Projet ANR-08-MIEN-0017 – INTESTINALAMIBE : Analyse moléculaire et cellulaire de la mobilité et du processus infectieux de Entamoeba histolytica pendant l'amibiase
Programme : Maladies Infectieuses et environnement (MIE) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : INSTITUT PASTEUR (INSTITUT PASTEUR)
Partenaires : Institut Curie; Institut Pasteur; Institut Pasteur; Institut Pasteur
Montant : 580000.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 36 mois
Résumé : La mobilité cellulaire repose sur des mécanismes physiques et moléculaires qui engendrent la polarisation de la cellule et orientent son déplacement vers des sources d'attraction telles les molécules inflammatoires. La distribution de complexes protéiques, du cytosquelette et d'adhérence, établit un axe de polarisation antéropostérieur de la cellule, matérialisé par le pseudopode frontal et l'uropode caudal. L'objectif est de comprendre les mécanismes cellulaires, physiques et moléculaires impliqués dans la mobilité de Entamoeba histolytica (agent responsable de la dysenterie) au sein de l'intestin humain. In vitro et sur un modèle d'explants de colon humain, des approches cellulaires (par imagerie), physiques et informatiques nous permettront de déterminer les éléments clés gouvernant cette mobilité. L'analyse du transcriptome de parasites obtenus soit en interaction avec la muqueuse intestinale soit isolés de selles de patients rendra compte des facteurs clés du processus pathogèneEntamoeba histolytica envahit la muqueuse intestinale et conduit à 50 millions de cas de dysenterie par an. Deux modes de déplacement sont observés : aléatoire dans un environnement dépourvu de gradient chimiotactique, ou directionnelle obéissant à des régulations du milieu telle la sécrétion de chemokines. En présence de TNF, un pseudopode unique se forme, le cytosquelette se modifie et le déplacement est plus rapide. Nous établirons une relation entre la fréquence de formation de pseudopodes (changement de morphologie) et le déplacement orienté (vitesse de mouvement, trajectoire) :
A-	En présence d'un gradient de TNF, ou sur des explants de colon, nous suivrons l'actine fluorescente, les changements de morphologie et de vitesse des parasites sauvages ou deficients pour le cytosquelette, l'adhérence ou la liaison au TNF. Nous utiliserons la microscopie multifocale monophoton  (visualisation à haute vitesse des microfilaments) ; la microscopie à deux photons (analyse en profondeur des échantillons vivants) et la microscopie « fluorescent speckle » (analyse de l¿assemblage / désassemblage de complexes in vivo).
B-	Par FRAP et contraste de champ clair (Nomarski), nous éprouverons un modèle physique qui tient compte : i) des forces de compression / relaxation des membranes en interaction avec le complexe actomyosine au sein de la protusion; ii) de la dynamique de polymérisation / dépolymérisation des filaments d¿actine ; ii) du milieu extérieur qui contrôle la balance osmotique contribuant à la dynamique de la protusion.
C-	À l'aide de biopuces Entamoeba, et des parasites virulents (isolés de selles de patients ou dans l'explant de colon) nous identifierons les gènes impliqués dans les étapes précoces de l'infection et dans la phase aiguë de la dysenterie.
D-	Nous implémenterons des méthodes mathématiques caractérisant la déformation des cellules, leur vitesse et orientation, par des algorithmes analysant les « contours actifs ». La dynamique des filaments sera analysé Les mécanismes soustendant la migration cellulaire orientée et sa régulation lors de l'invasion de l'intestin par E. histolytica seront élucidés. Nous attendons la mise en évidence : i) des caractéristiques de vitesse de croissance, de demi-vie et d'organisation macromoléculaire des filaments d'actine in vivo ; ii) du rôle des protéines associées aux microfilaments (myosine); iii) du rôle du TNF dans la chimiotaxie et dans l'activation des amibes ; iv) du rôle des molécules d¿adhérence dans la mobilité cellulaire au sein de tissus vivants; v) des gènes régulant le processus pathogène. L'étude de la mobilité aléatoire soulignera les éléments clés de l'interaction cytosquelette/membrane lors de la formation d¿un front de migration. Nos méthodes mathématiques inédites seront puissantes pour l'étude des cellules mobiles en situation normale (lymphocytaires) ou pathologique (cancéreuses), et pour l¿identification du rôle de complexes adhésifs dans la migration de ces cellules.