Projet ANR-12-BSV2-0008 – Nups&dev : Implication des pores nucléaires dans la différentiation des cellules souches
Programme : Blanc - SVSE 2 - Biologie cellulaire et biologie du développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame DOYE Valérie (Institut Jacques Monod)
Partenaires : Laboratoire public; Laboratoire public; New York Cancer Hospital; Institut Jacques Monod; Institut Jacques Monod
Montant : 443029.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Involvement of the nuclear pore complexes in stem cell differentiationBy elucidating the role of a nuclear pore constituent in stem cells differentiation, this project aims to deepen our understanding of both non-canonical functions of the nuclear pores complexes (NPCs) and the molecular mechanisms governing cell differentiation.
Decifer the mechanism by which Nup133 regulates stem/progenitor cell differentiationNup133 and NPC subunit composition in general, have barely been studied in the context of stem/progenitor cell differentiation; thus the proposed research represents a new line of experimentation in stem cell biology. By elucidating the role of an NPC constituent, Nup133,  in stem cells differentiation, this project will deepen our understanding of both non-canonical NPC functions and molecular mechanisms governing cell differentiation. Additionally, although fundamental to embryonic development and tissue homeostasis, the mechanisms coordinating changes in cell proliferation with differentiation remain poorly defined. Studies on NPCs promise to provide a new paradigm for elucidating how cell number/tissue size is coordinated with the differentiation of distinct cell types to form functional tissues.
Mouse embryonic stem cell differentiation and developmental genetics      We will characterize the molecular and cellular mechanisms underlying the requirement of Nup133 for embryonic stem cell differentiation. We will therefore culture both normal mouse embryonic stem (ES) cells and ES cells either lacking Nup133 or carrying specific mutations within Nup133 under conditions that induce them to differentiate into neurons and will assay them for different processes: already characterized functions of Nup133 in HeLa cells (NPC assembly, spindle positioning), cell cycle progression, gene regulation and epigenetic modifications. In addition, we will identify and characterize physical partners of Nup133 required for these processes. Analysis of the contribution to chimeric embryos of ES cells carrying specific mutations within Nup133 will then be used to validate our findings at the level of the whole organism.	In parallel, we will explore the regulations of Nup133 transcription and protein stability leading to the down-regulation of Nup133 levels upon differentiation of ESCs and proliferating progenitor/stem cells, and determine to which extent decreased levels of Nup133 are required for ES cell differentiation.	Finally, by using recently obtained conditional nup133 KO mice, we will determine to which extent Nup133 functions/regulations also contribute to the coordination of cell proliferation and differentiation in other populations of embryonic and adult tissue stem/progenitor cells.
Résumé de la soumission : Dans les cellules eucaryotes, les échanges entre noyau et cytoplasme s'effectuent au niveau des pores nucléaires (NPCs), assemblages protéiques ancrés dans l'enveloppe nucléaire et composés d’environs 30 protéines distinctes appelées nucléoporines (Nups). Les nucléoporines, au delà de leurs fonctions dans le transport nucléocytoplasmique qui contribuent à la régulation de nombreuses voies de signalisation, ont également été impliquées au cours de ces dernières années dans de nombreux autres processus cellulaires tels que la division cellulaire, la régulation de l'expression des gènes, ou la stabilité du génome.Nos travaux relatifs à un mutant de souris affectant la gastrulation, mermaid (merm), ont révélé un nouveau rôle des NPCs dans la régulation de la différenciation des cellules souches embryonnaires. L’allèle merm code pour une mutation nulle de Nup133, qui est un constituant d'une sous-unité structurale essentielle du NPC, le « Y-complex ». Nos études antérieures, ont révélé que, de façon inattendue  pour un composant structural des NPCs, Nup133 présente une expression cellulaire et développementale spécifique, principalement restreinte aux cellules souches/progénitrices. Nous avons de plus montré que l’absence de Nup133 affecte la différenciation des cellules pluripotentes de l’épiblaste et des cellules souches embryonnaires (mESCs) vers des progéniteurs neuraux capables de produire des neurones post-mitotiques. Cependant, le mécanisme par lequel Nup133 régule la différenciation des cellules souches/progénitrices reste inconnu.	Notre projet vise à déterminer comment Nup133 contrôle l'équilibre entre la pluripotence et l'état différencié d'une cellule. Il bénéficiera de l'expertise complémentaires des différents partenaires dans les domaines des pores nucléaires et du cycle cellulaire, des cellules souches embryonnaires, et de la génétique du développement de la souris, ainsi que des réactifs uniques que nous avons précédemment générés de façon collaborative.Un des objectifs de ce projet visera à comprendre le rôle de Nup133 dans la différenciation des cellules souches embryonnaires et à préciser les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu. Nous cultiverons pour cela des cellules embryonnaire (ES) sauvages ou mutantes pour Nup133 (mutant null merm, ou mutations plus restreintes dans Nup133) dans des conditions conduisant à la différentiation neuronale. Divers processus cellulaires seront étudiés dans ces cellules: les fonctions déjà caractérisées de Nup133 dans les cellules HeLa (assemblage des NPCs, positionnement du fuseau mitotique), mais aussi la progression du cycle cellulaire, la régulation de l’expression des gènes et les modifications épigénétiques. De plus, nous identifierons et caractériserons les partenaires physiques de Nup133 contribuant à ces processus. Afin de valider nos résultats dans le contexte d’un organisme en développement, nous étudierons alors la contribution de cellules ES exprimant certains allèles mutants de Nup133 au développement d'embryons chimériques.	 En parallèle, nous explorerons les régulations de la transcription et de la stabilité de Nup133 contribuant à la diminution des niveaux de Nup133 observée lors de la différenciation des cellules ES et des progéniteurs neuronaux, et déterminerons dans quelle mesure ces régulations sont requises pour la différenciation des cellules ES.	Enfin, en utilisant un modèle murin d’inactivation conditionnelle de Nup133 récemment obtenu, nous déterminerons dans quelle mesure les fonctions/régulations de Nup133 contribuent également à la coordination de la prolifération et de la différenciation cellulaire dans d'autres populations de cellules souches/progénitrices embryonnaires et adultes.	 En élucidant le rôle d'un constituant des NPCs dans la différenciation des cellules souches, ce projet approfondira notre compréhension tant des fonctions non conventionnelles des NPCs que des mécanismes moléculaires gouvernant la différenciation cellulaire.
Résultats : - In collaboration with the team of R. Vallee, we have demonstrated the implication of Nup133 and CENP-F in nuclear migration and mitotic entry in rat brain progenitor cells (Hu et al, 2013).
- We have established in collaboration with the team of K. Roux a proximity-dependent biotinylation (BioID) approach to identify proximal partners of several nucleoporins, notably Nup133, in interphase cells (Kim et al., 2014). 
- Our functional studies using both neuronal and mesoendodermal differentiation have identified poor cell survival upon differentiation as the first overt in vitro phenotype of Nup133-/- ESCs
- We have successfully set up a “rescue strategy” that has revealed the requirement for proper ES cell differentiation of the N-terminal domain of Nup133, which features its previously characterized ALPS sequence (contributing to interphase pore assembly in human U2OS cancer cells) and its CENP-F interaction domain.
- Using super-resolution microscopy, we have observed a reduction of the number and density of nuclear pores labeled with the basket nucleoporin TPR in Nup133-/- as compared to WT ES cells.
Perspectives : While this research is fundamental in nature, its outcomes are directly pertinent in the field of human health. Indeed, several nucleoporins have been directly linked to cancer and other diseases, yet the molecular mechanisms underlying these pathologies remain largely unsolved. In addition, improving our understanding of stem cell fate and differentiation appears as a pre-requisite for future development of stem cell based therapies for multiple degenerative pathologies as well as ageing. The findings from the proposed research, which focuses specifically on Nup133-mediated mechanisms for resetting a progenitor cell for differentiation, may lead to the implementation of new methods for properly and efficiently differentiating stem cells.
Publications et brevets : This research program so far led to 3 publications: 1) Hu et al., Cell, 2013 (co-authored by V.Doye), in which in collaboration with the team of R. Vallee, Nup133 function in nuclear migration and mitotic entry was characterized in rat brain progenitor cells; 2) Kim et al., PNAS 2014 (co-authored by V.Doye), in which in collaboration with the team of K. Roux, a recent approach termed BioID was applied to multiple nucleoporins including Nup133 to characterize NPC architecture; 3) Papanayotou et al., PLoS Biol, 2014, in which tools to characterize epiblast maturation were set up by A. Benhaddou (J. Collignon's team). In addition, one oral presentation and 3 posters describing ongoing collaborative studies between the three partners (implication of Nup133 in NPC density and requirement of Nup133 N-terminal domain for ES cell differentiation) were presented at international meetings in 2014