Projet ANR-11-JSV5-0001 – AFMYST : Etude Biophysique, biochimique et biomoléculaire de la paroi des levures.
Programme : JCJC - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (JCJC SVSE 5)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Etienne DAGUE (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE MIDI-PYRENEES)
Partenaires : Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes
Montant : 182000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Etude Biophysique, biochimique et biomoléculaire de la paroi des levuresLes levures sont des micro organismes eucaryotes essentiels pour l’agro alimentaire et les biotechnologies. Notre but est de mieux comprendre l’organisation biophysique et biomoléculaire de la surface de ces cellules. Cette connaissance permettra d’améliorer les process agro alimentaires et les biotechnologies
Architecture de la paroi des levuresLe projet transdisciplinaire AFMYST se positionne à l’interface de la biologie, de la chimie et de la physique. La question biologique posée concerne l’organisation et la morphogénèse de la paroi des levures Saccharomyces cerevisiae. Cette paroi cellulaire a été essentiellement étudiée par des méthodes de biochimie ou de biologie moléculaire. Notre objectif est d’apporter à cette connaissance les observations en microscopie à force atomique donnant accès à la biophysique de la paroi. Des résultats préliminaires obtenus sur des mutants pour les différents sucres composant la paroi montrent la pertinence de cette approche. Le rôle de chaque constituant de la paroi (polysaccharides et protéines) dans l’organisation et la morphogénèse sera évalué en réalisant des mesures de rugosité de surface et de nanomécanique, par AFM. L’effet de stress (thermique, osmotique, ionique, antifongique) sera également évalué. Dans un deuxième temps notre attention sera focalisée sur les protéines de surface et sur leur cartographie à la surface de la paroi. Pour ce faire les pointes AFM seront fonctionnalisées par les anticorps dirigés contre les protéines de surface pour réaliser des expériences de spectroscopie de force à l’échelle de la molécule unique sur des cellules vivantes. Le but ici est de cartographier quatre protéines : Flo11 de la famille des protéines Flo impliquées dans les phénomènes d’adhésion à des surfaces ou entre cellules ; Cwp1, une mannoprotéine impliquée dans l’organisation de la paroi, Pir1 de la famille des protéines Pir nécessaires à la stabilité de la paroi, et Gas1 qui porte une activité beta-1.3 glucanosyltranferase nécessaire à l’assemblage de la paroi. Enfin les cibles pariétales et le mécanisme d’action de molécules antifongiques (la caspofungine, et la toxin killer 9) seront étudiés grâce à des pointes AFM fonctionnalisées par ces molécules.
Le mircoscope à Force Atomique pour sonder les interfaces vivantes Le projet AFMYST a pour but de visualiser la paroi des levures en utilisant le microscope à force atomique. Deux verrous technologiques sont identifies. Le premier réside dans l’immobilisation de cellules pour l’AFM. La tache 1 est dédiée au développement des techniques d’immobilisation pour l’AFM (un article soumis). Le deuxième réside dans la biofonctionnalisation des pointes AFM. Nous développerons une méthode de Biofonctionnalisation, basée sur les dendrimères, qui a déjà donné lieu à une demande de brevet.
Résumé de la soumission : Le projet transdisciplinaire AFMYST se positionne à l’interface de la biologie, de la chimie et de la physique. La question biologique posée concerne l’organisation et la morphogénèse de la paroi des levures Saccharomyces cerevisiae. Cette paroi cellulaire a été essentiellement étudiée par des méthodes de biochimie ou de biologie moléculaire. Notre objectif est d’apporter à cette connaissance les observations en microscopie à force atomique donnant accès à la biophysique de la paroi. Des résultats préliminaires obtenus sur des mutants pour les différents sucres composant la paroi montrent la pertinence de cette approche. Le rôle de chaque constituant de la paroi (polysaccharides et protéines) dans l’organisation et la morphogénèse sera évalué en réalisant des mesures de rugosité de surface et de nanomécanique, par AFM. L’effet de stress (thermique, osmotique, ionique, antifongique) sera également évalué. Dans un deuxième temps notre attention sera focalisée sur les protéines de surface et sur leur cartographie à la surface de la paroi. Pour ce faire les pointes AFM seront fonctionnalisées par les anticorps dirigés contre les protéines de surface pour réaliser des expériences de spectroscopie de force à l’échelle de la molécule unique sur des cellules vivantes. Le but ici est de cartographier quatre protéines : Flo11 de la famille des protéines Flo impliquées dans les phénomènes d’adhésion à des surfaces ou entre cellules ; Cwp1, une mannoprotéine impliquée dans l’organisation de la paroi, Pir1 de la famille des protéines Pir nécessaires à la stabilité de la paroi, et Gas1 qui porte une activité beta-1.3 glucanosyltranferase nécessaire à l’assemblage de la paroi. Enfin les cibles pariétales et le mécanisme d’action de molécules antifongiques (la caspofungine, et la toxin killer 9) seront étudiés grâce à des pointes AFM fonctionnalisées par ces molécules.Ce projet transdisciplinaire rassemble 3 jeunes chercheurs, dont deux émanent de l’équipe NanoBioSystèmes du LAAS –CNRS dirigé par Liviu Nicu (E. DagueCR2-CNRS et C. Thibault MDC INSA), le troisième, de l’équipe de physiologie Microbienne moléculaire du LISBP (H Martin-Yken CR1 - INRA). Ces trois jeunes chercheurs présentent des compétences complémentaires. Le LISBP a une forte expertise dans le domaine de la paroi des levures alors que le LAAS-CNRS a l’expertise en AFM et micro-nano-fabrication. De plus, ce projet constitue aussi une rampe de lancement au sein de l’Institut Technologies Avancées des Sciences du Vivant (ITAV) qui a vocation à héberger des projets transdisciplinaires et de rupture technologique.Le projet est organisé en 5 tâches. La première, consiste à développer et optimiser les méthodes d’immobilisation des cellules vivantes pour leur étude en microscopie à force atomique. La deuxième est consacrée à la biophysique de la paroi dans les différentes conditions de stress. La troisième, est dédiée au développement de la chimie de surface nécessaire  à la bio fonctionnalisation des pointes AFM qui seront utilisées dans la 4ème tache intitulée analyse fonctionnelle de la paroi, consistant à cartographier des protéines d’intérêt à la surface des cellules vivantes et à étudier la cible d’action de molécules antifongiques. La 5ème tâche est une tâche de coordination et management qui sera réalisée par le coordinateur du projet, E Dague Les résultats seront principalement valorisés sous forme de publications scientifiquesLe coordinateur du Projet, E Dague est né en 1978, Phd, Docteur en pharmacie, lauréat de l’académie de pharmacie, chargé de recherche du CNRS depuis 2007. Il est l’auteur de 19 publications scientifiques dans le domaine de l’AFM appliqué aux cellules vivantes.La demande d’équipement concerne l’amélioration d’un AFM et d’un système de dosage des sucres constituants la paroi des levures.La demande de moyen humain concerne un post-doctorant qui sera impliqué dans les tâches 2 à 4
Résultats : La première tâche consistant a développé un outil d’immobilisation des cellules vivantes pour l’AFM nous a conduit à développer un outil versatile utilisable pour les levures saccharomyces cerevisiae mais aussi pour Candida albicans. Ce développement ouvre des perspectives intéressantes vers des applications biomédicales. 
D’autre part, nous avons étudié l’effet des stress thermique, éthanolique et antifongique sur la paroi des levures ce qui nous conduit à une meilleure connaissance de la paroi des levures
Perspectives : Le début du projet nous ouvre les voies d’application biomédicale. La levure Saccharomyces cerevisiae est un modèle d’étude interessant de levures pathogènes comme Candida albicans. Mieux comprendre les effets de diférents stress sur la paroi de S. cerevisae pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. 
Parallèlement, cette connaissance intéresse également les industriels qui produisent de la paroi de levure et souhaitent valoriser ce produit (comme probiotique ou comme filtre pour des polluants par exemple).
Publications et brevets : 1. Dague E., Jauvert E., Laplatine L., Viallet B., Thibault C., Ressier L. 2011. Assembly of live micro-organisms on microstructured PDMS stamps by convective/capillary deposition for AFM bio-experiments 22. 395102 Nanotechnology	IF = 3.979
Dans ce papier, nous décrivons notre méthode d’immobilisation originale des levures. Nous démontrons que la technique peut etre utilisée pour Saccharomyces cerevisiae et  Aspergillus fumigatus. Nous montrons que grâce à un assemblage dirigé des cellules, nous pouvons multiplexé les analyses et gagné en efficacité.
2. Jauvert E.*, Dague E.*, Severac M., Ressier L., Caminade A-M., Majoral J-P., Trévisiol E. 2012., Probing single molecule interactions using bio-functionalized dendritips Sensors and Actuators	IF = 3.898
* authors who have equally contributed to the work
Cet article décrit des mesures d’interaction à l’échelle de la molécule unique (antigène-anticorps) réalisées grâce aux dendritips. Ces pointes fonctionnalisées par un dendrimère aldéhydique ont été brevetées (cf. plus bas)
3. Formosa C., Grare M., Coutable A., Jauvert E., Regnouf de Vains J.-B., Mourer M., Duval R.E., Dague E. 2012. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and Cx1 on Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant, In Press, Scientific Reports (Nature Publishing Group)
Cette publication n’est pas en lien direct avec les levures mais utilise les dendritips qui sont le fruit d’un développement du projet. Elle n’aurait donc pas été possible sans le développement des pointes biofonctionnalisées d’AFMYST
4. Dague E., Trevisiol E., Jauvert E., Pointe de microscope à force atomique modifiée et biomodifiée, 2010 n° dépôt 10 57932, 30/09/2010
Ce brevet protège l’invention des pointes fonctionnalisées par un dendrimère aldéhydique pour le greffage de biomolécules.