Projet ANR-10-JCJC-1507 – RNASPIN : Approche RMN combinée au marquage de spin paramagnétique pour l'étude structurale et dynamique de complexes ARN/protéines: Application à l'ARN 7SK complexé à ses protéines
Programme : JCJC : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (JCJC SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Isabelle LEBARS (CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE - CERBM)
Partenaires : Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire
Montant : 300000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Développement d’une méthode innovante pour l’étude de complexes ribonucléoprotéiquesLa Résonance Magnétique Nucléaire combinée au marquage de spin paramagnétique pour l’étude structurale et dynamique de complexes ARN/protéines impliqués dans des processus de régulation : Application à l’ARN 7SK, régulateur de la transcription par l’ARN polymérase II.
Progresser dans la compréhension de systèmes biologiques régulateurs complexesLes complexes ribonucléoprotéiques sont impliqués dans de multiples processus cellulaires et dans le développement de pathologies. L’élucidation des mécanismes d’interaction entre les ARNs et leurs partenaires est donc devenue un enjeu majeur en biologie moléculaire et structurale. La clef pour comprendre la fonction biologique de ces complexes est d’étudier leur structure et leur dynamique.Le projet RNASPIN vise à développer une méthode innovante pour l’étude des complexes ribonucléoprotéiques en utilisant la Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Les méthodes classiques employées en RMN permettent d’obtenir des informations de distances et d’angles entre les atomes constituant l’objet étudié. La structure tridimensionnelle est ensuite reconstruite par modélisation à partir de ces contraintes. De nouvelles techniques basées sur l’incorporation de sondes paramagnétiques à des positions spécifiques dans la séquence d’ARN sont développées dans le cadre de ce projet et permettront d’obtenir des informations à plus longue distance pour la reconstruction de la structure tridimensionnelle. L’application de cette méthode aux sous-unités du complexe ribonucléique 7SK apportera des informations supplémentaires pour élucider son rôle majeur dans la régulation de l’ARN polymérase II.D'un point de vue technique, au terme du projet proposé, des protocoles de marquage, d'études structurales et de programmes de modélisation, seront élaborés et pourront être appliqués à d'autres systèmes complexes impliqués dans des processus de régulation.
Résonance Magnétique Nucléaire combinée au Marquage Paramagnétique de spinL’incorporation de sondes paramagnétiques est réalisée par réaction chimique sur des résidus modifiés introduits dans l’objet étudié. Dans le cas de l’ARN, ces résidus modifiés sont incorporés par voie enzymatique. Après greffage de la sonde, l’effet observé par RMN est fonction de la distance noyau observé/sonde paramagnétique. Ces données servent à compléter les informations issues des techniques de RMN classiques.
Résumé de la soumission : Les ARNs jouent un rôle majeur dans l’expression des gènes. En tant qu’intermédiaires entre l’ADN et les protéines, les ARNs sont à la fois porteurs de l’information génétique et de signaux de reconnaissance. Les architectures complexes formées par les ARNs sont en effet impliquées dans de nombreux processus biologiques dans tous les organismes. De telles structures sont stabilisées par des liaisons hydrogènes, l’empilement des bases ou des interactions électrostatiques.Les structures d’ARN constituent des sites de fixation pour d’autres partenaires tels des ligands, d’autres acides nucléiques ou des protéines. Les complexes ribonucléoprotéiques sont effectivement impliqués dans de multiples processus cellulaires, ou dans le développement de pathologies. La modulation de ces phénomènes de reconnaissance ARN/protéines intervenant dans la transcription, l’épissage d’ARN messager, la traduction ou le développement de rétrovirus, pourrait conduire à la conception de nouveaux agents thérapeutiques.L’élucidation des mécanismes d’interaction entre les ARNs et leurs partenaires est donc devenue un enjeu majeur en biologie moléculaire et structurale. L’étude des phénomènes de reconnaissance ARNs/protéines est fondamental pour la compréhension de la régulation de l’expression des gènes. La clef pour comprendre la fonction biologique de ces complexes est d’étudier leur structure et leur dynamique. La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est la technique la plus puissante pour l’étude dynamique des ARNs et de ses partenaires en solution. De plus, au cours de ces dernières années, de nombreuses techniques ont été développées pour dépasser les limites de la RMN. Parallèlement, la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) a connu un essor considérable pour l’étude de la structure et de la dynamique de macromolécules et des complexes. Tout d’abord appliquée avec succès aux protéines, la RPE a été récemment utilisée pour caractériser les interactions ARNs/protéines.Dans le projet présenté, nous proposons d’initier et de développer une approche combinée RMN/RPE pour l’étude structurale et dynamique de sous-unités du complexe 7SK/HEXIM1/P-TEFb/LaRP7/MePCE impliqué dans le développement de plusieurs pathologies tels le cancer, le VIH et l’hypertrophie cardiaque. Le complexe P-TEFb ("positive transcription elongation factor"), formé par la kinase cycline-dépendante Cdk9 et la cycline T1/T2, active la transcription en phosphorylant le domaine C-terminal de l'ARN polymérase II (ARNpol II). L'ARN 7SK agit en tant que régulateur de la transcription par l'ARNpol II, en coopération avec la protéine HEXIM1, en séquestrant P-TEFb dans le complexe ribonucléoprotéique 7SK/HEXIM1/P-TEFb.Des travaux récents ont montré que P-TEFb et HEXIM1 ont d'autres partenaires: la protéine LaRP7 et l'enzyme methylphosphatase MePCE. LaRP7 module la transcription en se liant à une région conservée de 7SK (3'-UUU-OH) et en séquestrant le complexe P-TEFb. Pour l'activation de la transcription, P-TEFb est relargué et LaRP7 reste liée à l'ARN. MePCE ajoute un monomethyl phosphate à l'extrémité 5' de 7SK. LaRP7 et MePCE agissent de façon coopérative pour assurer la stabilité de 7SK et promouvoir l'assemblage du complexe ribonucléoprotéique. A l'heure actuelle, aucune donnée dynamique et structurale au niveau atomique n'est disponible concernant la structure de l'ARN 7SK en interaction avec ses partenaires.Notre projet est de caractériser au niveau atomique les interactions entre la tige-boucle HP1 de 7SK et HEXIM1 d'une part, et la tige-boucle HP4 de 7SK et LaRP7 d'autre part, en utilisant la RMN et la RPE. Les données structurales obtenues permettront de mieux comprendre le mécanisme de reconnaissance entre l'ARN 7SK et ces protéines. Cette étude apportera ainsi des informations supplémentaires pour élucider le rôle majeur de 7SK dans la régulation de la transcription par l'ARNpol II.
Résultats : Nous avons mis au point l’incorporation de sondes paramagnétiques en position spécifique dans l’ARN. Nous pourrons ainsi appliquer cette méthode à la reconstruction de la structure de la tige-boucle HP1 de l’ARN 7SK libre et en interaction avec ses partenaires.
Perspectives : Les protocoles issus du développement de ce projet pourront permettre d’aborder des systèmes biologiques plus complexes non étudiables par les techniques de Résonance Magnétique Nucléaire classiques.
Publications et brevets : Les résultats n’ont pas encore été soumis à publication.