Projet ANR-10-JCJC-1501 – ARCHPOL : ADN polymérases et acides nucléiques endommagés chez les archaea: Maintenance génomique et Biotechnologie
Programme : JCJC : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (JCJC SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Ghislaine HENNEKE (INSTITUT FRANCAIS DE RECHERCHE POUR L'EXPLOITATION DE LA MER (IFREMER))
Partenaires : Institut français de recherche pour l'exploitation de la mer
Montant : 280200.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Synthèse de l’ADN à haute températureIsoler et caractériser des ADN polymérases thermostables en présence de lésions génomiques chez l’archaea hyperthermophile, P. abyssi. Examiner les mécanismes conventionnels ou non conventionnels de maintenance génomique dans les environnements extrêmes.
Identifier et caractériser de nouvelles activités polymérasiques chez les archaea hyperthermophiles en présence d’acides nucléiques endommagés.ARCHPOL a pour objectif d’identifier le spectre des dommages des acides nucléiques susceptibles d’être générés dans l’ADN de P. abyssi en réponse ou non à des agressions génotoxiques. L’identification et la quantification des dommages concernent l’ADN génomique et ses précurseurs. De la même façon, il est prévu de capturer de nouvelles activités polymérasiques induites ou non par un stress. Cet objectif est motivé par l’absence de polymérases spécialisées et du nombre limité d’ADN polymérases conventionnelles dans le génome de P. abyssi. Le comportement de ces nouvelles ADN polymérases ainsi que celles conventionnelles (familles B et D) en présence de dommages sera étudié. Ainsi, ARCHPOL permet d’appréhender les questions de tolérance aux dommages dans les environnements extrêmes via le concept de diversité fonctionnelle des ADN polymérases thermostables. Outre l’aspect fondamental que comporte ce projet, il intègre également la composante biotechnologique. L’obtention d’ADN polymérases thermostables capables d’amplifier par PCR de l’ADN endommagé correspond à une demande récurrente en recherche clinique et biologique, ou encore en paléontologie et criminologie. Ainsi, l’enjeu d’ARCHPOL est d’abonder le répertoire de telles enzymes, étant donné que la seule ADN polymérase thermostable disponible au catalogue possède un spectre de lésions réduit.
Identification de nouvelles activités polymérasiques et des acides nucléiques endommagés.Le bioréacteur gaz-lift permet de cultiver P. abyssi en continu. La biomasse obtenue est utilisée pour identifier les acides nucléiques endommagés et pour détecter les activités polymérasiques. La détection des dommages s’effectue par chromatographique HPLC-UV couplé à l’électrochimie ou la spectrométrie de masse. La capture des ADN polymérases comprend les techniques d’immunodéplétion, de séparation par affinité et de gels d’activités.
Résumé de la soumission : ARCHPOL a pour objectif d’identifier et de caractériser de nouvelles activités polymérasiques chez les archaea hyperthermophiles en présence d’acides nucléiques endommagés. Ce projet est motivé par l’absence d’ADN polymérases spécialisées et du nombre limité d’ADN polymérases conventionnelles dans le génome de la souche référent hyperthermophile, P. abyssi, posant la question ambitieuse de la tolérance aux dommages dans les environnements extrêmes. Même si P. abyssi semble disposer de mécanismes efficaces de réparation du génome, certaines lésions persistent. Très récemment, Palud. A et al ont publié que les ADN polymerases de P. abyssi possédaient des caractéristiques particulières pour faire face aux lésions persistantes dans le génome. Ainsi, ARCHPOL va permettre d’appréhender le concept de diversité fonctionnelle des ADN polymérases réplicatives ou encore d’isoler de nouvelles activités polymérasiques induites par les conditions extrêmes. La voie de la synthèse translésionnelle et, plus largement, les stratégies de survie cellulaire développées par ce microorganisme seront interprétés et intégrés à la maintenance génomique des êtres vivants.ARCHPOL prévoit de lister la diversité des lésions susceptibles d’être générées dans l’ADN en réponse ou non à des agressions génotoxiques (variations de pH, de température, stress oxydant…) et l’identification des acides nucléiques endommagés concernera les modifications chimiques de l’ADN génomique et celles des précurseurs. Des techniques de pointe, sollicitant un savoir-faire exclusif, e.g, le bioréacteur « gaz-lift » ou encore la chromatographie HPLC-UV-EC, seront mis à profit. De façon similaire, la capture et la détection de nouvelles activités polymérasiques impliqueront le développement de nouvelles approches méthodologiques, mais également, utiliseront les outils habituels. Le comportement des ADN polymérases de P. abyssi en présence des lésions physiologiques fera l’objet d’une analyse approfondie (incorporation préférentielle en face de la lésion, extension au-delà du dommage, affinité pour le substrat, etc) afin de comprendre et de proposer un mécanisme moléculaire de translésion. Outre l’aspect fondamental que comporte cet axe de recherche, il intègre également la composante biotechnologique puisque les connaissances et les outils enzymatiques générés seront transposables aux domaines de recherche appliquée (paléogénétique, criminologie, etc), la demande actuelle étant d’isoler de nouvelles ADN polymérases thermostables capable d’amplifier par PCR des ADN endommagés.
Résultats : La caractérisation enzymatique et structurale de l’ADN polymérase B de P. abyssi a révélé que la poche de reconnaissance de l’uracile (désamination spontanée de la cytosine accélérée à haute température) peut également accommoder les quatre bases canoniques de l’ADN génomique. Un rôle de vérification des bases du brin d’ADN à dupliquer est proposé. Ce mécanisme de contrôle d’identité des bases semble unique aux Archaea.
La caractérisation enzymatique de l’ADN polymérase D de P. abyssi en présence de l’uracile a démontré que ce dommage serait fortement inhibiteur de l’activité polymérasique provoquant une réduction de synthèse. Il stimule en outre l’activité de dégradation de l’amorce ADN hybridée à la matrice. Un mécanisme moléculaire de reconnaisse de l’uracile distinct de l’ADN polymérase B est proposé.
La mise au point des gels d’activités enzymatiques utilisés pour visualiser les acteurs de la synthèse d’ADN représente un enjeu méthodologique inattendu. En effet, l’abandon de la radioactivité au profit de la fluorescence a pour conséquence d’utiliser et de comparer différentes chimies de liaison aux produits synthétisés. Ce développement technique fera l’objet d’une publication méthodologique. D’autre part, l’électrophorèse des produits de dégradation des amorces ADN a donné lieu à des migrations aberrantes. Ces anomalies ont été étudiées et ont souligné que lorsque les marqueurs fluorescents étaient chargés positivement ils pouvaient induire un profil électrophorétique anormal.
L’ADN polymérase D de P. abyssi possède des performances en PCR supérieures à la Taq, enzyme représentative des kits couramment utilisés en laboratoires de recherches. Notamment, elle semble davantage tolérer des inhibiteurs de réactions PCR présents dans des échantillons humain ouvrant des applications potentielles en criminologie ou paleogénétique.
Perspectives : L’inhibition par l’uracile de l’activité polymérasique des ADN polymérases conventionnelles (familles B et D) pose la question de l’occurrence de ce dommage au niveau génomique et  dans le « pool » des précurseurs chez les Archaea. La quantification de ce dommage n’a pas été effectuée au cours de ce projet et est à réaliser prochainement. Cette perspective revêt un caractère novateur car, actuellement, aucun travail de ce type chez les eucaryotes ou les bactéries n’a été publié. D’autre part, l’étude de l’impact du dommage oxydatif 8-oxodG sur l’activité polymérasique des ADN polymérases conventionnelles est en cours d’investigation. Ce dommage est détectable dans le génome de P. abyssi et son occurrence est supérieure à la bactérie, Escherichia coli posant la question de la tolérance à cette lésion chez P. abyssi.
Publications et brevets : Une publication démontrant le passage des bases canoniques dans la poche de reconnaissance à l’uracile dans l’ADN polymérase B a été publiée en Août 2012. Jérôme Gouge, Céline Ralec, Ghislaine Henneke and Marc Delarue. Molecular Recognition of Canonical and Deaminated Bases by P. abyssi Family B DNA Polymerase. J. Mol. Biol. (2012) 423, 315–336
L’inhibition de l’activité polymérasique et la stimulation de la fonction de dégradation d’amorce ADN par l’uracile par l’ADN polymérase D a donné lieu à la publication Richardson TT, Gilroy L, Ishino Y, Connolly BA, Henneke G. Novel inhibition of archaeal family-D DNA polymerase by uracil. Nucleic Acid Research (2013) 41, 4207-18.
L’article montrant les migrations anormales électrophorétiques de courts fragments ADN marqués avec une molécule fluorescente chargée positivement est publié sous : Anomalous electrophoretic migration of short oligodeoxynucleotides labelled with 5’-terminal Cy5 dyes. Tom Killelea, Christine Saint-Pierre, Céline Ralec, Didier Gasparutto, Ghislaine Henneke. Electrophoresis Journal. Accepté en mars 2014