Projet ANR-13-BSV8-0014 – REPLIPOX : Elucidation structurale et fonctionnelle du processus de réplication génomique des poxvirus
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8) 2013
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Wim BURMEISTER (Unit of Virus Host Cell Interactions)
Partenaires : Institut de Biologie Structurale; Institut de recherche biomédicale des armées; Biologie Structurale des Interactions entre Virus et Cellule-Hôte
Montant : 350000.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 42 mois
Résumé : La variole a été un fléau majeur pendant des siècles avant son éradication en 1979. Néanmoins le risque d’une utilisation bioterroriste et la réintroduction de virus apparentés à partir d’un réservoir animal persiste. Les poxvirus sont particuliers car leur réplication est cytoplasmique et repose donc entièrement sur des protéines codées par le génome viral. Leur génome est formé d’un ADN linéaire double brin circularisé aux extrémités par des structures en épingle à cheveux. Cette organisation génomique est aussi présente chez des phycodnavirus et des afsarvirus. Tous ces virus partagent le même type d’ADN polymérase et d’hélicase-primase ainsi que d’autres spécificités et ont été regroupé pour former le clade des grands virus à ADN nucléo-cytoplasmique (NCLDV). Au début des années 80, plusieurs modèles de réplication des poxvirus ont été proposés basés sur une coupure simple brin, suivie d’une élongation monodirectionnelle et d’un réarrangement de brin. Mais l’identification d’une primase et les premiers résultats sur la structure 3D du complexe de réplication obtenus récemment par nos équipes challengent ces anciens modèles. Nous avons montré que l’hélicase-primase D5 est hexamérique comme d’autres hélicases de la famille 3. Cela suggère plutôt un mécanisme impliquant une fourche de réplication. Nous proposons de développer les investigations structurales et fonctionnelles de la machinerie de réplication impliquant d’un coté l’ADN polymérase E9, l’uracile ADN glycosidase D4 et le facteur de processivité A20 et de l’autre coté l’hélicase-primase hexamérique D5. En utilisant l’expression recombinante de protéines du virus de la vaccine, qui est un modèle à 97% identique au virus de la variole, nous sommes capables de produire des milligrammes de ces 4 composants en cellules d’insecte et certaines constructions de D4 et A20 s’expriment aussi en bactérie. Nous utiliserons la cristallographie des protéines et la microscopie électronique pour continuer le travail structural que nous avons engagé récemment afin de déterminer le détail des interactions moléculaires au sein de ces complexes. La reconstitution de la machinerie de réplication in vitro est aussi à notre portée et facilitera grandement nos études fonctionnelles. Comme nous avons révélé récemment la distance importante entre les sites catalytiques du complexe de réplication, nous souhaiterions définir précisément le rôle de D4 ainsi que l’activité primase en utilisant ce modèle in vitro. L’activité hélicase de D5 doit aussi être prouvée expérimentalement et pourrait nécessiter l’identification et l’inclusion de protéines partenaires. Nous pensons qu’une percée dans la compréhension de la réplication des poxvirus est à notre portée avec des implications fortes pour les autres virus du clade NCLDV et des applications potentielles dans la modélisation d’antiviraux, en particulier de composés ciblant les surfaces d’interactions au sein du complexe.