Projet ANR-06-BLAN-0062 – PHOSPHO-POL : Phosphorylation d'une polymérase virale et régulation du cycle de multiplication d'un virus de plante
Programme : Programme blanc (BLANC) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : CNRS DELEGATION REGIONALE PARIS B (CNRS DELEGATION REGIONALE PARIS B)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 280000.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 36 mois
Résumé : La phosphorylation réversible des protéines est une modification post-traductionnelle classiquement utilisée par les cellules eucaryotes pour induire des changements importants et rapides dans la fonction ou la stabilité des protéines. Chez les virus à ARN de polarité positive  qui comprennent de nombreux pathogènes humains, animaux ou végétaux  des évidences récentes suggèrent que la phosphorylation de certaines protéines virales puisse également être un processus de régulation important. L'une des protéines virales essentielle à la réplication des génomes de ces virus est l'ARN polymérase ARN-dépendante (ou RdRp), qui catalyse la synthèse des nouveaux génomes viraux. Plusieurs RdRp virales ont récemment été décrites comme étant phosphorylées et l'étude de leur phosphorylation se révèle particulièrement importante compte tenu du rôle essentiel de cette protéine dans le cycle viral, et de leur architecture, qui se révèle commune à toutes les polymérases. Nous avons récemment étudié la phosphorylation de la RdRp du virus de la mosaïque jaune du navet (TYMV), un pathogène de plante qui constitue un modèle d'étude de la réplication virale. Nous avons ainsi pu montrer que la RdRp du TYMV est phosphorylée dans les cellules végétales, qu'elle soit exprimée seule ou au cours du cycle infectieux. Grâce à une étude biochimique approfondie incluant des expériences de marquage métabolique et des analyses par spectrométrie de masse, nous avons pu caractériser deux sites de phosphorylation au sein d'une séquence PEST, tandis qu'un autre site de phosphorylation a pu être identifié au sein du domaine catalytique conservé entre toutes les polymérases. De façon intéressante, la mutation des sites de phosphorylation dans un système de génétique inverse du TYMV entraîne l'inhibition drastique du cycle viral. Ces résultats suggèrent que des mécanismes de régulation liés à son état de phosphorylation puissent contribuent à la fonction de la RdRp et au déroulement du cycle de réplication viral. Les données obtenues, qui constituent la première identification des sites de phosphorylation d'une RdRp virale, nous ont également permis de proposer un modèle et de formuler des hypothèses quant aux effets possibles de la phosphorylation sur le fonctionnement et la régulation de la RdRp virale: 1) Nous proposons que la phosphorylation de la séquence PEST  un signal conditionnel de dégradation des protéines  participe au contrôle de la stabilité métabolique de la RdRp et régule ainsi le taux d'accumulation de cette protéine virale essentielle. La phosphorylation aurait pour conséquence d'accroître le turn-over de la RdRp et d'empêcher son accumulation. Dans une telle situation, la RdRp deviendrait un composant limitant de la machinerie du complexe de réplication, ce qui pourrait conduire à l'inhibition du cycle de multiplication viral que nous avons observé.  2) Nous proposons que la phosphorylation d'un résidu conservé situé au sein du site catalytique participe au contrôle de la synthèse d'ARN au cours du cycle de multiplication viral. La conservation de ce résidu entre les différentes polymérases virales suggère que ce mécanisme puisse être une caractéristique générale chez les virus à ARN de polarité positive. L'objectif de ce projet est de répondre à certaines des questions que ces données récentes soulèvent, par exemple : la phosphorylation de la RdRp au niveau de la séquence PEST constitue t-elle une nouvelle stratégie cellulaire de défense antivirale ? Comment le virus régule-t-il ces modifications post-traductionnelles ? Quelles sont les protéines kinases impliquées ? Quel est l'effet de la phosphorylation sur la structure tridimensionnelle de la RdRp ? Ce projet repose sur l'utilisation d'une combinaison d'approches de biologie moléculaire, de biologie cellulaire et de biochimie, comme par exemple l'analyse de la phosphorylation et de la stabilité des protéines virales in vitro ou dans les cellules végétales, l'expression de protéines recombin...