Projet ANR-13-JSV1-0009 – Diaphanous : Vers une thérapie de la neuropathie auditive AUNA1
Programme : JCJC - SVSE 1 - Physiologie, physiopathologie, santé publique (JCJC SVSE 1)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur regis NOUVIAN (Pathologies sensorielles, Neuroplasticité et Thérapies)
Partenaires : Institut des Neurosciences de Montpellier - Déficits Sensoriels et Moteurs
Montant : 339464.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : DiaphanousLa mutation ponctuelle dans la région 5' non traduite du gène humain DIAPH3est à l'origine de la surdité AUNA1. La protéine Diaph3 fait partie de la famille des formines, dont la fonction est de réguler le cytosquelette cellulaire. De façon surprenante, l’expression hétérologue de la mutation de DIAPH3 provoque une surexpression anormale de la protéine Diaph3. Cependant, le rôle de Diaph3 dans la surdité AUNA1 reste inconnu.
Mécanisme à l'origine de la surdité AUNA1L’objectif de notre projet est d’étudier les mécanismes moléculaires responsables la neuropathie auditive AUNA1 afin de développer des stratégies thérapeutiques. Pour ce faire, nous proposons i) de caractériser le phénotype des souris transgénique mimant AUNA1, ii) de déterminer les voies de signalisation de Diaph3 et iii) de prévenir la neuropathie auditive chez les souris transgéniques.
modèle de la surdité AUNA1 et voie de signalisationL'étude des mécanismes à l'origine de la surdité AUNA1 repose sur des modèles mimant la surdité humaine, à savoir, des souris qui sur-expriment la protéine Diaph3. La voie de signalisation de Diaph3 repose sur la l'identification de partenaires de diaph3 avec des techniques de biologie moléculaire (double-hybride).
Résumé de la soumission : Depuis une dizaine d’année, les cliniciens décrivent une nouvelle classe de surdités : les neuropathies auditives. D’un point de vue diagnostique, ces surdités se caractérisent par des altérations des potentiels évoqués auditifs précoces (absents ou désynchronisés) et des otoémissions  (témoins de l’activité des cellules ciliées externes) normales. Récemment, Marcy Lesperance (Université du Michighan) a  montré que la neuropathie auditive non syndromique AUNA1 relève d’une mutation ponctuelle dans la région 5' non traduite du gène humain DIAPH3. Cette protéine Diaph3 fait partie de la famille des formines, dont la fonction est de réguler la nucléation de l'actine et des microtubules. De façon surprenante, l’expression hétérologue de la mutation de DIAPH3 provoque une surexpression anormale de la protéine Diaph3. Cependant, le rôle de Diaph3 dans la neuropathie auditive AUNA1 reste inconnu.L’objectif de notre projet de recherche est d’étudier les mécanismes moléculaires responsables la neuropathie auditive AUNA1 afin de développer des stratégies thérapeutiques. Pour ce faire, nous proposons i) de caractériser le phénotype des souris transgénique mimant AUNA1, ii) de déterminer les voies de signalisation de Diaph3 et iii) de prévenir la neuropathie auditive chez les souris transgéniques.Nos résultats préliminaires montrent que les souris transgéniques qui sur-expriment la protéine Diaph3 (le transgène Diaph3 étant sous le contrôle d’un promoteur fort) développent une surdité progressive, similaire à la neuropathie auditive AUNA1 : soit une élévation des seuils auditifs mesurés en électrophysiologie et des otoémissions normales chez les souris transgéniques. L’observation des cellules sensorielles auditives en microscopie électronique à balayage montre un gonflement  de la plaque cuticulaire des cellules ciliées internes (qui transforment les ondes sonores en message nerveux). En accord avec l’enregistrement des otoémissions, les cellules ciliées externes sont parfaitement normales. Notre premier objectif est donc de compléter l’étude du phénotype des souris transgéniques par des mesures de l’activité électrique des cellules ciliées internes en patch-clamp et l’enregistrement des potentiels d’action unitaires des fibres du nerf auditif. Ces résultats fonctionnels seront corrélés avec les observations des cellules ciliées internes en microscopie électronique et confocale.Notre deuxième objectif est de disséquer les voies de signalisation de Diaph3. Pour ce faire, nous étudierons l’expression temporelle et spatiale de Diaph3 dans la cochlée en immunocytochimie, western-blot et hybridation in situ. Les protéines d’interactions de Diaph3 seront ensuite identifiées par co-immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse. Alternativement, nous utiliserons une technique de double-hybride à partir d’une banque de cochlée. Une fois identifiées, la localisation des protéines d’interaction sera déterminée chez les souris transgéniques.Notre troisième objectif est de prévenir la surdité chez les souris transgéniques. Pour ce faire, nous appliquerons directement dans la cochlée des souris transgéniques des AAV (adeno-associated virus) codant un Si-RNA dirigé contre Diaph3 pour inhiber la surexpression de Diaph3. Alternativement, nous utiliserons des peptides compétiteurs ou des inhibiteurs pharmacologiques pour bloquer l’activation de Diaph3 par les membres de la famille des Rho-GTPases. Nul doute que l’ensemble de ces résultats permettra de comprendre les mécanismes à l’origine de la neuropathie auditive AUNA1 et constituera une preuve de concept dans le traitement de cette surdité.
Résultats : Nos résultats préliminaires montrent que les souris transgéniques qui sur-expriment la protéine Diaph3 (le transgène Diaph3 étant sous le contrôle d’un promoteur fort) développent une surdité progressive, similaire à la neuropathie auditive AUNA1.  L’observation en microscopie électronique à balayage montre une atteinte spécifique des cellules ciliées internes (qui transforment les ondes sonores en message nerveux). La voie de signalisation de diaph3 à l'origine de cette atteinte est en cours d'étude.
Perspectives : L’identification des mécanismes l’origine de la neuropathie auditive AUNA1 permettra d'isoler des candidats cibles pour developper des stratégies thérapeutiques.