Projet ANR-15-CE32-0004 – BioXFEL : Caractérisation d'états intermédiaires de protéines fluorescentes en utilisant des lasers à électrons libres X et les spectroscopies UV-visible et infrarouge ultra-rapides
Programme : Défi de tous les savoirs (DS10) 2015
Année de financement : 2015
Coordinateur du projet : Monsieur Martin WEIK (Institut de Biologie Structurale)
Montant : 439932.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Les protéines et leurs complexes régissent le vivant. La détermination de leur structure et de leur dynamique est un prérequis à la compréhension de leur fonction biologique. Une nouvelle génération de sources de rayons-X, les lasers à électrons libres X (XFEL), pourrait permettre à terme de déterminer à la fois la structure et la dynamique d’une protéine unique. Aujourd’hui, deux XFELs (LCLS, Etats-Unis et SACLA, Japon) fournissent déjà ces pulses de rayons-X extrêmement brefs et puissants qui sont requis pour étudier des nano-cristaux de protéines avec une résolution atomique et déterminer les structures d’espèces transitoires avec une résolution temporelle d’une centaine de femtosecondes. En 2016, deux XFELs seront opérationnels en Europe (XFEL Européen, Allemagne et SwissFEL, Suisse). Le but stratégique de notre proposition est de créer un consortium français pour utiliser les XFEL en biologie structurale. Pour cela, nous devons dès aujourd’hui développer des expériences au LCLS et au SACLA, afin d’être prêt pour l’utilisation des XFELs européens.
Notre objectif scientifique est l’utilisation combinée des XFELs et de la spectroscopie optique ultra-rapide pour déterminer avec une résolution atomique et temporelle de la femtoseconde jusqu’à la milliseconde, des structures et cinétiques d’espèces transitoires (photo-produits métastable, états excités) qui sont à l’origine des propriétés intrinsèques de protéines fluorescentes. Nous proposons d’étudier IrisFP et rsEGFP2, deux protéines fluorescentes photo-commutables qui sont utilisées en microscopie optique super-résolue.
Les structures statiques des deux protéines dans les divers états fluorescents et non-fluorescents ont été résolues dans le laboratoire du coordinateur à l’aide du rayonnement synchrotron. La photo-commutation implique une isomérisation cis-trans du chromophore, un transfert de protons avec des changements structuraux concomitants au niveau des acides aminés qui l’entourent. Ces différents processus peuvent avoir lieu à partir d’états excités ou de photo-produits métastables, cependant les détails mécanistiques et cinétiques des photoconversions sont inconnus, car aucune structure d’intermédiaires n’a été résolue à ce jour. En effet, nous avons observé par spectroscopie d’absorption transitoire UV-Vis que les étapes déterminantes dans IrisFP et rsEGFP2 se passent aux échelles fs - ps, des évolutions trop rapides pour pourvoir être étudiée par cristallographie résolue dans le temps au synchrotron (limitée à 100 ps). Par conséquent, l’utilisation des impulsions fs produites par les XFELs est requise. Nous proposons d’effectuer des expériences de spectroscopie optique ultra-rapides électronique et vibrationnelle (absorption transitoire UV-vis et IR, Raman de résonance, fluorescence), en solution et sur des microcristaux pour nous renseigner sur le nombre d’états intermédiaires et de leurs durées de vie. Ensuite, des expériences de cristallographie fs sérielle (SFX) seront effectuées aux XFELs selon le principe pompe-sonde pour résoudre les structures des états intermédiaires identifiés spectroscopiquement. 
Nous avons déjà démontré la faisabilité du projet. En particulier, nous avons produit des micro-cristaux d’IrisFP et de rsEGFP2 et collecté des données SFX XFEL (SACLA et LCLS) qui nous ont permis de déterminer la structure statique des deux protéines. De plus, des expériences de spectroscopie d’absorption transitoire UV-vis ont démontré l’existence de nombreux photo-produits dont les cinétiques couvrent le domaine fs - ms. Nous venons d’obtenir pour ce projet du temps de faisceau aux XFELs du LCLS (# LI56; 29/04 – 3/05/15) et SACLA (#29944; 23-25/07/15).
Les expériences proposées nous offriront une compréhension générale des processus moléculaires associés aux protéines fluorescentes photo-commutables. En cas de succès, notre projet ouvrira un nouveau domaine en biologie structurale, celui du cinéma moléculaire avec une résolution temporelle sans précédent.