Projet ANR-10-BLAN-1208 – ARCHITECT : Approche des mécanismes de la transduction du signal à travers l'étude des changements de conformation des récepteurs
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Bernard MOUILLAC (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
Partenaires : Institut de Génomique Fonctionnelle; Institut des Biomolécules Max Mousseron
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Compréhension du fonctionnement des récepteurs hormonaux dans le but développer des médicaments plus efficaces et sans effets secondairesIl est important de comprendre les bases structurales de la fonction des récepteurs membranaires et de relier leurs changements conformationnels à une réponse cellulaire adaptée. En particulier, pour développer des médicaments plus efficaces et sans effet secondaire, il est primordial de déterminer comment leurs ligands (hormones et neurotransmetteurs) les activent ou les inhibent et quels sont les signaux cellulaires engagés.
Suivi des changements de conformation des récepteurs membranaires au cours de leur interaction avec leurs activateurs/inhibiteursLes récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires, participent à la régulation de la majorité des fonctions physiologiques et représentent une cible thérapeutique de premier ordre. Comprendre leur fonctionnement à un niveau moléculaire au cours de leur liaison avec leurs ligands (hormones et neurotransmetteurs) est primordial dans le but de développer de façon rationnelle de nouveaux médicaments plus efficaces et sans effets secondaires. De plus leurs interactions avec d’autres protéines cellulaires influencent leur pharmacologie et leurs propriétés fonctionnelles. Cette plasticité fonctionnelle peut être attribuée à leur flexibilité structurale et à l’habilité de leurs ligands à induire des états conformationnels spécifiques. Nous étudions la dynamique et les changements de conformation des récepteurs de la vasopressine et de l’ocytocine, représentatifs des RCPG, sous l’effet de différentes classes de ligands pharmacologiques (activateurs, inhibiteurs, ligands biaisés (caractérisés par une sélectivité fonctionnelle) en utilisant des approches de fluorescence. Nous voulons également comprendre l’organisation structurale de ces récepteurs lorsqu’ils sont associés sous forme de dimères ou lorsqu’ils interagissent avec leurs partenaires cellulaires, en particulier protéines G et arrestines. Enfin, nous tentons d’établir des corrélations entre l’état conformationnel d’un récepteur induit par un ligand sélectif et l’activation d’une réponse biologique spécifique.
Approche des bases structurales de la signalisation des récepteurs par spectroscopie de fluorescencePour étudier les changements de conformation des récepteurs sous l’effet de leurs ligands sélectifs, il est nécessaire de développer plusieurs approches méthodologiques. Tout d’abord, les récepteurs sont produits et purifiés en quantité compatible avec leur analyse structurale ou biophysique. Ils sont ensuite reconstitués dans des systèmes artificiels pour les maintenir en solution afin de pouvoir les manipuler in vitro. Ensuite, pour mesurer leur activation, ils doivent être marqués par deux fluorophores particuliers à des positions bien précises. Sous l’effet de leurs ligands, les changements de conformation sont suivis par l’enregistrement des modifications des signaux de fluorescence, en particulier le transfert d’énergie de fluorescence entre les deux fluorophores. En parallèle, les partenaires habituels des récepteurs, en l’occurrence les protéines G et les arrestines, sont également produits et purifiés. Les complexes récepteurs / récepteurs, récepteurs / protéines G et récepteurs / arrestines sont reconstitués et leur organisation structurale abordée par fluorescence. Enfin, l’activité des récepteurs et des protéines partenaires, et leur réponse sous l’effet des ligands, est établie par le développement de tests fonctionnels adaptés et simples à mettre en pratique. Toutes ces approches doivent être maîtrisées et les résultats reproductibles.
Résumé de la soumission : Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande famille de protéines membranaires, sont activés par un large éventail de signaux extracellulaires (protéines, peptides, acides aminés, lipides, catécholamines, ions, photons), participent à la régulation de la plupart des fonctions physiologiques et sont la cible d'une majorité de médicaments. Ils sont donc des acteurs majeurs de la transduction du signal par laquelle les cellules répondent aux variations de leur environnement. Un contrôle très fin de la réponse cellulaire est lié à différents aspects du fonctionnement des RCPGs. Ils sont remarquablement polyvalents, capables de déclencher des voies de signalisation dépendantes ou non des protéines G, simultanément ou pas, souvent de façon spécifique vis-à-vis du ligand activateur. Leurs interactions avec des partenaires membranaires (d’autres récepteurs) ou cytoplasmiques (protéines G, arrestines) influencent leur pharmacologie et leurs propriétés fonctionnelles. Cette plasticité peut être attribuée à leur flexibilité structurale et à la capacité des ligands à induire ou stabiliser des conformations très sélectives.La connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine des changements de conformation d’un récepteur lors de l’activation de diverses réponses cellulaires est d’un intérêt fondamental et devrait faciliter la découverte de nouvelles drogues sur une base rationnelle. La cristallographie aux rayons X est une approche qui permet de définir la structure d’un RCPG. Parmi les structures cristallines de RCPGs disponibles aujourd’hui, la plupart sont celles de conformations inactives car les récepteurs sont complexés à des antagonistes ou des agonistes inverses. Ces structures ne représentent qu’une image statique de molécules très dynamiques. Il est donc absolument nécessaire de développer en parallèle des approches telles que la spectroscopie de fluorescence pour aborder la nature dynamique de ces récepteurs. Cette étude n’a été réellement entreprise que pour le récepteur beta2-adrénergique et les résultats sont d’une extrême importance. Ils suggèrent un mode de transduction du signal au cours duquel la liaison du ligand stimulateur s’effectue à travers une succession d’états conformationnels intermédiaires, chacun capable d’activer des voies de signalisation différentielles. Notre projet est d'analyser les mécanismes moléculaires de la transduction du signal par l'étude de la dynamique  des changements de conformation des récepteurs de la vasopressine (AVP) et de l’ocytocine (OT), famille prototype des RCPGs de la classe A. Nous explorerons en particulier la spectroscopie de fluorescence pour mesurer les changements de conformation de ces récepteurs lors de la liaison des ligands. Les récepteurs AVP/OT sont un modèle particulièrement adapté à cette étude. Une large panoplie de ligands agonistes et antagonistes sont disponibles. L’existence de différents états conformationnels stabilisés par différentes classes de ligands est évidente sur la base de données pharmacologiques. Ils sont une cible thérapeutique majeure et sont considérés comme caractéristiques des récepteurs à ligands peptidiques. La réalisation du projet nécessite la surexpression et la purification des récepteurs, la production de protéines G et d’arrestines pures et actives, le développement de supports chromatographiques pour purifier les formes fonctionnelles des récepteurs, la stabilisation des récepteurs en micelles de détergents ou en phospholipides, le marquage fluorescent des récepteurs purifiés, des protéines G et des arrestines, l’enregistrement des modifications de conformation des récepteurs et des protéines partenaires par mesure des variations de fluorescence. Ce projet est la première étude dédiée à l’analyse des changements conformationnels de récepteurs à ligands peptidiques et permettra d’aborder les bases structurales de la transduction du signal.
Résultats : Nous avons focalisé notre étude sur le récepteur V2 de la vasopressine. Celui-ci est localisé au niveau du rein et il est responsable de l’activité antidiurétique de l’hormone. C’est une fonction physiologique majeure pour les mammifères que nous sommes car la régulation de notre métabolisme hydrique est vitale pour notre organisme. Nous avons pu montrer que lors de la liaison de ligands spécifiques, les changements conformationnels du V2 impliqués dans l’activation de la protéine G (Gs plus particulièrement) sont différents de ceux responsables du recrutement des arrestines. Nous avons pu relier le caractère biaisé de certains ligands (engagement sélectif d’une partie des voies de transduction généralement associées à l’activation du récepteur par son hormone endogène) à des états conformationnels différents du récepteur. La sélectivité fonctionnelle de ces ligands est la résultante de mouvements coordonnés de différents domaines fonctionnels du récepteur, permettant ou pas l’engagement de différentes voies de transduction habituellement associées à son activation. Chaque ligand induit et stabilise un ensemble de changements spécifiques responsables de son efficacité (effet thérapeutique) et de sa sélectivité fonctionnelle (capacité à n’engager que les effets bénéfiques).
Perspectives : L’établissement de liens entre la conformation structurale d’un récepteur activé et l’engagement sélectif d’une réponse cellulaire adaptée permettra le développement rationnel de médicaments dont l’efficacité par rapport à l’effet bénéfique thérapeutique recherché sera augmentée tout en diminuant ou en éliminant les effets secondaires indésirables. Ces progrès devraient déboucher sur une pharmacologie/thérapie mieux ciblée, plus « intelligente ».
Publications et brevets : Une publication dans une revue américaine prestigieuse avec un facteur d'impact élevé.
Rahmeh R. et al., Structural insights into biased G protein-coupled receptor signaling revealed by fluorescence spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, 109, 6733-6738.