Projet ANR-11-BSV5-0026 – MEDDU : Formulations originales de liposomes acoustiques pour une délivrance assistée par des ultrasons
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Chantal PICHON (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE POITOU-CHARENTES)
Partenaires : Unité de Technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé; Centre de Biophysique Moléculaire; Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 400000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Délivrance d’ADN médicament ciblée par ultrasons et microbulles, un pas vers la théranostiqueLes récents succès cliniques de la thérapie génique démontrent que cette approche est réalisable. Nous proposons un système fiable de délivrance ciblée basé sur l’utilisation d'ultrasons assistés de microbulles de gaz transportant l’ADN thérapeutique. Ces microbulles oscillent sous ultrasons induisant une amélioration de leur délivrance dans les tissus à proximité. les ultrasons présent l'avantage d'atteindre des tissus profonds de manière non invasive,
Formulations originales de microbulles de gaz pour la délivrance ciblée de gènes par ultrasons.Malgré des efforts de développement de systèmes de délivrance de médicaments, les indices thérapeutiques et la sélectivité obtenus vis-à-vis des cibles pathologiques restent faibles. Le manque de sélectivité se traduit souvent par une forte toxicité. L'utilisation des ultrasons couplés aux microbulles de gaz est une approche pour atteindre de manière non invasive des cibles même profondes dans l'organisme. Il est donc important de développer de nouvelles microbulles adaptées au médicament à délivrer et d'approfondir les connaissances sur le comportement extra- et intracellulaire de celles-ci et de leur contenu pour connaître l'étendue de leurs applications.L’objectif du projet est de développer des microbulles de gaz capables de transporter des gènes médicaments et les délivrer spécifiquement à un endroit donné de l’organisme sous l’action des ultrasons. Le challenge est d’obtenir des particules capables de se lier à de l’ADN et de l’acheminer jusqu’au noyau des cellules cibles pour y être exprimé. De plus, ces particules doivent être stables dans l’organisme, activables spécifiquement par ultrasons et avoir la capacité d’être imagées par échographie.
Caractérisation des nouvelles microbulles développées pour le transfert de gènes.Les microbulles sont préparées par agitation mécanique de formulations originales de lipides cationiques, de colipides fusogéniques et d’agents surfactants. Les microbulles développées sont analysées et mesurées par microscopie optique, cytométrie en flux et microscopie confocale de fluorescence. L’activité acoustique des microbulles est analysée par la mesure de leur atténuation acoustique et par imagerie ultra-rapide. L’efficacité de transfert de gènes est mesurée in vitro à l’aide d’un gène rapporteur luciférase ou fluorescent et en utilisant un sonoporateur expérimental.
Résumé de la soumission : L'objectif principal de notre projet est de développer des formulations de microbulles de gaz à base de liposomes originaux pour obtenir un système de délivrance de gène assisté par ultrasons (UMTD). Comparé à d’autres méthodes physiques de délivrance, elle offre la possibilité d’atteindre des organes profonds de manière non invasive. Sous l’action des ultrasons, l’oscillation des microbulles génère une perméabilité cellulaire due à la formation de pores. Ce phénomène est appelé la sonoporation. Récemment, des travaux dont les nôtres suggèrent que l’endocytose pourrait être également impliquée. Il est possible que le mécanisme impliqué dans la sonoporation pourrait dépendre à la fois du type de MB, de leur taille et des cellules utilisées. Cette hypothèse s’appuie sur nos résultats préliminaires en temps réel montrant une meilleure internalisation de MB de petite taille sous certaines conditions acoustiques. Ainsi, le développement de ce système repose sur la compréhension des mécanismes régissant les interactions microbulles-cellules. Ceci peut être abordé en maîtrisant la taille des bulles et en adaptant leur composition chimique afin d’évaluer l’impact de leur interaction avec les membranes cellulaires. Par rapport aux bulles de gaz existantes, ces nouveaux liposomes gazeux auront à la fois des propriétés acoustiques et des propriétés de surface différentes qui augmenteront leurs interactions et/ou permettront leur fusion avec les membranes cellulaires pour une meilleure délivrance de leur cargo. Ce projet comprend deux parties: une partie fondamentale consistant en la formulation de liposomes gazeux, l'étude de leurs propriétés acoustiques et physico-chimiques ainsi que la compréhension de tous les mécanismes gouvernant les interactions ultrasons-microbulles-cellule; et une seconde partie consistant à leur développement expérimental pour le transfert de gènes in vivo.Les lipides qui seront utilisés sont originaux et ont été développés par les partenaires. Ils possèdent des activités spécifiques envers les membranes cellulaires, en particulier en fonction du pH. La caractérisation des bulles sera réalisée d’un point de vue physico-chimique et acoustique. Nous étudierons également l’internalisation et le routage intracellulaire des bulles et de leur cargo. En effet, ce sont des données absentes dans la littérature. En vue de leur application in vivo, nous rechercherons une relation entre les propriétés physico-chimiques des bulles et leur capacité à s’accumuler dans une région spécifique de l’organisme suite à une administration systémique. Ces bulles seront ensuite exploitées pour la délivrance de gènes in vivo. En particulier, nous nous focaliserons sur leur capacité à transférer des gènes dans les tendons et le foie respectivement par administration locale et systémique. La réalisation de ce projet permettra de préciser de manière fine la composition chimique requise pour une bonne délivrance assistée par ultrasons. Les bulles originales qui émaneront de ce projet pourraient servir de plateformes pour préparer dans le futur, des bulles ciblées pour l’imagerie et la thérapie.
Résultats : Les formulations développées ont permis la production de microbulles de taille et de concentration compatibles avec notre application. Ces microbulles ont une bonne capacité à se lier à de l’ADN plasmidique. Les complexes microbulles/ADN sont activables par ultrasons avec un pic de résonnance compris entre 1 et 1,5 MHz. Les complexes sont suffisamment stables dans le temps pour réaliser du transfert de gènes. Les expériences d’imagerie ultra-rapide en présence de cellules en culture a montré une interaction préférentielle des particules pour les membranes cellulaires. In vitro, un protocole de transfert de gènes efficace a été mis en place permettant une délivrance spécifique après activation ultrasonore. Les paramètres acoustiques optimaux ont été analysés. Des expériences préliminaires ont donné des résultats encourageants démontrant un transfert de gènes in vivo dans les tissus superficiels et profonds.
Perspectives : Le ciblage de la délivrance de médicaments reste un challenge à l’heure actuelle. Le déclenchement du ciblage par les ultrasons permet d'éliminer cet obstacle, grâce à la grande focalisation que permet d'obtenir les technologies actuelles qui sont de plus en pleine évolution. Ce ciblage est renforcé par la possibilité d’armer les microbulles, transporteurs de  médicaments avec des motifs de reconnaissance présents dans les tissus pathologiques. Notre projet s’inscrit également dans un domaine en évolution et très prometteur qui concerne le développement de vecteurs « théranostiques ». En effet, les microbulles originaux peuvent être exploité à la fois pour faire de l’imagerie ultrasonore et une délivrance active de médicaments. Le potentiel de valorisation de celles-ci est donc prometteur dans la mesure où nous détenons déjà les brevets des molécules qui entrent majoritairement dans la fabrication des microbulles.
Publications et brevets : 1.« Ultrasound and microbbule-assisted gene delivery :recent advances and ongoing challenges, Delalande, Postema, Mignet, Midoux, Pichon. Therapeutic Delivery 2012;3(10):1199-215.
2.	«Sonoporation: Mechanistics insights and ongoing challenges for gene transfer«, Delalande, Kotopoulis, Postema, Midoux, Pichon. Gene 2013; 525(2):191-9.