Projet ANR-10-BLAN-1209 – TODS : Tolérance au stress réplicatif
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Angelos CONSTANTINOU (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
Partenaires : Institut de Génétique Humaine
Montant : 400000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 48 mois
Résumé : Réponse de la Cellule aux Lésions de l’ADN et CancerLa prolifération aberrante des cellules tumorales conduit à l’apparition de cassures de l’ADN associées à la réplication. Les chimiothérapies visent à surcharger ces cellules de lésions de l’ADN de sorte à déclencher la mort cellulaire. Une bonne compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse cellulaire aux lésions de l’ADN est nécessaire pour améliorer les thérapies.
Mécanismes impliqués dans la signalisation et la réparation des lésions durant la réplication1.	Nous cherchons à récapituler in vitro l’activation des signaux impliqués dans la réponse cellulaire au stress réplicatif. Nous voulons disséquer les assemblages protéiques impliqués dans ces voies de signalisation et mettre à jour les déterminants structuraux de l’ADN conduisant à la nucléation des complexes de signalisation. Ce système acellulaire pourrait être adapté au criblage de molécules modulant la réponse aux lésions de l’ADN.2.	Nous cherchons à identifier de nouveaux facteurs jouant un rôle clé dans la tolérance des cellules au stress réplicatif. 3.	Nous explorons comment la dynamique de la réplication est régulée en réponse au stress durant la réplication.Ce travail devrait nous conduire à proposer de nouveaux outils diagnostic et pronostic ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques en vue d’optimiser les traitements anti tumoraux.
Caractérisation biochimique et moléculaire de la réponse aux lésions de l’ADNAfin de lever le voile sur les acteurs et les mécanismes impliqués dans la réponse cellulaire aux lésions de l’ADN, nous avons développé un système acellulaire permettant de reproduire le déclenchement de modifications post-traductionelles intervenant dans la signalisation des lésions de l’ADN dans un tube à essais. Bien entendu, il n’est pas possible de reproduire toutes les caractéristiques du noyau de la cellule in vitro. Afin de compléter le système acellulaire et étudier la dynamique des protéines de la réponse au stress réplicatif dans un contexte physiologique, nous avons mis au point une méthode permettant d’isoler et d’identifier les protéines associées à l’ADN nouvellement synthétisé, c’est à dire à proximité des fourches de réplication bloquées.Les complexes protéiques associés à la chromatine en réponse au stress réplication sont purifiés dans des conditions natives à l’aide de protéines recombinantes étiquetées. Le rôle des facteurs clés de la réponse au stress réplicatif sur la dynamique de la réplication est étudié à l’aide d’approches de biologie cellulaire classiques et spécialisées, tel que le « peignage moléculaire », qui permet la visualisation de la réplication de l’ADN nucléaire au niveau de la molécule unique.
Résumé de la soumission : Ce projet de recherche vise à élucider les bases moléculaires à l’origine de la réponse cellulaire au stress réplicatif, en relation avec des pathologies humaines. La réponse cellulaire aux lésions de l’ADN implique des systèmes de détection des lésions de l’ADN, des systèmes permettant de maintenir la stabilité les fourches de réplication bloquées, des systèmes de réparation de l’ADN ainsi que des stratégies permettant d’achever la duplication du génome en présence d'obstacles sur la matrice d'ADN à dupliquer. Cette réponse est notamment initiée par les kinases ATM (qui signal la présence de cassures d’ADN double-brins) et ATR (qui détecte des fourches de réplication bloquées), et relayée par des protéines transductrices et effectrices du signal. Un défaut de la réponse au stress génotoxique peut se manifester en clinique sous la forme de problèmes neurologiques et immunologiques, d’anomalies congénitales, et peu conduire à un vieillissement prématuré ainsi qu’à une forte prédisposition à développer des tumeurs. L’anémie de Fanconi est une maladie héréditaire prédisposant au cancer et causée par une réponse défectueuse au stress réplicatif. A ce jour, 13 gènes impliqués dans cette maladie ont été identifiés. Les produits de ces gènes font partie d’un réseau coordonné d’activités biochimiques permettant de surmonter le stress génotoxique durant la phase de synthèse du cycle cellulaire. Cependant, au niveau moléculaire, les rôles des protéines FANC restent encore très mal compris.Notre objectif est de comprendre : a) comment les structures d’ADN pathologiques associées à la réplication  sont détectées, signalées et réparées ; b) comment le signal est relayé aux protéines effectrices du signal ainsi que le rôle des protéines FANC dans ces processus ; et, c) comment la protéine FANCD2 promeut la réplication de l’ADN dans des conditions de stress. Afin d’y parvenir, nous allons nous employer à développer de nouveaux systèmes permettant de reproduire la signalisation de structures d’ADN pathologiques dans des extraits de noyaux de cellules humaines. De plus, nous utiliserons la technique du peignage moléculaire et des approches biochimiques complémentaires pour élucider comment FANCD2 promeut la réplication de l’ADN dans des conditions de stress.
Résultats : 1. Nous avons pu reproduire dans un tube à essais le déclanchement d’une voie de signalisation des lésions de l’ADN à l’aide d’un substrat nucléique, et nous avons entamé la caractérisation des facteurs clés de cette signalisation. D’autre part, nous avons obtenu de nouvelles données permettant d’expliquer comment les modifications post-traductionelles de certaines protéines facilitent la réparation de l’ADN.
2. Nous sommes parvenu à identifier de nouvelles protéines recrutées aux fourches de réplications bloquées par l’exposition des cellules à un agent chimio thérapeutique, la camptothécine, utilisé dans le traitement du cancer du colon. 
3. Les protéines impliquées dans l’anémie de Fanconi (protéines FANC) jouent un rôle clé dans la réparation des lésions provoquées par des agents pontant l’ADN utilisés en chimiothérapie. Nous avons mis en lumière un des mécanismes impliqués dans le recrutement de deux protéines FANC au niveau des fourches de réplication bloquées. De plus, nous avons observé que ces protéines sont non seulement impliquées dans la réparation des pontages de l’ADN, mais plus généralement dans le contrôle, en condition de stress, de protéines qui débobinent l’ADN lors de la réplication.
Perspectives : L’exploitation du système acellulaire de signalisation des lésions de l’ADN va nous permettre de poursuivre notre étude des mécanismes impliqués dans cette signalisation. Ce système pourrait nous conduire à l’identification et à la caractérisation de nouveaux médicaments qui agissent sur la réponse aux lésions de l’ADN. L’identification de nouveaux facteurs mobilisés aux fourches de réplication suite à un traitement des tumeurs du colon avec la camptothécine pourrait nous permettre d’identifier des bios marqueurs fonctionnels qui jouent un rôle clé dans la réponse thérapeutique.
Publications et brevets : Nous avons achevé la première phase du projet (18 mois) et les résultats décrits ne sont pas encore disponibles sous forme de publication. Nous avons pour l’instant publié une revue concernant le rôle des protéines de l’anémie de Fanconi dans la réponse au stress réplicatif. Nos résultats préliminaires ont été présentés sous la forme de communications orales ou de poster dans le cadre de colloques internationaux et nationaux. Nous projetons d’achever la première partie de ce travail et de le soumettre pour publication d’ici à la fin de cette année.  
Publication: Constantinou A (2012). Rescue of replication failure by Fanconi anaemia proteins. Chromosoma, 121, 21-36.
Congrès, présentation orale: Experimental Biology 2012. San Diego Convention Center, San Diego, CA, USA, April 21-25. Posters: a) Responses to DNA damage: From Molecular Mechanisms to Human Disease, 2011, Egmond aan Zee, The Netherlands, April 3-8. b) 9ème Colloque des 3 Rs, 2011, presqu’île de Giens, France, 2 - 5 Mai. c) 3nd Workshop de l’axe 2 Génome Structure et Fonctions 2012, Toulouse, France, 5 - 6 avril.