Projet ANR-14-CE20-0001 – MUFFIN : Film salivaire muqueux et interactions avec la flaveur
Programme : Enjeux agroalimentaires (DS0502)
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Monsieur Francis Canon (Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation)
Partenaires : Laboratoire public
Montant : 398662.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 60 mois
Résumé : Film salivaire mucosal, flaveur et interactions moléculairesMUFFIN a pour but d'étudier les mécanismes moléculaires entre les molécules de la flaveur et la muqueuse orale, en se concentrant sur deux modalité de la flaveur: l'astringence et la perception aromatique.
Objectifs de l'ANR MUFFINL’ANR MUFFIN a pour but de mieux comprendre le rôle de la muqueuse orale et en particulier de la pellicule salivaire dans la perception de la flaveur  sont de tester les hypothèses suivantes :1.	La présence de MUC1 facilite l’ancrage des protéines salivaires sur les cellules épithéliales de la muqueuse orale et donc la formation de la pellicule salivaire2.	La pellicule mucosale joue un rôle dans la persistance aromatique dans la cavité orale3.	Les protéines salivaires riches en proline (PRP) protègent la muqueuse orale contre les effets des tannins4.	 Les effets des tanins sur la pellicule de la muqueuse orale modifient sa capacité d’interagir avec les molécules d’arôme. 5.	Les variations inter-individuelles de la composition de la pellicule mucosale ou de la salive modifient la capacité de la muqueuse à interagir avec les molécules d’arôme.
Méthodes / ApprochesLes méthodes utilisées sont: • pour le workpackage 1 de la culture cellulaire, de la microscopie optique et AFM. • pour le WP2: de la GC-FID et du PTR-MS• pour le WP3: de la microscopie optique et AFM
Résumé de la soumission : La flaveur est un déterminant important du comportement alimentaire. Elle est constituée de plusieurs modalités: le goût, la perception aromatique, mais également la perception trigéminale, qui est impliquée dans la détection des molécules astringentes. Il est de plus en plus reconnu que la salive et plus particulièrement les protéines salivaires interviennent dans la perception de la flaveur. Ainsi, des études récentes ont révélé que les protéines de la pellicule de la muqueuse orale modifieraient la perception de la flaveur. De même, une étude portant sur la sensation d’astringence a conclu que les protéines salivaires libres inhibent la sensation d'astringence et que sa perception fait intervenir, au moins en partie, les protéines salivaires adhérées aux cellules buccales. Cependant, les interactions moléculaires impliquant les protéines de la pellicule de la muqueuse et les composés de la flaveur ont été peu étudiées et ne sont toujours pas bien comprises. MUFFIN propose d'élucider les bases moléculaires des interactions entre les constituants alimentaires et la pellicule de la muqueuse, en se concentrant sur deux modalités sensorielles : l'astringence et la perception aromatique.L'astringence est définie comme une sensation complexe caractérisée par une sensation de sécheresse et de rugosité au niveau de la cavité orale, résultant de l'exposition à des substances telles que les tanins. Il est généralement admis que les interactions qui se produisent entre les protéines salivaires riches en proline (PRP) et les tanins jouent un rôle dans cette sensation. Le mécanisme pourrait impliquer les complexes PRP•tanins agrégés et les protéines appartenant à la pellicule de la muqueuse. Une autre hypothèse propose que les PRP salivaires protègent les autres protéines des tanins.La muqueuse orale pourrait également être impliquée dans la persistance aromatique en bouche. En effet, aucune explication moléculaire n’a pour l’instant été apportée à ce phénomène. Il a été précédemment rapporté que les protéines salivaires libres, telles que les mucines et l'alpha-amylase, peuvent affecter la libération de composés d'arôme. Par conséquent, l'origine de la persistance aromatique en bouche pourrait être due à des interactions moléculaires entre les protéines de la pellicule et des composés aromatiques.Afin de caractériser les mécanismes moléculaires à l’origine de ces phénomènes, MUFFIN propose une stratégie de recherche basée sur des expériences in vitro utilisant un modèle de muqueuse orale. Ainsi, MUFFIN  est une occasion unique (1) de développer un modèle bien caractérisé de muqueuse orale composée d’un épithélium et de la couche de protéines salivaires ancrée à sa surface (la pellicule); (2) de caractériser le rôle joué par la pellicule de la muqueuse dans la libération des arômes et leur persistance en bouche ; (3) de caractériser l'impact des tannins sur la structure de la pellicule salivaire et le rôle des protéines riches en proline salivaires dans la protection de la muqueuse ; (4) d’étudier leurs conséquences sur la capacité de la pellicule salivaire à interagir avec les composés d'arôme et (5), enfin, d’étudier les effets des variations interindividuelles de la composition et de la structure de la muqueuse de la salive sur ses interactions moléculaires. Ce projet ambitieux prend en compte à la fois la composante multimodale de la flaveur et la variabilité inter-individualité apportant une vision globale du rôle de la pellicule de la muqueuse dans la perception de la flaveur.Pour réaliser ses objectifs, MUFFIN  propose une approche pluridisciplinaire associant la culture cellulaire, la biochimie, l’imagerie (MEB, MET, l'imagerie confocale, AFM), la chimie analytique (PTR-MS et GC-FID) et la chemoinformatique (approche QSAR). En outre, MUFFIN est un projet de recherche fondamentale qui donnera la possibilité à un jeune chercheur de développer sa propre thématique de recherche et de diriger son propre groupe de recherche.
Résultats : Au cours des 18 premiers mois, les travaux de recherche entrepris ont porté sur les workpackages WP1, WP2 et WP3. 
Le workpakage WP1 a pour principal objectif la mise au point d’un modèle de muqueuse orale. Un premier modèle de muqueuse orale a été développé en utilisant la lignée cellulaire TR146.  Ce modèle possède une pellicule mucosale reconstituée à l’aide de salive clarifiée. Des expériences de microscopie par immunoflurorescence ont permis de mettre en évidence l’ancrage de la mucine salivaire MUC5B à la surface des cellules. 
Afin d’améliorer ce modèle, la ligne cellulaire TR146 a été transfectée par le gène codant pour la mucine transmembranaire MUC1 afin d’obtenir un clone stable exprimant MUC1 à sa surface. Des expériences d’immunofluorescences ont ensuite permis de démontrer une augmentation de l’ancrage de la mucine salivaire MUC5B à la surface des cellules épithéliales de plus de 34%. 
Dans le WP2, afin de montrer l’existence d’un phénomène d’adsorption à la surface de la muqueuse orale,  des expériences de libération des molécules d’arôme à l’équilibre par GC-FID ont été mises en place.  Une première étude a porté sur une série linaire de méthylcétone (C5 à C10). Ces premières expériences n’ont pas permis de montrer un effet de rétention de ces molécules d’arôme au niveau de la muqueuse modèle. Cependant, un effet de métabolisation de la 2-decanone et de la 2-nonanone a été mis en évidence en présence de l’épithélium de la muqueuse.
Perspectives : Le modèle de muqueuse orale développé dans le WP1 permettra d'étudier le rôle de la muqueuse orale dans la rémanence aromatique dans le WP2 et dans l'astringence dans le WP3. Le WP4 porte sur l'effet des tanins dans le phénomène de rémanence aromatique et le 5 sur l'effet de la variabilité interindividuelle de la composition salivaire.
Publications et brevets : Article 
Ployon S, Belloir C, Bonnotte A, Lherminier J, Canon F & Morzel M. 2016. The membrane-associated MUC1 improves adhesion of salivary MUC5B on buccal cells. Application to development of an in vitro cellular model of oral epithelium. Archives of Oral Biology, 61:149-155. 
Posters
Ployon S, Sémon E, Le Quéré J-L, Belloir C, Tromelin A, Guichard E, Morzel M & Canon F. 2015. Développement d’une méthode d’analyse de la désorption de composés d’arôme par PTR-MS sur un modèle in vitro de muqueuse orale. Congrès français de Spectrométrie de Masse et d'Analyse Protéomique, Ajaccio, 15-18 Septembre 2015.
Aybeke EN, Ployon S, Brulé, Bourillot E, Morzel M, Lesniewska E & Canon F.  2016. Impact of a mucosal pellicle on the physical properties of oral epithelial cells. International Scanning Probe Microscopy Conference, Grindelwald, Switzerland,12th-15th June 2016. 
Ployon S, Pradels C, Belloir C, Morzel M & Canon F. 2016. Role of oral mucosa and mucosal pellicle in aroma persistence. 94th IADR (International Association for Dental Research) General Session, Seoul, Korea, 22nd-25th June 2016.
Communication orale
Ployon S, Pradels C, Belloir C, Morzel M & Canon F. 2016. Interactions between aroma compounds and the oral mucosa could be responsible for aroma persistence. 4th International Conference on Food Oral Processing (FOP), Lausanne, Switzerland, 3rd-6th July 2016.