Projet ANR-13-NANO-0007 – BioSiPharm : Sécurité biologique des nanoparticules de silice mésoporeuse selon leur recouvrement de surface et mise en place de standards d'évaluation
Programme : Nanotechnologies et nanosystèmes (P2N)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Jean-Marie Devoisselle (Institut Charles Gerhardt)
Partenaires : Divers privé; Laboratoire public; NANOMEDSYN
Montant : 799666.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 42 mois
Résumé : Sécurité biologique des nanoparticules de silice mésoporeuse selon leur recouvrement de surface et mise en place de standards d'évaluationCe projet se situe dans le contexte des nanoparticules à visée thérapeutique et diagnostique. Des travaux récents montrent un intérêt grandissant vers des nanoparticules siliciques mésoporeuses pour une application thérapeutique et/ou diagnostique. Cependant il existe très peu d ‘études concernant leur toxicité potentielle. Ce domaine nécessite des méthodes nouvelles pouvant faire l’objet de standards  permettant de relier des caractéristiques de surface et leur toxicité.
Nanoparticules mésoporeuses et comportement in vitro et in vivoDes nanoparticules siliciques mésoporeuses (deux porosités différentes) et magnétiques de 100 nm de diamètre seront synthétisées puis décorées par PEGylation pour une série soit par dépôt d’une bicouche phospholipidique à leur s urface pour une deuxième série. Le devenir de ces nanoparticules sera étudié après incubation dans différents milieux biologiques  et après interaction avec des cellules ainsi que leur devenir in vivo.
Comportement des NPs : approche physico-chimue, cellulaire et in vivoLa séparation des nanoparticules s’effectuera par magnétisme afin de préserver la couronne de protéines  adsorbées à leur surface. Les interactions avec les cellules seront suivies par microscopie de fluorescence biphotonique. Un technique ultrasensible protéomique sera mise en œuvre pour déceler les protéines adsorbées à la surface des ces différentes nanoparticules. Malgré les nombreuses études consacrées auxinteractions entre nanoparticules et cellules dont certaines reliées à leur toxicité potentielle, peu de travaux sont consacrés à un examen précoce et approfondi de leur impact cellulaire. La nanotoxicité et les conséquences du comportement deces différentes nanoparticules (extra- et intracellulaires) seront abordées dans ce projet par une approche transcriptomique. Cette information semble cruciale pour le futur développement industriel de  telles nanoparticules et leur sécurité d’emploi comme système de libération de principes actifs et/ou d’agents de contraste
Résumé de la soumission : Ce projet se situe dans le contexte des nanoparticules à visée thérapeutique et diagnostique et a pour objectif d’étudier leur toxicité potentielle in vitro et in vivo. Les nanoparticules administrées par voie intraveineuse peuvent être décorées à leur surface de différentes façons (PEGylation, bicouche phospholipidique afin de maitriser leur pharmacocinétique et leur biodistribution. Parmi ces nanoparticules,  des travaux récents montrent un intérêt grandissant vers des nanoparticules siliciques mésoporeuses pour une application thérapeutique et/ou diagnostique. Cependant il existe très peu d ‘études concernant leur toxicité potentielle. De plus, ce domaine nécessite des méthodes nouvelles pouvant faire l’objet de standards futurs permettant de relier des caractéristiques de surface et leur toxicité.Des nanoparticules siliciques mésoporeuses (deux porosités différentes) et magnétiques  de 100 nm de diamètre seront synthétisées puis décorées  par PEGylation pour une série soit par dépôt d’une bicouche phospholipidique à leur surface pour une deuxième série. Le devenir de ces nanoparticules sera étudié après incubation dans différents milieux biologiques  et après interaction avec des cellules. La séparation des nanoparticules s’effectuera par magnétisme afin de préserver la couronne de protéines  adsorbées à leur surface. Les interactions avec les cellules seront suivies par microscopie de fluorescence biphotonique. Un technique ultrasensible protéomique sera mise en œuvre pour déceler les protéines adsorbées à la surface des ces différentes nanoparticules. Malgré les nombreuses études consacrées aux interactions entre nanoparticules et cellules dont certaines reliées à leur toxicité potentielle, peu de travaux sont consacrés à un examen précoce et approfondi de leur impact cellulaire. La nanotoxicité et les conséquences du comportement de ces différentes nanoparticules (extra- et intracellulaires) seront abordées dans ce projet par une approche transcriptomique. Cette information semble cruciale pour le futur développement industriel de  telles nanoparticules et leur sécurité d’emploi comme système de libération de principes actifs et/ou d’agents de contraste.La biocompatibilité, la biodistribution et la toxicité de ces différentes nanoparticules seront évaluées sur des cellules en culture et in vivo chez la souris. La stratégie de la société NanoMedSyn, partenaire de ce projet, implique le développement de nanoparticules mésoporeuses siliciques pour le traitement  de cancers de petite taille par ciblage et thérapie photodynamique. Même si cette société a développé des approches innovantes ayant fait l’objet de brevets, la compréhension fondamentale de la réactivité de surface de ces nanoparticles en fonction de leur décoration de surface en relation avec leur toxicité in vivo reste un défi essentiel avant toute utilisation clinique. Ce projet multidisciplinaire s’attache donc à étudier les relations entre caractéristiques de surface (physique : porosité, chimique, PEGylation et bicouche phospholipidique) et leur comportement et toxicité après administration intraveineuse. De plus, ce projet permet aussi de participer à la sécurisation de l’utilisation de nanoparticules nécessitent la mise au point de méthodes standards pour évaluer et classer la sécurité d’emploi de nanomédicaments prometteurs.
Résultats : •	Synthèses des NPs et NPs fluorescentes nues
•	décoration par recouvrement de bicouche phospholipidique
•	Mise au point d’un protocole de reprise en suspension pour les solutions-stocks de NPs nues.
•	Etude granulométrique et charge de surface des NPs nues et recouvertes (bicouche phospholipidique) à cœur magnétique dans différents milieux par DLS.
•	Courbe dose-réponse par test de viabilité (ATP) sur cellule HepG2 avec les NPs à cœur magnétique.
•	Courbe cinétique par test d’impédance cellulaire (XCELLigence) sur cellule HepG2 avec les NPs à cœur magnétique.
•	Mise au point de l’étude cinétique de la corona en sérum par quantification des protéines adsorbées par test BCA.
•	Parallèlement, mise au point de tests transcriptomiques par exposition de cellules modèles à des NPs de silice et mise en évidence d’une réponse hiérarchique au stress en fonction de la concentration des NPs.
Perspectives : •	Standardisation des conditions de synthèse des NPS nues et fluorescentes et PEGylées par chimie sol-gel : obtention de lots reproductibles et calibrés en cours
•	Mise au point d’un protocole de suspension pour les solutions-stocks de NPs décorées.
•	Evaluation de la toxicité des particules décorées (dose-réponse et cinétique) versus nues
•	Poursuite des études comparatives biochimiques et protéomiques de la corona en sérum bovin et humain
•	Analyses transcriptomiques des diverses particules sur les cellules HepG2 et fouille biologique pour la mise en évidence des modes d’action.
Publications et brevets : 1.	Cédric Pisani, Jean-Charles Gaillard, Virginie Nouvel, Michaël Odorico, Jean Armengaud, Odette Prat (2015). High-throughput, quantitative assessment of the effects of low-dose silica nanoparticles on lung cells: grasping complex toxicity with a great depth of field. BMC Genomics. Apr 18;16:315.