Projet ANR-10-BLAN-1202 – CBioS : Fonctions cellulaires des protéines STOP : vers une compréhension fonctionnelle et moléculaire du rôle des microtubules dans la transmission synaptique et l’organisation neuronale
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Annie Andrieux (COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES - DIRECTION DU CENTRE DE FONTENAY-AUX-ROSES)
Partenaires : Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
Montant : 400000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Les protéines STOP/MAP6 et les microtubules: éléments cruciaux pour les neurones ?Vers une compréhension fonctionnelle et moléculaire du rôle des microtubules et des protéines STOP/MAP6 dans la transmission synaptique et l’organisation neuronale 
Définir les fonctions cellulaires et biochimiques des protéines STOP/MAP6Les protéines MAP6 sont des effecteurs majeurs des microtubules dont la délétion chez la souris conduit à de graves altérations des fonctions mentales supérieures avec des défauts cognitifs sensibles aux antipsychotiques. La souris STOP KO est largement utilisée pour étudier différents aspects de la physiopathologie de la schizophrénie. Le défi actuel consiste à étudier les propriétés cellulaires et moléculaires des protéines MAP6 pour établir les liens qui relient ces propriétés et les fonctions mentales supérieures.Nous analysons :-la dynamique et la plasticité des cônes de croissance et des épines dendritiques-les cascades de signalisation dépendantes de MAP6 au cours de la guidance axonale-le transport axonal-le recrutement protéique durant l’activation de la synapse-les propriétés de base des protéines MAP6 dans l’interaction avec les microtubules et l’actine
Approche cellulaire et moléculaire des protéines MAP6Nous cultivons des neurones issus des embryons déficients pour MAP6/STOP et comparons leurs propriétés à ceux de neurones sauvages. Par imagerie à fluorescence nous analysons différents paramètres dynamique des microtubules, transport axonal, différentiation.Nous produisons des protéines recombinantes en grande quantité et analysons leur propriétés in vitro vis-à-vis des microtubules ou de l’actine notamment en microscopie TIRF ;
Résumé de la soumission : Les microtubules sont les principaux constituants protéiques des neurones. Les microtubules ont longtemps été considérés comme des structures de maintenance cellulaire. Notre groupe a fourni une des premières indications expérimentales d’un rôle des microtubules dans d’autres fonctions neuronales, comme la neurotransmission, en développant un modèle de souris déficientes pour des protéines associées aux microtubules, les protéines STOPs (souris STOP KO). Ces souris présentent des troubles comportementaux sévères, réactifs aux drogues antipsychotiques comme les neuroleptiques, et associés à des défauts de la plasticité synaptique à court et long terme. Récemment nous avons observé une réduction globale de la masse cérébrale dans les souris STOP KO, associée à des défauts de plusieurs faisceaux axonaux, sans diminution détectable du nombre de neurones. Les déficits axonaux liés à la suppression des protéines STOPs sont massifs dans le fornix dont la partie postérieure est absente. Nos observations récentes, sur lesquelles se fonde le programme proposé, indiquent que les défauts d’organisation neuronale des souris STOP KO corrèlent avec des anomalies cellulaires sévères, affectant la morphogenèse, la guidance et le transport axonaux ainsi que l’import membranaire de divers récepteurs et l’organisation des densités post synaptiques.In vitro, le comportement spontané du cône de croissance semble anormal dans des neurones STOP KO, qui sont souvent tortueux et exagérément ramifiés. Ces anomalies pourraient refléter un rôle des protéines STOPs dans la régulation des assemblages d’actine et de microtubules dans le cône de croissance. La partie postérieure du fornix, manquante dans les souris STOP KO, est constituée des axones des neurones du subiculum. Nos données préliminaires indiquent que la réactivité des neurones du subiculum à un facteur de guidance axonal majeur, la sémaphorine 3 E, est perdue dans les neurones STOP KO. Nous testons actuellement la généralité de cette observation, dans d’autres cascades de signalisation dépendantes des sémaphorines. Les déficits d’arborisation axonale observés dans les souris STOP KO pourraient également être reliés à des défauts affectant le transport axonal et la signalisation BDNF. Nous avons de solides indications d’un défaut de transport rétrograde, dynéine dépendant dans les neurones STOP KO, avec atteinte concomitante du transport antérograde, et d’un défaut de positionnement du récepteur TrkB, un élément essentiel de la signalisation par BDNF.Nous avons récemment observé une diminution marquée de l’épaisseur de la densité post synaptique (PSD) dans les synapses STOP KO, apparemment liée à un défaut d’import protéique lors de l’activation synaptique. Plusieurs études ont montré que les protéines STOPs font partie des constituants de base des PSDs. Nous testons actuellement le défaut d’import d’autres protéines dans les synapses STOP KO, avec un intérêt particulier pour la CAMKII, qui est reliée de plusieurs manières aux protéines STOPs.Enfin, nous finaliserons des travaux en cours, montrant un rôle des STOPs dans la signalisation calcique neuronale, impliquant le positionnement de canaux calcium à la membrane. Nous avons identifié des partenaires des STOPs, autres que les microtubules. Les plus pertinents dans le cadre du programme proposé incluent l’actine, la CamKII, les CRMPs, des éléments majeurs de la signalisation par les sémaphorines ; Tctex-1, une sous unité du complexe dynéine avec un rôle autonome dans la signalisation calcique, et PSD 95, une protéine clé de la plasticité synaptique.Nous proposons maintenant d’utiliser notre identification récente de phénotypes cellulaires clairs dans les neurones STOP KO et de nouveaux partenaires des STOPs, pour identifier des systèmes moléculaires affectés par la suppression des STOPs. Ce travail devrait révéler des mécanismes par lesquels les microtubules affectent les fonctions cérébrales intégrées.
Résultats : -L’étude de la différentiation in vitro des neurones STOP ko a été réalisée, on a pu mettre en évidence
* une différentiation précoce
* un nombre anormal d’épines dendritiques 
*une absence de sensitivité à l’action positive de la sémaphorine 3E 
-L’étude des canaux calciques a montré que la quantité fonctionnelle de canaux de type N et P/Q à la membrane est réduite 
-Les 3 isoformes de STOP/MAP6 ont été produites. L’étude de la forme MAP6-F sur la stabilité au froid des microtubules a été finalisée.
Ainsi on a pu montrer que la protéine MAP6-F est un « senseur »  de froid et qu’elle change de conformation en fonction de la température pour lier et protéger les microtubules de la dépolymérisation.
Perspectives : Poursuivre les caractérisations moléculaire et cellulaire des protéines MAP6/STOP. Définir des motifs fonctionnels.
Publications et brevets : Delphin C , Bouvier D, Seggio M, Couriol E, Saoudi Y, Denarier E, Bosc C, Valiron O, Arnal I, and Annie Andrieux.  Fibroblastic Microtubule Associated Protein 6 (MAP6-F) is a temperature-sensor that directly binds to and protects microtubules from cold-induced depolymerization. J Biol Chem 2012