Projet ANR-14-CE11-0020 – MACRONANO : Nouvelles approches multimodales pour l’étude dynamique de macrophages humains individuels à l’échelle nanométrique
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401) 2014
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Monsieur christophe VIEU (Laboratoire d'Analyses et d'Architecture des Systèmes)
Partenaires : Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale; Laboratoire public; Laboratoire Francis Perrin
Montant : 471372.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 54 mois
Résumé : Les macrophages sont capables d’infiltrer tous les tissus d’un organisme, quelles que soient leurs compositions, rigidités ou architectures. Cette étape est critique pour leur fonction immuno-protectrice, mais elle est aussi associée à l’aggravation de pathologies chroniques. C’est pourquoi le contrôle de la migration des macrophages apparait comme un nouveau défi thérapeutique. Nous avons montré précédemment que la migration 3D mésenchymateuse des macrophages implique leurs structures d’adhérence: les podosomes qui constituent des cibles potentielles dans le cadre de nouvelles approches thérapeutiques visant à contrôler la migration des macrophages. Les podosomes sont des structures sub-micrométriques qui se présentent sous la forme d’un cœur d’actine filamentaire entouré d’un anneau composé de protéines d’adhérence, les intégrines, et de protéines connectant les intégrines au cytosquelette. Les podosomes sont interconnectés par un réseau radial de microfilaments d’actine, et sont suspectés de sentir la rigidité de l’environnement (« mechanosensing »), via l’application de forces de protrusion. Ces forces n’ont jamais pu être mesurées, du fait de l’absence de méthode dédiée à la mesure de forces perpendiculaires à un substrat. Ainsi, la compréhension des mécanismes impliqués dans l’activité de mechanosensing à l’échelle du podosome nécessite l’émergence de nouvelles technologies dotées d’une haute résolution spatiale, à l’interface entre la biologie et la physique.
Nous avons récemment développé une méthode dédiée à l’évaluation des forces de protrusion générées par des podosomes, que nous avons appelée « Protrusion Force Microscopy » (PFM). Elle consiste en la mesure, par microscopie à force atomique, des déformations produites par les podosomes dans une membrane de Formvar. Grâce à la PFM, nous avons pu montrer que chaque podosome exerce une force oscillatoire d’environ 90nN (Labernadie et al, en révision). 
Maintenant, notre objectif consiste à développer de nouvelles méthodologies basées sur les nanotechnologies pour étudier plus en détails l’activité de mechanosensing des macrophages. Le projet comprend 4 volets :
-	L’identification des protéines de l’anneau impliquées dans la production de force par les podosomes mesurée par PFM ;
-	L’étude des propriétés de mechanosensing des podosomes, en créant des motifs de rigidités contrôlées dans une membrane de Formvar par abrasion ionique (FIB) et en mesurant la force des podosomes par PFM sur ces surfaces;
-	L’étude du rôle de l’organisation des podosomes en réseau, qui sera contrôlée en faisant adhérer des macrophages sur des motifs de protéines de matrice extracellulaire dessinés par lithographie douce;
L’étude de la mécanique des macrophages dans une structure 3D dessinée par lithographie bi-photonique 3D.Le modèle théorique que nous avons élaboré afin d’expliquer les forces oscillatoires générées par un podosome isolé sera complété avec les résultats sur les régulateurs présents dans l’anneau des podosomes, les câbles latéraux et l’organisation des podosomes en réseau.
Les résultats de ce projet nécessiteront une analyse selon des perspectives biologiques et technologiques. De fait, d’une part nous allons générer des résultats quantitatifs originaux sur la mécanique et les propriétés de mechanosensing des macrophages humains et d’autre part, nous  allons valider une technologie applicable pour différents modèles cellulaires permettant l’étude dynamique (en temps réel), multimodale et quantitative des forces de protrusion. Pour atteindre ces objectifs, nous allons utiliser plusieurs méthodes issues des nanosciences: microscopie de force atomique en milieu liquide, lithographie douce, l’imagerie en force atomique (AFM) en milieu liquide, la lithographie douce, la gravure localisée par faisceaux d’ions focalisés, la lithographie 3D à deux photons et la microscopie de fluorescence en réflexion totale interne (TIRF).