Projet ANR-12-BSV6-0012 – GAMMATOLERANS : Exploration des mécanismes de radiotolérance de l’archée Thermococcus gammatolerans par des approches génomiques et protéomiques innovantes
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Jean ARMENGAUD (CEA-Marcoule, DSV-iBEB, Service de Biochimie et Toxicologie Nucléaire)
Partenaires : Institut de Biosciences et de Biotechnologies D’Aix-Marseille; Service de Chimie Inorganique et Biologique; Université Paris-Sud
Montant : 357000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Exploration des mécanismes moléculaires de l’archée Thermococcus gammatolerans, l’être vivant le plus radiorésistant connu à ce jour sur Terre.Des approches innovantes alliant intimement génomique et protéomique sont déployées afin de caractériser les mécanismes de radiotolérance passifs et actifs de l’archée Thermococcus gammatolerans, notamment après des stress endommageant fortement son patrimoine génétique.
Caractériser le rôle des protéines de réparation de l’ADN et de tolérance aux dommagesThermococcus gammatolerans a été isolée d’une source hydrothermale sous-marine. Cette archée est l’organisme le plus radiorésistant qui soit connu. Elle supporte une dose de 30 kGy de radiolyse pulsée sans aucune létalité. Caractériser les mécanismes impliqués dans sa radiotolérance extrême permet de documenter et comprendre la diversité des mécanismes de tolérance et réponses aux stress mis en place par le monde vivant. En complet contraste avec le monde bactérien où plusieurs modèles ont été étudiés sur plusieurs décennies (Escherichia coli, Deinococcus radiodurans), le monde archéen est resté pour l’heure relativement inexploré. Le projet a pour objectif de lever le voile sur les mécanismes « passifs/préventifs » (structuration du patrimoine génétique, réponse métabolique) et « actifs/curatifs » (mécanismes de détoxification, mécanismes de réparation de l’ADN).
Alliance intime des approches génomiques et protéomiqueNous avons amorcé un ambitieux programme avec séquençage et annotation du génome de Thermococcus gammatolerans, analyses transcriptomiques, analyses de protéomique globale préliminaires, purification de facteurs de transcription et analyse de leur interaction avec l’ADN. Nos approches sont développées afin (i) d’établir la dynamique du protéome global chez l’archée T. gammatolerans en réponse à l’irradiation gamma et la radiolyse pulsée à des doses très élevées (jusqu’à 30 kGy) par analyse shotgun, (ii) de caractériser dix facteurs de transcription de T. gammatolerans nécessaires pour la survie cellulaire et établir leurs régulons, et (iii)  d’identifier les protéines interagissant avec des dommages de l’ADN par enrichissement avec leurres (protéomique chimique). Nos expériences permettront d’établir la liste des protéines qui interagissent directement avec les dommages de l’ADN chez  T. gammatolerans et caractériser le rôle de ces protéines quant à la réparation de l’ADN et la radiotolérance.
Résumé de la soumission : Thermococcus gammatolerans a été isolée d’une source hydrothermale sous-marine. Cette archée est l’un des organismes les plus radiorésistants qui soit connu. Elle supporte une dose de 30 kGy de radiolyse pulsée sans aucune létalité. Afin de caractériser les mécanismes impliqués dans sa radiotolérance extrême, nous avons amorcé un ambitieux programme. Nous avons séquencé et annoté son génome, établit le protéome de cellules en phase exponentielle et phase stationnaire par une approche shotgun massive, et analysé son transcriptome lors de cinétique de réparation de son chromosome suite à une irradiation gamma de cellules en phase exponentielle de croissance. Nous établissons désormais la liste des protéines qui interagissent directement avec les dommages de l’ADN chez T. gammatolerans et caractérisons le rôle de ces protéines quant à la réparation de l’ADN et la radiotolérance. Pour cela, nous avons défini quatre tâches complémentaires : i)  établir la dynamique du protéome chez T. gammatolerans en réponse à l’irradiation gamma et la radiolyse pulsée; ii) décrire le rôle des facteurs de transcription clés impliqués dans la survie cellulaire et définir leurs régulons, iii)  identifier les protéines interagissant avec des dommages de l’ADN par une approche d’enrichissement par leurres (protéomique chimique) et, iv)  étudier au moins cinq protéines clés de la réparation de l’ADN et de la radiotolérance mises en évidence par nos approches transcriptomiques et dans le futur par enrichissement par leurre. Par analyse shotgun, nous identifierons et quantifierons les protéines les plus abondantes de cellules ayant été soumises à deux types de stress : gamma-irradiation (doses de 2,5 et 5,0 kGy) et radiolyse pulsée (doses de 5,0 et 30 kGy), en effectuant des cinétiques basées sur les études transcriptomiques que nous avons réalisé. Le niveau de modifications post-traductionnelles des protéines (oxydation, phosphorylation) sera établi. Ces analyses permettront de sonder les différences physiologiques en réponse à ces stress. Nous avons d’ores et déjà sélectionné dix régulateurs transcriptionnels qui devraient être impliqués dans la survie cellulaire après dommages à l’ADN chez T. gammatolerans. Nous avons initié leur production hétérologue et déjà purifié 4 cibles. Par une stratégie de type SELEX, nous définissons le motif ADN consensus reconnu par ces régulateurs que nous validerons par DNA footprinting, EMSA et autres méthodes biochimiques. Avec l’aide de nos partenaires chimistes, nous développerons des sondes ADN mimant des dommages occasionnés par irradiation gamma. Nous les utiliserons comme leurres pour piéger des protéines reconnaissant ces dommages à partir d’extraits de T. gammatolerans irradiée. Cette approche innovante permettra d’identifier de nouvelles protéines de reconnaissance des dommages, et de co-purifier leurs partenaires. Finalement, nous caractériserons au moins cinq protéines impliquées dans la réparation ou la radiotolérance révélées par nos différentes approches. Nous analyserons leurs caractéristiques en termes d’affinité pour l’ADN et de réparation.  Des avancées majeures dans la compréhension de la radiotolérance chez T. gammatolerans sont attendues avec la découverte de nouveaux mécanismes de réparation de l’ADN chez les archées. Sur la base de nos expériences préliminaires, notre investissement massif en protéomique sera extrêmement productif. Ce projet est aussi une opportunité pour développer de nouveaux savoirs quant à l’interprétation de données massives multi-omiques et décrire des mécanismes régulateurs originaux chez des organismes hyperthermophiles.
Résultats : Les résultats obtenus après six mois sont prometteurs et permettent de valider les approches expérimentales proposées. Une analyse comparée des dégâts du patrimoine génétique chez l’archée Thermococcus gammatolerans a été établie pour des rayonnements gamma et des irradiations avec bombardement d’électrons. La mise au point de l’approche de piège par ligands permettra d’identifier les protéines clés intervenant après ces dommages. Le suivi détaillé de la dynamique du protéome après ces dommages massifs à l’ADN est en cours.
Perspectives : Non relevant à ce stade
Publications et brevets : Armengaud J et al. (2013) Proteogenomics for environmental microbiology. Proteomics, in press. Une première publication de revue sur l’apport de la protéogénomique pour l’étude des microorganismes relevant en microbiologie environnementale est parue dans le journal Proteomics. Cette revue se base en partie sur T. gammatolerans comme exemple d’étude.