Projet ANR-14-CE05-0010 – HEROS : Hydrogénases résistantes à l’Oxygène
Programme : Transformations et inter-conversions énergétiques (DS0203)
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Madame Carole Baffert (Centre National de la Recherche Scientifique délégation Provence et Corse_Laboratoire de bioénergétique et ingénierie des protéines)
Partenaires : Laboratoire public; Institut Méditerranéen d'Océanographie; CSIC Laboratory de Bioelectrocatalysis; London University; University of Milan-Bicocca
Montant : 399464.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 60 mois
Résumé : Hydrogénases résistantes à l'oxygèneLes hydrogénases sont des metalloenzymes complexes qui catalysent réversiblement l'oxydation de H2. Elles peuvent être utilisées dans des systèmes biotechnologiques, c'est pourquoi les recherches se focalisent sur les processus d'inactivation par O2 qui limite grandement leur applications. Il est envisageable d'utiliser l'ingénierie des protéines pour rendre tolérantes les hydrogénases d'organismes photosynthétiques, à condition que le mécanisme d'inactivation par O2 soit compris.
Repenser et établir le mécanisme de réaction des hydrogénases NiFe avec l'oxygèneNotre objectif est d'utiliser des nouvelles méthodes biophysiques et des nouveaux systèmes biologiques pour comprendre le mécanisme d'inactivation par l'oxygène des hydrogénases NiFe ou la tolérance naturelle de certaines enzymes. Ceci permettra d'éventuellement construire des hydrogénases NiFe résistantes à l'oxygène qui pourront être utilisées pour la production biologique de H2 ou dans des biopiles à combustible.Pour cela, nous repenserons le mécanisme moléculaire d'inactivation par l'oxygène des hydrogénases NiFe et nous identifierons les déterminants structuraux de la tolérance à l'oxygène. Ceci inclus la constructions d'enzymes artificielles.
Biochimie, biologie moléculaire, électrochimie, RPE-Construction, surproduction et purification des enzymes.-Electrochimie directe.-Etudes RPE des enzymes sauvage, des enzymes artificielles et des mutants tolérants à O2.-Caractérisation par IR des enzymes sauvage, des enzymes artificielles et des mutants tolérants à O2.-Méthodes théoriques
Résumé de la soumission : L’hydrogène serait un vecteur énergétique propre s’il pouvait être produit de façon écologique. Une possibilité serait de le synthétiser par des approches biologiques, en particulier en utilisant des organismes photosynthétiques qui couplent l’oxydation de l'eau à la production de H2 grâce à des catalyseurs biologiques appelés hydrogénases. Ce sont des metalloenzymes complexes qui catalysent l'oxydation et la production de H2 au niveau d'un site actif bi-métallique (FeFe ou NiFe). La compétition intense dans ce domaine de recherche est motivée en partie par l’utilisation potentielle des hydrogénases dans des systèmes biotechnologiques. La recherche se focalise particulièrement sur leur inactivation par l'O2 qui limite grandement leurs applications. Utiliser l'ingénierie rationnelle des protéines pour rendre tolérantes à l'O2 les hydrogénases d'organismes photosynthétiques pourrait être envisagé si le mécanisme d'inactivation était compris. Les résultats spectaculaires obtenus récemment par les partenaires de ce projet ont souligné la nécessité de maintenir les efforts quant à l'étude des mécanismes de résistance et de sensibilité à l'O2 des hydrogénases à NiFe. En 2013, dans Nature Chemical Biology, nous avons remis en question le mécanisme d'inactivation oxydante des hydrogénases à NiFe et remis en question la structure chimique des états inactifs. Dans PNAS et JACS en 2012, nous avons décrit une série de mutants d'une hydrogénase sensible dont la tolérance à l'O2 est considérablement augmentée, par un mécanisme qui nécessite encore d'être étudié de manière approfondie.Dans ce projet, notre objectif est d'utiliser de nouvelles méthodes et approches pour repenser et approfondir la connaissance des mécanismes d'inactivation et de tolérance à l'O2 des hydrogénases à NiFe.Les quatre équipes des laboratoires français et les trois laboratoires étrangers participant à ce projet ont déjà fructueusement collaboré. Ces laboratoires sont experts dans le domaine des métalloenzymes (en particulier les hydrogénases) et maîtrisent les outils biochimiques, spectroscopiques, électrochimiques et théoriques utilisés depuis plusieurs années pour étudier ces enzymes dans le cadre d'un réseau de collaboration pluridisciplinaire à l'interface biologie/chimie/physique.Nous utiliserons notre système génétique modèle pour produire en routine l'hydrogénase sensible de Desulfovibrio fructosovorans et divers mutants plus résistants. Nous allons aussi développer la production et la purification de l’hydrogenase naturellement résistante de Salmonella enterica Typhimurium et de E. coli. D’autre part, nous allons mettre en place la production d'enzymes artificielles chimériques. Nous développerons et utiliserons de nouvelles méthodes électrochimiques, la chimie théorique et des techniques spectroscopiques à haute résolution pour  caractériser ces enzymes par l’approche pluridisciplinaire qui caractérise le laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines. Les trois différentes équipes de ce laboratoire participeront au projet avec leurs différentes approches (biologie moléculaire, électrochimie, spectroscopie RPE), et les trois partenaires étrangers recrutés apporteront leur expertise spécifique (spectroscopie infrarouge et chimie théorique). La production à grande échelle des enzymes d’intérêt sera mise en place et optimisée à l’Institut méditerranéen d'océanologie (MIO), elle sera cruciale pour les études biophysiques et pour les futures applications biotechnologiques. Les meilleures enzymes produites dans le projet seront utilisées par un consortium de chercheurs financés dans le cadre d’une ANR (CAROUCELL ANR 2013 BIOME) dont le but est d’élaborer des biopiles à combustibles.Les résultats obtenus permettront de rationaliser l’ingénierie des hydrogénases à NiFe d’organismes photosynthétiques, ce qui rendra possible la conception de systèmes de photoproduction biologique de H2.
Résultats : Clonage de la petite et de la grande sous-unité de l’hydrogénase Hyd-1 de E.coli avec le Tag en C-terminal de la petite sous-unité (à la place de la partie transmembranaire) sur plasmide, puis transformation d'une souche E. coli délétée des gènes des grandes sous-unités catalytiques des hydrogénases Hyd-1, Hyd-2 et Hyd-3.
En parallèle, les gènes hyaA et hyaC de Hyd-1 ont été délétés sur le chromosome (le gène B l’était déjà dans la souche utilisée), ainsi le chromosome ne possède plus les gènes des protéines structurales de l’hydrogénases mais possède toujours les gènes des maturases.
Résultats de chimie théorique (DFT) obtenus par Maurizio Bruschi (collaborateur étranger; Milan):
La stucture la plus basse en énergie pour l'espèce Ni-A présente une oxydation d'une des cystéine pontante le Ni et le Fe et donc formation d'une liaison Ni-O-S-Fe.
La formation de NiA pourrait passer par celle de NiB. Cette interconversion n'est pas claire du point de vue expérimentale.
Perspectives : La production de l'hydrogénase Hyd-1 est difficile dues à la formation de corps d'inclusion. Nous avons du déterminer les conditions de croissance optimale pour éviter la formation de ces corps d'inclusion.
Publications et brevets : Pierre Ceccaldi, Emilien Etienne, Sébastien Dementin, Bruno Guigliarelli, Christophe Léger, Bénédicte Burlat, “Mechanism of inhibition of NiFe hydrogenase by nitric oxide”, BBA – Bioenergetics (2016)