Projet ANR-07-MIME-0021 – ROSETTE : Analyses sérologiques, fonctionnelles et structurales des facteurs de virulence, PfEMP1, impliqués dans le rosetting et l'auto-agglutinantion
Programme : Microbiologie, immunologie et maladies émergentes (MIME) 2007
Année de financement : 2007
Coordinateur du projet : INSTITUT PASTEUR (INSTITUT PASTEUR)
Partenaires : Institut Pasteur; Institut Pasteur
Montant : 300000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Ce projet vise à caractériser une adhésine PfEMP1 impliquée dans le rosetting et l'auto-agglutination, phénomènes associés au paludisme grave. L'analyse des propriétés antigéniques et fonctionnelles permettra de mieux comprendre le rôle des réponses immunes dans la protection contre le paludisme et formera la base d'une stratégie rationnelle d'intervention. 
Ce projet comprend
(i) l'expression de domaines recombinants pour la totalité de la région extracellulaire de la protéine PfEMP1-varO;
(ii) l'analyse de l'acquisition de la séroréactivité contre les parasites et contre les domaines recombinants dans des populations Sénégalaises; 
(iii) la production d'anticorps (monoclonaux et polyclonaux) pour étudier le rosetting et l'auto-agglutination chez les patients impaludés;
(iv) l'identification des récepteurs de l'hôte impliqués dans le rosetting et l'auto-agglutination; 
(v) la détermination de la structure des domaines de liaison par des techniques de cristallographie aux rayons X.
//i) Production de domaines PfMEP1 varO recombinants solubles, de leurs mutants et de deux domaines de rosetting d'autres adhésines PfEMP1. Nous comparerons les domaines produits en baculovirus, Pichia pastoris et Escherichia coli pour déterminer le meilleur système pour procéder à la mutagenèse et produire les domaines mutants.
(ii) Production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux (mAb) contre les domaines recombinants. Les mAbs réagissant avec la surface des globules rouges infectés par les parasites varO seront sélectionnés. Ceux dissociant les rosettes ou les auto-agglutinats seront utilisés pour caractériser les sites de liaison au(x) récepteur(s). 
(iii) L'analyse immunologique sera réalisée dans deux populations sénégalaises recrutées dans un suivi longitudinal de cohorte. Nous explorerons l'acquisition des anticorps contre la surface des parasites et les domaines recombinants, leur capacité à dissocier rosettes ou auto-agglutinats, la réactivité croisée, les classes et sous-classes d'anticorps et la corrélation avec la protection. Ceci permettra de préciser la relation entre adhésines médiant le rosetting et entre reconnaissance contre l'un ou l'autre domaine et reconnaissance de la surface des parasites.
(iv) L'identification du ou des récepteurs impliqués dans le rosetting et l'auto-agglutination sera réalisée avec des approches biochimiques et protéomiques: purification et caractérisation de la glycoprotéine sérique impliquée; cross-linking de PfEMP1 varO ou des domaines recombinants au récepteur et au globule rouge puis purification des complexes par affinité sur les mAbs ou via le His-tag. En parallèle nous sonderons des microarrays de protéines et de glycanes avec les domaines recombinants marqués.
(v) Analyse structurale des domaines de varO, et de leur interaction avec des mAbs inhibant ou non la cytoadhérence. L'approche employée sera la cristallographie aux rayons X.
//L'ensemble des travaux proposés devrait apporter une description fine du rôle de PfEMP1 dans le rosetting et l'auto-agglutination. Ces données serviront à formuler  une stratégie rationnelle d'intervention visant à prévenir ou traiter le paludisme grave.  Résultats attendus:
Protocoles pour l'expression et la purification de domaines PfEMP1 solubles, homogènes et correctement repliés;
Définition structurale des sites de liaison de varO impliqués dans le rosetting et l'auto-agglutination;
Identification des récepteurs de l'hôte impliqués;
Corrélats structuraux de la protection immune;
Caractérisation des conditions d'acquisition des anticorps anti-rosetting et anti-auto-agglutination en zone d'endémie;
Réaction croisée entre diverses adhésines impliquées dans le rosetting;
Optimisation de domaines recombinants pour des études pré-cliniques;
Exploitation de données structurales domaines varO pour le design d'inhibiteurs solubles du rosetting ou auto-agglutination.