Projet ANR-08-PCVI-0020 – AFF-IDP : Determinants of specificity and affinity in partner recognition by intrinsically disordered proteins
Programme : Programme interdiciplinaire en physique et chimie du vivant (PCV) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : UNIVERSITE AIX-MARSEILLE II  [DE LA MEDITERRANEE]  (UNIVERSITE AIX-MARSEILLE II  [DE LA MEDITERRANEE])
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Aix-Marseille université
Montant : 490000.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 48 mois
Résumé : Des études récentes indiquent que chez les eucaryotes une forte proportion du génome code pour des protéines ou des régions intrinsèquement désordonnées. Les protéines intrinsèquement désordonnées (PIDs) sont des protéines fonctionnelles, dépourvues de structure secondaire et tertiaire stable en conditions physiologiques. Elles sont principalement impliquées dans des fonctions impliquant des interactions avec des partenaires multiples, telles que la reconnaissance moléculaire, l'assemblage moléculaire (et l'amyloïdogenèse), la régulation du cycle cellulaire, la transduction du signal et la transcription. Par conséquent, les PIDs sont impliquées dans le développement de plusieurs pathologies, telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires, et se sont révélées prometteuses en tant que nouvelles cibles potentielles pour la conception rationnelle de médicaments. Une des caractéristiques des PIDs est leur capacité à lier des partenaires multiples tout en préservant la spécificité. Bien que l'on suppose que leur promiscuité soit liée à la grande plasticité conférée par l'absence d'une structure rigide, aucune étude systématique n'a été entreprise à ce jour pour identifier les bases moléculaires de la sélectivité et de l'efficacité de liaison des PIDs. La compréhension des mécanismes moléculaires permettant la reconnaissance spécifique de plusieurs partenaires est donc pertinente pour la santé humaine et contribuera à améliorer notre compréhension des bases moléculaires des interactions protéine-protéine au sein des réseaux protéiques, un objectif ambitieux des efforts actuels dans le cadre de la "biologie des systèmes". L'objectif principal de ce projet est d'identifier les déterminants moléculaires de la spécificité et de l'affinité dans la reconnaissance de partenaires par les PIDs. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons une approche d'évolution in vitro afin de générer de la diversité de séquence au sein d'un domaine intrinsèquement désordonnée. Nous évaluerons ensuite l'impact de ces substitutions sur le partenariat moléculaire et sur la fonction biologique. Le système modèle utilisé dans cette étude sera le domaine C-terminal intrinsèquement désordonné de la nucléoprotéine du virus de la rougeole (NTAIL). Ce domaine, qui subit un repliement a-hélical lors de l'interaction avec le domaine X de la phosphoprotéine (P) du virus de la rougeole (MeV XD), possède une sélectivité vis-à-vis de ses partenaires en dépit de sa capacité à interagir avec plusieurs partenaires. Une banque de mutants de NTAIL sera générée par mutagenèse aléatoire, et les clones ayant un profil d'interaction altéré seront identifiés grâce à une méthode de criblage basée sur la reconstitution de la protéine fluorescente verte (GFP). Après séquençage, des variants de NTAIL seront sélectionnés, purifiés et caractérisés pour leur (in)capacité à interagir avec le "partenaire naturel" (MeV XD), et avec trois protéines modèles qui serviront de partenaires «non-naturels»: le domaine X de P du virus Sendaï (SeV XD), le domaine N-terminal intrinsèquement désordonné de P du virus de la rougeole (MeV PNT), et le domaine de régulation de IRF3 (IRF3-RD). Ces dernières protéines ont été choisies car MeV PNT et IRF3-RD sont de vrais partenaires potentiels de NTAIL dans les cellules infectées et car l'impact fonctionnel de leur interaction avec NTAIL peut être évalué dans un contexte cellulaire. La grande similarité structurale de SeV XD avec MeV XD permettra d'évaluer le rôle spécifique des interactions entre résidus à l'interface protéine-protéine dans le contexte d'une structure 3D identique, et son interaction avec NTAIL pourra également être évalué dans un contexte cellulaire. Les interactions entre les variants NTAIL et leurs partenaires seront étudiées en utilisant une panoplie d'approches spectroscopiques déjà validées par le Partenaire 1, ainsi que la résonance plasmonique de surface et la calorimétrie de titration isothermique. Les complexes entre les v