Projet ANR-10-BLAN-0725 – METABACT : métallodrogues à activité antibactérienne: de la synthèse à l'évaluation biologique in situ
Programme : Sciences de l'information, de la matière et de l'ingénierie :  Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Isabelle ARTAUD (UNIVERSITE DE PARIS V - RENE DESCARTES)
Partenaires : Transporteurs Membranaires, Chimiorésistance et Drug-Design; Unité de Recherche Soleil; Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques; Université Pierre et Marie Curie
Montant : 500000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Métallodrogues à activité antibactérienne : de la synthèse à l’évaluation biologique in situComment combattre la resistance des bacteries Gram- due à la faible perméabilité de la membrane externe et à l'expression de pompes d'efflux
Nouvelle voie de vectorisation : effet de perméabilisants et de modulateurs d’efflux, activité biologique et mapping intracellulaireObjectifs: améliorer les activités antibactériennes de molécules actives in vitro, et tester des complexes à activité SOD, en greffant un adjuvant pour combattre la non-perméabilité de la membrane externe de bactéries Gram- ou l’efflux. Finalité : 1) déterminer le spectre d’activité antibacterien des composés synnthétisés 2) mettre au point une nouvelle méthodologie permettant de relier activité biologique et localisation subcellulaire et concentration des molécules dans les bactéries
MethodologiesMéthodes : synthèse de complexes à activité SOD et de métallodrogues sur lesquels sont greffés des adjuvants tels que perméabilisant ou modulateur de l’efflux permettant d’augmenter la concentration intracellulaire de la drogue – Relation activité biologique / concentration et localisation intracellulaire : mesure de MIC sur différentes souches Gram(-) E coli et des isolats cliniques E.aerogenes isogéniques produisant des pompes d’efflux à des niveaux variés.- Pour les expériences de localisation et de concentration intracellulaire utilisation de la microscopie  à fluorescence VUV couplée à une ligne de lumière synchrotron assurant une excitation stable entre 200 et 600 nm.
Résumé de la soumission : Ce projet implique des chimistes, des bactériologistes et des biophysiciens dans le but d’étudier l’activité de métallodrogues à activité antibactérienne. Généralement, la plupart des composés actifs in vitro ne le sont que partiellement in cellulo en raison d’une faible concentration intracellulaire liée à l’imperméabilité de la membrane notamment chez les bactéries à Gram négatif. L'objectif majeur de ce projet est de proposer de nouvelles stratégies synthétiques pour améliorer la pénétration de tels composés, d’évaluer leurs activités biologiques et de les corréler à leur localisation et leur distribution à l’intérieur de la cellule. Le projet sera concentré sur: i) des inhibiteurs puissants de deux métalloprotéases essentielles à la survie des bactéries, les peptide déformylases (PDF-inhibs) et les méthionine aminopeptidases (MetAP-inhibs) ii) une série de glycocomplexes de Mn produisant par réaction avec O2•-, H2O2 puis in cellulo,  HO• (par réaction d’Haber Weiss) ou HOCl (par réaction avec la myéloperoxydase) des composés toxiques pour la bactérie. Afin d’augmenter l’activité antibactérienne, des chimiosensibilisateurs, tels que des peptides cationiques (reliés aux peptides antimicrobiens mais plus courts), des oligosaccharides ou des aminoglycosides seront utilisés en combinaison avec les composés précédents (systèmes binaires) ou greffés sur les métallodrogues à Mn à activité antioxydante ou sur le ligand auxiliaire d’une métal-chaperone construite avec les inhibiteurs de PDF ou de MetAP (bioconjugués) et jouant le rôle de transporteur de ces inhibiteurs. Seront également synthétisés des bioconjugués construits sur des Mn-SOD-like capables de délivrer à l’intérieur de la bactérie un complexe à activité SOD et un inhibiteur de PDF ou MetAP.L’activité antibactérienne des systèmes binaires et des bioconjugués sera évaluée sur différentes souches sauvages et sur des souches dont la perméabilité membranaire est modifiée (isolats cliniques surproduisant des systèmes de pompes d’efflux ou dépourvus de porines, souches mutées dans les transporteurs d'efflux). Les métallodrogues, dont l'activité biologique dépend du degré d'oxydation du métal, seront caractérisées par EXAFS et XANES de sorte à valider leur intégrité moléculaire et chimique jusqu'à leur pénétration dans la cellule. L'objectif ultime de ce projet est de relier les activités biologiques de tous ces composés, en tant que systèmes binaires ou bioconjugués, à leur taux de pénétration et à leur concentration intracellulaire. Ceci sera réalisé par des expériences d’imagerie par spectromicroscopie de fluorescence VUV sur DISCO à SOLEIL. Pour les composés les plus efficaces, quelques expériences de prospective seront réalisées à l’échelle nano (µ-SXRF) à l’ESRF puis sur la ligne nanoscopium qui sera disponible d’ici 3 ans à SOLEIL, en utilisant comme sonde un atome lourd (Br) présent sur les inhibiteurs ou sur les ligands des métallodrogues et /ou les cations métalliques Fe, Co et Mn. L’avantage évident des expériences d’imagerie, qui seront conduites prioritairement sur DISCO, est que ces techniques sont non invasives et ne nécessitent aucune addition de marqueurs. In fine, ce projet permettra de déterminer les paramètres structuraux et chimiques (pharmacophores) des métallodrogues et des perméabilisants greffés, qui jouent un rôle clé dans la diffusion au travers de la paroi bactérienne. La caractérisation de ces sytsèmes permettra ainsi d’élaborer de nouveaux outils pour augmenter l’efficacité antibactérienne de molécules actives sur des cibles bactériennes in vitro.
Résultats : (i) synthèse de différentes métallodrogues en serie TPA(Co(III) comportant un adjuvant perméabilisant ou modulateur d’efflux  (ii) mise en place d’une plateforme modulable efficace comme ligand (iii) CMI des métallodrogues résultant du couplage avec le TPA-PAßN, inférieure à celle de l’inhibiteur et du vecteur seul, quel que soit l’inhibiteur utilisé, et ceci sur des souches efflux positif ou efflux négatif (iv) des complexes de cuivre ont montré une activité antibactérienne encourageante (v) mise au point de la technique permettant de relier activité antibactérienne et concentration intracellulaire par une technique d’Imagerie basée sur la microfluorescence VUV, ceci a permis de visualiser l’accumulation des fluoroquinolones dans des bactéries MDR en utilisant la fluorescence propre de l’antibiotique
Perspectives : Les perspectives indiquées sont en continuation des résultats obtenus détaillés dans le rapport.
• Relation structure activité en faisant varier la nature du ligand des métallodrogues, du métal et du perméabilisant • développement de nouveaux antibactériens actifs sur des souches résistantes à la ciprofloxacine et mapping intracellulaire  • développement de nouveaux complexes de cuivre perméabilisants comme agents antibactériens
Publications et brevets : 1.	Evaluation of the Anti-oxidant Properties of a SOD-Mimic Mn-Complex in Activated Macrophages, Clotilde Policar et al, Dalton Trans, 2012, 41, 6399-6403, DOI: 10.1039/c2dt12479c Application of Inorganic Chemistry for non-Cancer Therapeutics
2.	Fluorescence Microscopy to Determine Antibiotic Accumulation with Single Cell Resolution Kašcáková S., Maigre L., Chevalier J., Réfrégiers M., Pagès J.-M. 2012. Antibiotic Transport in Resistant Bacteria: Synchrotron UV. PLoS ONE, 2012, 7(6): e38624. doi:10.1371/journal.pone.0038624
3.	Broad-specificity efflux pumps and their role in multidrug resistance of Gram-negative bacteria. Nikaido H., Pagès J.-M. 2012. FEMS Microbiol. Rev., 36: 340-363.
4.	Hydroxamic Acids as Potent Inhibitors of Fe(II) and Mn(II) E. coli Methionine Aminopeptidase: Biological Activities and X-ray Structures of Oxazole Hydroxamate–EcMetAPMn Complexes. Pagès, JM ; Artaud, I  et al ChemMedChem 2012, 7, 1020-1030 
5.	Characterization of cobalt(III) hydroxamic acid complexes based on a tris-(2-pyridylmethyl)amine scaffold : reactivity toward cysteine  methyl ester. Alimi, M ; Allam, A ; Artaud, I. et al Inorg. Chem. 2012, doi.org/10.1021/ic301090t