Projet ANR-07-PRIB-0002 – DEMANNF8 : Facteur VIII demannosylé recombinant pour le traitement des patients hémophiles A
Programme : Recherche et innovation en biotechnologie (RIB) 2007
Année de financement : 2007
Coordinateur du projet : LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES (LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES)
Partenaires : Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut national de la santé et de la recherche médicale; PME
Montant : 445755.0 euros
Durée : 24 mois
Résumé : L'hémophilie A est une maladie génétique rare de la coagulation consécutive à l'absence d'une protéine appelée le facteur VIII (FVIII). Le traitement des hémorragies à l'aide de FVIII exogène induit des auto-anticorps qui l'inhibent, ce qui complique le traitement des patients. Dans les pays occidentaux, le traitement annuel d'un patient avec inhibiteurs atteint 190000 euros/an. Nous avons démontré récemment que les sucres mannosylés sur les Asn239 et Asn2118 du FVIII permettent son internalisation par les cellules présentatrices de l'antigène, suivie de sa présentation aux lymphocytes T CD4+ et de l'activation des cellules T. 
L'objectif du projet DEMANNF8 est de produire un FVIII recombinant dépourvu de sucres mannosylés, qui serait moins immunogénique que les FVIII recombinantdisponibles commercialement. Nous produirons 4 variants de FVIII recombinant: un FVIII non muté, un FVIII Asn239Ala, un FVIII Asn2118Ala et un FVIII Asn239Ala/Asn2118Ala. A l¿aide du FVIII sauvage comme contrôle, nous vérifierons que 1) les différents FVIII démannosylés sont sécrétés par les cellules eukaryotes, 2) les rendements de production sont compatibles avec un développement industriel ultérieur, 3) l'activité pro-coagulante et la structure des molécules sont préservées, 4) l'immunogénicité est réduite. Nous apporterons ainsi la preuve de concept en faveur d'une nouvelle molécule de FVIII fonctionnelle en tant que co-facteur du facteur IX activé et peu immunogénique. //Notre description du rôle majeur joué par les sucres mannosylés du FVIII sur son immunogénicité in vitro est nouvelle, et fait l¿objet d¿un dépôt de brevet. Nous souhaitons introduire des mutations dans le FVIII afin d¿éliminer des sites de `N-glycosylation' et ainsi prévenir l¿addition de sucres mannosylés au moment de la synthèse du FVIII par les cellules. Aujourd¿hui, de nombreuses molécules de FVIII sont générées par mutagénèse dirigée par les différents groupes industriels internationaux. Les buts poursuivis sont mutliples: augmenter la demi-vie du FVIII thérapeutique, accroître la production du FVIII par les lignées cellulaires au stade de la production industrielle afin d¿abaisser les coûts de production, rendre le FVIII moins antigénique (modification des épitopes reconnus par les anticorps ou les cellules T). En comparaison, notre approche est différente et originale. Nous visons à rendre le FVIII moins immunogénique. L¿élimination des sucres mannosylés empêchera l¿interaction du FVIII avec les récepteurs d¿internalisation présents à la surface des cellules présentatrices de l¿antigène. Nous bloquerons ainsi, en amont de la réponse immunitaire, l¿interaction du FVIII avec les effecteurs cellulaires du système immunitaire. //L¿équipe 1 produit et commercialise du FVIII thérapeutique (Factane)et a développé un FVIII recombinant sans domaine B. Elle maîtrise la caractérisation fonctionnelle et structurale du FVIII, l¿analyse des sucres du FVIII et l¿étude de son immunogénicité chez le chien hémophile. Elle a la connaissance parfaite du marché et de l¿intérêt représenté par le développement d¿un FVIII thérapeutique moins immunogène. 
L¿équipe 2 travaille depuis 10 ans sur la réponse immunitaire contre le FVIII chez l¿hémophile. Elle a développé des tests cellulaires pour tester l¿immunogénicité du FVIII et utilise les souris hémophiles. L¿équipe 2 a récemment acquis les outils de biologie moléculaire permettant de produire des protéines recombinantes dans des systèmes eukaryotes. 
L¿équipe 3 possède une longue expérience en hémostase, et la connaissance technique pour la production de facteurs de la coagulation recombinants. L¿équipe 3 a récemment acquis le modèle expériemental d¿injection hydrodynamique. 
//Notre objectif est de produire un FVIII recombinant moins immunogène que les FVIII thérapeutiques commercialisés. Nous tenterons de réduire l¿immunogénicité du FVIII par mutagénèse dirigée, en remplaçant les Asn239 et 2118 auquels sont fixés les sucres mannosylés, par des