Projet ANR-10-JCJC-1502 – DenSicelles : Micelles complexes polyioniques : vecteurs de siRNA dans les cellules dendritiques immatures pour une immunothérapie cellulaire ex vivo dans l'arthrite.
Programme : JCJC : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (JCJC SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Anne AUBERT-POUESSEL (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
Partenaires : Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux - Institut Charles Gerhardt Montpellier
Montant : 215000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Nouvel outil thérapeutique pour renforcer le potentiel tolérogène des cellules dendritiques pour une application dans l’arthrite.Notre étude consiste à développer un vecteur capable de libérer des petits ARNs interférents pour renforcer le potentiel tolérogène des cellules dendritiques. Ces cellules modifiées permettront de rétablir un contrôle de la réponse immune.
Développement de Micelles de copolymère pour une vectorisation d’ARN interférent dans les cellules dendritiquesLes cellules dendritiques (DCs), cellules présentatrices d’antigènes professionnelles, ont un rôle clé dans la réponse immunitaire adaptative. Elles sont impliquées dans les mécanismes de tolérance périphérique et capables d’orienter la réponse immunitaire vers une immunité ou une tolérance en fonction de leur état de maturation. Afin d’envisager l’utilisation de DCs immatures pour rétablir une tolérance aux antigènes du soi dans les maladies auto-immunes telle que la polyarthrite, il apparaît crucial de bloquer l’induction de leur maturation afin de potentialiser leur propriétés tolérogènes. Nous envisageons d’utiliser de petits ARNs interférents (siRNA), ciblant des gènes conférant des propriétés immunogènes aux DCs. La vectorisation de ces siRNAs est un domaine de recherche en pleine expansion, et l’émergence de nouveaux vecteurs synthétiques semble une alternative plus réaliste que l’utilisation de vecteurs viraux, souvent efficaces mais toxiques et provoquant une maturation des DCs. Nous proposons dans ce projet, d’utiliser des micelles complexes polyioniques (PIC micelles) pour délivrer ex vivo les siRNAs dans les DCs. Les PIC micelles sont des nanoparticules composées d'un copolymère double hydrophile ionique et d'un polymère contre-polyion qui s’auto-assemblent par interactions électrostatiques. Pour une action optimale, les micelles doivent répondre à un certain nombre de critères : être stables en conditions physiologiques, être cyto-tolérantes vis-à-vis des DCs (ne pas modifier leur statut fonctionnel), être endocytées et protéger le siRNA pour le libérer dans le cytosol après échappement endosomal.
Evaluation des micelles de siRNA : de la membrane simple à la physiologie cellulaire-	Suivi de l’échappement endosomal des micelles sur des membranes modèles de liposomes ou de globules rouges-	Suivi du trafic intracellulaire des micelles : blocage chimique spécifique de chaque voie d’endocytose, suivi de micelles fluorescentes-	Suivi de l’efficacité du complexe micelle/SiRNA : extinction d’une protéine fluorescente dans des cellules modèles, extinction de molécules immunogènes dans des cellules dendritiques
Résumé de la soumission : Les cellules dendritiques (DCs), cellules présentatrices d’antigènes professionnelles, ont un rôle clé dans la réponse immunitaire adaptative. Elles sont impliquées dans les mécanismes de tolérance périphérique et capables d’orienter la réponse immunitaire vers une immunité ou une tolérance en fonction de leur état de maturation. Afin d’envisager l’utilisation de DCs immatures pour rétablir une tolérance aux antigènes du soi dans les maladies auto-immunes telle que la polyarthrite, il apparaît crucial de bloquer l’induction de leur maturation afin de potentialiser leur propriétés tolérogènes. Nous envisageons d’utiliser de petits ARNs interférents (siRNA), ciblant des gènes conférant des propriétés immunogènes aux DCs. La vectorisation de ces siRNAs est un domaine de recherche en pleine expansion, et l’émergence de nouveaux vecteurs synthétiques semble une alternative plus réaliste que l’utilisation de vecteurs viraux, souvent efficaces mais toxiques. Nous proposons dans ce projet, d’utiliser des micelles complexes polyioniques (PIC micelles) pour délivrer ex vivo les siRNAs dans les DCs.Les PIC micelles sont des nanoparticules composées d'un copolymère double hydrophile ionique et d'un polymère contre-polyion qui s’auto-assemblent par interactions électrostatiques. Pour une action optimale, les micelles doivent répondre à un certain nombre de critères : être stables en conditions physiologiques, être cyto-tolérantes vis-à-vis des DCs (ne pas modifier leur statut fonctionnel), être endocytées et protéger le siRNA pour le libérer dans le cytosol après échappement endosomal. Une étude avec des PIC micelles d’acide polyméthacrylique-b-polyethylène oxyde et de poly-L-lysine nous a permis d’obtenir des objets répondant à tous ces critères. Des molécules modèles (peptide, siRNA) ont ensuite été encapsulées pour valider le concept. Les micelles en présence des DCs ont permis, pour le peptide une présentation efficace aux lymphocytes T et pour le siRNA une extinction de l’expression de la protéine cible. Le projet est divisé en 3 objectifs. L’objectif 1 consiste en l’optimisation des PIC micelles pour permettre une libération efficace du siRNA dans le cytosol et l’étude de leur trafic intracellulaire. Des micelles seront préparées avec des copolymères à chaînes plus longues, greffés avec des fluorophores afin d’améliorer et de suivre l’échappement endosomal. Enfin, nous caractériserons leur trafic intracellulaire à l’aide d’inhibiteurs spécifiques, leur localisation subcellulaire par co-localisation avec des protéines marqueurs et étudierons le devenir des polymères une fois dans le cytosol. L’objectif 2 consiste à tester in vitro différents siRNAs afin de diminuer l’immunogénicité des DCs et d’orienter la réponse immunitaire vers un phénotype Th2. Les molécules cibles seront les cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-12 et/ou des molécules de co-stimulations (CD40). Les propriétés tolérogènes des DCs seront évaluées in vitro, d’une part par la caractérisation de leur état de maturation, de leur profil cytokinique et de leur capacité à induire, ou non, une prolifération des lymphocytes T. Enfin l’objectif 3 consiste à étudier la capacité de ces DCs immatures, transfectées par les micelles de siRNA, à moduler la réponse immune in vivo, dans un modèle expérimental d’arthrite. Ces DCs modifiées seront injectées à différentes étapes de la pathologie afin d’évaluer leur efficacité thérapeutique. Ce projet est basé sur une étroite collaboration entre des pharmaciens-chimistes développant des PIC micelles comme vecteurs de molécules thérapeutiques et des biologistes cellulaires utilisant les DCs pour induire une tolérance dans les modèles expérimentaux d’arthrite. Le résultat final sera de renforcer le potentiel thérapeutique de DCs immatures pour envisager leur utilisation dans les maladies auto-immunes telles que l’arthrite expérimentale et la polyarthrite rhumatoïde chez l’homme.
Résultats : Dans un premier temps, nous avons sélectionné des polymères, en étroite collaboration avec les équipes de  B. Frisch (Strasbourg) et V. Lapinte (Montpellier), pour la formulation des micelles avec ou sans ARN interférents et étudié leurs propriétés physico-chimiques (taille, stabilité, pH sensibilité), leur toxicité sur différents types cellulaires et leur bio-compatibilité sur les cellules dendritiques primaires murines. Leur capacité à déstabiliser les membranes a été validée sur un modèle in vitro de liposomes et sur des globules rouges.
Dans un deuxième temps, nous avons travaillé plus spécifiquement sur l’efficacité et les mécanismes d’entrée et de trafic intracellulaire des micelles. Nous utilisons des molécules chimiques qui bloquent spécifiquement les différents mécanismes d’entrée dans la cellule des micelles formulées avec des siRNA fluorescents. Le suivi de la fluorescence est analysé en cytométrie en flux et par microscopie confocale. La partie du projet visant à déterminer le devenir des polymères après désassemblage des micelles ne sera réalisé qu’après synthèse de polymères fluorescents.
En parallèle nous travaillons également sur l’efficacité d’extinction de gène ciblé par les siRNA dans les cellules dendritiques. Alors que l’efficacité de transfection est bonne, équivalente à celle d’autres vecteurs dans d’autres types cellulaires, l’extinction de l’expression de la GFP, choisi comme modèle dans cette partie du projet est faible (10%). Pour remédier à ce problème d’efficacité nous formulons actuellement les micelles avec des siRNAs ciblant différentes molécules afin d’étudier cette efficacité dans d’autres types cellulaires (primaires et lignées).
Perspectives : Les applications thérapeutiques de ce projet couvrent à la fois les domaines de l’autoimmunité et de la thérapie anticancéreuse car les cellules dendritiques modifiées pour l’expression de certains gènes peuvent être utilisées à la fois pour moduler ou au contraire stimuler la réponse immunitaire.
Les résultats de stabilité des micelles formulées avec les ARNs interférents dans des milieux physiologiques ainsi que la biocompatibilité de ces micelles sont très satisfaisants. Ces résultats laissent entrevoir la possibilité d’envisager l’injection intraveineuse des complexes siRNA/micelle et leur suivi dans l’organisme. Cela va probablement nécessiter la modification chimique de la surface des micelles, par exemple le greffage de molécules qui permettent aux micelles d’atteindre spécifiquement les cellules dendritiques une fois dans la circulation générale.
Publications et brevets : Les résultats de l’étude sur l’échappement endosomal a été présenté sous forme de poster lors du congrès du Groupement Thématique de Recherche sur La vectorisation à Bruxelles, en décembre 2012 : puis a fait l’objet d’une présentation aux journées de l’Ecole Doctorale en juin 2012.
Un article est en rédaction sur la formulation et la caractérisation des micelles de copolymères de masse molaire différente, leur capacité d’échappement endosomal et leur cytotolérance.