Projet ANR-13-JS09-0006 – CNOC : Nucleation de cristaux sur puce
Programme : JCJC - SIMI 9 - Sciences de l'Ingénierie, Matériaux, Procédes et Energie (JCJC SIMI 9)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Sébastien TEYCHENE (Laboratoire de Génie Chimique)
Partenaires : Laboratoire de Génie Chimique
Montant : 214989.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : CNOC - Nucleation de cistaux sur puceL’objectif principal du projet est de développer des outils expérimentaux et numériques permettant d’améliorer la compréhension des premiers instants de la nucléation de cristaux.
Mesurer les premiers instants de la nucléationL’objectif principal du projet est de développer des outils expérimentaux et numériques permettant d’améliorer la compréhension des premiers instants de la nucléation de cristaux. D’un point de vue expérimental, l’association de la microfluidique  et de la diffusion de rayon X aux petits angles issue d’un rayonnement synchrotron permet de sonder la matière aux échelles pertinentes pour le phénomène de nucléation  (i.e. échelle d’espace de l’ordre du nanomètre et à échelles de temps allant de la microseconde à l’heure). D’un point de vue numérique, des modèles de nucléation de type Monte Carlo Cinétique, permettent de traiter des systèmes complexes à une échelle d’espace comparable à celle générée à l’aide de puces microfluidiques. L’association de ces deux approches devrait donner un tableau général des mécanismes mis en jeu lors de la cristallisation.
Couplage SAXS et microfluidique* La microfluidique en goutte. Cette technologie nous permet de generer un grand nombre de «reacteurs« de crystallisation afin de procéder à une étude statistique des phénomènes de nucléation mais également d'étuider la thermodynamique de ce changement de phase (détermination des diagrammes de phases).* La diffusion de rayons X aux petits angles issues d'une source synchrotron : Cette méthode analytique nous permet de sonder la matières à des échelles de l'ordre du nanomètre, et l'intensité du rayonnement synchrotron nous permet d'avoir des temps d'acquisition courts (avec un ratio signal/bruit satisfaisant) ce qui est compatible avec l'analyse e ligne des phénomènes mis en jeu lors des processus de nucléation.* Pour aider les expérimentateurs du projet, une première version de la simualtion numérique  basée sur des m«thodes de monte carlo cinétique a également été mise au point. Cette approche nous permet de determiner les facteur de formes et de les comparer a ceux obtenus lors des expériences réalisée en diffusion de rayons X au synchrotron.
Résumé de la soumission : Le procédé de cristallisation est l’une des plus anciennes opérations unitaires du génie chimique et est connue depuis la nuit des temps. Cependant, en dépit de nombreux développement expérimentaux et théoriques et en dépit de ces nombreuses applications dans les domaines de la chimie, de la biologie…  la cristallisation est un phénomène complexe couplant différents processus (nucléation croissance, agrégation…)  à différentes échelles de temps et d’espace. La principale raison pour laquelle la cristallisation est encore mal connue réside dans la méconnaissance des mécanismes impliqués dans le processus de nucléation. En effet, la nucléation est un processus délicat à étudier tant du point de vue expérimental que théorique car ce phénomène est stochastique, impliquant des évènements rares, et met en jeu des structures de petites tailles (quelques nanomètre) dont la durée de vie est très courte. Le projet CNOC, est projet, fondamental - qui combine des approches théoriques et expérimentales originales- pluridisciplinaire- qui implique un physicien théoricien, des biophysiciens ainsi que des ingénieurs chimistes - dans le but  d’acquérir le savoir nécessaire à la compréhension des mécanismes impliqués dans le processus de nucléation de cristaux.Le projet CNOC associe des technologies de pointes (la microfluidique), des techniques de caractérisation performantes (diffusion de rayons X, SAXS) ainsi qu’une approche numérique originale basée sur des méthodes Monte-Carlo permettant une avancée certaine dans la compréhension des mécanismes impliqué dans le processus de nucléation. Le couplage SAXS-microfluidique permet de mesurer in-situ, à l’échelle du nanomètre,  les structures impliquées dans le processus de nucléation. En outre,  grâce à la conversion temps-espace offerte par les dispositifs microfluidiques, cette association permet de repousser  limites de la résolution temporelle à des échelles de l’ordre de la milli/microseconde. Enfin, la description théorique de la nucléation, basée sur des simulations Monte-Carlo capable de traiter des gros systèmes complexes  (similaires à ceux obtenus en microfluidique), permettra de mettre en évidence les mécanismes et d’en dégager les échelles de temps caractéristiques impliqués dans le processus de nucléation.Ce projet dure 48 mois, il inclut 5 taches principales et regroupes des chercheurs provenant de laboratoires reconnus internationalement : le laboratoire de génie chimique (LGC, Toulouse), l’Institut des Biomolécules Max Mousseron  (IBMM, Avignon), le  Laboratoire de Physique des Solides (LPS, Orsay) et le Laboratoire Européen de Biologie Moléculaire   (EMBL, Grenoble). Cette diversité des compétences, de savoir-faire, de connaissances et d’expertises est une garantie au bon déroulement de ce projet inter et pluridisciplinaire. La collaboration et les interactions fortes entre les différents participants permettra d’atteindre les objectifs de ce projet ambitieux, en développant des outils expérimentaux orignaux (puces microfluidiques compatibles avec les rayonnements X intenses provenant d’une source synchrotron), de mettre en place les analyses SAXS in-situ, permettant de suivre l’évolution des agrégats moléculaires  en solution lors du processus de nucléation, dans le but de réunir tous les éléments permettant la mise en place d’un théorie de la nucléation à partir des simulations numériques. Les résultats obtenus dans ce projet, sur une macromolécule modèle judicieusement choisie au préalable, permettront de mettre en évidence les différents mécanismes impliqués lors du processus de nucléation en déterminant expérimentalement et numériquement l’évolution temporelle des propriétés des nuclei (taille, forme, structure et nombre) : depuis la formation des agrégats moléculaire précritiques (avant le nucléation)  jusqu’à l’émergence du cristal en solution.
Résultats : Choix des systèmes d’étude
Le couplage microfluidique et rayonnement synchrotron n’est pas si fréquent dans la littérature et n’est une tâche aisée. En effet, étant donné l’intensité du rayonnement X, la majorité des huiles et des traitements de surface utilisés classiquement en microfluidique pour générer des gouttes de solution aqueuse sont détruit lors des premières secondes d’exposition. Une première phase d’étude nous a permis de lever ces verrous technologiques. Le système retenu s’est avéré très robuste aux rayonnements X et compatible avec les protéines. Grâce à ce système, nous avons pu déterminer in-situ la structure basse résolution de quatre protéines d’intérêt transportée dans des gouttes de solution aqueuse. 
Détermination des diagrammes de phase in-situ
Ce développement technologique nous a permis, de mesurer les potentiels d’interactions Protéine-Protéineet donc de déterminer les diagrammes de phases d’une protéine modèle. Les données obtenues sont en très bon accord avec les données publiée dans la littérature L’avantage de l’utilisation de la technologie microfluidique par rapport aux techniques classiques est un gain de temps et la faible consommation de produit .  Pour mener à bien cette étude, il était nécessaire d’avoir une très bonne résolution aux petits angles nous avons donc développé un système de synchronisation (basée sur une analyse d’image en temps réel) entre le passage des gouttes et le faisceau de rayons X. 
Etude de la cristallisation de la glucose isomérase.
Enfin, grâce à ce système, nous avons réalisé le suivi in-situ de la cristallisation de la glucose isomérase à partir des pics de Bragg obtenus aux grands angles.
Simulation Numériques
Le partenaire physicien théoricien, nous a fourni des premiers codes de calculs nous permettant d’analyser les courbes SAXS obtenus. A partir de différent mode d’agrégation, son modèle permet de remonter au facteur de structure des agrégats formés lors des premiers instants de nucléation.
Perspectives : Le dispositif expérimental étant prêt,  la prochaine période sera consacrée à la détermination des cinétiques de nucléation au laboratoire (approche statistique et macroscopique) et à la détermination des structures mis en jeu lors de la nucléation. Ces expériences, dont les résultats sont attendus pour le début du 2d semestre de 2015, permettront d’initier l’écriture d’un modèle numérique de nucléation attendu par le partenaire du LPS.
Publications et brevets : Publication : 
1.	N. V. Pham, D. Radajewski, P. Guillet, A. Round, M. Brennich, P. Pernot, B. Biscans, F. Bonnete´, S. Teychene´,  Coupling digital microfluidics and Small-Angle X-ray scattering to study the whole crystallization process of proteins in solution  Acta D Cryst 2015 (submitted)
Conférences Int.
1.	Coupling Droplet Microfluidic and Small Angle X-Ray Scattering N. V. Pham, D. Radajewski, P. Guillet, M. E. Brennich, A. Round, P. Pernot, B. Biscans, F. Bonneté, S. Teychené 19th International Symposium on Industrial Crystallization – 2014 - Toulouse France (ORAL)
2.	Coupling droplet microfluidic and small angle X-ray scattering: Toward on-line measurement of first nucleation step , D. Radajewski, N. V. Pham, P. Guillet, M. E. Brennich, A. Round, P. Pernot, B. Biscans, F. Bonneté, S. Teychené 15th International Conference on the Crystallization of Biological Macromolecules – 2014 Hambourg- Germany (ORAL)
3.	(INVITE) Coupling digital microfluidics and Small-Angle X-ray scattering to study the whole crystallization process of proteins in solution S. Teychene´, D. Radajewski, N. V. Pham, A. Round, M. Brennich, P. Pernot, B. Biscans, F. Bonnete´.
USER MEETING ESRF 2014 (ORAL)
4.	Coupling digital microfluidics and Small-Angle X-ray scattering D. Radajewski, P. Guillet, M. E. Brennich, A. Round, P. Pernot, B. Biscans, F. Bonneté, S. Teychené, EMBL Conference: Microfluidics 2014 – Heidelberg (POSTER)
National Conférences
1.	(INVITE) Coupling digital microfluidics and Small-Angle X-ray scattering to study the whole crystallization process of proteins in solution S. Teychene´, D. Radajewski, N. V. Pham, A. Round, M. Brennich, P. Pernot, B. Biscans, F. Bonnete´.
Journée Scientifique C’nano Porquerolles 2014.