Projet ANR-12-BS08-0002 – ELIPTIC : Electrochimie et Translocation de Peptides Cationiques
Programme : Blanc - SIMI 8 - Chimie du solide, colloïdes, physicochimie (Blanc SIMI 8)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Olivier BURIEZ (Groupe d'électrochimie, UMR 8640 "Pasteur")
Partenaires : Processus d'Activation Sélectif par Transfert d'Énergie Uni-Électronique ou Radiatif; Laboratoire des Biomolécules; Laboratoire Interfaces et Systèmes Électrochimiques
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Etude des processus impliqués au cours du passage transmembranaire de molécules à propriétés thérapeutiquesLe passage de molécules à propriétés thérapeutiques au travers des membranes biologiques est une problématique majeure qui commande le succès de nombreuses stratégies pharmaceutiques innovantes comme, par exemple, les thérapies épigénétiques qui ouvrent de nouveaux espoirs pour le traitement des cancers.
Développement d’outils analytiques originaux pour l’étude du passage transmembranaire de peptides cationiques.Les peptides pénétrants (CPPs), capables de traverser les membranes, sont devenus un des vecteurs les plus efficaces pour accéder au milieu intracellulaire et transporter ainsi des molécules biologiquement actives (médicaments, protéines, nanoparticules,…). Dans ce contexte, apporter des informations sur les mécanismes d’internalisation et sur les cinétiques de passage des CPPs au travers des membranes est un enjeu crucial pour le développement de nouvelles stratégies pharmaceutiques. Notre objectif est de développer de nouveaux outils analytiques basés sur des techniques électrochimiques et/ou de fluorescence de façon à analyser les conséquences des interactions peptides/lipides sur leurs organisations supramoléculaires. Ce projet vise avant tout au développement de nouvelles avancées dans le domaine des techniques analytiques via le couplage de l’électrochimie moléculaire avec la technique du « patch-clamp », la spectroscopie d’impédance, et avec des techniques de fluorescence comme la microscopie confocale. Au-delà de l’étude des peptides pénétrants, ce travail permettra d’étudier à l’avenir les mécanismes impliqués lors du passage transmembranaire de n’importe quel type de médicament/biomolécules.
Synthèse et études analytiques de peptides pénétrantsL’articulation du projet se fait autour des points suivants : (i) synthèse d’une famille de peptides cationiques portant une sonde redox ou fluorescente et études de leurs propriétés bio-physico-chimiques; (ii) études électrochimiques des interactions entre ces peptides et des modèles de membranes comme des vésicules de composition phospholidique définie; (iii) caractérisation d’assemblages spécifiques peptides/lipides par spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE) et par microscopie électrochimique (SECM) ; (iv) études électrochimiques de nano-flux de peptides cationiques pénétrants ou antimicrobiens à travers une bicouche lipidique suspendue au-dessus d’un micro-trou ou obtenue par « patch » de vésicules géantes ; (v) développement d’outils analytiques combinant électrochimie et fluorescence (microscopie confocale et TIRF) pour obtenir des informations cinétiques et une résolution spatiale sur les processus de translocation à la fois sur des gammes de temps courts et longs.embranes comme des vésicules de composition phospholidique définie;
Résumé de la soumission : Ce projet vise à caractériser à l’échelle moléculaire et nanomoléculaire les processus impliqués dans la translocation de peptides cationiques tels que les peptides de pénétration cellulaire (CPPs) et dans la perméabilisation des membranes par des peptides antimicrobiens (AMPs). Ces études seront menées sur différents modèles membranaires de compositions phospholipidiques contrôlées. Ces dernières années, l’intérêt de la communauté scientifique pour les CPPs n’a cessé de croître car ils sont capables de traverser efficacement la membrane cellulaire et donc de faire pénétrer dans une cellule des molécules biologiquement actives. La pénétration de peptides cationiques à travers les membranes cellulaires est un processus complexe, lié à la très grande diversité moléculaire de leurs séquences. Malgré le développement de nombreuses études à la fois in vivo et in vitro, basées essentiellement sur des techniques de fluorescence, le/les mécanismes impliqués lors du passage trans-membranaire de peptides cationiques fait encore débat. Dans ce contexte, nous proposons de développer un nouveau dispositif basé sur la combinaison des techniques électrochimique et de fluorescence permettant d’analyser les conséquences des interactions peptides/lipides sur leurs organisations supra-moléculaires en suivant simultanément la translocation de peptides cationiques au travers de membranes (CPPs) et l’altération de la perméabilité membranaire via la formation de pores (AMP). Nous proposons de développer une méthode originale et rapide pour cribler des familles de peptides afin de différencier ces deux propriétés extrêmes. Ce projet vise avant tout au développement de nouvelles avancées dans le domaine des techniques analytiques via le couplage de l’électrochimie moléculaire avec la spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) et avec des techniques de fluorescence comme la microscopie confocale ou la microscopie à onde évanescente (microscopie TIRF).Ce projet s’articulera autour des points suivants: (i) synthèse d’une famille de peptides cationiques portant une sonde redox ou fluorescente et études de leurs propriétés bio-physico-chimiques; (ii) études électrochimiques des interactions entre ces peptides et des modèles de membranes comme des vésicules de composition phospholidique définie; (iii) caractérisation d’assemblages spécifiques peptides/lipides par spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE) et par microscopie électrochimique (SECM) ; (iv) études électrochimiques de nano-flux de peptides cationiques pénétrants ou antimicrobiens à travers une bicouche lipidique suspendue au dessus d’un micro-trou ou obtenue par « patch » de vésicules géantes ; (v) développement d’outils analytiques combinant électrochimie et fluorescence (microscopie confocale et TIRF) pour obtenir des informations cinétiques et une résolution spatiale sur les processus de translocation à la fois sur des gammes de temps courts et longs.
Résultats : La combinaison des techniques de « patch-clamp » et d’ampérométrie a permis de développer un outil analytique original permettant de détecter, en temps réel, le passage de molécules au travers de membranes artificielles et réelles. D’un côté, la technique du « patch-clamp » permet de tendre un morceau de membrane réelle ou artificielle (par excision d’une cellule réelle ou artificielle type vésicule) sur la pointe d’une micropipette; d’un autre côté, la présence d’une ultra-microélectrode positionnée en face de la membrane suspendue permet une détection électrochimique efficace d’une molécule sortant de la micropipette au-travers de la membrane suspendue. Cette méthode qui a été validée expérimentalement à l’aide de sondes redox «classiques» (ex: ferrocène méthanol, hydroquinone,…) et de bicouches lipidiques constituées de phospholipides de type DPhPC, DOPC, et DOPG peut être utilisée pour des études qualitatives et quantitatives du passage transmembranaire de biomolécules à haute valeur ajoutée comme les peptides pénétrants.
Des études réalisées par spectroscopie de fluorescence a également permis de quantifier l’internalisation de différents peptides pénétrants (CPP) dans des vésicules uni-lamellaires. Il a été montré que la translocation était rapide, conduisant en quelques minutes à une accumulation intra-vésiculaire allant jusqu’à une concentration de 0.5 mM. Il a également été montré le rôle du flip-flop des phospholipides anioniques dans le processus de translocation. En effet, la concentration intra-vésiculaire de peptides est corrélée à la quantité de phospholipides transférés du feuillet externe au feuillet interne de la bicouche lipidique, démontrant ainsi le transport des CPPs par les phospholipides.
Perspectives : Ce projet devrait conduire à un certains nombres d’avancées scientifiques importantes dans le domaine des techniques analytiques (électrochimie moléculaire, spectroscopie d’impédance électrochimique, microscopie confocale,…) et de l’étude de l’interaction peptide/membrane via la synthèse et la caractérisation par électrochimie et/ou fluorescence de peptides cationiques originaux portant une sonde spécifique. Ce travail permettra d’étudier à l’avenir les mécanismes impliqués lors du passage transmembranaire de n’importe quel type de médicament/biomolécules et d’apporter ainsi des réponses cruciales pour le développement de nouvelles stratégies pharmaceutiques.
Publications et brevets : La combinaison des techniques de « patch-clamp » et d’ampérométrie a permis de développer un outil analytique original permettant de détecter, en temps réel, le passage de molécules au travers de membranes artificielles et réelles : Angew. Chem. Int. Ed. 53 (2014) 3192.
L’internalisation de différents peptides pénétrants (CPP) dans des vésicules de type LUV a été quantifiée. En outre, le rôle du flip-flop des phospholipides anioniques dans le processus de translocation a été montré : ChemBioChem. 15 (2014) 884.
Un peptide pénétrant modifié par une sonde redox (ferrocène) a pu être détecté par voie électrochimique, à des concentrations micromolaires, grâce à la présence d’un polymère échangeur de cations déposé à la surface de l’électrode : Electrochim. Acta. 80 (2012) 180.