Projet ANR-10-BLAN-1013 – DynRec : Détermination du panorama énergetique de la Recombinaison Homologue par manipulation d'un complèxe unique ADN-Rad51.
Programme : Sciences de l'information, de la matière et de l'ingénierie :  Nanosciences (Blanc SIMI 10) 2010
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Giovanni CAPPELLO (INSTITUT CURIE - SECTION DE RECHERCHE)
Partenaires : Biotechnologie, Biocatalyse et Biorégulation; Unité Physico-Chimie Curie; Laboratoire de Physique Théorique de la Matière Condensée
Montant : 655940.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : CONTEXTE
La recherche d’une nano-cible unique de la part d’un seul nano-chercheur est un problème vital, lorsque le chercheur est un fragment de chromosome endommagé et sa cible la séquence intacte sur le chromosome homologue. Si la cible est trouvée en temps utile, elle est utilisée comme modèle pour reconstituer l’ADN endommagé et la cellule survit sans porter de mutation génétique. Ce processus, appelé Recombinaison Homologue (HR), est essentiel pour le maintien de l’intégrité génomique et chez l’homme il est catalysé par la protéine Rad51.
OBJECTIF
La HR comporte une interaction entre l’ADN et la Rad51. Cette protéine applique des forces et des couples sur la molécule d’ADN et en modifie profondément la structure. La Rad51 polymérise autour de l’ADN endommagé et le déroule d’environ 15° par paire de bases et l’étire de 50% de sa longueur cristallographique, pour former le filament nucléoprotéique (NpF). Lorsque le NpF trouve le brin homologue, il y a formation transitoire d’un complexe à trois brins, pareillement déroulé et étiré. On croit que cette déformation joue un rôle dans la reconnaissance de séquence et dans l’échange de brins. Les détails moléculaires de la réaction restent partiellement inconnus, ainsi que son bilan énergétique.  Dans ce projet, nous voulons développer une nouvelle génération de pinces magnétiques qui permettent de manipuler une molécule unique d’ADN. Pour la première fois, on sera capable de déterminer simultanément les forces et les coules appliquées par Rad51 à l’ADN pendant la recombinaison. L’élongation de l’ADN (dl) et sa torsion (d??) seront mesurées pour un couple (T) et une force d’étirement donné (F), de manière à déterminer le travail (dW = F.dl + T.d? ) développé par la Rad51 à chaque étape du processus. Un tel montage expérimental pourra aussi être appliqué à d’autres interactions moléculaires dans le contexte de la biophysique.
PROBLEMATIQUE ET MOTIVATION
La HR est une réaction enzymatique parmi les plus complexes, difficile à étudier avec les méthodes classique de l’enzymologie. Elle fait intervenir un ADN double brin et un simple brin, la protéine Rad51 et une quantité d’ATP bien définie. De plus, les ADN son des longues hélices, avec une séquence spécifique et ils doivent s’intriquer pendant la recherche d’homologie.  La Rad51 aussi, agit de manière coopérative. On a vu récemment que l’approche « molécule unique » semble apporter beaucoup de réponses sur la cinétique et la dynamique de cette réaction complexe. 
APPROCHE PROPOSEE
Nous avons choisi de travailler avec trois approches complémentaires. 
1)	Manipulation de molécule unique, pour suivre les réactions en temps réel et déterminer les caractéristiques méchano-chimiques de la HR et les énergies mises en jeu à chaque étape du processus.
2)	Des mesures de cinétique de reconnaissance d’homologie en solution seront effectuées pour déterminer  les constantes d’association et dissociation des ADN, via l’interaction avec Rad51. On testera l’effet de défauts d’homologie sur la stabilité de la recombinaison.
3)	On développera un modèle théorique simplifié de la recherche d’homologie, pour estimer la distribution  des temps nécessaires à la reconnaissance. On cherchera à identifier les paramètres accessibles expérimentalement pour vérifier le modèle.