Projet ANR-10-BLAN-1210 – Nuclear siRNAs : Rôle des siRNA nucléaires dans le contrôle de la dynamique chromatinienne
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Christophe ANTONIEWSKI (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR OUEST ET NORD)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique
Montant : 272086.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Fonction et mécanisme d’action des petits ARN nucléairesChez les plantes comme chez les animaux, les petits ARN non-codants sont au cœur d’un vaste réseau de régulation par répression, encore insoupçonné il y vingt ans. Nous les étudions en nous focalisant sur leurs fonctions dans le noyau de la cellule et sur leurs rôles dans la structuration des chromosomes et la transmission épigénétique d’information au travers des générations.
Rôle des petits ARN nucléaires dans la mémoire cellulaire et l’hérédité épigénétiqueChez les plantes comme chez les animaux, les petits ARN non-codants sont au cœur d’un vaste réseau de régulation par répression, encore insoupçonné il y vingt ans. Ainsi, ils sont impliqués dans le contrôle du développement et de la différenciation cellulaire, de la structure de la chromatine et des chromosomes, et dans la défense contre les éléments transposables et les pathogènes exogènes. Notre objectif est de comprendre les mécanismes d’action des petits ARN nucléaires pour mieux appréhender leurs rôles dans la mémoire cellulaire et la transmission d’information épigénétique. En utilisant la drosophile comme modèle, nous poursuivons cet objectif par des approches de génétique moléculaire couplées à du séquençage haut-débit. Dans ce contexte nous développons des procédure informatiques pour traiter et analyser les très quantités de données génomiques générées. Au delà des questions biologiques fondamentales, nos travaux apportent des éléments pour mieux comprendre les composantes épigénétiques des maladies et des défauts de développements. Le savoir-faire informatique acquis au cours du projet nous permet également d’améliorer le profilage des petits ARN dans tous les organismes, contribuant ainsi à la recherche de nouveaux bio-marqueurs et cibles thérapeutiques.
Outils mis en œuvreNous utilisons les techniques récentes de recombinaisons in situ pour manipuler les gènes impliqués dans la biogenèse et l’activité des petits ARN et introduire dans leur séquence une « étiquette ». Il devient ainsi possible de visualiser en microscopie les protéines codées par ces gènes – et d’analyser leur localisation nucléaire, en utilisant un anticorps reconnaissant cette étiquette.Les nouvelles techniques de séquençage à haut-débit (NGS, Next Generation Sequencing), permettent de séquencer les petits ARN, de déterminer leur origine génomique, d’estimer leur abondance et d’identifier d’éventuelles modifications de structure et/ou de séquences. Nous y avons recours massivement dans ce projet. Le NGS couplé à des analyses génétiques, permet également d’avoir accès aux sites d’actions des proteines nucléaires impliquées dans la biogenèse ou l’activité des petits ARN.Enfin, l’analyse des données de NGS requière des approches bioinformatiques. Nous développons ces approches dans un environnement Galaxy, qui permet d’intégrer des algorithmes de traitement complexes sur une plateforme web accessible aux biologistes et médecins.
Résumé de la soumission : Les petits ARN de 20 à 30 nucléotides sont au cœur des processus de répression de l’expression génétique par les ARN non-codants. Ils s’associent avec des protéines de la famille Argonaute et les guident vers leurs cibles de séquence complémentaire. La répression qui en résulte peut intervenir par clivage, déstabilisation ou inhibition traductionnelle des ARN messagers, ou par modifications covalentes de l’ADN ou des histones au niveau de loci cibles. Les petits ARN sont impliqués dans un grand nombre de processus biologiques fondamentaux allant de la régulation des programmes génétiques de développement et de différenciation jusqu’au contrôle de la structure de la chromatine et des chromosomes, en passant par la défense contre les éléments transposables ou contre des agents pathogènes exogènes. Cette pléïotropie fonctionnelle reflète en réalité l’existence de multiples et diverses voies biochimiques faisant intervenir les petits ARN, voies qui ont toutes été découvertes au cours de la dernière décennie.Le rôle des petits ARN interférants (siRNA) dans la régulation de la structure chromatinienne a été étudié en détail chez les plantes et l’unicellulaire eucaryote Schizosaccharomyces pombe. La contribution des petits ARN au contrôle de la dynamique chromatinienne reste en revanche mal comprise chez les animaux. Pour autant, il apparaît aujourd’hui essentiel de mieux comprendre les mécanismes mis en jeux, car un nombre croissant de données indique que leur perturbation est liée au cancer, à des désordres génétiques et au vieillissement.Nous avons récemment démontré chez la drosophile que la séquestration dans le noyau de siRNA dérivants de l’expression d’éléments transposables altère la méthylation du résidu K9 des histones H3 et la distribution des protéines hétérochromatiniennes Su(Var)3.9 et HP1. De plus, cette séquestration relève la répression de marqueurs génétiques de l’hétérochromatine. Finalement, nous avons observé les mêmes effets dans des mutants de composants essentiels de la voie des siRNA, dicer-2, r2d2 et argonaute-2. Ainsi, nos résultats ont révélés l’existence d’une fonction nucléaire des siRNA endogènes chez la drosophile, qui est de faciliter la formation de l’hétérochromatine dans les cellules somatiques.Le but de ce projet est d’explorer cette nouvelle fonction nucléaire des siRNA et de caractériser en particulier son rôle dans la dynamique de l’hétérochromatine. Nos objectifs sont : (i)	de purifier les siRNA nucléaires, de caractériser leur séquence, leur structure et leur localisation génomique, et de tester le rôle des protéines hétérochromatiniennes Su(Var)3.9 et HP1 dans leur biogenèse.(ii)	de tirer parti des outils de génomique fonctionnelle récemment développés chez la drosophile (Recombinaison en Chromosome Artificiels Bactériens couplée à la transgénèse ciblée au site attP) pour créer une ressource de transgènes génomiques exprimant les composants de la voie des siRNA (Dicer-2, R2D2, Argonaute-2, etc.) fusionnés aux épitopes FLAG-HA ou GFP.(iii)	d’utiliser cette ressource pour caractériser en détail la localisation nucléaire des protéines Dicer-2 et Argonaute-2 par microscopie in vivo et in vitro et pour définir leurs interactions avec d’autres composants nucléaires au travers d’approches biochimiques.(iv)	de cartographier au niveau génomique les sites de fixation des protéines Dicer-2 et Argonaute-2 sur les chromosomes, par immunocoloration des chromosomes polytènes et par immunoprecipitation de chromatine couplée à un séquençage haut débit.Cette étude devrait au final permettre une meilleure compréhension des processus de régulation de la structure chromatinienne et d’hérédité cellulaire épigénétique, et faciliter leur exploitation dans le domaine de la médecine et de la santé.
Résultats : Découverte de la première paramutation stable dans le règne animal, et liée à l’émergence d’un locus produisant des petits ARN de type piRNA (Piwi-interacting RNA).
Découverte de siRNA produit par un virus infectant de façon permanente les stocks de drosophile. Nous souhaitons maintenant comprendre les effets à long-terme, sur plusieurs générations, de cette charge importante en petits ARN exogènes dans l’organisme.
Mise en place d’un serveur informatique dédié à l’analyse des séquences NGS des petits ARN.
Perspectives : Notre travail sur la paramutation fournit un modèle précieux pour l'analyse mécanistique de l'émergence de loci producteurs de piRNAs au sein des génomes et pour la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans les changements épigénétique de régulations géniques qui présentent des conséquences trans-générationnelles.
Nous souhaitons également comprendre les effets à long-terme, sur plusieurs générations, d’une charge importante en petits ARN d’origine virale dans l’organisme.
En concertation avec l’Université Pierre et Marie Curie, nous envisageons la création d’une start-up utilisant nos ressources informatique et notre expertise dans le domaine des petits ARN pour identifier de nouveaux « biomarqueurs » et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques en cancérologie.
Publications et brevets : 1.	Jouneau et al. (2012). Rna 18, 253-264. Ce travail a montré que les miRNAs sont impliqué dans la différenciation des cellules souches chez la souris
2.	van Mierlo, J.T. et al (2012). PLoS Pathog 8, e1002872. Ce travail décrit la caractérisation d’un virus endogène et non-pathogène de la drosophile, qui produit un niveau important de petits ARN dans l’organisme hôte. 
3.	de Vanssay, A. et al (2012). Nature. Ce travail décrit la découverte et la caractérisation d’une paramutation, liée et transmise au cours des générations par des petits ARN maternels.
4.	Antoniewski, C. (2011). Methods in molecular biology 721, 123-142. Ce travail décrit un algorithme informatique d’identification et d’analyse les petits ARN viraux