Publications et brevets : Posters: 
Atelier INSERM, Avril 2013
1: Various strategies to get structural data on the yeast ATP-synthase.
Marie-France Girauda,b*, Daniel Thomas c, Reynald Gilletc, Valentin Gordeliyd, Benoît Odaerte Thomas Meierf, Isabelle Larrieu a,b, Alain Dautant a,b, Patrick Paumard a,b, Corinne Sanchez a,b, , Daniel Brèthes a,b.
a University of Bordeaux, IBGC, UMR 5095, F-33000 Bordeaux, France
b CNRS, IBGC, UMR 5095, F-33077 Bordeaux, France
c IGDR, CNRS UMR 6290, F-35043 Rennes, France
d Institut de Biologie Structurale J.-P. Ebel, UMR5075 CEA-CNRS-UJF, F-38027 Grenoble, France
e Chimie et Biologie des Membranes et Nanoobjets, UMR 5248, F-33600, Pessac, France
f Max Planck Institute of Biophysics, D-60438 Frankfurt/Main, Germany
2: Congrès GFB, Septembre 2013:
Etude structurale par RMN de la sous-unité 4 de l'ATP-synthase de la levure.
Alexandre Barrasa,c, Isabelle Larrieu a,b, Corinne Sanchez a,b, Alain Dautant a,b, Daniel Brèthes a,b , Benoît Odaert, Marie-France Girauda,b.
a Université de Bordeaux, IBGC, UMR 5095, F-33000 Bordeaux, France
b CNRS, IBGC, UMR 5095, F-33077 Bordeaux, France
c Chimie et Biologie des Membranes et Nanoobjets, UMR 5248, F-33600, Pessac, France
Conférence (Marie-France Giraud, conférencière invitée)
Biomolecular Science Research Centre, Université de Saint-Andrews, Ecosse.
The yeast ATP-synthase: from its atomic structure to its supramolecular organization.