Projet ANR-13-JS07-0006 – FragVir : Développement d’inhibiteurs de la réplication de Flavivirus par une stratégie de « Fragment-Based Drug Discovery » ciblant l’activité méthyltransférase
Programme : JCJC - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (JCJC SIMI 7)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : KARINE BARRAL (Laboratoire Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques)
Partenaires : Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques
Montant : 204822.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : Développement de nouveaux inhibiteurs de la réplication des FlavivirusDéveloppement d’une nouvelle stratégie antivirale ciblant spécifiquement les méthyltransférares de Flavivirus décrites récemment comme essentielles à la maturation de l’ARN viral et donc à la réplication de ces virus qui posent un sérieux problème de santé publique internationale.
Développement  d’une nouvelle stratégie antivirale ciblant les méthyltransférares de FlavivirusLes enjeux et objectifs de ce projet sont d’une part la compréhension des mécanismes d’inhibition spécifique de méthyltransférases virales, et d’autre part, de poser les bases d’une nouvelle stratégie antivirale ciblant la maturation des ARN de virus émergents. Dans le contexte actuel, la découverte de médicaments antiviraux est non seulement nécessaire au niveau national mais représente un investissement scientifique, technologique et médical essentiel.
Développement d’une approche expérimentale de « Fragment-based drug discovery »La découverte de nouveaux inhibiteurs de Flavivirus, et plus particulièrement du virus de la Dengue, repose sur une approche expérimentale de « Fragment-based drug discovery » (FBDD) qui permet l’identification rapide de petits inhibiteurs (ou fragments) qui se lient à la protéine cible. Le criblage de fragments par des méthodes biophysiques permet d’identifier les sites et modes de fixation de ces fragments inhibiteurs. Les données structurales ainsi obtenues, couplées à de la modélisation moléculaire, de la synthèse chimique et à l’évaluation des activités antivirales, ouvrent la perspective d’une optimisation rapide et efficace de ces fragments en puissants inhibiteurs.
Résumé de la soumission : Les infections liées aux flavivirus, notamment ceux transmis par le moustique (Aedes aegypti) tels que les virus de la Dengue, du Nil occidental, de l’encéphalite japonaise et de la fièvre jaune, donnent lieu à des épidémies potentiellement mortelles qui ont un impact économique dévastateur. A lui seul, le virus de la dengue (DENV) infecte 50 à 100 millions de personnes par an, causant environ 30000 décès. Sa transmission, qui a considérablement augmenté, est devenue une préoccupation majeure de santé publique internationale. En l’absence de médicaments antiviraux disponibles pour traiter ou prévenir les infections par le DENV, les populations restent très vulnérables aux épidémies liées à ce virus. Dans un tel contexte, le développement de médicaments anti-flaviviraux représente un besoin urgent. Le but de ce projet est de déployer une approche innovante de découverte de candidat-médicament pour conduire à des antiviraux puissants contre infections par les flavivirus (et plus spécifiquement celles liées au DENV).Ces dernières années, de nombreuses étapes du cycle de réplication des flavivirus ont été élucidées, ce qui a conduit à l’identification de plusieurs cibles dont l’inhibition peut bloquer la réplication. En particulier, la protéine NS5 de flavivirus, qui porte les activités méthyltransférase (MTase) impliquées dans la formation de la coiffe des ARNs viraux qui est essentielle à la réplication. La caractérisation de ces MTases constitue un domaine en pleine expansion pour la découverte et le développement d’agents anti-flavivirus.L’approche de “Fragment-Based Drug Discovery” (FBDD) est maintenant bien établie comme étant une méthode puissante pour l’identification rapide de composés « hit » et pour leur optimisation en composés « lead ». A la lumière des résultats préliminaires dont nous disposons et des outils disponibles au laboratoire, nous avons décidé d’appliquer l’approche de FBDD au développement d’inhibiteurs spécifiques de méthyltransférases de flavivirus.Ce projet repose sur une approche multidisciplinaire combinant la biologie structurale, la virologie, la biochimie, la modélisation moléculaire et de la chimie médicinale, le tout associé dans une stratégie d’optimisation « hit-to-lead » rapide. Un criblage multi-étapes d’une chimiothèque de 500 fragments, par des tests de stabilité thermique par fluorescence et par de la cristallographie aux rayons-X, a permis d’identifier sept fragments qui se lient à quatre sites de fixation différents sur la MTase du DENV. Trois de ces sites ont été nouvellement mis en évidence grâce à ces travaux. Ces sept fragments « hit » montrent également un effet inhibiteur de l’activité MTase du DENV et constituent un point fort pour le démarrage de ce projet.Notre objectif est de développer les fragments identifiés en candidat-médicament par un processus itératif composé de cycles de (1) conception de chimiothèques virtuelles et de leur évaluation par modélisaton moléculaire (in silico docking), (2) synthèse parallèle des meilleures chimiothèques, (3) criblage in vitro des composés synthétisés sur les MTases de flavivirus afin d’évaluer leur potentiel d’inhibition, (4) détermination structurale et biophysique des interactions entre les composés synthétisés et la MTase de DENV, (5) évaluation de l’activité antivirale des composés les plus prometteurs en culture de cellules infectées par un panel de flavivirus et (6) évaluation des propriétés d’ADMETox pour les composés « lead » les plus actifs.A la fin de ce projet, nous nous attendons à ce qu’au moins une série des fragments « hit » identifiés conduisent à un « lead » puissant et, par conséquent, se prête à des tests sur modèle animal.Nous espérons faire, de cette stratégie innovante dans le domaine de la recherche d’antiviraux, la première preuve de concept pour le succès de ces approches FBDD sur les virus émergents et sur les protéines impliquées dans la coiffe de génomes viraux.
Résultats : Lors du criblage d’une chimiothèque de fragments contre la méthyltransférase du virus de la dengue (MTase DENV), sept fragments ‘hits’ ont été identifiés. A partir des données obtenues, trois séries de molécules issues de l’optimisation de ces fragments ‘hits’ ont été conçues par modélisation moléculaire puis une vingtaine d’analogues ont été synthétisé pour chacune de ces séries. 
Le processus d’optimisation par modélisation moléculaire a été réalisé sur la base d’un criblage virtuel par « docking » de chimiothèques ciblées. Une évaluation in silico rapide de ces chimiothèques virtuelles a permis de classer par « fonction de score » les analogues de fragment de la plus faible à la plus forte affinité. 
Pour chaque série, les analogues virtuels de plus forte affinité ont été synthétisés. L’activité inhibitrice de chaque analogue a été évaluée sur les activités N-7 et 2’-O-MTase DENV. L’interaction des analogues de chaque série avec la MTase DENV a également été étudiée par Thermofluor. Les molécules présentant la meilleure inhibition et/ou affinité ont ensuite été trempées avec des cristaux pré-formés de la MTase afin d’obtenir les structures cristallographiques des complexes inhibiteurs/MTase DENV et de valider leur mode de fixation.
Concernant la série 1, les analogues synthétisés n’ont montré aucune inhibition des activités N-7 et 2’-O-MTase DENV. Aucun complexe cristallographique analogue/MTase DENV n’a été obtenu ni par trempage, ni par co-cristallisation. Par conséquent, le processus d’optimisation de cette série a été abandonné.
Concernant les séries 2 et 3, les analogues synthétisés ont montré un gain de l’inhibition des activités N-7 et 2’-O-MTase DENV. Nous avons également obtenu les structures cristallographiques de certains de ces analogues en complexe avec la MTase DENV.
Perspectives : Ces étapes du procédé d’optimisation seront répétées et affinées autour des analogues de la série 2 et 3  jusqu’à la découverte d’un candidat-médicament.
Publications et brevets : B. Coutard, E. Decroly, C. Li, A. Sharff, J. Lescar, G. Bricogne and K. Barral. Assessment of Dengue virus helicase and methyltransferase as targets for fragment-based drug discovery. Antiviral Research  2014, 106, 61-70