Projet ANR-13-RPIB-0011 – MINITEN : Le GD-Xa comme nouveau traitement anti-hémorragique
Programme : Recherches Partenariales et Innovation Biomédicale (RPIB)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur PLANTIER Jean-Luc (LFB-BIOTECHNOLOGIES)
Partenaires : Laboratoire public; LFB-Biotechnologies; Techniques de l'Ingénierie Médicale et de la Complexité - Informatique, Mathématiques et Applications de Grenoble
Montant : 805959.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 36 mois
Résumé : Le GPAD-FXa comme nouveau traitement anti-hémorragiqueL’hémophilie est due à une déficience des facteurs VIII et IX soignée par des injections de facteur de substitution. Le développement d’une réponse immune intervient chez 30% des hémophiles A sévères et chez 3% des hémophiles B.  Ces limitations aux traitements des hémophiles avec inhibiteurs forment une opportunité pour le développement de stratégies alternatives.Certains anticoagulants directs (DOA) ciblent le facteur Xa sans que les cliniciens n’aient d’antidotes à leur disposition. 
Une solution innovante pour deux pathologies au besoin médical non satisfaitNotre but est de fournir une solution thérapeutique unique et innovante pour ces deux indications orphelines que sont l’hémophilie avec inhibiteurs et le surdosage en DAO. Ce projet appelé MiniTen se base sur l’utilisation d’un facteur X activé tronqué du domaine gamma-carboxyglutamique (GD-FXa) qui va servir de leurre pour le Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) ou les DAO circulant. Le TFPI est une cible intéressante pour lever l’inhibition naturelle de la coagulation dont il est responsable. Une série d’expériences in vitro et in vivo suggèrent l’intérêt de lever cette inhibition pour restaurer la coagulation chez les hémophiles. Par ailleurs, le GD-FXa présente l’avantage d’être dénué d’activité procoagulante.
Production, purification et caractérisation moléculaire d'une molécule recombinante de FX tronquée, agent anti-hémophilique et antidote des NOAUn FX tronqué du domaine gla a été généré et a montré sa capacité à restaurer l'hémostase dans des plasmas d'hémophile avec inhibiteurs.Le but du projet MiniTen a été d'améliorer la production de la version recombinante, établir un procédé de purification et caractériser en détail les capacités d'agent anti-hémophilique et d'antidote de anticoagulants direct (DOA). L'interaction de la molécule avec le TFPI sera aussi étudiée.Plusieurs modifications ont été réalisées pour améliorer la biosynthèse de la molécule, son expression et sa conservation. Un procédé de purification utilisant deux colonnes d'affinité a été mis au point. Une étude de modélisation moléculaire poussée a été réalisée afin de tenter d'améliorer l'interaction de la molécule avec le TFPI et avec les DOA. Des acides aminés d'intérêt ont été identifiés et substitués.Afin d'augmenter la demi-vie de la molécule in vivo des molécules chimériques ont été réalisées en les fusionnant avec des domaines Fc des immunogobulines. L'immunogénicité de ces différents produits sera envisagée in silico et in vitro. Le TFPI, requis pour évaluer son interaction avec MiniTen, a été produit et purifié. Il est maintenant prêt à être utilisé.
Résumé de la soumission : L’hémophilie est une maladie hémorragique due à une déficience des facteurs VIII (hémophilie A) et IX (hémophilie B). La thérapie utilisée pour soigner cette pathologie consiste en des injections répétées de facteurs de substitution. Le développement d’une réponse immune dirigée contre ces facteurs intervient chez 30% des hémophiles A sévères et chez 3% des hémophiles B. Ce phénomène est aussi la cause du développement de l’hémophilie acquise. Cette complication très sérieuse compromet l’utilisation des facteurs de substitution. Le traitement de choix  pour éradiquer ces inhibiteurs consiste en un protocole d’induction de tolérance immune. Ce traitement n’est pas efficace chez tous les patients et certains ne peuvent être tolériser. Il convient alors de les traiter soit avec des concentrés de plusieurs facteurs soit avec du facteur VII activé. Ces deux agents ne permettent toutefois pas de rétablir l’hémostase chez tous les patients, et une frange de malade encoure un risque fatal lors d’accidents hémorragiques. Ces limitations aux traitements des hémophiles avec inhibiteurs forment une opportunité pour le développement de stratégies alternatives. Le marché des anticoagulants a récemment évolué avec l’arrivée des anticoagulants oraux spécifiques (AOS). Ces molécules possèdent une haute affinité et une spécificité restreinte en ciblant soit le facteur Xa (Rivaroxaban) soit la thrombine (Argatroban ; Dabigatran). Il émerge cependant un consensus pour préférer l’inhibition du facteur X qui inhibe aussi l’amplification de la coagulation. Ces molécules sont cependant utilisées sans que les cliniciens n’aient d’antidotes à leur disposition et, des cas d’hémorragies fatales ont été décrites suite à leur utilisation.Notre but est de fournir une solution thérapeutique unique et innovante pour ces deux indications orphelines que sont l’hémophilie avec inhibiteurs et le surdosage en AOS. Ce projet appelé MiniTen se base sur l’utilisation d’un facteur X activé tronqué du domaine gamma-carboxyglutamique (GD-FXa) qui va servir de leurre pour le Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) ou les AOS. Le TFPI est une cible intéressante pour lever l’inhibition naturelle de la coagulation dont il est responsable. Une série d’expériences in vitro et in vivo suggèrent l’intérêt de lever cette inhibition pour restaurer la coagulation chez les hémophiles. Par ailleurs, le GD-FXa présente l’avantage d’être dénué d’activité procoagulante.Cette demande de financement a pour but de renforcer la collaboration entre le laboratoire TheREx (UMR5525, Grenoble) et LFB Biotechnologies, entreprise ayant une grande expérience des médicaments procoagulants. TheREx a développé, breveté et publié l’intérêt d’utiliser le GD-FXa pour traiter l’hémophilie. Par ailleurs, le laboratoire a identifié des mutations qui pourraient permettre d’augmenter l'efficacité de la molécule en augmentant son affinité au TFPI . Les constructions ont été réalisées et LFB Biotechnologies a montré que les molécules produites étaient plus efficace que le contrôle à restaurer l’hémostase dans des plasmas déficients en facteurs VIII et IX. Parmi les formes mutées, une molécule modifiée (GPAD-FXa) a montré les caractéristiques les plus intéressantes en étant active à des doses inférieures à 5% du contrôle et a été choisie comme « lead ».Le projet de recherche est maintenant mûr pour améliorer cette molécule candidate et son expression et valider son potentiel in vitro et dans des modèles animaux. Les partenaires du projet MiniTen souhaitent obtenir tous les attendus requis pour, au terme du projet, pouvoir passer la molécule en développement. Par ailleurs, l’étude de cette molécule devra permettre d’accroitre notre connaissance intime du mécanisme de la coagulation en nous intéressant à la nanostructure de la formation du caillot.
Résultats : Une molécule Lead (GPAD2opt-FXa ou GFXa) est produite en HEK FreeStyle sans sérum après une transfection stable. Elle possède une séquence optimisée pour une expression en cellule humaine, un peptide signal synthétique MB7 et un site de clivage à la furine additionnel entre les chaines lourde et légère. La molécule est produite a des quantités qui permettent d'envisager des essais vivo. Un procédé de purification avec une colonne d'héparine et une colonne de benzamidine permet de produire une molécule suffisament pure pour envisager son étude biochimique. Le produit résultant est sensible aux dégradations et l'utilisation d'antiprotéases est obligatoire. Après purification la molécule possède 60% d'activité chromogénique. La molécule est capable de restaurer la coagulation de manière dose-dépendante dans des plasmas déficients en FVIII ou FIX mais pas en facteur X. GFXA est aussi fonctionnelle en présence d'anticorps inhibiteurs du FVIII.
GFXA a aussi été essayé in vitro dans des plasmas surchargés en rivaroxaban ou fondaparinux. Elle antidote ces deux plasmas. Ces données démontrent que le GDFA possède in vitro le potentiel pour corriger les deux situations hémorragiques.
Une série de DOA a été modélisé dans le site actif du FXa. Les scores de docking ont été très bons et identiques pour toutes les molécules: il n'est par conséquent pas possible de pouvoir envisager d'augmenter l'affinité du FXa pour ses inhibiteurs. Afin d'essayer d'améliorer ces résultats des essais de dynamiques moléculaires ont été réalisés en comparant la liaison du rivaroxaban sur la molécule de type sauvage ou la molécule ayant la sérine du site actif mutée. Des possibilités de mutations ont été identifiées et ont été insérées dans la molécules GFXA.
Perspectives : La molécule hit GFXA doit maintenant être étudiée in vivo dans les deux indications ciblées. Des colonies de souris hémophiles A et B sont disponibles au LFB et seront utilisées dans l'application anti-hémophilie grace à un modèle d'évaluation des pertes sanguines, couramment utilisé.
Pour l'application Antidote des DOA, des essais préliminaires d'induction de saignement chez la souris wild-type sous rivaroxaban ont été réalisé mais doivent être répétés pour s'assurer de leur robustesse. Différentes mutations ponctuelles ont été réalisées pour améliorer l'efficacité de la molécule: augmentation de l'affinité au TFPI, au DOA, augmentation de la robustesse de la molécule. Les molécules mutées doivent être produites en quantité et caractérisées.
L'interaction entre GFXA et le TFPI recombinant est à évaluer. Elle servira de base pour l'étude des molécule mutées.
Les molécules long-lasting on été crées et doivent elles aussi être produites et analysées.
Publications et brevets : 1-9th International PPB Meeting-Laguna di Chia-Italy.  May 11-15th. Oral Communication. J-L Plantier et al. “MINITEN, a recombinant truncated activated factor X with dual function”
2-XXVth ISTH Congress, Toronto, Canada. Poster. June 20-25th. J-L Plantier et al. ”GENERATION OF A RECOMBINANT TRUNCATED ACTIVATED FACTOR X AS ANTI-HEMOPHILIC AGENT”
3- XXVth ISTH Congress, Toronto, Canada. Poster. June 20-25th. M Castellan et al. ”Production of highly active recombinant human tissue factor pathway inhibitor”
4-Patent: Facteur X dépourvu de domaine gla. N°FR2014/051542. PCT déposé le 20 juin 2014.