Projet ANR-08-BLAN-0232 – REGULncRNA : Identification and characterization of regulatory ncRNAs in budding yeast
Programme : Blanc (BLANC) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Institut Curie
Montant : 489563.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 36 mois
Résumé : Introduction-contexte Chez les cellules eucaryotes, les ARN non codants régulateurs jouent un rôle crucial pour l'établissement de domaines chromatiniens, régulant la structure des chromosomes et l'expression des gènes. Les ARNs régulateurs de longues ou de courtes tailles régulent les modifications des histones et le devenir des ARN messagers. Les longs ARN régulateurs s'associent directement à des complexes de modifications de la chromatine pour la mise en place d'une chromatine silencieuse. En ce qui concerne les ARNs régulateurs courts, la plupart des cellules eucaryotes présentent un mécanisme d'ARN interférence (ARNi) qui régule les domaines chromatiniens et l'expression des gènes. Etonnamment, les facteurs impliqués dans l'ARNi sont totalement absents de la levure S. cerevisiae. Toutefois, des données récentes publiées indépendamment par le groupe d'A. Morillon (coordinateur du projet) et le groupe de F. Stutz montrent que S. cerevisiae possède des voies de régulation alternatives de régulation de l'expression des gènes par des molécules d'ARN. Ces régulations mettent en jeu des transcrits cryptiques instables, modulant l'expression de gènes spécifiques par des marques épigénétiques caractéristiques de l'hétérochromatine silencieuse. Nous proposons que chez S. cerevisiae, la mise en place et la maintenance des domaines chromatiniens particuliers sont globalement régulés par des ARNs régulateurs non codants. De plus, nous favorisons l'idée que cette régulation encore peu caractérisée est conservée dans l'évolution. Ces ARN régulateurs contrôleraient donc la structure des chromosomes et l'expression des gènes. Objectifs et méthodologie Avec ce projet, nous proposons d'identifier systématiquement les ARNs trans-régulateurs chez S. cerevisiae et de caractériser leurs mécanismes d'action. Notre stratégie s'articule en 4 axes: Objectif A: Entreprendre une analyse globale des ARN non codants régulateurs chez la levure en utilisant l'approche de séquençage haut débit. Par des analyses de séquence et une comparaison des bases de données de S. cerevisiae, nous les localiserons dans le génome. Pour améliorer leur détection, les ARNs seront extraits de souches défectueuses pour les voies de dégradation des ARNs. Objectif B: Déterminer les niveaux de protéines dans les souches défectueuses pour les voies de dégradation des ARN, par des expériences de gels en 2 dimensions. Les protéines présentant une large diminution seront sélectionnées et leurs loci chromosomiques seront analysées pour la présence d'ARN non codants identifiés en A. Les ARN non codants seront clonés et exprimés en trans pour déterminer leurs rôles dans la régulation de ces gènes. Objectif C: Caractérisation fonctionnelle des ARN non codants télomériques, identifiés dans des travaux préliminaires du groupe d'A. Morillon. Nous analyserons la formation de l'hétérochromatine en présence de ces ARN potentiellement régulateurs. Objectif D: Déterminer les conditions physiologiques de stress permettant de détecter la présence des ARN non codant régulateurs, comme cela a été suggéré dans des cellules vieillissantes. Nous projetons d'étudier les ARN non codants dans des conditions variées de stress, en particulier en conditions de carence en nutriments et acides aminés ou en bloquant le cycle cellulaire. Dans un premier temps, nous étudierons des cas manuellement, puis globalement en appliquant les techniques de séquençage développées en A. Résultats attendus Hormis les travaux récents, les ARN régulateurs non codants n'avaient pas été caractérisés chez S. cerevisiae. Notre équipe a participé à la description du premier exemple d'ARN régulateur non codant chez la levure (Berretta et al. 2008). Au travers de ce projet, nous anticipons de dresser le premier catalogue exhaustif des ARN non codant régulateurs impliqués dans des régulations en trans de l'expression des gènes et de domaines chromatiniens. En examinant en détails des exemples que nous choisirons pour la régulation