Projet ANR-11-EMMA-0032 – TOXOCAg : Test immunoenzymatique pour la détection d'antigènes circulants au cours de l'infection par Toxoplasma gondii
Programme : Emergence de produits, technologies, ou services à fort potentiel de valorisation (Emergence)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Corinne MERCIER (UNIVERSITE GRENOBLE I [Joseph Fourier])
Partenaires : UJF-FILIALE; Université Claude Bernard - Lyon 1; Laboratoire Adaptation et Pathogénie des Micro-Organismes
Montant : 204639.0 euros
Durée : 24 mois
Résumé : Une alternative aux techniques usuelles de diagnostic de la toxoplasmoseEtablir le diagnostic de la toxoplasmose en détectant des anticorps spécifiques, est difficile chez les patients immunodéficients, les nouveaux-nés ou les femmes enceintes récemment contaminées.  L'enjeu est de développer un diagnostic basé sur la détection  d'un autre type de marqueurs.
Une méthode de diagnostic dédiée aux patients difficiles à diagnostiquerLe diagnostic de la toxoplasmose repose sur la détection d'anticorps spécifiques. Ces tests ne sont adaptés ni aux patients souffrant d’une réactivation de leur toxoplasmose congénitale sans rebond d'anticorps, ni aux patients immunodéprimés. Ces tests peuvent aussi ne pas être suffisamment sensibles pour les femmes enceintes infectées pendant le premier trimestre de grossesse. Pour ces patients difficiles à diagnostiquer, un diagnostic basé sur l’amplification du matériel génétique parasitaire est réalisé mais sa positivité ne garantit pas une infection active. L’objectif est d’apporter un diagnostic alternatif, en développant la détection d’un second type de marqueurs parasitaires spécifiques, ces marqueurs circulant dans les fluides biologiques tout au long de l’infection. Ce test automatisable à l'avenir (réduction des coûts), devrait permettre la détection fiable, sensible et précoce de marqueurs spécifiques du parasite, à partir de différents types de fluides biologiques.
Un test de diagnostic en microplaque, facile et rapide à mettre en œuvreLe test vise à développer un test immuno-enzymatique sandwich afin de rechercher un nouveau type de marqueurs parasitaires (MP), présents en faible quantité dans les fluides biologiques. MP est détecté à l'aide de 2 autres marqueurs (m1 et m2), eux-mêmes différents l’un de l’autre : un marqueur m1 est fixé sur une plaque en plastique et fixe MP. Lorsque celui-ci est présent dans le fluide biologique, le marqueur m2 vient prendre MP en sandwich. Ce m2 permet la révélation du test, grâce à un réactif commercial qui change de couleur lorsque m2, et donc MP, sont présents dans le fluide biologique. La difficulté de ce test réside dans l’obtention de marqueurs m1 et m2 suffisamment affins pour MP, afin qu’ils puissent piéger de façon spécifique, l’infime quantité de MP présente dans le fluide biologique. Il faut donc veiller à ce que l’assemblage m1 - MP - m2 soit dans des proportions adaptées à cette détection.
Résumé de la soumission : La toxoplasmose est une anthropozoonose qui peut être fatale si elle est contractée pendant le développement fœtal ou par des patients immunodéprimés (souffrant du Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA), transplantés, ou recevant une chimio-thérapie anti-cancéreuse). En Amérique du Sud apparaissent des souches de Toxoplasma gondii de virulence exacerbée et qui sont associées à une prévalence importante de terribles lésions oculaires et de fatalité, même chez les patients immuno-compétents. De plus, la toxoplasmose pourrait constituer un facteur de vulnérabilité pour plusieurs maladies mentales. L’agent étiologique infecte jusqu’à 1/3 de la population humaine mondiale. La prévalence de l’infection dépend de nombreux facteurs ; elle atteint 25-50% dans la plupart des pays d’Europe de l’Ouest et d’Europe Centrale. En France, la prévalence était de 43.8% en 2003, ce qui représentait 200,000-300,000 cas annuels incluant 600 cas de toxoplasmose congénitale et 200 cas d’encéphalite toxoplasmique survenant chez des patients souffrant du SIDA. La toxoplasmose est également considérée comme une maladie infectieuse négligée dont la prévalence dépasse 60% en Amérique du Sud et dans les pays situés autour du Golfe de Guinée. Il n’existe pas de vaccin contre les formes humaines de la toxoplasmose et les traitements disponibles doivent être administrés rapidement afin d’assurer leur efficacité. Des tests diagnostiques rapides, efficaces et sensibles sont donc requis pour dater la contamination le plus précisément possible. La plupart des tests utilisés actuellement reposent sur la détection par ELISA, d’anticorps spécifiques dans le sang périphérique des patients suspectés d’être atteints de la maladie. Ces tests sont sensibles chez les femmes enceintes (qui constituent la classe de population la plus importante testée pour la toxoplasmose dans les pays industrialisés) mais ils présentent de nombreuses limites chez les patients les plus fragiles. Dans ce projet, nous proposons de développer le premier test de diagnostic de la toxoplasmose basés sur la détection dans les fluides humains, d’antigènes activement sécrétés par les parasites viables. Tous les tests de diagnostic de la toxoplasmose commerciaux étant actuellement basés sur la détection d’anticorps spécifiques, le test de détection d’antigènes toxoplasmiques circulants sera le premier à être proposé sur le marché. La technologie sera mise en place à partir de tests pilotes effectués sur un petit nombre de prélèvements cliniques, puis sera développée et validée sur une large collection de prélèvements cliniques (Partenaire 1 : C. Mercier et M.F. Delauw, CNRS UMR 5163 – Université Joseph Fourier, Grenoble et Partenaire 2 : F. Peyron, Laboratoire de Parasitologie, Faculté de Médecine Lyon Sud-Charles Mérieux – Lyon 1 et Hôpital Lyon Croix Rousse). Cette nouvelle technologie a pour but de répondre aux besoins actuels des praticiens en termes de diagnostic rapide et fiable pour les patients fragiles (patients immuno-déprimés, nouveaux-nés et prématurés, …). Chez ces patients, cette nouvelle technologie qui, à terme, devrait être automatisée, devrait aider à discriminer les infections récentes des infections anciennes. La possibilité de détecter et quantifier les antigènes circulants en tant que nouveaux bio-marqueurs devrait également avoir un intérêt pronostique. Un brevet protégeant cette nouvelle technologie sera déposé. Sa commercialisation sous forme de licence d’exploitation auprès de compagnies spécialisées dans le diagnostic, sera assurée par le Partenaire 3 (Floralis). La complémentarité des deux partenaires scientifiques du projet (trios articles déjà publiés en collaboration) ainsi que le soutien du Partenaire 3 aux travaux de développement de C. Mercier depuis 2009, sont les garants du succès de ce projet.
Résultats : 2012 correspond à l'obtention des réactifs du projet. Des difficultés techniques en ont retardé l’avancée et ont grevé le budget du laboratoire P1.  Nous avons modifié une stratégie de clonage, purifié les marqueurs m1 et recherché une nouvelle compagnie de sous-traitance : tous les réactifs sont enfin disponibles depuis 10.2012 et l'accord de consortium entre toutes les institutions, est signé depuis 11.2012. La mise au point des 2 premiers tests est donc en cours dans les laboratoires P1 et P2.
Perspectives : La perspective est de développer un test rapide, fiable, et simple à mettre en œuvre, qui puisse détecter à partir de différents types de fluides biologiques, la présence de marqueurs parasitaires MP signant l’infection par Toxoplasma gondii. Le développement de ce test nécessitera, à l’issue du projet, une automatisation afin de répondre aux contraintes des laboratoires d’analyses médicales.
Publications et brevets : Pas de communication scientifique sur les résultats puisque l’objectif, si le test fonctionne à l’issue du projet, est de déposer un brevet d’invention et d’accorder une licence d’exploitation du test à une compagnie spécialisée dans la commercialisation de tests de diagnostic.