Projet ANR-11-BSV8-0003 – CYANOPROTECT : L’Orange Carotenoid Protein : une protéine photoactive impliquée dans la photoprotection chez les cyanobactéries
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Diana Kirilovsky (COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES  - DIRECTION DU CENTRE DE FONTENAY-AUX-ROSES)
Partenaires : Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives; Centre national de la recherche scientifique; Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
Montant : 349998.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Une protéine photoactive impliquée dans la photoprotection chez les cyanobactéries.CYANOPROTECT: Étude sur le photocycle et le mécanisme d’action de l’Orange Carotenoid Protein, qui est une protéine photoactive attachant une molécule de caroténoïde et qui est impliquée dans un mécanisme de photoprotection chez les cyanobactéries.
Objectifs de CYANOPROTECTL’ambition de ce projet est de créer un réseau multi-disciplinaire et international de laboratoires de tout premier rang mondial capable de résoudre le mécanisme de photoprotection chez les cyanobactéries, d’élucider le photocycle d’une nouvelle protéine photoactive et de comprendre plus profondément le rôle de la protéine dans les caractéristiques spectrales des caroténoïdes. En présence d’un excès de lumière, pour éviter les lésions photo-oxydatives, les organismes photosynthétiques dissipent une part de l’énergie qu’ils collectent sous forme de chaleur. Ce processus a été étudié en détail chez les plantes, mais est encore largement mal connu chez les cyanobactéries. Il n’a en effet été découvert que très récemment et son mécanisme doit être élucidé. Les éléments clé de ce mécanisme sont : le phycobilisome (l’antenne cyanobactérienne) ; l’OCP, une protéine photoactive avec un photocycle inconnu, qui attache une molécule de carotenoïde, qui est le détecteur de la forte lumière et l’inducteur de la dissipation thermale de l’énergie et la FRP, une protéine nécessaire pour diminuer la dissipation thermale. Nos principaux objectifs sont d’élucider 1) les composants du phycobilisome impliqués dans la photoprotection, 2) la nature du « quencher » d’énergie, 3) les interactions entre les différents éléments impliqués : OCP, phycobilisome et FRP.   L'OCP sera aussi utilisée comme une protéine modèle pour étudier comment les protéines influencent les propriétés électroniques des caroténoïdes. L'OCP est un modèle idéal pour mener à bien un tel projet, car c'est une protéine soluble qui ne lie qu'un seul caroténoïde, et qui peut être aisément génétiquement modifiée dans Synechocystis 6803, l'organisme concerné par ce projet. Ce projet présente aussi un intérêt d'application majeur. En effet, la connaissance et les souches qui vont résulter de notre travail pourraient permettre une meilleure optimisation de la production de biomasse par les cyanobactéries. 
Approches et méthodesLe succès du projet CYANOPROTECT nécessite une collaboration étroite entre des laboratoires possédant des expertises en biochimie (isolement des protéines et des complexes), génétique (construction des  mutants et régulation des gènes) et physiologie (mesures de photoprotection et activités photosynthétiques) des cyanobactéries, et en méthodes spectroscopiques avancées (Raman et InfraRed (FTIR))permettant l'étude des changements de conformation de l'OCP. Ces compétences complémentaires sont assurées par les deux partenaires participant à ce projet, qui ont déjà collaboré à plusieurs reprises sur des projets internationaux. Le fait qu'ils soient épaulés par des collaborations internationales avec des laboratoires experts en spectroscopie d'absorption et de fluorescence par flash ultrarapide et mesures sur molécules uniques (van Grondelle, Amsterdam et van Amerongen, Wageningen), et des cristallographes spécialisés dans l'étude de l'OCP et des phycobilisomes (Kerfeld, Berkeley et Adir, Haifa) donne à ce projet toutes les chances de réussite.Le groupe de Mme Kirilovsky construira et caractérisera tous les mutants de cyanobactéries nécessaires  pour cette étude et isolera les protéines OCP et FRP et les complexes phycobilisomes et OCP-phycobilisomes.  Le groupe de M Robert étudiera l’influence de la protéine sur le carotenoïde en utilisant la spectroscopie Raman et le photocycle de l’OCP en utilisant les spectroscopies Raman et FTIR ; le groupe de M van Grondelle étudiera les états excités du carotenoïde et le mécanisme de « quenching » avec des mesures de spectroscopie d'absorption par flash ultrarapide  et celui de M van Amerongen élucidera le site du quenching par mesures de cinétiques de fluorescence ultrarapide. Finalement, en collaboration avec les laboratoires de Mme Kerfeld et M Adir les structures de la FRP, de la forme active rouge de l’OCP et de complexes phycobilisomes-OCP vont être résolues.
Résumé de la soumission : Les organismes photosynthétiques renouvellent l'oxygène atmosphérique de la terre, produisent l'essentiel de la biomasse, et représentent une potentielle source d'énergie propre et renouvelable. Leur efficacité à convertir l'énergie solaire dépend d'un équilibre subtil entre leur capacité à collecter les photons solaires, d'une part, et à se protéger contre le stress photo-oxydatif de l'autre. Comme les plantes et les algues, les cyanobactéries –qui sont les organismes les plus abondants sur notre planète- se protègent contre les dommages photo-oxydatifs, en convertissant une part de l'énergie solaire absorbée en chaleur, régulant de fait l'énergie transférée de leurs antennes vers les photosystèmes. Ce type de processus a été largement étudié chez les plantes supérieures. Il n'a cependant été découvert que récemment chez les cyanobactéries, et procède de mécanismes clairement différents mais encore pauvrement caractérisés. Nous avons récemment montré que chez les cyanobactéries, la dissipation de l'énergie d'excitation en chaleur est induite par l'activation par la lumière d'une protéine soluble, contenant un caroténoïde, l'OCP (orange-carotenoid protein). L'illumination par une lumière bleu-verte intense induit un changement de conformation de cette protéine, et sa conversion en une forme rouge active relativement instable. L'OCP est la première protéine photoactive contenant un caroténoïde comme chromophore. Par ailleurs, le photocycle de l'OCP semble complètement différent des autres protéines photoactives. Presque rien n'est connu du mécanisme de photoactivation de cette protéine, ni de la manière dont elle assure la photoprotection. Nous avons de plus récemment montré qu'une autre protéine, la FRP (fluorescence recovery protein) intervient dans ce processus. Elle est essentielle pour récupérer la capacité maximale de l’antenne sous faibles intensités lumineuses. Le premier but de CYANOPROTECT est d'élucider les mécanismes moléculaires régissant l'activité de l'OCP et de la FRP. Dans le cadre de ce projet, l'OCP sera aussi utilisée par ailleurs comme une protéine modèle pour étudier comment les protéines influencent les propriétés électroniques des caroténoïdes, et donc comprendre comment ces molécules assurent leurs fonctions de photoprotection dans la vision et plus généralement d'anti-oxydants. L'OCP est un modèle idéal pour mener à bien un tel projet, car c'est une protéine soluble qui ne lie qu'un seul caroténoïde, et qui peut être aisément génétiquement modifiée dans Synechocystis 6803, l'organisme concerné par ce projet. Ce projet présente aussi un intérêt d'application majeur. En effet, la connaissance et les souches qui vont résulter de notre travail pourraient permettre une meilleure optimisation de la production de biomasse par les cyanobactéries.   Le succès du projet CYANOPROTECT nécessite une collaboration étroite entre des laboratoires possédant des expertises en biochimie, génétique et physiologie des cyanobactéries, et en méthodes spectroscopiques avancées permettant l'étude des changements de conformation de l'OCP. Ces compétences complémentaires sont assurées par les deux partenaires participant à ce projet, qui ont déjà collaboré à plusieurs projets internationaux et appartiennent au même campus de recherche. Ces deux partenaires sont des groupes reconnus internationalement comme des experts dans leurs domaines, publiant dans des journaux à fort coefficients d'impact (Nature, PNAS, Plant Cell). Le fait qu'ils soient épaulés par des collaborations internationales avec des laboratoires experts en spectroscopie d'absorption par flash ultrarapide et mesures sur molécules uniques (van Grondelle, Amsterdam et van Amerongen, Wageningen), et des cristallographes spécialisés dans l'étude de l'OCP et des antennes des cyanobactéries (Kerfeld, Berkeley and Adir, Haifa) donne à ce projet toutes les chances de réussite.
Résultats : Résultats déjà obtenus :
1)	En utilisant des mutants de phycobilisomes et des mesures de cinétiques de fluorescence ultrarapide nous avons démontré que le site du quenching dans le phycobilisome est un trimer d’allophycocyanine émettant de la fluorescence à 660 nm.
2)	Nous avons réussi à reconstruire in vitro le système de photoprotection en utilisant des phycobilisomes, de l’OCP et la FRP. En utilisant ce système nous avons démontré que 1) uniquement la forme rouge active de l’OCP est capable de s’attacher aux phycobilisomes et d’induire le quenching, 2) cet attachement est indépendant de la lumière, par contre l’activation de l’OCP dépend de l’intensité lumineuse, 3) la protéine FRP déstabilise l’interaction entre l’OCP et le phycobilisome et accélère sa désactivation. Nous sommes capables maintenant d’isoler des complexes OCP-phycobilisomes essentiels pour l’étude du mécanisme de « quenching ».
3)	Nous avons identifié un acide aminé, l’arg 155, essentiel pour l’attachement de l’OCP aux phycobilisomes. De plus nos résultats suggèrent fortement que la structure de la forme active rouge de l’OCP est plus ouverte que celle de la forme inactive orange.)
4)	Nous avons décrit les caractéristiques des états excités du carotenoïde dans la forme active (rouge) et inactive (orange) de l’OCP
Perspectives : Les prochains mois notre recherche va être centrée sur les points suivants :
1)	La protéine FRP : a) caractérisation de la FRP de Synechocystis (Task 2.3) ; b) identification des acides aminés de la FRP impliqués dans l’interaction avec l’OCP par construction et caractérisation de mutants de FRP.
2)	 Le photocycle de l’OCP : études à différentes températures de la photoactivation et désactivation de l’OCP en utilisant la spectroscopie FTIR, Raman et ultra-rapide transient absorption (collaboration avec lab de M van Grondelle)
3)	Influence des mutations de l’OCP sur les caractéristiques spectroscopiques du carotenoïde en utilisant de la spectroscopie Raman 
4)	Mécanisme de la dissipation thermale de l’énergie en collaboration avec le laboratoire de M van Grondelle.
Etant donné que nos recherches ont avancé plus rapidement que prévu de nouvelles thématiques vont être abordées : 
1)	Caractérisation d’OCPs d’autres souches de cyanobactérie et comparaison avec l’OCP de Synechocystis. Etude sur la spécificité de l’OCP : Est-ce que l’OCP de Synechocystis est capable d’induire le quenching de fluorescence des phycobilisomes d’autres souches ?
2)	Etude sur le rôle des protéines codées par des gènes homologues à celui codant pour la partie  N-terminale de l’OCP.
3)	Etude de la régulation transcriptionnelle des gènes ocp et frp. Etude des promoteurs.
Publications et brevets : Gwizdala, M, Wilson A, Kirilovsky D (2011) In vitro reconstitution of the cyanobacterial photoprotective mechanism mediated by the Orange Carotenoid Protein. 
Plant Cell 23 (7) 2631-2643
Lijin Tian, Ivo H.M. van Stokkum, Rob B. M. Koehorst, Aniek Jongerius, Diana L. Kirilovsky, and Herbert van Amerongen (2011) 
Site, rate and mechanism of photoprotective quenching in cyanobacteria. 
J. Am. Chem. Soc., 133 (45) 18304-18311
D. Kirilovsky, C.A. Kerfeld (2012)
The orange carotenoid protein in photoprotection of photosystem II in cyanobacteria,
Biochim. Biophys. Acta 1817, 158-166
Denis Jallet, Michal Gwizdala and Diana Kirilovsky  (2012) 
ApcD, ApcF and ApcE are not required for the Orange Carotenoid Protein related phycobilisome fluorescence quenching in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 
Biochim Biophys Acta 1817, 1411-1427
Rudi Berera, Ivo HM van Stokkum, Michal Gwizdala, Adjélé Wilson, Diana Kirilovsky and Rienk van Grondelle (2012) 
The photophysics of the Orange Carotenoid Protein, a light-powered molecular switch J Physical Chemistry B, 116: 2568-2574
Lijin Tian, Michal Gwizdala, Ivo H.M. van Stokkum, Rob B.M. Koehorst, Diana Kirilovsky and Herbert van Amerongen. (2012)
Picosecond Kinetics of Light Harvesting and Photoprotective Quenching in WT and mutant Phycobilisomes isolated from the Cyanobacterium Synechoscystis PCC 6803.
Biophysical Journal, 102 : 1692-1700
Wilson A, Gwizdala M, Mezzetti A, Alexandre M, Kerfeld CA, Kirilovsky D (2012) 
	The essential role of the N-terminal domain of the Orange Carotenoid Protein in cyanobacterial photoprotection: Importance of a positive charge for phycobilisome binding. 
	Plant Cell, DOI 10.1105/tpc.112.096909