Projet ANR-12-BSV6-0014 – ZygoPat : Formation et Intégrité des chromosomes paternels dans le zygote
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Benjamin Loppin (Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaire et Cellulaire)
Partenaires : Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaire et Cellulaire; Laboratoire de Biologie et Modélisation de la Cellule
Montant : 300000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Préserver l’intégrité des chromosomes paternels dans l’oeufEtude de Maternal Haploid, une protéine de l’oeuf conservée chez les animaux et qui assure la transmission et l’intégrité des chromosomes paternels pour le développement du futur embryon.
Comprendre la transmission des chromosomes paternels à la fécondationLe développement de la presque totalité des animaux débute lors de la formation du zygote qui réunit les noyaux de l’oeuf et du spermatozoïde. Cette étape cruciale pour l’embryon est longtemps restée ignorée et demeure encore relativement mal connue. En particulier, le noyau du gamète mâle qui transmet tous les chromosomes du père subit une réorganisation spectaculaire mais mal connue à la fécondation. Cette réorganisation permet de transformer le noyau ultracompact et inactif du spermatozoïde en un noyau à l’organisation standard appelé pronucleus. Ce reformatage du noyau mâle fait intervenir différentes protéines de l’oeuf essentielles pour la formation du zygote.No travaux récents chez la drosophile ont permis d’identifier une nouvelle protéine de l’oeuf (MH) critique pour l’intégrité des chromosomes paternels. Notre hypothèse actuelle implique un rôle de MH dans la préparation du génome paternel à la première réplication. Le programme ZygoPat a pour objectif d’identifier la fonction moléculaire de cette protéine afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeux lors de la formation du zygote.
Etudier le rôle de MH in vivo chez les organismes modèlesNotre compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeux lors de la formation du zygote dépend largement de l’utilisation d’organismes modèles. C’est chez la drosophile que le partenaire #1 a identifié le rôle essentielle de la protéine Maternal Haploid (MH) pour la transmission des chromosomes paternels au zygote. Notre méthodologie principale s’appuie en effet sur l’utilisation de la puissance génétique du modèle drosophile et sur l’utilisation de microscopie confocale, qui permet l’observation intime de la formation du zygote au coeur de l’oeuf. Cette approche est complétée par l’étude du même gène chez le nématode C. elegans par le partenaire #2 afin d’étudier la conservation fonctionnelle de MH. Enfin, la réalisation d’un crible à grande échelle par « ARN interférence en lignée germinale » chez la drosophile nous a permis d’identifier de nouveaux gènes essentiels pour la transmission des chromosomes paternels.
Résumé de la soumission : Lors de la reproduction sexuée, l'union des deux gamètes haploïdes forme le zygote, la première cellule de l'embryon. Chez les animaux, le noyau du spermatozoïde est très condensé et son ADN est empaqueté d'une manière incompatible avec les grandes fonctions nucléaires. A la fécondation, sa transformation en un pronucleus implique le remplacement, à l'échelle du génome entier, des protéines chromosomiques spécifiques du gamète mâle par des histones fournies par le cytoplasme de l'œuf, la réparation des lésions accumulées sur l'ADN paternel et l'acquisition de novo d'un programme de réplication. La réalisation correcte de chacune de ces étapes lors de la décondensation du noyau mâle est essentielle pour la transmission des chromosomes paternels au zygote. La drosophile est un modèle puissant pour l'étude fonctionnelle de ces processus qui sont assez mal connus. Dans ce projet, le partenaire#1 (B. Loppin) se propose d'étudier la formation du pronucleus mâle au travers de l'étude fonctionnelle d'une nouvelle protéine conservée, Maternal Haploid (MH), qui est spécifiquement requise pour l'intégration des chromosomes paternels dans le zygote. Par l'emploi d'approches expérimentales diverses, telles que l'utilisation de transgènes exprimant des protéines recombinantes,  l'imagerie de pointe et la purification de complexes protéiques, nous chercherons à explorer le rôle de MH dans le noyau mâle. Nous nous intéresserons en particulier aux processus de réplication, de réparation et de condensation de l'ADN paternel, en fonction des pistes suggérées par l'analyse détaillée du phénotype mutant. 	Ces efforts seront combinés à ceux d'un autre groupe (Partenaire#2 - F. Palladino) afin de déterminer si le rôle de MH dans la formation du pronucleus mâle est généralisable à d'autres métazoaires ou si la protéine a acquis d'autres fonctions au cours de l'évolution.  Dans ce but, nous caractériserons fonctionnellement l'orthologue de mh chez C. elegans (un allèle nul est disponible) et nous étudierons la distribution cytologique de la protéine au cours du développement. Un autre intérêt majeur associé à l'étude de MH est la présence d'un domaine protéique appelé SprT, très conservé chez tous les orthologues. De façon intéressante, cet ancien domaine contient un motif catalytique trouvé chez certaines protéases dépendantes du zinc. Les génomes animaux possèdent un nombre étonnamment faible de gènes codant pour des protéines à domaine SprT et aucun d'entre eux n'a encore été étudié. Nous escomptons donc caractériser pour la première fois le rôle de ce domaine, dans la protéine MH, chez les deux organismes modèles. 	La troisième tâche principale de ce projet sera consacrée à exploiter une nouvelle ressource de lignées transgéniques de drosophiles exprimant des ARN interférants dans la lignée germinale femelle. Cet outil précieux nous permettra de réaliser un crible génétique à grande échelle visant à identifier de nouveaux gènes requis pour la formation des chromosomes paternels. Nous espérons en particulier sélectionner des lignées associées à un phénotype de type mh afin d'identifier des gènes impliqués dans les mêmes processus moléculaires. 	En conclusion, notre analyse combinée des orthologues de mh chez la drosophile et le nématode devrait non seulement élucider le rôle de MH lors de la formation du pronucleus mâle, mais également apporter une perspective plus large sur sa fonction moléculaire et sur sa conservation fonctionnelle chez les métazoaires.
Résultats : Les travaux déjà réalisés ont permis de montrer que MH est essentiel pour préparer le génome paternel pour la première réplication zygotique. MH possède un domaine protéase qui pourrait être impliqué dans l'élimination de certaines protéines chromosomiques du sperme ou impliquée dans la réorganisation topologique du noyau mâle. La protéine MH est très conservée, et est représentée chez l'homme par la protéine Spartan, dont plusieurs équipes viennent de mettre en évidence le rôle dans la résistance du génome aux rayonnements UV. Sur la base de ces travaux, nous avons pu effectivement observer que les larves mh mutantes sont hypersensibles aux UV, ce qui démontre la conservation fonctionnelle entre MH et Spartan.
Nous avons par ailleurs effectué un crible génétique qui nous a permis d’identifier plusieurs nouvelles fonctions maternelles esentielle pour la formation des chromosomes paternels dans l’oeuf. L’étude de ces nouveaux gènes est en cours.
Perspectives : A compléter ultérieurement.
Publications et brevets : 1.	 Delabaere L, Orsi G, Sapey-Triomphe L, Horard B, Couble P and Loppin B. The Spartan ortholog maternal haploid is required for paternal chromosome integrity in the Drosophila zygote (2014) Current Biology, in press.
2.      Tirmarche S, Kimura S, Sapey-Triomphe L, Sullivan W, Landmann F, and Loppin B. Drosophila protamine-like Mst35Ba and Mst35Bb are required for proper sperm nuclear morphogenesis but are dispensable for male fertility. G3 :Genes, Genomes, Genetics, in press