Projet ANR-13-BSV1-0010 – Mouse_Kosto : Redondance et complémentarité de l’ostéopontine et de la sialoprotéine osseuse dans la biologie du squelette – génération et analyse expérimentale de la double extinction génique chez la souris.
Programme : Blanc - SVSE 1 - Physiologie, physiopathologie, santé publique (Blanc SVSE 1)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Luc MALAVAL (Laboratoire de biologie intégrative du tissu osseux)
Partenaires : Santé Ingénierie Biologie Saint-Etienne; Physiopathologie, Diagnostic et Traitements des Maladies Osseuses
Montant : 294999.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 36 mois
Résumé : Génération et analyse expérimentale de la double extinction génique de l'ostéopontine (OPN) et de la sialoprotéine osseuse (BSP) chez la souris.Le programme expérimental est destiné à comparer chez des simple et double KO de la BSP et de l'OPN, (1) le phénotype de base du squelette, (2) sa réponse à un défi expérimental de réparation (ablation médullaire) et (3) à deux défis de stimulation mécanique (vibrations, hypergravité).
Redondance et complémentarité de l’OPN et de la BSP dans la biologie du squeletteLes protéines de la famille des SIBLING (« Small Integrin Binding ligand N-linked Glycoproteins ») sont des composants la matrice extracellulaire osseuse qui jouent un rôle majeur dans la biologie du squelette et en particulier sa compétence biomécanique. Parmi elles, la BSP et l’OPN sont fortement exprimées par les cellules osseuses. Les extinctions géniques de la BSP (BSP-/-) ou de l’OPN induisent des phénotypes osseux différents, suggérant des fonctions distinctes. Toutefois, nos travaux antérieurs ont mis en évidence des compensation/substitutions fonctionnelles au moins partielles entre ces deux protéines (Bouleftour et al., 2015), qui compliquent la compréhension de leurs rôles respectifs dans la physiologie osseuse. La génération de souris double-KO pour ces protéines fournit un outil précieux pour anayser ces questions.
Usage de TALEN pour générer une double extinction de gènes situés sur le même locus et analyse du phénotype osseux des mutants1 / les souris présentant une double exticntion (DE) des gènes de l'OPN et de la BSP (Spp1-/-Ibsp-/-) ont été générées par injection de TALE nucleases (TALEN) dans des ovules de souris fécondées in vitro puis implantées (FIVETTE)2/ L'exploration du phénotype squelettique des souris mutantes s'effectue par microtomographie, imagerie vasculaire, hsitomorphométrie, cytométrie, immunohistochimie et QRT-PCR3/ La capacité des lignées de souris à réparer leur os sera analysée dans un modèle d'ablation de la moelle4/Les effets de la stimulation mécanique seront analysés avec des plaques vibrantes et un dispositif de centrifugation générant une hyper gravité.4/ L'effet des des mutations sur la composition de la matrice minéralisée et ses propriétés biomécaniques, ainsi que l'impact de l'hypergravité sur ces paramètres, seront analysés par tests de résistance (4 point bending), FTIRM, microradiographie quantitative et biochimie.
Résumé de la soumission : De multiples facteurs, systémique et locaux, concourent à la compétence biomécanique de la matrice osseuse minéralisée, qui est un déterminant majeur de la qualité de l'os. Les composants de la matrice jouent ici un rôle clé, et en particulier les protéines de la famille des SIBLING  (Small Integrin-Binding LIgand, N-linked Glycoproteins). Parmi ceux-ci, la sialoprotéine osseuse (BSP) et l'ostéopontine (OPN) sont fortement exprimés par les ostéoblastes, les chondrocytes hypertrophiques et les ostéoclastes. De simples extinctions (knock-out, KO) de leurs gènes respectifs ont démontré que ces deux facteurs étaient des régulateurs clés du processus de formation osseuse, de la minéralisation et du remodelage, avec des ensembles de fonctions distinctes, bien que se chevauchant partiellement. Toutefois, compte tenu des similitudes de structure de la BSP et de l'OPN et de leur co-expression dans différents types cellulaires, des substitutions fonctionnelles partielles et/ou des effets de compensation dans un seul modèle de KO par la protéine apparentée sont toujours possibles, et empêchent la bonne compréhension de la redondance et de la complémentarité de leurs rôles dans le métabolisme osseux et la résistance mécanique. De fait, l'étude des fonctions des SIBLING à travers l'analyse indépendante de chaque gène a atteint ses limites, et la compréhension de l'interaction entre ces facteurs exige maintenant la réalsiation de ciblages géniques multiples.Notre objectif dans ce projet est donc d'analyser des souris présentant une extinction double (DE) de l'OPN (gène Spp1) et de la BSP (gène Ibsp), et de décrire son effet sur la biologie du squelette grâce à de multiples approches expérimentales, en les comparant avec ceux d'extinctions uniques de chaque gène (BSP-/- et OPN-/-), générées sur le même fond génétique. Nous utiliserons pour ces travaux une lignée de souris BSP-/- générée sur un fond mixte non consaguin (129sv/CD1), ainsi que des souris produites par le consortium EUCOMM sur le fond C57-BL/6, qui affichent une insertion dans le premier intron du gène Ibsp, laquelle éteint son expression (BSPtme1). En utilisant la mutagenèse ciblée avec des TALEN, nous allons réaliser un KO du gène Spp1par injection dans des ovules fécondées BSP-/- et BSPtme1, puis générer à travers un programme de génotypage et de reproduction, des souris n'exprimant ni BSP ni OPN (souris DE), ainsi que simples OPN-/- sur le même fond génétique que le DE. Les lignées de souris seront ensuite utilisées pour étudier impact d'une mutation simple et double de l'OPN et BSP sur les principaux aspects de la biologie, la physiologie du squelette et la fonctionnalité du squelette, à savoir (a) le remodelage osseux et (b) le microenvironnement osseux (vascularisation, hématopoïèse), et leur réponse aux défis : (c) ablation de la moelle osseuse et (d) contrainte mécanique. La structure de la matrice osseuse et la composition de la matrice minéralisée (e) ainsi que ses propriétés biomécanique (f ) seront égélement analysées en conditions de base et quant à leur réponse à une contrainte mécanique intense (hypergravité). Ce projet sera réalisé par deux laboratoires qui ont déjà collaboré ces dernières années à l'élucidation du phénotype des souris BSP-/- et maîtrisent collectivement la diversité des compétences nécessaires à cette entreprise. L'ensemble de ce travail constituera une percée dans l'élucidation des rôles respectifs des SIBLING, qui apparaissent de plus en plus comme des régulateurs majeurs du métabolisme osseux et minéral, et qui sont aussi impliqués dans un nombre croissant d'autres mécanismes physiologiques.
Résultats : Les souris DE atteignent l’âge adulte et sont fertiles, montrant que la double extinction d’OPN et de BSP n’est pas létale.  Elles présentent une morphologie normale, mais une taille et un poids plus faible que les souris sauvages, comme c’est le cas pour les BSP-/- (Malaval et al., 2008) mais pas pour les OPN-/-.
L'analyse microtomographique des os des souris DE a montré qu'elles présentaient un volume trabéculaire (BV/TV) plus bas que celui des souris sauvages, alors que celui des BSP-/- est plus élevé (Malaval et al., 2008). La densité minérale de l'os cortical des souris DE est plus faible que celle de sauvages, comme pour les BSP-/-.
Perspectives : La densité minérale plus basse des DE est contre intuitive, car l'OPN est un facteur inhibant la minéralisation. Elle témoigne d'interactions complexes entre BSP et OPN dans la mise en place du minéral osseux, et justifie de l'intérêt du modèle pour leur étude.
Ce travail en cours débouchera sur une meilleure compréhension des rôles respectifs dans la biologie du squelette de l'OPN et la BSP, deux membres d'une famille, les SIBLING, dont l'apparition évolutive coincide avec le développement de l'os endochondral.
Publications et brevets : L'obtention des souris DE a fait l'objet d'une communication orale aux 16ièmes JFBTM, Limoges, 14-16 mai 2014 et d'une communication affichée au «12th Transgenic Technology Meeting«, à Edimbourg, les 6-18 octobre 2014.