Projet ANR-10-BLAN-1523 – STED-FLIM : Microscopie STED accordable résolue en temps pour une imagerie dynamique des interactions à l'echelle subcellulaire.
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Sandrine Leveque-Fort (CNRS - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD)
Partenaires : Institut du Cerveau et de la Moelle Épinière; Psychopathologie et Psychologie Médicale; Laboratoire Charles Fabry; Université Paris-Sud
Montant : 450000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Microscopie STEDCe projet consiste à développer un microscope de fluorescence dépassant la limite de résolution imposée par la diffraction pour étudier les mécanismes de la maladie d’Alzheimer à une échelle inaccessible jusqu’à présent avec la microscopie optique classique.
Microscopie optique super-résolue pour la neurobiologieL’objectif est de développer un système de microscopie STED à super-résolution accordable en longueur d’onde afin de pourvoir exciter une large gamme de fluorophores d’intérêt biologique, voire plusieurs fluorophores simultanément. En outre, la mesure de la fluorescence pourra être effectuée de manière résolue en temps afin d’accéder aux durées de vie de fluorescence des fluorophores. En complément des informations de localisation à l’échelle nanométrique, une analyse dynamique de processus moléculaires et métaboliques au sein des cellules sera ainsi possible, ainsi qu’une colocalisation de deux protéines. Ceci permettra ainsi par exemple des études à l’échelle de la synapse jusqu’à présent inaccessibles. Ce système d’imagerie ouvrira ainsi de nouvelles perspectives dans l’étude de nombreux processus biologiques, notamment en neurobiologie (maladie d’Alzheimer), où les domaines d’interactions mis en jeu ne peuvent être spécifiquement étudiés aujourd’hui à cause d’une résolution spatiale insuffisante. Implanté sur la plate-forme d’imagerie du Centre de Photonique Biomédicale de l’Université d’Orsay, cet instrument sera mis à la disposition de la communauté scientifique.
Microscopie de fluorescence à déplétion par émission stimulée (STED)Il s’agit d’un microscope de fluorescence à balayage où on superpose au faisceau d’excitation classiquement présent,  un faisceau de déplétion mis en forme de doughnut afin de dépasser la limite de résolution imposée par la diffraction. Cette limite est dépassée en utilisant l'émission stimulée pour empecher l’émission de fluorescence dans la zone associée au doughnut. Ainsi seule la zone intérieure au doughnut peut encore émettre de la la fluorescence, et la largeur de cette zone centrale est ajustée grâce à la saturation des effets de déplétion de la fluorescence.
Résumé de la soumission : Classiquement, les méthodes de microscopie en champ lointain sont limitées en résolution spatiale par le phénomène de diffraction. En microscopie de fluorescence à balayage (confocale ou non-linéaire par absorption à 2 photons), la résolution est directement donnée par la taille du faisceau laser incident focalisé au foyer de l'objectif. Cette taille dépend de la longueur d'onde et de l'ouverture numérique de l'objectif de microscope, soit au mieux ~ 250 nanomètres. Il est toutefois possible de dépasser cette limite imposée par la diffraction grâce à la technique de microscopie STED (acronyme de "Stimulated Emission Depletion"). Le concept, proposé par S. Hell et J. Wichmann en 1994, consiste à focaliser un deuxième faisceau laser à la périphérie de la tache de fluorescence afin de dépeupler le niveau excité par émission stimulée et par conséquent d'empêcher la fluorescence de se produire à cet endroit. Il est ainsi possible de réduire de manière significative la taille de la tache de fluorescence. Récemment (en 2008), une résolution spatiale de 7 nm a été obtenue par cette technique de microscopie STED. Nous proposons de développer un système de microscopie confocale de fluorescence basé sur le principe de désexcitation des fluorophores par émission stimulée (STED), avec la particularité d'être accordable en longueur d'onde afin de pourvoir exciter différents fluorophores d'intérêt en biologie.  La mesure de la fluorescence à ultra-haute résolution spatiale pourra être effectuée de manière résolue en temps afin d'accéder aux durées de vie de fluorescence des fluorophores. En complément des informations de localisation à ultra-haute résolution, une analyse dynamique de processus moléculaires et métaboliques au sein des cellules sera ainsi possible. Afin d'eviter le phénomène de photoblanchiment et de faciliter l'application à des cellules vivantes, une etude photophysique des sondes à employer sera menée et permettra d'optimiser les paramètres du faisceau STED pour les différents systèmes biologiques.  Ce dispositif d'imagerie original ouvrira de nouvelles perspectives dans l'étude de nombreux processus biologiques. Dans le cadre du projet, il sera appliqué à l’étude la localisation de l’APP (amyloid protein precursor) et de son enzyme clivage jusqu’au niveau de la vésicule synaptique (~50 nm), de leur interaction (FRET/FLIM) et de leurs déplacement à l'échelle d'un axone mature (diamètre 150 nm), phénomènes impliqués dans la maladie d’Alzheimer et jusque là inobservables par manque de résolution. Implanté sur la plate-forme d'imagerie du Centre de Photonique Biomédicale de l'Université d'Orsay, cet instrument sera, à l'issu du projet, mis à la disposition de la communauté scientifique.
Résultats : Obtention des premières images de fluorescence sous la limite de diffraction. Mise au point des protocoles de marquage pour l application neurobiologique
Perspectives : Améliorer la resolution latérale et axiale. 
Application à la compréhension de la maladie d' Alzheimer
Publications et brevets : Homodimerization of Amyloid Precursor Protein at the Plasma Membrane: A homoFRET Study by Time-Resolved Fluorescence Anisotropy Imaging, PLOS One 2012,  
Viviane Devauges, Catherine Marquer, Sandrine Lécart, Jack-Christophe Cossec, Marie-Claude Potier, Emmanuel Fort, Klaus Suhling, Sandrine Lévêque-Fort