Projet ANR-13-JS08-0002 – SPOC : Brosses de polymères stimulables pour le contrôle de l’adhésion cellulaire
Programme : JCJC - SIMI 8 - Chimie du solide, colloïdes, physicochimie (JCJC SIMI 8)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Lionel BUREAU (Laboratoire Interdisciplinaire de Physique)
Partenaires : Laboratoire Interdisciplinaire de Physique
Montant : 234991.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 48 mois
Résumé : Brosses de polymères stimulables pour le contrôle de l’adhésion cellulaireL'objectif du projet SPOC est la réalisation et la caractérisation de brosses de polymères stimuli-sensibles permettant de moduler l'adhésion cellulaire. Notre stratégie repose sur l'utilisation d'un changement photo-induit de conformation des macromolécules de la brosse, afin de contrôler l'adsorption/désorption de protéines, et ainsi l'adhésion de cellules cultivées sur ces surfaces. Ces brosses seront utilisées afin d'étudier et de quantifier les propriétés adhésives de cellules.
Synthèse de polymères photo-thermosensibles - Caractérisation optique de la conformation de brosses de polymère - Etude préliminaire de l'adhésion cellulaire en présence de brosses.- Il s'agit dans un premier temps de synthétiser des polymères présentant une LCST (Lower Critical Solution Temperature) voisine de 37 degrès en solution aqueuse, et dont la valeur exacte dépend de la polaritité de groupements photosensibles incorporés dans les macromolécules. L'objectif est ainsi d'induire, à température physiologique, un changement de conformation réversible des macromolécules, piloté uniquement par une irradiation lumineuse.- Ces polymères photosensibles seront greffés sur des surfaces, sous forme de brosses. Nous emploierons une méthode optique (RICM pour Reflection Interference Contrast Microscopy) afin de caractériser les changement de conformation de ces brosses induits par le stimulus lumineux.- En parallèle, nous mènerons une étude de l'adhésion de cellules de mammifères cultivées sur des substrats fonctionnalisés avec des brosses de polymères thermosensible, afin de déterminer la façon dont les paramètres moléculaires des brosses (densité de greffage, longueur des chaines) et la conformation des chaines (en bon ou en mauvais solvant) affecte l'adhésion et le détachement des cellules.
Stratégies de synthèse et de caractérisation- Nous nous concentrons sur la synthèse de ter-polymères photo-thermosensibles composés de dimethylacrylamide (DMA), N-isopropylacrylamide (NIPAM) et Azo-acrylamide (AzAAm). Ces polymères sont synthétisés par ATRP (Atom Transfer Radical Polymerization) en utilisant une méthode de regénération du catalyseur permettant de travailler en présence d'oxygène (ARGET, pour Activator ReGenerated by Electron Transfer). Cette voie de synthèse est ensuite directement transférable à l'élaboration de brosses par la méthode dite du «grafting-from«.- La microscopie RICM permet quant à elle de réaliser des mesures de réflectivité des brosses, donnant accès à leur changement de conformation en fonction du stimulus appliqué, et permettant ainsi de remonter aux paramètres moléculaires. Ce type de microscopie permet également de réaliser l'étude de l'adhésion cellulaire (imagerie des cellules, localisation et quantification des zones d'adhésion focales) sans nécessité de marquage spécifique des cellules.
Résumé de la soumission : Comprendre et contrôler les interactions adhésives entre cellules et surfaces synthétiques représente un enjeu majeur, à la fois fondamental et technologique, en biologie cellulaire. Les progrès de la science des matériaux et de la physico-chimie de la matière molle ont déjà permis l'élaboration de substrats avancés pour la culture de cellules in vitro, ainsi que la conception d'outils pour l'étude des mécanismes élémentaires impliqués dans l'adhésion cellulaire. Cependant, les questions relatives à la dynamique de l'adhésion cellulaire, ou aux processus de mécano-transduction qui couplent le devenir cellulaire aux propriétés mécaniques de l'environnement d'une cellule, restent encore largement ouvertes. Alors que ces questions sont au coeur des développements futurs dans des applications biomédicales (médecine régénérative) ou biotechnologiques ("cell-based assays"), les outils pour les aborder sont encore assez rares.La conception de substrats "intelligents" pour la culture cellulaire, dont les propriétés adhésives peuvent être altérées à volonté dans l'espace et dans le temps, se présente comme une approche prometteuse afin d'approfondir notre compréhension de la dynamique des interactions cellule/surface.  Le projet SPOC a pour ambition de développer des substrats intelligents utilisant des polymères photo-sensibles, présentant des propriétés adhésives altérables, via leur irradiation dans le visible, de façon réversible et dynamique, et ce avec une résolution spatiale de l'ordre du micromètre (i.e. jusqu'à l'échelle de la cellule unique). Reposant sur l'utilisation de la lumière comme stimulus externe pour moduler leurs propriétés, ces substrats originaux permettront un contrôle spatial et temporel de l'adhésion cellulaire, et ainsi la maitrise de la forme, de l'organisation et de la migration de cellules sur leur surface. L'élaboration de ces substrats reposera sur la synthèse de brosses de polymères photo-thermo-sensibles, dont la conformation pourra être basculée de façon réversible entre un état globulaire et un état gonflée sous l'effet d'une irradiation lumineuse à la longueur d'onde appropriée. Ce type de transition globulaire/gonflée, à la base de la modulation de l'adhésion cellulaire observée avec les couches minces de polymère thermo-sensibles déjà élaborées par le passé, sera exploitée pour générer, via une mise en forme de faisceaux lumineux, des motifs adhésifs dynamiques permettant d'affecter localement l'environnement cellulaire. Suite à un tel changement de la contrainte adhésive imposée aux cellules, nous nous intéresserons alors à la dynamique de ré-organisation, dans l'espace et dans le temps, des zones d'adhésion focales qui connectent le cytosquelette à la matrice extra-cellulaire. Par ailleurs, nous caractériserons quantitativement les propriétés mécaniques de ces brosses de polymères photo-thermo-sensibles afin d'utiliser nos substrats comme des dispositifs originaux d'actuation/mesure d'effort pour des applications de détermination des forces d'adhésion cellulaire et de tri de cellules pathologiques.
Résultats : - Nous sommes parvenu à synthétiser  des ter-polymer de DMA-NIPAM-AzAAm présentant une LCST dépendant de l'histoire d'irradiation lumineuse. Nous avons montré qu'en choisissant convenablement les compositions molaires de ces ter-polymères, il est possible d'induire de façon réversible l'effondrement/gonflement des macromolécules sous irradiation à 435/365 nm, le tout à 37°C.
- Nous avons entièrement développé un microscope RICM permettant de faire de l'imagerie interférentielle plein-champ à trois couleurs simultanément, ou de réaliser des mesures de réflectivité sur une gamme spectrale couvrant l'essentiel du visible.
- Ce microscope a été utilisé afin de caractériser des brosses de PNIPAM au voisinage de leur LCST. Nous avons montré que cette technique est suffisamment sensible pour mettre en évidence des effets de structuration verticale des brosses lors du passage de bon à mauvais solvant. Ceci constitue l'une des rare démonstration expérimentale d'effets prédits théoriquement depuis de nombreuses années.
- Le RICM a également été utilisé pour étudier qualitativement l'adhésion de fibroblastes en présence de brosses de PNIPAM. Nous avons pu ainsi mieux cerner l'influence de la densité de greffage et de la longueur des chaines de la brosse sur l'adhésion et l'efficacité de détachement des cellules.
Perspectives : L'élaboration de substrats de culture permettant de controler dans l'espace et dans le temps l'adhesion et la morphologie de cellules représente un enjeu de taille. Ce type de substrat représente la nouvelle génération d'outils qui permettra d'approfondir notre compréhension des interactions cellules/surfaces et d'étudier la dynamique d'adhésion cellulaire ainsi que les voies de mécanotransduction impliquées dans la réponse cellulaire à un changement de son environnement adhésif.
Après avoir réussi à synthétiser les polymères photo-sensibles envisagés dans notre projet, nous nous concentrons actuellement sur la synthèse et la caractérisation de brosses de ces polymères greffées sur des surfaces de verres. Ces substrats devraient permettre de manipuler in situ l'environnement adhésif de cellules, via le contrôle local de la conformation des brosses.
Publications et brevets : - Probing the conformation of thermo-sensitive polymer brushes with Reflection Interference Contrast Microscopy 
S. Varma, L. Bureau, D. Debarre 
Communication orale. Journées de la matière condensée JMC14/CMD25
24-29 aout 2014, Paris