Projet ANR-11-BSV6-0012 – O2StressAnaerob : Détoxication de l'Oxygène chez les bactéries anaérobies : génomique fonctionnelle et bioénergétique des oxygène réductases
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur ALAIN DOLLA (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE PROVENCE CORSE)
Partenaires : Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires; Interaction et Modulateurs de Réponses; Interaction et Modulateurs de Réponses
Montant : 483000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 48 mois
Résumé : Comment les microorganismes anaérobies détoxiquent-ils l'oxygène ?La présence d'oxygène réductases membranaires chez les microorganismes qui vivent en absence d'oxygène moléculaire est intriguant. L'étude de ces systèmes apporte des informations non seulement mécanistiques et évolutives mais permet également la caractérisation de nouveaux mécanismes antioxydants.
Fonction des oxygene-réductases chez les microorganismes anaérobiesL’utilisation de l’oxygène comme accepteur terminal d’électrons des systèmes respiratoires conduit à un rendement énergétique très élevé qui a été mis à profit par les formes de vie aérobies. Ces systèmes respiratoires contiennent tous une oxygène-réductase terminale membranaire. L’analyse des nombreux génomes séquencés a révélé la présence de gènes codant pour ces oxygène-réductases membranaires non seulement chez les organismes aérobies mais aussi chez des microorganismes anaérobies. Alors que la fonction de ces enzymes est évidente dans la respiration aérobie, leur présence chez des microorganismes anaérobies stricts est beaucoup plus surprenante. L’objectif principal de ce projet est donc de comprendre le rôle physiologique de ces oxygène-réductases membranaires chez les organismes anaérobies en utilisant Desulfovibrio vulgaris Hildenborough comme organisme modèle. Nous disposons à cet effet au laboratoire de simple et double mutants de délétion des gènes codant pour ces enzymes membranaires. Ces mutants sont des outils importants pour comprendre le rôle respectif de ces enzymes dans la cellule. L’approche de génomique fonctionnelle que nous développons nous permet non seulement la caractérisation moléculaire et fonctionnelle de ces oxygène-réductases membranaires chez les anaérobies mais aussi d’obtenir de nombreuses et nouvelles informations sur le rôle et l’importance respective de chacun des systèmes d’élimination de l’oxygène chez les organismes anaérobies et leur lien évolutif avec l’apparition de l’oxygène dans l’atmosphère.
Approche de génomique fonctionnelle, bioénergétique et biologie structuraleNous disposons de simple et double mutants de délétion des gènes codant pour les oxygène-réductases membranaires de D. vulgaris Hildenborough. Notre méthodologie est basée sur l'analyse des effets de ces délétions de gènes sur la physiologie de la bactérie et plus particulièrement sur ses capacités à se développer en présence d'oxygène moléculaire. Nous étudions ces effets au niveau du transcriptome (taux d'expressions des ARN messagers), des activités enzymatiques de réduction d'oxygène et du rendement énergétique lors des croissances. Par ailleurs, une approche structurale par RMN et cristallographie des protéines nous permet d'obtenir des informations sur les relations structure/fonction de ces systèmes de réduction de l'oxygène.
Résumé de la soumission : L’utilisation de l’oxygène comme accepteur terminal d’électrons des systèmes respiratoires conduit à un rendement énergétique très élevé qui a été mis à profit par les formes de vie aérobies. Ces systèmes respiratoires contiennent tous une oxygène-réductase terminale membranaire. L’analyse des nombreux génomes séquencés a révélé la présence de gènes codant pour ces oxygène-réductases membranaires non seulement chez les organismes aérobies mais aussi chez des microorganismes anaérobies. Alors que la fonction de ces oxydases est évidente dans la respiration aérobie, leur présence chez des microorganismes anaérobies stricts est beaucoup plus surprenante. Les données actuelles suggèrent que de nombreux microorganismes anaérobies, bien qu’incapables d’utiliser l’oxygène comme accepteur terminal d’électrons pour la croissance, ont développé des stratégies de défense pour se protéger contre les effets néfastes de l’oxygène et ont ainsi développé une aérotolérance. Ces études sur l’aérotolérance sont importantes pour mettre en évidence et caractériser les nouveaux systèmes impliqués dans la détoxication de l’oxygène et des espèces réactives de l’oxygène. Les espèces du genre Desulfovibrio sont parmi les plus étudiées concernant les mécanismes d’aérotolérance et des études écologiques ont montré que ces microorganismes sont capables de survivre à des expositions temporaires élévées en oxygène dans leurs biotopes naturels et sont capables de le réduire en H2O. Chez les Desulfovibrio, trois systèmes de réduction de l’oxygène ont été proposés et diffèrent de part leur localisation cellulaire : un système périplasmique impliquant hydrogénases et cytochromes, un système cytoplasmique constitué notamment d’une protéine flavodiferrique (la rubrédoxine-oxygène-oxydoréductase) et enfin un système de réduction membranaire constitué de deux enzymes, une quinol-oxydase de type bd et une cytochrome c oxydase appartenant à la superfamille des oxydases à hème-cuivre. Celle-ci est unique car elle possède deux hèmes supplémentaires sur la sous-unité II et serait de type nouveau cc(o/b)o3. Très peu de données sont disponibles actuellement concernant la caractérisation et le rôle fonctionnel respectif de ces oxydases terminales membranaires chez les organismes anaérobies strictes.L’objectif principal de ce projet est donc de comprendre le rôle physiologique de ces oxydases terminales membranaires chez les organismes anaérobies en utilisant Desulfovibrio vulgaris Hildenborough comme organisme modèle. Nous disposons à cet effet au laboratoire des simple et double mutants de délétion des gènes codant pour ces deux oxydases membranaires. Ces mutants sont des outils importants pour comprendre le rôle respectif de ces enzymes dans la cellule. Par ailleurs nous possédons également des mutants de délétion correspondant aux deux systèmes solubles de réduction de l’oxygène périplasmiques et cytoplasmiques décrits ci-dessus ainsi que le mutant de délétion des systèmes membranaire et cytoplasmique.L’approche de génomique fonctionnelle que nous proposons de développer nous permettra non seulement d’obtenir la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des oxygène réductases membranaires chez les anaérobies du genre Desulfovibrio, ainsi que leurs influences sur le métabolisme énergétique et carboné de la bactérie, mais aussi d’obtenir de nombreuses et nouvelles informations sur le rôle et l’importance respective de chacun des systèmes d’élimination de l’oxygène chez les organismes anaérobies et leur lien évolutif avec l’apparition de l’oxygène dans l’atmosphère.
Résultats : Les résultats obtenus mettent en évidence une résistance importante de D. vulgaris Hildenborough à la présence d'oxygène. L'absence des oxydases membranaires induit une forte augmentation de la sensibilité à l'oxygène, ce qui démontre l'implication de ces enzymes dans la détoxication de l'oxygène moléculaire dans cette bactérie anaérobie. L'importance relative de chacune des oxydases a été précisée et un lien électronique entre l'oxydation périplasmique de l'hydrogène et la réduction membranaire de l'oxygène a été mis en évidence pour la première fois.
Perspectives : Le projet est en cours; des perspectives seront définies à la fin du projet.
Publications et brevets : Ramel, F., Amrani, A., Pieulle, L., Lamrabet, O., Voordouw, G., Seddiki, N., Brèthes, D., Company, M., Dolla, A. and Brasseur, G. (2013) Membrane-bound oxygen reductases of the anaerobic sulfate-reducing Desulfovibrio vulgaris Hildenborough: roles in oxygen defense and electron link with the periplasmic hydrogen oxidation. Microbiology, 159, 2663-2673.
Cette publication décrit la sensibilité des souches sauvage et délétantes à l'oxygène ainsi que les activités oxygéne-réductase associées.