Projet ANR-06-BLAN-0010 – Megakaryocyte : Mechanisms of poylyploisation, migration and platelet formation by megakaryocytes
Programme : Programme blanc (BLANC) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE)
Partenaires : Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 520000.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 36 mois
Résumé : Les plaquettes cellules anucléées du sang naissent par fragmentation du mégacaryocyte (MK), cellule présente dans la moelle, par un processus dynamique très spécifique appelé formation de proplaquettes (PPs). La formation des plaquettes est un phénomène unique nécessitant la succession de 3 processus: - 1) Les MKs deviennent polyploides par un mécanisme appelé endomitose - 2) A la fin de la différenciation, les MKs forment des allongements cytoplasmiques par déroulement des membranes de démarcation sous l'action du cytosquelette et - 3) Les MKs migrent pour libérer les plaquettes dans le flux sanguin. Une meilleure connaissance de ces différents processus permettrait une avancée importante dans la biologie cellulaire et dans la compréhension des mécanismes des thrombopénies. Le but de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes de la production plaquettaire.  La 1ère partie de ce projet consistera à déterminer le rôle du l'environnement médullaire sur la régulation de la différenciation mégacaryocytaire. Nous étudierons si le couple CXCR4/SDF-1 permet au MK de se différencier dans un environnement permissif. Cette partie comprendra deux aspects: 1) in vivo par l'utilisation de souris CXCR4-/- et 2) in vitro par des expériences de coculture entre les cellules stromales et les MKs. Les molécules impliquées dans l'interaction des progéniteurs MKs avec les cellules stromales et leur participation éventuelle à la rétention des MKs au niveau de l'environnement médullaire seront déterminées. La sortie des MKs de la moelle vers les sinusoides pourrait être liée à la modification de la voie de signalisation de CXCR4. Nous avons montré qu'en fin de maturation SDF-1 perdait son effet chemo-attractant sur des MKs et que l'expression de 2 RGS, RGS16 et 18, augmentait en cours de différenciation. Le KO de RGS16 in vitro a entraîné une restauration partielle de la réponse à SDF-1. Nous voulons étudier 1) l'effet in vivo de l'inhibition de RGS16 et 2) la fonction de RGS18. La 2ème partie de ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes de la formation des plaquettes. Notre hypothèse est que les petites protéines G de la famille Rho jouent un rôle important dans le mécanisme des endomitoses et dans le contrôle de la formation des PPs. Des résultats préliminaires montrent que l'activation de la voie Rho/Rock aboutit à une inhibition de la formation des PPs; inversement l'activation de Cdc42 favorise ce processus. Nous travaillerons sur des cellules murines et humaines. Chez l'homme, nous induirons la différenciation MK par la TPO. Nous étudierons ensuite le rôle de la voie Rho et Cdc42 en utilisant des inhibiteurs chimiques et des formes vectorisées de dominants négatifs ou de formes actives de Rho, Rock et Cdc42. Nous évaluerons la formation de PPs de manière quantitative et qualitative en effectuant des expériences de vidéomicroscopie, d'immunofluorescence et d'ultrastructure pour déterminer la cinétique, la présence de structures branchées, la répartition de l'actine et des organelles. La localisation de Cdc42 activée au cours de la formation des PPs sera étudiée par des expériences de FRET utilisant un senseur et de la vidéomicroscopie. Le rôle précis de Cdc42 sera étudié en utilisant des souris invalidées de manière conditionnelle (Cre/Lox) qui seront croisées avec des souris MXCre. La phosphorylation de la chaîne légère de la myosine régulée par Rock semble jouer un rôle clef dans la formation des PPs. Son rôle sera étudié en détail en utilisant l'ARN interférence et des inhibiteurs de phosphorylation. Nous utiliserons également l'ARN interférence pour étudier la voie Cdc42, Wasp et la voie PAK1, LIM kinase, cofiline. En parallèle, nous étudierons le rôle de Rho/Rock sur la polyploïdisation du MK. En effet, le processus endomitotique est associé à un défaut d'élongation du fuseau cellulaire et à l'anaphase B aboutissant à une absence de vraie télophase et de cytokinèse, mécanisme régulé par Rock chez la drosophile. Le pro...