Projet ANR-13-ADAP-0009 – ReguloMobile : Identification de paramètres environnementaux affectant la dynamique d'éléments génétiques mobiles impliqués dans la dissémination de résistances aux antibiotiques
Programme : Adaptation - des gènes aux populations. Génétique et biologie de l'adaptation aux stress et aux perturbations (BIOADAPT 2013)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Christophe MERLIN (Laboratoire de Chimie Physique et Microbiologie pour l'Environnement (LCPME), UMR 7564 CNRS - Université de Lorraine)
Partenaires : Laboratoire de Chimie Physique et Microbiologie pour l'Environnement; Anti-Infectieux : Supports Moléculaires des Résistances et Innovations Thérapeutiques
Montant : 277908.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 42 mois
Résumé : Identification de paramètres environnementaux affectant la dynamique d'éléments génétiques mobiles impliqués dans la dissémination de résistances aux antibiotiques	L'émergence et la dissémination de l’antibiorésistance chez les bactéries sont reconnues pour suivre la consommation en antimicrobiens. Démontrer le transfert de gènes dans l’environnement est techniquement difficile en limitant donc l’exploration. Nous proposons de repousser la limite de nos connaissances concernant le transfert de gènes et l'adaptation bactérienne aux antibiotiques, avec une approche basée sur la régulation de gènes impliqués dans le transfert des éléments génétiques mobiles.
Comprendre la dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques à travers l’expression de fonctions de mobilité d’éléments génétiques mobiles.	Le but du projet ReguloMobile est de comprendre la dynamique des éléments génétiques mobiles impliqués dans le transfert de gènes de résistance aux antibiotiques dans l'environnement. L'accent est mis sur deux paramètres proposés à plusieurs reprises comme des éléments clés de la dissémination de la résistance aux antibiotiques: les antibiotiques en concentrations sub-inhibitrices et la vie en mode biofilm. Dans le contexte actuel, où notre compréhension de la dissémination de l’antibiorésistance dans l’environnement repose sur des évidences rétrospectives, nous avons clairement fait le choix d’explorer une approche plus directe reposant sur la régulation de gènes pour identifier les paramètres environnementaux modulant les fonctions de mobilité des éléments génétiques mobiles.	Les objectifs du projet ReguloMobile sont multiples : (1) Elaborer des biosenseurs dédiés à l'identification des conditions d'activation des fonctions de transfert d’éléments génétiques mobiles ; (2) Cribler une batterie d’antibiotiques pour leur implication dans la stimulation de fonctions de transfert d'éléments mobiles, notamment à de faibles concentrations ; (3) Localiser l'expression des gènes de transfert dans les structures de biofilms ; (4) Corréler l'expression de fonctions de mobilité et la dissémination de gènes dans des matrices environnementales en utilisant un élément mobile modèle ; (5) Mettre en place les bases d'un nouvel outil diagnostique reposant sur des biosenseurs bactériens pour identifier des « hotspots » environnementaux de dissémination de gènes.
Identification de conditions régulant les fonctions de mobilité d’éléments génétiques mobiles.	Avec le projet ReguloMobile, nous nous proposons d'évaluer différents antibiotiques pour leur aptitude à moduler l'activité de promoteurs d’éléments génétique mobiles fusionnés à des gènes de luminescence. Lorsque des antibiotiques modulateurs sont identifiés (et leurs concentrations actives définies), ils sont étudiés plus en détails, en combinaison avec une matrice environnementale, afin d'évaluer leur efficacité dans un contexte environnemental.	Les biofilms microbiens ont été proposés à plusieurs reprises comme des « hotspots » susceptibles de promouvoir la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques parmi les microorganismes. Les fusions promoteurs-gènes lux construits sont également utilisées pour identifier les promoteurs d’éléments génétiques mobiles spécifiquement modulés par le mode de vie en biofilm. L'expression des promoteurs modulés est étudiée plus avant dans les réacteurs à biofilm dédiés permettant d’imager l'expression de promoteurs dans les différentes parties du biofilm.	Des analyses de séquences détaillées avec des outils bioinformatiques dédiés sont utilisées pour fournir des informations de base concernant les limites des promoteurs étudiés et identifier des boîtes/boucles de régulation prédictives capables d'expliquer la façon dont les antibiotiques modulateurs pourraient promouvoir la mobilité des éléments génétiques mobiles à l’échelle moléculaire.
Résumé de la soumission : L’émergence et la dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques sont reconnues comme une conséquence de la consommation d’antibiotiques, mais ce n’est que récemment que la gravité de la situation a été considérée par diverses organisations. Ceci a conduit à la mise en place de recommandations, dans les domaines de la santé et de l’élevage, pour un meilleur contrôle des prescriptions afin de réduire l’adaptation bactérienne aux antibiotiques. Cependant, les rejets continus d’antibiotiques et de bactéries résistantes dans l’environnement soulèvent des inquiétudes sur l’éventualité de « hot spots » environnementaux de dissémination de gènes de résistance.	Démontrer le transfert de gènes dans des matrices environnementales est techniquement difficile, ce qui limite le champ des investigations possibles lorsque l’on explore des environnements pour leur propension à favoriser la dissémination de résistance aux antibiotiques. Dans ce projet, nous proposons de repousser les limites de nos connaissances sur le transfert de gènes et l’adaptation bactérienne aux antibiotiques en utilisant une approche centrée sur la régulation de l’expression de gènes impliqués dans le transfert d’élément génétiques mobiles. Trois questions fondamentales seront posées : (1) peut-on identifier des concentrations d’antibiotiques pertinentes d’un point de vue environnemental et qui soient capables de moduler la mobilité l’éléments génétiques mobiles ? (2) Est ce que ces antibiotiques sont toujours effectifs dans des structures de type biofilms microbiens majoritairement rencontrés dans l’environnement ? (3) Est ce que ces antibiotiques restent effectifs pour stimuler la mobilité d’éléments génétiques mobiles en conditions environnementales ?	Pour répondre à ces questions nous proposons une nouvelle approche basée sur l’utilisation de biosenseurs afin d’identifier des paramètres ou conditions environnementales modulant l’expression des fonctions de mobilité d’un panel d’éléments mobiles. Le programme scientifique proposé se divise en trois tâches interconnectées. (1) Cinquante promoteurs, dirigeant l’expression de fonctions de mobilité (transposition, intégration, conjugaison,...) de différents types d’éléments mobiles, seront fusionnés à des gènes lux pour construire un panel de biosenseurs. L’analyse détaillée de leurs séquences devra préciser leurs limites et fournir des prédictions relatives à leur implication dans des circuits de régulation. (2) Les biosenseurs obtenus seront exposées à divers antibiotiques afin d’identifier lesquels modulent l’expression des fonctions de mobilité sélectionnées et à quelles concentrations. (3) La modulation des biosenseurs sera également étudiée en biofilm, un mode de vie supposé favoriser le transfert de nombreux éléments mobiles. Les conditions identifiées comme modulant l’activité des biosenseurs seront évaluées pour leur influence sur la dissémination de l’élément modèle pB10, dans des matrices environnementales maintenues en microcosmes, en utilisant des méthodes moléculaires déjà mises au points par l’un des partenaire. Les résultats obtenus devront valider (ou non) la pertinence et l’utilité de l’approche biosenseur développée pour du criblage environnemental. 	En dehors de l’acquisition de connaissances fondamentales sur le transfert de gènes en conditions environnementales, le projet ReguloMobile devrait permettre de mettre en place les bases d’une nouvelle approche utilisant des biosenseurs afin de cribler des environnements/conditions pour leur propension à soutenir le transfert de gènes, et donc identifier des « hot-spots » environnementaux de dissémination de gènes.
Résultats : Des séquences d’éléments génétiques mobiles provenant de bactéries à Gram positif et à Gram négatif ont été analysées, permettant d’identifier une sélection de 76 promoteurs possiblement impliqués dans l’expression de fonctions de mobilité. Parmi eux, environ 70 ont été clonés avec succès en amont de gènes lux dans des vecteurs permettant d’exprimer une bioluminescence en fonction du niveau d’activité des promoteurs impliqués. Ces constructions ont été introduites dans un panel d’hôtes bactériens adaptés ayant conduit à la construction de 133 biosenseurs.
	Ces biosenseurs ont été exposés à différentes concentrations d’un panel de 48 antibiotiques balayant toutes les classes connues de ces antimicrobiens. L’activité des promoteurs exposés, évaluée par mesure de bioluminescence, a d’ores et déjà permis d’identifier deux types de profils : (1) des groupes de promoteurs présentant un même profil d’induction pour un ou plusieurs antibiotiques, et (2) des séries d’antibiotiques ayant les mêmes effets sur l’induction de promoteurs.
Perspectives : Suite aux premiers résultats obtenus concernant la réactivité des promoteurs aux antibiotiques, les perspectives immédiates s’orientent vers l’analyse et la comparaison des séquences promotrices impliquées pour dégager des points communs pouvant suggérer des schémas de régulation conservés avec des régulateurs apparentés.
	 Le projet entre maintenant dans une deuxième phase consistant à évaluer l'activité des promoteurs régulés dans les différentes couches de biofilms bactériens.
Publications et brevets : aucune