Projet ANR-10-GENM-0011 – GENAMIBE : Comprendre la pathogenicité de Entamoeba par l'utilisation de la transcriptomique et la phylogénétique comparatives
Programme : Génomique, Biotechnologies végétales (GENOM-BTV)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame NANCY GUILLEN (INSTITUT PASTEUR)
Partenaires : Institut Pasteur; Institut Pasteur
Montant : 641744.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Comprendre les maladies infectieuses par une recherché centrée en phylogénomique et transcriptomiqueEntamoeba histolytica est l’agent responsable de l’amibiase (provoquant des dysenteries et des abcès du foie) chez les humains. Deux espèces qui lui sont étroitement liées, E. dispar et E. moshkovskii, sont non-pathogènes et produisent des infections asymptomatiques. Quelle est la raison de résultats cliniques si divergents? Nous abordons cette question dans le cadre de perspectives transcriptomiques (ex. ARN) et génomiques (ex. ADN).
Vers la compréhension des différences génomiques et transcriptomiques entre les espèces de EntamoebaNous allons comparer les génomes de différentes espèces d’Entamoeba et cataloguer ainsi les gènes   qui pourraient expliquer l'adaptation et le mode de vie de ces espèces (ex. commensal ou parasitaire). Ensuite, nous allons caractériser les différences au niveau de leurs transcriptomes afin d'identifier les gènes spécifiquement exprimés et les ARNs régulateurs. Enfin, nous allons faire émerger les données communes entre l'ADN et l'ARN, qui seront confrontées avec nos annotations de génomes, afin de découvrir les ensembles de gènes qui pourraient  expliquer les différences cliniques entre les espèces et souches d'Entamoeba.
La génomique comparative et séquençage à haut débit de l'ARNPour l’axe génomique, nous allons annoter les familles de gènes chez différentes espèces pour ensuite identifier celles qui «évoluent anormalement«, par exemple celles issues d’une expansion génique, ou celles avec un taux de substitution très rapide. Pour l’axe transcriptomique, nous allons séquencer l'ARN des différentes espèces, en utilisant des méthodes de séquençage à haut débit, ce qui nous permettra d'identifier les gènes et les ARNs régulateurs spécifiques à chaque espèce. Nous développerons des logiciels pour les analyses des données de séquençage à haut débit. Enfin, pour faciliter l'interprétation de données, nous développerons une application bioinformatique permettant d’intégrer les données de génomique et de transcriptomique avec des annotations fonctionnelles.
Résumé de la soumission : Entamoeba histolytica est une amibe pathogène, parasite protozoaire dépourvu de mitochondries. C'est l'agent étiologique de l'amibiase qui se caractérise chez l’homme par une dysenterie et des abcès hépatiques. Près de 50 millions de cas cliniques et 100.000 décès sont recensés annuellement. La virulence de l’amibe varie selon les isolats: la souche E. histolytica HM1:IMSS (isolée d’ un patient souffrant de dysenterie) est virulente alors que la souche E. histolytica Rhaman (isolée d’un patient asymptomatique) est atténuée. Deux espèces très proches, E. dispar et E. moshkovskii sont non-pathogènes; la première est très répandue chez les humains alors que la seconde (isolée du sol) est rarement retrouvée chez des patients. Bien que ces diverses amibes soient très proches dans leur morphologie et phylogénie, leur issue clinique est dramatiquement différente, suggérant l'existence des facteurs indispensables au développement de la maladie et à l’adaptation du parasite à son hôte. Nous voulons caractériser les différences phénotypiques entre espèces/souches de Entamoeba par la comparaison de leurs génomes et de leurs transcriptomes. Nos objectifs majeurs sont : 1) déterminer précisément les différences transcriptomiques et phylogénomiques entre les espèces/souches de Entamoeba ; 2) annoter d'une manière fonctionnelle les familles protéiques et découvrir l'ensemble des gènes responsables des différences phénotypiques entre ces parasites.En première approche, nous utiliserons les nouvelles technologies de séquençage (dites NGS) pour caractériser le profil transcriptionnel des parasites. Nous cartographierons très précisément les transcrits codants et non codants, les petits ARN et ARN antisens. Les ARNs seront extraits d’amibes provenant de trois conditions expérimentales : en culture axénique, en présence de monoxyde d'azote (marqueur de l'inflammation pendant l'amibiase) et en contact avec des explants de colon humain. La comparaison des profils d'expression des petits ARN et des ARN non codants des différentes espèces d’amibes nous donnera des informations précieuses quant au rôle des ARN non-codants dans la régulation du transcriptome.Les différences phénotypiques entre souches pathogènes et non-pathogènes sont le résultat d'une sélection naturelle des mutations affectant des régions précises du génome (loci). L'identification de ces loci nous apportera des renseignements sur les bases génomiques responsables des différences phénotypiques.En deuxième approche, nous réaliserons donc l'exploration globale du génome à la recherche de ces mutations intéressantes pour l'évolution ; parmi celles-ci, nous identifierons les sites d'évolution adaptative et les mutations ponctuelles qui ont tous deux des impacts fonctionnels. Cette étude nous apportera une vision claire des spécificités génomiques des espèces de Entamoeba et contribuera à une meilleure compréhension de la phylogénie des organismes eucaryotes unicellulaires. En troisième approche, nous proposons d'annoter les protéines prédites par les séquences génomiques codantes; en effet, les génomes des amibes sont en général peu annotés. Les données seront hébergées dans une base simple permettant aux chercheurs d'analyser et comparer leurs résultats de transcriptomique. Ce projet représente la première étude complète s'intéressant aux génomes des eucaryotes unicellulaires. Elle se veut compréhensive par :(i) le type de transcrits que nous serons capables de capturer : codants, petits ARN, ARN antisens, ARNs longs non codants ;(ii) la cartographie des sites d’initiation et de terminaison de la transcription, des jonctions introns-exons, des sites de polyadénylation ;(iii) les différentes comparaisons entre espèces, intra-espèce et entre différents environnements.Le but est d'appliquer des méthodes modernes de transcriptomique et de phylogénomique pour caractériser l'ensemble des gènes responsables du caractère pathogène de E. histolytica.
Résultats : Premièrement, nous avons révisé et validé la plupart des annotations existantes des gènes chez E. histolytica. Nous avons par la suite découvert de nouveau gènes,  enrichissant ainsi l’ensemble génomique de cet organisme;  les données engendrées par cette étude ont fourni des  ressources capitales pour la recherche sur Entamoeba. Le bruit stochastique des processus d'épissage et polyadenylation de l’ARN a en effet été quantifié et nous avons conclu que le taux de ce bruit n’est pas fonctionnellement pertinent.
Deuxièmement, nos données suggèrent l’accumulation des niveaux élevés de petits ARNs dans les diverses souches. La quantité de petits ARNs pour un gène donné est corrélée avec la diminution de l'ARN messager correspondant ; ce profil diverge pour un ensemble de gènes selon le degré de pathogénicité de la souche testée. Des preuves pour étayer l'existence d'une voie d’ARN interférant endogène chez Entamoeba sont ainsi établies. Puis, nous avons démontré l'existence de transcrits anti-sens (généralisés à l’ensemble du génome) et déterminé que leur synthèse n’est pas le produit d’une transcription à partir de gènes adjacents. Notre hypothèse est que la genèse de l'ARN antisens corrèle avec celle de l'ARN de petite taille. Nous avons démontré que plusieurs facteurs de virulence sont réprimés par des petits ARNs dans la souche non pathogène E.histolytica, suggérant un rôle possible de petits ARNs dans la pathogénicité de cette espèce.
Perspectives : Il est attendu que Genamibe conduise aux retombées scientifiques suivantes: 
1) Améliorer significativement   l’annotation de gènes chez diverses espèces d’Entamoeba ; 
2) Découvrir des ARNs régulateurs dans ces génomes; 
3) Faire le point sur des concepts fondamentaux de la transcription génique chez les eucaryotes unicellulaires dans leur ensemble; 
4 ) Donner l'exemple de l’utilisation globale de la phylogénomique pour l’analyse des agents pathogènes; 
5) Démontrer qu’une comparaison inter-transcriptomique permet d’examiner les différences phénotypiques des agents pathogènes; 
6) Fournir des annotations approfondies de génomes d'Entamoeba afin de faciliter les interprétations du séquençage à haut débit lors d’études fonctionnelles.
Publications et brevets : A Comprehensive Evaluation of Normalization Methods for Illumina High-Throughput RNA-Seq Data Analysis. Briefings in bioinformatics (In press).
Nous avons comparé sept méthodes de normalisation de données de séquençage à haut debit des ARN et proposé une méthode appropriée pour l’analyse de données de séquençage de l’ARN