Projet ANR-13-BS07-0012 – MimictRNA : Synthèse d’analogues d’aminoacyl-tRNA pour explorer la synthèse peptidique non-ribosomale chez les bactéries
Programme : Blanc - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Madame Mélanie ETHEVE-QUELQUEJEU (Laboratoire de Chimie et de Biochimie pharmacologiques et toxicologiques)
Partenaires : Institut de Biochimie et Biophysique Moléculaire et Cellulaire; Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques; Centre de Recherche des Cordeliers; Institut de Biologie Intégrative de la Cellule
Montant : 444974.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : Synthèse d’analogues d’aminoacyl-tRNA pour explorer la synthèse peptidique non-ribosomale chez les bactériesNotre projet fournira des données concernant le mécanisme catalytique des transférases de la famille Fem, ainsi que des données structurelles sur les sites de reconnaissance de ces enzymes pour les ARNt. Le projet devrait apporter tous les outils nécessaires à la conception d'inhibiteurs des Fem transférases et autres cibles bactériennes dépendantes des ARNt. 
Synthèse d’analogues d’aminoacyl-tRNA pour explorer la synthèse peptidique non-ribosomale chez les bactériesThe major focus of the present proposal concerns the catalytic mechanism of FemX, a representative of the tRNA-dependent transferases involved in peptidoglycan synthesis. The first substrate of this enzyme, UDP-MurNAc-pentapeptide (UM5K) is a composite structure including a carbohydrate, a nucleotide and a peptide with unusual amide links. The chemical synthesis of this molecule remains particularly challenging and it is unlikely that versatile routes to analogues can be developed. For this reason, we propose to develop enzymatic synthesis of this molecule and access to modifications of its structure via protein engineering. The second substrate Ala-tRNAAla is even more complex. We have developed semi-synthesis of aminoacylated tRNAs and analogues based on organic synthesis of modified dinucleotides and their enzymatic ligation to RNA molecules obtained by in vitro transcription or by the classical solid support synthesis. Our first objective is the synthesis of functionalized analogues of the Ala-tRNA and UM5K substrates that will get access to bi-substrates by the Huisgen-Sharpless cycloaddition reaction. The Cu(I)- and FemX-catalyzed reaction will afford high affinity inhibitors that will be use to determine the structure of complexes and understand the interaction of the enzyme with the tRNA. The second objective is to explore the role of FemX in aminoacyl isomerization between the O2’ and O3’ hydroxyls of the tRNA. We will synthesize phospho-derivatives of the tRNA that will mimic the tetrahedral intermediary of the transacylation reaction and trap a relevant conformation of FemX for crystallogenesis.
Synthèse d’analogues d’aminoacyl-tRNA pour explorer la synthèse peptidique non-ribosomale chez les bactériesThe main objectives of the proposal was to investigate the catalytic mechanism of FemXWv using bi-substrates containing tRNA covalently linked to peptidoglycan precursor analogues. In order to synthesize the bi-substrates analogues, we introduce azides and alkynes into the tRNAs and UM5K, respectively. Cu(I)-catalyzed cycloaddition afford the desired bi-substrate. Azide-tRNA analogues was obtained by two strategies. The first strategy involves an enzymatic ligation by T4 RNA ligase and the second strategy is based on the solid phase synthesis. The solid-phase synthesis methods (developed in collaboration with Prof. Tom Brown, Oxford University) lead to short RNA micro-helixes containing matching base-pairs. Five 2’-azido RNA duplexes, which contain 2 to 7 base pairs have been synthezised and used to obtained peptidyl-RNA conjugates. Partner 3 synthesized UDP-MurNAc-pentapeptide and lipid II compounds in both unlabeled and radiolabeled forms. We also successfully synthesized several analogues of these two natural compounds: meso-cystine-containing UDP-MurNAc-pentapeptide and UDP-MurNAc-pentadepsipeptide, alkyne-lipid II and lipid II (-pentadepsipeptide). All synthesized compounds were checked by MALDI-TOF mass spectrometry and amino acid / amino sugar analyses.
Résumé de la soumission : Les aminoacyl-ARNt jouent un rôle important dans la synthèse protéique ribosomale. Ils interviennent aussi dans différentes étape des voies métaboliques comme source d’amino acides activés. Parmi les amino-acyl transférases ARNt-dépendantes, les enzymes de la famille Fem catalysent une étape essentielle de la synthèse du peptidoglycane chez les bactéries pathogènes. Ces enzymes sont considérées comme une cible attractive pour le développement de nouveaux antibiotiques. FemX, l’enzyme modèle de cette famille, transfert la L-Ala de l’Ala-ARNt vers l’amine epsilon de la L-Lys d’un précurseur du peptidoglycane (UM5K). Les structures cristallographiques de l’apo-enzyme et du complexe UM5K-FemX ont été décrites mais la co-cristallisation en présence du substrat Ala-tRNA n’a jamais été obtenue. Pour explorer le mécanisme catalytique de FemX et synthétiser des inhibiteurs de cette enzyme, nous proposons de développer une méthode d’hémi-synthèse de bi-substrats et d’aminoacyl-ARNt hautement fonctionnalisés. Les fonctions azides et alcynes seront respectivement introduites sur l’ARNt et l’UM5K. La réaction de cycloaddition de Huisgen-Sharpless catalysée par le cuivre, permettra d’obtenir des bi-substrats constitués de l’ARNt lié de façon covalente à l’UM5K. Par cette approche, nous obtiendrons des molécules stables appropriées pour des essais de co-cristallisation. Cette approche plus prometteuse que les essais classiques de cristallogenèse avec les substrats ou les produits de la réaction car la génération in situ des composés devrait bloquer l’enzyme dans un état conformationnel unique, correspondant à son état actif. Une autre famille de molécules, des dérivés phospho-ARNt, seront synthétisés pour mimer l’intermédiaire réactionnel formé lors de l’attaque intramoléculaire du carbonyl de l’Ala-ARNt par l’hydroxyle vicinal du ribose. Ces dérivés seront utilisés pour piéger une conformation de l’enzyme active pour la réaction de transacylation (transacylation de l’amino acide entre les positions 2’- et 3’- de l’adénosine de l’Ala-ARNt). La réaction de cycloaddition catalysée par l’enzyme sera ensuite utilisée pour identifier des inhibiteurs de FemX. Nous évaluerons et comparerons la contribution de la fixation et de l’activation du substrat dans deux réactions. (i) La réaction de cycloaddition catalysée par le cuivre et par FemX à partir des substrats fonctionnalisés. (ii) La réaction de transfert de l’amino acide catalysée par FemX avec le substrat naturel. Les informations obtenues concernant le mécanisme catalytique de FemX et la structure du site actif, pourraient apporter des données cruciales pour la conception de médicaments actifs sur ces nouvelles cibles Fem.
Résultats : The peptidyl-RNA conjugates were found to inhibit the non-ribosomal FemXWv aminoacyl-transferase with IC50 of 2 nM to 930 nMol and one of them was used to successfully obtain the crystallographic structure of FemXWv in complex with the Peptidyl-RNA. We have also obtained interesting results in the hemi-synthesis of 3’ fluoro-analogues of Ala-tRNAAla. The presence of fluorine in position 3’ blocks Ala at position 2’ by preventing spontaneous migration of the residue between positions 2’ and 3’. NMR analyses showed that substitution of the 3’ hydroxyl group by fluorine in the ribo configuration favors the S-type conformation of the furanose ring of terminal adenosine A76. In contrast, the N-type conformation is favored by the xylo configuration. Thus, introduction of fluorine in the ribo and xylo configurations affects the conformation of the furanose ring in reciprocal ways. Our compounds will provide insight into substrate recognition by Fem transferase and the Ala-tRNA synthetase.
Perspectives : We have investigated the formation of the triazole unit to link the tRNAAla analogs and alkyne-peptidoglycan, within the active site of FemXWv in the absence of CuI. By these approaches, (the in situ reaction), we tried to obtain molecules suitable for co-crystallization with FemXWv. Despite numerous attempts, FemXWv-catalyzed cycloaddition has not yet been observed. Other substrates analogues and other Fem enzymes will be used to achieve this objective.
Publications et brevets : 1.	“Synthesis of 3’-Fluoro-tRNA Analogues to explore non-ribosomal peptide synthesis in bacteria”, L. Iannazzo, G. Laisné, M. Fonvielle, E. Braud, J-P. Herbeuval, M. Arthur, M. Etheve-Quelquejeu, Chembiochem, 2015, 16, 477-486. 
2.	«Synthesis of 3'-triazoyl-dinucleotides as precursors of stable Phe-tRNAPhe and Leu-tRNALeu analogues«, M. Santarem, M. Fonvielle, N. Sakkas, G. Laisné, M. Chemama, J-P. Herbeuval, E. Braud,  M. Arthur,  M. Etheve-Quelquejeu, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2014, 24, 3231-3233.
1 chapitre : “Covalent functionalization of nucleic acids” M. Arthur & M. Etheve-quelquejeu, In Chemistry of Organo-Hybrids: Synthesis and Characterization of Functional Nano-Objects; Lacôte, E.; Charleux, B.; Copéret, C.; Eds.; Wiley-VCH, 2015.