Projet ANR-07-BLAN-0067 – SODATOL : Structural organization and dynamic analyses of Tol membrane proteins
Programme : Blanc (BLANC) 2007
Année de financement : 2007
Coordinateur du projet : Rolland LLOUBES (CNRS DELEGATION REGIONALE PROVENCE ET CORSE)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique
Montant : 239400.0 euros
Date de début : 2007
Durée : 36 mois
Résumé : Le système Tol est conservé chez les bactéries à Gram négatif. Il se compose de trois protéines de membrane interne, TolA-TolQ-TolR, d'une protéine périplasmique TolB et d'une lipoprotéine Pal ancrée dans la membrane externe. Le rôle exact de ce système est encore mal connu, même si son implication dans le maintient de l'intégrité membranaire est avéré. Des études récentes suggèrent également l'implication de ce système dans les étapes tardives du processus de division cellulaire. Les différentes interactions découvertes à ce jour entre les protéines du système Tol montrent que ces protéines forment des complexes protéiques permettant de relier la membrane interne à la membrane externe et au peptidoglycane (PG). L'établissement de certain complexes dépend de la force proton motrice. Cependant, la dynamique d'assemblage de ces différents complexes associés ou non au PG est à ce jour inconnue. Nous avions proposé un modèle d'organisation des segments transmembranaires (STM) des protéines TolA-TolQ-TolR où les résidus conservés appartenant à trois STM de TolQ et TolR participeraient à la formation d'un canal ionique. Nous avons démontré que l'interaction de TolAc avec Pal était dépendante de la force proton motrice et qu'elle nécessitait la présence des protéines TolQ-TolR. La transduction d'énergie longue distance est un mécanisme rare et qui est aussi retrouvé dans le transport actif de Fe3+-sidérophores par le système TonB. Sachant qu'il y a des possibilités d'échange entre systèmes Tol et TonB, notre projet à pour but de déterminer au niveau moléculaire le mécanisme de la transduction d'énergie de la membrane interne vers la membrane externe. -  Ce projet associe des microbiologistes, biochimistes et des physiciens. Notre équipe est seule à demander un financement ANR. Notre équipe réalisera les expériences de génétique, de biologie moléculaire, de mise au point des conditions d'expression, de purifications des protéines et d'analyses des complexes protéiques. L'analyse d'image par microscopie électronique est un outil disponible sur place que nous utiliserons pour l'analyse structurale à basse résolution. Nous venons de publier une analyse de mutations qui ciblent le fonctionnement du système Tol et qui ont permis de mieux définir l'organisation des STM et des résidus appartenant au canal ionique. D'autre part nous venons de publier l'analyse des changements conformationnels de la partie périplasmique de TolR en fonction de l'état énergétique en utilisant la technique de cystéine-scanning. Une étude systématique récente de chacun des résidus appartenant aux STM des protéines TolQ, TolR et TolA ainsi qu'aux boucles reliant les STM de TolQ a débuté. Une équipe associée à notre projet est impliquée dans la cristallographie des protéines Tol membranaires obtenues à partir de différent génomes pour obtenir des informations structurales. La purification des protéines et les analyses structurales seront réalisées par Nadir Seddiki dans le laboratoire du Dr Susan Buchanan (NIH, NIDDK, Bethesda). Nadir est inscrit à l'Université de la Méditerranée avec une bourse du NIH pour une Thèse co-dirigée par Dr Buchanan et Dr Lloubes. Il est important de souligner que l'équipe dirigée par Dr Buchanan travaille sur le système TonB et sur la cristallisation de protéines membranaires. Nos travaux actuels sur les complexes multimériques Tol, obtenus par la cartographie de deux cystéines localisées dans deux STM différents, seront tout à fait adaptés pour la purification de complexes Tol. En association avec l'équipe de physiciens spécialiste en Résonnance Paramagnétique Electronique (RPE), nous allons vérifier s'il est possible d'analyser les changements conformationnels des complexes Tol membranaires. En relation avec nos travaux actuels de cartographie par mutation cystéine, nous connaitrons les résidus accessibles qui n'interfèrent pas avec la fonction du système et qui seront ceux choisis pour faire des marquages spécifiques avec les sondes u