Projet ANR-13-LAB1-0005 – FucoChem : Laboratoire de Recherche sur les Polysaccharides Marins en Biothérapies Cardiovasculaires (LRPMBC)
Programme : Laboratoires communs organismes de recherche publics – PME/ETI (LabCom)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Cédric CHAUVIERRE (Bio-ingénierie de Polymères Cardiovasculaires)
Partenaires : Hémostase, Bio-Ingénierie et Remodelages Cardiovasculaires
Montant : 300000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : FucoChemLaboratoire de Recherche sur les Polysaccharides Marins en Biothérapie Cardiovasculaire (LabCom LRPMBC)
Valoriser les ressources marines en produisant un fucoïdane de grade Clinique pour le diagnostic et le traitement des maladies cardiovasculairesLa société Algues & Mer est un fournisseur d’un fucoïdane pour les industries cosmétiques. Elle ne dispose cependant pas des moyens nécessaires à la caractérisation, à la modification chimique, aux tests et à la validation de ce produit avec la rigueur et les exigences recommandées pour des applications à visée pharmaceutique. Algues & Mer bénéficiera de l'expertise du Laboratoire U1148 en termes de caractérisation des polysaccharides, de modifications chimiques, d’évaluation in vitro et in vivo et de développement de macromolécules naturelles pour la thérapie et le diagnostic des pathologies cardiovasculaires tout en assurant la validation du scale-up nécessaire. Un partenariat étroit entre Algues & Mer et le Laboratoire U1148 permettra d’établir les normes pour un fucoïdane de grade clinique. Le Laboratoire Commun (LabCom), intitulé «Laboratoire de Recherche sur les Polysaccharides Marins en Biothérapies Cardiovasculaires (LRPMBC)«, regroupe les compétences d’Algues & Mer et du Laboratoire U1148 pour approfondir les recherches sur ce composé, normaliser la production de lots fiables, et proposer sur le marché le premier fucoïdane à visée clinique qui servira d’étalon, sur le modèle des héparines de bas poids moléculaire. Ce LabCom LRPMBC est une étape importante pour la recherche, le développement et la production industrielle d’extraits polysaccharidiques marins bioactifs validés. La mise à disposition pour la communauté scientifique de lots de fucoïdane correctement identifiés améliorera fortement la qualité des recherches en supprimant l’incertitude actuelle sur la qualité des lots liée à la multiplicité des procédés d’extraction et de traitement, comme de fournisseurs. Ce LabCom LRPMBC établira les bases de la future exploitation du fucoïdane, puis d’autres macromolécules marines par les industries pharmaceutiques pour des approches thérapeutiques et de diagnostic dans le domaine des pathologies cardiovasculaires.
Caractérisations physico-chimiques et validation pré-clinique des fucoïdanesSix lots d’Asphy (nom de code des fucoïdanes dépolymérisés) (9486, 10056, 10116, 11026, 11363 et 12399) ont été fournis par A&M sous forme de poudre sèche atomisée.Les analyses suivantes ont été effectuées :Composition : Dosage colorimétrique des acides uroniques (étalonnage avec l’acide glucuronique – méthode de Bitter et Muir) ; dosage colorimétrique du L-fucose (méthode de Disch et Shettles, cystéine-sulfurique) ; dosage colorimétrique des sulfates (méthode de dosage développée au laboratoire basée sur la réduction des sulfates en sulfure d’hydrogène et quantification sous forme de bleu de méthylène, méthode de Gustaffson) ; analyse élémentaire ; taux d’humidité.Masse molaire : Analyse de la distribution des masses molaires par chromatographie d’exclusion stérique couplée à la diffusion de lumière et à la réfractométrie différentielle en ligne.1H-RMN : Analyse 1D et 2D à 500 MHz dans D2O.FT-IR : Analyse sous forme de pastilles de KBr (2% de produit).Les résultats précédents ont conduit à développer une stratégie de traitements physico-chimiques de l’Asphy afin d’isoler la ou les espèces macromoléculaires responsables de son activité biologique in vivo, l’élimination de ces fractions devant se faire principalement par voie urinaire.Deux techniques de purification ont donc été utilisées : la chromatographie d’échange d’ions basse pression et la précipitation des espèces polyuroniques par les cations divalents.Au final, 5 fractions ont été préparées, caractérisées et leur mode d’élimination a été examiné chez l’animal. Toutes ces fractions ont été obtenues après dialyse et lyophilisation.Deux types d’expériences ont été réalisés par scintigraphie après couplage avec le 99mTc (imagerie SPECT). Le marquage est aussi simple et efficace qu’avec le F7200 et s’effectue dans les mêmes conditions. L’injection de l’Asphy radiomarqué a été faite dans plusieurs modèles pathologiques de rat (endocardite, myocardite et ischémie-reperfusion) et sur des rats sains.
Résumé de la soumission : Les polysaccharides sont les macromolécules les plus abondantes sur terre et dans les océans. Les polysaccharides d'algues marines ont des propriétés physico-chimiques et biologiques qui sont intimement reliés à leurs structures chimiques. Parmi ceux ci, les fucoïdanes sont des polysaccharides isolés à partir d’algues brunes caractérisés par leur contenu en fucose et en esters de sulfate. Les fucoïdanes sont exploités par les industries cosmétique et agro-alimentaire dans le monde entier. Ils ont aussi un potentiel en biomédical comme par exemple des activités anticoagulantes, ainsi que la capacité à reconnaître des biomolécules liées aux processus pathologiques athérothrombotiques. Le Laboratoire de Bio-ingénierie des Polymères Cardiovasculaires (BPC) de l’Université Paris 13-Inserm développe activement des recherches sur les fucoïdanes extraits de l’algue brune Ascophyllum nodosum, ce qui a conduit à plus d’une vingtaine de publications internationales et à plusieurs brevets. Les études précliniques menées par le Laboratoire BPC ont démontré son fort potentiel pour l’imagerie des maladies cardiovasculaires.Malgré la démonstration de ces propriétés, l’exploitation des fucoïdanes par les industries pharmaceutiques pour des approches de thérapie et de diagnostic reste entravée par la variabilité de la matière première disponible sur le marché, variabilité principalement liée à une origine naturelle et aux différents procédés de traitement. Par conséquent, un besoin existe aujourd’hui d'une offre de fucoïdane aux caractéristiques structurales bien définies pour des applications cliniques.La société Algues & Mer (A&M) est un fournisseur d’un fucoïdane pour les industries cosmétique et agro-alimentaire. Elle ne dispose cependant pas des moyens nécessaires à la caractérisation, à la modification chimique, aux tests et à la validation de ce produit avec la rigueur et les exigences recommandées pour des applications à visée pharmaceutique. Alternativement, les compétences, les installations et les équipements d’A&M sont adaptés à un transfert d’échelle des procédés d’obtention d’un produit validé par le Laboratoire BPC. Ainsi A&M bénéficierait de l'expertise du Laboratoire BPC en termes de caractérisation des polysaccharides, de modifications chimiques, d’évaluation in vitro et in vivo et de développement de macromolécules naturelles pour la thérapie et le diagnostic des pathologies cardiovasculaires tout en assurant la validation du scale-up nécessaire. Enfin, les normes de référence du fucoïdane, facteurs clés pour le contrôle de la qualité et de la poursuite de son exploitation pharmaceutique, font également défaut. Le projet de Laboratoire Commun (LabCom) regroupe les compétences d’A&M et du Laboratoire BPC pour approfondir les recherches sur ce composé, normaliser la production de lots fiables, et proposer sur le marché le premier fucoïdane à visée clinique. La mise en œuvre de ce projet est une étape importante pour la recherche, le développement et la production industrielle d’extraits polysaccharidiques marins bioactifs validés. La disponibilité de lots correctement identifiés améliorera fortement la qualité des recherches en supprimant l’incertitude actuelle sur la qualité liée à la multiplicité des procédés d’extraction, de traitement, et de fournisseurs. Ce projet sera également bénéfique pour les industries agro-alimentaires et cosmétiques, qui exploitent déjà les fucoïdanes. Pour l'industrie pharmaceutique, les réalisations de ce LabCom LRPMBC seront fondamentales pour l'exploitation des propriétés du fucoïdane et son contrôle de qualité. De fait, ce projet résonne avec les demandes actuelles des organismes de réglementation des produits pharmaceutiques. Par conséquent, ce projet LabCom établira les bases de la future exploitation du fucoïdane, puis d’autres macromolécules marines par les industries pharmaceutiques pour des approches thérapeutiques et de diagnostic dans le domaine des pathologies cardiovasculaires.
Résultats : Les différents lots d’Asphy sont constitués d’un mélange d’espèces macromoléculaires de composition et structure complexes mais très proches. Dans les limites des analyses effectuées, ces lots peuvent être considérés comme identiques. Environ 30% de l’Asphy est constitué d’espèces oligosaccharidiques éliminées lors de l’étape de dialyse qui intervient après tous les traitements. Une légère dégradation est produite par le séchage par atomisation ainsi que l’ont montré quelques analyses effectuées sur le rétentat d’ultrafiltration de l’Asphy 12399 juste avant séchage. Le rendement global de préparation de fractions d’Asphy ne devrait pas dépasser 50-60% du produit atomisé.
La chromatographie d’échange d’ion a mis en évidence l’hétérogénéité structurale de l’Asphy. La dialyse permet cependant d’éliminer une grande partie de la fraction riche en acide uronique et en oses autres que le fucose. Le traitement d’Asphy par les ions calcium conduit à une fraction Asphy-Ca dont l’élimination, majoritairement urinaire, est similaire à celle du F7200, au contraire de l’Asphy brut. Ces résultats ont été validés avec plusieurs autres lots (notamment le lot 11363).
L’injection de l’Asphy radiomarqué dans plusieurs modèles pathologiques de rat (endocardite, myocardite et ischémie-reperfusion) indique un comportement similaire à celui du F7200.
L’injection de l’Asphy radiomarqué dans des rats sains et l’examen de la biodistribution par imagerie SPECT indiquent que l’Asphy est principalement éliminé par voie hépato-splénique au contraire du F7200 éliminé majoritairement par voie urinaire.
Perspectives : Le procédé d’obtention de l’Asphy développé par Algues et Mer permet la production de lots reproductibles offrant la garantie d’études postérieures fiables. A l’instar du F7200, l’Asphy marqué directement au 99mTc permet d’identifier des régions vasculaires pathologiques dans des modèles animaux par imagerie SPECT, bien que son mode d’élimination soit principalement hépato-splénique. Un protocole de post-traitement de l’Asphy a été développé qui permet d’isoler avec un rendement de 50% une fraction polysaccharidique Asphy-Ca dont l’élimination est similaire à celle du F7200. Il reste à valider in vivo la capacité diagnostique de cette fraction.
Perspectives :
?	Etablir la relation structure-fonction entre l’Asphy et la P-sélectine.
?	Isoler et caractériser complètement les structures responsables de l’activité.
?	Développer des protocoles de préparation transférables à l’échelle industrielle.
?	Produire un lot de grade clinique.
?	Etablir et optimiser des modifications chimiques de la fraction retenue.
Publications et brevets : Pierre Saboural, Frédéric Chaubet, François Rouzet, Faisal Al-Shoukr, Rana Ben Azzouna, Nadia Bouchemal, Luc Picton, Liliane Louedec, Murielle Maire, Lydia Rolland, Guy Potier, Dominique Le Guludec, Didier Letourneur and Cédric Chauvierre
Purification of a low molecular weight fucoidan for SPECT molecular imaging of myocardial infarction
Mar. Drugs 2014, 12 (9), 4851-4867