Projet ANR-08-MIEN-0032 – NidoRNAends : Nidovirus: protection et utilisation des extrémités des ARNs viraux
Programme : Maladies Infectieuses et environnement (MIE) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : UNIVERSITE AIX-MARSEILLE II  [DE LA MEDITERRANEE] (UNIVERSITE AIX-MARSEILLE II  [DE LA MEDITERRANEE])
Partenaires : Aix-Marseille université
Montant : 200000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Avant l'émergence de l'épidémie du SRAS-Coronavirus en 2003, les mécanismes sophistiqués de la réplication des nidovirus étaient peu étudiés. L'objectif de ce projet est de comprendre les réactions complexes qui se produisent aux extrémités de ces ARN (+) viraux, afin non seulement de les protéger de la dégradation par la cellule infectée, mais également pour permettre leur utilisation comme substrats afin de perpétuer le matériel génétique viral. Les objectifs de ce projet sont i) identification et caractérisation des mécanismes d'actions des enzymes responsables de la formation de la coiffe, ii) compréhension du rôle de l'ARN primase chez les coronavirus lors de l'initiation de la synthèse des ARN viraux et iii) élucidation des mécanismes d'initiation de la synthèse des ARN chez les arterivirus par «priming». Ce travail va permettre de comprendre chez des virus prototypes de la famille des nidovirus, comment les mécanismes de protection et ceux de synthèse des ARN viraux sont couplésL'émergence de virus pathogènes infectant l'homme, tel que le coronavirus responsable du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère (SARS-CoV), ont révélé au monde les risques pandémies impliquant les nidovirus. Or, les principes fondamentaux gouvernant la réplication des Nidovirus restent très mal compris. Ce projet vise d'une part à élucider les mécanismes d'initiation de la réplication des ARN de Nidovirus et d'autre part à comprendre les mécanismes de protection des extrémités 5' des ARNm viraux par addition d'une coiffe ou par liaison covalente d'un peptide. Nous proposons dans une première approche de caractériser les structures présentes à l'extrémité 5' de différentes familles de virus appartenant à l'ordre des Nidovirales. Nous déterminerons le type de coiffe présent en 5' des ARN de coronavirus, et nous déterminerons si les ARN d'arterivirus sont protégés par une coiffe ou un peptide liée de façon covalente, ou les deux. Nous projetons ensuite d'identifier les enzymes impliquées dans la formation de la structure coiffe des ARN de coronavirus en utilisant une méthode originale basée sur la technique de dot blot afin d'identifier les guanyltransferases et les N7-méthyltransférases sur base de leur capacité à reconnaître spécifiquement leurs substrats. Nous étudierons ensuite les mécanismes de l'initiation de la synthèse des ARN chez ces virus. Nous avons en effet récemment identifié une ARN primase chez les coronavirus. Nous tenterons de comprendre les mécanismes de coopérativité entre la primase virale et la polymérase virale. Enfin, nous avons récemment montré que l'activité polymérase des artérivirus (EAV) est stimulée par la protéine nsp7. De plus, la protéine nsp7 est guanylée en présence de la polymérase de EAV. Nous déterminerons comment ces deux enzymes coopèrent pour la formation de la coiffe et/ou de l'initiation de la synthèse des ARN viraux et nous évaluerons par génétique inverse, le rôle de la guanylation lors de la réplication virale. L'objectif de ce projet est de comprendre les réactions complexes qui se produisent aux extrémités des ARN (+) des Nidovirales, ordre virale qui comprend de nombreux agents pathogènes humains et animaux. L'utilisation d'approches biochimiques combinées avec les méthodes d'analyses structurales et les techniques de génétique inverse devraient non seulement permettre une compréhension globale des mécanismes de protection des ARN viraux de la dégradation par la cellule hôte, mais également permettre d'élucider les mécanismes d'initiation de la réplication/transcription. Nous identifierons 1) comment l'extrémité 5' des nidovirus est protégée et quelles sont les enzymes virales impliquées, et également 2) la façon dont l'initiation de la réplication du génome est régulée par l'ARN primase et/ou d'autres protéines virales. Ce projet va permettra l'acquisition de connaissances fondamentales sur les mécanismes de réplication des nidovirus préliminaires au développement de stratégies antivirale