Projet ANR-13-ISV6-0001 – EpiSplice : Epigénétique et épissage alternatif rôle dans la différenciation des lymphocytes T et leur transformation leucémique
Programme : Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SVSE 6 - Génomique, Génétique, Bioinformatique et Biologie systémique (Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SVSE 6)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Pierre FERRIER (Centre National de la Recherche Scientifique_ CIML)
Partenaires : Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy; IMM Institute of Molecular Medicine, Lisbon, Portugal
Montant : 209874.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 36 mois
Résumé : Epigénétique et épissage alternatif: rôles dans la différenciation des lymphocytes T et leur transformation leucémiqueNous posons comme hypothèse que les mécanismes épigénétiques contribuent - dans les cellules T en voie de différenciation - à la définition non seulement des profils d’expression génique mais aussi à ceux d’épissage RNA de manière spécifique - avec comme conséquence, en cas de dérégulation, la transformation maligne de ces cellules
Décryptage des voies moléculaires impliquées dans la différenciation normale et pathologique des lymphocytes Tla compréhension des voies moléculaires impliquées dans la différenciation T pourrait révéler de nouvelles stratégies thérapeutiques de traitement d’affections telles que les leucémies aigues lymphoblastiques T (LAL-T)
EpiSplice vise à élucider les connexions possibles entre structure de la chromatine, transcription et épissage alternatif des ‘pre-mRNAs’ au cours de la différenciation et la leucémogenèse TNous proposons d’axer nos analyses sur les cellules primaires précurseurs des cellules T dans le thymus murin, et sur des modèles cellulaires de transformation leucémique de ces cellules développés dans nos laboratoires. Les analyses méthodologiques combinent les approches de biologie systémique, de NGS (Next Generation Sequencing) à haut débit de l’épigénome et du transcriptome, et celles de l’imagerie microscopique ARN après marquage métabolique.
Résumé de la soumission : La différenciation des lymphocytes T dans le thymus implique de moduler l’expression de centaines de gènes selon un ordre temporel bien défini. Une dérégulation de ces processus fondamentaux peut conduire au développement d’un état cancéreux (leucémie). Parce que différenciation T physiologique et transformation aigüe lymphoblastique (ALL) sont étroitement corrélées, la compréhension des voies moléculaires qui sous tendent le 1er processus est capital pour imaginer de nouvelles stratégies thérapeutiques de ces affections généralement de mauvais pronostic. De récentes évidences expérimentales soulignent l’interconnexion entre modulation chromatinienne, transcription extra-génique et mécanismes de maturation post-transcriptionnelle de l’ARN. Cependant, on sait encore peu de chose en ce qui concerne les contrôles moléculaires des ces différents phénomènes. Nous posons comme hypothèse que les mécanismes épigénétiques contribuent plus encore qu’on ne le pense à l’élaboration de l’identité transcriptionnelle (incluant les processus d’épissage de l’ARN) des cellules T en voies de différenciation. Selon ce modèle, les variations de profils épigénétiques orchestrent l’expression finement régulée et éventuellement conduisent à la transformation leucémique des cellules T. Une définition détaillée de ces processus pourrait offrir des opportunités nouvelles afin de ‘manipuler’ le développement de ces cellules, voire même de mieux traiter ce type de cancer. Notre programme (EpiSplice) se propose d’élucider les connexions entre structure chromatinienne, transcription non-codante, et épissage alternatif en prenant comme modèles se prêtant tout particulièrement à ces analyses la différenciation T précoce et la leucémogenèse des cellules correspondantes. Nous exploiterons pour ces analyses des approches modernes épi/génomiques à haut-débit, des analyses transcriptomiques, des techniques de simulation combinées à des stratégies et protocoles de perte de fonction, de marquage métabolique des ARNs et de visualisation sub-cellulaires de ces molécules par techniques dites d’ hybridization in situ et de microscopie confocale. Nous escomptons ainsi : i) dégager une vision nouvelle de la biologie des ARNs non codants et des phénomènes d’épissage alternatif; ii) une vue plus précise de la progression temporelle des changements d’expression géniques conduisant à l’état leucémique; et iii) potentiellement, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces affections.Le plan de recherche qui est proposé veut construire sur une déjà longue période de collaboration entre les deux laboratoires partenaires qui a ses origines dans un précédent programme Européen de recherche ‘Research and Training Network Chromatin Plasticity’. L’élément crucial est l’intégration de savoirs, expertises et méthodologies complémentaires apportés par chaque laboratoire. L’equipe partenaire Française (CIML/CNRS - coordinateur de ce projet) dirigée par Pierre Ferrier possède une longue expérience dans l’étude des mécanismes de régulation du développement lymphocytaire, en particulier en ce qui concerne les analyses de la chromatine et des activités transcriptionnelles. Le laboratoire Portugais, dirigé par Maria Carmo-Fonseca est familier des études de coordination des processus transcriptionnels et post-transcriptionnels, notamment en ce qui concerne les phénomènes d’épissage alternatif.
Résultats : --Profil évolutif de mutations géniques dans un modèle murin de transformation leucémique: les analyses bioinformatiques ont permis d’établir la liste des gènes altérés pour chacune des conditions évolutives de leucémogenèse. On constate un nombre de mutations considérablement plus élevé dans les tumeurs et cellules TAP (~4000 gènes) que dans les cellules TLX3-1 d’origine (307 gènes). Ces travaux mettent en évidence un enrichissement progressif d’oncogènes/gènes suppresseurs de tumeur mutés au cours de la transformation maligne, permettant de retracer un historique précis de ce processus tumoral.
--Structure chromatinienne spécifique, dépendante de la transcription, au locus TCRß: Le cours du développement des cellules T est caractérisé par la mise en place d’un profil épigénétique spécifique montrant de hauts niveaux de marques H3K4me3 tout au long des segments Dß-Jß-Cß du gène TCRß. Cette tri-méthylation H3K4 étendue dépend pour sa mise en place de la transcription médiée par la polymérase ARN II (Pol II). Nous avons montré que les régions génomiques comprenant les deux clusters DJCß sont fortement enrichies en formes Pol II Ser5-phosphorylées ainsi qu’en transcrits sh-RNAs, deux stigmates d’initiation de transcription précoce. Ces propriétés sont retrouvées au niveau d’autres gènes dont l’expression est hautement ‘tissu-spécifique’. Ainsi, ces régions se comportent comme des plateformes d’initiation de la transcription, connectant ainsi un mécanisme spécialisé de transcription Pol II-dépendante avec une tri-méthylation H3K4 étendue et des segments de chromosomes hautement accessibles (Zacarias-Cabeza et al., J. Immunol. 2015).
Perspectives : --Le partenaire MCF a adapté une approche RNA FISH au niveau uni-moléculaire (sm-RNA FISH) afin de visualisation in situ de lncRNAs dans le modèle murin de LAL-T (développé dans le laboratoire du coordinateur - PF), utilisant de courtes sondes oligonucleotidiques et la technology LNA (Locked Nucleic Acid). Cette approche originale a été implémentée pour atteindre de plus hauts niveaux de résolution par utilisation de technologies ‘Enzyme Labeled Fluorescence (ELF) Signal Amplification’ et ‘Tyramide Signal Amplification’ (TSA), ave détection par microscopie confocale ‘spinning disk.
--Le laboratoire MCF - utilisant la technologie mNET-seq pour détecter les transcrits naissants associés à différentes formes de phosphorylation CTD de Pol II  - a montré des différences fondamentales vis-à-vis de ces marqueurs entre gènes codants pour des protéines ou des ‘lncRNAs’. Exploitant l’approche technologique de ‘chromatin RNA-sequencing’, ce laboratoire a de plus montré que les ‘lncRNAs’ se trouvent en majorité associés à la chromatine, à l’opposé des ARNm matures qui s’accumulent plutôt au niveau du nucléoplasme. Ces mêmes analyses vont maintenant pouvoir être appliquées aux systèmes modèles de la différenciation normale T et de la transformation leucémique de ces cellules.
Publications et brevets : 1.	ZACARIAS-CABEZA et al. (2015). Transcription dependent generation of a specialized chromatin structure at the TCR ß locus. J. Immunol. 194, 3432-3443.
2.	VAZ-DRAGO et al. (2015) Transcription-coupled RNA surveillance in human genetic diseases caused by splice site mutations. Hum Mol Genet. 24, 2784-95.
3.	RINO et al. STaQTool: Spot Tracking and Quantification Tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells. Methods (En révision).
4.	Additional publications: Nojima et al., Mammalian NET-seq reveals genome-wide nascent transcription coupled to RNA processing. Cell 161: 526-540; Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols (Sous presse).
5.	GROSSO & CARMO-FONSECA (2014) The potential of targeting splicing for cancer therapy. R. Kumar (ed.), Nuclear Signalling Pathways and Targeting Transcription in Cancer, Cancer Drug Discovery and Development; Springer Science+Business Media New York 2014.
6.	OUTTERS et al. (2015) Long-range control of V(D)J recombination & allelic exclusion: Modeling views. Adv Immunol. In Cornelis Murre, Editor: Long Range Regulation of V(D)J Recombination, Vol 128, AI, UK: Academic Press, pp. 363-413.