Projet ANR-10-BLAN-1503 – HelicaRN : Fonction, mécanismes d'action, et spécificité des hélicases à boîte DEAD
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Marc DREYFUS (CNRS - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS B)
Partenaires : École supérieure de physique et de chimie industrielles de la ville de Paris; Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 415000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Les ARN hélicases, des outils moléculaires pour apparier et désapparier les molécules d'ARNBien que simple-brin, les molécules d'ARN forment constamment des duplexes inter ou intramoléculaires. Le rôle des ARN hélicases, trouvées chez tous les organismes, est de catalyser leurs réarrangements. Ces enzymes essentiels ont un mode d'action mystérieux. «HelicaRN» propose de l'élucider, grâce entre autres à des approches de molécules uniques.
Comprendre comment les hélicases utilisent l'ATP pour agir sur les structures d'ARNCe projet de recherche fondamentale propose l’étude d’une famille d’enzyme essentiels à la biologie de l’ARN chez tous les organismes, les hélicases à boîte DEAD. Ces enzymes, dont l’expression inappropriée chez l’homme provoque parfois le cancer, ont la capacité de modifier ou de stabiliser la structure de l’ARN, mais leur mode d’action reste très mal compris, du fait notamment que leur action est fugace et ne laisse pas de trace sur l’ARN. Pour dépasser cette difficulté et échapper aux effets de moyenne inévitables lorsqu’on étudie de grandes populations de molécules, nous proposons d’examiner cette activité en temps réel et sur des molécules d’ARN uniques. En couplant ces techniques à des approches plus classiques et très bien maîtrisées au laboratoire -tests d’activité des protéines à boîte DEAD in vivo et in vitro, mutagenèse, comparaisons structurales et phylogénétiques – nous pensons pouvoir répondre, sur des cas particuliers, aux trois questions soulevées par la biologie de ces protéines, et qui restent généralement sans réponse: 1) comment ces enzymes utilisent-ils l’énergie de l’ATP pour modifier la conformation de l’ARN? 2) qu’est ce qui dirige ces protéines vers leur substrat ARN spécifique in vivo? et 3) quelle est leur action exacte sur ces substrats?
Combiner l'enzymologie classique avec des mesures sur des molécules uniques.Les mesures sur molécules uniques utilisée ici – mesures de la force nécessaire pour déplier l’ARN en présence ou en absence d'hélicase, mesure par transfert de fluorescence de la distance entre les extrémités d’un duplex – sont centrées sur le substrat ARN et permettent de comparer sa conformation en présence et en absence d'hélicase. Elles devraient permettre de détecter des états intermédiaires invisibles avec les méthodes classiques.
Résumé de la soumission : Ce projet émane de deux équipes, constituées l’une de biologistes de l’ARN et l’autre de physiciens spécialistes des mesures sur molécules uniques, travaillant à Paris dans deux établissements voisins. Il a pour objet l’étude des «protéines à boîte DEAD», une famille d’enzymes essentiels au métabolisme de l’ARN.Découvertes en 1989, ces protéines sont présentes chez tous les organismes, où elles participent à presque toutes les réactions impliquant l’ARN. Ces ATPases ARN-dépendantes sont caractérisées par neuf motifs conservés, dont le motif D-E-A-D qui leur a valu leur nom. In vitro, beaucoup d’entre elles sont capables de séparer des duplex d’ARN en présence d’ATP (activité hélicase), et de favoriser la formation de tels duplex en son absence. Le mode d’action de ces enzymes-clef est extrêmement mal compris, et trois questions majeures restent en suspens. La première concerne l’activité hélicase. Ces enzymes ressemblent aux hélicases impliquées dans la réplication de l’ADN, et pourtant le mécanisme d’ouverture des brins semble très différent dans les deux cas. Les hélicases réplicatives sont des translocases qui se déplacent de façon directionnelle sur l’ADN simple brin en «ouvrant» progressivement les duplex rencontrés, même longs. Au contraire, les protéines à boîte DEAD ne nécessitent pas pour agir d’extensions simple brins de polarité définie, mais elles ne peuvent dissocier que des duplex très courts (<20 pdb). Suivant le modèle actuel, en présence d’ATP, ces protéines interagiraient directement avec l’ARN double-brin qu’elles ouvriraient sur quelques paires de bases, permettant éventuellement la dissociation de duplex très peu stables. Après hydrolyse de l’ATP, l’enzyme relâcherait sa prise, et les duplex non dissociés se reformeraient. Ce modèle implique qu’au cours des cycles ATPase le duplex oscille entre deux états discrets, apparié et partiellement ouvert. L’existence de ce dernier état reste à démontrer, et c’est l’un des buts de ce projet: les techniques envisagées – influence de l’hélicase sur la force nécessaire pour ouvrir un duplex, ou sur le transfert de fluorescence entre les extrémités d’un duplex – devraient donner une réponse claire. La deuxième question concerne l’origine de la spécificité de ces protéines. La plupart d’entre elles n’ont pas de préférence de substrat in vitro; or, in vivo, elles jouent des rôles spécifiques, non interchangeables. On admet généralement qu’elles sont dirigées vers leur cible ARN par des partenaires spécifiques, mais ceux-ci sont généralement inconnus. Nous proposons d’identifier les partenaires de Ded1, une protéine à boîte DEAD de levure très utilisée comme modèle. Ded1 est en outre une phosphoprotéine, et son «cœur» à boîte DEAD est entouré d’extensions N- et C-terminales: nous testerons l’influence de la phosphorylation et des extensions sur l’activité et la spécificité de Ded1 in vivo et in vitro. Cette partie du projet fera appel à un large éventail de techniques biochimiques et génétiques. Enfin, la troisième question concerne le rôle exact de ces protéines in vivo. Sur quelle(s) structure(s) d’ARN agissent-elle? et quelle est leur action? réarranger ces structures (activité chaperonne)? déplacer des protéines liées (activité RNPase)? ou simplement liaison ATP-dependante à l’ARN? Dans le cas de SrmB, une protéine à boîte DEAD impliquée dans l’assemblage du ribosome de E. coli, nous pensons avoir identifié le site d’action—un sous domaine de l’ARN 23S—et peut-être la fonction—SrmB aiderait au repliement de ce sous domaine (activité chaperonne). Nous tenterons de le prouver par micromanipulation in vitro, en mesurant la force nécessaire pour s’opposer au repliement du sous domaine en présence et en absence de SrmB.Déjà présenté en 2009, ce projet avait été placé en «liste complémentaire». Depuis, nous avons obtenu de nombreux résultats qui montrent la faisabilité des approches interdisciplinaires proposées. Cette nouvelle version met l'accent sur ces approches.
Résultats : Les ARN hélicases sont des enzymes qui, grâce à l’énergie provenant de la dégradation de l’ATP, peuvent modifier la forme (la «conformation») des molécules d’ARN ou des complexes ARN-protéine dans la cellule, et ainsi réguler leur activité biologique. Toutefois, il est évident que ces enzymes ne doivent agir qu’à bon escient, sur les bonnes molécules d’ARN et au bon moment. Les résultats obtenus dans ce programme montrent, pour certaines hélicases modèles, comment l’ARN «cible» est choisi, quelle transformation il subit, et comment l’enzyme utilise l’énergie chimique contenue dans l’ATP pour obtenir ce résultat.
Parmi les réalisations les plus spectaculaires, mentionnons qu’il est désormais possible, grâce à des méthodes optiques très sensibles, de déterminer quelle force il faut appliquer pour modifier la forme de molécules d’ARN individuelles, et comment les protéines qui se fixent à l’ARN peuvent stabiliser ces formes. Les forces mises en jeu sont naturellement extrêmement petites: de l’ordre de 10 pN, ce qui correspond au poids d’un microgramme de matière seulement!
Ce projet, dont le but est de faire avancer les connaissances fondamentales, permet une synergie originale entre biologistes et physiciens.
Perspectives : Le projet HelicaRN vise à l’accroissement des connaissances fondamentales en biologie de l’ARN. L’application pratique des résultats n’est pas le but immédiat, même si celle-ci n’est jamais absente des préoccupations des chercheurs. Ainsi, N.K. Tanner a déposé (avec d’autres) un brevet pour l’utilisation des hélicases à boîte DEAD pour induire la production des cytokines (2008), et l’équipe de U. Bockelmann a fait breveter une invention destinée a stabiliser un piège optique double (2010). On peut espérer que d’autres inventions sortiront d’HelicaRN.
Publications et brevets : 1- Banroques, J., Cordin, O., Doere, M., Linder, P., &Tanner, N. K. (2011) J Mol Biol, 413,451-72.
Très similaires entre elles, les ARN hélicases différent par des extensions N- et C- terminales specifiques. Cet article analyse le rôle de ces extensions dans le cas de six hélicases essentielles de levure.
2- Proux, F., Dreyfus, M., & Iost, I. (2011) Mol Microbiol, 82, 300-311
Les hélicases ne laissant pas de trace sur l'ARN, on ne sait en général pas sur quelles structures ou nucléotides elles agissent in vivo. Dans cet article, ce voile est en partie levé: grâce à une approche génétique, nous déterminons les sites d'action d'une ARN hélicase de E. Coli sur son substrat, l'ARN ribosomique.
3- Mangeol, P., Bizebard, T., Chiaruttini, C., Dreyfus, M., Springer, M., & Bockelmann, U. (2011). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 18272–18276
En tirant sur les extrêmités d'une molécule d'ARN avec des pinces optiques, on peut déterminer la force mécanique nécessaire au dépliement des différents éléments de la structure de la molécule. Ici, nous mesurons pour la première fos l'effet sur cette force de protéines reconnaissant spécifiquement la structure d'ARN (ici des protéines ribosomiques; le cas des hélicases est en cours d’étude).