Projet ANR-10-BLAN-1620 – YeastIntrons : Analyse globale de la régulation des ARN contenant des PTC par la voie du NMD et le complexe EJC-like chez des levures riches ou pauvres en introns
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Guilhem JANBON (INSTITUT PASTEUR)
Partenaires : Institut national de la recherche agronomique; Institut Pasteur; Institut Pasteur
Montant : 400000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Comment l’épissage et la rétention des introns sont régulés chez les levuresNous étudions la structure et la dynamique du transcriptome d’une levure riche en introns et d’une autre levure moins riche en introns. Nous sommes notamment intéressés par l’influence de la voie du NMD et d’un complexe ressemblant à un EJC dans la régulation de la rétention d’introns.
Quel est le mécanisme qui régule la rétention d’introns chez les levuresLe rôle des introns et de la régulation de leur épissage ont été principalement étudiés chez les métazoaires avec les limitations techniques attenantes à l’étude des ces organismes. Nous étudions l’épissage des introns chez les champignons pour lesquels cette thématique de recherche a été de façon surprenante peu abordée. Nous avons choisi un organisme très riche en introns (Cryptococcus neoformans) et un organisme dans lequel les introns sont plus rares (Yarrowia lipolytica)Cinq grands objectifs ont été définis au début de ce programme de recherche :1)	Identifier tous les introns chez ces deux organismes.2)	Evaluer l’épissabilité de chaque intron3)	Construire un « pipe line » informatique pour l’analyse de l’épissage des introns4)	Construire une collection de souches dans lesquelles les gènes nécessaires au NMD ou ressemblant aux gènes codant des protéines de l’EJC ont été mutés. 5)	Evaluer l’importance de ces gènes sur l’épissage des gènes et la biologie de ces champignons.
Génétique et séquençage haut débitNotre stratégie utilise à la fois les techniques classiques de biologie moléculaire grâce auxquelles nous allons construire des mutants spécifiques des voies de régulation étudiées, mais aussi les techniques les plus modernes de séquençage haut débit. Grâce à ces techniques de séquençage de dernière génération, nous étudions la structure du transcriptome de deux levures, dans différentes conditions de culture. Nous déterminerons la façon dont les mutations que nous allons produire peuvent influencer la structure du transcriptome et notamment la rétention d’introns.
Résumé de la soumission : L’épissage alternatif des pré-ARN messagers est non seulement une source de diversité pour le protéome mais aussi un moyen de réguler l’expression des gènes. Ainsi, un des mécanismes les plus communs pour générer des isoformes alternatives provient de la rétention des introns. Dans ce cas, un ou plusieurs introns ne sont pas épissés générant ainsi un ARNm contenant un codon stop précoce. Ces codons stop sont alors sensés entrainer la dégradation de ces ARN par la voie du NMD (non sense mediated mRNA decay). Il existe un paradoxe entre la prédiction intuitive d’une régulation globale de l’expression des gènes par épissage alternatif et la voie du NMD, et les faibles conséquences de la délétion ou répression de l’expression du gène codant l’élément central du NMD sur le transcriptome en général. Dans ce projet, nous allons utiliser deux levures très différentes, la levure basidiomycète Cryptococcus neoformans et la levure hémiascomycète Yarrowia lipolytica, qui combinent, au moins en partie, la complexité du métabolisme des ARN des métazoaires et la facilité de manipulation de la levure Saccharomyces cerevisiae, pour étudier cette fascinante question. En effet, alors que cette problématique a fait l’objet de nombreuses études chez les métazoaires, l’importance, la complexité, la régulation et le rôle de l’épissage alternatif chez les champignons ont été très peu étudiés. Ici, nous allons utiliser les technologies de séquençage à ultrahaut débit les plus modernes (RNA-seq), associées à un nouvel outil bioinformatique (intron pipeline) que nous allons mettre au point, pour décrire et quantifier l’épissage alternatif chez ces levures. Nous nous intéresserons également à l’influence de mutations dans les constituants du complexe EJC-like et de la voie du NMD sur le transcriptome ainsi qu’à l’existence d’éventuelles voies parallèles pour la dégradation des transcrits non conformes.
Résultats : Nous avons re-annoté le gènome de Cryptococcus neoformans var. grubii et identifié plus de 4000 nouveaux introns. Plus de 40% des gènes ont vu leur annotation changée. Plus de 1000 introns en 5’UTR et 3’UTR ont été positionnés. Nous avons aussi positionné le ou les sites de polyadénylation pour plus de 80% des gènes. Cette nouvelle annotation va représenter la base de notre travail pour la suite du projet sur C. neoformans.
Nous avons fait une première réannotation du génome de Y. lipolytica, augmentant d’environ 20% le nombre de ses introns. Pour la première fois chez Y. lipolytica, des introns en 3’UTR ont été identifiés, ce qui de façon générale reste rare chez les levures hémiascomycètes.
Nous avons aussi construit des mutants du NMD et de ce qui ressemble à un EJC chez C. neoformans et Y. lipolytica. L’étude de ces mutants et notamment de leur influence sur la régulation de la rétention d’intron est l’axe premier de ce projet.
Perspectives : Les données que nous générons concernant la structure des transcriptomes sont d’une importance capitale pour ce projet (notamment pour l’étude de la régulation de la rétention des introns) mais aussi pour l’étude du métabolisme des ARN en général. Nos analyses seront en effet parmi les plus complètes jamais effectuées chez aucun organisme.
Publications et brevets : Une étude concernant l’épissage alternatif chez Y. lipolytica a été publiée cette année et une publication concernant le rôle des introns sur l’expression des gènes chez C. neoformans est en révision. Nous avons aussi participé à diverses conférences lors desquelles nous avons discuté de nos résultats et de leurs perspectives (3 posters, 3 communications orales).
Thon, Goebels, Gonzalez-Hilarion, Rolland, Moyrand, Beilhartz, Janbon, Introns regulate gene expression in Cryptococcus neoformans in a Pab2p dependent pathway (submitted)
Kabran, Rossignol, Gaillardin, Nicaud, Neuvéglise. 2012. Alternative Splicing Regulates Targeting of Malate Dehydrogenase in Yarrowia lipolytica. DNA Research doi:10.1093/dnares/dss007
Brunel, Proux, Coppée, Neuvéglise. Transcriptome analysis and expression regulation by the NMD pathway in the yeast Yarrowia lipolytica. San Feliu, Spain, Octobre 2011 (poster)
Thom, Rolland, Moyrand, Janbon G. Regulation of gene expression by intron in C. neoformans Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology. Fungal Pahtogens: From Basic Biology to Drug Discovery. Santa Fe, USA January 2012 USA (communication orale)
Janbon G. Annual meeting of the Korean Society for Microbiology and Biotechnology GyeongJu, South Korea June 2011.Role of the introns in regulating gene expression in C. neoformans. USA (communication orale)
Goebels, Gonzalez-Hilarion, Moyrand, Janbon Analysis of the role of introns on gene expression in Cryptococcus neoformans. October 2012 The complex life of mRNA EMBO EMBL symposium Heidelberg Germany. (poster)
Gonzalez-Hilarion, Mogensen, Janbon EJC and NMD mutant in Cryptococcus neoformans. June 2012. 17th annual meeting of the RNA Society, Ann Harbor, USA (poster)
Neuvéglise. Yeast genome evolution: comparison of divergent clades. ICY, Madison 26-30 août 2012, USA (communication orale)