Projet ANR-12-DSSA-0006 – EPICHILD : EFFETS DE FACTEURS SOCIAUX MATERNELS SUR L’ÉPIGÉNÉTIQUE DE L’ENFANT. ETUDES CHEZ DES FEMMES ENCEINTES ET CHEZ L’ENFANT OBÈSE.
Programme : Déterminants sociaux de santé (DSSA)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Pierre BOUGNÈRES (GENETIQUE ET EPIGENETIQUE DU DIABETE DE TYPE 1 DES TRAITS METABOLIQUES ET ENDOCRINIENS ET DE LA PTH)
Partenaires : Epidémiologie, Systèmes d'Information, Modélisation; Thérapie Génique, Génétique, Epigénétique en Neurologie, Endocrinologie et Développement de l'Enfant; Institut de Biologie et de Technologies de Saclay; Assistance Publique Hôpitaux de Paris
Montant : 145666.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : Effets de facteurs sociaux maternels sur l’épigénétique de l’enfant.Notre étude recherche les fondements biologiques grâce auxquels les expériences vécues au début du développement pré et postnatal sont capables de favoriser la survenue d’une obésité chez un enfant. Nous postulons que l’épigénétique (dans ce projet la méthylation des CGs de l’ADN génomique), qui constitue une mémoire moléculaire durable d’évènements sociaux précoces, peut constituer ce lien biologique manquant.
Identification des régions différentiellement méthylées communes aux nouveaux nés stressés et aux enfants obèses.L'enjeu de notre projet est de tracer une «route épigénétique« de l'exposition au stress in utero à l'obésité infantile.Nos objectifs sont :-Identifier les marques épigénétiques associées à l'obésité infantile.-Identifier les marques épigénétiques associées au stress in utero.-Identifier les marques épigénétiques communes à l'obésité et au stress.
Recrutement des cohortes et étude de la méthylation de l'ADN sur l'ensemble du génome.Nous avons recruté 2 cohortes : une cohorte de 150 enfants obèses et témoins non obèses et une cohorte de 500 femmes enceintes et nouveaux nés. Nous avons obtenu pour ces cohortes  les accords de promotion Inserm, l’accord du Comité de Protection des Personnes (CPP), celui du CCTIRS et celle de la CNIL. Nous avons choisi d'étudier la méthylation de l'ADN à l'aide de la puce Illumina 450K.
Résumé de la soumission : Notre étude recherche les fondements biologiques grâce auxquels les expériences vécues au début du développement pré et postnatal sont capables de favoriser la survenue d’une obésité chez un enfant. Pour des raisons exposées dans la version complète du projet, nous avons choisi l’obésité infantile comme paradigme pour aborder la recherche d’un lien biologique entre des facteurs sociaux maternels précoces et le développement de l’enfant car  l’épidémiologie associe l’obésité infantile avec de tels facteurs. Nous postulons que l’épigénétique (dans ce projet la méthylation des CpG de l’ADN génomique), qui constitue une mémoire moléculaire durable d’évènements sociaux précoces, peut constituer ce lien biologique manquant.Notre protocole comporte deux volets séparés mais complémentaires:i)	Nous chercherons d’une part s’il existe une relation entre des facteurs sociaux présents chez la femme enceinte et des marques épigénétiques de son fœtus, marques qui se seraient mises en place pendant le développement embryonnaire et fœtal précoce. Les marques épigénétiques ainsi héritées (non génétiquement) par le conceptus et  corrélées à des facteurs sociaux, seront appelées Eg1. ii)	Nous étudierons aussi la relation entre l’obésité infantile, les facteurs sociaux maternels anciens ou récents, et des marques épigénétiques. Les marques que nous trouverons plus fréquentes chez les enfants obèses seront appelées Eg2. Nous rechercherons aussi leurs corrélations avec des facteurs maternels exerçant leurs effets potentiels pendant la vie postnatale des bébés. iii)	 En combinant les résultats des analyses épigénétiques provenant des deux études, nous rechercherons s’il existe des marques communes à Eg1 et Eg2. Celles-ci indiqueraient, sous réserve d’une analyse statistique rigoureuse, que la méthylation de certaines régions génomiques est non seulement sensible à des facteurs sociaux prénataux maternels, mais favorisent l’obésité. Une “route épigénétique” pourrait ainsi être tracée entre des phénotypes sociaux (inégalités d’origine sociale) d’une mère et le phénotype obèse acquis par son enfant. Si de telles marques n’étaient pas trouvées à l’intersection de Eg1 et Eg2, cela suggèrerait que les marques épigénétiques reflétant chez le fœtus l’impact de facteurs sociaux prénataux n’ont pas d’effet prédisposant majeurs sur l’obésité de l’enfant. iv)	 La stabilité temporelle de Eg1 et Eg2 sera évaluée en re-prélevant certains des sujets étudiés à distance du premier prélèvement. Méthodes d’étude des marques épigénétiques : Pour identifier Eg1 et Eg2, nous caractériserons i) certains loci génomiques « candidats » où la méthylation est connue pour répondre à des évènements sociaux et stress dans des modèles animaux ou humains ii) la méthylation à l’échelle du génome entier en utilisant la puce CHARM. A cause du coût élevé des puces CHARM et leur complexité d’analyse, nous appliquerons ces études du méthylome entier à des sous-groupes sélectionnés de sujets, ayant néanmoins une puissance statistique compatible avec nos hypothèses. Ceux des résidus CpG qui seront trouvés associés aux facteurs maternels prénataux ou à l’obésité seront testés secondairement dans des groupes de plusieurs centaines de sujets pour valider leurs liens avec les facteurs sociaux. Enfin, pour déterminer si les marques épigénétiques des cellules sanguins étudiées, sont les mêmes que dans les différents tissus de l’organisme (la méthylation est souvent tissu-spécifique), nous les étudierons dans différents tissu prélevés à différents âges de la vie chez des fœtus, nouveaux-nés, enfants et adultes autopsiés pour des raisons médicales. Ceci aidera à définir la stabilité tissulaire des marques épigénétiques.
Résultats : La méthylation de 450,000 CGs du génome de 13 enfants obèses, 7 super obèses et 20 témoins a été mesurée à l’aide de la puce de méthylation Illumina 450K. La méthylation a été évaluée sur de l’ADN issu du sang total des individus. Chaque population cellulaire du sang ayant sa propre signature épigénétique, il est important que les patients et les témoins aient des proportions cellulaires comparables. Nous avons cependant observé des différences au niveau des granulocytes, des monocytes et des lymphocytes NK. Nous avons donc corrigé par la suite nos analyses pour cette hétérogénéité cellulaire entre les échantillons afin que les différences observées ne soient pas dues à des différences de proportions cellulaires mais bien réelles. 
En se plaçant à un FDR (False Discovery Rate) de 0.05, nous avons identifié 47 CGs différentiellement méthylés entre les enfants obèses et les témoins. La majorité de ces CGs est localisée dans les « shores » des ilots CpGs. L’analyse GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) a montré un enrichissement des gènes du pathway de l’insuline (p=7.10-5 et q=0.01).
Toujours après correction pour les tests multiples (FDR=0.05), nous avons identifié 547 CGs différentiellement méthylés entre les enfants super-obèses et les témoins. Cette fois, la majorité de ces CGs est localisée dans les ilôts CpGs. 
Nous répliquons actuellement nos résultats par pyroséquençage sur le top10 de chaque analyse.
Perspectives : Nous avons recruté les 500 femmes enceintes initialement prévues. A ce jour, 365 de ces femmes ont accouché et le sang de cordon a pu être prélevé chez 307 des nouveau-nés. La naissance du dernier bébé est prévue pour Février 2016, les études de méthylation pourront débuter ensuite.
L'étape suivante consistera à comparer les marques identifiées chez les enfants obèses à celles observées chez les nouveaux nés exposés au stress in utero.
Publications et brevets : Un article est en cours d'écriture concernant les résultats de méthylation chez les enfants obèses.