Projet ANR-12-EMMA-0051 – CellScan : Vidéomicroscopie miniaturisée et parallélisée pour microplaque 96 puits
Programme : Emergence (Emergence)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Vincent HAGUET (Laboratoire Biologie à Grande Echelle)
Partenaires : CEAVALO Cellule Valorisation CEA; Laboratoire d'Électronique et de Technologie de l'Information; Biologie à Grande Échelle
Montant : 250081.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 18 mois
Résumé : Vidéomicroscopie miniaturisée et parallélisée pour microplaque 96 puitsUn lecteur de plaque basé sur un nouveau principe optique est mis au point pour le suivi de cultures cellulaires dans le temps. Le lecteur et les logiciels permettent d'effectuer des cribles afin d'étudier la viabilité, la prolifération, la morphologie et la motilité des cellules.
ApplicationsLa vidéomicroscopie à champ large est destinée à la visualisation rapide et répétée des puits d'une microplaque. L'acquisition massive d'images par le microscope permet de déterminer l'évolution des différentes populations cellulaires dans le microplaque, à des fins de contrôle qualité des cultures, pour l'identification d'événements cellulaires spécifiques (divisions, agrégations, changements morphologiques,...) ou pour étudier et quantifier l'effet d'une famille ou d'une banque de drogues sur les types cellulaires d'intérêt. Les développements matériels concernent actuellement  l'optimisation de l'illumination des échantillons et sa synchronisation avec les acquisitions d'images. Par ailleurs, des traitements automatiques sont appliqués sur les grands volumes d'images générés par le lecteur de plaque afin d'assister l'utilisateur dans la réalisation de cribles et dans l'analyse des résultats obtenus.
Développements matériels et logicielsTous les composants matériels sont sélectionnés sur catalogue afin de minimiser le coût global du système d'imagerie. Ils sont ensuite assemblés au sein d'un boîtier conçu en interne et compatible avec les techniques de production en série. Les cartes électroniques d'éclairage et d'acquisition d'image sont conçues et fabriquées spécifiquement pour le lecteur de plaque. Les images sont enregistrées de manière automatique selon le pas de temps et la durée spécifiées par l'utilisateur. Des traitements automatiques appliqués sélectivement sur les jeux d'images sont développés actuellement dans l'objectif d'améliorer les images et en extraire les données physiologiques pertinentes pour l'utilisateur. Un logiciel est programmé pour analyser rapidement et de manière ergonomique les résultats issus d'un crible. Par ailleurs, des cribles tests sont effectués régulièrement pendant le projet afin de valider les architectures matérielles choisies et tester la robustesse des algorithmes développés.
Résumé de la soumission : L'imagerie classique de cellules chimiquement fixées fournit aux laboratoires académiques et aux industriels de la pharmacologie des informations précieuses sur la structure et le phénotype cellulaires. Cependant, elle offre des moyens limités d'accès à des données cinétiques telles que des événements cellulaires transitoires ou rares. Une demande croissante émerge actuellement pour suivre l'évolution de cultures cellulaires afin de pouvoir identifier des signatures cellulaires spécifiques, par exemple les effets de drogues sur la viabilité, la prolifération, la morphologie ou la motilité cellulaires. Les vidéomicroscopes et les systèmes récents d'imagerie en incubateur peuvent fournir des images de cellules vivantes à des intervalles de temps réguliers (time-lapse imaging). Néanmoins, ces équipements sont coûteux (dans la gamme 50-190 k€) et/ou ne disposent pas de capacités de parallélisation de l'imagerie ou seulement à bas débit. Pour des raisons de coût, ils possèdent généralement des champs de vue restreints et une résolution moyenne, et permettent d'imager un seul marqueur fluorescent. Ce projet de 18 mois vise à employer notre technologie d'imagerie cellulaire en mode contact développée précédemment pour surmonter ces difficultés. Notre architecture d'imagerie, en rupture avec les solutions habituellement adoptées, évite tout composant coûteux d'optique ou de renforcement de contraste. Elle permet de générer des images à fond clair de cellules dans des microplaques en mode time-lapse directement dans un incubateur. Les laboratoires BGE et LISA du CEA à Grenoble ajouteront au système d'imagerie cellulaire parallélisée, de nouvelles capacités à forte valeur ajoutée basées sur un système de micropositionnement à course centimétrique, des traitements optiques en couches minces et des logiciels de traitement d'image : (i) visualisation de l'aire complète des puits d'une microplaque afin d'étudier exhaustivement les populations cellulaires ; (ii) imagerie de cellules fluorescentes exploitant des filtres interférentiels déposés sous forme de micromotifs sur les capteurs d'image ; (iii) collecte automatisée et massive de données sur les cellules par segmentation et analyse des images à haut débit ; (iv) imagerie à l'échelle subcellulaire reposant sur un logiciel de reconstruction holographique des images et sur un marquage spécifique amplificateur de la diffraction. Avec le soutien de la Cellule Valorisation du CEA, les objectifs de valorisation seront de déposer des brevets sur l'architecture du dispositif obtenu et sur les algorithmes et les méthodes associés, et d'organiser le transfert de la technologie par le biais de contrats de license à une entreprise du secteur de l'imagerie, éventuellement à une entreprise issue du CEA si cette approche apparaît financièrement pertinente.
Résultats : Le lecteur de plaque a été utilisé avec succès à plusieurs reprises sur des périodes de plus d'une semaine. Il est compatible avec tous les formats de microplaque et avec tous les supports standards de culture. Les cartes électroniques sont très stables et soutiennent l'acquisition massive des 96 séries d'images. Une campagne de segmentations manuelles réalisée auprès de plusieurs utilisateurs a validé la segmentation automatique des objets sur les images. Les utilisateurs internes ont accueilli très favorablement les logiciels de visualisation des images et d'analyse graphique des résultats.
Perspectives : Des progrès importants ont été réalisés dans l'architecture d'illumination des échantillons. Le montage retenu pour éclairer les cultures cellulaires est compatible avec les contraintes mécaniques imposées par le lecteur de plaque. Par ailleurs, les premiers cribles effectués en interne ont déjà permis d'identifier des molécules hits qui seront étudiées plus spécifiquement dans les prochains mois. Ces résultats valident l'approche globale du vidéomicroscope pour l'application de crible.
Publications et brevets : 1) V. Haguet et al., «Parallelized lensfree time-lapse microscopy”, NanoBioEurope, p. 30, Toulouse, France, 10-12 juin 2013.  2) V. Haguet et al., «Time-lapse screening by parallelized lensfree imaging”, Accepté dans Proc. 17th µTAS Conference, Fribourg, Allemagne, 27-31 octobre 2013.