Projet ANR-11-BSV8-0023 – RAR-SCALES : Relations structure-fonction des récepteurs à l’acide rétinoïque, du génomique à l'échelle atomique
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Irwin Davidson (CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE - CERBM)
Partenaires : Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaire et Cellulaire
Montant : 450000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 39 mois
Résumé : RAR-SCALESL’acide rétinoïque tout-trans (RA, dérivé actif de la vitamine A) joue un rôle important dans le développement des vertébrés et dans la physiopathologie de plusieurs tissus adultes. Cette molécule simple agit via son interaction avec ses récepteurs les RARs, membres de la superfamille des récepteurs nucléaires (NRs). Les RARs hétérodimerisent avec les récepteurs des rexinoïdes (RXRs) pour réguler l’expression de leurs gènes cibles.
Element de réponse et Allostérie L’objectif de ce projet est d’identifier à l’échelle génomique la fixation des RARs et RXRs durant la différentiation cellulaire, de caractériser les éléments de réponse non canoniques et de déterminer si la séquence primaire et l’organisation des éléments de réponse de RARs contrôlent de façon allostérique l’activité des RAR/RXR.
ChIP-seq, EMSA; ITC, SAXS/SENSNous utiliserons la technique de ChIP-seq et RNA-seq pour élargir le répertoire des éléments de fixation des RAR et de déterminer la dynamique de recrutement spécifique des paralogues de RAR et leur activité transcriptionnelle lors de la différentiation des cellules ES et F9. Les séquences de fixation dans des régions où aucun élément n’a pu être identifié seront déterminées par EMSA. La séquence nucléotidique nécessaire à l’interaction sera déterminée par des expériences d’EMSA et les affinités mesurées par spectroscopie à fluorescence. L’orientation de l’héterodimère sur les éléments sera déterminée par FRET.Au niveau structural et afin d’obtenir des informations à l’échelle atomique, nous utiliserons la cristallographie aux rayons X pour déterminer les structures des domaines de fixation à l’ADN des RAR/RXR sur des éléments de réponse non-canoniques de type DR0, 1, 2, 5 et IR0. Ces structures permettront de comprendre l’effet de variation de séquence au niveau des hexanucléotides et les régions flanquantes dans la reconnaissance. La technique de diffusion des rayons X à petit angle (SAXS) couplé à la cristallographie aux rayons X seront utilisées pour déterminer la structure et l’architecture globale des RAR/RXR en complexes avec leurs cofacteurs sur les différents éléments.
Résumé de la soumission : L’acide rétinoïque tout-trans (RA, dérivé actif de la vitamine A) joue un rôle important dans le développement des vertébrés et dans la physiopathologie de plusieurs tissus adultes. Cette molécule simple agit via son interaction avec ses récepteurs les RARs, membres de la superfamille des récepteurs nucléaires (NRs). Les RARs hétérodimerisent avec les récepteurs des rexinoïdes (RXRs) pour réguler l’expression de leurs gènes cibles. L’ hétérodimère RAR/RXR régule l’expression en se fixant sur des éléments de réponse dont les mieux caractérisées sont des répétitions directes (DRs) de la séquence 5’-RGKTCA-3’ séparées de 1, 2 ou 5 nucléotides. Nous avons utilisé la technique d’immunoprécipitation de la chromatine afin d’identifier les sites de fixation des RARs dans des fibroblastes embryonnaires, des cellules souches embryonnaires ES et des cellules F9 de carcinome embryonnaire pour identifier un grand nombre de sites de fixation dont les séquences ne correspondent pas au motif consensus et révelant une large diversité en séquence primaire et dans la topologie des demi-sites.  Les gènes cibles des RARs régulés dans la différentiation des ES et F9 sont soit activés, soit réprimes par le RA, ou ne montrent aucune réponse transcriptionnelle. A présent aucune corrélation entre la réponse transcriptionnelle et le type d’élément de fixation des RARs n’a pu être mis en évidence. L’objectif de ce projet est d’identifier à l’échelle génomique la fixation des RARs et RXRs durant la différentiation cellulaire, de caractériser les éléments de réponse non canoniques et de déterminer si la séquence primaire et l’organisation des  éléments de réponse de RARs contrôlent  de façon allostérique  l’activité des RAR/RXR.  Afin de tester cette hypothèse nous proposons une série d’expériences fonctionnelles et structurales. Nous utiliserons la technique de ChIP-seq et RNA-seq pour élargir le répertoire des éléments de fixation des RAR et de déterminer la dynamique de recrutement spécifique des paralogues de RAR et leur activité transcriptionnelle lors de la différentiation des cellules ES et F9.  Les séquences de fixation dans des régions où aucun élément n’a pu être identifié seront déterminées par EMSA. La séquence nucléotidique nécessaire à l’interaction sera déterminée par des expériences d’EMSA et les affinités mesurées par spectroscopie à fluorescence. L’orientation de l’héterodimère sur les éléments sera déterminée par FRET. Les propriétés fonctionnelles des différents éléments de fixation non-canoniques seront évaluées isolément et dans le contexte du promoteur naturel par le remplacement du site de fixation naturel par un élément de classe différente (canonique et non canonique). De plus nous utiliserons le ChIP-seq et l’interférence par siRNA afin de déterminer les cofacteurs requis pour la fonction sur différents éléments dans les promoteurs. Au niveau structural et afin d’obtenir des informations à l’échelle atomique, nous utiliserons la cristallographie aux rayons X pour déterminer les structures des domaines de fixation à l’ADN des RAR/RXR sur des éléments de réponse non-canoniques de type DR0, 1, 2, 5 et IR0. Ces structures permettront de comprendre l’effet de variation de séquence au niveau des hexanucléotides et les régions flanquantes dans la reconnaissance. La technique de diffusion des rayons X à petit angle (SAXS) couplé à la cristallographie aux rayons X seront utilisées pour déterminer la structure et l’architecture globale des RAR/RXR en complexes avec leurs cofacteurs sur les différents éléments. Ce projet permettra de caractériser les sites de fixation des RAR/RXR de l’échelle génomique à l’échelle nucléotidique et atomique.  Cette combinaison d’approches fonctionnelles et structurales devrait nous permettre d’identifier et de comprendre les mécanismes par lesquelles la séquence et à l’organisation de l’élément de réponse exercent une contrôle allostérique de l’activité des RARs et le recrutement des cofacteurs.
Résultats : Voir annexe du rapport
Perspectives : Nous poursuivons ce travail afin d'élucider la structure RAR-RXR fixé sur des éléments DR0 et IR0 et DR8 afin de comprendre les bases structurales de l'effet du contrôle allostérique par l'espacement des demi-sites dans l'élément du réponse.
Publications et brevets : Moutier et al JBC sous presse voir annexe du rapport.