Projet ANR-10-BLAN-1410 – GenRESP : Physiologie et Evolution du Contrôle Nerveux de la respiration
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Neurosciences (Blanc SVSE 4)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur GILLES FORTIN (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 482512.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Physiologie et Evolution du Contrôle Nerveux de la RespirationDissection génétique des circuits centraux respiratoire / Evo-Devo du contrôle respiratoire et du contrôle viscéral
Dissection génétique et évolution des circuits respiratoiresLa partie principale du projet consiste en une exploration de l’architecture et du fonctionnement des circuits nerveux centraux contrôlant la respiration. Nous cherchons les preuves les plus solides possibles pour les rôles proposés, d’un centre de contrôle respiratoire: le noyau rétrotrapézoide (RTN). Le RTN est vu par divers auteurs comme i) un centre majeur de la chémosensibilité au CO2; ii) un oscillateur respiratoire; iii) un générateur de l’expiration active. Nous explorerons ces rôles putatifs par gain et perte de fonction du RTN sur des préparations ex vivo du bulbe rachidien embryonnaire, un modèle qui permet de reproduire de nombreux aspects du comportement respiratoire et où l’on peut explorer les conséquences de lésions qui seraient létales après la naissance. Le « gain de fonction » consistera en une excitation du RTN par optogénétique, après expression de la ChannelRhodopsine2 sous le contrôle du promoteur Vglut2. La « perte de fonction » du RTN sera obtenue par des techniques de transgenèse intersectionnelle exploitant deux, voire trois critères moléculaires qui définissent les neurones du RTN de façon univoque, à savoir : l’expression des facteurs de transcription Phox2b et Atoh1 et une genèse à partir de neuroblastes exprimant Egr2. Ces critères seront combinés pour i) tuer les cellules du RTN et ii) les inhiber de façon réversible. Enfin, les cibles du RTN seront recherchées par transgénèse conditionnelle d’un traceur trans-synaptique. La deuxième partie relève de la discipline Evo-Devo, appliquée aux neurosciences. Elle testera la généralité dans tout le règne des animaux bilatériens, de notre découverte que Phox2 est, chez les vertébrés, un maître gène du système nerveux autonome ou viscéral. Nous testons l’idée que Phox2 soit aussi exprimé dans les neurones viscéraux (incluant les respiratoires), de protostomiens dont le système nerveux viscéral (et respiratoire) sont particulièrement bien décrit.
Génétique intersectionnelle, enregistrements fonctionnels et modèles animaux distantsNous utilisons des méthodes de génétique intersectionnelle pourmarquer, supprimer, inactiver ou stimuler des populations neuronales spécifiques. Nous clonons chez les mollusques des gènes exprimés chez les vertébrés par les neurones formant des circuits de contrôle soit somatique soit viscéral. Nous cherchons à reconnaîtrel'exression de ces gènes chez des espèces animales distantes des vertébrés, plus précisemment des mollusques pour mettre en évidence une homologie profonde datant de l'ancêtre commun dit urbilatérien.
Résumé de la soumission : Cette proposition se divise en deux parties d’inégale ampleur. Sa partie principale consiste en une exploration de l’architecture et du fonctionnement des circuits nerveux centraux contrôlant la respiration. Nous chercherons les preuves les plus solides possibles pour les rôles proposés, mais encore très débattus, d’un centre de contrôle respiratoire dont l’importance a émergé au cours des dernières années : le noyau rétrotrapézoide ou groupe respiratoire parafacial (RTN/pFRG), un ensemble de neurones situés à la face ventrale du bulbe rachidien, sous le noyau moteur du facial. Trois rôles, non mutuellement incompatibles, ont été suggérés et argumentés pour cette structure, en se basant sur des données anatomiques, physiologiques, de génétique humaine et murine: le RTN est vu par divers auteurs comme i) un centre majeur de la chémosensibilité au CO2 (alors que d’autres théories font de celle-ci une propriété distribuée des circuits respiratoires, ou bien mettent en avant dans ce rôle les neurones sérotonergiques du raphé; ii) un oscillateur respiratoire couplé à l’autre oscillateur, précédemment identifié, le complexe de pre-Bötzinger (preBötC), ceci au moins pendant la mise en place du rythme respiratoire fœtal et à la naissance; iii) un générateur de l’expiration active.  Nous explorerons ces rôles putatifs par gain et perte de fonction du RTN sur des préparations ex vivo du bulbe rachidien embryonnaire, un modèle qui permet de reproduire de nombreux aspects du comportement respiratoire et où l’on peut explorer les conséquences de lésions qui seraient létales après la naissance (comme le plus souvent le sont les altérations du contrôle respiratoire). Le « gain de fonction » consistera en une excitation du RTN par optogénétique, après expression de la ChannelRhodopsine2 sous le contrôle du promoteur Vglut2 : la capacité d’entraînement du preBötC et/ou des pré-motoneurones expiratoires sera évaluée par enregistrement électrophysiologique et par imagerie calcique. La « perte de fonction » du RTN sera obtenue par des techniques de transgenèse intersectionnelle exploitant deux, voire trois critères moléculaires qui définissent les neurones du RTN de façon univoque, à savoir : l’expression des facteurs de transcription Phox2b et Atoh1 et une genèse à partir de neuroblastes exprimant Egr2. Ces critères seront combinés pour i) tuer spécifiquement les cellules du RTN par un allèle toxique de Phox2b ou la chaine A de la toxine diphtérique, et ii) les inhiber de façon aigüe et réversible avec l’allatostatine. Enfin, les cibles du RTN seront recherchées histologiquement par transgénèse conditionnelle d’un traceur trans-synaptique. Ce projet mobilise les compétences physiologiques de l’équipe Fortin et les compétences en production et caractérisation anatomo-histologique de souris génétiquement modifiées de l’équipe Brunet. La deuxième partie relève de la discipline Evo-Devo, appliquée aux neurosciences. Elle testera la généralité dans tout le règne des animaux bilatériens, de notre découverte que Phox2 est, chez les vertébrés, un maître gène du système nerveux autonome ou viscéral, incluant de nombreux neurones respiratoires. Nos travaux antérieurs ont montré que Phox2 est exprimé dans le ganglion cérébral des tuniciers adultes, qui contrôle leur pharynx respiratoire et digestif, faisant remonter à l’ancêtre des chordés, le « super-type » neuronal viscéral Phox2+. Nous allons maintenant tester l’idée que Phox2 soit aussi exprimé dans les neurones viscéraux (incluant les respiratoires), d’un protostomien dont le système nerveux viscéral (et respiratoire) est particulièrement bien décrit : le gastéropode Lymnaea stagnalis. Si cette hypothèse se vérifie nous aurons contribué une pièce essentielle à la reconstruction de l’ancêtre de tous les bilatériens: le neurone viscéral exprimant Phox2, dont les multiples déclinaisons et modifications auraient abouti au système nerveux viscéral des bilatériens contemporains (incluant l’homme).
Résultats : 1. Un modèle murin du syndrome congénital d'hypoventilation centrale (CCHS) porteur de la mutation humaine associée au CCHS (mutation Phox2b27Ala) ainsi que des mutants conditionnels chez lesquels cette mutation n'est exprimée que par des sous-groupe de neurones Phox2b incluant le RTN, tous perdent anatomiquement le RTN et le chémoréflexe associé à l'élévation de la pression partielle de gaz carbonique sanguin.(Publication 1: Ramanantsoa et al.,  (2011) J Neurosci 31:12880-8). 
2. Nous avons, établi l'expression de Phox2 dans le systême nerveux central de la lymnée (mollusque), comparé celle-ci à celle d'autres marqueurs et avons procédé à des marquages rétrogrades pour identifier les neurones sensoriels et moteurs somatiques exprimant les marqueurs Hb9, DrgX et sensorin suggérant un homologie profonde entre les mollusques et les vertébrés remontant aux urbilatériens.
Perspectives : L'hypothèse du RTN comme site du chémoréflexe respiratoire est plus que jamais soutenue par nos travaux qui tentent de le prouver ultimement par une lésion spécifique, rendue possible par une stratégie intersectionnelle combinant deux propriétés moléculaires de ces neurones, l'expression de Phox2b et celle du gène Atoh1. 
Notre publication en restreignant la mutation Phox2b27Ala à quelques populations neuronales comprenant le RTN, a montré qu'à la différence de la mutation globale (modèle original du CCHS) ces animaux conditionnellement mutés survivaient malgré l'absence de chémoréflexe. Ainsi une lésion nouvelle chez les souris modèles est certainement responsable du caractère létale de la mutation et méritera d'être identifiée anatomiquement.
Publications et brevets : A ce stade d'avancement ce projet a donné lieu à une publication dans le Journal of Neuroscience en 2011, une seconde publication destinée à un journal de biologie du développement sur la partie Evo-Devo est en préparation. Par ailleurs les résultats déjà obtenus ont été présentés dans cinq conférence internationales en 2011 et 2012, au Royaume Unis, en Allemagne, en Inde, en Hollande et au Etats-Unis.