Projet ANR-14-CE09-0003 – ESCRTfission : Mécanique de fission membranaire induite par  ESCRT-III
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401) 2014
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Monsieur Winfried Weissenhorn (institut de biologie structurale)
Partenaires : Institut Curie; Laboratoire public; Institut de Biologie Structurale
Montant : 398307.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 48 mois
Résumé : Le complexe ESCRT -III ("Endosomal sorting complex required for transport III") est recruté au cours de la formation des corps multivésiculaires,  de la cytocinèse et du bourgeonnement de certains virus enveloppés, pour catalyser l'étape finale de fission de la membrane. Celle-ci  est commune à ces  processus essentiels cellulaires et pathologiques, en apparence très distincts. Bien que notre groupe et d'autres aient proposé des modèles de fission membranaire par les ESCRT- III, aucune expérience n'a encore permis de déterminer clairement le mécanisme de ce processus fondamental. Dans ce but, nous proposons d'associer des études structurales à haute et moyenne résolution avec des études in vitro sur des tubes de membrane tirés de vésicules unilamellaires géantes (GUVs). Nos objectifs sont: (1) résoudre la structure cristalline du dimère de CHMP3 qui sert de modèle pour l'unité de base des polymères des ESCRT-III, CHMP3-CHMP2A, (2) visualiser les polymères d'ESCRT-III in vivo au site de sortie de virus et (3) reconstituer les protéines ESCRT-III et VPS4 à l'intérieur de tubes de membrane tirés de GUVs pour comprendre le mécanique de fission. L'objectif 1 est en bonne voie car nous avons de petits cristaux et maitrisons des outils de co-cristallisation tels que les nanobodies llama VHH qui faciliteront la cristallisation. Par ailleurs, en cas de difficulté à obtenir des cristaux, nous collaborerons avec un groupe local pour résoudre la structure par RMN. Cette structure nous permettra de générer un modèle quasi-atomique des polymères CHMP3-CHMP2A sur la base de notre carte de microscopie électronique (EM) à moyenne résolution. La structure finale fournira des informations importantes sur les interactions ESCRT-III/membrane et sur la formation des polymères in vitro, deux faits qui seront testées in vivo par des approches de mutagenèse basées sur cette structure. Le deuxième objectif est de visualiser in vivo les ESCRT-III aux sites de sortie de virus par des approches innovantes de microscopie électronique. Nous combinerons les techniques les plus avancées de cryo-microscopie électronique (CEM) seule et de sections vitreuses (CEMOVIS) avec une nouvelle approche pour "geler" les  ESCRT-III aux stades finaux du bourgeonnement. Bien qu'il soit difficile de visualiser les ESCR-III in vivo, les développements récents de l'EM avec l'utilisation d'une défocalisation faible (2 à 3 uM) permettront d'imager les filaments ESCRT -III, qui ont au moins 4 nm de largeur au vu des résultats d'EM sur des polymères d'ESCRT-III assemblés in vitro. En plus d'imager le complexe ESCRT - III natif de type sauvage, notre approche nous permettra d'analyser systématiquement le diamètre du cou des bourgeons et d'obtenir ainsi des informations indirectes sur les étapes de constriction du cou. Notre 3ème objectif est de développer des méthodes nouvelles et innovantes pour reconstituer les protéines ESCRT-III et l'ATPase de type AAA VPS4 dans des nanotubes de membrane formé à partir de GUVs. Bien que difficile à reconstituer, cette configuration physiologiquement correcte est absolument nécessaire pour étudier la fonction d'ESCRT- III in vitro. Après avoir testé de nombreuses approches, nous avons mis en place un protocole pour encapsuler les ESCRT-III à l'intérieur de GUVs et tirer des nanotubes membranaires. Cela va nous permettre de déterminer la composition du système de fission minimal et d'étudier les mécanismes de constriction et de fission des membranes par les ESCRTs. Finalement, nos approches fourniront un modèle intégré de l'architecture moléculaire du complexe ESCRT-III qui sera liée à sa fonction de fission des membranes.