Projet ANR-10-BLAN-1615 – REFOPOL : Programme spatiotemporel de réplication du génome humain
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Olivier Hyrien (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS B)
Partenaires : Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure; Centre national de la recherche scientifique; Laboratoire Joliot-Curie; Institut de Biologie et de Technologies de Saclay
Montant : 676782.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Comment les cellules humaines recopient leur génomeLes chromosomes sont fidèlement recopiés à chaque fois qu'une cellule se divise en deux cellules filles. Ce processus fondamental à tous les êtres vivants a un impact médical et sociétal considérable. Chez l'homme il démarre en des dizaines de milliers d'«origines de réplication« dont nous tentons d'identifier la position et le moment d'activation exacts.
Comprendre la logique du programme de duplication des chromosomesCe paragraphe précise les enjeux et objectifs du projet : indiquez le contexte, l’objectif général, les problèmes traités, les solutions recherchées, les perspectives et les retombées au niveau technique ou/et sociétalLa duplication ou réplication de l'ADN est un processus fondamental de tout être vivant. Les deux brins complémentaires de l'ADN se séparent localement et chacun sert de matrice pour synthétiser un nouveau brin complémentaire. On obtient alors deux molécules «filles« formées chacune d'un ancien et d'un nouveau brin, rigoureusement identiques à la molécule «mère« formée des deux brins anciens. Des déréglages de ce processus peuvent altérer le génome, favoriser l'apparition de mutations, de cancers et d'autres maladies génétiques. Par ailleurs de nombreux médicaments utilisés comme antibiotiques, antiviraux ou anticancéreux interfèrent avec ce processus.Chez les bactéries et les virus ce processus démarre en un endroit précis du chromosome, généralement circulaire, et se propage dans les deux directions jusqu'à copie complète du chromosome. Chez les organismes plus complexes comme l'homme qui possèdent de très longs chromosomes ce processus démarre en des dizaines de milliers de points. Notre objectif est d'identifier la localisation et le moment d'activation de chacun de ces points en déterminant la direction locale de copie sur l'ensemble des chromosomes. Les résultats nous permettent de comprendre le lien entre l'organisation des chromosomes dans le noyau de chaque type cellulaire, les gènes qui s'y expriment, l'ordre dans lequel les différentes parties des chromosomes sont copiées et les points de fragilité du processus.
Séquençage d'intermédiaires de réplicationNotre objectif est d'identifier la localisation et le moment d'activation de chacun de ces points de démarrage de la réplication en déterminant la direction locale de copie sur l'ensemble des chromosomes humains. Pour cela nous isolons des fragments d'ADN en cours de copie et établissons leur séquence nucléotidique afin de reconstituer le déroulement du processus. Cette tâche très difficile est devenue possible grâce aux nouvelles techniques de séquençage qui permettent de l'étudier au niveau du génome entier, donc à grande échelle, aux progrès de la bioinformatique qui permettent de manipuler d'énormes quantités de données, et à des travaux de modélisation mathématique qui permettent d'interpréter ces données et de comprendre la dynamique du processus.
Résumé de la soumission : La réplication de l'ADN humain démarre en un grand nombre de sites appelés origines de réplication selon un programme spatiotemporel modulé au cours du développement et de la différenciation. Comprendre ce programme est un enjeu majeur car très peu d'origines ont été caractérisées à ce jour. Leur spécification semble reposer sur des propriétés relativement mal définies de la chromatine et non pas sur la reconnaissance de motifs simples de la séquence d'ADN. Au cours du projet ANR HUGOREP (2006-2008), nous avons déterminé le profil temporel de réplication du génome humain entier par séquençage massif d'intermédiaires de réplication. Ceci, avec des études bioinformatiques du biais de composition nucléotidique, nous a permis de montrer qu'un tiers du génome humain est organisé en "domaines N", segments de ~1Mb dont les bords contiennent des origines de réplication très efficaces et qui présentent un profil caractéristique, en forme de N, du biais de composition nucléotidique. Ce biais résulterait d'une asymétrie des processus de mutation/réparation entre le brin continu et le brin discontinu de la fourche de réplication et reflèterait la polarité moyenne des fourches. L'analyse détaillée du gradient temporel de réplication des bords au centre des domaines N et des expériences de peignage de l'ADN montre que la réplication démarre d'abord à des origines maîtresses localisées aux bords et spécifiées par une structure chromatinienne ouverte codée par la séquence ADN, puis se poursuit par une cascade d'initiations secondaires à l'intérieur des domaines. Ces résultats constituent une avancée importante dans la compréhension du programme de réplication humain, mais ils appellent de nombreuses vérifications expérimentales concernant l’existence des origines maîtresses et des origines secondaires, sur leur efficacité, et sur l’organisation remarquable des gradients de polarité des fourches entre les origines maîtresses. Ici, nous proposons de déterminer expérimentalement la polarité des fourches de réplication tout au long du génome humain en séquençant des fragments d'Okazaki hautement purifiés, à l'aide d'une technique qui préserve l'information de spécificité du brin. Ceci nous permettra non seulement de cartographier les origines à haute résolution mais aussi de déterminer leur efficacité. Les changements brutaux de polarité révèleront les origines efficaces et les changements plus progressifs les zones d'initiation moins efficaces et donc difficiles à détecter autrement mais qui sont essentielles pour comprendre le profil de réplication de tout le génome. A notre connaissance, le séquençage de fragments d'Okazaki n'a jamais été publié ni envisagé. Cette méthode est plus directe, plus informative et plus originale que  les autres approches qui ont été précédemment utilisées à grande échelle. Nous utiliserons la modélisation physique du chapelet nucléosomal et l'analyse expérimentale de la conformation tridimensionnelle de domaines chromatiniens pour établir un lien entre la structure chromatinienne et les mécanismes fondamentaux de la réplication de l'ADN dans les domaines N ainsi que dans les autres régions du génome. Ces études devraient apporter un éclairage nouveau sur le rôle de la chromatine dans la régulation de la réplication.Le travail sera réalisé par un consortium de biologistes moléculaires (Part. 1), de physiciens (Part. 2), de bioinformaticiens (Part. 3) et de biophysiciens (Part. 4) qui ont déjà collaboré sur des projets antérieurs. Notre consortium est véritablement multidisciplinaire, fortement compétitif et très motivé, et réunit les compétences requises pour une description détaillée de la réplication du génome humain. Ces qualités et l'expérience acquise lors de travaux expérimentaux et théoriques antérieurs nous permettront de déchiffrer l'énigme de la spécification des origines de réplication et de comprendre comment des milliers d'origines sont coordonnées pour assurer la réplication fidèle du génome.
Résultats : Nous avons montré que le génome peut se subdiviser en un à deux milliers de domaines qui sont copiés selon un mode caractéristique. Les bords de ces domaines sont les premiers à être copiés. La copie progresse ensuite vers leur centre, par activation ordonnée des origines de réplication (environ une trentaine) qui jalonnent chaque domaine. Chacun de ces domaines correspond à un globule de chromatine où le filament chromosomique est pelotonné sur lui-même. Ainsi les différentes parties d'un domaine sont fréquemment en contact entre elles mais rarement avec d'autres domaines même adjacents. A l'intérieur de ces domaines isolés les uns des autres les gènes se positionnent près des bords et sont orientés de telle sorte que leur transcription se fasse dans le même sens que leur réplication. Enfin nous avons observé que la copie est plus fidèle vers les bords que vers les centres et qu'au cours de l'évolution les parties copiées en dernier changent plus vite que celles copiées en premier. Nos résultats dévoilent ainsi une structuration physico-biologique des chromosomes, conservée chez tous les mammifères et les oiseaux, en unités fonctionnelles où la réplication est coordonnée à l'expression et la structuration du filament chromosomique.
Perspectives : Le travail en cours permettra de mettre à la disposition de la communauté scientifique un ensemble de données permettant à tout chercheur de savoir dans quel sens est copiée telle ou telle partie du génome dans tel ou tel tissu ou type cellulaire, normal ou cancéreux, embryonnaire ou différencié, jeune ou vieillissant, etc... Ces données pourront être croisées avec celles dont on dispose déjà ou en cours de réalisation sur d'innombrables aspects du fonctionnement des chromosomes : régions réarrangées dans les cancers, position et expression des gènes associés à telle ou telle maladie génétique, régions conservées ou non entre l'homme et d'autres animaux. A terme nous pourrons mieux comprendre comment le processus de copie de l'ADN interagit avec tous les autres aspects de son fonctionnement et façonne le génome au cours de l'évolution.
Publications et brevets : 1. Chen CL, Duquenne L, Audit B, Guilbaud G, Rappailles A, Baker A, Huvet M, d'Aubenton-Carafa Y, Hyrien O, Arneodo A, Thermes C (2011) Replication-associated mutational asymmetry in the human genome. Mol Biol Evol 28: 2327-2337
2. Guilbaud G, Rappailles A, Baker A, Chen CL, Arneodo A, Goldar A, d'Aubenton-Carafa Y, Thermes C, Audit B, Hyrien O (2011) Evidence for Sequential and Increasing Activation of Replication Origins along Replication Timing Gradients in the Human Genome. Plos Comput Biol 7: e1002322.
3. Ma E, Hyrien O, Goldar A (2012) Do replication forks control late origin firing in Saccharomyces cerevisiae? Nucleic Acids Res 40: 2010-2019.
4. Baker A, Audit B, Chen CL, Moindrot B, Leleu A, Guilbaud G, Rappailles A, Vaillant C, Goldar A, Mongelard F, d'Aubenton-Carafa Y, Hyrien O, Thermes C, & Arneodo A (2012) Replication fork polarity gradients revealed by megabase-sized U-shaped replication timing domains in human cell lines. PLoS Comput. Biol. 8(4): e1002443.
5. Audit B, Baker A, Chen CL, Rappailles A, Guilbaud G, Julienne H, Goldar A, d'Aubenton-Carafa Y, Hyrien O, Thermes C, Arneodo A (2012) Multi-scale analysis of genome wide replication timing profiles using wavelets. Nature Protocols, en révision.
6. A. Baker, B. Audit, S. C.-H. Yang, J. Bechhoefer, A. Arneodo, Inferring where and when replication initiates from genome-wide replication timing data, Phys. Rev. Lett. 108 (2012) 268101. 
7. B. Audit, L. Zaghloul, A. Baker, A. Arneodo, C.-L. Chen, Y. d’Aubenton-Carafa & C. Thermes. Megabase replication domains along the human genome : Relation to chromatin structure and genome organisation in Epigenetics: Development and Disease, édité par T. K. Kundu (Springer, New York, 2012).
8. B. Moindrot, B. Audit, P. Klous, A. Baker, C. Thermes, W. de Laat, P. Bouvet, F. Mongelard, A. Arneodo, 3D chromatin conformation correlates with replication timing and is conserved in resting cells, Nucleic Acids Res. (2012) in press.