Projet ANR-13-BSV8-0007 – gTuRC : La nucléation et l’organisation des microtubules par les complexes multiprotéiques de tubuline gamma
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8) 2013
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Andreas MERDES (Centre de Biologie du Développement)
Partenaires : Centre de Biologie du Développement; Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale; Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale
Montant : 350000.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 42 mois
Résumé : Les complexes multiprotéiques de gamma-tubuline sont essentiels à la formation du réseau de microtubules et à la dynamique des microtubules, chez tous les eucaryotes. Dans la plupart des organismes, ces complexes existent sous la forme d’anneaux ouverts appelés “gamma-Tubulin Ring Complexes” ou “gamma-TuRCs”. Les gamma-TuRCs sont majoritairement présents dans le cytoplasme sous la forme d’un pool soluble et inactif. La fraction active minoritaire est liée au centrosome et/ou à d’autres centres organisateurs des microtubules. Le potentiel de nucléation des microtubules est donc souvent corrélé à la liaison des gamma-TuRCs au centrosome. Plusieurs protéines centrosomales ont été caractérisées comme des partenaires du gamma-TuRC. Parmi elles, la protéine Cdk5rap2 a récemment été décrite comme un activateur du gamma-TuRC : son domaine N-terminal CM1 est suffisant pour l’activation. De plus, ce domaine CM1 semble activer les gamma-TuRCs indépendamment de leur localisation, et en particulier le pool soluble présent dans le cytoplasme.  A partir de ces données, nous pouvons envisager des stratégies qui permettent de découpler la liaison au centrosome et l’activation du gamma-TuRC Dans ce projet, nous caractériserons les mécanismes par lesquels Cdk5rap2 peut activer le gamma-TuRC, et nous rechercherons si d’autres protéines peuvent exercer une fonction activatrice similaire. L’activation du gamma-TuRC impliquerait des changements conformationels au sein du complexe, en particulier au niveau d’un de ses constituants, GCP3. Nous étudierons la capacité des différentes sous-unités du gamma-TuRC à se lier au domaine CM1, et nous testerons si la conformation de GCP3 est altérée par la liaison à CM1. Cette analyse impliquera des méthodes biophysiques telles que la RMN ou le transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (FRET). Pour comprendre les modifications conformationelles au niveau structural, nous déterminerons la structure cristallographique de la protéine GCP3 « flexible » et de la sous-unité GCP2 plus « rigide ». Ceci se fera par cristallographie aux rayons X des différents domaines de ces protéines, et par remplacement moléculaire et modélisation, en utilisant la structure que nous avons récemment publiée de la sous-unité GCP4 du gamma-TuRC. Nous étudierons également le mécanisme de liaison des gamma-TuRCs au centrosome, en étudiant le rôle de la protéine ninéine. En utilisant des cellules dérivées d’une souris knockout pour la ninéine, nous caractériserons les différents domaines de la ninéine, précédemment décrits comme impliqués dans la nucléation et l’ancrage des microtubules, dans un fond génétique nul pour la ninéine. En outre, nous testerons la contribution d’autres protéines centrosomales pouvant interagir avec la ninéine et qui pourraient contribuer à l’activation et la liaison des gamma-TuRCs au centrosome.