Projet ANR-12-BSV6-0015 – RepliCare : Mécanismes de protection de l’intégrité du génome au cours de la réplication
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Philippe Pasero (IGH CNRS )
Partenaires : Institut de Génétique Humaine
Montant : 379733.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : Mécanismes de protection de l’intégrité du génome au cours de la réplicationCaractérisation des mécanismes qui limitent l’instabilité génétique chez les eucaryotes en contrôlant l’activation séquentielle des origines et la stabilité des fourches de réplication
Vers une meilleure compréhension du stress réplicatif comme cause d’instabilité génétiqueLes défauts de réplication représentent une source majeure d’instabilité génétique, à l’origine de plusieurs pathologies humaines comme le cancer. Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules contrôlent l’activation des origines et stabilisent les fourches de réplication en conditions de croissance normales afin d’éviter l’instabilité génétique induite par le stress réplicatifDans le cadre de ce projet de recherche, nous allons déterminer comment les mécanismes de surveillance du génome (checkpoints) et de modification de la chromatine (histones déacétylases) coopèrent afin d’assurer l’exécution correcte des programmes de réplication chez la levure S. cerevisiae. Nous aborderons notamment les points suivants :Tâche 1 : Nous déterminerons si les mécanismes de surveillance de la réplication sont activés dans des conditions normales de croissance et si ils contrôlent le programme temporel de réplication..Tâche 2 : Nous étudierons l’effet de ces mécanismes de surveillance sur la progression des fourches de réplication. Tâche 3 : Nous analyserons les profils de réplication d’une collection de mutants de levure afin d’identifier les facteurs de modification de la chromatine impliqués dans la mise en place du programme temporel de réplication. Tâche 4 : Nous caractériserons de nouveaux mécanismes de protection des fourches de réplication impliquant des protéines de la famille SMC, telles que les cohésines et Rad50. 
Etude de la dynamique de réplication, de la molécule unique à la génomiqueCe projet s’appuie sur des technologies de pointe qui ont été mises en place au laboratoire dans le cadre de l’ANR DynaRep (2009-2012) et qui sont parfaitement maitrisées par les membres de l’équipe. Il s’agit notamment de la technique de peignage moléculaire, qui permet d’étudier l’activation des origines de réplication et la progression des fourches le long de chromosomes individuels, étirés sur des lames de verre. En complément de cette approche « molécule unique », nous étudions également la distribution des fourches au niveau du génome entier grâce à l’utilisation de puces à ADN ou de la technologie de séquençage à haut débit de dernière génération.
Résumé de la soumission : La réplication fidèle et rapide des génomes eucaryotes dépend de l’activation séquentielle de milliers d’origines de réplication distribuées le long des chromosomes. Elle dépend également de la progression de milliers de fourches de réplication à partir de ces origines. Différents travaux indiquent que ce programme de réplication est déterminé à la fois par le contexte chromosomique et par les mécanismes de surveillance de la phase S. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans cette régulation restent mal connus. Dans le cadre de ce projet de recherche, nous allons déterminer comment les kinases de checkpoint et certaines histones déacétylases (HDACs) coopèrent afin d’assurer l’exécution correcte des programmes de réplication chez la levure S. cerevisiae. Nous utiliserons une combinaison de techniques comme le ChIP-chip, le séquençage massivement parallèle et le peignage moléculaire afin d’étudier la dynamique de la réplication à l’échelle de fibres d’ADN individuelles et du génome entier. Nous aborderons notamment les points suivants :Tâche 1 : Nous déterminerons si les kinases de checkpoint sont actives durant une phase S normale et si elles contrôlent le programme temporel d’activation des origines de réplication en conditions normales de croissance. Nous identifierons également les loci qui induisent l’activation basale du checkpoint de réplication au cours d’une phase S normale, en portant une attention particulière aux R-loops, des hybrides ADN-ARN qui se forment au cours de la transcription et interfèrent avec la progression des fourches.Tâche 2 : Nous étudierons l’effet des kinases de checkpoint sur la progression des fourches de réplication. Nous nous intéresserons en particulier aux effets directs du checkpoint sur la vitesse d’élongation ainsi qu’aux effets indirects via la régulation des pools de dNTPs.Tâche 3 : Nous analyserons les profils de réplication d’une collection de mutants de levure afin d’identifier les HDACs impliquées dans la mise en place du programme temporel de réplication. Nous étudierons ensuite plus précisément les mécanismes moléculaires impliqués dans cette régulation.Tâche 4 : Nous caractériserons également de nouveaux mécanismes de protection des fourches de réplication impliquant d’une part l’HDAC Sir2 et d’autre part des protéines SMC telles que les cohésines et Rad50. Ce projet s’appuie sur des technologies de pointe qui ont été mises en place au laboratoire dans le cadre de l’ANR DynaRep (2009-2011) et qui sont parfaitement maitrisées par les membres de l’équipe. Il s’appuie également sur de très nombreuses données préliminaires et sur l’expérience reconnue de notre équipe dans les domaines de la réplication et de l’instabilité génétique. Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui assurent une réplication fidèle et complète des génomes eucaryotes.
Résultats : Les principaux résultats obtenus au cours de ce projet concernent la caractérisation de nouveaux mécanismes de protection des fourches de réplication faisant intervenir différents complexes de la famille SMC, dont le complexe cohésine. Nous avons également identifié les principaux facteurs chromatiniens qui contrôlent le programme de réplication chez la levure en régulant l’accessibilité des origines de réplication.
Perspectives : A terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment les cellules gèrent les problèmes de réplication associés à la physiologie normale de la cellule, par exemple quand une ADN polymérase (réplication) rencontre une ARN polymérase (transcription) progressant en sens inverse sur la même molécule d’ADN. Les mécanismes utilisés par les cellules afin de gérer ce type de conflit sont d’une importance capitale pour le maintien de l’intégrité du génome mais sont encore très mal compris. Nos travaux, notamment grâce aux approches combinées molécule unique / génome entier, devraient apporter des informations capitales pour notre compréhension des mécanismes moléculaires impliqués.
Publications et brevets : Les travaux mentionnés ci-dessus ont donné lieu à cinq articles originaux (3 Molecular Cell, 1 J Cell Biol, 1 PNAS), trois articles de revue et un chapitre d’ouvrage. Ces travaux ont également été présentés oralement dans quinze conférences internationales