Projet ANR-08-PCVI-0036 – NUCLEOPOL : Integrated structural biology of rDNA transcription
Programme : Programme interdiciplinaire en physique et chimie du vivant (PCV) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE - CERBM (CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE - CERBM)
Partenaires : CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE; Centre national de la recherche scientifique; Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 36 mois
Résumé : La synthèse des précurseurs des ARN ribosomiques est réalisée par l'ARN Polymérase I (ARN Pol I) et représente environ 65 % de l'activité transcriptionelle d'une cellule eucaryote. Cette activité essentielle est régulée au cours du cycle cellulaire ainsi que par l'activation de différentes voies de signalisation. La transcription de l'ADNr se déroule dans un compartiment nucléaire: le nucléole où elle est couplée à maturation de l'ARNr et à l'assemblage des particules pre-ribosomiques. La régulation transcriptionnelle est associée à une réorganisation profonde de la structure du nucléole qui se transforme au cours du cycle cellulaire. L'ARN Pol I elle-même, de par son organisation en unités de transcription active, est un acteur incontournable des variations spatio-temporelles du nucléole. Notre objectif est d'étudier le rôle de la transcription par l'ARN Pol I, la maturation de l'ARN ribosomique et l'assemblage en pré-ribosomes dans l'organisation structurale du nucléole. Nous étudierons à plusieurs niveaux de résolution la structure et la dynamique de l'ARN Pol I dans différents contextes cellulaires et extra-cellulaires. Dans un premier temps, nous chercherons à décrire la structure moléculaire d'un complexe d'initiation de la transcription par l'ARN Pol I dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous utiliserons une combinaison d'approches de biologie moléculaire, de génétique de la levure et de biophysique pour reconstituer in vitro un complexe d'initiation fonctionnel et pour visualiser celui ci par cryo microscopie électronique (Cryo ME) afin de déterminer un modèle tridimensionnel (3-D) du complexe sous forme hydratée. Nous utiliserons une souche de levure mutante qui stabilise une interaction critique entre l'ARN Pol I et le facteur de transcription Rrn3 et consolide le complexe d'initiation. Nous avons déjà déterminé un modèle 3-D de l'ARN Pol I à 18 ú de résolution qui sera utilisé comme référence pour étudier les réorganisations structurales de l'enzyme et ses interactions avec les facteurs d'initiation et l'ADN dans le complexe d'initiation. Ces informations seront corrélées avec la structure atomique de l'ARN Pol II afin d'identifier les domaines structuraux impliqués. Des facteurs d'initiation actifs en transcription in vitro sont d'ors et déjà produits dans des cellules d'insectes et purifiés à homogénéité. Dans une seconde partie, nous étudierons par cryo tomographie électronique, la structure 3-D d'unités de transcription partiellement purifiées. Nous adapterons les méthodes d'étalement de la chromatine pour visualiser les unités de transcription et utiliserons des méthodes d'analyse d'images dédiées pour comprendre l'architecture des ARN Pol I associées aux particules ribonucléoprotéiques. La position de l'ARN pol I sur le gène décrit son état cinétique ce qui permet d'extraire une information résolue en temps du couplage entre la transcription, la maturation de l'ARN et l'assemblage en pré-ribosomes. Nous emploierons des souches de levure mutantes et des marquages immunologiques des unités de transcription pour explorer la maturation de l'ARNr. Nous souhaitons ensuite localiser les unités de transcription dans la cellule afin d'analyser leur compaction et leur position dans le nucléole. Nous concentrerons nos efforts sur la localisation de l'ARN Pol I et utiliserons des méthodes de pointe pour préserver au mieux l'ultrastructure cellulaire (congélation haute pression, cryo substitution, cryo coupes de cellules hydratées congelées). Nous utiliserons la cryo tomographie électronique pour déterminer la structure 3-D des coupes de nucléole ainsi que trois approches pour révéler l'ARN Pol I : des immunomarquages, des souches de levure mutantes avec une modification du taux d'occupation des gènes par l'ARN Pol I et la reconnaissance de la forme de l'enzyme dans des cryo tomogrammes. La distribution des molécules d'ARN Pol I révélera l'organisation 3-D des unités de transcription dans leur contexte cellulaire. Enf