Projet ANR-11-BSV5-0009 – BROCOLI : Echafaudages 3D en polyélectrolytes de culture de cellules prostatiques : un outil d'étude de l'effet du microenvironnement sur le phénotype cancéreux et d'identification de nouveaux biomarqueurs
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Donald Martin (UNIVERSITE GRENOBLE I [Joseph Fourier])
Partenaires : Laboratoire d'Électronique et de Technologie de l'Information; Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives; Université de Grenoble Alpes
Montant : 484399.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : BROCOLI - Echafaudages 3D en polyélectrolytes de culture de cellules prostatiquesun outil d'étude de l'effet du microenvironnement sur le phénotype cancéreux et d'identification de nouveau biomarqueurs
2.3.	OBJECTIFS ET CARACTERE AMBITIEUX ET/OU NOVATEUR DE LA PROPOSITION DE PROJETL'objectif de ce projet est de développer un format 3D-microculture qui fournit un échafaudage canalaire de microtubes de polyélectrolytes pour permettre aux cellules de la prostate de se développer dans une structure glandulaire acini normale. Des systèmes de culture de cellules prostatiques 3D actuellement utiliser une matrice de collagène ou Matrigel à fournir un substrat dans lequel les cellules sont ensemencées puis développent spontanément structures acineuses. Après le développement de structures telles acineuses, les cellules prostatiques sécrètent des ions, des enzymes et des hormones dans le noyau de l'acinus. Cependant, il est difficile d'analyser les sécrétions de ces acini, car ils sont des amas individuels au sein de la matrice 3D et il n'y a pas de lien structure collectrice canalaire à partir de laquelle les sécrétions acineuses peuvent être collectées. Dans ce cas, la matrice 3D doit être disséqué et les acini prélevé pour analyse.La nouveauté de ce projet est de développer un échafaudage canalaire pour soutenir la croissance des cellules acineuses de la prostate, ce qui permettra de mesurer les réponses sécrétoires des cellules de la prostate en temps réel.Polyélectrolyte (PE) semble être le candidat idéal, que des films fabriqués à partir de ces polymères chargés sont non cytotoxiques et relativement pas cher. Nous avons déjà utilisé PE pour faire des micro-capsules de taille et des tubes et des films minces qui ont soutenu avec succès les lipides et l'adhésion cellulaire et la croissance. En outre, les films PE sont viscoélastique compressible et d'autres paramètres physiques sont facilement contrôlés.
3.	PROGRAMME SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE, ORGANISATION DE LA PROPOSITION DE PROJETLes objectifs spécifiques de ce projet sont les suivants:1. de construire un polyélectrolyte bio-puce en utilisant 3-dimensionnelles canalaires micro-structures pour fournir un contrôle biomimétique micro-environnement pour la croissance des cellules des glandes exocrines.2. à caractériser l'effet de la micro-environnement (c'est-à-dire le substrat et la composition physique du fluide extracellulaire) sur la croissance des cellules cancéreuses des glandes exocrines,3. à caractériser l'effet de la micro-environnement (c'est-à-dire le substrat et la composition physique du fluide extracellulaire) sur la fonction physiologique (qui est, les sécrétions) de cellules cancéreuses des glandes exocrines,4. d'utiliser le 3-dimensions bio-puce pour mesurer le rôle des médicaments pour améliorer la fonction physiologique et le phénotype des cellules cancéreuses des glandes exocrinesPour atteindre ces objectifs, le programme scientifique est organisé en 3 phases:Phase 1: 3-dimensionnelle polyélectrolyte canalaire microstructures de fournir contrôlé micro-environnement pour la croissance des cellules des glandes exocrines (objectif 1)Phase 2: micro-environnement influence sur la croissance et la fonction physiologique des cellules des glandes exocrines (objectifs 2 et 3)Phase 3: analyse des médicaments pour améliorer le phénotype et la fonction physiologique des cellules des glandes exocrines (objectif 4)
Résumé de la soumission : Le cœur de ce projet est de caractériser un nouveau système d’échafaudage 3D à base de poly- électrolytes pour la culture cellulaire 3D de cellules de prostates et de pouvoir ainsi contrôler le microenvironnement de cellules prostatiques et mieux comprendre : i) la morphogénèse d’une glande exocrine et les processus de différenciation et ii) la formation des acini et les mécanismes qui régissent l’architecture tissulaire et la désorganisation des acini lors de pathologies telles que le cancer. Le modèle étudié ici est la cellule prostatique en lien direct avec l’expertise des 2 partenaires du projet, TIMC-UJF et CEA-Biopuces mais les résultats attendus pourront être applicables à tout modèle de glande exocrine. La nouveauté dans cette approche est de créer une structure 3D branchue avec un lumen utilisant des polyélectrolytes. Nous avons déjà avec succès crée des microcapsules et microtubes en polyélectrolytes, hébergeant des canaux ioniques et compatibles avec la croissance cellulaire. En parallèle, le CEA-Biopuces a obtenu des résultats préliminaires en culture 2D de cellules prostatiques normales et tumorigènes avec l’étude de kinases qui jouent un rôle fondamental dans les équilibres prolifération, différenciation et mort cellulaire. Ainsi, ce projet BROCOLI combine l’expertise de partenaires dans les domaines de la physiologie des glandes exocrines, la bio-ingénierie et nanobiotechnologie (Dr. Martin, UJF) et la biologie cellulaire, l’électrophysiologie et les laboratoires-sur-puces (Dr. Picollet-D’hahan, CEA). Nous nous proposons de développer un système de culture 3D autour d’un espace luminal (microtubes) mimant la structure in vivo du lumen d’une glande exocrine. Ce système nous permettra d’étudier l’influence des paramètres du microenvironnement, à la fois chimiques, physiques et mécaniques, sur les mécanismes de formation du lumen des acini de prostate et apportera des données significatives sur la compréhension des mécanismes de la morphogénèse lors du développement normal et cancéreux de l’organe. Notre stratégie est basée sur des analyses cellulaires de croissance, prolifération, différenciation de cellules normales et cancéreuses, à l’aide de marqueurs spécifiques, sur films de polyélectrolytes 2D et sur microstructures 3D (microsphères et microtubes). Notre objectif est de démontrer qu’il est possible grâce aux polyélectrolytes de recréer un microenvironnement fonctionnel pour ces cellules, hébergeant les signaux biochimiques et structuraux nécessaires à la polarité des acini et à l’organisation des cellules épithéliales. En couplant cette architecture tubulaire 3D en polyélectrolytes avec un système de microfluidique (de type « lab-on-chip »), nous chercherons a réaliser une analyse quantitative de l’activité sécrétrice des cellules prostatiques. Les retombées de ce projet pourraient avoir des applications en terme de diagnostique du cancer de la prostate et de nouvel outil de culture cellulaire pour l’ingénierie tissulaire de glande exocrine. Enfin, les connaissances acquises sur les paramètres influant du microenvironnement devraient à terme permettre de prévenir voire réverser un phénotype cancéreux.
Résultats : Nos résultats escomptés sont dans 3 domaines principaux:
1. utilisant des polyélectrolytes à l'ingénieur une culture cellulaire 3D système d'échafaudage pour étudier normales et cancéreuses de la prostate et des lignées cellulaires de quantifier l'activité sécrétoire des cellules. Notre format 3D fournira un moyen de recueillir et d'analyser les fluides de la lumière et aussi de déclencher ou de mesurer la déformation mécanique dans le mouvement des fluides lumière suivant. Par conséquent, l'originalité de ce projet est aussi d'utiliser les microfluidique pour l'analyse de la réponse dynamique des cellules, plutôt que l'utilisation de la microfluidique précédemment rapporté comme un simple outil pour la construction de la culture cellulaire 3D,
2. que polyélectrolyte pertinente 3D micro-environnement offrirait de nouvelles perspectives dans les mécanismes de contrôle de la polarité épithéliale et la formation de lumière qui sont à ce jour encore mal compris. En modulant chimique, les propriétés physiques et mécaniques du PE, nous pouvons influer sur la dynamique de polarité cellulaires des deux côtés de cellules épithéliales: du milieu de culture externe (permettre la distribution de réactifs et médicaments importants ou des siRNA), mais aussi du côté interne de la lumen. Il s'agit d'un aspect très original puisque l'événement important morphologique de mouvement fluide polarisé a été démontré dans la formation de l'espace lumière,
3. nous vous proposons de (i) créer le preuve-de-concept de PE échafaudages 3D pour la morphogenèse épithéliale, et (ii) démontrer que PE sont fonctionnels en fournissant les signaux structurales et biochimiques nécessaires à la morphogenèse de l'organisation 3D des cellules épithéliales. Un résultat escompté est de fournir un protocole pour la culture cellulaire dans un microenvironnement nouvelle 3D en utilisant des microsphères et microtubes de PE.
Perspectives : Les résultats et les conclusions de ce projet fournira BROCOLI qui sous-tend la recherche fondamentale pour promouvoir le développement des biotechnologies et bio-ingénierie pour améliorer le diagnostic et / ou l'analyse in vitro. Dans ces conditions, BROCOLI correspond parfaitement à l'ITMO (Institut Thématique «Multi-Organisme») objectifs et des stratégies essentiellement comptaient sur la découverte de nouveaux biomarqueurs et leur validation clinique. De plus, nous croyons que notre projet BROCOLI multidisciplinaire fondée sur l'application de la culture cellulaire 3D et les polyélectrolytes à la découverte de biomarqueurs, s'adapte bien à la SNRI («Stratégie Nationale de la Recherche et de l'Innovation»). L'une des priorités SNRI repose en effet sur la nécessité d'une médecine personnalisée grâce au développement de meilleurs outils de diagnostic. BROCOLI propose un nouvel outil d'analyse de laboratoire-sur-puce qui répond à ce besoin.
Publications et brevets : Nous avons soumis le manuscrit pour publication suivante:
Nathalie Picollet-D’hahan N, Sophie Gerbaud S, Kermarrec F, Alcaraz J-P, Guyon L, Sulpice E, Cinquin P, Gidrol X, Martin DK. (2012). Polyelectrolyte nanofilms modulate attachment, growth and morphology of cancerous prostate cells. Biomaterials (a soumis)