Projet ANR-11-BSV5-0012 – NOBLEACH : Contrôle du photoblanchiment des protéines fluorescentes pour la microscopie super-résolution.
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Dominique BOURGEOIS (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES)
Partenaires : Laboratoire de Chimie Physique; Institut de Biologie Structurale; Laboratoire de Physiologie Cellulaire Végétale
Montant : 503119.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Pourquoi les protéines fluorescentes sont-elles si sensibles à la lumière ?Cette recherche servira le développement de la microscopie de fluorescence en biologie par la mise au point de marqueurs fluorescents plus performants.
Etude des mécanismes de photoblanchiment des protéines fluorescentes pour l'ingénierie rationnelle de variants photo résistants.La microscopie de fluorescence joue un rôle croissant en sciences du vivant. Récemment, la microscopie super-résolution (nanoscopie) a été développée, permettant d'obtenir des images d'échantillons vivants à une résolution spatiale d'environ 20 nm, ouvrant la porte à un nouveau champ de recherche considérable. Il ne fait pas de doute que la nanoscopie apporte un progrès en recherche médicale et contribuera à terme à une amélioration de la santé publique. Des marqueurs fluorescents spéciaux, appelés « protéines fluorescentes photo-transformables » (PTFPs) sont utilisés en nanoscopie. Elles sont homologues de la « protéine fluorescente verte » (GFP) bien connue. Comme la GFP, ces protéines montrent une forte susceptibilité au photoblanchiment, c'est-à-dire une perte rapide de fluorescence sous illumination. Dans ce projet, nous proposons d'étudier les mécanismes de photoblanchiment des PTFPs, de comprendre le rôle des facteurs environnementaux, et de mettre au point des variants photo résistants.
Du monocristal à la molécule unique.Nous utilisons un vaste panel de techniques, allant de l'étude du monocristal à celle de la molécule unique. Les processus de transfert de charges (électron et proton), au coeur des mécanismes de photoblanchiment, seront étudiés en détail. En plus d'études à l'échelle moléculaire par une combinaison de cristallographie, de spectroscopie optique et de modélisation, nous mettrons l'accent sur des approches molécules uniques in vitro et in cellulo. Des cellules tests eucaryotes et procaryotes nous permettront de valider les performances des protéines fluorescentes d'intérêt pour la microscopie super résolution. Dans un mécanisme de feed-back, nous viserons à proposer de manière rationnelle des variants possédant de meilleures propriétés de photo transformations et de photoblanchiment.
Résumé de la soumission : Les techniques de microscopie de fluorescence jouent un rôle croissant en sciences du vivant. Ces dernières années, le développement le plus spectaculaire a concerné la microscopie super-résolution (nanoscopie), qui permet d'obtenir des images à une résolution d'environ 20 nm. Rendant possible l'observation de la cellule vivante à l'échelle de macromolécules individuelles, la nanoscopie ouvre un vaste champ de recherche, intégrant biologie structurale et biologie cellulaire. Il est pressenti que la technique, bien qu'encore immature, aura un impact majeur en médecine et santé humaine.Les méthodes de nanoscopie par localisation de molécules uniques (PALM/STORM) sont les plus polyvalentes et les plus prometteuses. Elles sont presque entièrement fondées sur la manipulation des propriétés photophysiques des marqueurs fluorescents, typiquement des sondes photoactivables pouvant être activées sélectivement d'un état éteint à un état allumé au moyen d'une illumination laser adéquate. Les protéines fluorescentes (FPs) photoactivables de la famille GFP sont ainsi des acteurs fondamentaux en microscopie PALM.Ces dernières années nous avons acquis une expertise reconnue dans le domaine de la photophysique des protéines fluorescentes. Nous avons développé et caractérisé de nouvelles FPs photoactivables en utilisant une combinaison de cristallographie cinétique, spectroscopie in cristallo, et modélisation, dans le contexte de notre précédent projet ANR "DSPF".Un problème majeur des FPs concerne leur grande susceptibilité au photoblanchiment, ie, leur perte rapide et non réversible de fluorescence suite à leur illumination. Le problème du photoblanchiment affecte pratiquement toutes les techniques de microscopie de fluorescence et limite sérieusement la résolution atteignable en nanoscopie PALM. Pourtant, les mécanismes qui gouvernent le photoblanchiment chez les FPs restent largement méconnus. Nous proposons ici d'étendre notre recherche sur les protéines fluorescentes à la question du photoblanchiment, afin de caractériser les mécanismes impliqués, de comprendre le rôle de facteurs environnementaux (potentiel redox, pH, oxygène), et de mettre au point des variants photorésistants. Photoblanchiment et photoactivation étant intimement liés, nos études combineront l'analyse des deux phénomènes.Nous utiliserons une vaste palette de techniques allant du monocristal jusqu'à la molécule unique. Les réactions impliquant des transferts de charge (électron, proton), au cœur des mécanismes de photoblanchiment, seront étudiées en détail. En plus d'études à l'échelle moléculaire effectuées par cristallographie, spectroscopie optique et modélisation, nous donneront une grande importance aux investigations sur molécules uniques in vitro et in cellulo. Des cellules "tests" nous permettront de valider les performances de nos protéines fluorescentes pour l'imagerie PALM. Nous tenterons de proposer des variants mis au point de façon rationnelle, possédant des propriétés de photoactivation et de photoblanchiment améliorées. En plus de servir le développement de la microscopie super-résolution et d'améliorer notre connaissance de la photophysique des protéines fluorescentes, cette recherche fondamentale pourrait trouver des applications en biotechnologie et mener au développement de nouveaux senseurs.Ce projet sera conduit dans le cadre d'une nouvelle équipe de recherche appelée "Pixel". Cette équipe lie d'une manière unique deux instituts grenoblois, l'IBS et l'iRTSV, avec le but de développer la microscopie de fluorescence super-résolution à la frontière entre la biologie structurale et la biologie cellulaire. Ce projet accompagne un élargissement majeur des activités du coordinateur vers l'imagerie et la biologie structurale intégrée. La position stratégique de l'équipe Pixel sera idéale pour que les résultats de notre recherche bénéficient directement à la communauté de biologie cellulaire.
Résultats : Après 18 mois de travail, notre principal résultat est une vue structurale détaillée du processus de photoblanchiment chez la protéine photo-transformable IrisFP. Nos travaux ont permis de montrer que ce processus dépend considérablement de l'intensité de la lumière utilisée pour exciter la fluorescence : à haute intensité, un processus de transfert d'électrons photo-induit déstabilise complètement le chromophore de la protéine. A basse intensité un processus lié à la formation d'oxygène singulet résulte en la sulfoxidation de résidus situés à proximité du chromophore. Le premier processus, qui ne génère pas d'espèces réactives de l'oxygène, serait moins cytotoxique pour la cellule vivante. Les microscopistes auraient donc intérêt à utiliser des puissances laser assez fortes (pendant un temps plus court) lorsqu'ils travaillent avec des protéines de type IrisFP.
Perspectives : Ces résultats suggèrent des idées pour tenter de mettre au point de façon rationnelle des mutants photorésistants d’IrisFP. D'autres protéines fluorescentes sont à l'étude, et leur comportements photophysiques sont étudiés d'un point de vue mécanistique ainsi que dans le contexte cellulaire à l'échelle de la molécule unique. Ce projet fondamental de biophysique est lié à d'autres projets d'intérêt biologique, notamment l'étude de la division cellulaire bactérienne.
Publications et brevets : Dominique Bourgeois, Aline Regis-Faro & Virgile Adam. “Photoactivated structural dynamics of fluorescent proteins” Biochem. Soc. Trans., (2012), 40, 531-538
Dominique Bourgeois & Virgile Adam. “Reversible photoswitching in fluorescent proteins: A mechanistic view” IUBMB Life, (2012), 10.1002/iub.1023