Projet ANR-06-PCVI-0029 – CEMO-TO-VIS : 3D Structure and organization of cell componets using CEMOVIS and CETOVIS
Programme : Physique et Chimie du Vivant (PCV) (PCV) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : CNRS DELEGATION REGIONALE ILE DE FRANCE SUD (CNRS DELEGATION REGIONALE ILE DE FRANCE SUD)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut Curie
Montant : 400000.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 48 mois
Résumé : La structure et l'organisation de la cellule a été reconsidérée ces dernières années grâce au développement des techniques d'imagerie de fluorescence et à l'expression de marqueurs fluorescents conçus pour identifier spécifiquement certains constituants cellulaires. Parallèlement, les techniques de Cryomicroscopie Electronique et de tomographie des sections vitreuses (CEMOVIS et TOVIS) permettent une visualisation des constituants cellulaires dans leur environnement natif, avec une résolution moléculaire (1 à 5 nm). Ces méthodes très prometteuses sont à ce jour développées dans un très petit nombre de laboratoires. Elles devraient permettre à terme d'obtenir une compréhension tridimensionnelle de la cellule dans des conditions aussi proches que possible du vivant.  Nous proposons de développer les méthodes CEMOVIS et TOVIS pour traiter trois questions biologiques précises i) la morphogenèse, la structure et la duplication du centriole, ii) la biogenèse des mélanosomes et iii) l'organisation du chromosome eucaryote.  (i)	Le centriole subit des changements conformationnels au cours de sa maturation et de sa duplication. Il est trop gros pour être observé sans dommage dans un mince film d'eau. L'objectif est ici de réaliser des cryosections des centrioles vitrifiés, soit isolés, soit in situ dans la cellule, et d'utiliser les méthodes de tomographie électronique pour obtenir une reconstruction tridimensionnelle de centrioles individuels. L'étape suivante est de pouvoir localiser des protéines qui participent à l'architecture et au fonctionnement du corps basal et du centrosome. (ii)	Les mélanosomes suivent un processus de maturation complexe qui implique des changements structuraux pendant la synthèse et l'accumulation de mélanine. La reconstruction tomographique de ces organelles dans leurs différents états de maturation constitue un atout pour la compréhension du processus de biosynthèse. (iii)	L'obtention d'images haute résolution de la chromatine intranucléaire reste très délicate, probablement à cause de la concentration très élevée en nucléosomes, et de leur dimensions réduites par comparaison avec l'épaisseur des coupes. L'objectif est de reconnaître les nucléosomes au sein du noyau in situ, de déterminer leur organisation supramoléculaire locale et de détecter des transitions de phase entre ces différentes structures en réponse à des changements de l'activité du génome. Pour traiter chacune de ces questions biologiques, l'environnement initial aqueux et ionique doit être maintenu. Nous proposons de déterminer la structure de ces composants cellulaires (centrosome, mélanosomes, chromosomes) à différentes étapes du cycle cellulaire, de détecter les changements conformationnels des macromolécules liés à des activités biologiques spécifiques et d'accéder à leurs interactions. Le projet s'appuie sur la mise en oeuvre et le développement des techniques de cryomicroscopie électronique, et plus précisément la cryoprotection et la vitrification des échantillons, la cryo-ultramicrotomie et l'imagerie et la reconstruction 3D (imagerie haute résolution, tomographie avec collecte automatisée d'images sous de faibles doses d'électrons, conception et implémentation de logiciels pour la tomographie). Pour identifier et déterminer la structure des objets dans le contexte cellulaire, nous nous appuierons sur des images de ces mêmes objets, isolés, en solution. Les méthodes de reconnaissance d'images seront appliquées aux tomogrammes. Les possibilités de marquage spécifique des composants cellulaires par des particules denses aux électrons seront également explorées. Nous espérons i) obtenir une reconstruction tridimensionnelle des corps basaux et des centrioles, et décrire les changements morphologiques intervenant lors de leur maturation et/ou duplication, ii) déterminer la structure trimensionnelle des mélanosomes à différentes étapes de leur maturation et iii) déterminer la structure locale de la chromatine eucaryote (i.e. l'organisati.