Projet ANR-10-BLAN-1513 – ENZYMAGE : Développement de sondes d’imagerie magnétiques et optiques et leur validation in vivo pour la détection d’activité enzymatique liée à l’infection
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Eva Jakab Toth (CNRS - DELEGATION REGIONALE CENTRE POITOU-CHARENTES)
Partenaires : Centre de Biophysique Moléculaire; Institut de Chimie des Substances Naturelles; Institut national de la santé et de la recherche médicale; SAS CHEMATECH
Montant : 544938.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Sondes d’imagerie pour la détection d’activité enzymatique liée à l’infectionSondes magnétiques et optiques permettant la détection in vivo, en temps réel, de manière reproductible et non invasive, d’un disfonctionnement enzymatique à l’origine d’une maladie.
Enjeux et objectifAlors que la mise en évidence d’un disfonctionnement cellulaire à l’échelle moléculaire est aujourd’hui techniquement possible in vitro, sa visualisation en temps réel in vivo reste un défi majeur de l’imagerie. C’est dans ce cadre que nous proposons de concevoir des sondes magnétiques et optiques permettant la détection in vivo, en temps réel, de manière reproductible et non invasive, d’un disfonctionnement enzymatique à l’origine d’une maladie. La visualisation de ce phénomène, que ce soit par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) ou par Imagerie Optique (IO) est conditionnée à l’activation de la sonde par une enzyme spécifique.
MéthodesLes sondes activables sont constituées par une plate-forme hautement modulable contenant un chélate de lanthanide et connectée au substrat d’une enzyme. Cette architecture leur confère un grand potentiel que ce soit au niveau du type d’imagerie accessible que de la diversité des enzymes ciblées. Bien que chimiquement similaires, les lanthanides se différencient radicalement par leurs propriétés magnétiques et optiques. La nature du lanthanide présent dans le chélate va ainsi déterminer l’utilisation de la sonde pour l’IRM ou l’IO. L’activation des sondes repose sur la dégradation partielle de la plateforme catalysée par l’action d’une enzyme ; la nature du substrat lié à la plate-forme déterminera la spécificité enzymatique de la sonde. La détection par IRM s’effectuera de manière classique (dit « T1 ou Gd –stimulé ») ou par effet PARACEST ; ce dernier est particulièrement bien adapté au cas de l’imagerie moléculaire car les agents correspondants peuvent être activés ou désactivés à volonté. La détection optique repose sur la luminescence des lanthanides induite par excitation d’un chromophore sensibilisateur porté par la plate-forme. L’action d’une enzyme sur la sonde pourra soit la désactiver par élimination du chromophore soit l’activer si elle conduit à l’élimination d’un « extincteur » de luminescence situé à proximité. L’IO sera réalisée à l’échelle cellulaire en utilisant un microscope ou sur animal de petite taille avec un macroscope.Ces sondes seront utilisées pour la détection de maladies infectieuses. Les méthodes actuellement utilisées dans ce domaine sont basées sur l’utilisation de sondes aspécifiques ou d’organismes génétiquement modifiés. Nous proposons dans ce projet d’aller plus loin en permettant la détection par IRM ou IO d’enzymes spécifiques d’un microorganisme.
Résumé de la soumission : Alors que la mise en évidence d’un disfonctionnement cellulaire à l’échelle moléculaire est aujourd’hui techniquement possible in vitro, sa visualisation en temps réel in vivo reste un défi majeur de l’imagerie. C’est dans ce cadre que nous proposons de concevoir des sondes magnétiques et optiques permettant la détection in vivo, en temps réel, de manière reproductible et non invasive, d’un disfonctionnement enzymatique à l’origine d’une maladie. La visualisation de ce phénomène, que ce soit par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) ou par Imagerie Optique (IO) est conditionnée à l’activation de la sonde par une enzyme spécifique.Les sondes activables sont constituées par une plate-forme hautement modulable contenant un chélate de lanthanide et connectée au substrat d’une enzyme. Cette architecture leur confère un grand potentiel que ce soit au niveau du type d’imagerie accessible que de la diversité des enzymes ciblées. Bien que chimiquement similaires, les lanthanides se différencient radicalement par leurs propriétés magnétiques et optiques. La nature du lanthanide présent dans le chélate va ainsi déterminer l’utilisation de la sonde pour l’IRM ou l’IO. L’activation des sondes repose sur la dégradation partielle de la plateforme catalysée par l’action d’une enzyme ; la nature du substrat lié à la plate-forme déterminera la spécificité enzymatique de la sonde. La détection par IRM s’effectuera de manière classique (dit « T1 ou Gd –stimulé ») ou par effet PARACEST ; ce dernier est particulièrement bien adapté au cas de l’imagerie moléculaire car les agents correspondants peuvent être activés ou désactivés à volonté. La détection optique repose sur la luminescence des lanthanides induite par excitation d’un chromophore sensibilisateur porté par la plate-forme. L’action d’une enzyme sur la sonde pourra soit la désactiver par élimination du chromophore soit l’activer si elle conduit à l’élimination d’un « extincteur » de luminescence situé à proximité. L’IO sera réalisée à l’échelle cellulaire en utilisant un microscope ou sur animal de petite taille avec un macroscope.Ces sondes seront utilisées pour la détection de maladies infectieuses. Les méthodes actuellement utilisées dans ce domaine sont basées sur l’utilisation de sondes aspécifiques ou d’organismes génétiquement modifiés. Nous proposons dans ce projet d’aller plus loin en permettant la détection par IRM ou IO d’enzymes spécifiques d’un microorganisme.Ce projet constitue une évolution du précédent projet ANR intitulé « Enzyme-Activated Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging” (ENZYMRI) qui prend fin en 2010. Ce dernier nous a permis de démontrer la possibilité d’activer de façon enzymatique une sonde IRM via un processus auto-immolatif. (publié dans Angewandte Chemie Int. Ed.). Le présent projet se distingue du précédent par les points suivants : i) nous proposons de nouveaux composés auto-immolables présentant une plus grande stabilité intrinsèque et une meilleure accessibilité synthétique ; ii) le concept est étendu à des sondes dédiées à la détection optique ; iii) nous proposons la mise en place des premières étapes pour l’utilisation « in vivo » de ces sondes.
Résultats : We have presented the proof of concept for the PARACEST detection of enzymatic activity with molecular agents based on a self-immolative platform approach. The concept relies on coupling an enzyme-specific substrate to a lanthanide (LnIII)-chelating unit through a self-immolative spacer. While these agents share an identical LnIII-chelating unit and a self-immolative spacer, the choice of the substrate ensures enzyme specificity. 
We synthesized and investigated two structurally different chelating units for the design of enzyme-responsive imaging probes: 
a) The first one is based on ??amino glycine derivatives for coupling of the lanthanide chelate to the self-immolative spacer. We synthesized a series of Gd3+ and Yb3+ complexes derived from this platform, including those bearing a self-immolative arm and a sugar unit as selective substrate to ?-galactosidase, LnL1, the -NH2 amine derivatives formed after enzymatic cleavage, LnL2, and the model compounds, LnL3 and LnL4. The relaxivity change upon enzymatic cleavage is limited which prevents application of this system as enzyme-responsive T1 relaxation agent. The Yb3+ analogues show a PARACEST effect after enzymatic cleavage which can be exploited for the specific detection of enzymatic activity. 
b) The second family used a 6-amino 2-methyl pyridine-like heterocycle as linker between the lanthanide chelate and the self-immolative arm. For optical detection, a pyridine unit as an organic chromophore was incorporated. We have synthesized two model ligands, L4 and L5. L4 has a pyridine-derivative arm that, for the purpose of the physico-chemical studies, models the self-immolative linker and the enzyme-specific substrate that will be attached to the agent in the real enzymatic probe. We have demonstrated that, when complexed to GdIII, they function as efficient T1 MRI agents. When the same ligands are complexed to YbIII or EuIII, the system works as a CEST MRI contrast agent, but also as a luminescent probe.
Perspectives : The main application fields of our imaging agents are:
-	1. Biomedical research, including rationalization of the parameters related to disease processes, thus strongly contributing to drug development. They are biological tools that can contribute to faster identification and testing of new therapeutic agents. They can allow for replacement of the invasive research techniques (histology) by time-effective, repeatable, real-time visualization of biologically relevant processes to ensure a reduction of animal use in research experiments. 
-	2. Clinical diagnostics, in a future perspective. Our imaging agents can allow early detection of the disease and prediction of treatment responsiveness. They can offer the possibility of unambiguous and rapid identification of the nature of the infection based on the specific enzymatic response related to a given bacteria. This would be a huge progress with respect to the currently used bacterial cultures to identify the infectious agent which require at least 24 hours (for the most rapidly growing bacteria) up to 3 weeks (Mycobacterium tuberculosis, the cause of tuberculosis).
Publications et brevets : 1.	T. Chauvin, S. Torres, R. Rosseto, J. Kotek, B. Badet, P. Durand and É. Tóth, Lanthanide(III) complexes bearing a self-immolative arm: potential enzyme responsive 	contrast agents for magnetic resonance imaging, Chem. Eur. J, 2012, 18, 1408–1418.