Projet ANR-11-BSV3-0023 – StrucEvolAlpha : Structure et évolution des complexes de fusion membranaire des alphavirus
Programme : Blanc - SVSE 3 - Microbiologie, immunologie, infectiologie (Blanc SVSE 3)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Jean LEPAULT (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD)
Partenaires : Virologie Moléculaire et Structurale; Unité de Recherche Virologie et Immunologie Moléculaires; Institut Pasteur
Montant : 380000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : La virologie structurale pour comprendre la fusion membranaire et l’évolution d’une famille viraleDétermination de la structure 3D de l’hétérodimère  E2-E1 d’un alphavirus atypique de salmonidé. Visualisation des différentes étapes du processus de fusion membranaire par cryo-tomographie et cryo-microscopie électronique. Etude du rôle du cholestérol dans le processus d’infection par la génération d’alphavirus mutants.
Structure atomique du complexe de fusion membranaire d’un alphavirus atypique de salmonidéLes résultats sur la structure de cet alphavirus atypique par comparaison aux structures connues du virus de la Forêt Semiliki, de Sindbis et du Chikungunya apporteront des connaissances sur l’évolution des alphavirus, permettront de déterminer les changements structuraux associés au franchissement des barrières d’espèce. Ces données aideront à mieux comprendre l’émergence de nouveaux virus.Sur un plan plus fondamental, cet alphavirus atypique manipulable en laboratoire non confiné permettra d’aborder l’étude des étapes précoces de fusion membranaire par les techniques de tomographie électronique. 
Virologie moléculaire et structuraleNous appliquons les méthodes de génétique inverse pour analyser la dépendance au cholestérol du phénomène de fusion de SDV. Nous déterminons la structure de SDV par cryo-microscopie électronique. Nous exprimons le complexe de fusion de SDV dans le but de les cristalliser.
Résumé de la soumission : La fusion membranaire est un mécanisme ubiquitaire qui est à la base de nombreux phénomènes biologiques fondamentaux : trafic vésiculaire au sein des cellules eucaryotes, fécondation d’un ovule par le spermatozoïde, contraction musculaire…. et infection virale. Tous ces processus impliquent que deux compartiments cellulaires, initialement délimités par une membrane biologique, entrent en contact puis mettent en commun leurs composants lipidiques et cytosoliques. Les membranes biologiques étant des structures très stables, l’intervention de protéines spécialisées est généralement  nécessaire pour surmonter les barrières énergétiques des étapes conduisant à la fusion membranaire. Bien que les structures de nombreuses glycoprotéines virales aient été résolues à la résolution atomique, la plupart des étapes qui constituent le phénomène de fusion atomique restent hypothétiques. La connaissance de la structure de ces complexes demande en effet une étude des systèmes lipides-protéines qui est souvent délicate. Pour déterminer la structure de ces complexes lipides-protéines, des méthodes structurales, radiocristallographie et cryo-microscopie électronique (cryo-EM), mais aussi des méthodes de biologie moléculaires comme l’expression de virus par génétique inverse doivent être combinées. Cette demande de subvention consiste à appliquer une telle approche à l’étude d’un alphavirus qui a été découvert en France, le virus de la maladie du sommeil du saumon (SDV). Ce choix a été fait en considérant deux propriétés importantes de SDV. Premièrement, SDV n’étant pas un pathogène de l’homme, il peut être étudié dans des laboratoires P0 dans lesquels sont placés les équipements de biologie structurale (synchrotron, microscope électronique, fluorimètre…). Deuxièmement, SDV présente les séquences les plus divergentes pour les protéines structurales de tous les alphavirus connus. La comparaison de SDV aux autres alphavirus doit donc apporter des informations importantes sur l’évolution des virus.Nous déterminerons la structure de SDV par cryo-EM. Une reconstruction préliminaire à une résolution de 1.5 nm a été obtenue. En utilisant un microscope Polara, et en augmentant le nombre d’images utilisées pour la reconstruction, nous espérons obtenir une résolution inférieure à 1nm et ainsi visualiser des éléments de structure secondaire.Nous cristalliserons le complexe E1-E2-E3 de SDV et déterminerons la structure de ces glycoprotéines. En comparant ces données à celles qui ont été obtenues récemment sur le Chikungunya, évolution des virus, franchissement de la barrière d’espèce devraient être mieux compris.Nous étudierons la fusion de SDV à des liposomes et visualiserons les étapes de la fusion des membranes virales. Ces études seront faites par tomographie électronique. En particulier nous espérons pouvoir visualiser le complexe de fusion et déterminer des paramètres importants comme le nombre minimal de molécules E1 nécessaires à sa formation. Pour faciliter cette tâche, nous construirons des virus mutés en utilisant un système d’expression par génétique inverse. Nous focaliserons notre attention sur une meilleure compréhension de la dépendance de la fusion à la présence de cholestérol dans la membrane cible. La connaissance des structures des glycoprotéines de différentes espèces et  des complexes qu’elles forment avec les membranes biologiques doit fournir une base rationnelle au développement de molécules antivirales qui empêchent les virus d’entrer dans leur cellule hôte.
Résultats : 6 mois après le démarrage du projet, des avancées significatives ont déjà été réalisées:
- la démonstration biologique de l’importance du cholestérol pour l’infection des cellules par l’alphavirus de salmonidé.
- un éventail d’alphavirus recombinants mutants sur E2 et E1, en particulier dans la région de fusion et dans la région impliquée dans la dépendance au cholestérol ont été générés et sont en cours d’étude in vitro et in vivo.
- différentes constructions pour l’expression en cellules d’insecte S2 de E2-E1 ont été réalisées, les protéines recombinantes sont en cours de purification et leur expression en cours d’optimisation.
Perspectives : La connaissance sur les structures atomiques des glycoprotéines des différentes espèces d’alphavirus et sur les complexes qu’il forme avec les membranes biologiques permettront le développement  de molécules antiviral prévenant le virus de pénétrer dans les cellules and d’infecter son hôte. L’utilisation de telles molécules pourraient peut-être utiliser pour prévenir l’infection par la plupart des virus à enveloppe.
Publications et brevets : Non disponible.