Projet ANR-11-BS07-0012 – MIAM CoCoNuts : Modulation de l'interaction protéines/acides nucléiques, cas de l'intégrase, par des nucléotides à conformation contrainte
Programme : Blanc - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur jean-marc escudier (UNIVERSITE TOULOUSE III [PAUL SABATIER])
Partenaires : Imagerie et Stratégies Thérapeutiques des Pathologies Cérébrales et Tumorales; Synthèse et Physico-Chimie de Molécules d'Intérêt Biologique
Montant : 429928.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : MIAMCoCoNutsNous cherchons à faire la preuve du concept que le gain entropique apporté par une contrainte conformationelle au niveau de petites unités  nucléotidiques d’acides nucléiques peut être transposé avec bénéfice à la formation du complexe de la structure nucléique préorganisée avec la protéine et permettre une étude approfondie du mode d’action.
Analogues structuraux et complexe ADN/intégrasePeut-on intervenir sur la capacité de protéines à reconnaître leur partenaire ADN en imposant une structure initiale à ce dernier correspondant à celle qu’il doit adopter dans le complexe final ? La pré-organisation structurale du substrat peut-elle conduire à une nouvelle classe d’inhibiteurs ou bien permettre d’élaborer une stratégie nouvelle pour moduler l’action de protéines ?
Synthèse et cristallographieLe projet nécessite un gros travail de synthèse organique pour préparer les unités à géométrie contrainte qui seront ensuite incorporées à des positions stratégiques sur le brin d’acide nucléique pour imposer une rigidification de la structure ou une déformation définie de la structure. La construction des nucléotides contraints s’effectue par des méthodes de synthèses organiques multiétapes pour installer la modification chimique nécessaire au contrôle de la géométrie du squelette sucre/phosphate. Les brins d’ADN modifiés sont alors préparés grâce à un synthétiseur automatique qui permet de contrôler la position de la contrainte dans la séquence. Le deuxième composant de la méthodologie concerne les mesures de fixation de la protéine à son substrat, et la coupure du substrat par l’enzyme si son activité est amélioré ou diminué. Enfin, on procédera à la détermination de la structure tridimensionnelle du complexe entre la protéine et l’ADN par cristallographie aux rayons-X.
Résumé de la soumission : Des unités structurales dinucléotidiques dans lesquelles les paramètres géométriques du squelette sucre/phosphate des acides nucléiques peuvent être contrôlés et bloqués à des valeurs canoniques ou non de celles observées dans une structure de type double hélice peuvent être synthétisées sous forme de dinucléotides à conformation contrainte par introduction d'un cycle à six chaînons de type dioxaphosphorinane ou phostone (D- ou P-CNA: Dioxaphosphorinane- ou Phostone- Constrained Nucleic Acids). Cette contrainte sur chaque jeu d'angle de torsion du squelette sucre/phosphate apporté à des postions prédéfinies permet d'obtenir une boite à outil de seize unités structurantes différentes en s'affranchissant de la nature des bases et de leur enchaînement. Nous disposons déjà par exemple des dimères diastéréisomères de thymidine contraints sur les angles de torsion alpha et béta pour lesquels nous avons montré qu'ils pouvaient se comporter comme de très bon mime de la structure hélicale de type B ou bien préorganiser la région non appariée de structure en épingle à cheveux. Dans ce cadre, la partie chimie du projet vise à la préparation de tous les combinaisons en bases des dinucléotides existant, de produire une famille importante en série 2'-désoxyribo (ou ribo) contrainte sur les angles de torsion epsilon et dzêta qui eux aussi peuvent adopter des valeurs canoniques ou non, et enfin d'étudier la préorganisation induite par ces structures lors de l'incorporation de ces unités dans des fragments d'ADN. Le concept est dans ce cas d'essayer de transposer le bénéfice entropique obtenu par le chimiste lors de la synthèse de dinuclèotides "pré-structurés" à la modulation de la formation et de l'activité de complexes supramoléculaires entre ADN et protéines connus pour avoir de fortes déformation des chaînes nucléotidiques.La jonction "Holliday" est une structure d'ADN contraint clef qui existe naturellement avec quatre branches double-brin connectée à un centre géométrique. Cette architecture qui est cruciale pour la recombinaison homologue de l'ADN et sa réparation est un modèle biologique idéal pour démontrer le potentiel des CNAs à moduler l'activité protéique. Le complexe intégron/intégrase produit cette structure puis attends la machinerie de réplication pour la résoudre en produits recombinés. Nous projetons de suivre l'impact de la contrainte géométrique apportés par des modules dinucléotidique CNAs en position centrale de la région de recombinaison (cross-over) sur l'activité recombinase par des approches biochimiques et cristallographique aux rayons X. Ce travail serra la première investigation sur la reconnaissance d'état pré-transitoire et leur réaction avec les enzymes du système de recombinaison.
Résultats : Au niveau de la synthèse des éléments contraints, les CNAs, même si nous avons dû nous résoudre à abandonner la préparation des CNAs contraints sur les angles e et ?, nous avons pu réaliser l’essentiel du programme sur la famille a, ß et a,ß , gamma-CNA en développant des analogues soufrés et séléniés particulièrement intéressants pour augmenter la stabilité des ODNs et surtout susceptibles de faciliter les études cristallographiques. Ces derniers n’ont pu être incorporés dans des ODNs à cause d’un comportement inattendu du sélénium mais, bien que hors délais, la chimie des H-phosphonates devrait être une solution pour préparer des ODN contraints et « marqués » au sélénium. De plus, les développements méthodologiques originaux permettent de préparer des P-CNA et C2NA, éléments très prometteurs dans l’élaboration d’ODN à conformation contrôlés. 
Les jonctions quatre voies contraintes ont pu être préparées et complexées avec les protéines démontrant que les CNAs sont des outils qui ne perturbent pas fondamentalement le comportement du substrat HJ en fixation, mais permettent de bloquer la réaction de coupure par le choix de l’isomère qui est utilisé. En revanche, la détermination structurale s’est trouvée confrontée au problème très classique de l’obtention d’un cristal du complexe Int-HJ contraint, et dans le cas du non-contraint d’obtenir une résolution suffisante pour avoir une information pertinente sur les contacts protéine/ADN. Le complexe non-contraint/ intégrase a permis, cependant, d’avoir une idée globale du complexe par microscopie électronique, et en solution. Toutefois, les efforts déployés en utilisant une large panoplie de techniques pour obtenir des informations structurales permettent d’affiner notre connaissance de ces complexes.
Perspectives : En l’état actuel d’avancement du projet, les perspectives sont celles envisagées dans le programme c’est-à-dire la détermination de la capacité de l’enzyme à reconnaître un substrat dans un état conformationnel figé et grâce à une étude cristallographique de cet état transitoire concevoir des inhibiteurs de cette enzyme.
Publications et brevets : 1. Dioxaphosphorinane- Constrained nucleic acid Dinucleotides as tools for Sructural Tuning of Nucleic acids by D. A. Catana, B-L. Renard, M. Maturano, C. Payrastre, N. Tarrat, J.-M. Escudier, J. Nucleic Acids, 2012, 2012, 1-17.
2. Differential Effects on Allele Selective Silencing of Mutant Huntingtin By Two Stereoisomers of a,ß-Constrained Nucleic Acid. M. Østergaard, B. Gerland, J-M Escudier, E. E. Swayze, P. P. Seth ACS Chem Biol. 2014, 9, 1975-1979. 
3. Stabilization of hairpins and bulged secondary structures of nucleic acids by single incorporation of a,ß-D-CNA featuring a gauche(+) alpha torsional angle, B. Gerland, P. Millard, C. Dupouy, B.L. Renard and J.-M. Escudier, RSC Advances, 2014, 4(90), 48821-48826.