Projet ANR-12-CHEX-0002 – LSD1 : Nouvelles interplays impliquant l'histone demethylase LSD1 in vivo
Programme : Chaires d’excellence (CHEX)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame Luisa DI STEFANO (Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire du Contrôle de la Prolifération)
Partenaires : Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire du Contrôle de la Prolifération
Montant : 474552.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Rôle de l’histone déméthylase LSD1 dans le développement et le cancerLe but de ce projet est de comprendre le rôle de l’histone déméthylase LSD1 dans la régulation de l’homéostasie de la chromatine durant un développement normal et dans les maladies comme le cancer.
Trouver de nouvelles fonctions de l’histone déméthylase LSD1 in vivo.Les modifications d’histones jouent un rôle déterminant dans le contrôle de l’expression génique et de l’architecture chromatinienne. Parmi ces modifications, la méthylation des histones a longtemps été considérée comme une marque épigénétique stable et irréversible. La découverte récente des histones démethylases a montré que la méthylation était en fait réversible, mettant en lumière le rôle dynamique de cette marque dans la régulation transcriptionelle. LSD1/KDM1 a été la première histone déméthylase identifiée et s’est révélée être un régulateur chromatinien fondamental. Plusieurs études ont montré l’implication de l’histone déméthylase LSD1 dans la genèse de tumeurs et il existe un intérêt croissant pour l’utilisation de LSD1 comme cible thérapeutique. Malgré les progrès importants, le rôle précis de LSD1 au cours du développement et dans la genèse de tumeurs est encore largement méconnu. Notre stratégie est d’utiliser un modèle animal, drosophile, comme point de départ pour identifier les gènes et les voies qui collaborent ou antagonisent l’activité de dLsd1 in vivo, puis de tester leurs conservations chez les mammifères ainsi que leurs potentielles implications dans le cancer. Pour identifier ces nouvelles voies impliquant dLsd1 in vivo, nous avons effectué des cribles RNAi et nous avons trouvé différents activateurs et répresseurs du phénotype perte de fonction de dLsd1. Dans cette proposition, nous suggérons d’étudier comment dLsd1 et les candidats identifiés dans le crible contribuent à la structure de la chromatine et à la transcription des gènes au cours d’un développement normal. Le but est de répondre aux questions suivantes : 1) Comment dLSD1 collabore avec ses intéracteurs pour réguler l'homéostasie de la chromatine et la transcription des gènes? 2) Les interactions fonctionnelles découvertes chez la drosophile sont-elles conservées chez les mammifères ? 3) Peuvent-elles être utilisées pour détruire les cellules cancéreuses ?
De la génétique à la génomiqueNous utilisons la mouche Drosophila melanogaster comme modèle d’étude du rôle de dLsd1 dans l’homéostasie de la chromatine et l’expression in vivo. Nous avons profité de la banque de lignées RNAi transgéniques disponibles à Harvard Medical School pour établir un crible afin de définir de nouveaux partenaires génétiques de dLsd1. L’avantage d’utiliser des RNAi transgéniques est la possibilité de perturber l’activité de gènes avec une résolution temporelle et spatiale, difficiles à atteindre avec des techniques de génétique classique. En utilisant cette banque, nous avons eu la possibilité de cribler une centaine de gènes de façon non biaisée dans le contexte d’un organisme complet et nous avons trouvé différents nouveaux partenaires génétiques de dLsd1. Nous sommes actuellement en train d’élucider la collaboration entre dLsd1 et ses partenaires en utilisant une approche biochimique. De plus, nous avons prévu de réaliser des analyses à haut débit pour identifier où dLsd1 se situe dans le génome dans différents contextes développementaux et comment cette liaison peut affecter ses partenaires génétiques.
Résumé de la soumission : Les modifications d’histones, jouent un rôle crucial dans le contrôle de l’expression génique et de l’architecture chromatinienne. Une régulation stricte des marques d’histones est donc critique pour le développement normal. Des défauts dans l’organisation chromatiniennes et dans l’expression des gènes dus à l’activité aberrantes d’enzymes de modification de la chromatine peuvent contribuer à des maladies comme le cancer. Nos connaissances actuelles sur la méthylation des histones proviennent largement de l’étude des histone méthyl transférases. La découverte récente des histones déméthylases a montré que la méthylation est réversible, soutenant un rôle plus dynamique de la méthylation des histones. La première histone déméthylases caractérisée a été LSD1. Depuis sa découverte, LSD1 apparaît comme un régulateur clé des fonctions spécifiques de la chromatine. De plus, plusieurs études ont impliquée LSD1 dans la tumorigénèse et il y a un intérêt croissant pour LSD1 comme cible thérapeutique. Cependant, malgré les progrès importants dans notre compréhension de la régulation dynamique de la méthylation des histones par LSD1, les fonctions biologiques de LSD1 commencent juste à être découvertes. En particulier, nous avons encore une connaissance limitée des fonctions de LSD1 dans les voies spécifiques et aucune étude à l’échelle du génome du rôle de LSD1 dans un organisme entier n’a encore été réalisée.J’ai pris avantage du réseau organisé de protéines présent dans la drosophile pour démontrer que l’activité de LSD1 est conservé chez les mouches et pour trouver de nouvelles fonctions de LSD1 au cours du développement. Par une approche génétique, j’ai trouvé un antagonisme surprenant entre les deux histones déméthylases LSD1 et Lid. La recherche des bases moléculaires de cet antagonisme a révélé que Lid s’oppose aux fonctions de LSD1 de promouvoir l’extension de l’hétérochromatine. De plus, ces données ont permis de démontrer  un rôle de LSD1 dans la voie de signalisation Notch chez la drosophile. Dans le projet proposé, j’envisage de tirer partie de l’ensemble des outils disponibles chez la drosophile pour identifier de nouvelles voies de signalisation impliquant LSD1. Plus spécifiquement, je réalise un  criblage RNAi in vivo at j’ai déjà trouvé plusieurs gènes « enhancers » ou « suppressors » du phénotype perte de fonction de LSD1. Cette approche n’a jamais été utilisée pour étudier la fonction de dLSD1 et présente l’avantage clé d’être non biaisée et d’être effectuée dans le cadre d’un organisme entier, ca est crucial car il peut permettre de mettre en évidence des interactions dépendant du contexte importantes pour le développement, qui peuvent être perdues dans des cellules en culture. Le criblage sera suivie par une caractérisation fonctionnelle détaillée des interactions génétiques clés obtenue par le criblage (tâche 1). Dans la tâche 2, j’utiliserai les technologies de ChIP-Seq et d’analyses transcriptomiques pour étendre la caractérisation des mouches mutantes pour LSD1. Le but est de comprendre comment LSD1 et ses interacteurs contrôlent la transcription génique et l’homéostasie de la chromatine dans des contextes développementaux spécifiques. Un important aspect de cette stratégie est l’idée que les mécanismes qui augmentent ou suppriment les phénotypes mutants dLSD1 sont conservés entre les mouches et les hommes. Dans une première tentative pour vérifier cette conservation, nous avons d’ores et déjà démontré que cela est vrai pour l’interplay entre dLSD1 et la voie Notch. Dans la tâche 3, je prévois d’étudier quelques nouvelles interactions clés découvertes dans la tâche 1 et de tester si cette information nouvelle est conservée chez les mammifères. Je testerai également la possibilité que cette interaction peut être exploitée pour cibler les cellules tumorales.
Résultats : Le crible génétique m’a donné l’opportunité d’identifier de nouveaux modulateurs et des cibles en aval de dLsd1, étendant potentiellement la compréhension des fonctions de ces enzymes dans le cancer. La prochaine étape consiste maintenant à intégrer le rôle de dLsd1 et ses partenaires. Ces études vont fournir une compréhension détaillée de quand, où et comment dLsd1 est recruté à des loci spécifiques selon les contextes développementaux. Surtout, une identification de ces mécanismes épigénétiques chez les mouches va aider à approfondir les phénomènes parallèles chez les humains et comment leurs dérégulations peuvent mener à des développements de cancers. Nous prévoyons également de tester la conservation de ces mécanismes chez les humains, en collaborations avec d’autres chercheurs travaillant sur différents types de cancers.
Perspectives : Le rôle de LSD1 dans  les cellules cancéreuses apparaît comme étant hautement dépendant du contexte, donc une analyse systémique soigneuse des différents rôles biologiques de LSD1 est essentielle, surtout en considérant l’énorme potentiel comme cible thérapeutique. Les expériences proposées ont pour but d’approfondir la compréhension de la fonction de dLSD1 in vivo et pourraient fournir des informations clés pour le développement de stratégies épigénétiques sélectives afin de détruire les cellules cancéreuses.
Publications et brevets : Di Stefano L and Dyson N. The emerging roles for histone demethylases in the modulations of signaling pathways. Biomolecular Concepts. 2013; 4(1): 13–27
Di Stefano L and Dyson N. The complex roles of histone demethylases in vivo. Cell Cycle. 2011 Jul 1;10 (13): 2049-50. 
Mulligan P, Yang F, Di Stefano L, Ji J, Nishikawa J, Wang Q, Kulkarni M, Najafi-Shoushtari H, Mostosvalsky R, Gygi S, Gill G, Dyson N and Näär A. A SIRT-LSD1 co-repressor complex regulating Notch target gene expression and development. Mol Cell. 2011 Jun 10;42(5):689-99. 
Di Stefano L, Walker J, Burgio G, Corona D, Mulligan P, Näär A and Dyson N. Functional antagonism between histone H3K4 demethylases in vivo. Genes and Development. 2011 Jan 1; 25 (1): 17-28. 
The modENCODE Consortium. Identification of functional elements and regulatory circuits in Drosophila by large scale data integration. Science. 2010 Dec 24; 330 (6012):1787-97. 
Morris E, Ji J, Yang F, Di Stefano L, Herr A, Moon NS, Kwon EJ, Haigis KM, Näär A and Dyson N. E2F1 represses beta-catenin transcription and is antagonized by both pRb and CDK8. Nature. 2008 Sep 25; 455(7212): 552-6. 
Moon NS, Di Stefano L, Morris E, Patel R, White K and Dyson N. E2F and p53 induce apoptosis independently during Drosophila development but intersect in the context of DNA damage. PLoS Genet. 2008 Aug 8;4(8).
Di Stefano L, Ji J, Moon NS, Herr A and Dyson N. Mutation of Drosophila Lsd1 disrupts H3-K4 methylation resulting in tissue specific defects during development. Curr Biol. 2007 May 1; 17(9): 808-12. 
Qiao H*, Di Stefano L*, Tian C, Li YY, Yin YH, Qian XP, Pang XW, Li Y, McNutt MA, Helin K, Zhang Y, Chen WF. Human TFDP-3, a novel DP protein, inhibits DNA binding and trans-activation by E2F. J Biol Chem. 2007 Jan 5; 283 (1) 454-66. *these authors equally contributed to the paper.