Projet ANR-10-BLAN-1224 – RIBOPRE40S : Analyse structurale et fonctionnelle du processus de maturation des précurseurs de la petite sous-unité ribosomique eucaryote
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur HENRY Yves (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE MIDI-PYRENEES)
Partenaires : Laboratoire de Biologie Moléculaire des Eucaryotes; Laboratoire de Biologie Moléculaire des Eucaryotes; Institut Européen de Chimie et Biologie
Montant : 600000.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : Détermination de la structure des précurseurs des sous unités du ribosomeLe ribosome, constitué de deux sous unités (petite sous unité et grande sous unité) est la machine moléculaire qui produit les protéines chez tous les organismes. Le mode de production des ribosomes dans les cellules comportant un noyau (cellules eucaryotes) reste mal compris. Ce projet vise à améliorer notre compréhension du mode de production des ribosomes dans ces cellules.
Détermination de la structure tridimensionnelle des précurseurs de la petite sous unité et de la grande sous unité du ribosome.Les ribosomes produisent les protéines dans tous les organismes vivants. Leur mode de fonctionnement et leur structure sont maintenant compris au niveau moléculaire et atomique. En revanche, de nombreux aspects du mode de production des ribosomes chez les cellules comprenant un noyau (les cellules eucaryotes, la brique de base des organismes évolués) restent obscurs. Comprendre cette production est fondamental, puisque qu’elle est modifiée dans la plupart des cancers et dans certaines maladies génétiques, comme l’anémie de Diamond et Blackfan, maladies dénommées « ribosomopathies ». Les deux sous unités du ribosome sont produites à partir d’une particule précurseur initiale, qui va se scinder en deux pour donner naissance à une particule précurseur de la petite sous unité du ribosome et une particule précurseur de la grande sous unité. Ces deux types de particules précurseur vont subir plusieurs étapes de maturation et de transport dans la cellule pour aboutir aux sous unités ribosomiques matures fonctionnelles. Si les facteurs qui composent les particules précurseur sont maintenant identifiés, leurs rôles dans l’évolution du processus de maturation de ces particules, la structure tri-dimensionnelle de celles-ci et le positionnement de leurs divers composants au sein de cette structure sont très mal connus. Pourtant, il s’agit là d’informations cruciales pour une bonne compréhension du processus de synthèse des ribosomes. Le projet a pour but de déterminer les diverses structures qu’adoptent les particules précurseur de la petite sous unité du ribosome, puis d’engager une étude similaire concernant les particules précurseur de la grande sous unité du ribosome. Le projet vise aussi à comprendre comment des particules précurseur aberrantes sont éliminées (processus de contrôle qualité de la synthèse des ribosomes).
Détermination de la structure des particules précurseur des sous unités ribosomiques à partir de données de microscopie électronique.Pour étudier la structure des particules précurseur des ribosomes, il est nécessaire dans un premier temps de les purifier ; les particules obtenues doivent être suffisamment pures et abondantes. Dans une première partie du projet, nous nous sommes attachés à développer une méthode de purification. Nous utilisons comme source de particules des extraits de cellules de levure. Les particules sont purifiées grâce une protéine « appât » intégrée dans les particules. Les propriétés biochimiques des particules purifiées sont ensuite déterminées et leur structure tridimensionnelle sera calculée à partir d’images de centaines de ces particules, images obtenues par microscopie électronique à partir d’échantillons congelés à très basse température. La position au sein des particules précurseur de certaines protéines sera déterminée par traitement de ces particules avec des anticorps se fixant sur ces protéines. Enfin, la structure atomique de ces protéines sera déterminée en faisant appel à une technique comprenant l’utilisation de cristaux de ces protéines et leur irradiation par des rayons X.
Résumé de la soumission : La synthèse des ribosomes est l’une des activités cellulaires majeures. La production des ribosomes eucaryotes comprend (1) la synthèse dans le nucléole de précurseurs des ARN ribosomiques matures (2) le repliement correct, les modifications post-transcriptionnelles et la maturation de ces pré-ARNr pour aboutir aux ARNr matures (3) l’association séquentielle des protéines ribosomiques avec les ARNr au sein de leurs précurseurs (4) le transport de particules pré-ribosomiques résultant de ces associations du nucléole vers le nucléoplasme et de là vers le cytoplasme après un passage à travers les complexes de pore. Près de 200 protéines non-ribosomiques interagissent de manière transitoire avec les particules pré-ribosomiques. Il est admis que ces protéines non-ribosomiques jouent des rôles cruciaux dans les aspects clefs de la synthèse des ribosomes, mais la fonction moléculaire précise de la plupart reste inconnue. De manière remarquable, plusieurs enzymes consommatrices d’énergie figurent parmi ces protéines non-ribosomiques. Ceci suggère que les particules pré-ribosomiques subissent des étapes de remaniements de conformation nécessitant de l’énergie. De plus, les informations actuelles suggèrent que l’exécution de ces étapes de remaniement est évaluée par des systèmes de contrôle. Le défi dans le domaine est de définir la composition et la structure à l’échelle atomique des particules pré-ribosomiques aux différentes étapes du processus de maturation et comment les protéines ribosomiques et non-ribosomiques participent à la conversion d’une structure à la suivante. 	Etant donné la difficulté de la tâche, nous nous concentrerons d’abord sur la maturation des particules pré-40S, les précurseurs des sous-unités 40S. L’un des buts de ce projet est d’aboutir à une description moléculaire des transitions structurales successives que subissent les sous-unités pré-40S de leur état nucléaire jusqu’aux sous-unités 40S cytoplasmiques matures. Le second but est de mieux comprendre comment la cellule contrôle la maturation des sous-unités pré-40S dans le cytoplasme. Pour réaliser ces objectifs, nous procéderons comme suit. Nous allons déterminer la structure cristalline atomique des protéines non-ribosomiques et de certaines protéines ribosomiques des particules pré-40S. En parallèle, nous allons étudier grâce à des sondes chimiques et enzymatiques la structure du pré-ARNr 20S et les interactions protéines/pré-ARNr 20S au sein de particules pré-40S purifiées à différents stades de maturation. Nous allons également déterminer la structure tridimensionnelle de ces particules pré-40S purifiées en utilisant la cryo-microscopie électronique (cryo-ME). La position des protéines non-ribosomiques et de leurs protéines ribosomiques partenaires dans les particules pré-40S sera déterminée par immuno-localisation. Les informations biochimiques et morphologiques résultant des expériences de détermination d’empreintes sur l’ARN 20S et d’immuno-localisation permettront un placement précis des structures cristallines atomiques des protéines non-ribosomiques et ribosomiques au sein des structures tridimensionnelles des particules pré-40S déterminées par cryo-ME. De plus, nous tenterons de reconstituer certaines étapes cytoplasmiques de maturation des particules pré-40S in vitro. La structure des particules pré-40S remaniées in vitro sera comparée à celle des particules correspondantes purifiées à partir des cellules de levure. Enfin, nous étudierons comment la machinerie de dégradation  ‘No Go’ détecte et cible vers une voie de dégradation les particules pré-40S associées à des ARNm. 	Les approches développées durant ce projet en utilisant des particules pré-40S vont certainement s’avérer d’une importance cruciale pour l’étude ultérieure de particules pré-ribosomiques plus complexes telles que les particules 90S et pré-60S, et de manière plus générale pour l’étude de particules ribonucléiques complexes subissant des remaniements de structure.
Résultats : Nous avons déterminé la structure tri-dimensionnelle d’une  protéine qui permet la production de la première particule précurseur de la petite sous unité du ribosome, en association avec une protéine partenaire qui module son activité.  Nous avons mis au point une méthode efficace de purification de particules précurseur de la petite sous unité du ribosome et obtenu des images de ces particules par microscopie électronique. Nous avons identifié des facteurs qui interviennent dans l’élimination de particules précurseur aberrantes.
Perspectives : Nous allons maintenant passer à une phase d’acquisition par microscopie électronique de très nombreuses images des particules précurseur de la petite sous unités du ribosome, images utilisées pour modéliser les structures tridimensionnelles de ces particules. En parallèle, nous allons mettre en place le protocole de purification des particules précurseur précoces de la grande sous unité du ribosome dans le but d’en déterminer la structure par les approches décrites ci-dessus.
Publications et brevets : Des articles scientifiques sont en cours de préparation concernant la structure de composants protéiques des particules précurseur des sous unités ribosomiques.