Projet ANR-07-PHYS-0016 – MN Profile : Identification d¿antigènes et de peptides immunodominants dans la glomérulopathie extramembraneuse (GEM) : établissement de nouveaux biomarqueurs de pronostic et de surveillance
Programme : Physiopathologie des maladies humaines (PHYSIO) 2007
Année de financement : 2007
Coordinateur du projet : INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE - DELEGATION PARIS VI (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE - DELEGATION PARIS VI)
Partenaires : Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 350000.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : La physiopathologie des glomérulopathies extramembraneuses (GEM) reste mal connue et leur traitement est empirique. Nous avons identifié le premier antigène (endopeptidase neutre) impliqué dans une forme anténatale, mais les cibles antigéniques dans les GEM de l'adulte restent inconnues. Nos objectifs sont :
1. l'identification d¿antigènes et de peptides immunodominants spécifiquement reconnus par les anticorps circulants, en utilisant des techniques sensibles de protéomique et une librairie de peptides aléatoires ;
2. la démonstration du rôle de ces antigènes/peptides dans la pathogénie de la GEM par microscopie confocale permettant d'analyser leur présence dans les dépôts, et par immunisation passive ou active de souris; 
3. le développement de « protein chips » où seront déposés les fragments d'antigènes identifiés afin de définir le profil de réactivité des anticorps sériques. Ce profil sera utilisé pour les indications et la surveillance des traitements.
//1. Identification de ligands antigéniques des anticorps circulants
-Approche protéomique : des extraits de podocytes humains en culture seront fractionnés, séparés en gel uni et bidimensionnel, et les spots réactifs en Western blot avec les sérums des patients seront identifiés par spectrométrie de masse;
-Librairie peptidique aléatoire : la libraire FliTrx dans E. coli sera testée avec les IgG des patients, les colonies d'intérêt seront développées, l'ADN séquencé, et la réactivité sera confirmée à l'aide de peptides de synthèse. L'interrogation des banques de données permettra d¿identifier non seulement la protéine correspondante, mais aussi les protéines ayant une réactivité croisée qu peuvent jouer un rôle fonctionnel important.
2. Mise en évidence du rôle des antigènes/peptides identifiés
-Recherche par microscope confocale de la présence des antigènes/peptides dans les dépôts extramembraneux dans une collection de 200 biopsies humaines ;
-Transfert des anticorps humains purifiés à la souris ;
-Immunisation active des souris à l¿aide des peptides identifiés.
   L'étude de la maladie rénale induite par immunisation portera sur la protéinurie, la créatinine sérique, et l'examen histologique.
3. Développement de microarrays pour l¿établissement du profil de réactivité des sérums
   Les antigènes (peptides synthétiques ou protéines recombinantes) seront déposés sur des lames. La réactivité et la sous-classe (IgG1 ou IgG4) seront déterminés pour chaque sérum, et les résultats soumis à une analyse de « cluster ».
4. Applications du « profiling » des anticorps
-Etablissement de critères pour les indications du traitement immunosuppresseur en collaboration avec les coordonnateurs d'essais cliniques en cours ou prévus ;
-Identification de facteurs de réponse au Rituximab (un anticorps anti-CD20 déplétant les cellules B) dans deux cohortes rétrospective et prospective de 30 et de 100 patients, respectivement;
-Détection des patients à risque de GEM.//   L'amélioration du traitement des GEM nécessite une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques. L'identification des antigènes cibles et de profils de réponse immune (« antibody profiling ») permettra :
-de disséquer à l'échelon moléculaire l¿hétérogénéité de la maladie,
-de fournir de nouveaux biomarqueurs pour le choix des indications thérapeutiques,  et pour la surveillance des traitements,
-d'identifier des patients à risque de GEM,
-d'envisager des thérapeutiques immunosuppressives ciblées en commençant par des expériences pilotes dans les modèles expérimentaux que nous aurons mis au 	point.