Projet ANR-10-BLAN-1207 – GREATWALL : Rôle de la kinase Greatwall dans l'entrée et la progression mitotique
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Anna CASTRO (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
Partenaires : Centre de Recherche en Biologie Cellulaire de Montpellier
Montant : 470000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 48 mois
Résumé : Rôle de la kinase Greatwall dans l’entrée et la progression mitotiqueLa mitose ou division cellulaire est incontestablement la phase la plus spectaculaire du cycle cellulaire. Des erreurs dans les différentes étapes de ce processus peuvent conduire à l’aneuploïdie ou à l’instabilité génétique source de proliférations anarchiques et de mort cellulaire. Le projet soutenu par l’ANR, vise à comprendre comment la protéine Greatwall, un régulateur de la mitose récemment découvert, contrôle le cycle cellulaire.
Caractérisation des mécanismes d’action et de régulation de GreatwallLa mitose est très finement régulée par la phosphorylation et la déphosphorylation (addition ou retrait d’un résidu phosphate) de protéines qui assurent le bon déroulement spatio-temporel de cette phase du cycle cellulaire. L’altération de ces processus biochimiques peut provoquer des erreurs mitotiques et la formation de tumeurs. Il est donc fondamental de comprendre les mécanismes de phosphorylation/déphosphorylation pour mettre au point des thérapies ciblées. Nous avons montré précédemment que l’activation de Greatwall induit l’entrée en mitose en régulant négativement l’activité de la protéine phosphatase PP2A responsable de la déphosphorylation des protéines mitotiques. Nous avons également montré que, l’inactivation de Greatwall est aussi nécessaire pour une sortie correcte de cette phase du cycle cellulaire. Il est donc essentiel de comprendre comment Greatwall est activé et inactivé au bon moment du cycle cellulaire et par quel mécanisme elle régule la phosphatase PP2A.  L’objectif de ce projet est donc de caractériser les mécanismes d’action et de régulation de Greatwall.
Méthodologie UtiliséCe travail sera réalisé à partir de cellules en culture et sur des extraits d’oeufs de xénope (crapauds d’Afrique du Sud). Ces oeufs présentent un matériel de choix pour la purification biochimique et pour la caractérisation des modifications post traductionnelles des protéines.De plus, ils ont l’avantage d’être tous synchronisés dans une même phase du cycle cellulaire. Nous avons déjà utilisé ce type d’approche par le passé et nous disposons des outils nécessaires pour l’ensemble des expériences proposées.Nous utiliserons également des cellules en culture. Nous réaliserons des expériences d’élimination o de surexpression de Greatwall et nous analyserons les phénotypes obtenus par des méthodes de microscopie.
Résumé de la soumission : Greatwall (GW) est une protéine kinase nouvellement caractérisée et requise dans les extraits d’œufs de xénope pour l’entrée et la progression mitotique. La perte de Greatwall dans ces extraits, induit une sortie de mitose, ainsi que l’inhibition de l ‘entrée en mitose dans des extraits d’œufs cyclant. Greatwall joue aussi un rôle important dans la progression mitotique chez la drosophile. Des mutations du Greatwall de drosophile induisent une mauvaise condensation des chromosomes et un délai dans la progression du cycle cellulaire. En dépit de son rôle majeur lors de la division cellulaire, peu d’informations sont disponibles au sujet des voies de transduction qui permettent à cette kinase de contrôler le cycle cellulaire. Dans ce projet, nous nous proposons de comprendre comment Greatwall induit et maintient l’état mitotique ainsi que les mécanismes de sa régulation. Nos résultats obtenus dans les œufs de xénope arrêtés en Métaphase II de méiose et les cellules humaines démontrent clairement que Greatwall induit et maintient l’état mitotique en inhibant PP2A, la protéine phosphatase responsable de la déphosphosphorylation des substrats de la kinase Cdk1-cycline B. Toutefois, nos résultats indiquent que cette inhibition est probablement indirecte et implique un troisième partenaire. Au cours de ce projet, nous voulons caractériser les substrats de Greatwall qui sont actuellement inconnus et qui sont probablement des inhibiteurs de la PP2A. De plus, nous allons étudier les différentes voies altérées dans les cellules où Greatwall a été éliminé et qui sont responsables des deux phénotypes majeurs observés dans ces cellules :un défaut de  ségrégation des chromatides sœurs et un défaut du nombre de centrioles. Finalement, puisque Greatwall induit l’entrée et la sortie de mitose, le moment précis de son activation et inactivation est essentiel pour permettre une correcte division cellulaire. Greatwall est phosphorylée lors de l’entrée en mitose et déphosphorylée à la sortie de mitose et ceci en étroite corrélation avec l’activation et l’inactivation de cette kinase. Par conséquent, il est logique de penser que l’activité de Greatwall est régulée par phosphorylation. Un autre objectif majeur de ce projet sera de caractériser les mécanismes qui induisent la phosphorylation et la déphosphorylation de Greatwall. Pour cela, nous déterminerons par spectrométrie de masse et par mutagenèse le rôle de chacun des sites de phosphorylation requis pour l’activation de la kinase et nous identifierons la phosphatase responsable de son inactivation lors de la sortie de mitose.
Résultats : Nous avons pu décrypter de façon détaillée la succession des événements par lesquels Greatwall régule la division cellulaire. Nos résultats montrent que trois protéines différentes participent à ce mécanisme de contrôle. La plus en amont étant Greatwall qui va avoir comme cible finale la phosphatase PP2A et comme intermédiaire la protéine Arpp19. Arpp19, une fois activée par phosphorylation par la kinase Greatwall, va s’associer et inhiber PP2A. PP2A est elle-même responsable de la régulation de protéines essentielles à l’initiation et au maintien de la division cellulaire.
Nous avons également pu montrer que Greatwall est soumise à des phosphorylations et que ces phosphorylations sont nécessaires pour l’activation Greatwall et par conséquent pour l’entre en mitose. Également, nous avons montré que la perte de ces phosphorylations en sortie de mitose est aussi essentielle, puisque la  réactivation de la phosphatase PP2A est requise pour la sortie de cette phase du cycle cellulaire.
Perspectives : Dans une future proche, nous allons nous attacher à la caractérisation des protéines kinases responsables de la phosphorylation de Greatwall lors de l’entrée en mitose et des phosphatases requises pour la déphosphorylation de cette protéine lors de la sortie de cette phase du cycle cellulaire.
Nous allons également essayer de comprendre par quel mécanisme l’association de la protéine Arpp19 à PP2A induit son inhibition.
Ces deux études nous permettront, peut être dans une future proche, de caractériser des drogues qui pourraient cibler spécifiquement cette nouvelle voie de signalisation et donc d’envoyer vers une mort cellulaire les cellules avec une division cellulaire anormale.
Publications et brevets : Publication
Lorca T and Castro A. (2012). The Greatwall kinase: a new pathway in the control of the cell cycle. Oncogene. (In press) (Cette publication correspond à une revue où toute cette nouvelle voie de signalisation qui a été récemment identifie en part par notre laboratoire a été exposée).
 Brevet
Un brevet internationale sur l’identification des nouveaux substrates de la kinase Greatwall a été déposée.