Projet ANR-08-BLAN-0244 – RNA Transport : RNA Transport in Plants
Programme : Blanc (BLANC) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : CNRS DELEGATION REGIONALE ALSACE (CNRS DELEGATION REGIONALE ALSACE)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Université de Strasbourg
Montant : 320000.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 36 mois
Résumé : La communication intercellulaire, qui permet la transmission d'informations cruciales pour la spécification de la destinée cellulaire, est un processus biologique primordial dans la coordination du développement des organismes pluricellulaires. Chez les végétaux ce processus met en jeu l'ARN qui voyage au travers des plasmodesmes (PD) et des tissus conducteurs. Ainsi, l'ARN a un rôle de vecteur moléculaire d'informations lors du développement ou d'agent de « RNA silencing ». Les virus à ARN, comme celui bien connu de la mosaïque du tabac (VMT), exploitent la machinerie cellulaire de transport de l'ARN pour répandre l'infection. Ils représentent ainsi un modèle de choix pour élucider ces mécanismes de transport. La dissémination de l'ARN du VMT est dépendante de protéines de mouvement (MP), qui sont codées par le virus. Celles si peuvent donc être utilisées efficacement comme sondes, pour caractériser les voies de transport de l'ARN. De récents progrès ont été effectués sur la compréhension de l'association des MP avec des composants cellulaires de l'hôte et sur le rôle de ces associations dans la dissémination de l'infection. Cependant, la compréhension fine des voies de transport de l'ARN dépend de notre capacité à accéder aux mécanismes du transport de la molécule d'ARN, en le visualisant directement, et non de méthodes indirectes d'imagerie des MP. Notre laboratoire a développé des outils permettant l'observation simultanée des MP et de l'ARN in vivo, mais aussi de marqueurs cellulaires spécifiques dans des tissus végétaux infectés et transfectés. Des études fonctionnelles indiquent que la MP forme des particules mobiles, aussi bien dans les cellules infectées par le VMT que dans des cellules exprimant transitoirement la MP. Des particules mobiles similaires sont aussi observées dans des cellules dont l'ARNm de la MP a été marqué par la GFP. Les MP et l'ARNm correspondant se colocalisent dans les PD, suggérant que ces particules de MP représentent des complexes mobiles dirigeant l'ARNm des MP, mais aussi potentiellement d'autres ARN, vers les PD. En étudiant des cellules exprimant transitoirement les MP et des cellules infectées par le VMT, nous allons déterminer: (i) si les particules de MP observées dans des cellules transfectées sont reliées à la fonction des MP pendant l'infection, (ii) si les particules de MP observées dans des tissus transfectés et infectés contiennent de l'ARN, (iii) si les MP et l'ARN interagissent in vivo (comme cela est suggéré par des études in vitro), (iv) si la fonction des MP est requise pour la l'adressage des molécules d'ARN vers le PD, et (v) les voies cellulaires qui ciblent l'ARN vers les PD (en utilisant des tests impliquant des inhibiteurs spécifiques du cytosquelette et des voies de sécrétions). Par ailleurs, pour améliorer notre capacité à visualiser des ARN spécifiques in vivo et pour étudier leur distribution et leur mobilité, nous allons adopter une démarche pluridisciplinaire avec notre partenaire, afin de développer une technologie qui permettra le marquage in vivo de l'ARN avec des sondes fluorescentes. Cette méthode est basée sur la capacité d'un fluorochrome, le vert de malachite (VM), à décupler sa fluorescence par liaison avec un aptamer spécifique. Le consortium va concevoir et synthétiser des dérivés de VM avec des propriétés améliorées pour des applications sur des tissus vivants, par exemple une fluorescence accrue, une perméabilité membranaire optimisée, une forte sensibilité à l'excitation bi-photonique ou encore une faible toxicité. Les sondes fluorescentes qui auront de fortes affinités pour les aptamers du VM seront testées et appliquées in vitro, et surtout in vivo pour la détection d'ARN comportant un aptamer. Le projet proposé ici combine l'utilisation de techniques de biologie moléculaire de pointe (clonage Gateway, détection d'acides nucléiques basée sur des aptamers, utilisation de mutations sensibles à la température, utilisation de protéines fluorescentes va