Projet ANR-10-CESA-0003 – MYCODIAG : Intégration d’outils sélectifs pour l’analyse de l’Ochratoxine A : méthodes de diagnostic pour l’évaluation du risque toxicologique
Programme : Contaminants, Ecosystèmes, Santé (CES)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Marie-Claire HENNION (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS B)
Partenaires : École supérieure de physique et de chimie industrielles de la ville de Paris; Centre national de la recherche scientifique; Institut National Recherche Sécurité; Institut national polytechnique de Toulouse; POLYINTELL
Montant : 374957.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Développement d’outils innovants pour l’analyse de l’Ochratoxine ADéveloppement de polymères à empreintes moléculaires et de supports à base d’aptamères sous différents formats pour l’analyse de l’Ochratoxine A dans le cadre de la surveillance d’expositions professionnelles, de la sécurité alimentaire et d’études d’évaluation de sa toxicité
Amélioration des performances des méthodes d’analyse de l’Ochratoxine ALes objectifs sont de synthétiser, de caractériser des supports à reconnaissance moléculaire, des polymères à empreintes moléculaires (MIP) et des oligoadsorbants (supports greffés par des aptamères, OS) et de développer des procédures sélectives d’extraction adaptées à chaque type de support et aux différentes matrices ciblées (poussières et fluides biologiques principalement). Différents formats sont envisagés : des formats cartouches conventionnels jusqu’à des dispositifs miniaturisés. Ces développements reposent en partie sur la synthèse et la purification de quantités suffisantes des métabolites d’intérêt (formes quinone de l’OTA, ainsi que les dérivés liés au glutathion comme l’OTHQ-GSH), métabolites que l’on retrouve dans les matrices biologiques d’organismes exposés à l’OTA.Il est parallèlement envisagé de générer de façon contrôlée des atmosphères empoussiérées puis d’étudier l’efficacité des supports développés pour l’analyse de l’OTA dans des prélèvements atmosphériques de poussières contaminées (analyses effectuées dans le cadre de l’évaluation des expositions professionnelles). Dans un deuxième temps ces outils serviront à faciliter l’analyse d’échantillons, notamment des fluides biologiques dans lesquels, par techniques conventionnelles, les métabolites ont été détectés.Si les outils développés au cours de ce projet seront mis à profit par deux des partenaires pour des applications bien ciblées (poussières contaminées, fluides biologiques), ces outils doivent être une alternative aux supports d’immunoaffinité, relativement performant mais très couteux, actuellement utilisés pour le contrôle alimentaire.
Synthèse, caractérisation de supports à reconnaissance moléculaire et applicationsDeux outils permettant d’extraire l’Ochratoxine A (OTA) par un mécanisme de reconnaissance moléculaire et donc d’éliminer tous les autres constituants des échantillons analysés ont été synthétisés : des polymères à empreintes moléculaires et des oligoadsorbants (support constitué d’aptamères greffés). Une caractérisation en milieu pur est réalisée pour évaluer la sélectivité du support vis-à-vis de l’OTA et sa capacité de rétention. L’étude se poursuit alors en milieu réel dopé, les autres composants de l’échantillon pouvant modifier le mécanisme de rétention et nécessiter ainsi une modification de la procédure d’utilisation établie en milieu pur. Ces supports sont ensuite fournis aux autres partenaires qui les évaluent sur leurs échantillons afin de les comparer aux outils existants. Si l’un attend de ces supports une amélioration de la sensibilité de sa méthode d’analyse de traces, l’autre attend que ces supports permettent aussi l’extraction sélective des métabolites de l’OTA recherchés pour évaluer l’effet toxique de celle-ci. Etant face à des échantillons de taille variée, ces supports seront préparés sous différents formats, plus ou moins miniaturisés, de manière à les adapter au mieux au besoin de l’analyte, la miniaturisation impliquant de revoir totalement les modes de synthèse et d’utilisation.
Résumé de la soumission : L’ochratoxine A (OTA) est la mycotoxine que l’on retrouve le plus dans nos régions tempérées, elle contamine les denrées alimentaires avant récolte mais aussi au cours du stockage. Son action sur synthèse de protéines et sur activité de certaines enzymes lui confère des propriétés néphrotoxiques, neurotoxiques et immunotoxiques. Suite à son ingestion, l’OTA se retrouve dans le sang puis est transporté jusqu’aux reins qui assure sa biotransformation en métabolites, responsables de sa toxicité, que l’on retrouve ensuite dans les fluides biologiques. De plus, son inhalation sur les lieux de travail est désormais considérée comme une voie d’exposition supplémentaire à considérer. Son suivi dans différentes matrices nécessite des méthodes d’analyse rapides, fiables et à faibles coûts. Son analyse se fait généralement par chromatographie liquide/détection par fluorescence après un prétraitement par immunoaffinité (IAC) pour éliminer les composants de l’échantillon.L’étude de l’impact de l’OTA lors de son inhalation via des particules de l’air nécessite cependant des méthodes très sensibles mais aussi adaptées à la taille réduite des échantillons ce qui rend les IAC inadaptés à ce type d’étude. De plus, leur application à l’analyse de matrices alimentaires a conduit à des sous-estimations des niveaux de contamination. Enfin, les anticorps mis en œuvre dans les IAC ne permettent pas le piégeage des métabolites de l’OTA et donc à leur application à leur recherche dans les fluides biologiques pour des études en toxicologie. MYCODIAG a pour objectif de proposer des systèmes d’extraction plus performants et moins couteux que les IAC via le développement de polymères à empreintes moléculaires (MIP) ou de supports à base d’aptamères immobilisés, des oligoadsorbants, permettant l’extraction sélective de l’OTA et de ses analogues structuraux de matrices complexes.Ces supports seront dans un premier temps développés en format traditionnel puis comparés aux IAC sur matrices réelles mais aussi développés en formats miniaturisés pour être adaptés à des échantillons de petite taille et pour être intégrés dans des systèmes analytiques directement utilisables sur le terrain. Les MIP sont obtenus par polymérisation de monomères autour d’une molécule empreinte, i.e. l’OTA ou un analogue, qui après élimination de cette dernière permet l’obtention de cavités complémentaires en taille et en fonctionnalités de la molécule ciblée ou d'analogues variés. Les aptamères sont des oligonucléotides dont la séquence particulière est capable de se lier avec une forte affinité à une molécule cible et à ses analogues structuraux. Comparés aux IAC, la plus grande capacité déjà reconnue pour les MIP et attendue pour les oligoadsorbants (taille plus petite des aptamères permettant d’augmenter les taux de greffage par rapport aux IAC) constitue un atout indéniable pour leur miniaturisation.De plus, des mécanismes de rétention différents sur ces supports doivent les rendre complémentaires lors de leur application à des matrices différentes et vis-à-vis des analogues. Ces outils seront évalués pour l'analyse de l'OTA de particules atmosphèriques de tailles bien définies et développées pour être utilisées à terme dans des études d'inhalation. Ils seront aussi évalués dans le cadre d'études toxicologiques menées sur des fluides biologiques (sang, urines) d'animaux soumis à une ingestion d'OTA, études pour lesquelles l'analyse des métabolites et d'adduits ADN constitue un point important pour améliorer la compréhension du mode d'action de l'OTA. Ces évaluations en matrices réelles constitueront un atout important pour évaluer les risques de contamination par inhalation.
Résultats : -	Premier développement d’un oligoadsorbant (OS) utilisé en SPE pour l’extraction de l’OTA avant analyse LC/Fluo
-	Première comparaison support d’immunoaffinité/OS
-	Mise en évidence du mécanisme d’action commun entre la formation d’adduit à l’ADN d’ochratoxine et la forme conjuguée de l’OTA sous forme d’OTB-GSH.
-	Isolement de quantité suffisante d’OTHQ (forme quinone de l’OTA) afin de pouvoir  tester les nouveaux outils
-	Plusieurs matrices ont été testées en SPE et montrent la performance du MIP pour détecter l’OTA à l’échelle de 0.5 – 1 µg/kg
-	Génération d’échantillons d’atmosphères empoussiérées et 1ères comparaisons support d’immunoaffinité/MIP
Perspectives : Si pour cette étude l’OTA est la molécule pour laquelle il est nécessaire de développer des outils plus performants que ceux existants, de nombreux résultats aideront à la transposition des outils développer à d’autres molécules et d’autres domaines pour lesquels les besoins analytiques sont importants.
Publications et brevets : Les résultats issus de ce projet ont donnés lieu à deux posters présentés conjointement par les partenaires 1 et 2. Chaque partenaire assure parallèlement une diffusion importante des connaissances acquises puisque l’on compte à ce jour, 2 publications parues et deux soumises dans des journaux de rang A, 2 communications orales invitées dans des congrès internationaux, 5 autres communications orales à l’international et 3 au niveau national auxquelles s’ajoutent 3 posters. L’un des membres de l’équipe Partenaire 1 est co-chairman du congrès MIP 2012 qui sera une bonne vitrine pour exposer les futurs résultats du consortium. Enfin, un tutorial portant sur les MIP et les OS a été donné dans le cadre d’un congrès international, action de formation forte pour ouvrir de futurs chercheurs à ces domaines.