Projet ANR-13-BSV6-0007 – IMPACT : Identification des protéines de la matrice affectant les propriétés cristallographiques de la coquille des œufs de poules et de pintades
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Joel GAUTRON (Institut National de la Recherche Agronomique - Centre de Tours)
Partenaires : Génétique Physiologie et Systèmes d'Élevage; Biopolymères, Interactions Assemblages; Physiologie de la Reproduction et des Comportements; Recherches Avicoles; UGRANADA University of Granada; UOTTAWA University of Ottawa
Montant : 238459.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : Comprendre et expliquer pourquoi une coquille d’œuf est si solideComprendre les mécanismes de formation de la coquille des oiseaux. Identifier et caractériser les mécanismes d’interactions entre protéines et minéraux dans l’appareil reproducteur des oiseaux qui permettent l’élaboration de la structure cristallographique de la coquille.
Comprendre la formation de la coquille pour renforcer la qualité sanitaire de l’œufL’œuf est un produit de base de la consommation humaine et un aliment de grande qualité à un faible coût pour le consommateur. Il se doit d’être sain et exempt de pathogènes. L’œuf et les produits d’œufs sont consommés crus (e.g mayonnaise…) et sont encore une source importante de salmonellose. La coquille calcifiée des oiseaux constitue un système de protection naturelle efficace de l’œuf pour protéger l’embryon et maintenir l’œuf exempt de microbes. Ce projet vise à caractériser par des méthodes à haut-débits les différents acteurs moléculaires impliqués dans le processus de fabrication de la coquille. Les approches conduites dans IMPACT hiérarchiseront des candidats fonctionnels clefs qui pourront être utilisés en sélection assistée par marqueurs pour améliorer la solidité des coquilles et par conséquent la sécurité alimentaire de ce produit de grande consommation. A côté de son implication dans les sciences de l’aliment, le projet IMPACT permet de mieux comprendre les mécanismes de calcification en milieu biologique et est par conséquent un modèle d’étude de fabrication des biomatériaux d’intérêt pour l’industrie des céramiques, puisque les biominéraux sont des céramiques naturelles formées à température ambiante et pression normale. Ce projet fournira donc des informations générales en relation avec des applications industrielles dans ces domaines
Caractérisation des molécules clefs de la formation de la coquille par des méthodes à haut-débit.La coquille est le résultat d’un assemblage complexe de protéines qui interagit avec du carbonate de calcium pour donner une structure cristalline précise et ordonnée qui donne à la coquille ses propriétés mécaniques exceptionnelles. Parmi les plus de 600 protéines potentiellement impliquées, nous avons conduit des approches de caractérisation et de quantification à haut débit pour déterminer les molécules impliquées aux différent temps clefs de la minéralisation qui déterminent l’ultrastructure de la coquille.Les méthodes utilisées consistent en de la protéomique quantitative et du séquençage des ARN, ainsi que des mesures physiques pour caractériser la minéralogie de la coquille.Ces approches multidisciplinaires et complémentaires permettent de révéler les protéines de la coquille qui sont responsables de la texture de la coquille. Elles sont complétées par des analyses des fonctions pour fournir des avancées sur le rôle de ces protéines dans les propriétés mécaniques de la coquille qui déterminent la défense physique de l’œuf contre la pénétration de bactéries et les chocs du milieu extérieur.
Résumé de la soumission : La coquille calcifiée des oiseaux protège l'embryon et maintient l’œuf exempt de pathogènes. La coquille est le résultat d’événements de nucléation sur un support fibreux (membranes coquillières), et d'interaction entre les cristaux minéraux en croissance et la matrice organique de la coquille. L'ensemble forme une microstructure hautement ordonnée et une texture qui lui donne des propriétés mécaniques exceptionnelles. La minéralisation de la coquille se produit en 3 phases distinctes (initiation, croissance et arrêt), qui sont associées avec des protéines secrétées dans le milieu de formation (fluide utérin) et agissent comme modulateurs du processus. La matrice de la coquille est un mélange de protéines, protéoglycanes et glycoprotéines, qui contrôlent la nucléation et la croissance des cristaux et déterminent ainsi la texture et les propriétés mécaniques de la coquille. Le développement récent des méthodes à haut-débit a permis l'identification de séquences associées à la minéralisation de la coquille (528 protéines et 605 transcrits), mais peu d'informations sont disponibles sur leurs fonctions. Afin de déterminer leur importance vis à vis du processus de minéralisation, ce projet utilisera la protéomique quantitative et des méthodologies de séquençage des ARN couplées à des analyses bioinformatiques. Ces données seront corrélées avec la composition minérale et les caractéristiques de la coquille, pour déterminer les protéines jouant un rôle pivot dans la nucléation des cristaux, la microstructure, la texture et les propriétés mécaniques de la coquille.Dans la tâche 1, les échantillons de coquille et les tissus impliqués  seront collectés chez la poule à différents stades de formation, dans le but de définir les protéines et les transcrits associés à chaque phase de calcification et plus particulièrement la phase cruciale de l'initiation. Les analyses statistiques établiront une liste restreintes d’acteurs moléculaires associés à cette phase responsable des évènements de nucléation primaire. Une analyse comparative des protéines de la matrice de coquille de poule et de pintade sera conduite dans la tâche 2. La coquille d’œuf de pintade est exceptionnellement solide du fait d'une texture cristalline altérée au milieu de la coquille, conséquence d'une nucléation secondaire probablement due à des protéines spécifiques et non caractérisées de cette espèce. Une banque cDNA de l'utérus sera préparée pour obtenir des milliers de produits de gènes de la pintade. Cette approche sera complétée par une analyse protéomique exhaustive rendue possible grâce aux séquences cDNA et complétée par du séquençage de novo. La protéomique quantitative et le RNA-Seq réalisés aux différentes phases de calcification permettront de déterminer les protéines clefs responsables du changement d'orientation cristalline dans la coquille de pintade et qui renforcent ses propriétés mécaniques. L'interaction entre le carbonate de calcium et les protéines recueillies aux différents stades de formation de la coquille sera déterminée pour la poule et la pintade dans la tâche 3 par un essai de croissance cristalline in vitro et complétée par des analyses in situ de la texture et des propriétés mécaniques. Les analyses bioinformatiques in silico (tâche 4), détermineront les motifs et domaines associés avec la minéralisation. L'intégration de ces données permettra d'élucider les mécanismes qui contrôlent la minéralogie et la microstructure de la coquille en formation.Cette approche multidisciplinaire caractérisera les composés de la matrice jouant un rôle essentiel lors des différentes phases de formation de la coquille et fourniront des informations fondamentales concernant les protéines qui contrôlent la nucléation primaire et secondaire lors de la biominéralisation calcitique. Ces résultats fourniront des avancées sur la régulation par les protéines des propriétés mécaniques de la coquille à l’origine de la première défense de l’œuf contre les microbes.
Résultats : Nous avons montré pour la première fois la présence de carbonate de calcium amorphe (ACC) comme un intermédiaire transitoire, plus soluble et réactif et permettant d‘expliquer la vitesse de calcification de la coquille de l’œuf de poule. Cette forme minérale est cruciale et est observée pour la première fois chez un vertébré. 
Deux études qualitative et quantitative ont permis de mettre en évidence plus de 300 protéines de la matrice organique impliquées dans ces processus de calcification et de hiérarchiser parmi elles une vingtaine de candidats dont la fonction dans le processus de minéralisation et la transformation du minéral en amorphe semble potentiellement importante.
Perspectives : Ce travail sera complété par des analyses de séquences du matériel génétique (ARN) codant pour ces protéines. Par ailleurs le même travail sera entrepris chez la pintade qui produit des œufs aux coquilles particulièrement solides. Nous pourrons ainsi analyser les similitudes et différences entre les 2 espèces et en tirer des conclusions sur la compréhension des mécanismes de biominéralisation.
Publications et brevets : Au cours des 18 premiers mois de ce projet, 5 articles ont été publiés dans des revues scientifiques internationales à comité de lecture. Par ailleurs ce programme et ces résultats ont été présentés à 2 conférences internationales et plusieurs congrès nationaux