Projet ANR-10-BLAN-1229 – ArfRabCrosstalk : Coordination fonctionnelle des petites protéines G Arf et Rab par des cascades Rab-ArfGEF-Arf1 dans les voies de trafic impliquant le Golgi
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Cathy JACKSON (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS B)
Partenaires : Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire; Institut Jacques Monod; Institut de Génétique et Microbiologie; Compartimentation et Dynamique Cellulaires; Université Paris-Sud
Montant : 740000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Interrupteurs moléculaires et senseurs de membranes régulant le trafic membranaireLes cellules eucaryotes sont caractérisées par leur compartimentation interne membranaire qui est régulée par 2 familles d'interrupteurs moléculaires, les protéines G Rab et Arf, qui contiennent des hélices amphipathiques agissant comme senseurs de membranes afin de lire l'information portée par les lipides des membranes cellulaires.
Coordination du trafic de lipides et de protéines par  Arf et Rab et les senseurs amphipatiquesUn objectif majeur est d'élucider les mécanismes par lesquels les petites protéines G impliquées dans le trafic vésiculaires, les Arfs et les Rabs, sont coordinées. Notre projet, utilisant des approches systématiques, est très original par le fait qu'il va démontrer pour la première fois un nouveau mécanisme  moléculaire liant ces 2 voies de signalisation et sa fonction dans la coordination du trafic de lipides et de protéines. Mon groupe a été un des premiers à montrer le rôle de Arf1, de son activateur GBF1 et de l'effecteur COPI dans le métabolisme des gouttelettes lipidiques (GL). Les GLs, composées d'un cœur de lipides neutres entouré par une monocouche de phospholipides, sont présentes dans la plupart des cellules mais plus particulièrement dans les adipocytes. Elles servent dans le stockage de l'énergie sous forme de triglycérides (cœur) et dans la mobilisation des lipides pour la production de membranes. L'obésité est le résultat d'un excès de stockage de lipides dans les GLs. Un de nos objectifs est de développer un test qui permette de suivre la liaison des protéines Arf et Rab et de leurs régulateurs sur la monocouche de phospholipides des GLs in vitro et de comparer avec les résultats obtenus avec des liposomes (bicouche). Les hélices amphipathiques (AHs) sont connues pour cibler les GLs et des prédictions de structures montrent que les domaines des activateurs de Arf qui se lient aux lipides in vitro se replieraient en AHs. Des études de protéomiques et d'imagerie de GBF1 seront menées afin d'identifier et de caractériser les partenaires protéiques impliqués dans la régulation de la localisation sur les GLs et sur le Golgi.
Imagerie cellulaire, Biochimie et Génomique de la levureNous utilisons l'approche quantitative de carte de densité des organelles cellulaires par microscopie confocale développée par une de nos équipes (B. Goud) afin de caractériser les protéines Rab ainsi que leurs régulateurs et effecteurs qui influencent la localisation de GBF1 dans les cellules. La microscopie à super résolution sera menée sur la plateforme d'imagerie de l'IJM et en collaboration avec J. Lippincott-Schwartz  (NIH, USA), et la microscopie électronique corrélative par J-M. Verbavatz (CBI-MPG,  Dresden).  Nous testons in vitro, en présence de liposomes, l'activité sur Arf1 myristilé de fragments de l'activateur de Arf GBF1 exprimés dans la bactérie. Nous allons exprimer GBF1 entier à l’aide de baculovirus, système qui permettrait d’obtenir une protéine recombinante présentant une activité d'échange in vitro sur Arf1 myristylé. Nous allons mener des études génomiques en utilisant le système modèle levure afin de comprendre les circuits globaux de régulation impliqués dans la coordination des trafic de protéines et de lipides. Plus spécifiquement, des cellules de levure exprimant des biosondes sous forme d’HAs qui présentent des perturbations au niveau des voies de trafic membranaire seront analysées sur le plan génomique.
Résumé de la soumission : L'objectif majeur du projet consiste à élucider les mécanismes impliqués dans la coordination des fonctions de deux familles de petites protéines G impliquées dans le trafic vésiculaire, les protéines Arf et Rab. Alors que chacune des deux familles a été étudiée intensivement, très peu d'études ont adressé les connections entre elles. Ainsi, le travail de nombreux laboratoires a indiqué qu’elles ont des fonctions distinctes dans le trafic vésiculaire : les protéines Arf sont nécessaires à la formation des vésicules tandis que les protéines Rab le sont pour leur adressage et leur fusion avec le compartiment accepteur. De plus, les protéines Rab ont des localisations subcellulaires restreintes tandis que les protéines Arf présentent moins de spécificité de compartiment. De façon intéressante, il a été montré que Rab1-GTP recrute GBF1, facteur d'échange (GEF) pour Arf1, sur les membranes du Golgi précoce. Tenant compte de la spécificité de compartiment des protéines Rab, leur implication dans le recrutement aux membranes d'une GEF pour Arf apparaît comme une idée attractive puisque cela confère une spécificité pour l'activation d’Arf. Cependant, ce résultat pose un problème puisque, dans une même étape de trafic, les protéines Rab interviennent après les protéines Arf.De nombreuses protéines impliquées dans le trafic sont des protéines transmembranaires, telles les SNARE et les récepteurs de cargaison, et doivent donc retourner vers leur organelle donneuse par un système de recyclage faisant intervenir, lui aussi, des vésicules. Il paraît ainsi raisonnable de concevoir l'existence d'une connexion entre la machinerie de fusion d'un type de vésicules et la machinerie de bourgeonnement des vésicules nécessaires à l'étape suivante de recyclage. Très peu d'études ont cherché à ce jour à adresser cette question. Cependant, récemment, évidences qui soutiennent l'idée d'une coordination entre le bourgeonnement de vésicules et les processus d'adressage et de fusion ont commencé à émerger. Le recrutement aux membranes de la GEF pour Arf1 GBF1 par Rab1 fournit ainsi un nouveau mécanisme moléculaire pour la coordination entre la fusion des vésicules antérogrades et le bourgeonnement des vésicules impliquées dans l'étape suivante de recyclage. Dans le présent projet, nous allons donc explorer la coordination des réseaux des petites protéines G Arf et Rab dans le trafic vésiculaire. Nous allons tout d'abord nous focaliser sur le recrutement de GBF1 sur les membranes par Rab1, que nous référerons ensuite comme la cascade Rab1-GBF1-Arf1. Ce projet est divisé en trois objectifs. Dans l’objectif 1, « localisation et activation de GBF1, GEF pour Arf1 », nous étudierons individuellement chaque aspect de la cascade : localisation de GBF1 dans des cellules présentant une expression de Rab1 réduite soit exprimant des formes mutées de cette dernière, caractérisation biochimique en solution de l'interaction entre GBF1 et Rab1 et développement d'un test d'activation d'Arf1 par GBF1 sur des liposomes. Dans l’objectif 2, « caractérisation de la cascade Rab1-GBF1-Arf1 dans les cellules et in vitro », nous allons reconstituer le recrutement de GBF1 par Rab1 sur des membranes artificielles et tester l'activité d'échange de GBF1 sur Arf1 en présence de Rab1 et d'autres partenaires physiologiques. En plus de ces études mécanistiques, nous allons utiliser à la fois l'imagerie sur cellules vivantes et la microscopie électronique avec immunomarquage afin de déterminer avec précision la nature des membranes sur lesquelles Rab1 recrute GBF1 dans les cellules et en étudier les conséquences fonctionnelles. Dans l’objectif 3, « parallèles entre les fonctions Rab et Arf dans les voies de trafic ER-Golgi et TGN-endosome », nous allons explorer les cascades Rab-ArfGEF-Arf1 dans les voies TGN-endosome et, plus généralement, mener une étude systématique des interactions entre Rab et Arf dans les voies aux niveaux des faces cis et trans du Golgi.
Résultats : Les purifications par affinité de l'activateur de Arf GBF1 ont été menées et les protéines copurifiées identifiées par spectroscopie de masse. Cette approche a été un grand succès. Plusieurs protéines ont été identifiées, notamment un grand nombre de Rabs. Par un test de double hybride dans la levure, les interactions avec Rab1, Rab6A et Rab6A’ ont été confirmées. Ces 3 Rabs dans leur forme active interagissent avec l'extrémité N-terminale de GBF1. De plus, Rab6A-T27N interagit avec le domaine catalytique Sec7 de GBF1 et la protéine entière. Ces résultats soutiennent la conclusion que Rab6 est un partenaire interagissant directement avec GBF1. L'analyse par spectroscopie de masse des protéines copurifiées a aussi identifié des membres de la famille Arf dont  Arf4, Arl1 et Arl2. Arf4 est une protéine localisée au niveau du cis-Golgi dont les fonctions recoupent celles de Arf1 et de GBF1 par exemple pour le recrutement de COPI. Cette interaction sera analysée plus en détails par des analyses fonctionnelles. Deux domaines de GBF1 localisent sur les GLs dans les cellules mais par sur le Golgi; GBF1 entier se localise sur les deux.  Nous étudions les mécanismes de cette double localisation de GBF1 en particulier l'influence du domaine catalytique Sec7 sur cette localisation.  Les domaines qui se localisent sur les GLs sont des domaines capables de se lier directement aux lipides in vitro. Nous avons démontré que l'un d'eux se lie à la double couche de phospholipides des liposomes ainsi qu'à la simple couche de phospholipides des gouttelettes lipidiques in vitro.
Perspectives : De nombreuses protéines dans l’orbite de Arf (GBF1, l’inactivateur ArfGAP1 et ses effecteurs) sont recrutées aux membranes par l’intermédiaire de domaines interagissant avec les lipides formés d’HAs qui s’insèrent dans la région interfaciale du feuillet de phospholipides. Cette liaison qui implique des contacts multiples avec les lipides procure aux HAs une forte capacité d’interprétation des informations codées par les lipides. Le recrutement de protéines sur la monocouche de phospholipides des GLs fait souvent intervenir des HAs. En plus de coordiner le trafic vers les GLs et dans la voie sécrétoire, Arf1, GBF1 et son partenaire Rab6 pourraient aussi coordiner les trafics de lipides et de protéines aux sites de contact ER-Golgi, hypothèse que nous étudions par imagerie, biochimie, bioinformatique et génomique.
Publications et brevets : Ellong EN, Soni KG, Bui QT, Sougrat R, Golinelli-Cohen MP, Jackson CL. 2011. Interaction between the triglyceride lipase ATGL and the Arf1 activator GBF1. PLoS One. 6(7):e21889
Donaldson JG, Jackson CL. ARF family G proteins and their regulators: roles in membrane transport, development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. (2011) 12:362-75. Review