Projet ANR-12-BSV8-0002 – (Kines-Tubul-DARP)-in : Le cycle structural des kinésines: l’interaction kinésine-tubuline à résolution atomique en relation avec l’état nucléotidique.
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8) 2012
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Benoît GIGANT (Laboratoire d'Enzymologie et Biochimie Structurales)
Partenaires : Laboratoire d'Enzymologie et Biochimie Structurales
Montant : 300000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : Les moteurs moléculaires associés au cytosquelette sont ubiquitaires chez les eucaryotes. Ils sont impliqués aussi bien dans le transport intracellulaire que dans la mitose. Ils utilisent l’énergie produite par l’hydrolyse de l’ATP pour se déplacer le long des filaments d’actine, pour ce qui est des myosines, ou le long des microtubules dans le cas des kinésines et des dynéines. Il existe une relation forte entre le cycle nucléotidique et les variations structurales à la base du mécanisme d’action de ces moteurs. Nous disposons de structures à résolution atomique pour des constructions fonctionnelles des trois types de moteur, en absence de filament, et de modèles à basse résolution, issus de microscopie électronique, de filaments décorés. Mais jusqu’ici, il nous manque une description à haute résolution de la structure d’un complexe moteur-filament. De ce fait, les modèles structuraux actuels ne rendent pas bien compte des propriétés des moteurs moléculaires et de leur variation lors de la fixation au filament.
Notre objectif principal est de combler ce manque en décrivant le cycle structural complet d’un moteur moléculaire. Nous proposons de déterminer la structure atomique par radiocristallographie aux rayons X d’une construction fonctionnelle d’une kinésine motile dans ses différents états nucléotidiques, ceci en complexe avec la protéine constitutive des microtubules, la tubuline. Nous nous intéresserons également aux kinésines de classe 13 qui ont la particularité d’induire le désassemblage des microtubules.
Notre projet repose sur le développement de ‘chaperons’ de la tubuline en vue de sa cristallisation. Dans le cadre du projet ANR Mec-tub, nous avons sélectionné des DARPins (‘Designed Ankyrin Repeats Proteins’) reconnaissant la tubuline. Ces DARPins sont déjà utilisées au laboratoire, mais leur affinité pour la tubuline est limitée (Kd entre 0,1 et 0,3 µM). Nous identifierons les DARPins capables de former un complexe ternaire avec la tubuline et les kinésines, et les ferons évoluer pour une meilleure affinité. 
Ces DARPins de deuxième génération serviront pour les expériences de cristallisation dans l’ensemble de ce projet. En ce qui concerne les kinésines motiles, nous ferons varier leur état nucléotidique au sein des complexes ternaires soumis aux essais de cristallisation (ATP, ADP, sans nucléotide, ainsi qu’en présence d’analogues d’état de transition de l’hydrolyse de l’ATP) afin d’atteindre notre objectif premier. Les résultats préliminaires que nous venons d’obtenir nous confortent dans la pertinence de notre approche.
Un deuxième objectif est l’étude des kinésines dépolymérisantes. Elles se distinguent des kinésines motiles par le fait qu’elles se fixent préférentiellement aux extrémités plutôt qu’au cœur des microtubules, et qu’elles y induisent le désassemblage. Elles ont un cycle nucléotidique adapté à leur fonction, avec une affinité élevée pour la tubuline seulement en présence d’ATP, alors que les kinésines motiles se fixent fortement aux microtubules également dans l’état sans nucléotide. De ce fait, la structure pertinente sera celle d’une kinésine-13-ATP liée à la tubuline. Nous disposons de constructions fonctionnelles des trois kinésines-13 humaines. Pour une meilleure chance de succès, nous prévoyons de travailler également avec des kinésines-13 dont la séquence en diverge significativement, par exemple celles de diatomées. Nous vérifierons si ces kinésines sont bien des dépolymérases et, le cas échéant, nous les étudierons d’un point de vue structural.