Projet ANR-10-ALIA-0003 – OENOPOLYS : Les polysaccharides de la bactérie lactique Oenococcus oeni, de l’élucidation de leurs structures et voies de biosynthèse à leur valorisation technologique
Programme : Alimentation et industries alimentaires (ALIA)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Marguerite DOLS-LAFARGUE (UNIVERSITE BORDEAUX II (VICTOR SEGALEN))
Partenaires : Sciences pour l'Oenologie; Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés; SOCIETE D'APPLICATIONS DE RECHERCHES ET DE CONSEILS OENOLOGIQUES; Université de Bordeaux
Montant : 429778.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Les exopolysaccharides d’ Oenococcus oeni, des polymères potentiellement originaux, éléments d’adaptation de la bactérie à sa niche écologique et éventuellement utiles en vinification ?L'espèce Oenococcus oeni qui conduit la fermentation malolactique (FML) dans la plupart des vins présente, selon les souches considérées, des capacités très diverses de production d’exopolysaccharides (EPS). La nature de ces polysaccharides, des enzymes impliquées dans leur production, leur impact organoleptique dans le vin et leur rôle biologique, encore inconnus sont étudiés et les possibilités de valorisation examinées.
Caractérisation des voies de biosynthèse des exopolysaccharides chez Oenococcus oeni.Parmi les bactéries lactiques, O. oeni occupe une place singulière, du fait de son petit génome fortement évolutif et de sa niche écologique spécifique : le vin. Les bactéries de cette espèce réalisent la fermentation malolactique (FML) dans la plupart des vins dans les régions tempérées, soit spontanément (flore indigène du raisin), soit après ajout de souches commerciales au vin. Des travaux réalisés au cours d’un projet précédent ont permis d’identifier des souches d’O. oeni produisant différents polysaccharides, à différentes concentrations dans le vin. La nature de ces polysaccharides, les enzymes assurant leur production, leur impact sur la qualité du vin et leur rôle biologique sont encore inconnus. Le projet Oenopolys repose sur la collaboration de trois partenaires académiques qui regroupent l’ensemble des compétences scientifiques nécessaires à sa réalisation, et un partenaire industriel, capable de réaliser la production et l’évaluation technologique des produits (polysaccharides purifiés) et souches bactériennes qui seront obtenus. Les résultats attendus sont principalement : un inventaire des gènes dédiés à la synthèse d’exopolysaccharides,  l’identification (1) de la structure des polysaccharides produits et (2) du rôle respectif de chaque glycosyltransférase impliquée dans la synthèse. Par ailleurs, l’intérêt technologique de ces polysaccharides et des souches qui les produisent sera étudié en milieu modèle, puis lors d’essais industriels et de vinifications réelles.
Du génome à la valorisation technologique en passant par la caractérisation des enzymes et des polymères.Le génome d’une vingtaine de souches représentatives de l’espèce et des phénotypes exopolysaccharides a été séquencé et les gènes dédiés au métabolisme des exopolysaccharides (homo et hétéropolysaccharides) ont été recensés. Le clonage de glycosyltransférases représentatives est en cours, en parallèle avec la caractérisation des polymères et enzymes produits par les souches sauvages.
Résumé de la soumission : A côté des polysaccharides végétaux utilisés sous forme native ou après modification, les polysaccharides microbiens connaissent un intérêt croissant. En effet, certains possèdent des structures chimiques inédites associées à des comportements en solution uniques, de mieux en mieux exploités en industrie alimentaire. Parmi les bactéries lactiques, bactéries au statut GRAS très utilisées pour les fermentations alimentaires traditionnelles et industrielles, Oenococcus oeni occupe une place singulière du fait de son petit génome fortement évolutif et de sa niche écologique spécifique : le vin. Les bactéries de cette espèce réalisent la fermentation malolactique (FML) dans la plupart des vins dans les régions tempérées, soit spontanément (flore indigène du raisin) soit après ajout de souches commerciales au vin. Ces dernières sont actuellement sélectionnées sans prendre en compte leur capacité à produire des exopolysaccharides (EPS). Pourtant, cette propriété pourrait être cruciale, compte tenu de l’impact que présentent certains autres polysaccharides sur la stabilité colloïdale et sur les propriétés organoleptiques du vin (sucrosité, palatabilité). Les EPS d’O. oeni pourraient également assurer un rôle protecteur, lors de la production industrielle des bactéries, lors de leur conservation ou lors de leur inoculation dans le vin (résistance au choc acide, à l’éthanol ou aux phages). La diversité des souches d’O. oeni est considérable et actuellement évaluée dans le cadre du projet ANR DivOeni (2008-2011). Des travaux réalisés au cours de ce projet ont permis d’identifier des souches d’O. oeni produisant différents polysaccharides à différentes concentrations dans le vin. La nature de ces polysaccharides, les enzymes assurant leur production, leur impact sur la qualité du vin et leur rôle biologique sont encore inconnus. Le projet proposé ici a pour objectifs majeurs de répondre à ces questions. Ce projet repose sur la collaboration de trois partenaires académiques qui regroupent l’ensemble des compétences scientifiques nécessaires à sa réalisation, et un partenaire industriel capable de réaliser la production et l’évaluation technologique des produits (polysaccharides purifiés) et souches bactériennes qui seront obtenus. Les résultats attendus sont principalement : un inventaire exhaustif des gènes dédiés à la synthèse d’exopolysaccharides chez au moins 8 souches au phénotype remarquable, l’identification de la structure des polysaccharides produits et du rôle respectif de chaque glycosyltransférase impliquée dans la synthèse. La présence simultanée de plusieurs voies de biosynthèse des exopolysaccharides chez une même souche bactérienne semble être la norme au sein de l’espèce O. oeni. Les conséquences de ce phénomène, rarement décrit et jamais étudié auparavant seront étudiées. Par ailleurs, l’intérêt technologique de ces polysaccharides et des souches qui les produisent sera étudié en milieu modèle puis lors d’essais industriel et de vinifications réelles. Selon les résultats obtenus, de nouveaux procédés de production et conservation des levains limitant les intrants dans un souci de développement durable pourront être proposés. De même, de nouveaux levains malolactiques, sélectionnés pour leur capacité à produire des polysaccharides et de nouveaux ingrédients/additifs de vinification respectueux du produit et de l’environnement pourront être développés.
Résultats : Toutes les souches étudiées sont équipées de plusieurs gènes codant différentes voies de biosynthèse des EPS, bien qu’elles produisent des niveaux de concentration d’EPS solubles très variables. L’analyse des 20 génomes indique la présence de deux gènes de dextransucrase, un gène de levansucrase, un gène isolé de glycosyltransferase autonome et deux opérons hétéropolysaccharide (hePS) potentiels :
•	un des gènes de dextransucrase identifié est très conservé (présent chez les 20 souches) mais sous forme tronquée et potentiellement inactive chez la moitié des souches. Cinq souches sur 20 présentent un deuxième gène de dextransucrase, systématiquement tronqué et sûrement inactif et 7 souches sur 20 un gène de levansucrase; ces gènes sont toujours insérés au même site sur le chromosome.
•	3 souches sur 20 présentent un gène de glycosyltransferase homologue à 97% au gène gtf du pédiocoque filant. Deux sites d’insertion distincts ont été identifiés. 
•	sur 20 génomes, trois modèles (différents par l’organisation) ont été recensés pour le premier opéron hePS et 12 modèles (différents par les gènes présents) ont été recensés pour le second opéron hePS. Dix modèles sur 12 sont complets et potentiellement fonctionnels et deux sont partiellement ou fortement tronqués. 
Une telle diversité est surprenante et un tel niveau d’équipement n’étaient pas attendus au lancement du projet. Des méthodes d’analyse par PCR ont été mises au point et ont permis de rechercher différents gènes et opérons chez les souches de la collection de l’unité Oenologie: cette grande diversité des gènes dédiés au métabolisme des polysaccharides est bien représentative de l’espèce.
Perspectives : La caractérisation des enzymes et polymères et l’étude des possibilités de valorisation technologique sont en cours
Publications et brevets : Un article paru dans Int J Food microbiol. sur les bases scientifiques du projet
Deux posters présentés dans des conférences nationales.