Projet ANR-10-BLAN-1238 – CERES : Contrôle de l'expression des gènes du REseau de régulation "AFL" et développement de la graine
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Loïc LEPINIEC (INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - CENTRE DE RECHERCHE DE VERSAILLES GRIGNON)
Partenaires : Institut de Biologie des Plantes; Institut de recherche pour le développement; Institut Jean-Pierre Bourgin
Montant : 550000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 48 mois
Résumé : Contrôle du développement et de la maturation des grainesLe développement et la maturation des graines sont contrôlés par quelques facteurs clefs de régulation de la transcription. La régulation de l’expression de ces facteurs est mal connue, en particulier sa composante chromatinienne. Ce projet vise à comprendre les mécanismes impliqués.
Compréhension des mécanismes génétiques et épigénétiques qui contrôlent le développement et la maturation de la graine.Les graines représentent une source majeure pour l'alimentation humaine et animale. En tant que semences, elles déterminent le rendement de la plupart des grandes cultures. Dans ce contexte, la compréhension des mécanismes génétiques et épigénétiques contrôlant le développement de la graine et son métabolisme est donc un domaine de recherche stratégique pour l’agriculture.Chez Arabidopsis thaliana, une plante modèle très utilisée pour les analyses de génétique moléculaire, un groupe de facteurs de régulation de l’expression des gènes (transcription) nommés « AFL » (pour ABI3, FUSCA3 LEC1, LEC2) joue un rôle majeur pendant l’embryogenèse et l’accumulation des réserves. Ces gènes forment un réseau qui permet l’activation coordonnée de programmes du développement des graines. Il semble que ce réseau AFL soit en partie régulé par des mécanismes agissant au niveau de la chromatine. Ce programme vise à expliciter le rôle des modifications de la chromatine sur et avec le réseau AFL dans le contrôle du développement et de la maturation de la graine, et nécessitera le développement de nouveaux outils de biologie moléculaire adaptés à la petite taille des graines d’Arabidopsis. Les applications potentielles sont nombreuses en terme d’amélioration des plantes cultivées pour modifier la qualité et la quantité des composés de réserve (huiles, protéines ou amidon), dans les graines.
Contrôle chromatinien de l’expression des gènes du réseau de régulation « AFL »L’une des raisons expliquant le manque de données sur le régulation du réseau AFL dans la graine réside dans la petite taille et la faible accessibilité de cet organe. La méthode de choix pour caractériser in vivo le statut chromatinien, les modifications des histones ou les activités de liaison à l’ADN est l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Le projet est basé sur une adaptation de ces techniques pour les appliquer à la graine en cours de développement. Des méthodes d’étiquetage des protéines d’intérêt (protéines chimériques) seront menées, tout en gardant la fonctionnalité des protéines modifiées. La validation fonctionnelle des régulateurs/régulations sera effectuée dans des systèmes d’expression (levure, protoplastes de mousse) ou in planta, en utilisant les outils de la génétique classique et des mutants disponibles. En parallèle une analyse de l’expression des AFLs, de leurs cibles et de leurs régulateurs sera menée, par l’étude de l’accumulation des transcrits correspondant et de l’activité des promoteurs correspondant.
Résumé de la soumission : Les modifications post-traductionnelles des histones et la méthylation de l’ADN constituent la base de l'épigenome cellulaire susceptible d’évoluer et de moduler l'expression des gènes au cours du développement. Chez les plantes, il a été démontré que le remodelage de la chromatine joue un rôle crucial dans certaines phases développementales (à la floraison ou la fécondation, par exemple), par l’établissement et le maintien à travers les mitoses de profils spécifiques d’expression de gènes. Bien qu’il y ait de nombreuses évidences du rôle essentiel des modifications chromatiniennes durant la germination, peu de données sont disponibles en ce qui concerne l’importance de ces régulations lors du développement des graines. Il a été montré que le développement et la maturation des graines sont contrôlés principalement par quatre gènes régulateurs, ABI3, FUS3, LEC1 et LEC2 (collectivement appelés « AFL "). En raison de leur rôle d’activateur de la maturation des graines, il est essentiel que leur expression soit inhibée dès la germination et pendant la croissance de la plante. Des analyses génétiques ont démontré la participation de différents régulateurs dans cette répression de l'expression des gènes AFL dans les tissus végétatifs, tels que des histones déacétylase (e.g. HDA6 et 9), des protéines de type Polycomb (e.g. MEA, CLF et SWN) et différentes sous-unités de complexes de modification de la chromatine (e.g. PKL et BRM). Il s’agit maintenant de comprendre comment la phase de maturation est activée, maintenue, puis réprimée au cours du développement de la graine.Le projet CERES tentera de répondre à ces questions en étudiant comment les modifications de la chromatine régulent l’expression des gènes AFL pendant le développement de la graine d’une part, et si les AFL participent eux mêmes à des modifications de la chromatine pour contrôler leurs cibles, d’autre part. Pour cela, nous établirons tout d’abord une carte spatio-temporelle précise de l’expression des gènes AFL ainsi qu'une description de la dynamique des modifications de la chromatine aux loci AFL, durant le développement de la graine. Puisque les gènes AFL sont affectés par des marques répressives (H3K27me3) pendant la croissance végétative, nous comparerons les données obtenues en fond génétique de type sauvage et en fonds mutants affectés dans des activités de modification d'histone (e.g. hat/hdac, Jmj). Les différences nous permettront d’identifier les régulateurs impliqués et les cibles AFL affectées. De plus, comme certaines données suggèrent que les AFL pourraient également recruter des protéines de modification de la chromatine pour réguler l’expression de leurs cibles, la dynamique de la chromatine sera évaluée pour une certain nombre de ces cibles et les interactions possibles entre les régulateurs et les AFL seront étudiées. Enfin, l’analyse fonctionnelle des séquences régulatrice des 4 gènes d'AFL sera menée. Elle doit permettre d’une part de caractériser les séquences d’ADN reconnues par les régulateurs chromatiniens et, d’autre part, d’identifier de nouveaux facteurs de transcription impliqués dans le contrôle du réseau des AFL.Le projet CERES est ambitieux de part les questions biologiques qu’il aborde, le nombre de gènes dont la fonction sera étudiée, le développement de nouveaux outils adaptés à l’étude des graines et les applications potentielles pour l'amélioration des plantes. Il repose sur la collaboration entre les trois partenaires qui ont des expertises très complémentaires en ce qui concerne l'étude du contrôle de l’expression des gènes et du développement de la graine. Nous pensons que ces recherches apporteront des données importantes sur le rôle de la chromatine dans le contrôle de l'expression des gènes aux niveaux spatiaux et temporels durant le développement de la graine.
Résultats : Le projet se déroule normalement et les résultats les plus marquants ne sont attendus qu’à la fin du programme.
Nous avons cependant déjà pu mettre en évidence et caractériser une première régulation de type chromatinienne sur le promoteur du gène LEC2 et identifier une séquence régulatrice dans le promoteur de LEC2 qui est responsable de son inactivation en dehors de la graine en développement. 
Ceci permet de mieux comprendre pourquoi ce gène ne peut pas être réactivé facilement dans les parties végétatives (pour faire accumuler des réserves dans des feuilles par exemple) car son expression est lié à un « état » de différenciation du tissu végétal (graine vs feuille) et pas seulement à la fixation spécifique d’un simple activateur transcriptionnel qui serait alors plus facile de manipuler.
Perspectives : La compréhension des régulations du réseau AFL pourrait permettre de modifier les graines de plantes cultivées par des approches classiques ou « biotechnologiques ». 
Au delà de ce réseau, le développement de nouveaux outils pour l’étude de la chromatine et des interactions protéines/ADN dans la graine ouvrira la voie à des analyses exhaustives de ses  cibles « in planta » et pourra être utilisé pour l’étude d’autres réseaux plus spécifiques (accumulation des lipides, des protéines de réserve ou de métabolites secondaires). 
Par ailleurs ce projet devrait contribuer une meilleure compréhension des mécanismes de différenciation cellulaire, ce qui pourra avoir des impacts pour l’amélioration des plantes.
Publications et brevets : 1- Berger N., Dubreucq B., Roudier F., Dubos C., and Lepiniec L. (2011). Transcriptional regulation of Arabidopsis LEAFY COTYLEDON2 involves RLE, a cis-element that regulates trimethylation of histone H3 at Lys-27. Plant Cell. , 23, 11 4065-4078.
Cet article décrit la régulation de LEC2, un des AFLs, et la façon dont ce gène est réprimé dans les organes végétatifs par un mécanisme chromatinien lié à la modification post-traductionnelle d’histones positionnés au niveau du promoteur de LEC2. 
2- Berger N and Dubreucq B. (2012). Evolution goes GAGA : GAGA binding proteins across kingdoms. BBA gene regulatory mechanisms, 1819, 863-868.
Cet article est une revue montrant les similarités de certains mécanismes de régulation entre le monde animal et le monde végétal.