Projet ANR-10-BLAN-1517 – ECSTASE : Développement d’un aptacapteur avec amplification électro-catalytique pour la détection sensible et énantiosélective de drogues amphétaminiques
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Benoît LIMOGES (CNRS - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS B)
Partenaires : Interfaces, Traitements, Organisation et Dynamique des Systèmes; Laboratoire d'Électrochimie Moléculaire; Acides Nucléiques : Régulations Naturelles et Artificielles; Département de Pharmacochimie Moléculaire; Institut d'Imagerie Biomédicale
Montant : 700186.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Développement d’un aptacapteur avec amplification électro-catalytique pour la détection sensible et énantiosélective de drogues amphétaminiquesMise au point de systèmes analytiques capables de déterminer avec précision la composition de drogues de synthèse dérivées de la famille des amphétamines.
Détecter rapidement, simplement et efficacement les drogues amphétaminiques sur le terrain : un enjeu sociétal d’actualitéA l’heure actuelle, les méthodes de dépistage des amphétamines et de ses métabolites associés sont réalisées sur des échantillons urinaires. Elles reposent majoritairement sur des tests immunochimiques qualitatifs rapides, mettant en jeux une mesure généralement colorimétrique (voire même tout simplement visuelle dans le cas par exemple de la formation d’une réaction colorée sur une bandelette) de l’activité d’un marqueur enzymatique selon un format du type EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique) ou immuno-chromatographique par compétition. La confirmation des résultats positifs se fait généralement ultérieurement par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Le projet a pour objectif de remplacer les anticorps par des aptamères possédant des propriétés de reconnaissance énantiosélectives vis-à-vis de dérivés amphétaminiques, et de substituer la mesure optique d’un marqueur enzymatique par une détection électrochimique d’un marqueur redox fonctionnant selon un principe de type interrupteur « on/off » avec amplification électrocatalytique. Par ailleurs, à travers cette approche, nous visons la possibilité de fournir un dispositif analytique de type biocapteur, ou l’ensemble des éléments nécessaires à la détection fait partie intégrante du dispositif, sans qu’il soit nécessaire d’ajouter un réactif supplémentaire dans l’échantillon à analyser. L’idée à terme est de pouvoir disposer d’un outil analytique qui soit simple, rapide, sensible, éventuellement portatif, et capable de réaliser une quantification énantiosélective de plusieurs dérivés amphétaminiques dans un même échantillon.
Combinaison de méthodes pour le design de l’aptacapteur électrochimiqueL’objectif est de mieux comprendre et de rationaliser l’ensemble des phénomènes intervenant sur le principe de détection électrochimique et donc, indirectement, sur les performances analytiques de l’aptacapteur en utilisant plusieurs techniques allant du SELEX, au marquage chimique d’acides nucléiques par des composés redox, en passant par la fonctionnalisation de surfaces conductrices jusqu’à la modélisation des processus physico-chimiques aux interfaces.
Résumé de la soumission : Le dépistage rapide d’une intoxication aux drogues amphétaminiques est devenu un enjeu majeur de santé public en raison de leur consommation illicite de plus en plus courante et banalisée. A l’heure actuelle, le dépistage est réalisé à l’aide de tests immunochimiques qualitatifs rapides. Cependant ces tests posent de sérieux problèmes de spécificité et sensibilité. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux outils analytiques aux performances, en termes de sélectivité et sensibilité, bien supérieures aux tests d’immunodétection existants. Pour aller dans cette direction, nous envisageons de remplacer les anticorps par des aptamères possédant des propriétés de reconnaissance énantiosélectives vis-à-vis de dérivés amphétaminiques, et de substituer la mesure optique d’un marqueur enzymatique par une détection électrochimique d’un marqueur redox fonctionnant selon un principe de type interrupteur « on/off » avec amplification électrocatalytique. A travers cette approche, nous visons la possibilité de fournir un dispositif analytique de type biocapteur qui soit simple d’utilisation, rapide, sensible, éventuellement portatif, et ou l’ensemble des éléments nécessaires à la détection fera partie intégrante du dispositif, sans qu’il soit nécessaire d’ajouter un réactif supplémentaire dans l’échantillon à analyser. Nous envisageons même une quantification énantiosélective de dérivés amphétaminiques ou métamphétaminiques, directement sur des échantillons biologiques non dilués. Pour l’instant, aucun exemple d’aptacapteur amphétaminique n’a été décrit, ni même d’aptacapteur électrochimique possédant des propriétés énantiosélectives. D’autre part, parmi les différents grands principes d’aptacapteurs électrochimiques existants, et notamment ceux reposant sur un marqueur redox permettant le suivi d’une réorganisation structurale de l’aptamère avec sa cible, aucun n’a été envisagé avec amplification par catalyse redox comme nous le proposons. Cette stratégie d’amplification est l’un des points fort du projet puisqu’elle devrait permettre d’améliorer significativement la sensibilité des systèmes existants d’un facteur 10 à 100. Pour atteindre cet objectif ambitieux, de nature pluridisciplinaire, le projet s’appuiera sur la coopération étroite entre 5 partenaires aux compétences complémentaires et répartis géographiquement sur trois sites Universitaires, l’Université Paris Diderot (Laboratoire d’Electrochimie Moléculaire LEM – UMR CNRS 7591 et ITODYS – UMR CNRS 7086), l’Université Joseph Fourier de Grenoble (Département de Chimie Moléculaire, I2BM – UMR CNRS 5250 et Département de Pharmacochimie Moléculaire DPM – UMR CNRS 5063), et l’Université Victor Segalen de Bordeaux 2 (ARN : Régulations Naturelle et Artificielle ARNA – INSERM U869). Ce projet est d’autant plus ambitieux que nous souhaitons développer un dispositif parfaitement maitrisé dont on pourra comprendre et rationaliser les paramètres clefs qui gouvernent ses performances analytiques, et ainsi prédire et optimiser sa sélectivité, sensibilité et limite de détection. Pour mener à bien le projet, il sera donc nécessaire de s’appuyer sur l’ensemble des compétences et savoir-faire apportés par chacun des partenaires. Des efforts importants devront être fait non seulement pour sélectionner des aptamères énantiospécifiques d’amphétamines et de métamphétamines grâce à des techniques combinatoires de type SELEX, mais aussi pour accéder systématiquement aux constantes thermodynamiques et cinétiques de reconnaissance biomoléculaire des aptamères vis-à-vis de leur cible, et ce en phase homogène comme en phase immobilisée. Ces données seront très utiles pour mieux comprendre les conséquences de l’immobilisation sur les propriétés de reconnaissance et d’affinité de l’aptamère, et l’éventuelle nécessité de jouer sur la nature du lien permettant l’accrochage de l’aptamère à la surface de l’électrode.
Résultats : Dans sa phase préliminaire, les partenaires du projet se sont attachés à décrire le phénomène de reconnaissance molécule chirale/aptamère, tant d’un point de vue cinétique que thermodynamique en couplant plusieurs techniques telles que la polarisation de fluorescence, l’électrochimie ou encore l’électrophorèse capillaire. Outre les nombreuses informations obtenues, ce travail a conduit, pour la première fois, à la mise au point d’une méthode de mesure d’excès énantiomérique (ee) par électrochimie conciliant simplicité, rapidité, versatilité (transférable à tous les analytes pour lesquels la séquence aptamère est connue) et haute sélectivité (mesure d’ee<0,1%).
Parallèlement, l’étude de la reconnaissance moléculaire pour un brin d’aptamère immobilisée a été initiée en utilisant de puissantes méthodes d’analyse telles que la résonnance de plasmon de surface et la microbalance à quartz couplée à l’électrochimie. Ces résultats ont permis d’appréhender l’influence de l’immobilisation de la sonde aptamère sur ses propriétés de reconnaissance et serviront directement au design de l’aptacapteur électrochimique
Perspectives : L’approche consistant à étudier un même phénomène, la reconnaissance moléculaire entre la cible et son aptamère, sous différents angles permettra d’établir de nouvelles méthodologies analytiques transférables directement à la mise au point de dispositifs de détection de petites molécules organiques chirales, enjeux analytique contemporain. A travers cette approche, nous visons la possibilité de fournir un outil analytique qui soit simple, rapide, sensible, éventuellement portatif, et capable de réaliser une quantification énantiosélective de plusieurs dérivés amphétaminiques.
Publications et brevets : Les résultats scientifiques actuels portent sur la méthode de détermination électrochimique d’excès énantiomérique (cf. illustration) suivant une approche de type échange compétitif :
Brevet international en cours d’obtention :
L. CHALLIER, C. FAVE, B. LIMOGES, D. MARCHAL, F. MAVRÉ,V. NOEL, B. SCHÖLLHORN, ELECTROCHEMICAL COMPETITIVE ASSAY AND USE THEREOF, Patent EP 12 165 696.1
Revue Internationale à comité de lecture
L. CHALLIER, , F. MAVRÉ, J. MOREAU, C. FAVE, B. SCHOLLOHRN, D. MARCHAL, E. PEYRIN, V. NOEL, B. LIMOGES, Fast and simple aptamer based electroanalytical method for the enantioselective recognition of small chiral molecules, Anal. Chem. 2012, 84 (12), pp 5415–5420.
Conférence Internationale:
J. MOREAU, C. FAVE, B. SCHÖLLHORN, L. CHALLIER, F. MAVRÉ, V. NOËL, B. LIMOGES, Fast and simple aptamer based electroanalytical method for the enantioselective recognition of small chiral molecules, ESEAC, Slovénie, 3-7 Juin 2012.
Conférence Nationale :
V. NOEL, L. CHALLIER, F. MAVRÉ, C. FAVE, D. MARCHAL, B. SCHÖLLHORN, B. LIMOGES, E. PEYRIN. Mise au point d’une méthodologie pour la détection électrochimique énantiosélective de cible chirale. Journées d’Electrochimie, Grenoble, juillet 2011.