Projet ANR-10-BLAN-1222 – IMAGenEx : Imagerie de l’expression génétique dans la cellule
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2) 2010
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur edouard BERTRAND (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; École normale supérieure de Paris; Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier
Montant : 550000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : L’expression des gènes est un processus biologique fondamental qui a fait l’objet de décennies d’études génétiques et biochimiques. Alors que les machineries impliquées sont bien caractérisées du point de vue biochimique et structural, on comprend mal comment ce processus se déroule réellement dans les cellules. Bien que relativement récentes, les techniques d’imagerie sur cellules vivantes ont révélé de nombreux résultats inattendus. Par exemple, il est apparu que la transcription est un processus discontinu, dans lequel des gènes individuels oscillent entre des états «allumés» et «éteints», conduisant notamment à la notion de «bruit transcriptionnel». Plus généralement, compte tenu du faible nombre de molécules impliquées (1 ou 2 séquences d’ADN, quelques molécules d’ARN), tous les processus intervenant dans l’expression des gènes doivent être compris au niveau des molécules uniques. Un défi majeur est donc de mesurer l’activité de machineries moléculaires uniques dans leur contexte cellulaire.
Les techniques pour mesurer les molécules d’ARN et d’ADN à l’échelle cellulaire existent, mais dans ce projet nous comptons réaliser un bond technique pour mesurer positions et distances avec une résolution de 10-20 nm, et caractériser des molécules uniques. Nous mettrons en commun notre expertise distincte pour développer et appliquer les outils nécessaires pour répondre à trois questions centrales :
Premièrement, nous analyserons la topologie des ANR messagers (ARNm), pour déterminer s’ils sont compacts, allongés, ou circulaires. Hormis le fait que l’ARNm est circularisé pour initier la transcription, peu de données sont disponibles sur sa topologie. Nous mesurerons la distance entre les extrémités 5’ et 3’ d’ARNm rapporteurs dans des cellules fixées, et entre une extrémité et le milieu. Ceci indiquera si la forme de l’ARNm dépend de sa localisation intracellulaire et répondra à plusieurs sous-questions : l’ARNm est-il plus compact dans le nucléoplasme pour faciliter sa diffusion ? Est-il déplié pour traverser le pore ou passe-t-il comme une particule compactée ? Quelle est la topologie de l’ARNm dans le cytoplasme, peut-on visualiser sa circularisation, et par là identifier les molécules en cours de traduction ?
Deuxièmement, nous analyserons l’activité de molécules d’ARN polymérase II isolées au niveau de gènes uniques. Nous utiliserons les fluctuations stochastiques de l’initiation transcriptionnelle pour capturer l’activité de polymérases uniques ou en faible nombre sur un gène rapporteur. De ces données nous tirerons plusieurs paramètres fondamentaux: la fréquence et distribution des événements d’initiation au cours du temps ; les taux d’élongation moyens et instantanés ; les fréquences et durées de pauses transcriptionnelles ; les taux et distributions de la formation d’extrémités 3’. Les résultats indiqueront si ces processus sont déterministes ou stochastiques, et dans quelle mesure ils sont régulés. 
Troisièmement, nous analyserons les liens entre la position nucléaire d’un gène, son activité transcriptionnelle, et sa capacité à former des boucles entre les extrémités 3’ et 5’. Dans la levure, les gènes Gal se relocalisent vers la périphérie lors de l’induction transcriptionnelle. Par ailleurs, ces gènes forment des boucles 3’-5’ qui sont requises pour la mémoire transcriptionnelle, i.e. la réactivation rapide après une première induction. Bien que plusieurs études ont corrélé le positionnement des gènes a leur activité, des mesures simultanées et précises de la position et de l’activité transcriptionnelle par microscopie quantitative font jusqu’ici défaut. De même, la topologie des gènes a été analysée par des méthodes biochimiques, qui fournissent des moyennes sur des populations et ne sont pas pleinement quantitatives. Nous utiliserons des techniques d’imagerie à haute résolution pour analyser quantitativement le lien entre positionnement des gènes, formation de boucles, et activité transcriptionnelle.