Projet ANR-11-JS07-0014 – Cellmemprobes : Sondes moléculaires multifonctionnelles pour l’imagerie de fluorescence de membranes cellulaires
Programme : JCJC - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (JCJC SIMI 7)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Andrey KLYMCHENKO (UNIVERSITE DE STRASBOURG)
Partenaires : Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie
Montant : 179556.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Sondes fluorescentes multifonctionnelles pour l’imagerie de cellules vivantesLe développement rapide des techniques d'imagerie optique nécessite de nouveaux outils moléculaires de pointe - des sondes fluorescentes. Le projet permettra de développer de nouvelles sondes ayant plusieurs fonctions: marquage spécifique de la membrane, la reconnaissance spécifique des protéines membranaires (récepteurs) et la réponse en couleur aux domaines lipidiques dans les membranes plasmiques, en particulier dans l'environnement nanoscopique du récepteur.
Sondes multi-couleur pour domaines lipidiques et récepteurs membranairesLa bio-imagerie de fluorescence est un domaine de recherche en développement rapide car elle ouvre des possibilités de détection non-invasive de cibles biomoléculaires, présentant ainsi un intérêt certain tant en recherche qu’en diagnostic clinique. Ce type d’imagerie requiert des outils spécifiques, à savoir des sondes fluorescentes.L’objectif général de ce projet est le développement de sondes membranaires fluorescentes et multifonctionnelles pour l’imagerie cellulaire. La fluorescence de ces sondes devra répondre de manière spécifique ou non à la liaison à un récepteur membranaire et renseigner sur les propriétés de la membrane via une modification de leur spectre. Elles seront appliquées à la résolution des problèmes courants de biologie membranaire. En premier, ces nouvelles sondes seront appliquées à l’imagerie des domaines lipidiques (rafts) à la surface membranaire des cellules, domaines jouant un rôle clef dans la fonction des protéines membranaires. En second, elles devront sonder l’environnement lipidique d’un récepteur donné afin d’évaluer le rôle des domaines lipidiques.
Développement de sondes fluorescentes pour les domaines lipidiques et récepteurs membranairesCe projet comprend cinq étapes. La première consiste en sa coordination. La seconde sera de synthétiser de nouvelles sondes membranaires fluorescentes via les méthodes de chimie organique et de bio-conjugaison. La sonde fluorescente membranaire est constituée d’un fluorophore et d’une ancre amphiphile. Pour qu’une telle sonde soit récepteur-spécifique, elle doit aussi posséder un ligand via un espaceur. Lors de l’étape 3, la réponse de ces sondes à l’ordre lipidique sera évaluée sur des vésicules unilamellaires, larges et géantes, par spectroscopie et microscopie de fluorescence. Lors de l’étape 4, les sondes sélectionnées à l’étape précédente seront évaluées sur des cellules vivantes afin d’étudier leur liaison à la membrane plasmique et leur internalisation. L’étape 5 visera à développer des applications (1) pour l’imagerie de l’ordre lipidique et des microdomaines et (2) pour la reconnaissance des récepteurs et de leur environnement lipidique. Les sondes seront testées sur différentes lignées cellulaires exprimant différents récepteurs (intégrines, récepteur à l'ocytocine, etc.) afin d’évaluer leur réponse « turn-on » aux récepteurs et de suivre l’ordre lipidique dans le voisinage de ces récepteurs.
Résumé de la soumission : La bio-imagerie de fluorescence est un domaine de recherche en développement rapide car elle ouvre des possibilités de détection non-invasive, présentant ainsi un intérêt certain tant en recherche qu’en diagnostic clinique. Ce type d’imagerie requiert des outils spécifiques, à savoir des sondes fluorescentes. L’une des cibles les plus intéressantes en imagerie cellulaire est la membrane plasmique. La conception de nouvelles sondes membranaires, en vue d’un large champ d’applications en biologie requiert leur multi-fonctionnalité, les différentiant ainsi des sondes classiques des membranes lipidiques. Le but du présent projet vise à développer des sondes fluorescentes membranaires remplissant les fonctions suivantes. La première est la sensibilité aux propriétés membranaires, notamment l’ordre lipidique, paramètre qui est lié à la formation de domaines membranaires (radeaux lipidiques), qui doivent jouer un rôle clé dans l’activité des protéines membranaires. Cette sensibilité peut être obtenue par l’utilisation de sondes sensibles à l’environnement, via leur intensité et/ou leur spectre. La seconde fonction nécessaire est le ciblage spécifique de la membrane plasmique cellulaire, et plus particulièrement le feuillet externe, de concert avec un “allumage” de la fluorescence lors du marquage de la membrane. Ce marquage spécifique du feuillet externe est important parce ce que celui-ci est enrichi en lipides responsable de la formation des radeaux lipidiques. Un autre aspect important réside dans la conception de sondes membranaires fonctionnalisées capables de cibler des récepteurs membranaires. De telles sondes pourraient à la fois de détecter les cellules cibles et suivre certains paramètres comme l’ordre lipidique dans le voisinage d’un récepteur. Notre groupe s’est fortement impliqué dans le développement de sondes membranaires  (>25 articles et un brevet sous licence) et les résultats obtenus fournissent un socle solide pour le développement de ces sondes multifonctionnelles. Le présent projet comporte 5 tâches: La première tâche est la coordination du projet. Dans la tâche 2, nous synthétiserons de nouvelles sondes membranaires en couplant des groupements amphiphiles appropriés à des fluorophores sensibles à l’environnement ou des inhibiteurs de fluorescence. Les sondes obtenues devraient présenter des propriétés de fluorescence améliorées, une sélectivité pour le feuillet externe avec un flip-flop minime, un marquage membranaire efficace et une meilleure solubilité. Afin d’obtenir la spécificité pour un récepteur membranaire donné, ces sondes seront ensuite conjuguées avec un ligand spécifique. Les sondes obtenues seront caractérisées de manière détaillée, d’abord en solution et sur des membranes modèles (Tâche 3), puis sur des cellules (Tâche 4) afin d’évaluer leur liaison à la membrane plasmique, leur flip-flop, leur internalisation cellulaire et leur cytotoxicité. Finalement (Tâche 5), nous utiliserons les sondes sélectionnées pour deux applications précises. Tout d’abord pour imager des domaines membranaires en phase lipide ordonnée, par les techniques de microscopie de fluorescence les plus récentes (de molécules uniques et à résolution nanoscopique : “STED” et “PALM”), puis la reconnaissance de récepteurs par ces sondes et l’évaluation de l’ordre lipidique dans leur voisinage.  Le consortium consiste en une équipe hautement interdisciplinaire composée de sept jeunes chercheurs d’expertise complémentaire. Il est à remarquer que trois d’entre eux ont été primés en 2010 pour leur excellence scientifique. Les résultats seront publiés dans les meilleures revues et les sondes les plus performantes seront brevetées et commercialisées. Nous nous attendons à voir ces sondes trouver de larges applications en recherche cellulaire, particulièrement en ce qui concerne les radeaux lipidiques et les protéines membranaires ainsi qu’en diagnostic clinique pour l’imagerie des cellules cibles.
Résultats : (1) Une variété de nouvelles sondes membranaires fluorescentes a été développée : (a) Des sondes bicolores pour l'ordre lipidique et l'apoptose. (b) Des sondes bleues brillantes et photostables pour l'imagerie multicolore. (c) Des sondes à base de squaraines, émettant dans le rouge lointain, possédant une brillance exceptionnelle pour l'imagerie in vitro et in vivo. (2) Nous avons obtenu un « boite d'outils » basé sur des sondes « Nile Red » avec un quencher FRET capables de cibler de façon spécifique et d'identifier différentes phases des membranes cellulaires, fournissant de nouvelles preuves de la présence des radeaux lipidiques.  (3) Des sondes fluorogènes innovantes pour les récepteurs membranaires ont été obtenues à partir de Nile Red et de monomères et dimères de squaraines.
Perspectives : (1) Nous escomptons que ces nouvelles sondes seront utiles à une large communauté de chercheurs travaillant en biologie membranaire, en particulier sur les récepteurs membranaires et l’organisation lipidique de la membrane. En outre, ces sondes à même de détecter des récepteurs  trouveront des applications dans le criblage de molécules et le diagnostic clinique pour l’imagerie de cellules cible. (2) Nous nous attendons à d’importantes avancées concernant la structure, la dynamique et les fonctions des domaines membranaires, mettant en évidence leurs interactions avec des protéines membranaires.
Publications et brevets : Nouvelles sondes membranaires pour les domaines lipidiques et imagerie multi-couleur:
(1) Kreder et al, RSC Adv., DOI: 10.1039/C4RA16225K. (2) Kreder et al, ACS Chem. Biol. (accepted). (3) Niko et al, Chem. Eur. J. 2014, 20, 16473. (4) Darwich et al, RSC Adv., 2014, 4, 2014, 8481. (5) Klymchenko & Kreder Chem. Biol., 2014, 21, 97. (6) Darwich et al, MAF J. 2013, 1, 025002. (7) Darwich et al, Biochm. Biphys. Acta 2012, 1818, 3048. (8) Kucherak et al, Phys. Chem. Chem. Phys. 2012, 14, 2292.
Sondes fluorogènes pour les récepteurs membranaires:
(1) Karpenko et al, Chem. Commun., 2015, 51, 2960. (2) Karpenko et al, J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 405. (3) Karpenko, Kreder, et al, ChemBioChem, 2014, 15, 359.
Applications de sondes membranaires en collaboration: 8 articles.