Projet ANR-12-BSV6-0013 – MilkChEST : Approche intégrée des voies de sécrétion de la cellule épithéliale mammaire: adaptabilité de la matière grasse laitière
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Patrice MARTIN (Institut National de la Recherche Agronomique-UMR 1313)
Partenaires : Génétique Animale et Biologie Intégrative; Stress Oxydant et Pathologies Métaboliques; Unité Mixte de Recherche sur les Herbivores; Institut national de la recherche agronomique
Montant : 463999.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 48 mois
Résumé : Dissection moléculaire des mécanismes de sécrétion des constituants majeurs du laitNotre connaissance de la plupart des événements moléculaires qui concourent à l’assemblage, au transport intracellulaire et à la sécrétion des principaux constituants du lait (micelles de caséines, globules gras) demeure fragmentaire. Notre but est d'identifier, en intégrant différentes approches, des gènes clés sur lesquels des programmes de sélection pourraient s'engager afin de moduler la composition du lait.
Proposer des voies de valorisation différenciée du lait.Le projet exploite un matériel biologique unique : la chèvre, espèce dans laquelle une invalidation  naturelle du gène spécifiant la caséine alphaS1 (CSN1S1) a révélé une relation étroite entre mécanismes de biosynthèse et sécrétion des micelles de caséine et des globules gras (GG). Les animaux «défectifs« au locus CSN1S1, présentent un stress du réticulum endoplasmique consécutif à l'accumulation des autres caséines dans ce compartiment qui induit une réponse adaptative de type « Unfolded Protein Response ». L'analyse différentielle d'animaux contrôles et défectifs a permis d'identifier des gènes contribuant à ces réponses, des protéines impliquées dans le transport des caséines, et des enzymes impliquées dans la biogenèse des gouttelettes lipidiques. La dissection moléculaire des voies de biosynthèse et de sécrétion des composants majeurs du lait qui déterminent leur structure et leurs propriétés fonctionnelles sera poursuivie, pour : 1) définir la fraction du génome exprimée dans la cellule épithéliale mammaire (CEM), 2) accéder à une meilleure compréhension du rôle joué par la caséine alphaS1 dans l'exportation des caséines depuis le réticulum vers le Golgi, 3) cerner les mécanismes de formation des gouttelettes lipidiques et leur interaction avec la membrane plasmique au cours de la sécrétion du GG. Nous comparerons la formation de ces gouttelettes dans la CEM et dans l'adipocyte, cellule produisant des gouttelettes lipidiques, mais sans les secréter. Une étude sur les microvésicules du lait, potentiellement impliquées dans le développement du système immunitaire du jeune, a été introduite. Ces études visent également la production d'outils et de ressources pour analyser l'expression du génome, dans la CEM et un phénotypage expressionnel innovant basé sur un échantillonnage non invasif des ARN mammaires. Le but ultime est d'identifier des gènes sur lesquels des programmes d'élevage et de sélection pourraient porter afin de moduler la composition fine du lait.
Intégration d’approches méthodologiques multiples pour comprendre le phénotype sécrétoireEn marge de technologies et de méthodes plus conventionnelles et éprouvées de Biologie cellulaire (fractionnement subcellulaire, microscopie électronique) et de biochimie (électrophorèse, dosages immunochimiques) et d’enzymologie, différentes approches et stratégies reposant sur des technologies innovantes et hautement résolutives telles que la microdissection laser (tri cellulaire sous contrôle morphologique), le séquençage haut-débit des ARNs (profil d’expression des gènes), la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse (protéome golgien, profil des lactoprotéines majeures et de leurs isoformes), ou la PCR quantitative moyen débit en microfluidique (niveau d’expression transcriptionnelle de gènes cibles) seront mises en œuvre. Une méthode non-invasive d’échantillonnage des ARN, à partir des globules gras du lait, dont la validité a été démontrée sera exploitée pour les études de populations. La préparation et la caractérisation des microvésicules extracellulaires, présentes dans le lait (lactosomes) et produites par les adipocytes nécessiteront des mises au point méthodologiques qui seront développées en interaction entre les équipes concernées (Inserm et INRA).Les analyses globales des membranes des globules gras du lait et des microvésicules (protéomique et lipidomique) seront externalisées auprès de plateformes spécialisées. Enfin, le développement d’outils informatiques et statistiques pour l’intégration des données de formats multiples générées par ces approches constitue l’un des enjeux majeurs de ce programme.
Résumé de la soumission : Les voies de biosynthèses responsables de la production des principaux constituants du lait sont connues dans leurs grandes lignes, mais notre connaissance de la plupart des événements moléculaires survenant lors de l'assemblage, du transport intracellulaire et de la sécrétion des deux constituants majeurs du lait: micelles de caséine et globules gras (GG) reste lacunaire. Quant à la libération de microparticules dans le lait, rien n'est connu. Pour aborder cette thématique complexe, quatre partenaires (INRA et INSERM) vont collaborer en combinant leurs expertises dans une approche multidisciplinaire. Le projet proposé prolonge le programme "Genomilk Fat" financé par l'ANR (Genanimal 2005) et auquel trois des partenaires ont déjà participés. Il est basé sur du matériel biologique et les résultats significatifs obtenus dans ce contexte, notamment la mise en évidence de l'existence d'une relation étroite entre les mécanismes de biosynthèse et de sécrétion des micelles de caséine et des GG. La pertinence du modèle chèvre, avec un "KO naturel" du gène spécifiant la caséine alphaS1, a également été démontrée. Les chèvres homozygotes pour un allèle nul au locus CSN1S1 (animaux "défectifs"), présentent un stress chronique du réticulum endoplasmique (RE) suite à l'accumulation des autres caséines dans ce compartiment. Ce stress induit une réponse adaptative de type Unfolded Protein Response, combinée à un stress oxydatif. L'analyse différentielle d'animaux contrôles et défectifs nous a permis d'identifier des gènes qui contribuent à ces réponses, des protéines impliquées dans le transport des caséines entre le RE et le Golgi, et des enzymes jouant un rôle dans la biogenèse des gouttelettes lipidiques, les précurseurs des GGs. Dans ce programme, nous projetons de poursuivre la dissection moléculaire des voies de biosynthèse et de sécrétion des composants majeurs du lait, ainsi que des processus qui déterminent leur structure et leurs propriétés fonctionnelles. Nous envisageons aussi d'introduire une étude pionnière sur les microparticules du lait, ces structures étant potentiellement impliquées dans le développement du tractus gastro-intestinal et/ou du système immunitaire du nouveau-né. Nos objectifs de recherche seront: 1) de définir la fraction du génome qui est exprimée dans la CEM de chèvre pendant la lactation, 2) d'aboutir à une meilleure compréhension du rôle joué par la caséine alphaS1 dans l'exportation des caséines du RE vers l'appareil de Golgi, 3) d'identifier les facteurs qui déterminent le profil des acides gras du lait, 4) d'aller plus loin dans la compréhension des mécanismes de formation des gouttelettes lipidiques (qui naissent au niveau du RE) et de leur interaction avec la membrane plasmique au cours de la sécrétion du GG. Dans ce but, nous mènerons une étude comparative de la formation des gouttelettes lipidiques dans la CEM vs. l'adipocyte, cellule produisant aussi des gouttelettes lipidiques sans les secréter. D'autre part, l'étude de la production de microparticules par les adipocytes et leur caractérisation dans le lait de chèvre seront entreprises. Nous focaliserons nos efforts sur l'impact de l'absence de caséine alphaS1 sur les voies de sécrétion des protéines et des lipides, ainsi que sur la composition fine du lait, dans le but de décrypter les mécanismes conduisant à la production de ces constituants par la CEM. Les études proposées visent également la production d'outils et de ressources qui permettront d'améliorer nos connaissances sur l'expression du génome et sa régulation, dans la CEM, pour une meilleure maîtrise de la composition du lait et pour fournir des méthodes de phénotypage innovantes basées sur une technique d'échantillonnage non invasive des ARN mammaires. Le but ultime est d'identifier des gènes clés impliqué dans la production de la matière grasse par la CEM sur lesquels des programmes d'élevage et de sélection pourraient s'engager afin de moduler la composition lipidique du lait.
Résultats : - Un premier transcriptome consistant de la cellule épithéliale mammaire a été établie : plus de 17000 gènes recensés.
- Une méthode validée et optimisée d'isolement de vésicules extracellulaires contenus dans le lait a été mise au point.
- de façon similaire, une méthode permettant d'isoler des vésicules extracellulaires produits par des adipocytes en culture a été développée et mise en oeuvre pour caractériser la production de ces vésicules dans un contexte d'obesité in vivo. 
- Mise en évidence et caractérisation d'un stress du réticulum associé à une réponse de type Unfolded Protein Response (UPR) chez les individus de génotype O/O au locus CSN1S1
Perspectives : sans objet
Publications et brevets : sans objet