Projet ANR-13-BSV6-0003 – ARREPRESS : Bases moléculaires et impact physiologique de la répression des gènes par les récepteurs de l'acide rétinoïque
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Pierre GERMAIN (Centre de Biochimie Structurale)
Partenaires : Centre de Biochimie Structurale; Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaire et Cellulaire; Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; Biométrie et Biologie Évolutive
Montant : 574076.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : L’importance de la répression des gènes par les récepteurs de l’acide rétinoïque.Le rôle de la répression des gènes sur le développement de l’organisme est peu connu. Le projet ARREPRESS propose d’identifier les gènes réprimés par les récepteurs de l’acide rétinoïque et le rôle de cette répression dans le développement de l’organisme.
Identification et rôle des gènes réprimés par les récepteurs de l’acide rétinoïque.Les récepteurs de l’acide rétinoïque sont des protéines qui contrôlent l’expression de gènes spécifiques dans les noyaux des cellules de l’organisme.  Ainsi ces récepteurs sont des facteurs de transcription appartenant à la grande famille des récepteurs nucléaires et agissent en ciblant des complexes protéiques enzymatiques de modification de la chromatine au niveau de gènes cibles.Si l’activation de l’expression des gènes par ces protéines est bien connue, la répression, c’est-à-dire la non-expression des gènes, l’est beaucoup moins, notamment en termes de rôle dans le développement de l’organisme ou de maladies. Les objectifs du projet ARREPRESS sont d’accroître nos connaissances relatives aux mécanismes de la répression régulés par les récepteurs de l’acide rétinoïque et de proposer des outils biologiques qui permettront de démontrer que cette répression contribue à différents processus biologiques. Plus spécifiquement, le projet ARREPRESS propose (i) d’élucider les mécanismes moléculaires contrôlant les fonctions de répresseur des récepteurs de l’acide rétinoïque non liés à un ligand régulateur ; (ii) de comprendre le rôle de la répression contrôlée par les récepteurs de l’acide rétinoïque liés à des ligands ; (iii) d’évaluer la signification physiologique de la répression des gènes contrôlée par les récepteurs de l’acide rétinoïque à partir de la création de cellules modifiées génétiquement et de modèles animaux.
Des outils biologiques et des méthodes modernes pour étudier la répression des gènes.Nous avons récemment mis en évidence un mode d’interaction inédit entre les récepteurs de l’acide rétinoïque et les corépresseurs transcriptionnels, qui explique très clairement leur interaction constitutive et leur dissociation induite par addition d’un agoniste comme l’acide rétinoïque. Nous avons alors conçu des mutants des récepteurs de l’acide rétinoïque qui perdent spécifiquement leur capacité à interagir avec les corépresseurs sans pour autant être affectés dans leur fonction d’activation de l’expression des gènes en présence d’agoniste. Dans le projet ARREPRESS, ces mutants sont transposés in vivo, par la création de modèles de lignées cellulaires et murines. Ces modèles constituent des outils extrêmement utiles pour effectuer des analyses génomiques globales des gènes réprimés par les récepteurs de l’acide rétinoïque et pour tester l’importance physiologique et pathologique de la répression transcriptionnelle par ces protéines. L’analyse génomique fait appel à des méthodes de séquençages performantes comme le ChIP-seq (pour l’identification des sites d’interaction des récepteurs de l’acide rétinoïque sur l’ADN) et le RNA-seq (pour l’étude de l’expression des gènes contrôlés par les récepteurs de l’acide rétinoïque).
Résumé de la soumission : Les trois paralogues du récepteur de l’acide rétinoïque (RARA, B, et G) relaient les effets cellulaires des rétinoïdes et contrôlent une grande variété de voies biologiques essentielles, mais aussi leurs désordres. Les RAR sont des facteurs de transcription appartenant à la grande famille des récepteurs nucléaires et agissent en ciblant des complexes de modification de la chromatine au niveau de gènes cibles. Cependant, les mécanismes moléculaires qui déterminent la spécificité d’action des paralogues de RAR et la contribution, la composition et la dynamique des complexes régulateurs au niveau des gènes cibles de ces récepteurs restent largement inconnus. Les récepteurs nucléaires (RN) contrôlent l’expression de gènes en activant ou réprimant la transcription de leurs gènes cibles. Ces propriétés permettent aux RAR par exemple de contrôler des réseaux de gènes fondamentaux pour l’homéostasie, le développement embryonnaire et la reproduction des métazoaires. L’extinction des gènes se produit via le recrutement de complexes contenant des corépresseurs, tels que NCOR1 (NCoR) ou NCOR2 (SMRT), par le récepteur non lié à son ligand (forme apo) et lié à l’ADN, alors que l’activation de gènes induite par la liaison de l’hormone implique la dissociation du corépresseur et le recrutement des complexes coactivateurs. Des études structurales, des recherches sur les agonistes des RN et sur les modèles génétiques des coactivateurs des RN ont révélé les bases déterminantes de l’interaction des RAR avec les coactivateurs et les rôles importants de l’activation de la transcription par les RAR. Cependant, en dépit d’une importance physiologique majeure, les bases moléculaires de l’interaction des RAR avec les corépresseurs et l’impact physiologique de la répression des gènes par les RAR sont beaucoup moins décrits. De plus, bien que la liaison d’un agoniste aux RAR soit principalement associée au recrutement des coactivateurs, des études récentes montrent que la liaison d’un agoniste peu également provoquer la liaison de corépresseurs.Dans ce contexte, les objectifs de ARREPRESS sont d’accroître nos connaissances aux mécanismes de la répression transcriptionnelle régulée par les RAR et de proposer des outils qui permettront de vérifier que la répression par les RAR contribue à différents processus biologiques, dont le développement. Plus spécifiquement, le projet ARREPRESS propose (i) d’élucider les mécanismes moléculaires contrôlant les fonctions de répresseur des RAR non liés à un ligand ; (ii) de comprendre le rôle de la répression contrôlée par les RAR liés à des ligands ; (iii) d’évaluer la signification physiologique de la répression des gènes contrôlée par les RAR à partir de la création de cellules modifiées génétiquement et de modèles animaux.Nous avons récemment mis en évidence un mode d’interaction inédit entre les RAR et les corépresseurs, qui explique très clairement leur interaction constitutive et leur dissociation induite par addition d’un agoniste (le Maire et al., NSMB, 2010). Nous avons alors conçu des mutants des RARs qui perdent spécifiquement leur capacité à interagir avec les corépresseurs sans pour autant être affectés dans leur fonction d’activation. Dans ARREPRESS, ces mutants seront transposés in vivo, par la création de modèles de lignées cellulaires et murines. Ces modèles constitueront des outils extrêmement utiles pour effectuer des analyses génomiques globales (ChIP-seq et GRO-seq) des gènes réprimés par les RAR et pour tester l’importance physiologique et pathologique de la répression transcriptionnelle par les RAR. La force et l’originalité du projet ARREPRESS résident dans l’approche multidisciplinaire choisie qui permettra de corréler un mécanisme moléculaire spécifique in vitro, avec des résultats physiologiques et développementaux in vivo.
Résultats : Le premier résultat marquant du projet est la création de souris génétiquement modifiées qui comportent un mutant de RAR alpha ayant perdu la propriété de réprimer les gènes. Les animaux sont viables mais infertiles, indiquant que la fonction de répression du récepteur de l’acide rétinoïque alpha n’est pas nécessaire au bon développement prénatal mais qu’elle est cruciale à la fonction testiculaire. Aussi on peut conclure que la majorité des fonctions postnatales du récepteur de l’acide rétinoïque alpha s’opèrent dans les cellules de Sertoli qui sont des cellules de soutien des cellules germinales au sein des testicules, et qu’elles nécessitent la fonction de répression du récepteur de l’acide rétinoïque alpha. La génération de la lignée de souris exprimant le récepteur de l’acide rétinoïque gamma dépourvu de ses capacités de liaison des corépresseurs transcriptionnels, et donc de répression, est en cours.
Les protocoles visant à obtenir la caractérisation au niveau du génome entier des modifications épigénétiques associées au processus de différenciation des cellules F9 traitées par l’acide rétinoïque ont été optimisés, les cellules F9 étant un modèle cellulaire standard d’étude des voies cellulaires contrôlées par les récepteurs de l’acide rétinoïque. La collecte du matériel devant être séquencé est en cours et les jeux de données devraient être disponibles durant l’été.
Le premier ligand agoniste complet spécifique du récepteur de l’acide rétinoïque beta a été identifié et caractérisé. Un tel composé  sera un outil essentiel pour cibler ce récepteur dans nos études cellulaires et animales.
Perspectives : La force et l’originalité du projet ARREPRESS résident dans l’approche multidisciplinaire  choisie qui permettra de corréler un mécanisme moléculaire spécifique in vitro, avec des résultats physiologiques et développementaux in vivo. Une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu dans le contrôle de la répression des gènes par les récepteurs de l’acide rétinoïque et des conséquences de cette répression sur les cellules et le développement de l’organisme conduira à un progrès dans le domaine de la pharmacogénomique des récepteurs de l’acide rétinoïque et apportera des avancées significatives dans la compréhension  du rôle de la répression des gènes dans son ensemble. Ce travail peut permettre d’établir de nouveaux concepts et offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Publications et brevets : Un article a été publié dans le journal Plos One relatif à l’identification du premier ligand agoniste spécifique du récepteur beta de l’acide rétinoïque qui sera utilisé pour cibler ce récepteur dans toutes les études cellulaires et animales planifiées dans le projet ARREPRESS. Un autre article publié dans Nucleic Acid Research démontre la faisabilité et la qualité technique des méthodes de ChIP-seq et de RNA-Seq pour la réalisation du projet ARREPRESS.