Projet ANR-08-PCVI-0026 – EzrinBiomim : Ezrin mediated membrane cytoskeleton coupling : studies in biomimetic systems
Programme : Programme interdiciplinaire en physique et chimie du vivant (PCV) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 400000.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 36 mois
Résumé : Le but de ce projet est de comprendre à l'échelle moléculaire le lien entre structures membranaires et cytosquelette d'actine. Ce lien à l'origine de protrusions membranaires (telles que microvilli et pseudopodes) contribue à l'ancrage de la cellule dans son environnement. L'ezrine, membre de la famille des ERM (ezrine, radixine, moésine), est un des facteurs moléculaires qui établit un lien direct entre le cytosquelette et la membrane plasmique. L'ezrine est impliquée dans la morphogenèse et la motilité cellulaire. Cette protéine est en équilibre dynamique entre le cytosol, où elle est dans une conformation dormante (fermée) et la membrane, lorsqu'elle est activée (conformation ouverte). Ce processus d'activation, très dynamique, requiert son interaction avec un lipide spécifique, le phosphatidylinositol-4,5-bisphophate (PIP2) et/ou des phosphorylations à des sites spécifiques. L'ezrine associée à la membrane interagit alors avec l'actine du cytosquelette. La plupart de ces observations sont issues d'études in cellulo et les mécanismes moléculaires à l'origine de ces effets biologiques doivent être maintenant élucidés par des expériences biochimiques. Les études destinées à élucider les relations structure/fonction des protéines ERM in vitro avec des membranes n'ont commencé à apparaître que très récemment avec les études de Takeda et al. sur des vésicules géantes (GUVs) (J Mol Biol 2006), de Steinem et al sur des bicouches lipidiques supportées (SLBs) (Biochemistry 2006), puis celles de notre groupe sur des grandes vésicules (LUVs) (Blin et al., Biophys J 2008) et sur des GUVs (Carvalho et al., Biophys J, manuscript révisé envoyé le 19/02/08). De plus, la structure de la moésine entière a été déterminée l'an passé (Tesmer et al., J Mol Biol 2007). Ces premières études doivent être poursuivies. Notre but est donc d'étudier in vitro les relations entre le PIP2, l'ezrine et l'actine dans des systèmes biomimétiques afin de mieux comprendre les processus moléculaires sous-jacents. Ces constituants purifiés seront ajoutés étape par étape. L'originalité de ce projet réside en trois principaux aspects : 1) L'ancrage d'une protéine clef entre l'actine du cytosquelette et la membrane plasmique via PIP2. En utilisant l'ezrine entière, un mutant phosphomimétique et des domaines individuels de la molécule, nous étudierons leurs rôles respectifs quant aux interactions soit avec la membrane via le PIP2 soit avec l'actine. In vivo, l'interaction avec le PIP2 et la phosphorylation de certains résidus sont cruciaux pour établir les propriétés fonctionnelles de l'ezrine. Dans les protéines ERM, un site de liaison à l'actine localisé dans le domaine C-terminal a été identifié et est reconnu par la communauté scientifique. La présence d'un second site cryptique dans le domaine N-terminal, identifié par délétions successives, pourrait être à l'origine d'une faible activité de nucléation. De même, les filaments de F-actine déjà polymérisés pourraient être stabilisés par l'ezrine, via des interactions ezrine/actine le long du filament d'actine. 2) L'investigation des interactions entre des lipides spécifiques et des protéines par des méthodes biophysiques et biochimiques sur différents types d'objets biomimétiques complémentaires. Ainsi, des billes calibrées et couvertes d'ezrine, ou des systèmes biomimétiques divers contenant du PIP2 (vésicules multilamellaires, LUVs, GUVs ou bicouches lipidiques supportées), seront mis à profit pour répondre à des questions spécifiques. De plus, des expériences avec de l'actine pyrène (réalisée par spectrofluorimétrie) seront utilisées pour décortiquer les effets de l'ezrine sur la polymérisation de l'actine, son élongation et/ou sa dépolymérisation. 3) La compréhension du couplage entre la courbure membranaire et les hétérogénéités latérales de composition membranaire (s'il y en a), l'activation de l'ezrine et la polymérisation de l'actine. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons des objets biomimétiques