Projet ANR-10-CD2I-0014 – NaturaDyRe : Réactions d'oxydation biocatalysées efficaces pour la synthèse de composés naturels ou énantiopurs
Programme : Chimie Durable - Industries - Innovation (CD2I)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Véronique ALPHAND (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE PROVENCE)
Partenaires : Institut des Sciences Moléculaires de Marseille; Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives; Biologie Intégrée du Globule Rouge; NATURAMOLE
Montant : 891202.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Une centaine de nouvelles enzymes d’oxydation de cétones : quoi de neuf ?Ou comment compléter et élargir l’offre de biocatalyseurs permettant de synthétiser des lactones de manière plus écologique tout en diminuant les risques d’accident.
Exploration de la biodiversité des BVMOs et application à de nouvelles synthèsesL’objectif de ce projet est de mettre à disposition dans les laboratoires et, à terme, en production industrielle, de nouveaux catalyseurs éco-compatibles qui autorisent des réactions de Baeyer-Villiger beaucoup plus sélectives (chimio-, régio-, stéréospécificité) et beaucoup plus propres et sûres que les réactions chimiques conventionnelles, à base de peracides explosifs. Ces catalyseurs se présentent sous forme de cellules de E. coli modifiées pour produire des enzymes appelées Baeyer-Villiger Monooxygénases qui sont protégées et « alimentées » en électrons par le métabolisme cellulaire. Or, la faiblesse de l’offre en début de programme (une seule enzyme commercialisée et une petite trentaine d’enzymes identifiées et expérimentalement étudiées) restreint de fait le recours à ces biotransformations. Nous avons donc souhaité proposer un panel conséquent de nouvelles enzymes d’activités complémentaires. Par ailleurs, la productivité des réactions de Baeyer-Villiger biocatalysées étant limitée par des phénomènes d’inhibition, nous avons cherché à développer des procédés plus efficaces afin de permettre à terme la production de molécules présentant un intérêt dans le domaine des arômes ou des intermédiaires de synthèse.
Clonage / criblage haut débit et Dédoublement Cinétique DynamiqueUn grand nombre de protéines similaires à des Baeyer-Villiger monooxygénases connues a été identifié dans les banques de données protéiques (UniprotKB) par comparaison de séquences. Une analyse bioinformatique a permis de sélectionner un nombre limité de protéines représentant la diversité de cette famille. Les gènes correspondants ont été clonés et introduits dans des microorganismes-hôtes grâce une plateforme de clonage à haut débit. Les taux de réussite initialement très bas du fait des caractéristiques de ces gènes (fort taux d’acides nucléiques GC) ont été améliorés par l’élaboration de protocoles particuliers. Des tests de criblage de haut et moyen débit destinés à établir les profils d’activité et d’énantiosélectivité de ces enzymes ont été mis au point et effectués. Des corrélations entre les séquences, les modèles structuraux des enzymes et leurs propriétés biocatalytiques ont été recherchées avec cependant un succès relatif. Par ailleurs, la productivité des certaines réactions a été améliorée par des Dédoublements Cinétiques Dynamiques. Ces procédés permettent de dépasser les 50% de rendement maximal inhérents aux dédoublements cinétiques classiques en associant simultanément racémisation in situ du substrat et réaction microbiologique.
Résumé de la soumission : L’objectif de ce projet est de mettre à disposition des chimistes (de laboratoire ou en production industrielle) un nouvel outil : une réaction de Baeyer-Villiger biocatalysée régio- et/ou énantiosélective, de haut rendement, et applicable à haute concentration.            Afin de remédier à la faiblesse de l’offre actuelle en Baeyer-Villigérases (une douzaine d’enzymes disponibles en laboratoire, une seule commercialisée) qui restreint le recours à ces biotransformations, nous souhaitons proposer un panel conséquent de nouvelles enzymes affichant des activités complémentaires. Pour cela, un grand nombre de gènes de BVases putatives sera recherché  dans des banques de données génomiques par comparaison de séquences puis introduits dans des microorganismes-hôtes via un clonage à haut débit. Des tests de criblage de haut et moyen débit destinés à établir les profils d’activité et d’énantiosélectivité de ces enzymes seront mis au point et réalisés. Des corrélations entre les séquences, les modèles structuraux des enzymes et leurs propriétés biocatalytiques seront recherchées  afin de mettre au point un outil d'aide à la décision du choix du catalyseur.           Par ailleurs, la productivité des réactions de Baeyer-Villiger biocatalysées étant limitée du fait de phénomènes de toxicité ou d’inhibition, il s’agira de développer un procédé à base de résines adsorbantes qui autorisera une augmentation des concentrations de travail afin de les rapprocher des standards industriels.             Outre leur aspect « vert » et durable, les réactions de Baeyer-Villiger biocatalysées présentent  l’avantage d’offrir une version enzymatique bien plus performante en terme d’énantiosélectivité que la version chimique. Afin d’exploiter au mieux ces caractéristiques, des procédés de Dédoublement Cinétique Dynamique qui permettent de dépasser les 50% de rendement maximal inhérents aux dédoublements classiques en associant simultanément racémisation in situ du substrat et réaction de Baeyer-Villiger microbiologique seront mis en œuvre. A cette fin, diverses conditions de racémisation, chimiques et enzymatiques, seront explorées. Les deux procédés seront finalement réunis dans un Dédoublement Dynamique à Haute Concentration qui devrait conduire à une augmentation conséquente de la productivité.            Une place particulière sera accordée tout au long de ce travail aux méthodologies de recherche expérimentale (plans d’expériences pour réduire le nombre d’expériences, modèle QSAR pour mieux cibler les gènes d’intérêt).                La démarche proposée dans ce projet sera validé par la fabrication à l'échelle industrielle de molécules présentant un intérêt dans le domaine des arômes ou des intermédiaires de synthèse.
Résultats : Une centaine de nouvelles Baeyer-Villiger Monooxygénases a été découverte. Deux d’entre elles ont révélé une réactivité originale envers des cétones a,ß-insaturées, donnant accès à des ène- et des énol-lactones chirales jusqu’alors difficiles d’accès. Des biocatalyseurs ont été construits spécifiquement à cet effet afin d’éliminer des réactions secondaires inopportunes, d’autres ont été construits pour la synthèse de molécules aromatiques via des réactions enzymatiques en cascade.
Perspectives : -
Publications et brevets : Ces travaux ont donné lieu à deux publications dans des revues internationales (Chemical Communications, Biochimie), douze communications orales ou par affiches dans des congrès nationaux ou internationaux. Deux thèses ont également été soutenues.