Projet ANR-11-BS07-0032 – cN-II Focus : Une enzyme clé dans la biosynthèse des acides nucléiques : La 5’-nucléotidase cytosolique (cN-II) comme nouvelle cible thérapeutique
Programme : Blanc - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Suzanne PEYROTTES (UNIVERSITE DE MONTPELLIER II [SCIENCES   TECHNIQUES DU LANGUEDOC])
Partenaires : Centre d'Études d'Agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé; Bases Moléculaires et Structurales des Systèmes Infectieux; Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon; Institut des Biomolécules Max Mousseron
Montant : 376987.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Stratégie thérapeutique face à la résistance aux analogues de nucléosides cytotoxiquesCe projet a pour objectif d’étudier un système enzymatique impliqué dans la résistance à une famille d’anticancéreux (les analogues de nucléosides cytotoxiques) et devrait permettre à terme d’améliorer l’efficacité des traitements utilisant ces médicaments
Conception d’inhibiteurs potentiels de la 5’-nucléotidase cytosolique II (cN-II)Les analogues de nucléosides constituent par leur nombre et leur importance curative une classe d'agents thérapeutiques très largement utilisée dans le traitement des hémopathies malignes et des tumeurs solides. L'utilisation de ces médicaments se heurte néanmoins à l'apparition de phénomènes de résistance, d'origine multifactorielle, qui sont à ce jour mal appréhendés. De récents travaux semblent montrer que l'un des mécanismes impliqués dans la résistance aux analogues de nucléosides serait associé à une dérégulation enzymatique entre l'expression de kinases et de nucléotidases Cette dérégulation entraînerait une diminution des concentrations intracellulaires en métabolites phosphorylés (nucléotides) nécessaires à l'activité anticancéreuse. L'objectif premier de ce projet est d’identifier une nouvelle cible potentielle en chimiothérapie antitumorale grâce à la conception et l'étude des structures inédites, susceptibles d'inhiber sélectivement l'activité d’une 5’-nucléotidase cytosolique (cN-II)
Conception, synthèse et étude d’inhibiteurs potentiels de cN-IIDiverses approches sont proposées:1) La recherche d’analogues de substrats (nucléosides 5’-monophosphate ou nucléotides); cette phase a déjà été initiée au travers de la synthèse de composés stables enzymatiquement et chimiquement tels que des nucléotides de type phosphonates. Appuyée par la structure cristallographique de la protéine en complexe avec le ligand d’interêt (quand l’expérience le permet), la modélisation des interactions moléculaires devrait permettre l’optimisation de l’affinité des premiers analogues obtenus. 2) La conception d’inhibiteurs «par fragment«, approche qui consiste à cribler par RMN l'interaction de fragments moléculaires de faible complexité structurale avec une cible protéique, même si leur affinité pour la macromolécule est faible (les constantes de dissociation compatibles avec cette technique sont généralement comprises entre quelques µM et quelques mM). Cette particularité place le criblage RMN en amont dans la recherche de ligands, aux phases d’étude de « touches » (hits) qui correspondent à des associations protéine-ligand faibles mais potentiellement essentielles. On peut donc qualifier ces motifs de « fragments élémentaires » (scaffolds), qui seront ensuite optimisés en composés « tête de série » (lead-like puis drug-like). Cette optimisation peut mettre en jeu soit l’association de différents fragments soit une augmentation de la complexité structurale du fragment élémentaire.3) le criblage virtuel de librairies.L’intérêt de ces deux dernières stratégies par rapport à l’élaboration d’analogues de substrats réside bien évidemment en sa COMPLEMENTARITE. La démarche entreprise ici devrait conduire à des inhibiteurs structurellement non apparentés aux analogues de substrats (nucléotides), et n’interagissant probablement pas au niveau du site catalytique mais comme des effecteurs allostériques de l’enzyme
Résumé de la soumission : Les analogues de nucléosides représentent une des classes médicamenteuses largement utilisée en chimiothérapie antivirale et anticancéreuse. Ces composés miment les métabolites physiologiques en interférant avec les étapes clé de la biosynthèse des acides nucléiques viraux et/ou la prolifération de cellules cancéreuses. Cependant, le développement de nouveaux agents cytotoxiques est actuellement limité du fait de l’apparence de mécanismes de résistance modifiant par exemple le métabolisme cellulaire des nucléotides. Parmi les cinq nucléotidases cytosoliques humaines impliquées dans la régulation des pools nucléotidiques cellulaires, la surexpression de la 5’-nucléotidase de type II (cN-II) a été montré comme étant un facteur prédictif défavorable de survie chez les patients leucémiques traités par la cytarabine. A ce titre, son implication dans la résistance aux analogues de nucléosides cytotoxiques est proposée.L’objectif principal de ce projet est donc de concevoir et d’étudier des inhibiteurs sélectifs de cette enzyme afin de (re-)potentialiser l’activité des analogues de nucléosides utilisés en clinique. La conception rationnelle d’inhibiteurs de type allostérique et/ou présentant une analogie structurale avec les substrats naturels (nucléosides 5’-monophosphates puriques, IMP, GMP …) s’appuiera sur la modélisation moléculaire, la cristallographie, le criblage virtuel de librairies et une approche originale dite par fragment via le criblage d’une chimiothèque par RMN.   L’identification des inhibiteurs potentiels sera réalisée grâce à des études in vitro sur l’enzyme recombinante purifiée et l’activité biologique des composés têtes-de série, seuls ou en association, sera déterminée en culture cellulaire et éventuellement in vivo. Parallèlement à ces travaux, nous nous intéresserons également à la spécificité des composés vis-à-vis des autres nucléotidases, au rôle de la cN-II dans l’activation et/ou le catabolisme des analogues de nucléosides cytotoxiques, ainsi qu’à l’étude des modifications du métabolisme nucléotidique cellulaire après inhibition de la cN-II. Ce projet pluridisciplinaire associant chimie, cristallographie, modélisation moléculaire, enzymologie et évaluations biologiques a pour finalité, au travers de la conception d’inhibiteurs sélectifs, de mieux appréhender le rôle et la fonction cellulaires de la cN-II.
Résultats : Notre objectif principal est donc de concevoir et d’étudier des inhibiteurs sélectifs de cette protéine afin de (re-)potentialiser l’activité des analogues de nucléosides utilisés en clinique. La conception rationnelle d’inhibiteurs de type allostérique et/ou présentant une analogie structurale avec les substrats naturels (nucléosides 5’-monophosphates) est actuellement réalisée avec l’aide de la modélisation moléculaire et de données cristallographiques. Nous développons également le criblage virtuel de librairies et une approche originale dite par fragment (FBDD). La sélection et l’identification des inhibiteurs potentiels s’effectuent au travers d’études in vitro sur l’enzyme recombinante purifiée et/ou via la détermination de leur activité biologique en culture cellulaire, seuls ou en association.
Parallèlement à ces travaux, nous nous intéressons également à l’étude du rôle et de la fonction cellulaires de la cN-II. Afin d’étudier les modifications du métabolisme nucléotidique cellulaire après inhibition de la cN-II, une méthode d’analyse (détection et quantification de l’inosine, produit de la réaction d’hydrolyse de l’IMP par la cN-II) a d’ores et déjà été mise au point.
Perspectives : L'implication d'une surexpression de l'activité nucléotidasique (cN-II) comme l'un des mécanismes de résistance aux analogues de nucléosides cytotoxiques ouvre de nombreuses perspectives dans l'amélioration de l'efficacité des traitements usuels. La conception d'inhibiteurs puissants et sélectifs de cette enzyme pourrait avoir un impact thérapeutique dans un grand nombre de pathologies tumorales telles que les leucémies aiguës, les cancers du pancréas et du poumon pour lesquels la majorité des patients décède en dépit de l'efficacité initiale du traitement.
Publications et brevets : Revue: Therapeutic perspectives for cN-II in cancer, Lars Petter Jordheim & Laurent Chaloin in Current Medicinal Chemistry, Vol 20, 2013, sous presse.