Projet ANR-11-BS07-0007 – PepSiFUR : Relations structure-fonction de régulateurs du métabolisme du fer (FUR) et de leurs inhibiteurs; vers de nouveaux composés antibactériens de type peptido-sidérophores
Programme : Blanc - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Isabelle MICHAUD-SORET (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Institut de Biologie Structurale; Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux
Montant : 436000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Nouveaux composés anti-bactériens de type peptido-sidérophoresL’augmentation du nombre d’infections bactériennes résistantes aux antibiotiques actuels est un phénomène extrêmement inquiétant, particulièrement en milieu hospitalier (infections nosocomiales). Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies et des antibiotiques innovants pour lutter contre ces microorganismes particulièrement virulents. 
Des aptamères peptidiques aux peptides inhibiteurs: nouvelles molécules à action anti-virulence ciblant la régulation de l'homéostasie du ferLe métabolisme du fer et la virulence des pathogènes sont liés. Un élément clé de ce métabolisme chez les bactéries est la protéine Fur (Ferric uptake regulator) qui contrôle au niveau transcriptionnel l'expression des gènes impliqués dans l'homéostasie du fer. Toute perturbation de l'activité de Fur affecte la prolifération et la virulence des souches pathogènes. Le projet vise à valoriser la découverte de 4 aptamères peptidiques capables d'interagir avec Fur d'E. coli et de provoquer une perte de virulence démontrée in vivo. Les peptides dérivés ont été testés et optimisés contre les Fur de pathogènes comme Francisella tularensis, Yersinia pestis ou Pseudomonas aeruginosa. Cela a permis i) de définir une nouvelle famille structurale de Fur tétramérique, ii) de préciser les zones d'interactions entre les peptides et les chaines protéiques en couplant démarches théorique et expérimentale, iii) de synthétiser des vecteurs catécholés biomimétiques de sidérophores pour véhiculer ces peptides vers leur cible in vivo dans une stratégie de type Cheval de Troie et de tester le premier peptido-sidérophore anti-Fur, et iv) d'utiliser ces interactions pour cribler des chimiothèques à la recherche d'interactants synthétiques.
Purification et caractérisation de nouvelles protéines Fur, peptidisation, criblage de chimiothèques synthèses de vecteurs catécholés et de peptidesEn plus de la protéine d'E. coli, la purification et la caractérisation des Fur de Francisella tularensis (agent de la tularémie), de Yersinia pestis (agent de la peste) et de Pseudomonas aeruginosa (agent responsable des complications chez les malades atteints de mucoviscidose) ont été réalisées. Des méthodes in silico (modélisation, amarrage moléculaire), in vitro (activités, interactions, mutagenèse, approches structurales) et in vivo (double-hybride) ont été appliquées pour définir et caractériser leurs interactions avec des peptides linéaires anti-Fur de 6 à 13 acides aminés. Les peptides les plus prometteurs sont couplés à la dernière génération de vecteurs catécholés synthétiques biomimétiques de sidérophores développés pour promouvoir l'incorporation du fer chez E. coli ou P. aeruginosa dans une stratégie dite du Cheval de Troie. Le criblage de la chimiothèque Prestwick pour l'inhibition de l'interaction avec des aptamères peptidiques a permis la sélection d'un composé X inhibant l'oligomérisation de Fur de P. aeruginosa. La meilleure connaissance des interactions peptides-protéines a permis d'identifier des molécules potentiellement inhibitrices par criblage virtuel de la banque ZINC.
Résumé de la soumission : L’utilisation excessive d’antibiotiques a conduit au développement de pathogènes résistants qui menacent gravement la santé publique. Il faut donc trouver de nouveaux composés antibactériens et de nouvelles cibles. La protéine FUR (Ferric Uptake Regulator) est un régulateur global bactérien sans homologue chez les eucaryotes. FUR utilise le fer comme cofacteur. La métallation confère à la protéine FUR la capacité de se fixer à des séquences spécifiques de l'ADN et ainsi de réguler la transcription de gènes impliqués dans le métabolisme du fer et dans la virulence du pathogène. Le lien bien établi entre la disponibilité du fer et la virulence des pathogènes ainsi que la virulence réduite des mutants fur font de FUR une cible antibactérienne de choix. Le but de ce projet est de développer des inhibiteurs de FUR à partir de molécules déjà identifiées grâce à la technologie des aptamères peptidiques. Nous attendons de cette étude des relations structure-fonction entre FUR et ces inhibiteurs, la conception de nouvelles molécules antibactériennes et une meilleure connaissance des mécanismes d’action de FUR.Ce projet implique trois groupes d’expertises complémentaires qui ont en commun la volonté de découvrir des inhibiteurs spécifiques de FUR pour concevoir de nouvelles drogues antibactériennes. Ce sont des biochimistes bioinorganiciens et des chimistes théoriciens du Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux à Grenoble, experts en métallorégulateurs tels que FUR ainsi qu'en modélisation et dynamique moléculaire (Partenaire 1 et coordinateur), des chimistes organiciens du groupe "Transport membranaire bactérien" du laboratoire "Biotechnologie et Signalisation Cellulaire" à Strasbourg (Partenaire 2) et des biochimistes et biologistes structuraux du "Groupe Métalloprotéines" à "l'Institut de Biologie Structurale" de Grenoble (Partenaire 3).Le partenaire 1 développe depuis plusieurs années l’idée d'utiliser FUR comme cible antibactérienne. Ce groupe possède déjà 4 inhibiteurs antiFUR découverts grâce à la technologie des aptamères peptidiques. Ces 4 aptamères peptidiques inhibent FUR d'E. coli in vivo et in vitro. De plus, une étude sur la mouche a montré que ces inhibiteurs avaient une influence significative sur la virulence d'une souche pathogène d'E. coli. Des études structurales et fonctionnelles des interactions de ces 4 aptamères peptidiques avec FUR sont en cours. Des peptides de 13 acides aminés dérivés des aptamères ont déjà été obtenus ; ils inhibent FUR et sont donc très prometteurs.Les objectifs de ce projet sont:1) l'obtention d'informations structurales permettant d’envisager la conception rationalisée de médicaments. Ceci devrait découler de déterminations de structures cristallographiques, d’études biochimiques et de modélisation;2) la synthèse de nouveaux inhibiteurs dérivés des meilleurs composés, l'amélioration de leur pouvoir inhibiteur et de leur capacité à être incorporés par les bactéries. Des peptido-sidérophores délivrables dans le cytoplasme et des peptides cycliques seront synthétisés et testés sur l'activité de FUR in vitro et in vivo;3) la compréhension de la spécificité de ces inhibiteurs et la démonstration de leur efficacité comme nouveaux inhibiteurs antiFUR.De nombreux groupes dans le monde s’intéressent à l'acquisition du fer par les bactéries pour enrichir notre connaissance fondamentale de ces phénomènes et développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant, le partenaire 1 est le seul, à notre connaissance, à avoir ciblé FUR et à avoir découvert des inhibiteurs antiFUR ayant un effet sur la virulence d’une souche pathogène. L'association de chercheurs spécialistes de biochimie, de biologie structurale, de synthèse chimique et de dynamique moléculaire autour de cette question devrait conduire à des avancées significatives dans le domaine et avoir sa place dans la compétition internationale.Il n’y a pas eu d’autre demande de support financier auprès de l'ANR avec ces partenaires.
Résultats : Ce projet a été développé sur des bases de recherche fondamentale, prémices au développement des molécules clé identifiées. Il est valorisé par des articles scientifiques déjà publiés, actuellement soumis, ou en cours de rédaction. Les principaux résultats ont été présentés en congrès. Nous pouvons citer le développement de peptides inhibiteurs optimisés et l'analyse de leurs interactions avec différentes Fur, la synthèse de molécules destinées à la vectorisation intracellulaire de ces peptides, la découverte inattendue d'une nouvelle famille de Fur tétramériques et leur caractérisation.
Perspectives : -
Publications et brevets : Publiés:
Baco E. et al. (2014) Org. Biomol. Chem., 12, 749-757. Synthèse de molécules destinées à la vectorisation intracellulaire de peptides inhibiteurs.
Cissé C. et al. (2014) ACS Chem Biol., 9, 2779-2786. Interactions peptide-Fur et mécanisme d'inhibition.
Soumis:
Pérard et al. (2015) Biochemistry en révision, Caractérisation d'une nouvelle famille de Fur tétramériques.
Mathieu et al. (2015) ACS Chem. Biol. soumis, Peptides anti-Fur optimisés, approche théorique et expérimentale.