Projet ANR-10-BLAN-1530 – Green Fib : Substitut vert de fibronectine et fonctionalisation de matériaux
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Karine ANSELME (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ALSACE)
Partenaires : Institut de Sciences des Matériaux de Mulhouse; Équipe de Recherche sur les Relations Matrice Extracellulaire-Cellules; Polymères, Biopolymères, Surfaces
Montant : 440000.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Une fibronectine « verte » issue de plantes pourrait remplacer la fibronectine humaine pour améliorer les surfaces d’implantsLa fibronectine issue du plasma sanguin humain est utilisée pour favoriser l’adhésion des cellules et tissus humains sur des matériaux utilisés notamment pour la réalisation d’implants. Notre projet a pour objectif de la remplacer par une fibronectine d’origine végétale ce qui diminuerait son coût et le risque de transmission de maladies.
Remplacer la fibronectine humaine par une fibronectine ‘verte’ d’origine végétaleDes stratégies récentes en biomatériau ont cherché à fixer à la surface des implants des molécules reconnues par les cellules comme la fibronectine (FN). La FN utilisée dans le domaine des biomatériaux est généralement purifiée à partir du plasma humain (pFN). Nous avons démontré précédemment qu’il est possible d’isoler une protéine similaire à la pFN (gFN pour green FN) à partir de plantes. De plus, cette gFN a un potentiel comparable à celui de la pFN pour l’adhésion des bactéries et des cellules eucaryotes. Par conséquent, la gFN est une bonne candidate comme protéine de remplacement de la pFN. Afin de valider l’intérêt de la gFN pour remplacer la pFN dans ses utilisations les plus courantes, nous proposons d’évaluer le potentiel de la gFN pour la fonctionnalisation de matériaux pour les implants osseux (titane), de polystyrène pour la culture cellulaire et de silicium pour les micropuces à cellules. Pour cela des méthodes classiques et originales de greffage de la gFN seront développées. Les interactions de la gFN avec des cellules humaines saines ou cancéreuses mais aussi avec des bactéries non pathogènes et pathogènes souvent impliquées dans les infections sur implants seront étudiées séparément et dans un modèle de co-culture. Cette gFN, si elle fonctionne dans les différentes applications citées ci-dessus, présenterait plusieurs avantages dont une diminution du risque de transmission de maladies mais surtout une diminution notable du coût de production.
Purifier et caractériser la fibronectine ‘verte’ pour fonctionnaliser des matériauxLes fibronectines humaines (pFN) et végétales (gFN) sont purifiées par chromatographie d’affinité. La structure de la gFN est déterminée et comparée à celle de la pFN. En particulier, les résidus sucre, nombreux dans les protéines végétales, sont identifiés et utilisés pour développer des méthodes de greffage originales. L’efficacité de la gFN sur l’adhésion des cellules mais aussi des bactéries est évaluée dans un modèle original de co-culture.
Résumé de la soumission : Comme les cellules reconnaissent et adhèrent via les intégrines sur les biomacromolécules de la matrice extracellulaire (MEC), des stratégies récentes en biomatériau ont cherché à mettre des ligands des intégrines à la surface des implants. La fibronectine (FN) est une protéine présente dans la MEC qui interagit avec les cellules pour contrôler l’adhésion, l’organisation du cytosquelette et la signalisation cellulaire. La FN utilisée dans le domaine des biomatériaux est généralement purifiée à partir du plasma humain et a été largement utilisée in vitro pour favoriser les interactions des cellules avec la surface des matériaux mais aussi in vivo pour améliorer l’intégration des implants dans les tissus. La FN est aussi fréquemment utilisée pour la fonctionnalisation des boites de culture cellulaire et les biochips.Deux stratégies d’immobilisation des protéines à la surface existent: l’adsorption de protéines (qui donne une modification chimique peu résistante avec le temps dans les fluides biologiques) et le greffage de protéines (qui donne une couche de protéines stables avec le temps). Jusqu’à présent, cette dernière stratégie a été utilisée pour des peptides RGD ou des fragments de FN mais pas pour la molécule entière à cause du coût du procédé de purification de la FN à partir du plasma humain (pFN) mais plus sûrement à cause du risque de contaminations par des virus ou des prions après implantation. Nous avons démontré précédemment qu’il est possible d’isoler une protéine FN-like (gFN pour green FN) à partir de plantes. De plus, cette gFN a un potentiel comparable à celui de la pFN pour l’adhésion des bactéries et des cellules eucaryotes. Par conséquent, la gFN a un potentiel important pour remplacer la pFN.Comme la gFN possède un fort pourcentage de glycosylations (70%), nous proposons de tirer avantage de cela pour développer une nouvelle méthode de greffage basée sur l’amination réductive des résidus sucre ce qui permettrait de maintenir la conformation active de la molécule et des domaines peptidiques impliqués dans les interactions cellules/FN. Les molécules de gFN et de pFN seront comparées à la vitronectine humaine (pVN) qui est aussi purifiée à partir du sérum et qui possède un taux de glycosylation intermédiaire (30%).De plus, ce fort taux de glycosylation de la gFN pourrait avoir un effet stimulant sur l’adhésion bactérienne puisqu’il est bien connu que les bactéries ont une forte affinité pour les résidus sucres par l’intermédiaire des lectines et pourrait aussi influencer l’adhésion cellulaire. Ainsi il apparait essentiel d’évaluer le potential de la gFN sur les cellules eucarytes d’une part, des bactéries d’autre part et des deux ensemble. En effet, les bactéries sont fréquemment introduite à la surface d’un implant lors de la chirurgie et la course pour la surface commence avant que l’intégration tissulaire n’ait lieu. D’autre part, une infection bactérienne dans le corps d’un patient relargue des bactéries libres qui sont capables d’infecter ensuite la surface d’un implant déjà colonisé par les cellules eucaryotes. Pour cette raison, les deux situations pourraient être affectées d’une manière complexe par les modifications chimiques résultant de la fonctionalisation de surface des dispositifs biomédicaux. Jusqu’à présent aucune étude d’une nouvelle fonctionalisation de surface pour améliorer l’intégration tissulaire n’a abordé simultanément la formation de biofilm et l’intégration tissulaire. Finalement nous proposons d’évaluer le potentiel de la gFN pour la fonctionalisation de matériaux pour les implants osseux (titane), de polystyrene pour la culture cellulaire et de silicium pour les biochips. Les interactions de la gFN avec des cellules osseuses humaines saines et des cellules cancéreuses ovariennes humaines mais aussi avec des bactéries non pathogènes et pathogènes souvent impliquées dnas les infections osseuses seront étudiées séparément et dans un modèle de co-culture.
Résultats : La gFN a été purifiée et les premiers tests ont permis de confirmer son effet adhésif sur des cellules. Malgré des optimisations nécessaires pour augmenter le rendement de purification, les phases de caractérisation de la gFN ont été entamées notamment avec l’objectif de connaitre sa composition en acides aminés et en sucre et d’en extraire les fragments les plus intéressants. Ces informations seront importantes pour développer des méthodes originales permettant de la fixer de manière pérenne à la surface de matériaux pour des utilisations médicales. La gFN contenant beaucoup de radicaux sucres susceptibles de favoriser l’adhésion de bactéries, il sera important de tester sa capacité à favoriser l’adhésion des cellules humaines mais aussi des bactéries pathogènes. Un modèle de co-cultures de cellules avec des bactéries a été mis au point. Il permettra de vérifier le risque de favoriser avec la gFN l’adhésion des bactéries au détriment des cellules. Le résultat obtenu sera essentiel dans le cadre d’utilisations médicales de la gFN. Il permettra aussi de modifier le protocole de fixation de la gFN sur le matériau afin de limiter l’adhésion des bactéries au profit des cellules.
Perspectives : Ce projet pourrait permettre de proposer un substitut de la fibronectine plasmatique (pFN) extrait à partir de plantes (gFN) pour la fonctionnalisation de biomatériaux ou de supports pour culture cellulaire. Cette gFN présenterait plusieurs avantages par rapport à la pFN dont une diminution du risque de transmission de maladies mais surtout une diminution notable du coût de production. Si la gFN s’avérait équivalente en termes d’efficacité à la FN plasmatique, le procédé de purification ainsi que les techniques de greffages adaptées pourraient faire l’objet d’un transfert industriel.
Publications et brevets : Néant pour l’instant.