Projet ANR-12-BSV8-0012 – NHEJ-complexes : Etudes structurales et fonctionnelles des complexes multi-protéiques de la voie NHEJ humaine
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8) 2012
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Jean-Baptiste Charbonnier (UMR 8221)
Partenaires : European Molecular Biology Laboratory; IHU Imagine - Institut des Maladies Génétiques; Signalisation, Noyaux et Innovations en Cancérologie; Systèmes Membranaires, Photobiologie, Stress et Détoxication
Montant : 480000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Les cassures double-brin de l'ADN (CDBs) sont parmi les lésions les plus toxiques de l'ADN. Chez les mammifères, les CDBs sont réparées principalement par la voie NHEJ (pour Non-Homologous End Joining). La voie NHEJ est également impliquée dans les processus de réarrangement des gènes des immunoglobulines et des récepteurs des cellules T, appelé recombinaison V(D)J. La voie NHEJ fait intervenir au moins sept protéines qui forment, entre elles, trois complexes multi-protéiques: le complexe de reconnaissance (Ku70/Ku80), le complexe de préparation des extrémités (DNA-PKcs/Artemis) et le complexe de ligation (LigaseIV/Xrcc4/Cernunnos). Chez l'homme, un défaut de la voie NHEJ est associé à des immunodéficiences sévères (appelées SCID). Le Partenaire 2 a identifié ces dernières années, deux protéines majeures de la voie NHEJ humaine, l'ADN nucléase Artemis et le facteur de ligation Cernunnos (appelé également XLF), en complémentant des cellules de patients SCID par des ADNc humains (Moshous, 2001, Cell; Buck, 2005, Cell). 
Les protéines du NHEJ ont fait l'objet individuellement de nombreuses études structure-fonction, notamment au travers des travaux des Partenaires 1, 2 et 3. Il apparait aujourd'hui essentiel d'étudier dans leur ensemble les complexes multi-protéiques de la voie NHEJ afin de caractériser leur mécanisme moléculaire tout au long de la réparation des CDBs. Un objectif majeur du projet est la production des trois complexes de la voie NHEJ. Ce projet s'appuiera sur l'approche MultiBac développée par le Partenaire 4 pour l'expression en cellules d'insectes de complexes multi-protéiques eucaryotes. Cette approche a été utilisée récemment avec succès pour l'étude structurale de large complexes multi-protéiques (Imasaki, 2011, Nature; Yamada, 2011, Nature). Parmi les protéines du NHEJ devant être produites, DNA-PKcs est la cible la plus ambitieuse avec 4128 acides aminés, ce qui en fait la plus grande kinase humaine connue. Des protéines de cette taille (dynein 520kDa, NF1 320kDa, Smg1 400kDa) ont récemment été produites avec succès par l'approche MultiBac (Bieniossek, 2011, TIBS). Le second objectif du projet est l'étude structurale et fonctionnelle des complexes du NHEJ purifiés au cours de ce projet ou déjà purifiés pour certains d'entre eux par le Partenaire 1. 
Le projet intégrera de nombreuses approches complémentaires: (i) cristallographie et SAXS (Partenaire 1), (ii) microscopie électronique et à force atomique (Partenaire 3), (iii) mesures in vivo et in vitro de réparation de l'ADN (Partenaire 2) et enfin (iv) méthodes avancées de production des complexes multiprotéiques (Partenaire 4). Le projet s'appuiera sur une collaboration de longue date entre les Partenaires 1 et 2 sur le complexe de ligation du NHEJ humain (Malivert, 2010, J Biol Chem). Cette collaboration s'est étendue récemment au Partenaire 3 dans le cadre de l'étude structurale du complexe Xrcc4/Cernunnos par cristallographie et microscopie électronique. Ces travaux ont permis de mettre en évidence un arrangement en filaments du complexe Xrcc4/Cernunnos (Ropars, 2011, PNAS). 
L'objectif est aujourd'hui d'étudier la structure à haute résolution du complexe entier de ligation, LigIV/Xrcc4/Cernunnos et d'étendre progressivement nos études sur les autres complexes de la voie NHEJ. Notre consortium possède tous les outils et les expertises nécessaires pour aborder les questions ambitieuses proposées. La retombée principale attendue pour ce projet est une description précise sur le mécanisme moléculaire des complexes multi-protéiques du NHEJ. Ce projet répond également à des enjeux sociétaux importants car la réparation des CDBs est une voie majeure de résistance de certaines cellules tumorales aux chimio- et radio-thérapies classiques (Friesen, 2008, Mol Biol Cell). Notre projet permettra à terme de développer de nouvelles classes d'inhibiteurs de la voie NHEJ et d'augmenter significativement l’efficacité de traitements anti-cancer.