Projet ANR-11-JSV6-0003 – HexpanD : Mécanismes de l'instabilité des expansions de trinucléotides CAG dans la maladie de Huntington
Programme : JCJC - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (JCJC SVSE 6)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Karine Merienne (CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE - CERBM)
Partenaires : Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire
Montant : 239000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : L’instabilité des mutations à triplets : application à la maladie de HuntingtonUne vingtaine de maladies génétiques, comme la maladie de Huntington, résulte de l’expansion de répétitions de trinucléotides dans certaines régions du génome. Ces expansions sont instables dans les cellules des patients, ce qui accélère la progression de la maladie. Le mécanisme d’instabilité des expansions est mal connu et fait l’objet des nos recherches.
Mécanismes de l’instabilité des expansions de trinucléotides : lien avec les maladies associéesL’objectif du projet est de préciser les mécanismes responsables de l’instabilité des expansions de trinucléotides CAG/CTG impliquées dans plusieurs maladies neurodégénératives, dont la maladie de Huntington (MH). L’instabilité de la mutation conduit à une augmentation de la taille de l’expansion dans certains tissus. Dans la MH, le striatum dans le cerveau présente la plus grande instabilité CAG/CTG ; c’est  aussi le tissu qui dégénère préférentiellement. Il résulte de cette coïncidence une accélération de la progression de la maladie. A l’aide d’approches in vitro et in vivo (utilisation de souris modèles de la MH par exemple), nous cherchons à comprendre les ressorts moléculaires de la spécificité tissulaire de l’instabilité des expansions CAG/CTG dans la MH. Dans ce but, nous nous intéressons à la relation entre réparation de l’ADN par excision de base et instabilité des expansions CAG/CTG, qui nécessite d’être clarifiée. Nous nous intéressons aussi au rôle des mécanismes épigénétique et transcriptionnel dans l’instabilité des expansions CAG/CTG, dont l’importance in vivo reste à démontrer. Nous cherchons à déterminer si facteurs de réparation de l’ADN, transcriptionnels et/ou épigénétiques, régulés de manière tissue-spécifique, contribuent à la sélectivité tissulaire de l’instabilité des expansions de trinucléotides dans la MH. De tels facteurs pourraient constituer des cibles thérapeutiques.
L’utilisation combinée d’approches in vitro et in vivo (modèles souris)Nous utilisons des modèles murins de la MH récapitulant la sélectivité tissulaire de l’instabilité des expansions CAG/CTG observée chez les patients. Cela nous permet de corréler les caractéristiques moléculaires des tissus en fonction de leurs degrés d’instabilité, et d’identifier des facteurs susceptibles de jouer un rôle dans le mécanisme d’instabilité. Nous nous intéressons à des tissus présentant une forte instabilité (comme le striatum dans le cerveau) et, au contraire, une instabilité minimale (comme le cervelet). Dans le cas de l’étude de la réparation par excision de base (BER), la concentration des enzymes du BER dans ces deux tissus est déterminée au niveau molaire. Les stoechiométries résultantes sont utilisées dans des tests de réparation de l’ADN in vitro, utilisant des enzymes recombinantes et des oligonucléotides portant un dommage à l’ADN dans une séquence contenant des répétitions CAG ou CTG. Cette approche, combinant méthodes in vivo et in vitro permet de préciser l’effet de la stoechiométrie des enzymes du BER sur la réparation de répétitions CAG/CTG et de déterminer les facteurs critiques. Dans le cas de l’étude des mécanismes épigénétiques et transcriptionnels, des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, de western-blot et des études d’expression sont réalisées à partir des tissus des souris modèles de la MH, afin d’établir des corrélations entre structure de la chromatine, transcription et niveau d’instabilité des répétitions CAG dans les tissus, et d’identifier des facteurs épigénétiques ou transcriptionnels régulés de manière tissu-spécifique. A l’aide d’expérience d’invalidation dans la souris (utilisation de souris knockout ou de shRNA délivrés par des AAV recombinants), il est ensuite possible de valider le rôle des facteurs identifiés dans le mécanisme d'instabilité.
Résumé de la soumission : Les désordres associés à des répétitions trinucléotidiques (TNR) constituent une classe d’une quinzaine de maladies génétiques neurologiques, neurodégénératives et neuromusculaires. La mutation, une expansion aberrante de TNR, est instable dans les cellules germinales et somatiques, entrainant une augmentation de la taille de l’expansion entre générations successives et au sein des tissus des patients avec le temps. La maladie de Huntington (MH), l’une des plus fréquentes de ces maladies, est une maladie fatale causée par une expansion de triplets CAG dans la partie codante du gène Huntingtine (CTG sur le brin opposé). La mutation entraine la production d’une protéine contenant une expansion de polyglutamine neurotoxique, avec une toxicité proportionnelle à la taille de l’expansion. Les conséquences cliniques de l’instabilité de l’expansion sont délétères dans la MH. L’instabilité germinale est responsable du phénomène d’anticipation, correspondant à une aggravation des symptômes au fil des générations. L’instabilité somatique qui varie d’un tissu à un autre affecte principalement le striatum, la région du cerveau dégénérant préférentiellement. Ainsi, des protéines de toxicité croissante avec le temps sont produites dans le striatum, accélérant la progression de la maladie. Supprimer ou limiter l’instabilité des expansions CAG/CTG pourrait donc être bénéfique, mais nécessite de mieux comprendre le processus d’instabilité. Les modèles d’instabilité des TNR impliquent la formation de structures secondaires stables de l’ADN. Leur prise en charge erronée par les mécanismes associés aux physiologies de l’ADN/ARN, comme la réparation de l’ADN ou la transcription, entrainerait l’instabilité. Cependant, les mécanismes exacts restent hypothétiques. De plus, l’instabilité des TNR semble soumise à une régulation épigénétique, dont les mécanismes sont énigmatiques. L’objectif de ce programme est double. Premièrement, il s’agit de clarifier le rôle de la réparation de l’ADN par excision de base (BER) dans l’instabilité somatique des expansions CAG/CTG, et d’étendre une étude que nous avons récemment initiée qui suggère que la stœchiométrie des enzymes du BER contribue à la sélectivité tissulaire de l’instabilité somatique dans la MH. Nous examinerons cette hypothèse par une approche in vitro. Nous déterminerons l’efficacité et le mode de réparation d’une lésion portée par un substrat oligonucléotidique ou plasmidique contenant des répétitions CAG/CTG, en présence de cocktails de protéines recombinantes du BER de stœchiométries variables. Deuxièmement, nous voulons clarifier le rôle des mécanismes transcriptionnels et épigénétiques dans l’instabilité des expansions CAG/CTG dans la MH. Dans ce but, i) nous comparerons la structure chromatinienne et l’activité transcriptionnelle au niveau du locus Huntington entre les modèles murins Huntington R6/1 et R6/2. Le même transgène est exprimé par ces deux lignées, mais il est intégré dans des régions différentes du génome. Ces lignées qui montrent des niveaux d’instabilité somatique différents représentent donc d’excellents modèles pour examiner le rôle du contexte chromatinien sur l’instabilité. ii) Nous étudierons le rôle des mécanismes épigénétiques à partir de cellules et tissus Huntington. En particulier, nous rechercherons la présence d’éléments régulateurs en cis. iii) Nous traiterons des cellules ou souris Huntington avec des inhibiteurs de HDACs. Ces composés qui modifient la chromatine pourraient accroître l’instabilité des expansions CAG/CTG. Par ailleurs, les inhibiteurs de HDACs étant actuellement utilisés dans des essais cliniques Huntington de phase II, il est essentiel de déterminer leur effet sur l’instabilité. Au final, ce programme doit clarifier les contributions du BER, de la transcription et des mécanismes épigénétiques dans l’instabilité des expansions CAG/CTG dans la MH.
Résultats : Nous avons montré que les enzymes du BER sont globalement plus abondantes dans le cervelet comparé au striatum. En conséquence, la réparation de dommages à l’ADN situés sur des séquences CAG/CTG est plus efficace quand la stoechiométrie des enzymes du BER dans le cervelet est utilisée. Nous avons montré que cette plus grande efficacité résulte d’un meilleur processing des produits de réparation intermédiaires. De plus, nous avons montré que la séquence nucléotidique et la position du dommage au sein de séquences répétées CAG ou CTG ont aussi un effet sur la réparation. Elles augmentent ou diminuent la probabilité de former une structure secondaire stable, ce qui affecte le processing des produits de réparation intermédiaires. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que la stoechiométrie des enzymes du BER peut contribuer à la spécificité tissulaire de l’instabilité des expansions CAG/CTG dans la maladie de Huntington en augmentant, dans certains tissus comme le striatum, la probabilité de formation de produits intermédiaires mal réparés et de structures secondaires de l’ADN stables, que l’on sait favoriser l’instabilité.
Perspectives : Le BER est un mécanisme de réparation de l’ADN spécialisé dans l’élimination des dommages oxydants à l’ADN. Diminuer la quantité de dommages oxydants à l’ADN pourrait ainsi permettre de limiter l’instabilité des expansions CAG associée au BER, voire la progression de la maladie. Par ailleurs, d’autres mécanismes de réparation de l’ADN sont impliqués dans l’instabilité des expansions CAG/CTG comme la réparation des mésappariements (MMR) ou la réparation par excision de nucléotide (NER). Il reste à déterminer si ces différents mécanismes modulent de façon synergique ou indépendante l’instabilité des expansions CAG/CTG dans les tissus.
Publications et brevets : Nucleotide sequence, DNA damage location and protein stoichiometry influence base excision repair outcome at disease-associated CAG/CTG repeats. Agathi-Vasiliki Goula 1, Christopher E. Pearson 2,3 Julie Della Maria4, Alan E. Tomkinson 4, David M. Wilson III 5, Karine Merienne 1. Biochemistry, 51(18) :3919-32.
Cette publication largement collaborative répond à un des objectifs du projet ANR, qui est de préciser le rôle de la réparation par excision de base dans l’instabilité des expansions CAG/CTG. Elle a pu être finalisée grâce au financement ANR.