Projet ANR-11-BS07-0021 – KITUSE : Espaceurs aromatiques auto-immolables cinétiquement modulables
Programme : Blanc - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Frédéric SCHMIDT (INSTITUT CURIE - SECTION DE RECHERCHE)
Partenaires : École normale supérieure de Paris; Institut Curie
Montant : 298369.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Contrôle de la libération de composés à partir d’un déclenchement par la lumièreAprès une étape de photoactivation, un ou plusieurs composés biologiquement actifs ou reporteurs fluorescents seront libérés grâce à l’utilisation d’un espaceur auto-immolable.
Après une étape de photoactivation, un ou plusieurs composés biologiquement actifs seront libérés grâce à l’utilisation d’un espaceur auto-immolableLes espaceurs auto-immolables sont déjà utilisés pour certains médicaments existant sous forme de prodrogue. Notre but consiste à contrôler plus finement l’étape de libération, en particulier au niveau de la vitesse. La mesure de la vitesse de ce type de réaction a été rendue possible par une construction faisant intervenir une étape de photoactivation rapide ; la plupart des travaux antérieurs sont basés sur une activation enzymatique lente qui rend très imprécise les mesures de l’étape de libération. Les retombées de ce type d’études seront multiples : fournir aux biologistes des outils permettant d’étudier la fonction d’un composé libéré à un moment précis à l’intérieur d’une cellule, des applications dans le domaine de l’imagerie en libérant des fluorophores, et des applications thérapeutiques dans le domaine des prodrogues.
Mesure de la vitesse de l’étape de libération par photoactivationL’idée consiste à synthétiser des molécules constituées de 3 parties : un groupement photoactivateur, un espaceur auto-immolable, et un reporteur fluorescent. L’irradiation du composé va déclencher la coupure du groupement photoactivateur de façon contrôlée. Le système évoluera alors de façon spontanée et nous pourrons mesurer son évolution grâce à la fluorescence du ou des groupements reporteurs. Ces mesures ont permis de calculer les différents paramètres cinétiques caractéristiques de l’étape d’auto-immolation. En faisant varier la structure de l’espaceur auto-immolable, nous avons pu déterminer des relations entre la structure de l’espaceur et ses propriétés d’auto-immolation. Nous disposons ainsi d’une gamme d’espaceurs adaptés soit à une libération lente soit à une libération rapide en fonction des applications biologiques ou thérapeutiques recherchées.
Résumé de la soumission : Les espaceurs auto-immolables sont des édifices chimiques covalents utilisés pour augmenter la diversité des substrats d’enzymes à des fins thérapeutiques ou bio-analytiques: la réaction enzymatique déclenche la libération du principe actif d’un médicament ou d’une sonde. Dans ce projet, nous souhaitons développer une banque d’espaceurs auto-immolables cinétiquement modulables, ce qui permettra d’élargir encore leur champ d’application. Nous voulons par ailleurs les mettre en oeuvre pour introduire de puissants outils à des fins de biologie quantitative.Les espaceurs auto-immolables les plus couramment utilisés exploitent une réaction d’élimination impliquant la réorganisation d’électrons sur un noyau aromatique. Ce projet développe une approche raisonnée conçue pour fournir des relations structure-propriétés actuellement insuffisamment dégagées. Grâce à la synthèse et à l’étude cinétique détaillée de plusieurs séries de modèles, il deviendra possible, à partir de sa structure, de choisir un espaceur à cinétique d’auto-immolation adaptée pour une utilisation donnée d’un couple enzyme-principe actif/sonde particulier. De façon plus spécifique, nous chercherons aussi à augmenter au maximum la vitesse d’élimination du principe actif/sonde après l’étape d’activation enzymatique.Dans ce projet, la lumière sera utilisée à la fois pour initier l’activation des espaceurs auto-immolables et pour observer l’avancement de l’élimination menant à la libération d’un rapporteur fluorescent. Les études cinétiques reposeront ainsi principalement sur l’utilisation de méthodes optiques (spectroscopie d’absorption et d’émission stationnaire, spectroscopie de corrélation de fluorescence). Outre sa mise en oeuvre à des fins d’analyse physico-chimique, l’utilisation de la lumière pour initier la libération d’un produit et rapporter son occurrence nous permettra de proposer de nouveaux groupements protecteurs photo-labiles à rapporteur fluorescent. Nous utiliserons pour cela des espaceurs auto-immolables “rapides” que nous équiperons de ramifications. Après synthèse et étude photochimique complète in vitro, ces systèmes seront évalués sur cultures cellulaires.Les espaceurs auto-immolables peuvent constituer plus que des connecteurs passifs subissant une réaction d’élimination. Nous proposons ainsi de synthétiser des espaceurs incorporant un motif photochrome qui permettra de piloter la cinétique de libération d’un produit d’élimination fluorescent grâce à la lumière. Cette caractéristique sera mise à profit dans un contexte bioanalytique pour détecter et quantifier une activité enzymatique dans des conditions expérimentales difficiles (présence d’interférents, niveau de bruit élevé) telles que celles rencontrées in vivo. Nous utiliserons pour cela un protocole original d’observation. L’activité enzymatique sous excitation lumineuse modulée donnera lieu à une modulation de l’émission de fluorescence dont l’analyse par transformée de Fourier ou par détection synchrone permettra d’extraire sélectivement la contribution du seul fluorophore rapporteur de l’activité enzymatique.
Résultats : Nous nous sommes attachés à réaliser la synthèse des composés modèles susceptibles de libérer 1 ou 2 fluorophores. Une banque d’espaceurs auto-immolables variés a ainsi été obtenue. Des relations entre la structure chimique et les propriétés cinétiques ont été étudiées et ont alors permis de comprendre l’influence des divers paramètres. Ces résultats in vitro ont été étendus aux cellules.
Perspectives : Les applications potentielles vont depuis les aspects les plus fondamentaux jusqu’aux applications en imagerie et à la thérapie. En biologie, délivrer un ou plusieurs composés actifs de façon contrôlée dans le temps à l’intérieur d’une cellule ouvrira de nouveaux horizons. En thérapie, la libération d’un principe actif à partir de sa prodrogue est une stratégie importante qui pourrait bénéficier de données cinétiques apportées par nos études.
Publications et brevets : (1) Labruère R, Alouane A, Le Saux T, Aujard I, Pelupessy P, Gautier A, Dubruille S, Schmidt F, Jullien L. «Self-immolative« spacer for uncaging with fluorescence reporting. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Sep 10;51(37):9344-7.
doi: 10.1002/anie.201204032.
(2) Alouane A, Labruère R, Le Saux T, Aujard I, Dubruille S, Schmidt F, Jullien L. Light activation for the versatile and accurate kinetic analysis of disassembly of self-immolative spacers. Chemistry. 2013 Aug 26;19(35):11717-24.
doi: 10.1002/chem.201301298.
(3) Alouane A, Labruère R, Silvestre KJ, Le Saux T, Schmidt F, Jullien L. Disassembly kinetics of quinone-methide-based self-immolative spacers that contain aromatic nitrogen heterocycles. Chem Asian J. 2014 May;9(5):1334-40.
doi: 10.1002/asia.201400051.
3 publications supplémentaires (2 articles et 1 revue) en cours de rédaction