Projet ANR-10-MALZ-0002 – TAU-STRUCT : Characterization par Résonance Magnétique Nucléaire des changements conformationelles par Phosphorylation de la protéine Tau, impliquée dans la maladie d’Alzheimers.
Programme : Maladie d'Alzheimer et Maladies Apparentées (MALZ)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Martin Blackledge (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique
Montant : 219377.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Tau-StructNMR-spectroscopic characterization of the conformational changes of the Alzheimer-associated protein Tau induced by phosphorylation
Aims and ObjectivesOur aim is to develop a molecular ensemble description of Tau that combines and reflects multiple complementary conformationally-dependent experimental parameters. We will use this description to examine the transition from apparent normality into the diseased state of Tau. In Alzheimer's disease, Tau becomes excessively phosphorylated, loses its ability to bind to microtubules and aggregates into neurofibrillary tangles that consist of paired helical filaments of Tau. Key questions that will be addressed during the course of this project concern the chemical and environmental factors that induce conformational transition, in particular the conformational effects of high levels of phosphorylation.
Development of a self-consistent molecular description of the unfolded stateThe description of the highly heterogeneous conformational space available to intrinsically disordered proteins poses inherent difficulties. Approaches that are based on the use of molecular dynamics simulation run the risk of undersampling the available conformational space, and the effect using direct constraints depends strongly on the relative weighting of experimental restraints and classical force field terms. We have developed an approach that uses efficient, restraint free sampling to flood the available conformational space, and then selects from this space to provide ensembles consistent with the experimental data. Extensive ensembles are calculated, on the basis of residue specific amino acid conformational properties, and experimental parameters calculated for each conformer, and combined using a highly efficient selection algorithm called ASTEROIDS (A Selection Tool for the Ensemble Representation Of Intrinsically Disordered States). This approach is used to develop an ensemble descriptions that are in agreement with chemical shifts, residual dipolar couplings and paramagnetic relaxation enhancements. The precise ability of these restraints to define the conformational sampling of the backbone are described in detail in the following articles :Ozenne et al J. Am Chem Soc. In Press (2012)Schneider,et al. Mol Biosyst. 8, 58-68 (2012)Ozenne et al Bioinformatics. 28, 1463-70 (2012)
Résumé de la soumission : La protéine Tau, une protéine qui controle la dynamique des microtubules (MT) dans sa forme physiologique, joue aussi un rôle central dans la progression de la maladie d'Alzheimer. Dans la maladie d'Alzheimer, Tau devient hyper-phosphorylée, perd sa capacité à se lier aux microtubules, et s'aggrege en plaques. La base moléculaire de cette transition reste largement inconnue, et l’origine du changement conformationelle est d’autant plus intriguant car dans sa forme physiologique et soluble la proteine Tau est intrinsèquement désordonnée. Au cours de la dernière décennie, il est devenu de plus en plus clair qu'une fraction importante (jusqu'à 40%) des protéines codées par le génome humain sont intrinsèquement désordonnées ou contiennent des régions désordonnées de longueur importante (> 50 aa). Ces protéines intrinsèquement désordonnées (PIDs) sont fonctionnelles en dépit d'une absence de structure stable. Il est essentiel d’élaborer une nouvelle méthodologie pour comprendre la relation entre la séquence primaire d’une PID et sa fonction et malfonction. Les transitions ordre-désordre accompagnant les interactions de PIDs avec leurs partenaires physiologiques, et les transitions entre formes solubles, saines, et formes agrégées, pathologiques, de certaines de ces protéines constituent des exemples particulièrement intrigants dont les origines moléculaires reste peu ou pas comprise en terme de biophysique structurale. Le fait que les PIDs soient fréquemment associées à des maladies humaines, y les maladies neurodégénératives, ne fait que renforcer l’importance de ces questions.Ici, nous  proposons d'utiliser la résonance magnétique nucléaire, en combinaison avec la diffusion aux petits angles des rayons X (SAXS) pour développer une description moléculaire de la comportement conformationelle de la protéine Tau, et nous utiliserons ensuite ces méthodes comme outils de bases pour suivre le passage de l'état physiologique à l'état des pathologique de la protéine Tau. Notre approche est d’étudier l’effet de la phosphorylation de la protéine Tau. Dans sa forme aggregée Tau est hyperphosphorylée, et l’inhibition des kinases responsables pour la phosphorylation de Tau est considérée comme une des stratégies les plus rationnelles pour trouver de nouveaux médicaments visant à inhiber la neurodégénérescence. Pour comprendre l’effet de la phosphorylation sur la comportement structurale de la protéine, commencant avec la première description à une résolution atomique de la protéine à l’etat natif, nous allons étudier les changements conformationelles induites par la phosphorylation progressive de la protéine.Le projet fournira un aperçu sans précédent des changements de conformation qui sont associés à des formes de Tau pathogènes et, plus généralement, établira des méthodes pour décrire les protéines desordonnées et les changements conformationelles qui accompagnent la developpement des maladies conformationelles.
Résultats : Task 1 : Refined Ensemble of Structures populated by 441-residue TAU in solution
The intrinsically disordered protein tau becomes excessively phosphorylated and aggregates into neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease. To obtain insight into the structural consequences of phosphorylation, we characterized a mutant protein of tau in which epitopes recognized by Alzheimer diagnostic antibodies were mimicked by mutation to glutamic acid [AT8 (S199E, S202E, T205E), AT100 (T212E and S214E), and PHF1 (S396E and S404E)]. A large number of distance restraints obtained from NMR paramagnetic relaxation enhancement in combination with ensemble conformer calculations demonstrate that pseudophosphorylation causes an opening of the transient folding of tau. Together with previous studies on the Parkinson-related protein a-synuclein, our data indicate that networks of transient long-range interactions are common properties of intrinsically disordered proteins and that their modulation is important for aggregation.
The article was published in the 
Journal of the American Chemical Society  J. Am Chem Soc, 133, 15842–15845 (2011)
Perspectives : Remaining Work :
The remaining tasks are on course, however there is one main stumbling block concerning the application of this work to the different Phosphorylated forms of the protein. As described in the report at 06 months, a promising candidate had been identified for the ANR-funded postdoctoral position to carry on this work. He was expected to start working at the beginning of the summer 2012, however for personal reasons he decided not to come to France from the US. This means that we are now behind in this recruitment procedure. We therefore request an extension of the project by 6 months. We believe that this is crucial to the successful completion of the second phase of the project, where we will attempt to detect the differences in conformational behaviour of the protein following different stages of Phosphorylation – In agreement with our initial estimation, we still consider that this will require a dedicated and experienced scientist to work full time on the project for a period approaching 2 years, which will only be possible if we can extend the project closure from 04/2014 to 10/2014. We have identified a candidate to fill this position.
Publications et brevets : 1.	Mapping the Potential Energy Landscape of Intrinsically Disordered Proteins at Amino Acid Specific Resolution. Ozenne V, Schneider R, Yao M, Huang JR, Salmon L, Zweckstetter M, Jensen MR, Blackledge M J. Am Chem Soc. In Press (2012)
2.	Towards a robust description of intrinsic protein disorder using nuclear magnetic resonance spectroscopy. R. Schneider, J.R.Huang, M. Yao, G. Communie, V.Ozenne, L.Mollica, L.Salmon, M. Ringkjøbing Jensen, M. Blackledge. Mol Biosyst. 8, 58-68 (2012)
3.	Intrinsically disordered proteins: from sequence and conformational properties toward drug discovery. Rezaei-Ghaleh N, Blackledge M, Zweckstetter M. Chembiochem. 13, 930-950 (2012)
4.	Flexible-meccano: a tool for the generation of explicit ensemble descriptions of intrinsically disordered proteins and their associated experimental observables Ozenne V, Bauer F, Salmon L, Huang JR, Jensen MR, Segard S, Bernadó P, Charavay C, Blackledge M. Bioinformatics. 28, 1463-70 (2012)
5.	Structural Impact of Proline-Directed Pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 Epitopes on 441-Residue Tau. S. Bibow, V. Ozenne, J. Biernat, M. Blackledge, E. Mandelkow, M. Zweckstetter. J Am Chem Soc. 133, 15842-15825 (2011)