Projet ANR-10-BLAN-1235 – FURETT : Fonction et Régulation des Transcrits Télomériques
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Pierre JALINOT (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-AUVERGNE)
Partenaires : Laboratoire de Biologie et Pathologie des Génomes; Laboratoire de Biologie et Modélisation de la Cellule; Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Régulation des télomères par les transcrits issus de ces domaines chromosomiquesLes télomères protègent les extrémités des chromosomes et sont constitués d’un motif de six nucléotides répété un grand nombre de fois. Le projet développé cherche à comprendre comment des ARNs issus de la transcription de ces domaines chromosomiques interviennent dans la régulation de leur structure chromatinienne et de l’expression des gènes à proximité.
Maturation et effets chromatiniens des transcrits télomèriques  La taille des télomères est finement régulée et décroît au cours du vieillissement. Des modifications de cette régulation sont associées à des maladies génétiques, à la cancérisation et à la sénescence cellulaire.  Il est donc important d’identifier les facteurs impliqués dans le contrôle de la taille des télomères et leur bon fonctionnement.  Dans cette perspective il a été caractérisé que ces domaines chromosomiques étaient transcrits en ARNs de tailles variables capables de s’associer aux télomères. Des résultats divergents ont été rapportés sur l’action de ces ARNs sur l’enzyme télomèrase qui est capable d’augmenter la taille des télomères.  Le programme de recherche s’intéresse à mieux comprendre comment ces ARNs interviennent dans le fonctionnement normal et pathologique des télomères.  Les objectifs principaux du travail sont de mieux comprendre comment ces ARNs télomèriques sont modifiés après leur transcription, comment leur stabilité est contrôlée, et aussi comment ils s’associent aux télomères. Nous cherchons aussi à établir comment ils interviennent sur la structure de la chromatine télomèrique et comment ils régulent l’expression des gènes voisins. Une dernière partie du programme s’intéresse à la transmission de l’information épigénétique par de petits ARNs comprenant des motifs télomèriques.  Les connaissances fondamentales acquises par la réalisation de ces recherches devraient être importantes pour mieux comprendre les pathologies cancéreuses et du vieillissement.
Analyses de biologie moléculaire et cellulaire des transcrits télomèriques  Une partie des recherches analyse les transcrits issus des télomères. Ceci est fait par transcription inverse de ces ARNs, puis par amplification quantitative de l’ADN résultant. Une autre approche de ce point est l’évaluation directe de la quantité de ces transcrits par hybridation à une sonde marquée radioactivement ou par un groupement fluorescent.   Pour tester l’influence de certaines protéines sur ces transcrits, nous utilisons la technique d’ARN interférence qui permet l’élimination spécifique d’une protéine donnée dans la cellule par dégradation de l’ARN messager correspondant suite à l’introduction de petits ARNs complémentaires de même séquence.   L’analyse de télomères fait appel à différentes techniques de microscopie permettant de repérer à l’aide de sondes fluorescentes la présence de protéines, d’ADN ou d’ARN spécifiques (en particulier ceux comprenant le motif télomèrique).  Pour l’analyse de l’influence des transcrits télomèriques sur l’expression des gènes voisins, un système génétique a été développé permettant l’introduction d’un gène test codant pour une protéine fluorescente dans différentes configurations en amont d’une série de répétitions télomèriques. Ce système permet une analyse simple par mesure de la fluorescence des cellules de l’influence de la transcription des répétitions télomèriques.  L’analyse des transcrits de petite taille comprenant un motif télomèrique dans les cellules de la lignée germinale est réalisée par différentes techniques de séquençage à haut débit. L’étude de la localisation de ces transcrits après injection dans l’oocyte de souris est faite par analyse microscopique de ces ARNs marqués par un groupement fluorescent.
Résumé de la soumission : Les télomères sont des structures nucléoprotéiques essentielles qui protègent les extrémités linéaires des chromosomes et les empêchent d’être reconnues comme des cassures ADN double brin. Ils sont au cœur d’aspects importants de la vie cellulaire tels que la prolifération et la sénescence. Ces régions chromosomiques étaient précédemment considérées comme transcriptionnellement silencieuses, mais il est maintenant établi qu’elles donnent des transcrits hétérogènes d’une taille de 100 à 9000 paires de bases contenant essentiellement des répétitions UUAGGG. La synthèse de ces ARNs non codant télomériques appelés TERRA est initiée dans la région subtélomérique. De façon intéressante ces TERRA colocalisent avec des composants télomériques dans les noyaux interphasiques et sont retrouvés aux extrémités des chromosomes métaphasiques. Cette localisation des TERRA aux téloméres est régulée par des protéines SMG et UPF, établissant par là un rapport imprévu avec la voie de “nonsense-mediated mRNA decay“ (NMD). Il a été montré que le niveau des TERRA était abaissé dans les cellules cancéreuses et au cours du développement embryonnaire. Les données publiées suggèrent un rôle important des TERRA sur des activités enzymatiques dont celle de la télomérase.Ces données soulèvent de nombreuses questions sur la maturation et l’association aux télomères des TERRA, ainsi que sur leurs effets sur ces domaines chromosomiques d’une importance majeure. Les buts de notre projet seront 1) de mieux caractériser la maturation de ces transcrits TERRA par les facteurs cellulaires impliqués dans la voie NMD. 2) de rechercher un rôle des variants de l’histone H1 dans l’association des TERRA avec les téloméres.3) d’examiner comment les TERRA agissent sur la structure chromatinienne télomérique. 4) d’étudier leur rôle au cours du développement embryonnaire de la souris.Concernant la maturation des TERRA, sur la base de différents résultats préliminaires nous allons porter une attention particulière à la protéine INT6/EIF3e. Nous avons en effet démontré précédemment que cette sous-unité de EIF3 joue un rôle spécifique dans la voie NMD et qu’elle interagit avec les facteurs UPF1 et UPF2. Un effet de cette protéine sur la maturation et l’ancrage aux télomères des TERRA sera donc recherché et permettra de mieux comprendre le rôle de la traduction et de la voie de dégradation NMD dans la maturation des TERRA. Concernant l’association des TERRA avec les téloméres nous développerons des observations montrant un effet de la déplétion de variants de l’histone H1 sur la taille des télomères et sur l’expression de certains ARNs non codants. Nous allons analyser si certains variants de H1 régulent l’expression des TERRA et rechercher s’ils interviennent comme lien entre la ribonucléoprotéine TERRA et la chromatine télomérique. Dans la continuité de cette analyse nous aborderons la question de la formation d’hétérochromatine aux téloméres. Ces derniers possèdent en effet des marques spécifiques de l’hétérochromatine et exerce un effet négatif sur l’expression de gènes localisés dans la région subtélomérique. Par analogie avec ce qui est connu pour d’autres ARNs non codants, nous rechercherons un effet possible des TERRA sur la structure chromatinienne télomérique en analysant si une transcription forcée des télomères affecte l’effet de position télomérique, ainsi que les marques d’hétérochromatine. Enfin pour mieux définir le rôle fonctionnel des TERRA nous analyserons leur effet sur la régulation de la longueur des télomères aux stades précoces du développement de la souris. L’injection d’ARN mimant les TERRA dans des ovocytes fertilisés de souris nous permettra de voir s’ils s’associent aux télomères et comment cet événement altère l’allongement des télomères. L’ensemble de ces approches expérimentales nous permettra de mieux comprendre la fonction des TERRA dans l’organisme, en particulier au cours des stades précoces du développement.
Résultats : Les travaux menés sur les transcrits issus des télomères et incluant des motifs répétés ont permis d’observer que leur quantité dans la cellule était maintenue à un niveau réduit par une protéine impliquée dans le contrôle de l’initiation de la traduction des ARNs messagers et aussi dans la dégradation de certains ARNs cellulaires possédant différentes anomalies comme par exemple un codon stop prématuré. En examinant la présence de dommages de l’ADN aux télomères, nous avons aussi pu observer que cette protéine jouait un rôle protecteur. Il est intéressant de mettre en rapport l’instabilité génomique pouvant résulter de cet effet avec les propriétés oncogéniques liées à l’altération de l’expression de cette protéine, notamment dans le cas du cancer du sein. 
Un autre axe du projet a permis grâce à la mise au point d’un système génétique original de tester l’action de ces transcrits télomèriques sur l’expression d’un gène situé à proximité des télomères. Cette approche a permis de mettre en évidence l’action répressive des transcrits télomèriques sur cette expression.
Une particularité des ARNs possédant des motifs télomèriques est de s’associer aux télomères. De façon intéressante les travaux menés ont aussi permis de mettre en évidence que de petits ARNs existaient dans les cellules spermatiques et pouvaient s’associer à des territoires chromosomiques précis dans le noyau de l’oocyte. Cette association est maintenue au cours des premières divisions de la cellule initiale. Ces petits ARNs pourraient représenter un moyen de transmission d’une information épigénétique.
Perspectives : La taille des télomères est très étroitement régulée et diminue régulièrement au cours des divisions des cellules suite à la réplication des chromosomes. Des altérations de cette régulation peuvent entraîner un vieillissement prématuré. Des perturbations de la structure des télomères peuvent aussi provoquer une instabilité chromosomique menant à des altérations génomiques pouvant favoriser l’émergence de cellules cancéreuses.
La compréhension de l’action des transcrits télomèriques dans la bonne exécution des propriétés protectrices des télomères apparaît donc comme importante pour l’étude de différentes pathologies. Les techniques d’analyse des transcrits télomèriques mises au point dans le cadre de cette étude pourraient amener au développement de nouvelles méthodes d’analyses diagnostiques et pronostiques dans les champs du vieillissement et du cancer. Les travaux sur les petits ARNs possédant un motif télomèrique pourraient aussi apporter de nouveaux concepts dans le cas du développement de l’embryon.
Publications et brevets : - INT6 interacts with MIF4GD/SLIP1 and is necessary for efficient histone mRNA translation.
Neusiedler J, Mocquet V, Limousin T, Ohlmann T, Morris C, Jalinot P.
RNA. (2012) 6:1163-77. 
- INT6/EIF3E interacts with ATM and is required for proper execution of the DNA damage response in human cells.
Morris C, Tomimatsu N, Richard DJ, Cluet D, Burma S, Khanna KK, Jalinot P.
Cancer Res. (2012) 8:2006-16.
n.b. : les publications données ci-dessus ne sont pas en rapport direct avec le sujet des transcrits télomèriques, mais représentent des données préalables obtenues par une des équipes participantes (PJ) importantes à intégrer pour la bonne progression des études programmées sur les transcrits télomèriques.