Projet ANR-10-BLAN-1603 – GENOMAC : Analyse à grande échelle du positionnement des nucléosomes dans les noyaux de Paramecium tetraurelia
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Mireille BETERMIER (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD)
Partenaires : Centre de Génétique Moléculaire; Centre de Génétique Moléculaire; Centre de Génétique Moléculaire
Montant : 565035.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Evaluation du rôle de l’empaquetage de l’ADN dans la cellule pour remanier le génomeLa paramécie est un modèle pour l’étude des mécanismes impliqués dans la reconnaissance de séquences éliminées du génome à chaque cycle sexuel. Le projet consiste à évaluer si ces séquences sont empaquetées dans la chromatine ou si elles sont dans des régions libres, éventuellement facilement accessibles aux machineries effectuant les réarrangements.
Comment les séquences à réarranger sont empaquetées dans les noyaux de la paramécieDans les noyaux des cellules, l’ADN est enroulé autour de complexes protéiques pour former les unités primaires de la chromatine appelées nucléosomes. De nombreuses études montrent que cet empaquetage ne se fait pas au hasard et que le positionnement des nucléosomes joue un rôle important, notamment pour le contrôle de l’expression des gènes.L’originalité de la paramécie est que cet organisme unicellulaire possède deux types de noyaux qui assurent des fonctions différentes : le macronoyau (MAC) est le siège de l’expression des gènes tandis que le micronoyau (MIC) est transmis à la descendance lors des processus sexuels. A chaque cycle sexuel, le MAC, pourtant essentiel à la survie de la cellule, est détruit et un nouveau MAC se développe à partir d’une copie du MIC. La formation du nouveau MAC s’accompagne de l’excision précise de dizaines de milliers de courtes séquences d’ADN qui interrompent les gènes dans le MIC et empêchent leur expression si elles ne sont pas éliminées du MAC. Ces séquences, appelées IES, ne possèdent aucun motif conservé qui puisse permettre leur reconnaissance et leur élimination. Elles sont de plus extrêmement courtes, la plupart étant de taille inférieure à la longueur d’ADN enroulée autour d’un nucléosome. Ceci pose la question d’un rôle éventuel de la chromatine pour leur reconnaissance : les IES sont-elles empaquetées dans des nucléosomes ou plutôt situées dans des régions vides de nucléosomes directement accessibles à la machinerie d’excision ?L’objectif du projet GENOMAC est de déterminer la position, à l’échelle du génome entier, des nucléosomes dans les différents noyaux de la paramécie : le MIC, le MAC mature et le MAC en cours de développement.
Cartographie des nucléosomes et des unités de transcription par séquençage haut débitNucléosomes du MAC mature. Les noyaux sont purifiés par fractionnement cellulaire selon une méthode mise au point pour les MAC matures. La chromatine est ensuite digérée par une enzyme qui coupe l’ADN préférentiellement dans les régions situées entre les nucléosomes. L’ADN résistant au traitement, qui représente donc l’ADN enroulé autour des nucléosomes, est ensuite purifié et séquencé par des techniques de séquençage haut débit. Le génome MAC ayant été entièrement séquencé en 2006 et sa séquence ayant été soigneusement corrigée depuis, le positionnement des lectures obtenues peut être réalisé directement.En parallèle, les unités de transcription sont cartographiées avec précision grâce à des techniques de séquençage haut débit adaptées aux ARN.Ces données expérimentales permettront de déterminer les paramètres spécifiques de la chromatine de la paramécie et de modéliser le positionnement les nucléosomes dans le MAC par rapport aux unités de transcription.Nucléosomes du MIC et du MAC en développement. Par rapport à celle des MAC, la purification des MIC et des MAC en développement nécessite une étape supplémentaire de tri basé sur la fluorescence différentielle de ces noyaux, éventuellement associé à un marquage spécifique de chacun d’eux. Si des quantités suffisantes de noyaux sont obtenues, le séquençage de l’ADN associé aux nucléosomes sera réalisé selon la même procédure que pour le MAC mature. Le positionnement des lectures nécessite la détermination de la séquence de la version non réarrangée du génome. Les résultats obtenus pour les deux types de noyaux seront comparés aux prédictions de positionnement des nucléosomes réalisées in silico.
Résumé de la soumission : La position des nucléosomes peut altérer l’accessibilité de l’ADN dans le noyau et joue donc un rôle essentiel dans la régulation des processus cellulaires. De par leurs  propriétés uniques, les ciliés sont un très bon modèle pour l’étude à grande échelle de l’impact du positionnement des nucléosomes sur le contrôle de la dynamique des génomes.Les ciliés se caractérisent par la séparation d’une version germinale et d’une version somatique réarrangée de leur génome dans deux noyaux fonctionnellement distincts qui cohabitent dans le cytoplasme de ces eucaryotes unicellulaires. Les micronoyaux diploïdes (MIC) assurent les fonctions germinales et subissent la méiose lors des événements sexuels. Le macronoyau (MAC) fortement polyploïde assure l’expression des gènes pendant toute la vie de la cellule. Il est détruit à chaque génération sexuelle pour être remplacé par un nouveau MAC dérivant du noyau germinal. Pendant le développement du nouveau MAC, le génome subit une endo-réplication ainsi que des réarrangements massifs et reproductibles. Chez la paramécie, l’élimination imprécise d’ADN répété (transposons, minisatellites) est associée à une fragmentation des chromosomes. De plus, des milliers de courtes (26 à ~1000 bp) séquences non-codantes, les IES (Internal Eliminated Sequences) s’excisent précisément des régions codantes et non-codantes. Les IES sont encadrées par deux dinucléotides TA conservés dont un seul est maintenu dans le MAC. Leur excision débute par la coupure des deux brins de l’ADN de part et d’autre de chaque TA. Nous avons montré que PiggyMac, une transposase piggyBac domestiquée potentiellement active, est impliquée dans la coupure, alors que les IES n’ont aucune similarité de séquence avec des transposons piggyBac et ne possèdent aucune répétition terminale à leurs bornes susceptible d’être reconnue de façon séquence-spécifique. La question de la reconnaissance spécifique des IES reste donc largement ouverte.Des mécanismes épigénétiques régulent l’élimination de certaines IES et de l’ADN répété via des ARN non-codants (ncRNA) qui pourraient déposer des marques épigénétiques encore non identifiées sur les séquences à éliminer. Chez le cilié Tetrahymena, des nucléosomes marqués par H3K9me3 ou H3K27me3 s’associent spécifiquement avec l’ADN éliminé. Chez Euplotes crassus, plus distant, le développement MAC s’accompagne de modifications notables des profils de nucléosomes. Chez la paramécie, la formation d’hétérochromatine pourrait expliquer la délétion imprécise des régions contenant des séquences répétées et l’excision des plus grandes IES. Cependant, 75% des IES sont trop courtes pour définir un nucléosome. Notre hypothèse de travail est que ces IES sont reconnues parce qu’elles seraient exclues des nucléosomes, ce qui les rendrait accessibles à la machinerie d’excision. L’existence de régions d’exclusion de nucléosomes (NFR) au niveau des promoteurs de gènes a été démontrée récemment.Nous proposons de cartographier à grande échelle la position des nucléosomes dans la chromatine des MIC et MAC végétatifs ainsi que dans les MAC en développement. Nous réaliserons le séquençage à haut débit de l’ADN associé aux nucléosomes préparés à partir de noyaux purifiés. Nous caractériserons la distribution en taille des NFR et leur position sur le génome et comparerons également ces résultats à la cartographie des unités de transcription établie par séquençage haut débit d’ARNm. Cette première étude réalisée sur le génome riche en A/T d’un cilié permettra de comparer les règles de positionnement des nucléosomes à celles déjà établies pour les autres eucaryotes. L’alignement des distributions des NFR et des IES devrait révéler de possibles liens entre densité de nucléosomes et excision des IES.
Résultats : Nucléosomes du MAC mature. Le séquençage des ARN messagers réalisé pendant cette étude a permis une très bonne couverture du génome du MAC mature et indique que 90% des gènes sont exprimés dans au moins une des conditions testées. Ces données seront exploitées pour affiner l’annotation des gènes et la cartographie précise des unités de transcription.
La purification des mononucléosomes MAC a été menée à bien. Les premières données du séquençage réalisé sur ces échantillons sont en cours d’analyse.
Nucléosomes du MIC et du MAC en développement. La séquence de 45 000 IES a été obtenue, ce qui a permis de reconstituer la séquence MIC de toutes les régions colinéaires avec les « chromosomes » MAC. Ce travail nous a permis de montrer que (i) il n’existe pas de biais entre les régions codantes ou intergéniques pour la localisation des IES dans le MIC, (ii) 47% des gènes sont interrompus par au moins une IES, (iii) 90% des IES sont de taille inférieure à la longueur d’ADN enroulée autour d’un nucléosome, 30% étant comprises entre 26 et 30 bp, et (iv) la distribution en taille des IES présente une périodicité coïncidant avec le pas de la double hélice d’ADN. Les implications de cette contrainte de taille sur le mécanisme d’excision sont maintenant en cours d’étude.
La purification des MIC et des MAC en développement en vue d’en extraire la chromatine est encore en cours de mise an point.
Perspectives : La particularité des réarrangements programmés du génome chez la paramécie est l’absence d’un motif conservé qui pourrait assurer la reconnaissance spécifique des séquences qui sont éliminées lors de la formation du macronoyau. Ce système constitue donc un modèle de choix pour étudier les autres facteurs qui interviennent dans la reconnaissance d’une région particulière du génome. La mise en évidence d’un rôle du positionnement des nucléosomes dans le ciblage de ces régions permettrait d’étendre la fonction de la chromatine au-delà du contrôle de la transcription, à celui de la dynamique du génome.
Publications et brevets : Le partenaire P2 a présenté la problématique abordée dans le projet dans un article de synthèse publié en 2012 dans la revue Biol Cell (Coyne RS et al. RNA-guided DNA rearrangements in ciliates: Is the best genome defense a good offense? Biol Cell. 2012 104, 1–17). L’analyse des IES à l’échelle de tout le génome est actuellement en révision à PloS Genet (Arnaiz, O et al. The Paramecium germline genome provides a niche for intragenic parasitic DNA: Origin and evolution of Internal Eliminated Sequences) et fait l’objet d’un article de synthèse publié par le partenaire P1 (Dubois, E. et al. Transposon invasion of the Paramecium germline genome countered by a domesticated PiggyBac transposase and the NHEJ pathway”. Int J of Evol Biol. Sous presse). Les partenaires P1 et P3 ont présenté ces résultats dans 7 colloques ou réunions en France et à l’étranger.