Projet ANR-13-PRTS-0001 – PRIMA-TALEN VISION : Validation de PRIMA-1MET et TALEN comme agents thérapeutiques des déficiences visuelles EEC
Programme : Programme de Recherche Translationnelle en Santé (PRTS)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Eric GABISON (Service d'ophtalmologie, Fondation Ophtalmologique A. de Rothschild)
Partenaires : GOUILLAT CHRISTIAN; Divers privé; Immunologie, Dermatologie, Oncologie
Montant : 221200.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 48 mois
Résumé : Soigner la vision de patients atteints de dysplasie ectodermique liée à p63Notre projet consiste à valider une molécule-médicament capable de soigner la vision de patients atteints de dysplasie ectodermique liée à p63, en testant son effet sur nos modèles de reconstruction de cornée et chez l'animal.
Aboutir à la validation d'un premier traitement pour cette maladie rare.Les patients atteints de dysplasie ectodermique liée à p63 (EEC) souffrent de malformations  des membres, de la peau et pour certains d'entre eux, d'opacification progressive de la cornée jusqu'à perte de vision. Aucun traitement n'est proposé aujourd'hui. Notre réseau a  montré que des fibroblastes de patients, reprogrammmées et différenciées en cellules épithéliales de cornée récapitulent le défaut observé chez les patients. Ce modèle unique a permis d'identifier la molécule PRIMA-1 capable de réverter le défaut de ces cellules. Notre objectif est de valider PRIMA-1 comme médicament occulaire des EEC. Pour cela, nous devons confirmer l'effet bénéfique de PRIMA-1  dans un modèle de cornée reconstruite en culture 3D à partir de cellules de patients, ainsi que sur un modèle animal d'EEC a produire par greffe de cellules de patients sur cornée de souris. De plus, nous devons tester la cytotoxicité occulaire éventuelle de PRIMA-1 in vitro et in vivo. 
Reconstruction organotypique et modèle murin pour valider le potentiel de PRIMA-1Les cellules reprogrammées issues des patients EEC (EEC-iPSC) et contrôle sain seront induites à se différencier en cellules de la cornée en présence ou non de PRIMA-1. Par culture en interface air-liquide sur équivalent stromal, une stratification sera induite pour permettre la production d'un épithélium pluristratifié de cornée qui sera évalué par histologie et immunomarquage. En parallèle, un modèle EEC sera créé chez la souris par greffe des EEC-iPSC différenciées. PRIMA-1MET sera alors testée en gouttes occulaires directement sur les cornées greffées. Ces techniques sont déjà utilisées par les partenaires du réseau sur des cellules somatiques normales. Enfin, Même si PRIMA-1 est déjà utilisée en essais cliniques phase II pour traiter des cancers portant des mutations sur p53 (molécule très similaire à p63) sans effets toxiques apparents, nous évaluerons PRIMA-1 dans des tests de toxicité occulaire in vitro (sur cellules limbiques primaires) et in vivo (souris contrôles).
Résumé de la soumission : P63, facteur de transcription appartenant à la famille p53 joue un rôle essentiel dans le développement épithélial. Des mutations sur le domaine de liaison à l'ADN (DBD) du gène p63 sont responsables d'une dysplasie ectodermique appelée EEC (Ectrodactyly-Ectodermal dysplasia- Cleft lip palate), maladie rare associée à une carence progressive de cellules souches limbiques (LSCD), aboutissant à une déficience visuelle. Aujourd'hui, il n'existe aucun traitement pour ces patients et aucun modèle animal disponible pour le criblage de composés thérapeutiques potentiels. Nous avons récemment reprogrammé des fibroblastes dermiques provenant de patients EEC, en cellules pluripotentes induites (EEC-iPSC) et démontré leur incapacité à se différencier en cellules épithéliales de cornée, contrairement à des iPSC contrôles. La forte homologie entre les DBD de P53 et P63 nous a conduits à tester PRIMA-1MET, molécule de faible poids moléculaire réactivant P53 muté chez des patients atteints de cancer, au cours de la différenciation cornéale des EEC-iPSC. Nous avons montré que  PRIMA-1MET peut restaurer les défauts de différenciation épithéliale et réactiver l’expression des gènes cibles de P63 dans des EEC-iPSC portant la mutation R304W, mutation  la plus fréquente chez des patients EEC. De manière intéressante,  PRIMA-1MET a peu d'effet sur  R204W, une autre mutation du DBD de P63 qui altère la stabilité protéique et pas la liaison de l’ADN comme dans la mutation R304W. De par son accessibilité, la cornée est un organe privilégié pour la thérapie, son épithélium est non vascularisé et toute restauration de la vision chez des patients peut être aisément mesurable. De plus, les défauts de vision liés à une LSCD chez des patients EEC apparaissent tardivement, permettant un traitement avant ou au début de l’apparition des symptômes. Les patients EEC sont des candidats idéaux pour tester PRIMA-1MET, une molécule déjà en essais cliniques en cancérologie, pour une restauration de la vision. Notre projet est une étude préclinique ayant pour but de valider expérimentalement de nouveaux outils thérapeutiques prometteurs.Objectifs :1-	Etablir en France une cohorte de patients susceptibles de répondre au traitement par PRIMA-1MET. Des patients portant la mutation R204W et R304W ont déjà été identifiés par un de nos collaborateurs en Hollande (Hans Van Bokhoven). Cependant, comme nous avons l’expertise pour traiter les troubles de la vision liés à un défaut de la cornée, nous souhaitons établir en France un registre de données de patients EEC souffrant de LSCD pour effectuer les premiers essais à la fondation ophtalmique ou à l'hôpital St Louis.2-	Valider de façon expérimentale la capacité de PRIMA-1MET à traiter des patients EEC. Pour cela, nous allons créer un modèle animal en greffant des iPSC-R204W et R304W différenciées en cellules de cornée, sur des cornées murines blessées. Des gouttes oculaires contenant PRIMA-1MET seront ensuite instillées à ces souris et un suivi histologique et phénotypique de la cornée sera effectué dans le temps. PRIMA-1MET est déjà utilisé en essais cliniques de cancérologie et ne montre pas d'effets secondaires. Malgré tout, nous devons tester l'innocuité de PRIMA-1MET au niveau oculaire. Des tests de cytotoxicité seront effectués in vitro et in vivo.3-	Réverter la mutation R204W par thérapie génique puisqu'elle est peu sensible à PRIMA-1MET. Les méganucléases modifiées, appelées TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) peuvent provoquer des substitutions nucléotidiques dans le génome. Nous utiliserons cette technique innovante (Cellectis) pour corriger la mutation R204W des iPSC de patients EEC. Puis nous différencierons les cellules révertées en cellules de cornée prêtes à être greffées sur des souris LSCD, dans le but de tester leur capacité à restaurer une vision normale in vivo.
Résultats : Si PRIMA-1 montre sa capacité à régénérer la cornée de souris modèle EEC, confirmée par la production en 3D d'un éptihelium cornéen, l'étape suivante sera de préparer PRIMA en gouttes oculaire et d'effectuer les premiers essais cliniques sur des patients atteints d'EEC en cours de recrutement. De plus, notre approche représentera une preuve de concept pour d'autres pathologies occulaires (aniridia). Dans le cadre de notre réseau européen sur p63, nous envisageons  que les essais cliniques puissent se faire de manière multicentrique.
Perspectives : Voir ci-dessus
Publications et brevets : Le projet vient de démarrer