Projet ANR-12-JS07-0003 – MELIVAC : Développement d'un vaccin glycoconjugué contre la mélioïdose
Programme : JCJC - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (JCJC SIMI 7)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Charles Gauthier (Institut de Chimie des Milieux et des Matériaux de Poitiers (IC2MP))
Partenaires : Institut de Chimie des Milieux et des Matériaux de Poitiers
Montant : 187842.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 48 mois
Résumé : Vaccin sucré contre la mélioïdose, une maladie tropicale à potentiel bioterroristeLa mélioïdose est une maladie infectieuse causée par la bactérie tropicale B. pseudomallei, un agent potentiel du bioterrorisme. Aucun vaccin n’est à ce jour disponible pour se prémunir contre cette maladie nécessitant un lourd traitement antibiotique. Une approche vaccinale basée sur les sucres exprimés par B. pseudomallei est une voie prometteuse à suivre.
Développement d’un vaccin semi-synthétique sucre-protéine contre la mélioïdoseBurkholderia pseudomallei (Bp), bactérie à gram-négatif, est l’agent infectieux de la mélioïdose. Retrouvée dans les milieux humides de la Thaïlande et du nord de l’Australie, cette bactérie est à la base d’importants problèmes sanitaires en zone d’endémie. La haute virulence de Bp par voie respiratoire, sa résistance accrue aux antibiotiques couplée à un taux de mortalité élevé font de Bp un agent potentiel du bioterrorisme. Aucun vaccin n’étant disponible, la recherche sur le sujet s’est récemment accélérée. Différents vaccins expérimentaux contre la mélioïdose ont été testés chez l’animal, mais aucun n’a permis de prévenir totalement l’infection. De récentes études ont montré que les polysaccharides de surface de Bp peuvent activer la production d’anticorps protecteurs et sont donc des candidats vaccins prometteurs contre la mélioïdose. L’objectif général du projet est de développer un vaccin « glycoconjugué » mimant les polysaccharides exprimés par Bp. Le vaccin sera constitué d’une partie « sucre », obtenue par synthèse organique, chimiquement liée à une protéine porteuse. Ce type de vaccin, qui permet l’induction d’une réponse immunitaire mémoire et ce même chez les groupes à risque, est déjà commercialisé pour la méningite. Il présente, entre autre, l’avantage d’être exempt de contaminants bactériens. La nécessité pour la France de se prémunir d’un vaccin de biodéfense afin de protéger les populations contre la mélioïdose est une priorité. La disponibilité d’un tel vaccin est l’une des meilleures façons de dissuader les « terroristes » d’utiliser une arme biologique basée sur Bp.
Approche méthodologique envisagée pour la préparation d’un vaccin contre la mélioïdoseDe nouvelles méthodologies ont été et seront mises au point en vue de préparer des mimes « fonctionnels » de l’unité répétitive des trois principaux polysaccharides de surface de Bp, i.e. le polysaccharide capsulaire, l’exopolysaccharide et le lipopolysaccharide. Les sucres seront fonctionnalisés à leur extrémité réductrice par un bras espaceur aminé permettant leur couplage subséquent avec une protéine porteuse. En collaboration avec le Pr Ben Davis de l’Université d’Oxford, les sucres seront liés de façon covalente avec la toxoïde diphtérique, une protéine approuvée cliniquement. Après purification par chromatographie à exclusion stérique, le ratio sucre/protéine sera déterminé par des analyses de masse haute résolution. Les techniques spectroscopiques permettront d’évaluer l’intégrité de la protéine après modification. En collaboration avec les chercheurs de l’Institut de Recherche Biomédicale des Armées de Grenoble, des souris seront injectées avec les conjugués. Après quatre semaines, les niveaux d’anticorps seront évalués dans le sérum sanguin à l’aide d’une méthode immuno-enzymatique. Les conjugués présentant le meilleur profil immunogène seront testés pour leur potentiel protecteur. En bref, les souris seront immunisées, et ensuite infectées avec une souche virulente de Bp dans un laboratoire de niveau 3 de confinement. Le pouvoir protecteur des conjugués sera évalué pendant quatre semaines pour leur capacité à accroître significativement l’espérance de vie des souris infectées par Bp.
Résumé de la soumission : Burkholderia pseudomallei (Bp), l’agent infectieux de la mélioïdose, est la cause d’importants problèmes de santé en Thaïlande et en Australie. En raison de sa haute infectivité par voie respiratoire, de sa résistance accrue aux antibiotiques et de son taux de mortalité élevé, Bp est considérée comme une arme biologique potentielle de bioterrorisme. Le développement d’un vaccin fonctionnel contre la mélioïdose, qui pourrait protéger aussi bien la population que les soldats, est d’une importance capitale pour les gouvernements occidentaux. La membrane externe de Bp est couverte par un dense réseau de polysaccharides (LPS, PSC et EPS) qui agissent comme facteurs de virulence de la bactérie, et peuvent activer la production d’anticorps protecteurs chez l’homme. L’objectif principal du projet de recherche est le développement d’un vaccin glycoonjugué contre la mélioïdose basé sur la liaison covalente entre des sucres  synthétiques et une protéine porteuse immunogénique. À cette fin, nous proposons de mettre au point des voies de synthèse performantes pour la préparation d’oligosaccharides mimes de l’Ag-O du LPS, du PSC et de l’EPS de Bp, fonctionnalisés à leur extrémité réductrice par un espaceur aminopentyle. Les oligomères du PSC de Bp présentant une succession linéaire de résidus 2-O-Ac-6-déoxy-beta-D-manno-heptopyranoses seront synthétisés via une approche de glycosylation intramoléculaire. En route vers la synthèse de mimes de l’EPS de Bp, une nouvelle méthodologie sera développée pour la formation stéréosélective des liaisons beta-D-Kdo. L’ester de méthoxyphénacyle sera utilisé en tant que groupement auxiliaire en position C-1. Il devrait permettre la stabilisation de l’ion oxonium via la face alpha du cycle Kdo, favorisant ainsi le couplage sur la face beta moins encombrée. De surcroît, trois hexasaccharides présentant un motif d’acétylation/méthylation naturel non-stoechiométrique seront synthétisés selon une approche convergente basée sur la combinaison judicieuse de deux donneurs taloses et d’un accepteur glucose. Les oligosaccharides synthétisés seront testés pour leur antigénicité chez la souris. Les sucres générant le meilleur profile immunogénique seront liés d’une manière covalente avec la protéine CRM-197. La conjugaison sera effectuée en tirant avantage des 39 résidus lysines présents sur la protéine porteuse via un couplage de type ester NHS ou en présence de thiophosgène. Le ratio sucres sur protéine sera déterminé par analyses SDS-PAGE et MALDI-TOF-MS tandis que les spectroscopies RMN 1H et dichroïsme circulaire seront utilisées pour évaluer l’intégrité de la protéine après modification. Les souris BALB/c seront immunisées avec les glycoconjugués synthétiques, et seront ensuite infectées avec une souche virulente de Bp. Le potentiel immunogénique des vaccins glycoconjugués sera mesuré selon leur capacité à accroître la durée de vie des souris infectées et, éventuellement, de les protéger contre l’infection à Bp.
Résultats : Durant les six premiers mois du projet, les efforts de recherche se sont concentrés sur la préparation des mimes de l’exopolysaccharide (EPS) et du polysaccharide capsulaire (CPS) de Bp. Pour la partie EPS, une méthodologie a été développée pour l’obtention stéréosélective de glycosides de l’acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique (Kdo). Ce composé constitue l’un des quatre sucres nécessaires à la préparation de l’unité répétitive de l’EPS. Il est à noter que cette méthodologie pourrait être utilisée pour la préparation de mimes d’EPS à résidus Kdo provenant d’autres espèces du genre Burkholderia. Par la suite, trois différents dérivés galactosylés correctement fonctionnalisés ont été préparés à une échelle supérieure au gramme. L’agencement convergent de ces quatre sucres devrait permettre l’obtention d’un premier tétrasaccharide mime de l’EPS de Bp prêt à être couplé sur une protéine porteuse. Pour la partie CPS, les travaux ont consisté à la préparation à grande échelle (>3 g) d’un dérivé mannoheptose. Ce dernier a été fonctionnalisé avec un bras espaceur aminé par une réaction de glycosylation intramoléculaire. L’acétylation suivie de la déprotection globale de la molécule génèrera le premier monosaccharide mime du CPS de Bp. L’étude de la polymérisation contrôlée du dérivé mannoheptose est présentement en cours. Cette approche innovante a pour objectif l’obtention d’oligomères de différentes tailles (deux à cinq résidus) pouvant simuler le polymère bactérien.
Perspectives : Bp est une bactérie hautement virulente par voie respiratoire, multi-résistante aux antibiotiques, et présente un taux de mortalité très élevé (=50%). Aucun vaccin n’est disponible pour s’en protéger. En outre, le nombre de cas de mélioïdose à travers le monde ne cesse de croître. Ces facteurs font de Bp une arme biologique de choix pour les terroristes et une préoccupation majeure pour les acteurs de santé publique. La découverte d’un vaccin fonctionnel contre la mélioïdose est donc une priorité pour le gouvernement français. La Direction Générale de l’Armement (DGA) est également intéressé par un tel vaccin. En effet, certains pays, dont l’ancienne U.R.S.S. et l’Égypte, ont déjà étudié la possibilité de développer une arme biologique basée sur Bp. De plus, des cas de contamination avec Bp sont fréquemment rapportés par les soldats et le personnel militaire œuvrant en zone d’endémie.
Publications et brevets : Le projet n’a pas, pour l’instant, donné lieu à la publication d’articles scientifiques ou de brevets. Deux articles en lien avec la synthèse organique sont en préparation et devraient être soumis début 2014 dans des revues générales de chimie. Par ailleurs, le projet préliminaire a été présenté lors du 2e Séminaire du Département de Microbiologie de l’Institut de Recherche Biomédicale des Armées (IRBA) à l’école du Val-de-Grâce de Paris, France, le 16 octobre 2012.