Projet ANR-12-BSV8-0013 – SelArom : Utilisation sélective d'acides aminés aromatiques par les protéines à radical SAM.
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8) 2012
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Juan-Carlos FONTECILLA-CAMPS (Institut de Biologie Structurale)
Partenaires : Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux; Institut de Biologie Structurale; Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé Humaine; Service de Chimie Inorganique et Biologique
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : Les protéines à radical S-adénosyl-L-méthionine (SAM) sont des enzymes capables de catalyser des réactions complexes telles que l’insertion d’atomes de soufre, des cyclisations ou des méthylations particulières. La réduction par un électron d’un centre Fe4S4 conservé permet la coupure de la SAM produisant ainsi une espèce 5’-désoxyadénosyl radicalaire hautement réactive. Ce radical peut, à son tour, extraire un atome d’hydrogène de substrats extrêmement variés, conduisant à la propagation de l’espèce radicalaire réactive. La SAM peut être un substrat ou un cofacteur selon que la réaction de terminaison permette sa régénération ou bien consomme définitivement le radical.
Plusieurs enzymes à radical SAM ont été caractérisées, que ce soit du point de vue structural ou fonctionnel. Cependant, aucune étude systématique concernant les facteurs qui modulent la formation d’un radical spécifique ou qui conduisent à un produit particulier n’a été réalisée. Nous avons donc sélectionné quatre protéines : HydG (une enzyme de maturation des hydrogénases à fer-fer) ; ThiH (impliquée dans la synthèse de la vitamine B1) ; la FO (didéméthyl-hydroxy-déazaflavine)-synthase (impliquée dans la production du cofacteur F420) et NosL (impliquée dans la synthèse d’un précurseur d’antibiotique). Ces enzymes catalysent toutes la même réaction de rupture de la liaison Ca-Cß d’un acide aminé aromatique (tyrosine dans le cas de HydG, ThiH et FO-synthase et tryptophane pour NosL). Ces quatre enzymes produisent en revanche des produits extrêmement différents. Au cours de cette réaction, un des fragments produit est soit de la déhydroglycine (ThiH et FO-synthase) soit un radical glycyl (HydG et NosL). HydG, ThiH et NosL utilisent ce fragment pour produire du cyanure et du monoxyde de carbone (HydG), le cycle thiazole de la thiamine (ThiH) ou l’intermédiaire de synthèse de nosyheptides (NosL). En revanche, la FO-synthase utilise le second fragment produit, à savoir un radical p-crésyl. Ainsi, le p-crésol peut être soit un produit secondaire de réaction (HydG et ThiH) ou bien partie intégrante du produit final (FO-synthase). Dans une réaction similaire, NosL fixe le groupement carboxylate de la partie déhydroglycyl sur le noyau méthylindole.
Le but de ce projet est de comprendre comment ces enzymes sont capables de guider la réaction vers un produit plutôt qu’un autre. Notre but n’est pas simplement de comprendre le mécanisme de chacune d’elles, mais d’arriver à extraire des principes généraux concernant la réaction radicalaire mise en jeu. Nous souhaitons donc adopter une approche synthétique combinant les techniques de biochimie, biologie structurale, spectroscopie et chimie computationnelle afin d’identifier les espèces radicalaires impliquées dans la réaction ainsi que les interactions substrat-protéine qui affectent la sélectivité de réaction.
Les quatre partenaires impliqués ont des compétences complémentaires qui seront judicieusement utilisées sur les différentes cibles du projet : production des échantillons et études fonctionnelles détaillées incluant la caractérisation des produits, l’analyse des paramètres cinétiques (Partenaire 2), détermination de structures par cristallographie aux rayons X, incluant l’étude des complexes avec les substrats, inhibiteurs et produits, mais aussi cristallographie cinétique et calculs théoriques (Partenaire 1) (Une plateforme automatique de cristallisation de protéines en conditions anaérobes a été très récemment développée par le Partenaire 1. Cette plateforme est une des rares disponibles dans le monde). Les Partenaires 3 et 4 réaliseront des études par spectroscopie Mössbauer et RPE. Le Partenaire 3 possède la seule plateforme Mössbauer dédiée aux échantillons biologiques en France et une des rares dans le monde. Le Partenaire 4 est membre d’une équipe ‘RPE avancée qui pratique des expériences d’ENDOR pulsée et d’ESEEM adaptées à l’identification et au suivi de radicaux organiques.