Projet ANR-12-BSV5-0018 – DynamIC : Dynamique et interactions de complexes intranucléaires par microscopie.
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Laurent HELIOT (Institut de Recherche Interdisciplinaire USR3078)
Partenaires : Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure; Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure; Institut de Recherche Interdisciplinaire
Montant : 570000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Dynamique et interactions de complexes intranucléaires par microscopieLe facteur positif d’élongation de la transcription (P-TEFb) est un modèle pertinent pour étudier la façon dont des évènements moléculaires indépendants se coordonnent et sont régulés au cours de la transcription. En combinant la création de mutants spécifiques, l’utilisation de techniques de biophotonique complémentaires et la simulation numérique nous étudierons les interactions de ce facteur avec ses différents partenaires..
Dynamique et interactions de complexes intranucléairesAvec des techniques de biochimie, le laboratoire d’Olivier Bensaude (et d’autres) a montré l’existence de deux populations de complexes P-TEFb qui se distinguent par la taille, la composition en sous-unités et l’activité. Un « petit » complexe, actif est inactivé lorsqu’il s’associe avec la protéine HEXIM et la petite particule ribonucléique 7SK pour former un « grand » complexe. En réponse à des stimulations physiologiques ou lorsque la transcription est bloquée, le plus grand complexe P-TEFb se dissocie pour former le « petit » complexe actif. Dans ce projet, nous allons étudier l’existence et la dynamique de ces complexes au cours de l’activation de la transcription dans des cellules vivantes.  répondre aux questions suivantes 1) Comment les interactions avec la RNA Polymérase et les composants du « grand complexe » P-TEFb/HEXIM/7SK/snRNP interfèrent avec la mobilité de P-TEFb ? 2) Quelle est la durée de vie de ce « grand complexe » ? 3) Est-ce que les petits et grands complexes P-TEFb ont le même accès à l’espace nucléaire ? 4) Est-ce que la fixation de HEXIM1/7SK affecte le recrutement et la libération de P-TEFb aux sites actifs de transcription ? Le manque de définition des espèces macromoléculaires observées a été une des limitations majeures de nos expériences préliminaires. Pour surmonter ce problème, nous allons utiliser la génétique. Des mutants perte et gain de fonction de P-TEFb pour l’assemblage avec HEXIM1/7SK seront construits et leur comportement sera étudié par une combinaison de techniques de photo blanchiment, de spectroscopies de corrélation et de suivi de protéine unique. De plus, un microscope bimodal qui associe le FCCS et le FLIM (FLCS) sera développé pour définir les paramètres de diffusion des complexes identifiés. Enfin l’interprétation des données obtenues dans différentes échelles de temps et d’espace fera appel à des techniques de simulation numérique.
Ensemble d’outils de mesure des dynamiques et interactions moléculairesLes techniques de photo blanchiment nécessitent des concentrations élevées de protéines marquées, l’interprétation du signal FRET est limitée par les temps d’acquisition (entre la seconde et quelques minutes) et la gamme de temps couverte par le FCCS se situe entre la microseconde et la seconde. Le suivi de protéine unique (SPT) ne convient pas facilement à des études à haut débit. L’utilisation d’une seule des techniques mentionnées ci-dessus rend difficile l’interprétation des résultats. Une approche intégrée est donc nécessaire, les données obtenues par une méthode permettant de contraindre les modèles utilisés pour interpréter les autres expériences
Résumé de la soumission : L’expression des gènes est un processus dynamique qui implique une cascade d’évènements qui ont lieu à différentes échelles, entre le nanomètre et le micromètre (des macromolécules aux chromosomes), et entre la microseconde et l’heure (de la diffusion de petites molécules à la transcription de gènes longs de plusieurs mégabases). En utilisant des étiquettes fluorescentes, il est aujourd’hui possible : a) de vérifier l’existence de complexes macromoléculaires dans des cellules vivantes avec les techniques de transfert résonnant de fluorescence (FRET), b) d’étudier leur mobilité avec des techniques de photo blanchiment telles que le FRAP et le FLIP, les spectroscopies de corrélation (FCS, FLCS, FCCS, ICS) et le suivi de protéine unique (SPT). Ces méthodes couvrent différentes échelles de temps et ont chacune leurs propres limitations. Les techniques de photo blanchiment nécessitent des concentrations élevées de protéines marquées, l’interprétation du signal FRET est limitée par les temps d’acquisition (entre la seconde et quelques minutes) et la gamme de temps couverte par le FCCS se situe entre la microseconde et la seconde. Le suivi de protéine unique (SPT) ne convient pas facilement à des études à haut débit. L’utilisation d’une seule des techniques mentionnées ci-dessus rend difficile l’interprétation des résultats. Une approche intégrée est donc nécessaire, les données obtenues par une méthode permettant de contraindre les modèles utilisés pour interpréter les autres expériences.Le facteur positif d’élongation de la transcription (P-TEFb) est un modèle intéressant pour étudier la façon dont des évènements moléculaires indépendants se coordonnent et sont régulés au cours de la transcription. Ce facteur est essentiel pour la synthèse et la maturation de la plupart des gènes transcrits par la RNA polymérase II. Avec des techniques de biochimie, le laboratoire d’Olivier Bensaude, et d’autres, ont montré l’existence de deux populations de complexes P-TEFb qui se distinguent par la taille, la composition en sous-unités et l’activité. Un « petit » complexe (rayon de Stokes 4,5 nm), actif est inactivé lorsqu’il s’associe avec la protéine HEXIM et la petite particule ribonucléique 7SK pour former un « grand » complexe (rayon de Stokes 11,6 nm). En réponse à des stimulations physiologiques oulorsque la transcription est bloquée, le plus grand complexe P-TEFb se dissocie pour former le « petit » complexe actif. Des résultats préliminaires obtenus par le consortium qui présente ce projet suggèrent, de façon inattendue, que le plus grand complexe peut présenter une mobilité plus grande que le petit complexe. Cette interprétation ouvre de nouvelles perspectives sur la fonction de l’association entre P-TEFb, HEXIM1 et 7S snRNP. Le complexe P-TEFb inactif pourraiten effet rejoindre sa cible plus vite que le complexe actif grâce à un effet chaperon/ transporteur d’HEXIM/7SK.Dans ce projet, nous allons étudier les différentes mobilités des complexes P-TERFb et répondre aux questions suivantes 1) Quelles interactions interfèrent avec la mobilité de P-TEFb ? 2) Quelle est la durée de vie du complexe P-TEFb/HEXIM1/7SK ? 3) Est-ce que les petits et grands complexes P-TEFb ont le même accès à l’espace nucléaire ? 4) Est-ce que la fixation de HEXIM1/7SK affecte le recrutement et la libération de P-TEFb aux sites actifs de transcription ? Le manque de définition des espèces macromoléculaires observées a été une des limitations majeures de nos expériences préliminaires. Pour surmonter ce problème, nous allons utiliser la génétique. Des mutants perte et gain de fonction de P-TEFb pour l’assemblage avec HEXIM1/7SK seront construits et leur comportement sera étudié par une combinaison de techniques de photo blanchiment, de spectroscopies de corrélation et de suivi de protéine unique. De plus, un microscope bimodal qui associe le FCCS et le FLIM (FLCS) sera développé pour définir les paramètres de diffusion des complexes identifiés.
Résultats : Faits marquants :   Une trentaine de mutations ponctuelles de la Cycline T1 abolissant ses interactions avec la protéine HEXIM1 ont été identifiées dans un test en double-hybride chez la levure. Parmis celle-ci le partenainre 2 a identifié une seule mutation ayant totalement perdu l’interaction avec HEXIM1 tout en maintenant celle avec CDK9. Nous avons vérifié par un test kinase que l’activité spécifique de CDK9 associée à cette protéine mutée est normale.
Perspectives : Compréhension de la régulation des mécanismes moléculaires sous-jacents à des formes de cancer ; P-TEFb est aussi un cofacteur principal pour l’activation du virus du SIDA. Le développement des outils de microscopie multimodale a un intérêt général pour l’étude de la dynamique des complexes moléculaires dans des cellules vivantes.
Publications et brevets : A ce stade du projet il n’y pas encore de résultat relevant de cette catégorie