Projet ANR-13-BSV5-0003 – MTaQ : Quantification à haut débit en milieu biologique : Alternative à la Radioactivité
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5) 2013
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Madame Christine Enjalbal (Institut des Biomolécules Max Mousseron)
Partenaires : Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier; Institut des Biomolécules Max Mousseron; Institut des Sciences Analytiques et de Physico-Chimie pour l'Environnement et les Matériaux
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 48 mois
Résumé : Le criblage pharmacologique à haut débit (HTS) s’est imposé comme un outil majeur dans la recherche et l'optimisation de molécules bioactives à visée thérapeutique. Toutefois, la mesure d’interaction entre un récepteur et un ligand nécessite des moyens de détection et de quantification puissants (Ki<10-8M). Le recours au radiomarquage de ligands de référence est souvent incontournable. L’utilisation de la radioactivité reste particulièrement délicate (laboratoire dédié, personnel formé, traitement des déchets) et est donc inadaptée aux stratégies à haut débit qui démultiplient le nombre d’essais et de déchets contaminés. Dans ce contexte, nous voulons développer une méthode générique de détection et de quantification de ligands de référence dans des milieux biologiques complexes à un niveau de concentration égalant les performances de la radioactivité. La spectrométrie de masse, moléculaire ou élémentaire, est une piste particulièrement intéressante dans l’exploration de cette problématique. En effet, cette technique est remarquable pour sa spécificité et sa sensibilité permettant la détection, l’identification et la quantification de biomolécules ou d'éléments chimiques dans des milieux complexes. Une première stratégie, appelée ‘Ligand quantification’, consiste en la conception et synthèse de nouveaux marqueurs chimiques universels qui pourront être liés à de multiples ligands de référence. Ces marqueurs devront favoriser la détection des molécules d’intérêt et permettre leur quantification par marquage isotopique. La seconde partie du projet met en œuvre une stratégie appelée ‘Probe quantification’. Au lieu de quantifier la molécule d’intérêt dans l’échantillon, nous cherchons à doser uniquement un marqueur. La nature chimique du marqueur sera optimisée pour qu’il produise en spectrométrie de masse moléculaire (ESI ou MALDI) un ion caractéristique et spécifique pouvant être obtenu soit par un traitement chimique ou biochimique simple de l’échantillon, soit par une fragmentation dans la source, et en spectrométrie de masse inorganique un élément par atomisation de l'échantillon (ICP-MS). Au contraire des méthodes décrites dans la bibliographie, suivant la nature du marqueur (ion préformé, élément chimique spécifique, exhausteur d’ionisation…), la quantification se fera par introduction d’un marqueur universel à toutes les expériences de dosage en ESI/MALDI-MS et de façon absolue en ICP-MS rendant ces stratégies génériques. Ces méthodes seront mises en œuvre, dans le cadre de tests de liaison compétitifs, sur deux modèles biologiques d’interaction ligand/récepteur (CCKB et MCR1), présentant des protéines membranaires insolubles et des peptides comme ligands naturels. Ensuite, afin d'élargir les perspectives de ce projet, des protéines solubles  (telles que les P38 kinases) seront étudiées comme exemple de systèmes biologiques faisant intervenir, d'une part des protéines solubles et, d'autre part, des ligands naturels qui ne sont plus des peptides mais des petites molécules organiques hétérocycliques. D’un point de vue méthodologique, ce projet fait intervenir la synthèse de nouveaux marqueurs spécifiques pouvant être mis en évidence avec une sensibilité comparable à la radioactivité. Une mise au point très importante en spectrométrie de masse concernera le traitement d’échantillons biologiques, la détection de signaux spécifiques et la quantification de composés au sein d’un mélange. La réussite de ce programme facilitera l’étude des interactions moléculaires en proposant une alternative à la radioactivité sûre et respectueuse de l’environnement pouvant déboucher sur des applications industrielles importantes.