Projet ANR-10-BLAN-1307 – FLUNUCLEOVIR : Développement de nouveaux antiviraux à large spectre dirigés contre la  nucléoprotéine d’Influenza A
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Microbiologie, immunologie, infectiosité (Blanc SVSE 3)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Anny SLAMA-SCHWOK (INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - CENTRE DE RECHERCHE DE JOUY-EN-JOSAS)
Partenaires : Biologie Structurale des Interactions entre Virus et Cellule-Hôte; Institut national de la recherche agronomique
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : La nucléoprotéine des virus Influenza A : nouvelle cible pour des antiviraux de nouvelle générationComment la structure cristallographique de la nucléoprotéine conduit à la découverte de nouveaux antiviraux à large spectre contre les virus Influenza A
Caractérisation structurale des nucléoprotéines et de leurs inhibiteursDeux enjeux: 1- Caractérisation structurale des nucléoprotéines des virus Influenza A et Thogoto2- Développement de nouveaux antiviraux ciblant la nucléoprotéine des virus Influenza A par une approche de drug design basée sur la structure.
Approches de virologie structurale, drug design et tests d'antiviraux- Virologie structurale: microscopie électronique, et méthodes biophysiques en solution jointes à la cristallographie des protéines en l'absence et présence d'ARN - Drug design: identification in silico de nouveaux inhibiteurs de la nucléoprotéine et leur amélioration itérative basée sur la structure des complexes-Tests des effets antiviraux: in vitro, en cellules et in vivo (modèle souris)
Résumé de la soumission : La pandémie 2009-2010 du virus Influenza A H1N1 et la virulence des souches H5N1 encore circulantes militent pour la recherche de nouveaux inhibiteurs des virus Influenza. Deux des protéines virales, la neuraminidase et le canal à protons M2 sont des cibles de drogue anti-virales utilisées en traitement curatif. Il s’avère que des virus résistants à ces drogues circulent efficacement dans le monde. D’autres antiviraux visant la polymérase virale, comme la ribavirine, sont peu spécifiques aux virus Influenza A et se révèlent avoir des effets secondaires notoires. Le développement de nouveaux antiviraux contre les virus Influenza A s’avère donc nécessaire. Dans cette optique, la nucléoprotéine (NP), associée au génome viral, modulant ainsi la réplication, la transcription et la stabilité de la particule virale, constitue une cible d’intérêt pour la recherche d’antiviraux. De par la grande conservation de séquence de NP, tout inhibiteur ciblant cette protéine devrait constituer un antiviral à large spectre contre ces virus. L’objectif principal de ce projet est le développement de nouveaux inhibiteurs contre les virus Influenza A ciblant l’interaction de la nucléoprotéine à l’ARN viral. Nous démarrons ce projet avec deux molécules déjà identifiées par une approche de docking in silico, basée sur la structure de NP élucidée en l’absence d’ARN (H1N1:Ye et al 2006, et H5N1:Ng et al. 2008). Ces molécules commerciales ont été sélectionnées pour se fixer à la surface où se loge l’ARN viral. Nous les nommerons N et T dans ce résumé. Nos résultats montrent que l’association de N à NP est compétitive à des concentrations micromolaires avec la fixation de l’ARN à NP. N et T protégent des cellules de poumon humain A549 contre un challenge viral H1N1 wsn, sans toxicité notable. Notre approche est -1 d’obtenir les structures cristallographiques des complexes NP-N, NP-T et NP-ARN. Ces structures guideront le design d’une deuxième génération d’inhibiteurs à partir des deux molécules commerciales afin -2 d’améliorer leur affinité pour la NP, et de leur conférer une bonne spécificité avec un minimum d’effets secondaires chez l’hôte. -1 Les structures RX des nucléoprotéines seules et en complexe avec l’ARN des virus Influenza A et Thogoto, seront également résolues par le groupe de Rob Ruigrok du laboratoire UVHCI de Grenoble. La comparaison de ces structures avec celles du complexe NP-RNA des virus de la rage (Albertini et al. 2006) et syncytial (Tawar et al. 2009) nous permettra de comprendre (i) le mode d’oligomérisation de NP en présence d’ARN (ii) la conservation structurale des nucléoprotéines chez les Orthomyxoviridae. -2  partir de la seconde génération d’inhibiteurs améliorés par ajout de fragments, nous testerons la stabilité des complexes NP-inhibiteurs par des dynamiques de 50 ns en solvant explicite grâce à l’accès au cluster IBM Vargas (Orsay). Ces molécules seront synthétisées par le groupe de Stéphane Quideau à l’IECB de Bordeaux. Nous évaluerons l’efficacité des inhibiteurs, in vitro, en cellules et sur modèle animal à l’aide de différentes souches en confinement P2 et P3 de l’unité VIM de l’INRA, afin de valider le concept d’antiviraux à large spectre. Les forces complémentaires de la virologie structurale, la biologie moléculaire associées au criblage virtuel et à la biophysique permettent de proposer ces nouveaux antiviraux, à fort potentiel de valorisation, contre des pathogènes viraux présentant une menace pour la population mondiale.
Résultats : - Expression, purification de la nucléoprotéine sauvage recombinante sous forme monomérique ainsi que plusieurs mutants, monomériques ou trimériques
- Cristallisation de la nucléoprotéine sans ARN
- Identification et tests de plusieurs inhibiteurs de la nucléoprotéine
Perspectives : - Compréhension de l'interaction de NP avec l'ARN viral, qui est une partie essentielle de la machinerie permettant la réplication des virus Influenza A
- Cristallisation du complexe NP-inhibiteur 1 permettant de générer des inhibiteurs de NP plus performants
Publications et brevets : Dépôt de brevet français (21 avril 2011) : « COMPOSITIONS ANTIVIRALES DIRIGEES CONTRE LA NUCLEOPROTEINE DES VIRUS INFLUENZA » Anny Slama-Schwok et Bernard Delmas
- B. Tarus, O Bakowiez, S.Chenavas, L.Duchemin, L. Estrozi, C. Chevalier, C. Bourdieu, J. Bernard, M.Moudjou, B. Delmas, C. Di Primo, R.WH Ruigrok and A. Slama-Schwok : Multiple oligomerization paths of the nucleoprotein from Influenza A virus Biochimie: 94 776-785.  doi.10.1016/j.biochi.2011.11.009
- B. Tarus, C.  Chevalier, B. Delmas, C. Di Primo, and A.Slama-Schwok. Molecular dynamics studies of the nucleoprotein from Influenza A virus , PlosOne 2012 (1): e30038. doi:10.1371/journal.pone.0030038
- Ruigrok RW, Crépin T, Kolakofsky D. Nucleoproteins and nucleocapsids of negative-strand RNA viruses. Curr Opin Microbiol. 2011 Aug;14(4):504-10. Epub 2011 Aug 6.