Projet ANR-10-BLAN-1525 – TERMINATOR : Mécanisme de la terminaison transcriptionelle par le facteur Rho
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Emmanuel MARGEAT (CNRS - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
Partenaires : Centre de Biophysique Moléculaire; Centre de Biochimie Structurale; Centre de Biochimie Structurale
Montant : 480000.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Mecanisme de Rho : un nanomoteur moléculaire au cœur de l’expression des gènesL’hélicase Rho est un nanomoteur moléculaire, impliqué dans la régulation de l’expression des gènes chez la bactérie E Coli, dont le mode d’action reste mal compris malgré des décennies de recherche. Dans ce projet, nous proposons de lever le voile sur son fonctionnement, par la combinaison de méthodes de pointe de biophysique et de chimie combinatoire.
Comprendre la régulation de l’expression des gènesCe projet vise à élucider le mécanisme par lequel Rho agit pour empêcher l’expression d’un gène, en stoppant la transcription de l’ADN. Il s’agit d’un mécanisme très général de régulation génique chez les bactéries telles que E. Coli. Par ailleurs, Rho constitue la cible privilégiée pour des antibiotiques de type bicyclomycine.
Une combinaison de méthodes de pointe de biophysique et de chimie combinatoireBien que Rho ait été découvert au début des années 70, son mécanisme d’action reste mal connu. Nous utilisons ici un ensemble de technologies de pointe afin d’élucider ces mécanismes : la nanomanipulation d’acides nucléiques par pinces optiques ou magnétiques, et la chimie combinatoire permettant de déterminer à haut débit les groupements chimiques impliqués dans les réactions.
Résumé de la soumission : La transcription, le processus de biosynthèse de l’ARN, est la première étape importante de l’expression génique (1, 2). Cette activité enzymatique est assurée par l’ARN polymérase (ARNP) et est contrôlée par de multiples événements dynamiques mal compris qui impliquent les composants du complexe ternaire de transcription (ARNP, ADN et transcrit ARN) et des cofacteurs protéiques ou métaboliques. Les ARNP bactériennes présentent de grandes homologies de séquence, structure et fonction avec les ARNP eucaryotes (2) et constituent donc d’excellents modèles pour l’analyse des mécanismes transcriptionnels. Des facteurs, tels que le facteur de terminaison Rho d’E. Coli, influencent aussi bien l’activité des ARNP bactériennes que celles d’organismes supérieurs (3). Rho est une protéine homo-hexamèrique, qui se lie au transcrit, a une activité ATPase ARN-dépendante, et peut dérouler directionnellement des hélices ARN-ARN et ARN-ADN. Ces propriétés font de Rho un exemple unique de moteur moléculaire ARN-dépendant et structuré en anneau (4, 5). Cependant, les mécanismes par lesquels Rho exerce ses fonctions biologiques restent mal compris. Le grand intérêt suscité par ces mécanismes s’est pourtant récemment renforcé, suite à la démonstration de l’activité régulatrice globale du génome d’E. Coli par Rho (6, 7).Dans ce projet, nous proposons d’étudier le mécanisme de terminaison transcriptionelle induite par Rho en utilisant une approche innovante qui intègre des expériences de biophysique de molécules uniques et d’analyse chimiogénétique combinatoire. Des mesures en nanomanipulation (pinces optiques et magnétiques) nous permettront de mesurer les caractéristiques physiques élémentaires du moteur Rho (vitesse et taille du pas élémentaire de translocation, coordination inter sous-unités, couplage entre hydrolyse de l’ATP et mouvement, …). Nous utiliserons ensuite une nouvelle forme, résolue en temps, d’analyse chimiogénétique avec des sondes nucléotidiques (trNAIM) pour déterminer la signature cinétique des signaux d’interférence que nous avons découvert récemment (8), et qui révèlent un étonnante périodicité (7nt) d’activation de Rho par des groupements 2’-OH de sa piste ARN. Avec cette nouvelle approche, nous étudierons les mécanismes de communication allostérique dans l’anneau Rho, déterminerons la nature et le réarrangement des interactions Rho-ARN, et expliquerons comment ces éléments gouvernent l’activité de Rho. Nous étudierons également le mécanisme par lequel Rho provoque la dissociation de l’ARNP (et donc la terminaison transcriptionnelle), par des mesures de FRET sur des complexes de transcription uniques et immobilisés. Enfin, nous étudierons Rho dans des environnements plus complexes, notamment en présence des facteurs NusG, Yaeo ou Psu, ou directement dans la bactérie en mesurant l’interaction de Rho avec ses partenaires par des techniques de fluctuation de fluorescence. Toutes ces informations nous permettront de tester les modèles les plus récents de coordination mécanochimique au sein de Rho, de réviser les modèles de terminaison Rho-dépendante, et de comprendre comment Rho fonctionne dans des contextes régulateurs plus complexes. Plus généralement, ces études permettront une meilleure compréhension des mécanismes utilisés par des hélicases et moteurs analogues (anneaux de type RecA ou AAA+) impliqués dans la ségrégation des chromosomes, la compaction de l’ADN, la conjugaison bactérienne, ou la protéolyse.1.	G. Orphanides et al. Cell 108, 439 (2002).2.	R. H. Ebright, J Mol Biol 304, 687 (2000).3.	T. J. Santangelo et al., J Mol Biol 355, 196 (2006).4.	S. S. Patel, et al. Annu Rev Biophys Biomol Struct 69, 651 (2000).5.	J. P. Richardson, Biochim Biophys Acta 1577, 251 (2002).6.	C. J. Cardinale et al., Science 320, 935 (2008).7.	R. A. Mooney et al., Mol Cell 33, 97 (2009).8.	A. Schwartz et al., Nat Struct Mol Biol 16, 1309 (2009).
Résultats : Mise en évidence du mécansime de translocation de Rho sur l'ARN
Perspectives : Poursuite du projet
Publications et brevets : Analysis of Helicase-RNA interactions using Nucleotide Analog Interference Mapping (NAIM). Schwartz A., Rabhi M.,Margeat E. ,Boudvillain M. Methods in Enzymology (2012) 511, 149-169
Transfert d’énergie de Förster sur molécules uniques. Margeat E. L’actualité chimique (2010) 347