Projet ANR-12-BS08-0003 – fluometadn : Analyse du mécanisme de méthylation de l’ADN impliquant UHRF1 et DNMT1 par de nouveaux outils en fluorescence
Programme : Blanc - SIMI 8 - Chimie du solide, colloïdes, physicochimie (Blanc SIMI 8)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Yves Mely (Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie)
Partenaires : Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie; Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie
Montant : 485680.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Caractérisation au niveau moléculaire d’un mécanisme de méthylation de l’ADN par de nouveaux outils de fluorescenceCe projet repose sur deux enjeux majeurs interconnectés. Le premier enjeu correspond à la compréhension d’un mécanisme central de méthylation des ADN. Le second concerne le développement d’outils de fluorescence extrêmement sensibles, capables de suivre au niveau moléculaire ce mécanisme de méthylation.
Mécanisme de méthylation et développement de sondes fluorescentesLa méthylation de l’ADN joue un rôle central dans l’épigénétique. Par son implication dans les mécanismes épigénétiques, la protéine DNTM1 constitue une cible pour combattre les cancers, qui sont souvent accompagnés d’une altération du patron de méthylation. La compréhension des mécanismes moléculaires de cette protéine constitue donc un enjeu majeur pour développer de nouvelles stratégies anti-cancer. Grâce à la capacité qu’ont les techniques fondées sur la fluorescence d’atteindre le seuil de détection d’une molécule unique et grâce à l’extrême sensibilité de certains fluorophores à leur environnement, la spectroscopie de fluorescence est une technique de choix pour caractériser ces mécanismes moléculaires et leurs dynamiques. Cependant, cette technique souffre d’un manque de sondes de fluorescence optimisées, capables de suivre de manière sensible, site-spécifique et multiparamétrique les changements conformationnels d’acides nucléiques durant leur interaction avec leurs partenaires protéiques. Dans ce contexte, nous proposons de développer de nouveaux outils basés sur des sondes fluorescentes sensibles à l’environnement pour étudier par des techniques de fluorescence de pointe la dynamique et le mécanisme de la méthylation de l’ADN par le couple de protéines UHRF1/DNTM1, qui joue un rôle clé dans la réplication de l’ADN en transférant le patron de méthylation du brin d’ADN parent au brin d’ADN néo-synthétisé. Par conséquent, la caractérisation des étapes moléculaires impliquées dans la transmission du patron de méthylation devrait i) révéler de nouveaux aspects mécanistiques pouvant être potentiellement ciblés dans des stratégies anti-cancers et ii) suggérer de nouveaux essais pour cribler des molécules anti-cancéreuses.
Développement de nouvelles sondes fluorescentes pour marquer des acides nucléiques.Un des objectifs majeurs de ce projet repose sur la conception et la synthèse de nouveaux analogues fluorescents de nucléosides pour marquer des acides nucléiques. En effet, à l’heure actuelle, on dispose de très peu d’outils pour suivre spécifiquement et de manière site-spécifique des modifications structurales et conformationnelles d’acides nucléiques par des techniques de fluorescence. La raison en est que les analogues fluorescents devant être synthétisés doivent répondre à un cahier des charges très exigeant. En effet, ces analogues doivent s’intégrer dans la séquence d’ADN sans en altérer la structure, doivent présenter de très bonnes propriétés de fluorescence une fois intégrés dans l’ADN, doivent être sensibles à des modifications mineures de leur environnement et présenter une structure chimique capable de résister aux conditions de synthèse des ADN marqués. Dans ce projet, sur la base de résultats préliminaires très prometteurs, nous allons concevoir des analogues fluorescents dérivées des 3-hydroxychromones qui répondent à l’ensemble de ces critères. En outre, pour suivre les interactions des protéines UHRF1 et DNMT1 avec ces ADN marqués par ces composés, nous utiliserons des techniques de pointe en fluorescence, comme la spectroscopie de molécules uniques (qui permet de suivre des molécules individuelles et s’affranchir ainsi des effets de moyenne qui se produisent avec les techniques d’ensemble) et des techniques de fluorescence résolue en temps qui procurent des informations fines sur les environnements individuels de chaque population de molécules en solution.
Résumé de la soumission : De nombreux mécanismes cellulaires tels que la réplication, la traduction, la réparation de l’ADN, la méthylation de l’ADN et le silençage de gènes impliquent des complexes multimoléculaires d’acides nucléiques et de protéines. Grâce à la capacité qu’ont les techniques fondées sur la fluorescence d’atteindre le seuil de détection d’une molécule unique  et  grâce à l’extrême sensibilité de certains fluorophores à leur environnement, la spectroscopie de fluorescence est une technique de choix pour caractériser les mécanismes moléculaires et les dynamiques de ces complexes multimoléculaires. Cependant, cette technique est limitée par la disponibilité de sondes de fluorescence optimisées, capables de suivre de manière sensible, site-spécifique et multiparamétrique les changements conformationnels d’acides nucléiques durant leur interaction avec leurs partenaires protéiques. Dans ce contexte, nous proposons de développer de nouveaux outils basés sur des sondes fluorescentes sensibles à l’environnement de la famille des 3-hydroxychromones (3HC), pour étudier par des techniques de fluorescence de pointe la dynamique et le mécanisme de la méthylation de l’ADN par le couple de protéines UHRF1/DNTM1, qui joue un rôle clé dans la réplication de l’ADN en transferrant le patron de méthylation du brin d’ADN parent au brin d’ADN néo-synthétisé. En outre, du fait de son rôle dans les mécanismes épigénétiques, la protéine DNTM1 a été identifiée comme une cible pour combattre les cancers, qui sont souvent accompagnés d’une altération du patron de méthylation. Par conséquent, la caractérisation des étapes moléculaires impliquées dans la transmission du patron de méthylation devrait i) révéler de nouveaux aspects mécanistiques pouvant être potentiellement ciblés dans des stratégies anti-cancers et ii) suggérer de nouveaux essais pouvant être utilisés pour cribler des molécules anti-cancéreuses. Une première génération d’analogues nucléosidiques fluorescents à base de 3HC a déjà été synthétisée et démontrée comme possédant les propriétés d’une base universelle. Cette génération n’induit qu’une déstabilisation limitée des ADN dans lesquels elle est insérée et répond par un changement du rapport des deux bandes d’émission à la liaison de protéines, donnant ainsi la preuve de concept de notre approche. Ce projet hautement interdisciplinaire à l’interface chimie/biophysique sera mené par deux partenaires hautement complémentaires. Le partenaire 1 est un expert en spectroscopie de fluorescence et en sondes 3HC, ainsi qu’en interactions protéines/acides nucléiques et en protéine UHRF1. Par conséquent, le partenaire 1 sera chargé de la sélection des chromophores 3HC pour le développement d’analogues nucléosidiques fluorescents, de la caractérisation des propriétés photophysiques de ces analogues ainsi que des oligonucléotides fluorescents et de l’étude des étapes moléculaires impliquées dans la méthylation de l’ADN par le couple UHRF1/DNTM1. Le partenaire 2 est spécialisé en chimie organique et médicinale, dans la conception de sondes fluorescentes et la chimie des acides nucléiques. Le partenaire 2 sera chargé de la conception et de la synthèse des nouveaux outils de fluorescence de ce projet et de leur intégration dans des oligonucléotides par synthèse en phase solide.
Résultats : Dans les six premiers mois du projet, une série de séquences ADN modifiées en différentes positions par un analogue nucléotidique fluorescent de première génération ont été synthétisées. Quelques unes de ces séquences ont été caractérisées pour leurs propriétés spectroscopiques et leurs interactions avec le domaine de liaison de la protéine UHRF1. Les résultats préliminaires sont encourageants, car les propriétés de fluorescence de l’analogue nucléotidique s’avèrent sensibles à la méthylation de la séquence marquée et aux changements conformationnels induits par la liaison de la protéine. Si ces données sont confirmées, nous disposerons d’un outil performant et sensible pour suivre en temps réel la méthylation de l’ADN et caractériser les mécanismes moléculaires des protéines UHRF1 et DNMT1 qui agissent de manière concertée dans la réplication de l’ADN en transférant le patron de méthylation du brin d’ADN parent au brin d’ADN néo-synthétisé.
Perspectives : Ce projet à l’interface chimie/biophysique devrait conduire à i) des améliorations majeures dans le suivi des interactions protéines/ADN grâce aux sondes fluorescentes développées, ii) des progrès importants dans la compréhension du mécanisme de méthylation de l’ADN impliquant les protéines UHRF1 et DNMT1, avec un impact potentiel en thérapie anti-cancéreuse et iii) l’obtention de nouveaux outils pour réaliser des criblages à haut-débit et des tests diagnostiques.
Publications et brevets : Le projet n’ayant débuté que depuis six mois, aucune production scientifique ou brevet n’ont pu être produites.