Projet ANR-10-BLAN-1228 – DROSOGUT : Homéostasie de l'épithélium intestinal au cours d'une infection bacterienne par Serratia marcescens chez la drosophile
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Dominique FERRANDON (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ALSACE)
Partenaires : CNRS UPR 9022  CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ALSACE
Montant : 350000.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 48 mois
Résumé : Comment l'intestin se répare-t-il après une attaque microbienne?La défense de l'hôte contre les infections microbiennes se fait selon deux dimensions complémentaires: la résistance, c'est-à-dire l'attaque du pathogène par le système immunitaire, et l'endurance/tolérance, qui est la capacité de l'hôte à subir et réparer dans une certaine mesure les dommages provoqués par le pathogène, ou la propre réponse immunitaire de l'hôte. Nous étudions cette problématique dans un modèle d'infection intestinale d'un organisme génétique-modèle, la drosophile.
L'approche génétique pour comprendre les mécanismes de régulation de l'intégrité intestinale.	Nous utilisons la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster comme un organisme génétique modèle pour comprendre la défense de l'hôte contre les infections. La réponse immunitaire humorale systémique a été étudiée en détail à l'aide de microorganismes non pathogènes. Au contraire, nous avons développé un modèle d'infection intestinale avec la bactérie entomopathogène Serratia marcescens. Le tube digestif est soumis à de multiples attaques par cette bactérie pathogène, dont une toxine capable de percer des trous dans les membranes qui délimitent les cellules de l'intestin. Dans un contrat ANR précédent, nous avons montré que les défenses de l'hôte contre de telles infections prennent place à au moins deux niveaux : 1) une réponse immunitaire locale au niveau de l'épithélium intestinal qui fait intervenir une des voies qui contrôle l'expression de peptides antimicrobiens lors de la réponse systémique, 2) la phagocytose par des hémocytes des bactéries qui ont réussi à traverser la barrière intestinale. Nous avons réalisé le premier crible à l'échelle d'un génome entier dans lequel nous avons identifié les gènes requis pour une survie améliorée ou diminuée. Nous avons identifié ainsi près de 160 gènes qui interviennent au niveau de l'épithélium intestinal, sans que leur fonction exacte dans ce processus soit comprise. Nous avons aussi découvert que l'apoptose massive des entérocytes induite par l'infection est compensée par la prolifération de cellules-souches intestinales (CSI). La défense de l'hôte ne se limite donc pas aux voies classiques de la réponse immunitaire mais implique également l'homéostasie de l'épithélium intestinal, un mécanisme de «tolérance«. Il est vraisemblable que des dysfonctionnements à ce niveau puissent être à l'origine de maladies coliques.Les objectifs sont d'identifier et d'étudier les fonctions de certains gènes dans ces processus de maintien de l'intégrité du fonctionnement du tube digestif.
Des approches multiples pour comprendre l'endurance/tolérance de l'hôteUne première approche consiste à étudier en détail les différentes phases de l'infection à l'aide de plusieurs techniques de microscopie, en particulier la microscopie électronique. Une deuxième approche consiste à mesurer l'expression des gènes à des étapes clés de l'infection: dégradation de l'épithélium et différentes étapes de la réparation du tube digestif. Finalement, une autre approche consiste à déterminer quel processus est affecté lorsque certains gènes sont mutés, par exemple ceux dont l'expression est modifiée au cours de l'infection et ceux identifiés préalablement au cours d'un crible génétique ayant ciblé le génome entier.
Résumé de la soumission : La réponse de l'hôte à l'infection recouvre deux dimensions distinctes : d'une part, la réponse immunitaire attaquant le pathogène, et d'autre part, la capacité de l'hôte à soutenir et réparer les dommages causés soit par l'infection, soit par la réponse immunitaire elle-même. Ainsi, les défenses de l'hôte comprennent les deux facettes complémentaires de la résistance et de la "tolérance" à l'infection. Alors que la première est étudiée intensivement, la seconde demeure plutôt mystérieuse.	Nous utilisons la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster comme un organisme génétique modèle pour comprendre la défense de l'hôte contre les infections. La réponse immunitaire humorale systémique a été étudiée en détail à l'aide de microorganismes non pathogènes. Au contraire, nous avons développé un modèle d'infection intestinale avec la bactérie entomopathogène Serratia marcescens. In fine, les mouches succombent apparemment à des dommages irréversibles du tube digestif. Dans un contrat ANR précédent, nous avons montré que les défenses de l'hôte contre de telles infections prennent place à au moins deux niveaux : 1) une réponse immunitaire locale au niveau de l'épithélium intestinal qui fait intervenir une des voies qui contrôle l'expression de peptides antimicrobiens lors de la réponse systémique, 2) la phagocytose par des hémocytes des bactéries qui ont réussi à traverser la barrière intestinale. Nous avons réalisé le premier crible à l'échelle d'un génome entier dans lequel nous avons identifié les gènes requis pour une survie améliorée ou diminuée. Nous avons identifié ainsi près de 160 gènes qui interviennent au niveau de l'épithélium intestinal, sans que leur fonction exacte dans ce processus soit comprise. Nous avons aussi découvert que l'apoptose massive des entérocytes induite par l'infection est compensée par la prolifération de cellules-souches intestinales (CSI) sous le contrôle de la voie JAK-STAT. La défense de l'hôte ne se limite donc pas aux voies classiques de la réponse immunitaire mais implique également l'homéostasie de l'épithélium intestinal, un mécanisme de "tolérance". 	Dans ce projet, nous proposons quatre objectifs pour approfondir notre modèle. Un premier objectif consiste à fournir une vue détaillée au niveau transcriptomique des différentes phases de l'infection. Ceci sera réalisé de manière complémentaire à une analyse systématique des 160 gènes candidats mis en évidence lors du programme précédent. Cette analyse nous amènera à nous concentrer sur un faible nombre de gènes qui seront alors étudiés intensivement. Notre deuxième objectif est de comprendre les mécanismes mis en jeu lors des divisions rapides des CSI en se concentrant plus particulièrement sur un gène candidat qui semble requis spécifiquement pour ces divisions rapides. Nous aborderons aussi la problématique de la différenciation des CSI en entérocytes en testant une hypothèse originale découlant de nos résultats préliminaires. Notre troisième objectif sera d'atteindre une compréhension globale in vivo du mode de fonctionnement de la voie JAK-STAT dans les processus de prolifération et de différenciation des CSI. Finalement nous tâcherons de savoir si la morphologie des CSI joue un rôle fonctionnel dans le maintien de l'homéostasie de l'épithélium intestinal. 	Nous visons à comprendre de manière détaillée les processus mis en jeu lors de la régénération intestinale et à appréhender le mode de régulation de la voie JAK-STATqui semble si simple. Etant données les similitudes au niveau moléculaire entre les épithélia intestinaux de la drosophile et ceux des mammifères, nous espérons que nos travaux permettront d'éclairer d'une lumière nouvelle la physiologie de l'épithélium intestinal pendant l'inflammation et la genèse de cancers. L'étude du gène candidat pour la prolifération rapide des CSI sera peut-être pertinente pour d'autres processus similaires, tels les cancers pulmonaires à petites cellules.
Résultats : Nous avons démontré l'existence d'une phase précoce de l'infection causée essentiellement par une toxine bactérienne, l'hémolysine de Serratia marcescens. Celle-ci conduit à une attaque rapide de l'épithélium intestinal, lequel se répare en quelques heures d'une manière tout-à-fait remarquable: les cellules ne sont pas tuées mais perdent une partie importante de leur volume et montre des signes importants de stress, en particulier au niveau de leurs centrales énergétiques, les mitochondries. Ces résultats ont été obtenus en utilisant une technique originale de microscopie électronique dans laquelle les intestins disséqués sont introduits dans des tubes capillaires en plastique. Dans une étape plus tardive de l'infection, le stade chronique, les cellules de l'épithélium tuées sont remplacées par la prolifération induite des cellules-souches intestinales.
Nos résultats mettent en évidence plusieurs types de réponses au niveau  cellulaire à l'attaque de l'hémolysine, en particulier en ce qui concerne l'expression modifiée de certains gènes. De manière intéressante, il apparaît que près de la moitié des gènes que nous avons testé (en raison de leur fonction proposée, de leur expression altérée ou de leur identification lors de notre crible génétique) sont requis, au moins partiellement, pour réparer les dommages causés par la toxine bactérienne. Une étude plus poussée de certains d'entre eux est en cours.
Perspectives : Notre corps contient plus de bactéries dans le tube digestif que de cellules humaines dans l'organisme entier. Pourtant, une simple monocouche de cellules épithéliales nous protège efficacement contre une intrusion par ces bactéries formant notre microbiota ou alors contre des bactéries pathogènes ingérées lors d'intoxications alimentaires. Nos travaux portent sur des gènes de drosophile qui ont été conservés au cours de l'évolution car ils devaient déjà, pour certain d'entre eux, assurer une fonction similaire chez l'ancêtre commun de l'homme et de la mouche, il y a plus de 600 millions d'années. Même s'il s'agit de temps éloignés, cet organisme ancestral était déjà soumis aux mêmes contraintes car il vivait dans un monde déjà dominé par les microorganismes. Ainsi, nos travaux devraient éclairer d'un jour nouveau les mécanismes permettant de réparer l'intestin, à l'instar de travaux antérieurs sur la drosophile qui ont permis de mieux comprendre notre propre développement (ainsi que celui des cancers) et notre immunité innée (Prix Nobel 1995 et 2011).
Publications et brevets : Pas de publication scientifique pour l'instant, mais exposé de nos travaux dans plusieurs conférences internationales en Europe, Afrique et Amérique.