Projet ANR-10-BLAN-1322 – BORNA-PHOSPHO-PATH : La phosphoprotéine du Bornavirus : un déterminant majeur du transport axonal du virus et de  l'interférence virale avec le fonctionnement neuronal ?
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Microbiologie, immunologie, infectiosité (Blanc SVSE 3)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Daniel GONZALEZ-DUNIA (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE - Délégation régionale Midi-Pyrénées Limousin)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 400000.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : Analyse des rôles d'une protéine exprimée par un virus dans la perturbation du fonctionnement des neuronesEn tant que parasites obligatoires les virus ont développé des stratégies leur permettant d'optimiser leur survie. Pour les virus persistant dans le cerveau, il est essentiel de se multiplier en préservant la viabilité des neurones, qui sont des cellules peu renouvelables. Nous voulons comprendre comment des protéines exprimées par ces virus durant cette phase de persistance peuvent perturber le fonctionnement des neurones infectés et être responsables de troubles comportementaux ou cognitifs.
Mécanismes et conséquences de la persistance virale dans le cerveauEn utilisant le Bornavirus, un modèle de virus persistant, tenter de mieux comprendre comment la phospho-protéine de ce virus peut perturber le fonctionnement neuronal en interagissant spécifiquement avec certaines voies métaboliques importantes pour le fonctionnement normal des neurones. Analyser également si certains facteurs qui sont produits par le virus afin de prolonger sa réplication dans les neurones ne pourraient pas être «détournés« afin de protéger plus généralement les neurones lors de pathologies neurodégénératives.
Analyses expérimentales en culture cellulaire ou chez la sourisNous utilisons diverses approches afin d'étudier l'impact des protéines virales isolées sur les neurones. Nous utilisons des méthodes de transfert de gène (voir illustration) appliquées à des primo-cultures de neurones ou directement dans le cerveau des souris. Nous analysons ensuite les effets de l'expression de ces protéines, soit au niveau moléculaire soit au niveau comportemental en soumettant les souris à des analyses comportementales classiques.
Résumé de la soumission : Le Bornavirus (ou BDV) constitue un modèle de choix pour l'étude des mécanismes par lesquels les virus peuvent persister dans le cerveau et induire des troubles du fonctionnement neuronal sans inflammation ou destruction cellulaire associée. Récemment, nous avons montré que l'infection de cultures primaires de neurones par le BDV interférait avec la réponse à certains protocoles de stimulation, sous-tendant un défaut d'apprentissage des neurones. Ce blocage a été corrélé à une inhibition de la signalisation dépendant de la protéine kinase C (PKC). En outre, le déterminant viral majeur impliqué est la phosphoprotéine (P), qui représente un exemple original de protéine virale interférant avec le fonctionnement synaptique. Notre hypothèse de travail est que la protéine P, qui est phosphorylée par la PKC, interfère avec la phosphorylation des substrats neuronaux de la PKC, provoquant des défauts du fonctionnement neuronal. Par ailleurs, des virus recombinants comportant des mutations de la protéine P se caractérisent par une cinétique de dissémination virale ralentie, suggérant que la P joue aussi un rôle important dans le transport axonal du virus. Sur la base de ces résultats, nous proposons une approche combinant virologie et neurobiologie, grâce à la collaboration entre quatre équipes d’expérience complémentaire. Notre objectif est de préciser les mécanismes du blocage de la PKC lié au BDV ainsi que ses conséquences sur l'activité synaptique, la dissémination virale et le comportement. Ce projet, divisé en quatre tâches, s’attachera tout d’abord à poursuivre l'analyse du phénotype de virus recombinants produits par génétique inverse dans des cultures primaires de neurones. Nous évaluerons aussi leurs propriétés électrophysiologiques sur réseau de microélectrodes (Tâche 1). En parallèle, nous utiliserons des vecteurs lentiviraux exprimant la protéine P afin d'étudier ses effets en dehors du contexte viral (Tâche 2). Ces vecteurs lentiviraux permettront d'obtenir une expression à long terme des formes sauvage et mutée de la P dans les neurones, avec une grande efficacité. Après transduction neuronale, nous analyserons les effets sur la signalisation médiée par la PKC. Nous étudierons ensuite les conséquences de l'expression de la P sur l’activité électrique de réseaux neuronaux. Enfin, nous étudierons les effets de la protéine P sur le comportement après injection stéréotaxique des vecteurs lentiviraux dans l’hippocampe de rats. Par ailleurs, nous testerons l’hypothèse selon laquelle l’interférence de la P avec la voie de signalisation dépendant de la PKC pourrait permettre de protéger les neurones contre certains stress neurodégénératifs (Tâche 3). Enfin, nous analyserons les modalités du transport rétrograde des virus recombinants, grâce à l'utilisation de cultures de neurones primaires compartimentalisés en chambres de culture microfluidiques. Nous avons récemment construit des virus portant de plus une étiquette tetracystéine, facilitant leur suivi en microscopie en temps réel (Tâche 4). Ce projet de recherche pluridisciplinaire devrait permettre d'appréhender les mécanismes par lesquels un virus peut provoquer des troubles du fonctionnement neuronal et du comportement, ainsi que de préciser la contribution réelle de la protéine P, y compris en dehors du contexte viral, dans les troubles du comportement associés au BDV. Nous espérons obtenir des informations nouvelles et pertinentes sur les mécanismes de l'interférence du BDV avec le fonctionnement neuronal, en particulier dans la signalisation médiée par la PKC dans le cerveau et sur ses effets sur l'activité de réseaux de neurones. Dans ce contexte, il faut rappeler que les travaux démontrant des changements dans la signalisation médiée par la PKC dans le cerveau de patients souffrant de schizophrénie ou de troubles bipolaires.
Résultats : Nous avons confirmé que la phospho-protéine virale bloque la voie de la protéine kinase C, une voie importante dans la régulation du fonctionnement neuronal. Chez la souris, ce blocage se traduit par un comportement d'anxiété chronique et des défauts d'apprentissage. Par ailleurs, un autre déterminant viral semble protéger les neurones contre des stress neuronaux qui caractérisent des maladies telles que la maladie de Parkinson.
Perspectives : Notre objectif immédiat est d'achever la description précise des effets de cette phospho-protéine virale sur l'homéostasie neuronale. Par ailleurs, ce programme permet d'envisager le développement d'un projet visant à montrer que certains produits dérivés de ce virus pourraient être utilisés afin de protéger les neurones au cours de maladies neurodégénératives.
Publications et brevets : Plusieurs publications dans des journaux scientifiques sont en cours de rédaction et décrivent l'impact de l'expression de ces protéines virales sur le fonctionnement des neurones ou sur le comportement d'animaux manipulés. Par ailleurs, un brevet décrivant le potentiel neuroprotecteur d'un déterminant du virus est en cours de dépôt.