Projet ANR-14-CE09-0014 – ReconstMT-Act : Reconstitution de l'interface entre les microtubules et l'actine corticale
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401) 2014
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Monsieur Dimitris Liakopoulos (Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire)
Partenaires : Laboratoire public; Laboratoire de Physiologie Cellulaire Végétale
Montant : 439689.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 60 mois
Résumé : L'interaction entre les réseaux d’actine et de microtubules est essentielle dans de nombreux processus cellulaires, par exemple au cours de la croissance des neurones ou lors du développement des tissus. Des mutations du gène APC, codant pour la protéine "Adenomatous Polyposis Coli" qui module cette interaction, peuvent entraîner le cancer colorectal. Cependant, les informations sur les mécanismes moléculaires contrôlant le lien entre ces deux composants du cytosquelette sont limitées en raison de la taille des protéines ou des complexes protéiques impliqués dans cette interaction. Au cours de ce projet nous allons caractériser le lien actine/microtubule et plus particulièrement le rôle de Kar9 au cours de ce processus.  La protéine de levure Kar9 forme notamment un complexe avec la myosine V et une protéine interagissant avec l’extrémité plus des microtubules : EB1. Kar9 présente des homologies fonctionnelles avec le suppresseur de tumeur APC et les spectraplakines assurant le lien actine/microtubules chez les mammifères. L’objectif de ce projet est d’élucider le lien entre filaments d’actine et microtubules à travers une analyse du type relation structure-fonction du complexe Kar9.
Pour atteindre cet objectif, l’équipe Liakopoulos a analysé la fonction du complexe Kar9 in vivo et a identifié des modifications post-traductionnelles qui régulent sa fonction. Cette équipe a développé les outils nécessaire à l’étude de ces processus in vivo et a utilisé des protéines purifiées pour reconstituer de façon partielle le complexe protéique nécessaire au transport de Kar9 et à son interaction avec l'actine.
L’équipe Blanchoin/Théry est experte dans l’élaboration de systèmes reconstitués in vitro pour étudier la dynamique du cytosquelette. Cette équipe a développé récemment une technique de micropatrons pour contrôler de façon géométrique l’assemblage du cytosquelette in vitro et a montré que ce procédé peut être mis en oeuvre pour étudier les lois d’organisation du cytosquelette. 
Dans ce projet collaboratif,  l’équipe 1 cherchera à obtenir des informations structurales sur la protéine Kar9 et le complexe qu’elle forme avec ses partenaires protéiques. Pour cela le complexe natif Kar9 sera purifié dans la levure ou reconstitué à partir de protéines recombinantes. Cette approche permettra de cartographier les interactions entre les différentes protéines formant ce complexe et d'examiner le rôle des modifications post-traductionnelles sur son assemblage et sa stabilité. Nous pourrons ainsi identifier la stœchiométrie des différentes protéines composant le complexe Kar9 endogène et la comparer avec celle du complexe reconstitué. Nous utiliserons la cryo- ou microscopie électronique afin d’étudier la structure du complexe Kar9 lié aux microtubules.
Nous allons combiner les outils protéiques générés par l'équipe 1 et l'expertise de l'équipe 2 en système reconstitué et en imagerie de type molécule unique avec 2 objectifs principaux. Le premier reposera sur l’étude du transport de Kar9 le long des microtubules in vitro. Le deuxième sera de reconstituer le lien entre les microtubules et les filaments d’actine modulé par Kar9. L’équipe 2 va élaborer des réseaux dynamiques de filaments d'actine et de microtubules ayant une géométrie bien définie à partir de micropatrons. Nous allons utiliser ces organisations pour reconstituer les interactions entre les microtubules et des filaments d'actine, en utilisant des complexes Kar9 natif ou assemblés à partir de protéines recombinantes. Ces approches nous permettrons d'analyser quantitativement la structure et les propriétés biophysiques (montant de forces générées ou dynamique complexe) des assemblages de protéines dynamiques qui constituent l'interface microtubules/actine. Cette approche méthodologique pourra être étendue à l'étude de systèmes plus complexes impliquant les spectraplakins et/ou la protéine APC.