Projet ANR-10-BLAN-1306 – DYN-FHAC : La Sécrétion à Deux Partenaires chez les bactéries : dynamique conformationnelle du transporteur FhaC.
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Microbiologie, immunologie, infectiosité (Blanc SVSE 3)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Françoise JACOB-DUBUISSON (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE - DELEGATION DE LILLE)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Laboratoire de Spectrochimie Infrarouge et Raman; Institut de Biologie Structurale; Centre d'Infection et d'Immunité de Lille
Montant : 450000.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Etude de la dynamique conformationnelle du transporteur FhaCTransport de l’adhésine FHA, facteur de virulence de l’agent de la coqueluche Bordetella pertussis, à travers la membrane externe de la bactérie: compréhension des mécanismes moléculaires de cette voie de sécrétion protéique sur base de la structure cristallographique du transporteur FhaC.
FhaC, modèle des transporteurs de la superfamille Omp85La voie de sécrétion à deux partenaires (voie TPS) est très répandue chez les bactéries à Gram négatif dont plusieurs pathogènes importants. Les transporteurs ‘TpsB’ dont fait partie FhaC appartiennent à une superfamille de transporteurs de protéines ubiquitaires dans le monde vivant, la famille Omp85. La structure du transporteur FhaC sert de paradigme pour cette superfamille. La compréhension des mécanismes de ce mode de transport pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches anti-bactériennes.
Combinaison d’approches biochimiques et biophysiques pour étudier la dynamique de FhaCFhaC comporte un canal dans la membrane externe et deux domaines périplasmiques. Pour étudier les changements de conformation permettant l’ouverture du canal nous utilisons des approches biophysiques donnant accès à la structure en solution de FhaC et à la mobilité de ses éléments structuraux. Nous déterminons aussi comment FHA et FhaC interagissent. Enfin nous caractérisons les structures aux rayons X d’homologues de ces deux protéines.
Résumé de la soumission : Les bactéries, en particulier pathogènes, sécrètent des enzymes, toxines, adhésines etc. leur permettant d’interagir de façon optimale avec leur environnement. Chez les bactéries à Gram négatif, la présence de la membrane externe a nécessité la mise en place de divers systèmes spécifiques pour l’adressage correct de ces protéines. L’importance des phénomènes de sécrétion protéique chez les bactéries justifie l’intérêt porté à ces systèmes, tant d’un point de vue fondamental que comme cibles thérapeutiques potentielles. La voie de sécrétion à deux partenaires (voie TPS) est largement répandue chez les bactéries à Gram négatif, dont chez d’importants pathogènes comme Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis ou Pseudomonas aeruginosa et dédiée à la sécrétion d’adhésines et cytolysines de grande taille adoptant un repliement en hélice beta. Les deux partenaires de ces systèmes sont la protéine sécrétée TpsA, qui porte un domaine N-terminal TPS conservé essentiel à la sécrétion et son transporteur spécifique TpsB qui forme un canal dans la membrane externe. Nous utilisons le système de sécrétion de l’adhésine FHA de B. pertussis par son transporteur FhaC comme modèle de la voie TPS. FHA est un facteur de virulence important de ce pathogène. FhaC fait partie de la superfamille TpsB/Omp85, qui comprend aussi des transporteurs de protéines mitochondriaux et chloroplastiques essentiels. Notre système représente donc aussi un modèle pour le fonctionnement de toute la superfamille.Nous avons obtenu en 2007 la structure cristallographique de FhaC, qui reste aujourd’hui la seule dans la superfamille. FhaC forme un tonneau beta transmembranaire à 16 brins, précédé d’un domaine périplasmique soluble composé de deux domaines POTRA. De larges boucles extracellulaires et de courts coudes périplasmiques joignent les brins anti parallèles du tonneau. Le pore du tonneau est obstrué par une longue hélice alpha (H1) et une boucle extracellulaire repliée à l’intérieur du tonneau (L6). H1 forme le N terminus de FhaC et est suivie d’un linker périplasmique qui la joint au 1er POTRA. Nous avons montré l’importance fonctionnelle des deux POTRA pour la reconnaissance moléculaire du domaine TPS de FHA, ainsi que celles de L6 et du linker pour l’activité de FhaC. Notre modèle basé sur de nombreux résultats expérimentaux obtenus ces dernières années est le suivant. Après l’export Sec-dépendant de FHA à travers la membrane plasmique, le domaine TPS interagit en conformation étendue avec les POTRAs de FhaC. Ceci déclencherait l’ouverture du pore, permettant la translocation de la FHA en conformation étendue à travers la membrane externe, suive de son repliement progressif à la surface de la bactérie. La structure X de FhaC serait donc la forme au repos du transporteur, qui doit subir des changements conformationnnels lors de la translocation de FHA, comme la sortie de H1 et/ou L6 hors du pore.La structure de FhaC et notre expérience du système fondent notre projet de déchiffrer à l’échelle moléculaire la dynamique de FhaC au cours du cycle de sécrétion. Nous voulons combiner des approches structurales en solution (SANS) et par radiocristallographie avec des approches biochimique de cross-linking et biophysique de résonance paramagnétique électronique, pour appréhender les changements de conformation de FhaC en cours du cycle de sécrétion et obtenir une vue de FhaC en action. Plus spécifiquement, nous voulons analyser la dynamique des divers éléments structuraux de FhaC (POTRAs, H1, linker, L6, autres boucles de surface) dans les formes au repos et en action du transporteur. Nous voulons établir le chemin de translocation de FHA dans FhaC en établissant ses interactions avec ces éléments. Nous voulons obtenir la structure d’une forme en action de FhaC grâce à l’isolement d'un complexe ‘bloqué’ entre FhaC et une protéine chimérique comprenant une portion N-terminale sécrétable de la FHA suivie d’un domaine globulaire incompatible avec la sécrétion.
Résultats : Grâce à des approches multidisciplinaires et à plusieurs niveaux (sur la protéine purifiée, dans des bactéries entières et par modélisation in silico), nous avons mis en évidence que le transporteur FhaC a une conformation très dynamique, particulièrement dans son environnement naturel membranaire. Des changements de conformation importants se produisent lors du transport de la FHA.
Perspectives : Un de nos objectifs actuels est de mettre au point avec FhaC une méthode biophysique sophistiquée,  la résonance paramagnétique pulsée, pour mesurer des distances au sein de la protéine afin de confirmer et d’affiner nos résultats. Nous combinerons aussi ces approches avec des modélisations in silico grâce à l’implication depuis peu d’un spéclaliste de ces approches dans notre consortium.
Publications et brevets : Nous avons publié en 2011 deux articles, l’un sur la reconnaissance entre FHA et FhaC, et l’autre sur le rôle d’un chaperon moléculaire, DegP, dans la voie TPS. En collaboration avec un groupe allemand qui étudie aussi la voie TPS nous avons publié un article en 2012 sur la reconstitution du système FHA/FhaC in vitro. En collaboration avec un groupe belge, nous avons soumis pour publication un travail sur le repliement de la FHA lors de sa sécrétion.