Projet ANR-07-BLAN-0263 – Efflux : Dynamical assembly of efflux pump membrane proteins in a biomimetic bilayer
Programme : Blanc (BLANC) 2007
Année de financement : 2007
Coordinateur du projet : CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS A (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS A)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 350000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : P. aeruginosa, bactérie gram négatif à double paroi bactérienne, possède de nombreuses façons de résister aux antibiotiques. L'efflux actif est un des mécanismes primordiaux décrits. Ce mécanisme est la cause de nombreux phénotypes multidrogues-résistants chez P. aeruginosa. -  Parmi les douze systèmes identifiés dans le génome complet de P. aeruginosa, quatre ont été biochimiquement identifiés -  Chacune est composée de trois protéines codées par des gènes organisés en opéron. -  ' Une protéine type RND (pour Resistance Nodulation Division family) de la membrane cytoplasmique (MexB, MexD, MexF, MexY) agit comme une pompe liée à la force proto-motrice ayant une large spécificité de substrats à rejeter. -  ' Une seconde protéine OMF (Outer Membrane Factor family) : OprM, OprJ, OprN, OpmG est logée dans la membrane externe. -  ' La troisième protéine MFP (Membrane Fusion Protein family) : MexA, MexC, MexE, MexX est localisée dans l'espace périplasmique et assure le lien physique entre les deux autres. -  Les spécificités de recrutement restent mal connues ; par exemple le système MexX/Y fonctionne soit avec la protéine de la membrane externe OprM, soit avec OpmG. -  Seul le système MexAB-OprM est exprimé constitutivement, les trois autres ne l'étant que dans des conditions particulières qu'il reste à élucider. -  Le présent projet se situe à l'interface de la physique et de la biologie. Il rassemble des biologistes moléculaires, des biochimistes, chimistes, structuralistes et spécialistes des phases lamellaires et des vésicules. -  L'objectif principal du projet est de reconstituer in vitro une pompe d'efflux en utilisant les micromanipulations dans des bicouches biomimétiques. Ce projet est divisé en trois workpackages: -  WP1: Co-expression dans un même vecteur (par 2 ou par 3) et purification des protéines de pompe à efflux (équipe 1) -  WP2: Compréhension des mécanismes d'assemblage (équipe 2) et pour cela nous étudierons -  2.1	La distance entre les bicouches et le mode d'interaction des protéines constituantes -  2.2	La stoechiométrie nécessaire à l'assemblage -  2.3	L'énergie et les constantes d'association entre les différentes composants d'une pompe -  WP3: Assemblages et activation des constituants d'une pompe à efflux dans vésicules lamellaires géantes (équipe 1 et 2) -  -  À court terme, la reconstitution d'un système d'efflux permettra d'étudier les propriétés d'assemblage dynamique des constituants et leur influence sur l'activité d'une pompe. Pour cela la technique des vésicules micromanipulées permettra de répondre à des questions énergétiques mais aussi fonctionnelles -  -  Sur le long terme, la réalisation d'un nouveau système à double paroi membranaire impliqué dans de tels mécanismes d'efflux devrait permettre de nouvelles possibilités de criblage direct de drogues in vitro et mettre au jour le développement de futurs agents antimicrobiens. -  -  Les compétences complémentaires acquises chez les deux partenaires de ce projet sont les suivantes: -  Equipe A. Ducruix à la Faculté de Pharmacie de Paris -  L'équipe 1 possède la maîtrise de la production et de la manipulation de protéines membranaires. Elle a développé des outils de biologie moléculaire (nouvelles souches) pour la surexpression des pompes à efflux, étape nécessaire à toute approche de biophysique. Elle dispose des appareils pour effectuer la purification en détergent (coût important) de grandes quantités de protéines purifiées. Elle a une expertise en cristallisation qu'elle a étendue à l'étude de l'assemblage in vitro des protéines de pompe à efflux. -  Equipe W. Urbach au LPS de l'ENS: -  L'équipe 2 possède la maîtrise de la conception et fabrication de réseaux microfluidiques utilisant la technologie 3D de gestion des flux : réalisation de plaquettes intégrant valves, pompes et micro-optiques. Elle a une solide expérience sur la micromanipulation, les mesures de forces à l'échelle de la molécule unique et les mesures de mobilité sur vésicules g