Projet ANR-11-BSV8-0009 – Decapping : Mécanisme de clivage de la coiffe des ARNm eucaryotes
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Marc GRAILLE (CNRS DR IDF SECTEUR  OUEST NORD)
Partenaires : Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE; Bases Moléculaires et Régulation de la Biosynthèse Protéique; Institut de Biochimie et Biophysique Moléculaire et Cellulaire
Montant : 450000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Mécanisme de dégradation de la coiffe, une étape critique de la régulation de l'expression géniqueL’objectif est de déterminer le mécanisme d’activation et de régulation de l’enzyme Dcp2 qui coupe un des éléments protecteurs (la coiffe en 5’) des ARN messagers (ARNm) eucaryotes. Il s’agit d’une étape décisive dans la dégradation des ARNm et donc dans la régulation de l’expression des gènes.
Dissection du processus de dégradation de la coiffe des ARNm et de sa régulation.Les ARNm eucaryotes matures sont protégés d’une dégradation rapide et non régulée dans le cytoplasme par deux éléments stabilisateurs: une coiffe et une queue poly(A), respectivement au niveau des extrémités 5’ et 3’ des ARNm. La dégradation des ARNm nécessite donc un remodelage conséquent de la structure des ARNm qui est déclenché par des signaux spécifiques et permet le recrutement d’activateurs de leur dégradation. La dégradation des ARNm eucaryotes est généralement initiée par la dégradation de la queue poly(A) suivie de l’élimination de la coiffe en 5’. Cette dernière étape est réalisée par le complexe enzymatique Dcp1-Dcp2, où Dcp2 est la sous-unité catalytique et Dcp1 son activateur. Ce complexe possède une très faible activité enzymatique intrinsèque et nécessite le recrutement de nombreux facteurs qui vont l’activer par un mécanisme qui demeure largement obscur.L’objectif de ce projet est de déterminer les mécanismes d’activation du complexe Dcp1-Dcp2 et de comprendre les moyens utilisés par les cellules pour réguler ce processus au cours du développement des cellules ou lors de l’exposition à des signaux environnementaux externes.
Couplage entre des approches structurales, fonctionnelles et mécanistiques.Notre consortium regroupe des compétences très complémentaires dont les domaines d’expertise s’étendent de la biologie structurale à la biochimie et la génétique moléculaire. Notre objectif est de mieux comprendre le mécanisme de dégradation de la coiffe des ARNm en:•	déterminant précisément les régions de chaque protéine impliquées dans la formation du réseau d’interaction entre ces différentes protéines;•	exprimant et purifiant les facteurs impliqués dans ce mécanisme ;•	obtenant des informations structurales, à la résolution atomique, sur ces protéines et sur les complexes multiprotéiques qu’elles forment, par cristallographie des rayons X ou d’autres méthodes adaptées ;•	étudiant les relations entre les facteurs impliqués dans la dégradation de la coiffe par des approches de génétique et de biochimie •	analysant l’influence de ces interactions sur la régulation de la stabilité des ARNm et l’inhibition de la synthèse des protéines
Résumé de la soumission : Le transfert fidèle de l’information génétique de l’ADN aux protéines en passant par les ARN messagers (ARNm) requiert, chez les eucaryotes, de nombreuses étapes. Pour cela, les cellules possèdent des machineries hautement régulées permettant l’expression des gènes. Dans le cas des ARNm, cela nécessite des complexes multimériques protéine-ARNm (mRNP) impliqués dans l’épissage, la polyadénylation, l’export des ARNm du noyau vers le cytoplasme, leur traduction en protéines et leur dégradation finale. Pendant longtemps, la dégradation des ARNm eucaryotes a été considérée comme une étape passive mais cette idée s’est modifiée au cours des dernières années. La dégradation apparaît maintenant comme un processus hautement régulé qui permet aux cellules de modifier rapidement les niveaux de protéines en réponse à différents stimuli. La régulation des vitesses de dégradation des ARNm constitue un point de contrôle important dans la détermination de l’abondance de certains transcrits cellulaires. Ainsi, les vitesses de dégradation de certains ARNm varient fortement au cours du cycle cellulaire ou en réponse à des stimuli externes. Ces différences ont des effets notables sur l’expression de certains gènes et permettent aux cellules de modifier rapidement l’abondance de certains ARNm et par conséquent de réguler l’expression génique. Afin de comprendre le contrôle de l’expression génique, il est nécessaire de déchiffrer la régulation et les mécanismes de dégradation des ARNm. Lors des dernières années, la majorité des protéines impliquées dans la dégradation des ARNm a été identifiée, offrant une vision globale assez nette de la dégradation des ARNm dans le cytoplasme des cellules eucaryotes. Cependant, si les protéines intervenant dans la dégradation des ARNm sont connues, elles font toutes partie de complexes protéiques multifonctionnels et dynamiques dont l’importance devient de plus en plus évidente. Il est donc nécessaire de comprendre les bases moléculaires responsable de la dynamique de ces complexes et les interactions impliquées afin de comprendre les mécanismes de dégradation des ARNm et leur régulation.Les ARNm eucaryotes matures sont protégés d’une dégradation rapide et non régulée dans le cytoplasme par deux éléments stabilisateurs: une coiffe (méthylguanosine) et une queue poly(A), respectivement au niveau des extrémités 5’ et 3’ des ARNm. La dégradation des ARNm nécessite donc un remodelage conséquent de la structure mRNP qui est déclenché par des signaux spécifiques et permet le recrutement d’activateurs de la dégradation. La dégradation des ARNm eucaryotes est généralement initiée par la déadenylation suivie de l’élimination de la coiffe en 5’. Cette dernière étape est réalisée par le complexe enzymatique Dcp1-Dcp2, où Dcp2 est la sous-unité catalytique et Dcp1 son activateur. Ce complexe possède une très faible activité enzymatique intrinsèque et nécessite le recrutement de nombreux facteurs qui vont l’activer par un mécanisme qui demeure largement obscur. Lorsque la coiffe des ARNm a été clivée, ils sont rapidement dégradés dans le sens 5’?3’ par l’exonucléase cytoplasmique Xrn1 qui interagit avec la machinerie de coupure de la coiffe des ARNm.L’objectif de ce projet est de déterminer les mécanismes d’activation du complexe Dcp1-Dcp2 par des approches structurales et fonctionnelles et en utilisant la levure S. cerevisiae comme modèle d’étude. Nous étudierons les différentes protéines connues pour influencer le processus de clivage de la coiffe des ARNm de façon à déterminer leur rôle précis sur (1) l’activation de Dcp1-Dcp2 ; (2) le remodelage des structures mRNP et (3) la relation entre l’inhibition de l’étape d’initiation de la traduction et la dégradation des ARNm. Pour atteindre cet objectif, nous avons établi un consortium alliant des compétences très complémentaires dont les domaines d’expertise s’étendent de la biologie structurale à la biochimie et la génétique moléculaire.
Résultats : Le projet a débuté il y a 6 mois. Aucun jeu de résultats complet permettant la soumission d’une publication n’a été obtenu dans ce court laps de temps, mais beaucoup de résultats préliminaires qui nécessitent des études complémentaires ont été réunis (production de protéines et complexes recombinants, obtention de cristaux, définition d’interactions, construction de mutants et tests fonctionnels…).
Perspectives : Ce projet nous permettra d’améliorer nos connaissances sur les mécanismes et la dynamique de la dégradation des ARNm chez les eucaryotes. En effet, ce mécanisme n’est pas passif mais est finement régulé de façon à permettre aux cellules de s’adapter au cours de leur développement ou en réponse à des stimuli. Ainsi, nous pouvons espérer mieux comprendre l’un des mécanismes utilisés par les cellules pour réguler l’expression de certains gènes.
Publications et brevets : Le projet a débuté il y a 6 mois. Pour le moment, aucun article n’a été publié mais une revue chevauchant ce sujet est en préparation par les collaborateurs.