Projet ANR-11-BSV4-0003 – FlyBrainImaging : Imagerie cérébrale fonctionnelle de l’activité spontanée dans les Corps Pédonculés, et de leur régulation circadienne, chez la Drosophile.
Programme : Blanc - SVSE 4 - Neurosciences (Blanc SVSE 4)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Jean-René MARTIN (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD)
Partenaires : Institut des Neurosciences Paris Saclay; Institut des Neurosciences Paris Saclay
Montant : 417554.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Imagerie cérébrale des Corps Pédonculés, en relation avec la mémoire et le sommeil.Caractérisation par imagerie cérébrale fonctionnelle, in-vivo, en bioluminescence des Corps Pédonculés (une structure impliquée dans l’apprentissage, la mémoire, et le sommeil) et de leur régulation circadienne, chez la Drosophile.
Elucider, au niveau génétique, moléculaire, cellulaire et des réseaux neuronaux, les mécanismes neurophysiologiques du sommeil, de la mémoire et de leur régulation circadienne.Ce projet consiste à étudier le rôle physiologique de l’activité cérébrale (calcique) survenant dans certaines structures cérébrales, comme les Corps Pédonculés, chez la Drosophile. En effet, à partir d’une nouvelle technique d’imagerie cérébrale in-vivo, que nous avons développé dans mon laboratoire, nous pouvons visualiser, en continue, sur de longue périodes (plusieurs heures) de façon fonctionnelle et en temps réel, l’activité cérébrale. Entre-autres, cette nouvelle technique nous a permis de révéler des pics d’activité très particuliers dans ces structures au cours de la nuit. Les Corps Pédonculés sont des structures majeures dans le cerveau de la Drosophile, impliqués dans l’apprentissage, la mémoire et dans le sommeil. De plus, plusieurs études effectuées sur différents organismes ont suggéré qu’il y aurait une relation entre le sommeil et la consolidation de la mémoire. Par conséquent, l’étude de ce phénomène chez un organisme modèle comme la Drosophile, pour lequel nous disposons de multiples outils génétiques, devrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes génétiques, moléculaires, cellulaires, et ce jusqu’aux circuits neuronaux, impliqués vraisemblablement dans le sommeil, voire possiblement dans la consolidation de la mémoire. Nous étudions également la relation de ces pics d’activité avec les neurones contrôlant les rythmes circadiens. Bref, une meilleure compréhension des mécanismes neuronaux contrôlant le sommeil et/ou la mémoire représente sans équivoque, un intérêt sociétal majeur. 
Imagerie cérébrale fonctionnelle, in-vivo, en bioluminescence, en relation avec la génétiqueL’approche principale de ce projet consiste à enregistrer l’activité calcique cérébrale, in-vivo, en continue sur de longues périodes (over-night, voir jusqu’à 48 heures), en utilisant la technique de bioluminescence (GFP-aequorin) que nous avons développé dans mon laboratoire. Nous étudions principalement les Corps Pédonculés, une structure impliquée dans l’apprentissage et la mémoire olfactive et dans le sommeil, ainsi que les neurones impliqués dans les rythmes circadiens (neurones latéraux ventraux, neurones dorsaux, etc.). Cette approche plutôt neurophysiologique est complémentée par les multiples approches (outils) génétiques qu’offre la Drosophile, c’est-à-dire les diverses mutations et l’expression ciblée de RNAi spécifique d’un gène (mutation ciblée) ou encore divers gènes effecteurs permettant soit d’activer ou d’inhiber spécifiquement un groupe de neurones.  Techniquement, avec le nouveau système d’imagerie, nous pouvons enregistrer l’activité calcique à une résolution temporelle de 10 msec, et ce, sur plusieurs heures. De plus, en parallèle, nous avons développé un système (quantification de la rotation d’une balle soutenue par un jet d’air) permettant de quantifier l’activité locomotrice de la Drosophile, simultanément de l’activité cérébrale. Ainsi, nous essayons de corréler l’activité des différentes structures cérébrales avec une activité comportementale, l’activité locomotrice. Finalement, plus récemment, nous enregistrons, via une technique de video-tracking permettant de quantifier l’activité locomotrice, le sommeil des mouches.
Résumé de la soumission : Enregistrer l'activité des neurones in-vivo est indispensable pour comprendre le contrôle du comportement par le cerveau, mais rencontre de très grandes difficultés techniques, en particulier chez les invertébrés. Différentes techniques d'imagerie détectant l'activité calcique grâce à des marqueurs fluorescents ont été développées afin d'étudier l'activité neuronale et le code neural à la base des principales fonctions neurophysiologiques. Cependant, l’excitation lumineuse requise génère de l’auto-fluorescence, de la photo-toxicité et de la photo-atténuation, qui limitent généralement l'utilisation de la fluorescence aux régions superficielles du cerveau et ce sur de courte durée (secondes ou minutes). Par conséquent, l’enregistrement de l’activité de l'ensemble des structures cérébrales sur une longue période (de l’ordre de l’heure voire du jour) demeure difficile. 	Une nouvelle technique d'imagerie calcique en bioluminescence, basée sur une protéine chimérique GFP-aequorin (GA) a été récemment développée, permettant de visualiser l’activité neuronale in-vivo. Nous avons généré des Drosophiles transgéniques et avec le système P[GAL4], exprimé ce rapporteur dans différentes structures cérébrales pour en mesurer l'activité spontanée ou évoquée. L'activité a été enregistrée dans les Corps Pédonculés (CPs), impliqués dans la mémoire olfactive et dans le sommeil, ainsi que dans le Complexe Central, une structure profonde impliquée dans la régulation de l'activité locomotrice. Enfin, l'expression pan-neuronale de la GA a permis d'enregistrer l'activité spontanée de l'ensemble du cerveau sur plusieurs heures de façon continue. Ces résultats (Martin et al., PLoS-ONE, 2007) démontrent la possibilité, par cette nouvelle approche, d'enregistrer in-vivo, l'activité de n'importe quelle structure du cerveau. Des résultats préliminaires obtenus à partir d'enregistrement de longue durée ont ainsi révélé que les CPs présentent un pic intense d’activité calcique au cours de la nuit. Par ailleurs, l'enregistrement sur 24h d'une sous-population de neurones impliqués dans les rythmes circadiens (neurones exprimant le neuropeptide PDF), a révélé un pic d’activité le soir, qui disparaît chez les mutants arythmiques. Les objectifs de ce projet sont d’étudier et de caractériser l’activité « spontanée » du cerveau de la Drosophile et plus particulièrement le pic nocturne d’activité dans les CPs. En parallèle, nous caractériserons l’activité des différents neurones qui contrôlent les rythmes veille-sommeil, et chercherons à définir les interactions entre ces neurones et l’activité observée dans les CPs. Enfin, nous étudierons le rôle de ce pic d’activité dans les CPs, en particulier son implication possible dans le sommeil et/ou la mémoire. 	Pour effectuer ce projet, nous disposons de nombreuses lignées P[GAL4] permettant d'exprimer la GA dans les différentes structures cérébrales d’intérêt, ainsi que de l'appareillage spécifique et unique pour détecter la bioluminescence. La détection de l’activité calcique neuronale, à une résolution spatiale de l'ordre de quelques microns (potentiellement à une résolution d'un seul neurone) sur un organisme comme la Drosophile (dont la puissance des outils génétiques est sans égal) représente une avancée considérable. La réalisation de ce projet permettra de mieux comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux au travers de l'activité neuronale des différents ensembles cellulaires qui les constituent, ainsi que d’élucider, au niveau cellulaire, la fonction des activités spontanées observées, probablement impliquées dans des fonctions aussi importantes que le sommeil ou la mémoire.
Résultats : D’abord, je tiens à rappeler que l’imagerie cérébrale in-vivo est une technique délicate et plutôt assez lourde à mettre en œuvre, et par conséquent, elle requiert une certaine période d’entraînement. Dans mon labo (J-R Martin), tel que prévu dans le projet initial, nous avons caractérisé les différents paramètres des pics d’activité calcique spontanées dans les Corps Pédonculés (CPs) au cours de la nuit. Brièvement, les mouches présentent deux pics d’activité dans les CPs (un pic court d’environ 3 minutes, mais de très grande amplitude) et un pic beaucoup plus long (d’environ 3 heures, mais de faible amplitude). De plus, comme les CPs sont connus pour être impliqués dans la régulation du sommeil, pour le moment, nos premiers résultats (encore préliminaires) montrent que ces pics sont modifiés dans les mouches mutantes pour certains gènes affectant le sommeil, comme minisleep. En parallèle, des analyses comportementales effectuées en video-tracking, permettant de quantifier le sommeil montrent que certains mutants ont une perturbation du sommeil, comme par exemple, des défauts d’endormissement.   
Pour  la partie concernant F. Rouyer, A. Chatterjee (Post-Doc) a pu bénéficier du savoir faire et de l’expertise de mon laboratoire, acquis depuis quelques années, pour enregistrer l’activité calcique des divers neurones impliquées dans les rythmes circadiens. Il a commencé par enregistrer l'activité calcique dans les neurones d'horloge (activité spontanée en obscurité constante) avec différents pilotes P[Gal4], et les résultats préliminaires suggèrent une activité calcique matinale dans les neurones responsables de l'activité locomotrice matinale. Il a aussi pu montrer, par l'utilisation d'un système d'excitation neuronale par la température que l’activation de certains neurones d'horloge engendre de l’activité calcique dans les CPs. Ces résultats originaux constituent une première étape concernant la caractérisation des voies de sortie des neurones circadiens.
Perspectives : En perspective, comme prévu dans le projet initial, nous allons continuer de suivre le planning développé dans le projet. Nous allons poursuivre la caractérisation physiologique et la recherche du rôle des pics d’activité spontanée observés dans les CPs au cours de la nuit (sommeil et/ou mémoire). Récemment, nous avons remarqué un effet du degré d’oxygénation de la mouche sur ce pic d’activité. Des expériences dédiées à l’étude de cet effet sont en préparation. En parallèle, nous enregistrons aussi l’activité comportementale des mouches dans le video-tracking, dans une situation « nocturne » afin d’analyser (quantitativement et qualitativement) le sommeil. 
De son côté, F. Rouyer va poursuivre la caractérisation de l’activité des différents neurones circadiens du réseau, ainsi que l’identification des voies efférentes (output) des neurones d’horloge.
Publications et brevets : Dans le cadre du meeting annuel du Club de Neurobiologie des Invertébrés, Daiana Minocci et Pierre Pavot ont présenté les premiers résultats dans un meeting, à Paris, les 24 et 25 mai 2012, et plus récemment à Lyon (les 13-14 Juin, 2013). De plus, un article, décrivant entre-autres une première caractérisation des pics d’activité nocturne des Corps Pédonculés a été publié dans BBA-MCR (July 2013). 
[Minocci, D, Carbognin, E Murmu, M, Martin, JR (2013). In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. Biochim Biophys Acta., Mol. Cell Res., 1833, 1632-1640.