Projet ANR-11-BSV5-0001 – Light-GatedP2XR : Photo-régulation de l’activité canal du récepteur purinergique de type P2X : détermination de la stœchiométrie d’activation
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Thomas Grutter (UNIVERSITE DE STRASBOURG)
Partenaires : Laboratoire de Conception et Application de Molécules Bioactives; Laboratoire de Conception et Application de Molécules Bioactives
Montant : 376012.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Nouveaux développements optogénétiques de récepteurs canauxIngénierie génétique et chimique de canaux ioniques normalement activés par l’ATP en canaux activés par la lumière
Nouveaux photo-commutateurs régulant l’ouverture de canaux ioniques activés par l’ATPLa structure atomique de chacun des membres de la superfamille de récepteurs canaux activés par des ligands a été résolue récemment, ce qui encourage le développement d’outils chimiques originaux permettant d’explorer en détail le fonctionnement de ces récepteurs. Parmi eux, les récepteurs P2X activés par l’ATP sont particulièrement intéressants parce qu’ils sont exprimés de manière quasi ubiquitaire dans le corps humain et sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques, aussi divers que la transmission synaptique, la réponse inflammatoire, la récupération de l’insuffisance cardiaque ischémique et la perception de la douleur. La connaissance du mécanisme moléculaire d’activation de ces récepteurs est encore assez limitée. En particulier, le nombre de molécules d’ATP requises pour ouvrir efficacement le canal, ainsi que les étapes qui relient mécaniquement la fixation de l’agoniste à l’ouverture du pore restent encore mal compris. Pour répondre à ces questions, nous développons au laboratoire une stratégie centrée sur la photo-régulation des récepteurs purinergiques P2X. Il s’agit de créer par ingénierie chimique et génétique un nouveau récepteur capable d’activer et d’inactiver, à volonté et par la lumière, un canal ionique.
Mise en place des nouveaux outilsDeux disciplines sont réunies dans ce projet : la biologie et la synthèse organique. Nous concevons de nouveaux dérivés de l’adénosine triphosphate (ATP) portant une fonction photosensible et un site d’attachement irréversible et spécifique à la protéine. Ces molécules, baptisées photo-commutateurs, devraient être capables une fois correctement attachées au récepteur d’ouvrir et de fermer le pore ionique grâce à une impulsion lumineuse. Pour cela, nous utilisons l’électrophysiologie patch-clamp couplée à un système d’irradiation par LED pour enregistrer les courants issus de ces canaux activés par la lumière.
Résumé de la soumission : La structure atomique de chacun des membres de la superfamille des récepteurs canaux activés par des ligands a été résolue récemment, ce qui encourage le développement d'outils chimiques originaux permettant d'explorer en détail le fonctionnement de ces récepteurs. Parmi eux, les récepteurs P2X, activés par l'ATP, sont particulièrement intéressants parce qu'ils sont exprimés de manière ubiquitaire dans le corps humain et sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques, aussi divers que la transmission synaptique, la réponse inflammatoire, la récupération de l'insuffisance cardiaque ischémique et la perception de la douleur. La connaissance du mécanisme moléculaire d'activation de ces récepteurs découverts récemment est encore très limitée. En particulier, le nombre de molécules d'ATP requises pour ouvrir le canal, ainsi que les étapes mécaniques qui relient la fixation de l'agoniste à l'ouverture du canal restent totalement inconnues. Pour répondre à ces questions en suspend, nous proposons de développer des outils innovants en se basant sur des résultats préliminaires prometteurs. Nous développerons une stratégie centrée sur la photo-régulation des récepteurs purinergiques P2X. Nous prévoyons de convertir ces canaux activés par l'ATP en canaux activés par la lumière en concevant un analogue de l'ATP original portant une fonction azobenzène (photo-commutateur sensible à la lumière). En fonction de la longueur d'onde de la lumière d'irradiation le lien azobenzène attaché devrait concentrer (ou non) la partie ATP dans son site de fixation. Cette variation de position devrait entrainer l'ouverture (ou la fermeture) du canal ionique. Nous synthétiserons plusieurs photo-commutateurs dérivés de l'ATP. En parallèle, guidés par la modélisation moléculaire basée sur la structure aux rayons-X du récepteur P2X et notre identification récente du site de liaison de l'ATP par marquage d'affinité, nous introduirons des résidus cystéine dans le récepteur, tant sur des sous-unités isolées que concaténées. Ces mutations seront introduites, une à la fois, à proximité du site de liaison de l'ATP, pour assurer une liaison optimale du groupement ATP du photo-commutateur fixé. Nous utiliserons l'électrophysiologie patch-clamp couplée à une irradiation LED ultra-lumineuse pour enregistrer les courants en canal unique des récepteurs P2X photo-sensibles. Ces outils représentent une opportunité originale de déterminer la stœchiométrie d'activation des récepteurs P2X et de comprendre les premières étapes qui relient l'occupation du site de liaison à l'ouverture du canal. Dans le futur, ils devraient également être utiles à d'autres scientifiques pour révéler la contribution précise des courants ATP-dépendant aux situations physiologiques pertinentes.Ce projet requiert des compétences en chimie et biologie. Nous avons donc réuni deux équipes: la première (partenaire 1, laboratoire de biophysicochimie des récepteurs canaux) est spécialisée dans les relations structure-fonction des canaux ioniques activés par les ligands, en particulier les récepteurs P2X, et le second (partenaire 2, laboratoire de chimie bioorganique) est spécialisé dans la chimie bio-organique de composés photosensibles agissant sur les protéines. Cette collaboration est donc idéale pour ce projet.
Résultats : Nous avons criblé par bioinformatique une série de photo-commutateurs présentant des bras espaceurs de tailles variables sur un modèle tridimensionnel de récepteur P2X2 basé sur une structure cristallographique d’un récepteur homologue. Nous avons sélectionné une molécule ayant les conditions optimales afin de discriminer dans le site de liaison de l’ATP les deux photo-isomères cis et trans. Nous avons alors synthétisé avec succès la partie bras espaceur de ce photo-commutateur, il ne nous restera plus qu’à le greffer sur l’ATP. En parallèle de ce travail de chimie organique, nous avons crée par biologie moléculaire une trentaine de mutations ponctuelles cystéine sur le récepteur P2X2. Nous avons testé leur fonctionnalité par électrophysiologie patch-clamp, et nous montrons que la grande majorité de ces mutants s’exprime dans les cellules HEK et reste fonctionnelle. Enfin, nous avons adapté au poste d’électrophysiologie un système d’irradiation par LED ce qui nous permettra prochainement de tester la photo-régulation de nos commutateurs sur des cellules exprimant les récepteurs mutants.
En parallèle de ce projet, nous avons montré l’existence d’un état intermédiaire sur le récepteur P2X2. Grace à des enregistrements de canaux uniques activés par le zinc sur un récepteur mutant, nous avons réussi à piéger cet état non-conductant qui diffère de l’état de repos par sa sensibilité aux agonistes et qui précède l’état d’ouverture du canal ionique. Ces résultats ont été publiés très récemment.
Perspectives : Les nouveaux outils développés dans ce projet représentent une opportunité originale pour étudier non seulement la biophysique de ces récepteurs mais également leur contribution tant au niveau physiologique que pathologique. Ils devraient être utiles à d’autres scientifiques pour mettre en lumière la contribution précise des courants ATP dans une situation physiologique pertinente.
Publications et brevets : - Jiang, R., Taly, A., Lemoine, D., Martz, A., Cunrath, O., Specht, A. & Grutter, T. (2012) Intermediate closed channel state(s) precede(s) activation in the ATP-gated P2X2 receptor. Channels (Austin), in press.
Ce travail suggère l’existence d’un état intermédiaire partiellement ligandé par les agonistes qui précède l’ouverture du canal ionique mais qui diffère également de l’état de repos du récepteur par sa sensibilité aux agonistes. Nous proposons que dans cet état intermédiaire, un changement de conformation se produit dans le site de liaison, mais que ce changement n’est pas suffisant pour ouvrir efficacement le canal ionique