Projet ANR-12-BSV5-0004 – MITOTUBES : Disséquer la Dynamique des Microtubules en Mitose par Reconstitution de Sous-Modules du Fuseau
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame Ariane ABRIEU (Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire)
Partenaires : Laboratoire de Physiologie Cellulaire Végétale; Centre de Recherche en Biologie Cellulaire de Montpellier
Montant : 480000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Comprendre le fonctionnement du fuseau mitotique : reconstitution d’unités fonctionnelles in vitroAu cours de la mitose, les cellules doivent construire un fuseau mitotique bipolaire pour diviser leur patrimoine génétique. Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation et le fonctionnement du fuseau des cellules eucaryotes.
Reconstruire les sous-modules minimum du fuseau mitotique in vitro pour étudier le rôle de protéines clé et modéliser les mécanismes de son assemblage et fonctionnement cellulaire.Pour diviser correctement son génome, la cellule doit orchestrer la construction d’un fuseau mitotique bipolaire dont l’activité repose essentiellement sur la dynamique d’assemblage des microtubules, éléments majeurs du cytosquelette. Les microtubules sont des éléments tubulaires assemblés à partir de dimères de tubuline (unité de base des microtubules). Pour assurer ses fonctions, le fuseau mitotique est composé de plusieurs réseaux de microtubules : i) les microtubules interdigités de la zone centrale du fuseau mitotique (« midzone ») qui jouent un rôle crucial dans l’établissement de la bipolarité du fuseau mitotique et dans le maintien de sa stabilité, ii) les microtubules arrimés au kinétochore des chromosomes (fibres du kinétochore) et dont la dépolymérisation synchrone en anaphase permet la montée des chromosomes vers les pôles, et iii) les microtubules astraux qui irradient à partir des pôles du fuseau. Jusqu’ici notre connaissance des mécanismes moléculaires par lesquels les cellules organisent ces différents réseaux reste peu documentée. Pour progresser dans cette connaissance, nous devons caractériser les propriétés moléculaires et fonctionnelles des protéines strictement indispensables au contrôle de la dynamique des microtubules (assemblage/dépolymérisation) et de leurs associations latérales (formation des faisceaux), et comprendre comment elles fonctionnent ensemble. Cependant, l’étude fine de la dynamique des microtubules au cœur du fuseau dans les cellules vivantes reste difficile à aborder et ceci à cause de la très forte densité/complexité des réseaux de microtubules. Dans ce contexte, les objectifs de ce projet sont de reconstituer in vitro des modules minimum du fuseau mitotique dans des conditions biochimiquement contrôlées (systèmes biomimétiques). 
Reconstitution in vitro de modules minimum de microtubules impliqués dans le processus mitotique sur des surfaces et espaces contraints (2D).Pour étudier les mécanismes de fonctionnement du fuseau mitotique à l’échelle moléculaire, notre stratégie repose sur la reconstitution in vitro de réseaux minimum de microtubules du fuseau mitotique en présence de protéines clés, dans des conditions chimiques contrôlées et avec analyse en imagerie moléculaire (microscopie à onde évanescente (TIRF). Le contrôle de la géométrie d’assemblage des microtubules est réalisé par une méthode de micro-ingénierie qui permet la nucléation des microtubules à partir de zones dont les formes, la taille et la distribution les unes par rapport aux autres sont à l’échelle cellulaire.
Résumé de la soumission : L’étude fine de la dynamique des microtubules (MTs) au coeur du fuseau mitotique dans les cellules vivantes est obscurcie à cause de la densité et de la complexité des réseaux de MTs. C’est pourquoi nous avons cherché à reconstituer un module minimal de ces réseaux de MTs dans un milieu biochimiquement contrôlé (essai biomimétique). En effet, le fuseau mitotique peut-être conceptualisé comme un ensemble de sous-réseaux intégrés parmi lesquels figurent les MTs radiaux au niveau des pôles (MTs astraux), les MTs chevauchant à la « midzone » et les MTs connectés au kinétochore (fibres du kinétochore), ou à la chromatine. Afin d’imposer une géométrie d’assemblage pour que les MTs puissent mimer ces différentes unités de manière simplifiée, nous développons de nouvelles techniques de micro-ingénierie. Nous avons développé une méthode de micro-impression permettant de contrôler précisément la position des centres de nucléation des MTs, à une échelle qui correspond aux dimensions cellulaires (Figure 1). Grâce à un système de microscopie « dual view TIRF » (Total Internal Reflexion Fluorescence utilisant deux lasers simultanément), nous disposons du « nec plus ultra » pour réaliser les plus fines mesures de la dynamique des MTs.Tout d’abord, nous reconstituerons une structure de « midzone » minimale en contraignant la géométrie de MTs antiparallèles en présence d’une ou deux protéines responsables de l’organisation de MTs en faisceaux (tâches 1 & 2). Nous déterminerons également comment la phosphorylation de ces protéines par des kinases mitotiques candidates affecte leur activité de fasciculation. Afin d’avoir une meilleure lecture de l’organisation du fuseau, nous développerons un nouvel essai permettant d’explorer la contribution relative des centres de nucléation agissant habituellement de concert, in vivo. Dans ce but, nous individualiserons les trois principaux centres de nucléation: centrosomes, kinétochores et chromatine, sur des surfaces micro-imprimées en présence d’extraits d’œufs de Xenope (in extracto, tâches 3 & 4). L’extrait fournira la complexité du cytoplasme et reconstituera sa viscosité naturelle. Nous analyserons par des études de déplétion/complémentation la contribution relative de plusieurs kinases mitotiques dans la régulation de la dynamique des MTs à partir de sous-modules individualisés. De plus, nous explorerons comment la géométrie imposée par la micro-impression affecte l’organisation et la dynamique du fuseau. Si besoin, le comportement dynamique des MTs qui sont connectés au sein de faisceaux sera analysé en utilisant un modèle mathématique développé par l’équipe 2. Pour les études in extracto nous utiliserons la technique de « speckle microscopy» qui permet d’individualiser des sous-unités de tubuline liées à un fluorochrome au sein du MT et marquerons l’extrémité « plus » des MTs grâce à une protéine marqueur fluorescente.L’essai in vitro imposant une géométrie qui est développé par l’équipe 2 permettra de franchir une nouvelle étape dans l’étude des MTs et de leurs protéines régulatrices. Le programme développé par l’équipe 1 augmentera la complexité du système en utilisant des sous-modules de centres de nucléation dans les extraits d’œufs de Xenope. Ensemble, ces études complémentaires constitueront le chainon manquant entre les essais de reconstitution utilisant des protéines solubles et la complexité inhérente aux MTs in cellulo. Ainsi, nous proposons d’établir un contexte optimal pour disséquer les voies parallèles qui sont nécessaires à l’assemblage d’un fuseau mitotique robuste.
Résultats : Mise au point de reconstitution d’un module de zone centrale du fuseau mitotique :
Nous avons mis au point des conditions d’observations de microtubules sur des supports micro-structurés (micro-impression) qui imposent une géométrie d’assemblage pour les microtubules (analyse en système 2D contraint) dans des limites qui se rapprochent de celles observées dans les cellules. Avec cette méthode, nous avons contraint l'assemblage de microtubules à partir de deux disques opposées permettant de mimer les deux pôles du fuseau (les microtubules croient radialement par leur extrémité ‘+’). En utilisant cette méthode, nous avons assemblé un sous-réseau du fuseau mitotique : la centre centrale ou « midzone ». Deux « pseudo-asters » sont positionnés face à face dans le but de mimer les deux pôles du fuseau mitotique. L’ajout de la protéine associée aux microtubules MAP65-1/Ase1 dans ce système induit la formation de faisceaux de microtubules anti-parallèles et interdigités entre les deux « asters », générant une structure qui correspond au module protéique minimal de la midzone en anaphase. Ce module sera utilisé pour étudier le rôle de protéines clé qui fonctionnent en synergie ou en opposition avec MAP65 pour organiser une midzone dynamique telle que la protéine de bout ‘+’ CLASP, en cours de purification. 
En parallèle, la régulation de l’activité de MAP65 par les Aurora kinase est en cours.
Perspectives : La technique d’impression des MTs (micro-patterning) permet de reconstituer des réseaux de MTs dans des conditions définies où la nucléation, la polarité et la biochimie des MTs sont entièrement contrôlées. Ce système peut donc être facilement modulé pour caractériser les éléments essentiels à la construction d’un réseau de MTs dans un environnement proche de celui de la cellule. Le projet de recherche que nous développons propose d’étudier le rôle de protéines clés (purifiées et/ou présentes dans des extraits de xénopes) dans la construction/fonctionnement du fuseau de division en utilisant des sous-modules reconstitués de centres de nucléation de MTs. Ce système constituera le chainon manquant entre les essais de reconstitution utilisant des protéines purifiées in vitro et la complexité inhérente de l’organisation des MTs in cellulo. Il devrait nous permettre de franchir une nouvelle étape dans la compréhension des mécanismes mis en place par les cellules pour ségréger leur génome. La réussite de ce projet dépend complètement de la présence de personnel maitrisant ces nouvelles technologies.
Publications et brevets : Néant