Projet ANR-14-CE14-0011 – METHYL-MEMORY : Rôle de la protéine Zbtb24 et de la méthylation de l'ADN dans la différenciation tardive des lymphocytes B et la réponse mémoire humorale
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401) 2014
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Madame Claude-Agnès Reynaud (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
Partenaires : Laboratoire public; Laboratoire public; Laboratoire public
Montant : 533995.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 48 mois
Résumé : Les lymphocytes B (LB) mémoire et les plasmocytes à longue durée de vie (LLPC) sont les deux bras de la protection humorale contre les agents pathogènes, mais les facteurs qui assurent leur différenciation et leur persistance restent largement méconnus. 	
	Pour identifier ces facteurs, nous étudierons une maladie génétique rare, le syndrome ICF (Immunodéficience, instabilité centromérique et anomalies faciales), qui se caractérise par une hypo- ou une agammaglobulinémie combinée à une forte diminution du nombre de LB mémoire. Comme le phénotype ICF traduit un défaut probable de différenciation et/ou de maintien des LB mémoire et des LLPC, la compréhension du mécanisme causant ce déficit immunitaire devrait permettre une meilleure connaissance de ces processus.
 	L'ICF est causé par des mutations de Dnmt3b, une des deux de novo ADN méthyltransférases, ou de Zbtb24, un hypothétique facteur de transcription. Zbtb24 pourrait également contrôler la méthylation des séquences satellites centromériques et/ou péricentromériques, conjointement avec Dnmt3b, puisque tous les patients ICF présentent une hypométhylation de ces régions et une instabilité centromérique caractéristique. 
	Notre premier objectif est d'identifier le stade de différenciation touché par les mutations ICF. Nous étudierons l'impact de la perte de fonction de Zbtb24 sur la différenciation in vitro de cellules B naïves humaines en LB mémoire et en plasmocytes. Nous caractériserons également deux nouvelles lignées de souris mutantes pour Zbtb24 : une lignée portant un allèle "gene-trapped" convertible en allèle knockout conditionnel ou en rapporteur (LacZ), et une autre lignée portant une mutation ponctuelle observée chez des patients ICF. Nous confirmerons que ces animaux récapitulent le phénotype ICF et nous suivrons l'expression normale de Zbtb24 grâce au rapporteur LacZ. Nous étudierons ensuite le développement lymphocytaire de ces animaux et leur capacité à développer une réponse anticorps mémoire et nous déterminerons si le défaut est intrinsèque au lignage B.
	Notre second objectif est de comprendre comment la perte de fonction de Zbtb24 affecte les LB. Comme Zbtb24 est probablement un facteur de transcription, nous combinerons l'analyse du méthylome et du transcriptome des souris mutantes et nous comparerons ces données à celles que nous avons obtenues précédemment sur un modèle de souris mutées pour Dnmt3b. Ceci nous permettra de trouver les cibles directes de Zbtb24, dont nous testerons l'importance à l'aide d'expériences de gain ou de perte de fonction par transduction rétrovirale de cellules souches hématopoïétiques. Les mutations de Zbtb24 et de Dnmt3b pourraient également affecter les LB de façon indirecte. L'hypométhylation des séquences satellites, combinée à la répression spontanée de p53 dans les cellules du centre germinatif, pourrait conduire à la production d'ARN double-brin toxiques et à l'apoptose de ces cellules par une voie dépendante de l'interféron de type I (IFN-I). Nous testerons cette hypothèse en croisant les souris mutantes avec un lignée invalidée pour le récepteur à l'IFN-I.
	Notre troisième objectif consistera à identifier les partenaires de Zbtb24 impliqués dans le contrôle de la méthylation de l'ADN. Nous effectuerons un crible double-hybride et nous testerons également différents candidats impliqués dans les modifications de la chromatine, puis nous définerons la séquence de recrutement de ces molécules au niveau des chromocentres des cellules de souris.
	Notre étude devrait ainsi améliorer notre connaissance des mécanismes de la différenciation tardive des LB et livrer des pistes pour améliorer la réponse humorale des patients ICF, et plus généralement le développement de vaccins plus efficaces.