Projet ANR-12-BSV8-0011 – FtsH-Thyl-Chlamy : Rôle des protéases FtsH du thylacoïde dans la biogenèse et la dégradation des protéines du chloroplaste dans l’organisme modèle photosynthétique Chlamydomonas reinhardtii
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame CATHERINE DE VITRY (Physiologie Membranaire et Moléculaire du Chloroplaste, CNRS/UPMC UMR 7141)
Partenaires : Physiologie Membranaire et Moléculaire du Chloroplaste
Montant : 310000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : FtsH-Thyl-ChlamyRôle des protéases FtsH du thylacoïde dans la biogenèse et la dégradation des protéines du chloroplaste dans l’organisme modèle photosynthétique Chlamydomonas reinhardtii
Substrats et fonctions régulatrice des protéases FtsH du  thylacoïdeMalgré les efforts croissants de plusieurs équipes, notre connaissance du spectre des substrats et de l’importance physiologique des différentes protéases du thylacoïde reste très limitée. Le rôle des protéases FtsH du thylacoïde dans la biogenèse et la dégradation des protéines du chloroplaste sera étudié dans l'organisme photosynthétique modèle Chlamydomonas reinhardtii. Nous étudierons des mutants de FtsH et des doubles mutants combinant des défauts dans l'activité protéolytique de FtsH et dans d'autres processus de biogenèse ou de protéolyse. Deux types différents de protéase FtsH sont présents dans les membranes de thylacoïdes et ces deux types comprennent plusieurs isoformes dans Arabidopsis. La situation dans Chlamydomonas est beaucoup plus simple de ce point de vue car ces deux types ont seulement un représentant. Nous avons déjà isolés différents allèles mutants de FtsH1 et nous génèrerons des mutants de FtsH2. Les stress sont des conditions adéquates pour mettre en évidence le rôle des protéases et pour identifier leurs substrats. Etant donné que FtsH1 et FtsH2 sont des protéases ancrées dans la membrane du thylacoïde, nous testerons d'abord les complexes photosynthétiques transmembranaires comme substrats dans différentes conditions de stress. En plus que de révéler le rôle des protéases dans le processus global de biogenèse, nous avons montré que ces mutants permettent de sauver des complexes protéiques partiellement assemblés qui sinon sont peu accumulés à cause de leur grande sensibilité aux protéases. En conséquence, les mutants de FtsH sont des outils versatiles pour la compréhension de l'assemblage et de la fonction de l'appareil photosynthétique.
Etude génétique, biochimique et biophysique du rôle des protéases FtsH dy thylacoïdeL’approche génétique dans l’organisme modèle photosynthétique Chlamydomonas (noyau haploïde, phototrophe facultatif, mutants nucléaires et chloroplastiques) permet d’isoler et de combiner des mutants originaux. Notre laboratoire a constitué une collection de mutants de photosynthèse de Chlamydomonas (http://chlamystation.free.fr/) et a développé une instrumentation spectroscopique exceptionnelle pour étudier la photosynthèse par des mesures in vivo par spectroscopie d’absorption optique résolue en temps et de fluorescence. La complémentarité de nos approches incluant génétique, biologie moléculaire, biochimie et biophysique permet la caractérisation approfondie in vivo et in vitro des complexes photosynthétiques.
Résumé de la soumission : Le rôle des protéases FtsH du thylacoïde dans la biogenèse et la dégradation des protéines du chloroplaste sera étudié dans l'organisme photosynthétique modèle Chlamydomonas reinhardtii. Nous analyserons des mutants de FtsH et des doubles mutants combinant des défauts dans l'activité protéolytique de FtsH et dans d'autres processus de biogenèse ou de protéolyse. Deux types différents de protéase FtsH sont présents dans les membranes de thylacoïdes et ces deux types comprennent plusieurs isoformes dans Arabidopsis. La situation dans Chlamydomonas est beaucoup plus simple de ce point de vue car ces deux types ont seulement un représentant. Nous avons déjà isolés différents allèles mutants de FtsH1 et nous génèrerons des mutants de FtsH2. Les stress sont des conditions adéquates pour mettre en évidence le rôle des protéases et pour identifier leurs substrats. Etant donné que FtsH1 et FtsH2 sont des protéases ancrées dans la membrane du thylacoïde, nous testerons d'abord les complexes photosynthétiques transmembranaires comme substrats dans différentes conditions de stress. En plus de révéler le rôle des protéases dans le processus global de biogenèse, nous avons montré que ces mutants permettent de sauver des complexes protéiques partiellement assemblés qui sinon seraient dégradés à cause de leur grande sensibilité aux protéases. En conséquence, les mutants de FtsH sont des outils versatiles pour la compréhension de l'assemblage et de la fonction de l'appareil photosynthétique. En profitant du fait que Chlamydomonas est un unicellulaire, haploïde, phototrophe facultatif et que de nombreux mutants de photosynthèse mutants sont disponibles, nous exploiterons les possibilités de générer et combiner des mutants chloroplastique et nucléaires dans Chlamydomonas.
Résultats : Pour aborder la question du rôle des protéases du chloroplaste dans la biogenèse et la maintenance des protéines de la membrane photosynthétique, nous avons choisi Chlamydomonas comme organisme photosynthétique modèle pour développer un crible génétique de recherche de suppresseurs ayant pour but d’identifier des protéases impliquées dans le contrôle qualité du complexe cytochrome b6f. Nous avons apporté la première démonstration qu’un mutant de la métalloprotéase ATP dépendante FtsH localisée dans le chloroplaste et ancrée dans le thylacoïde contrôle à la fois le recyclage du photosystème II (PSII) et du complexe cytochrome b6f lors de stress lumineux ou nutritionnels. Nous avons utilisé le phénotype très photosensible de ce mutant pour le clonage positionnel et l’identification de la mutation suppresseur. La mutation ftsH1-R420C est une substitution d’un résidu arginine connu comme étant essential pour l’activité ATPase et l’activité protéase de FtsH dans Escherichia coli. La complémentation de cette mutation par l’ADN génomique de type sauvage FTSH1 restaure un phénotype non-photosensible de type sauvage. Nous avons démontré que les complexes cytochrome b6f mal-assemblés sont  dégradés par une voie FtsH-dépendante. Nous avons montré que ce mutant de FtsH ne recycle pas le PSII au cours d’une carence en  phosphate ou en soufre et apporté des éléments en faveur d’une action combinée des protéases  FtsH et probablement Deg dans la dégradation de la sous-unité D1 du PSII en conditions de  photoinhibition et lors d’autres changements environnementaux. Nous avons apporté la première évidence d’une dégradation du PSII lumière-indépendante et médiée par FtsH en carence en soufre dans Chlamydomonas reinhardtii.
Perspectives : Nous proposons une étude basique du rôle des protéases FtsH du thylacoïde dans la biogenèse et la dégradation des protéines du chloroplaste dans l’organisme modèle photosynthétique Chlamydomonas reinhardtii. Cette étude permettra d’identifier d’autres substrats de FtsH, de caractériser les fonctions régulatrices des protéases FtsH du thylacoïde et de disposer de mutants de protéase qui sont des outils versatiles. Le chloroplaste de microalgues semble prometteur pour la production de protéines d’intérêt pharmaceutique et le développement de nouveaux biocarburants. Nos mutants avec une activité protéolytique limitée pourraient être de futurs outils pour générer des systèmes de production originaux.
Publications et brevets : - Sarah Estelle Pousset. Rapport de stage de Master 2 de l’UPMC, soutenu le 20 juin 2013. Rôle de la protéase FtsH du thylakoïde dans le remodelage de la bioénergétique du chloroplaste au cours de la carence en soufre chez Chlamydomonas reinhardtii.
- Alizée Malnoë et al. The FtsH Protease of Chlamydomonas contributes to Photosystem II and Cytochrome b6f Remodelling in Stress Conditions. En préparation.