Projet ANR-13-JSV6-0003 – COLOC_ACHR : Corégulation des gènes du récepteur de l'acétylcholine par interactions à longue distance
Programme : JCJC - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (JCJC SVSE 6)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Alexandre MEJAT (Laboratoire de Biologie Moléculaire de la Cellule)
Partenaires : Laboratoire de Biologie et Modélisation de la Cellule
Montant : 327641.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : Réarrangements dynamiques du génome au cours de la différenciation musculaireLa cellule musculaire est unique car elle contient plusieurs noyaux qui organisent leur ADN de manière différente selon leur position et l’activité musculaire. Nous voulons comprendre comment et pourquoi l’organisation du génome change au cours de la différenciation musculaire. 
Ou comment la cellule musculaire organise 40km d’information dans une balle de tennis ?Chaque noyau cellulaire mesure 10um et contient un génome de 2m d’ADN soit l’équivalent de 40km compacté dans le volume d’une balle de tennis. La cellule musculaire présente la propriété originale de contenir plusieurs noyaux présentant des repliements différents de leur génome. Notre objectif est de décrire la manière dont le repliement tridimensionnel de l’ADN s’organise au cours de la différenciation musculaire et de comprendre le rôle de cette dynamique pour le fonctionnement musculaire. 
Imagerie et séquençage haut débit pour l’étude de l’organisation du génome musculaireNotre projet vise à combiner plusieurs technologies permettant de décrire l’organisation et l’activité du génome telle que :-	L’imagerie à haut débit qui permet de visualiser la position d’un gène dans l’espace nucléaire.-	La « capture de conformation de chromosome » qui permet de connaître les interactions physiques entre gènes distants.-	Le séquençage à haut débit des ARN qui permet de connaître l’activité de chacun des gènes à un moment donné de la différenciation musculaire.
Résumé de la soumission : Les génomes eucaryotes doivent accommoder deux contraintes diamétralement opposées: la compaction de 2 m d'ADN génomique dans une sphère de 10 um de diamètre et, en même temps, l'accessibilité de I'ADN à une grande variété de machineries cellulaires impliquées dans la réplication, la transcription, la recombinaison et la réparation de l'ADN. L'organisation tridimensionnelle du noyau est donc cruciale pour le fonctionnement cellulaire. La fibre musculaire est un modèle parfait pour explorer la manière dont le fonctionnement cellulaire est lié à l'architecture nucléaire. La différenciation musculaire est un modèle bien caractérisé de différenciation cellulaire durant laquelle des myoblastes mononuclés sortent irréversiblement du cycle cellulaire et se différencient en myocytes qui fusionnent pour former des myotubes multinuclés en une série ordonnée d'événements. In vivo, chaque fibre musculaire est contactée par l'axone d'un motoneurone initiant la formation d'une structure dédiée à la communication nerf/muscle, appelée jonction neuromusculaire (JNM). L'innervation motrice conduit à la restriction de l'expression des gènes spécifiques de la synapse à quelques noyaux musculaires situés directement sous la synapse. De ce point de vue, la fibre musculaire mature est unique chez les mammifères car elle est la seule cellule multinuclée au sein de laquelle différent programmes génétiques sont exprimés dans les noyaux d'une même cellule. Enfin, des mutations dans les composants de l'enveloppe nucléaire ont été associées à plusieurs dystrophies musculaires humaines, suggérant que l'organisation nucléaire est cruciale pour la différenciation musculaire. Nous avons montré précédemment comment l'activité électrique induite par le nerf moteur régule l'expression des gènes musculaires et nous avons identifié l'Histone Déacétylase 9 (HDAC9) comme un régulateur clé de l'organisation de la chromatine musculaire et une cible potentielle pour bloquer l'atrophie musculaire. Nous avons aussi élucidé le rôle de composants majeurs de la lame nucléaire, les lamines A/C, dans la fibre musculaire mature et montré que les mutations dans les lamines A/C induisent des défauts de la jonction neuromusculaire largement responsables du phénotype pathologique dans la dystrophie musculaire d'Emery-Dreifuss. Notre projet étendra ces études et abordera le rôle fonctionnel des interactions à longue distance dans la régulation de l'expression des gènes musculaires. Nous proposons de prendre les gènes des sous-unités du récepteur de l'acétylcholine (RACh) comme modèle de gènes corégulés différentiellement exprimés in vivo et d'évaluer la contribution des séquences promotrices, de la liaison des facteurs de transcription, des modifications de la chromatine et des interactions avec les protéines d'enveloppe nucléaire dans les interactions à longue distance de gènes corégulés. Notre but à long terme est d'élucider la manière dont l'organisation spatiale du génome change au cours de la différenciation musculaire et comment ces changements affectent la fonction du génome. Pour atteindre ce but, notre projet a trois objectifs scientifiques: Objectif 1. Mesurer les positions radiales et relatives des gènes du RACh et la cinétique de leur mouvement au cours de la différenciation musculaire en utilisant l'hybridation in situ de sondes fluorescentes (FISH).Objectif 2. Définir les interactions inter- et intra-chromosomiques entre sous unités du RACh par Capture de Conformation de Chromosome (3C/4C).Objectif 3. Modéliser l'organisation tridimensionnelle des gènes du RACh en combinant des données biologiques (FISH, 3C/4C, ChIP seq, RNA seq) et des modèles de physique théorique.Les expériences et collaborations proposées représentent un ensemble unique de techniques et d'expertises complémentaires pour élucider et modéliser l'organisation tridimensionnelle et la dynamique du génome dans un modèle de différenciation cellulaire physiologique et bien défini.
Résultats : L’analyse à haut débit d’image nous a permis de montrer que les gènes musculaires sont différemment positionnés dans deux types de noyaux : les noyaux de la synapse musculaire et les noyaux extrasynaptiques. Nous avons pu reproduire ces deux organisations différentes dans des cellules en culture afin de disséquer les mécanismes contrôlant la position des gènes et ainsi montré que leur position est en partie contrôlée par leur expression.
Perspectives : Des mutations dans les gènes du récepteur de l’acétylcholine sont responsables d’une pathologie appelée « Myasthénie congénitale ». La compréhension des mécanismes de régulation de l’expression de ces gènes pourrait à terme permettre le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour cette pathologie.
Publications et brevets : Les résultats obtenus dans la première phase de ce projet ont fait l’objet de présentations orales dans deux colloques scientifiques : l’un international et l’autre national. De plus, un article présentant ces travaux est en cours de rédaction et sera prochainement soumis pour publication à un journal scientifique.