Projet ANR-13-BSV4-0008 – ECTOPIA : Élucidation des causes moléculaires et cellulaires des hétérotopies
Programme : Blanc - SVSE 4 - Neurosciences (Blanc SVSE 4)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Madame FIONA FRANCIS (Institut du Fer à Moulin, Inserm UMRS 839, UPMC)
Partenaires : Institut de Génomique; Institut Cochin; Institut du Fer à Moulin
Montant : 336912.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 42 mois
Résumé : Identification des causes moléculaires et des bases cellulaires à l’origine des hétérotopiesCe projet réunit biologistes moléculaires et cellulaires, cliniciens et bioinformaticiens pour étudier les mécanismes biologiques à l’origine des hétérotopies sous corticales. Ses objectifs sont d’étudier la protéine EML1 pendant le développement normal et les perturbations de la structure et la fonction des progéniteurs neuronaux induites par son dysfonctionnement. Ce projet permet d’aborder des mécanismes critiques de la formation du cortex cérébral aujourd’hui mal connus.
Nos travaux permettront d’améliorer la connaissance et la caractérisation des hétérotopies neuronales et d’identifier les mécanismes clés des progéniteurs neuronaux durant le développement cortical.Il s’agit d’un projet de recherche fondamental dont l’objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires dans lesquels intervient la protéine clé du cytosquelette EML1. Bien que jamais étudiée pendant le développement cérébral, cette protéine joue probablement un rôle important dans les cellules progéniteurs neuronaux. Ainsi, nous chercherons à élucider les voies biochimiques dans lesquelles elle intervient, à identifier les partenaires avec lesquels elle interagit, ce qui pourrait nous mener vers l’identification de nouveaux gènes impliqués dans des formes humaines d’hétérotopies géantes ou sous-corticales pour lesquels des mutations EML1 n’ont pas été trouvées.  En parallèle, nous poursuivrons la recherche de nouvelles bases génétiques de ces formes rares d’hétérotopies chez ces patients par séquençage exome. L’identification de nouveaux gènes responsables de ces maladies, permettra d’une part d’améliorer le diagnostic et le conseil génétique et surtout, permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives pour améliorer la compréhension des mécanismes subcellulaires critiques pour la fonction des progéniteurs neuronaux du cortex. Objectif 1: Caractériser la protéine Eml1 et ses fonctions dans les microtubules et les vésicules dans les progéniteurs et identifier les protéines partenaires d’EML1.Objectif 2: Caractériser des patients souffrant d’hétérotopies géantes, réaliser le séquençage d’exome pour identifier les mutations puis valider les résultats d’exome par le screening d’une cohorte et étudier in vitro des nouveaux gènes identifiés pour évaluer les conséquences de leur mutation.Objectif 3: Analyser les données de transcriptome du mutant HeCo versus sauvage (WT) chez la souris, intégrer les différentes données issues des expériences de protéome lié à Eml1, de transcriptome HeCo, d’exomes des patients et établir une base de données moléculaires pour mieux comprendre le mécanisme cellulaire des hétérotopies.
Mécanismes moléculaires et cellulaires du développement du cortex cérébral.Tache 1 : Biochimie et biologie cellulaire•	Etude de la fonction des microtubules par biochimie, transfection cellulaire et vidéomicroscopie•	Electroporation in utero chez la souris et études du cerveau de souris à différents  stades du développement (jour embryonnaire 13,5 et 15,5) en immunohistochimie et microscopie confocale •	Préparation des protéines purifiées et analyses par spectrométrie de masse, confirmations biochimiques des partenairesTache 2 : Phénotypage clinique et radiologique des patients porteurs d’hétérotopies sous-corticales, analyses moléculaires et études fonctionnelles•	Etude de la présentation clinique et radiologiques, et définition de l’histoire naturelle de la maladie liée aux hétérotopies sous-corticales. •	Mise en place d’une classification radio-clinique des patients. Sequençage par Whole Exome Sequencing (WES).•	Conception et clonage des shRNA pour les gènes candidats identifiés en WES et gènes témoins dans le vecteur pCAGMIR30•	Transfections cellulaires et études des cellules transfectées avec les mutants en immunohistochimie et microscopie confocale•	Etudes protéiques et subcellulaires par des techniques de fractionnement subcellulaire, Western blot et PCR quantitatives•	Etudes du cerveau de souris en développement à différents stades du développement embryonnaire  (Jours 14.5, 15.5, 17.5) et néonatal avec des marquages en immunohistochimie Tache 3 : Bioinformatique•	Expression génétique, analyse différentielle, statistique descriptive, (test-t  student), analyse de données, intégration de données.
Résumé de la soumission : Les malformations corticales sont des troubles sévères du neurodéveloppement, et sont associées à une épilepsie pharmaco-résistante et à des déficits intellectuels. Pendant le développement du cerveau, les protéines du cytosquelette jouent un rôle critique dans la génération, migration et différenciation neuronale. Le fonctionnement anormal de ces protéines est une cause majeure de certains troubles dites ‘anomalies de la migration neuronale’, qui présentent des neurones corticaux mal-positionnés dans la substance blanche (‘hétérotopie’) et des malformations corticales sévères. Des cellules hétérotopiques et des réseaux neuronaux perturbés sont vraisemblablement  les défauts sous-jacents qui mènent à une épilepsie sévère et à des déficits cognitifs, bien que cette relation soit encore mal comprise. Les gènes DCX, TUBA1A et LIS1 sont mutés dans la lissencéphalie de type I et l’hétérotopie en bande. D’autres patients atteints de formes typiques ou atypiques de ces désordres, ne possèdent pas de mutation dans ces gènes. Nous avons récemment identifié le gène Eml1, muté dans un modèle murin spontané (HeCo), qui diffère des souris mutantes de Lis1, Dcx et Tuba1a, en raison de la présence d’une hétérotopie en bande sévère. Nous avons notamment montré qu’EML1 est muté dans une famille française atteinte d’une forme atypique d’hétérotopie géante (Kielar et al soumis). Le rôle de cette protéine pendant le développement cortical n’a jamais été étudié. Elle est susceptible d’interagir dans d’autres voies biochimiques que celles impliquant DCX et LIS1. L’étude de cette protéine pourrait ainsi révéler de nouveaux aspects du développement cortical. Nos données montrent qu’EML1 s’associe aux microtubules (MTs) avec un profil vésiculaire dans les progéniteurs neuronaux et les neurones post-mitotiques. Les souris mutantes HeCo montrent des anomalies de progéniteurs neuronaux et une prolifération anormale. Nos données suggèrent qu’un mauvais positionnement et fonctionnement des progéniteurs est le défaut primaire dans ce modèle, perturbant par la suite la migration neuronale. Ceci représente un concept peu étudié dans le domaine des ‘désordres de la migration neuronale’. L’objectif principal de ce projet, qui fédère des biologistes, des cliniciens et des bioinformaticiens, est d’identifier le rôle d’Eml1 et ses voies biochimiques pendant le développement cortical normal, et de caractériser comment la mutation de cette protéine perturbe la polarité et la division des progéniteurs glies radiaires. Les mécanismes qui maintiennent ces cellules importantes dans les zones prolifératives du cortex en développement sont peu étudiés et notre projet fournira des éléments clés sur ces processus critiques. Nos objectifs sont les suivants: 1) Identifier des partenaires protéiques d’Eml1, afin de fournir des pistes concernant les complexes protéiques dans lesquelles elle agit, vraisemblablement impliqués dans la dynamique de MTs et la division des glies radiaires. Grâce à des protéines fluorescentes, nous allons suivre par vidéo-microscopie le noyau, le cytosquelette de MTs et les processus apicaux de ces cellules pendant le cycle cellulaire; 2) Identifier de nouvelles mutations dans d’autres gènes qui codent pour des protéines dans la même voie biochimique qu’EML1, en séquençant les exomes de 10 patients atteint d’hétérotopies géantes sans mutations dans EML1; 3) Comprendre comment la perturbation des réseaux géniques et protéiques mène au phénotype anormal des progéniteurs neuronaux dans les souris HeCo, en analysant et en intégrant de manière approfondie des données transcriptomiques déjà obtenues, avec les protéines qui interagissent avec EML1 et les données obtenues sur les exomes de patients. Dans ce projet, nous allons identifier les bases sous-jacentes des mécanismes à l’origine de l’hétérotopie dans ce modèle et à une hétérotopie géante chez l’homme, révélant ainsi de nouveaux aspects fondamentaux du développement du cerveau.
Résultats : Nous avons trouvé que des anomalies de la protéine Eml1, probablement impliquée dans la dynamique des microtubules, étaient à l’origine des hétérotopies sous-corticales chez la souris et l’humain. La mutation du gène EML1 est associée à un positionnement anomal des neurones dans la substance blanche (l’hétérotopie) et à une anomalie des progéniteurs neuronaux durant le développement cortical (publié par notre groupe dans Nature Neuroscience 2014). 
Pour caractériser la protéine Eml1, nous analysons la fonction microtubulaire et caractérisons les défauts dans les cellules mutantes dans des coupes cérébrales de la souris. Nous avons également identifié une liste de protéines partenaires d’Eml1 que nous sommes en train d’étudier. Pour caractériser les patients atteints, une petite cohorte présentant des hétérotopies sous-corticales proche du phénotype lié à EML1 (dit EML-like), a été étudiée par Whole exome sequencing (en trio avec leurs parents). De cette analyse, certains patients présentent des variantes potentiellement pathogènes dans des gènes candidats qui sont en cours d’étude. 
Nous avons ainsi commencé l’étude de l’un de ces gènes dans le cerveau de la souris pendant le développement. Nous avons également débuté l’étude des effets de downrégulation de la protéine et de l’expression d’ARNm, sa surexpression et ses partenaires possibles en utilisant une lignée cellulaire de neuroblastome, proche des cellules progéniteurs neuronaux. Nous avons également réalisé l’analyse des données d’expression génétique afin d’identifier des voies biochimiques perturbées par l’inactivation d’EML1, responsable d’hétérotopie chez le modèle murin. De ces analyses, nous avons identifié un ensemble de gènes différentiellement exprimés. Des interactions potentielles entre ces gènes nous permettent d’établir un réseau d’interaction. Une première intégration des données d’expression avec les données d’exome nous a permis d’inférer un réseau de gènes très fortement connectés.
Perspectives : Après avoir identifié EML1 comme un nouveau gène impliqué dans les hétérotopies sous corticales, nous proposons de poursuivre son étude avec comme but de mieux comprendre sa fonction et la voie dans laquelle il intervient dans le cerveau en développement. 
Nous continuerons à investiguer son rôle, particulièrement dans les cellules en division par des approches de biochimie et biologie cellulaire. Nous poursuivrons notre étude visant à identifier les partenaires avec lesquels elle interagit et, en parallèle continuerons à étudier les causes des hétérotopies en utilisant la souris comme modèle. 
Nous poursuivons également nos études sur les causes génétiques d’hétérotopies géantes dans une cohorte de patients identifiés en France. Nous étendons notre recherche à d’autres patients atteints d’hétérotopies sous-corticales issus de cohortes européennes pour lesquelles nous avons des collaborations (dans le cadre de consortium européen). En parallèle de la recherche de mutations associées aux hétérotopies sous corticales, nous étendrons nos analyses à des patients ayant des caractéristiques similaires telles que les patients souffrant d’un syndrome d’Aicardi.
Nous souhaitons identifier de nouveaux liens entre les partenaires d’Eml1, les réseaux de gènes perturbés dans le tissu cérébral de la souris HeCo et les gènes mutés chez les patients souffrant d’hétérotopies, pour révéler de nouveaux mécanismes subcellulaires et orienter de futures études fonctionnelles et génétiques. Nos données préliminaires suggèrent que certaines voies seraient dérégulées et permettent d’envisager des expériences fonctionnelles pertinentes afin tester les conséquences des mutations sur les cellules de la glie radiaire. Enfin, des analyses plus globales sont prévues pour avoir une perspective complète du jeu de données. La base de données (‘Ectopia-DB’) permettant des interrogations croisées entre les données sera construite par un bioinformaticien dédié et mis à disposition.
Publications et brevets : 1.	Kielar M*., Phan Dinh Tuy F*., Bizzotto S*., Lebrand C*., de Juan C, Poirier K., Oegema R., Mancini GM, Bahi-Buisson N., Olaso R., Le Moing A. G., Boutourlinsky K., Boucher D., Carpentier W., Berquin P., Deleuze JF., Belvindrah R., Borrell V, Welker E., Chelly J., Croquelois A#., Francis F#. (2014). Mutations in Eml1 lead to ectopic progenitors and neuronal heterotopia in mouse and human. Nat Neurosci. 17, 923–933. 
2. Bizzotto S and Francis F (2015) Morphological and functional aspects of progenitors perturbed in cortical malformations. Front Cell Neurosci 9:30. doi: 10.3389/fncel.2015.00030 
3. Kielar M., Phan Dinh Tuy F., Bizzotto S., Belvindrah R., Croquelois A., Francis F. (2014). [Mutations in Eml1/EML1 lead to ectopic progenitors and neuronal heterotopia in mouse and human]. Mutations du gène EML1/Eml1, progéniteurs neuronaux et hétérotopies chez l’homme et la souris Med Sci (Paris) 30 : 1087–1090.