Projet ANR-11-BSV8-0025 – MITIC : Messagers dont l’Initiation de la Traduction Interne est dirigée par la Coiffe
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Gilbert ERIANI (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ALSACE)
Partenaires : Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; Architecture et Réactivité de l'Arn
Montant : 450000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 48 mois
Résumé : ARNm de l’histone H4 : bien plus qu’un simple messager à traduireLa structure de l’ARNm de l’histone H4 manipule les facteurs d’initiation de la traduction et les ribosomes entrainant un démarrage non conventionnel de la traduction
Voir et comprendre la structure et le fonctionnement de l’ARNm de l’histone H4Nous avons récemment montré que la traduction de l’histone H4 est initiée par un mécanisme original, reprenant à la fois certaines caractéristiques cellulaires (présence d’une coiffe) et virales (absence de « scanning » et entrée interne des ribosomes). Contrairement aux ARN messagers classiques, la coiffe de l’ARNm de l’histone H4 n’est pas accessible car elle est enfouie dans une poche formée par la phase codante. De ce fait, le facteur eIF4E, qui normalement reconnaît la coiffe, est recruté à l’intérieur de l’ARNm. Ceci permet l’assemblage des ribosomes qui sont ainsi directement positionnés sur l’AUG initiateur. Ce mécanisme simplifié de recrutement interne assure donc un démarrage immédiat de la traduction, sans étape de « scanning », coûteuse en temps et en énergie. Un tel processus pourrait expliquer la production massive en histone, destinée à compacter l’ADN synthétisé juste avant la division cellulaire. L’objectif général vise à comprendre ce mécanisme d’initiation par recrutement interne du complexe d’initiation à partir des structures de l’ARNm. Le projet apportera de nouvelles connaissances fondamentales sur (i) la compréhension du mécanisme d’initiation par recrutement interne des complexes d’initiation. (ii) Il permettra l’élucidation des structures tridimensionnelles des complexes d’initiation intermédiaires assemblés grâce aux structures de l’ARNm et (iii) il conduira au recensement des ARNm cellulaires pouvant initier la traduction par la voie du recrutement interne.A terme, le projet conduira à une révision du modèle classique d’initiation de la traduction par « scanning » en y intégrant une certaine proportion de recrutement interne.
Intégrer résultats fonctionnels et approches structurales dans un nouveau modèle d’initiation de la traductionDe façon générale, ce projet se propose d’apporter des réponses fonctionnelles, structurales et topologiques à la question complexe de l’initiation de la traduction chez les eucaryotes. Le projet porte sur l’initiation par recrutement interne à l’aide de structures de l’ARNm situées à l’intérieur de sa phase codante. Dans ce mécanisme d’initiation non canonique, l’ARNm joue un rôle critique que l’étude fonctionnelle tente de comprendre par des approches de sondage en solution, de pontage aux rayons UV de la coiffe et des facteurs d’initiation. D’un point de vue structural, deux approches sont utilisées. La cryo microscopie électronique apporte une réponse structurale et topologique à basse résolution. Les structures des ribosomes 80S assemblés sur l’ARNm de l’histone H4 ainsi que les différents complexes d’initiation intermédiaires (43S, 48S) sont étudiés. La cristallographie aux rayons X est utilisée pour résoudre la structure de l’ARNm à haute résolution, sous forme libre ou en complexe avec des ligands comme le facteur d’initiation eIF4E ou la protéine SLBP impliquée dans la maturation de l’ARNm en se fixant à son extrémité 3’. Enfin, le projet s’emploie à répertorier l’ensemble des ARNm cellulaires pouvant utiliser un mécanisme d’initiation interne similaire à celui de l’histone H4. Nous utilisons la méthode « CLIP-SEQ » pour isoler par immuno-précipitation les ARNm fixant eIF4E de façon non conventionnelle sur son domaine amino-terminal. Ces ARNm sont identifiés par séquençage haut débit et comparés au transcriptome cellulaire.
Résumé de la soumission : Notre laboratoire a récemment montré que la traduction de l’histone H4 était initiée par un mécanisme original reprenant à la fois certaines caractéristiques cellulaires (fixation à la coiffe) et virales (absence de scanning et entrée interne des ribosomes). Les ribosomes sont recrutés par des facteurs d’initiation fixés sur des séquences de l’ARNm situées dans la phase codante pour la protéine. Ceux-ci sont déposés directement sur l’AUG initiateur où d’autres structures de l’ARNm participent à son positionnement. Ce mécanisme simplifié assure un démarrage immédiat de la traduction, sans étape de scanning coûteuse en temps et énergie. C’est la première fois qu’un mécanisme de « tethering » des ribosomes à partir d’un site de recrutement interne est ainsi démontré. Ce processus simplifié d’initiation pourrait expliquer la production massive en histone destinée à compacter l’ADN synthétisé lors de la phase S du cycle cellulaire. C’est sur la base de ces résultats actuellement sous presse dans Molecular Cell que repose le projet MITIC. Il se décompose en 6 tâches explorant différents aspects fonctionnels et structuraux du phénomène de tethering.(1) Un point essentiel du projet consistera à recenser les ARNm cellulaires fixant le facteur eIF4E sur des éléments structuraux internes qui pourraient conduire à une initiation de la traduction de type tethering. Nous développerons un système d’isolement des ARNm utilisant le tethering grâce à l’utilisation de variants d’eIF4E capables de fixer les structures secondaires des ARNm. Ces ARNm seront identifiés par « deep sequencing » ce qui permettra d’évaluer l’importance du mécanisme de tethering dans la cellule. (2) Parmi les éléments structuraux essentiels de l’ARNm H4, notre étude a mis en évidence un élément 4E-SE (eIF4E-Sensitive Element) impliqué dans la fixation d’eIF4E. Nous examinerons le rôle de cet élément dans l’export nucléo-cytoplasmique à l’aide de tests de co-immunoprécipitation sur des extraits nucléaires. L’ARNm de l’histone H4 pourrait être exporté par la voie impliquant eIF4E qui est réservée à l’export de certains ARNm impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire.(3) Le projet consistera également à identifier de manière exhaustive les partenaires protéiques impliqués dans l’initiation par tethering. Des tests de reconstitution de complexes d’initiation seront entrepris à partir de facteurs purifiés à partir de cellules HeLa ou recombinants.(4, 5) L’étude tridimensionnelle de l’ARNm et des complexes d’initiation constituera un autre point déterminant du projet. Nous avons mis au point un protocole d’assemblage de complexes d’initiation sur l’ARNm H4 et d’immobilisation sur support de billes magnétiques. Un modèle préliminaire de la structure du complexe 80S sur l’ARNm H4 bloqué par la cycloheximide a été obtenu par cryoEM. Il sera affiné dans le cadre du projet. Nous développerons des protocoles dérivés afin d’isoler des complexes 48S sur l’ARNm H4, c’est-à-dire la petite sous-unité ribosomique fixée sur l’AUG initiateur en présence des facteurs d’initiation. La structure d’une telle particule 48S n’a jamais été résolue auparavant. L’ARNm de l’histone H4 constitue également une plateforme d’assemblage et d’observation idéale du facteur eIF4F. En effet, en se fixant de façon interne, il sera certainement plus stable que le même facteur fixé à l’extrémité 5’ d’un ARNm conventionnel non structuré.(6) Enfin, la structure tridimensionnelle de l’ARNm sera étudiée par diffraction ou diffusion des rayons X (SAXS) ainsi que le domaine N-terminal du facteur d’initiation eIF4E, impliqué dans la fixation à l‘élément 4E-SE et dont la structure est à ce jour encore inconnue.
Résultats : L’ARNm de l’histone H4 possède une structure unique agissant comme un riboswitch à coiffe. Lorsque la coiffe est séquestrée dans cet « interrupteur », l’ARNm est maintenu dans une conformation inactive. Nous avons établi un modèle préliminaire d’interaction de la coiffe par sondage en solution et pontage aux rayons UV. Le recensement des ARNm cellulaires capables d’interagir avec eIF4E en utilisant un mode similaire à celui de l’ARNm de l’histone H4 a été entrepris. Nous utilisons l’approche du « ribosome profiling » qui permet d’observer l’occupation de tous les ARNm cellulaires par les ribosomes. Des lignées stables (Flp-ln T-REX 293) exprimant eIF4E sauvage et délété de l’extrémité N-terminale, essentielle pour la fixation de l’ARNm H4, ont été construites et seront testées. Une première reconstruction 3D du complexe 80S/H4 a pu être obtenue par cryoEM. Cette structure préliminaire a moyenne résolution montre un ribosome intact au niveau des structures d’ARNr et des protéines ribosomales. Par ailleurs, une densité a pu être identifiée par différence avec une structure de référence du ribosome vide, indiquant la présence de l’ARN H4 proche de l’entrée du site d’entrée de l’ARNm de la petite sous-unité ribosomale. Des nouvelles préparations du complexe 80S/H4 sont en cours de traitement avec sur le cryo-microscope électronique Titan Krios installé récemment par le partenaire 2. Le traitement des données devrait conduire à une reconstruction 3D au niveau moléculaire. L’analyse de grilles de complexes 48S assemblés sur l’ARNm H4 est également en cours. Dix-huit formes tronquées de l’ARNm ont été purifiées et soumises à des essais de cristallisation. Cependant, aucun cristal n’a été obtenu. Des expériences de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ont été entreprises sur la ligne X33 au synchrotron DESY à Hambourg. Les différents modèles ab initio qui ont été générés suggèrent que l' ARNm H4 n'est pas compact mais de forme allongée, sinueuse et ramifiée.
Perspectives : Le recensement des ARNm fixant eIF4E de manière interne pourra permettre de dresser la carte complète des cibles dont l’expression est augmentée par eIF4E dans les cellules cancéreuses. En effet, il a été montré qu’eIF4E est surproduit dans les cellules tumorales et qu’il augmente l’expression de nombreux gènes présentant des extrémités 5’ non traduites particulièrement structurées où il pourrait se fixer et stimuler le recrutement des complexes d’initiation. L’élucidation de l’interactome d’eIF4E pourra conduire à des développements de puces permettant à terme de diagnostiquer la nature tumorale d’une culture cellulaire ou d’un prélèvement de tissu. D'un point de vue des approches structurales, les efforts vont désormais porter sur l'obtention de particules ribosomiques 48S assemblées sur l'ARNm H4 pour l'étude par cryo microscopie électronique. L'approche SAXS sera employée sur l'ARNm isolé afin d'obtenir l'enveloppe de l'ARNm. Différents fragments tronqués de l'ARNm seront utilisés afin d'orienter et d'aider la construction d'un modèle de repliement tertiaire de l'ARNm H4.
Publications et brevets : Rapid purification of ribosomal particles assembled on histone H4 mRNA: a new method based on mRNA-DNA chimeras
Prongidi-Fix, L., Schaeffer, L., Simonetti, A., Barends, S., Ménétret, J.F., Klaholz, B., Eriani, G. and Martin, F. (2013) 
BIOCHEM J. 449, 719-728.
The paper describes the new method we have developed to isolate 80S ribosomal particles assembled on histone H4 mRNA. The method can be adapted to isolate 80S and 48S particles assembled on any mRNA.
Cap analogs containing 6-thioguanosine–reagents for the synthesis of mRNAs selectively photo-crosslinkable with cap-binding biomolecules. 
Nowakowska, M., Kowalska, J., Martin, F., d’Orchymont, A., Zuberek, J., Lukaszewicz, M., Darzynkiewicza, E. and Jemielity, J.
ORG. BIOMOL. CHEM. (2014) 12, 4841-4847.
This paper describes the crosslink capacity of new cap analogs synthesized in collaboration with the lab of Jacek Jemielity. With these results, the orientation of 5’ cap end of histone H4 mRNA could be oriented over the cap-binding pocket of the mRNA.
Hypermethylated-capped selenoprotein mRNAs in mammals 
Wurth, L., Gribling-Burrer, A.S., Verheggen, C., Leichter, M., Takeuchi, A., Baudrey, S., Martin, F., Krol, A., Bertrand, E. and Allmang, C. 
NUCL. ACIDS RES. (2014) 42, 8663-8677 first published online July 10, 2014 doi:10.1093/nar/gku580
In the broader framework of our project, we have explored translation initiation of selenocysteine-containing protein mRNAs. These mRNAs are hypermethylated in a way reminiscent of small nuclear RNAs. They do not bind the cap-binding initiation factor eIF4E but are found in polysomes. Further experiments will be performed to understand this unusual mode of translation initiation.