Projet ANR-10-BLAN-1518 – MIT-2M : Mécanismes moléculaires de transport dans les mitochondries
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Eva PEBAY-PEYROULA (UNIVERSITE GRENOBLE I [Joseph Fourier])
Partenaires : Laboratoire Structure et Réactivité des Systèmes Moléculaires Complexes; Laboratoire de Biologie Physico-Chimique des Protéines Membranaires; Institut de Biologie et de Technologies de Saclay; Institut de Biologie Structurale
Montant : 719986.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Mécanismes moléculaires de transport dans les mitochondriesLes mitochondries sont des organites responsables de la production de l’ATP, véritable fuel de la cellule. Plusieurs cycles métaboliques se déroulent dans ce compartiment cellulaire. Pour fonctionner un ensemble de métabolites ou de petites molécules doivent transiter entre la matrice mitochondriale et le cytoplasme. Le projet vise à comprendre les mécanismes de transport au niveau moléculaire, plus spécifiquement de protéines membranaires essentielles, les transporteurs mitochondriaux.
Structures et mécanismes de transport de trois transporteurs mitochondriauxLa première structure d’AAC résolue par un des partenaires du projet en 2003, reste toujours la seule structure connue à haute résolution. Cette structure a apporté le premier éclairage sur les transporteurs mitochondriaux. Elle montre le repliement général et le mécanisme d’inhibition des atractylosides, connus pour être des poisons violents. Elle permet également d’émettre des premières hypothèses sur le mécanisme de liaison du substrat. Des nouvelles informations sont venues des simulations de dynamique moléculaire basée sur la structure (collaboration entre deux partenaires de ce réseau). Une première étude a pu montrer l’influence de certains paramètres externes sur la liaison du substrat, illustrant ainsi la force de l’approche couplée entre théorie et expériences. UCP1 et UCP2, également membres de la même famille de transporteurs, sont étudiés par un des partenaires depuis plusieurs années. La compréhension complète du mécanisme de transport nécessitera la connaissance de plusieurs conformations adoptées par les transporteurs en action. Les caractérisations fonctionnelles de mutants ou l’effet de différents ligands sur le transport permettront de progresser vers les études structurales d’autres conformations et de compléter les données des dynamiques moléculaires.
Production, caractérisation et structures de trois transporteurs mitochondriauxLes études structurales de protéines membranaires restent encore un défi. Pour le relever, nous combinons expérience et théorie, en couplant des approches fonctionnelles, des informations structurales et des simulations de dynamique moléculaire. La première étape consiste à réussir la production de ces protéines en quantité suffisante, à identifier les conditions permettant leur stabilisation dans une conformation native, pour pouvoir ainsi aborder la cristallisation de ces protéines en vue d’études structurales. Ainsi, plusieurs systèmes d’expression seront utilisés, E. coli (deux partenaires ont déjà des résultats préliminaires avec des protéines de fusion dans les membranes), et S. cerevisiae (un des partenaires a adapté un vecteur spécial et produit Serca1a Ca2+-ATPase une autre protéine membranaire eucaryote avec ce vecteur). La conception de nouveaux ligands et de mutants optimisant la production de protéines stables sera facilitée par des approches théoriques. Cette première étape permettra d’aborder la partie centrale du projet qui vise à relier structures, caractérisations fonctionnelles et simulations de dynamique moléculaire afin de comprendre la spécificité et les mécanismes permettant le transport. Cette partie se fera en utilisant la structure déjà connue comme modèle de départ, et en établissant des expériences permettant de mesurer les activités de transport. Plusieurs mutants pourront ainsi être étudiés, de même l’effet de ligands sera suivi. La dernière étape ouvrira la voie vers la cristallisation par des approches classiques et nouvelles en phases de lipides afin d’obtenir des informations structurales supplémentaires intéressantes.
Résumé de la soumission : Le projet vise à comprendre les mécanismes d’action au niveau moléculaire de protéines membranaires essentielles, les transporteurs mitochondriaux. Ces transporteurs jouent un rôle crucial dans l’import et l’export très spécifiques de substrats ou produits de toutes les réactions métaboliques qui se déroulent dans les mitochondries. Le projet sera focalisé sur 3  transporteurs humains, le transporteur ADP/ATP (AAC), et les protéines découplantes (UCP1, UCP2). Les études structurales de protéines membranaires restent encore un défi. Afin d’optimiser le projet, nous proposons une stratégie qui combine expérience et théorie. Ainsi, nous couplerons approches fonctionnelles, informations structurales et simulations de dynamique moléculaire. Nous devrons également surpasser plusieurs difficultés notoires liées à la chimie des protéines membranaires, la production en grande quantité, la stabilisation dans une conformation native et la cristallisation.AAC, qui importe l’ADP depuis le cytosol et exporte l’ATP après synthèse dans la matrice mitochondriale à partir d’ADP et de phosphate inorganique est le membre le plus connu de la famille des MCF. Bien que tous les transporteurs MCF soient essentiels dans de nombreuses voies métaboliques, peu d’équipes s’intéressent aux études structurales. Cette faible implication traduit surtout la difficulté de ces études plutôt que le manque d’intérêt. La première structure d’AAC résolue par le partenaire 1 en 2003, reste toujours la seule structure connue à haute résolution. Cette structure a apporté le premier éclairage sur les transporteurs MCF. Elle montre le repliement général et le mécanisme d’inhibition des atractylosides, connus pour être des poisons violents. Elle permet également des premières hypothèses sur le mécanisme de liaison du substrat. Des nouvelles informations sont venues des simulations de dynamique moléculaire basée sur la structure (partenaire 2 en collaboration avec partenaire 1 et autres). En particulier, P2 et P1 ont pu montrer l’influence de certains paramètres externes sur la liaison du substrat, illustrant ainsi la force de l’approche couplée entre théorie et expériences.UCP1 et UCP2, également membres de la famille MCF, sont étudiés par le partenaire 2 depuis plusieurs années. Les séquences contiennent la triplication des motifs MCF et les protéines ont donc très probablement le même repliement que AAC. Néanmoins, les substrats transportés sont très différents : nucléotide à adénine pour AAC et proton pour UCP. Une étude structure/fonction comparative entre AAC et UCP à l’échelle atomique portera des informations importantes pour la compréhension des mécanismes de transport et leur spécificité.	Le projet est divisé en 3 tâches et plusieurs sous-tâches. La plupart des sous-tâches implique plus de 2 partenaires. La tâche 1 focalisera sur la production des transporteurs par deux systèmes d’expression, E. coli (P1 et P3 ont déjà des résultats préliminaires avec des protéines de fusion dans les membranes), et S. cerevisiae ( P4 a adapté un vecteur spécial et produit Serca1a Ca2+-ATPase une autre protéine membranaire eucaryote). La conception de nouveaux ligands et de mutants facilitant la production de protéines stables sera facilitée par des approches théoriques. La tâche 1 permettra de produire les protéines pour les tâches 2 et 3. La tâche 2 est la partie centrale du projet car elle concerne le lien entre structure/dynamique et fonction reliant structures, caractérisations fonctionnelles et simulations de dynamique moléculaire afin de comprendre la spécificité et les mécanismes permettant le transport. La tâche 3 ouvrira la voie vers la cristallisation par des approches classiques et nouvelles en phases de lipides afin d’obtenir des informations structurales supplémentaires intéressantes pour la tâche 2.
Résultats : Les méthodes mises en place pour étudier les caractéristiques de transport d’AAC1 ainsi que les simulations numériques permettant de suivre l’entrée de l’ADP dans la cavité et sa liaison, ont conduit à comprendre le lien entre transport à l’échelle moléculaire, propriétés dynamiques du transporteur et gravité des maladies associées à six mutations pathologiques. Ces résultats ont été acceptés pour publication dans ACS Chemical Biology (Ravaud et al. 2102) et feront l’objet de la page de couverture.
Les protocoles d’expression pour tous les systèmes envisagés ont été mis en place et sont opératoires. Les protocoles de purification sont également en place et seront encore affinés pour certains. Deux protocoles de mesure de transport d’activité ont été mis en place, dont un basé sur des mesures de courant électrique induit par le transport. Les premières simulations sur AAC en présence de nucléotides différents des nucléotides, i.e., GMP, GDP et GTP, ont été faites. Les premières analyses ne sont pas encore suffisantes pour comprendre la spécificité d’AAC pour les nucléotides à adénine. Des expériences de transport basées sur l’import d’ATP radiomarqué par des cellules E.coli exprimant AAC ont permis de montrer que GDP et GTP ne sont pas transportés et AMP partiellement (manuscrit soumis).
Perspectives : La production en quantité plus grande a débuté pour AAC1 exprimé en protéine de fusion dans E. coli et pour AAC1 exprimé en levure. Le scale-up des autres protocoles et pour les autres protéines suivra prochainement. Les nouveaux fermenteurs ont été installés et pourront permettre notamment dans les 18 prochains mois le test de l’expression de divers mutants. Des premiers essais de cristallisation d’AAC1 exprimé dans E.coli et dans S. cerevisiae ont été mis en place and vont être fortement amplifiés.
Publications et brevets : 1.	« Mutations of the mitochondrial ADP/ATP carrier causing genetic diseases impair the transport of nucleotides » S. Ravaud, A. Bidon-Chanal, I. Blesneac, P. Machillot, C. Juillan-Binard, F. Dehez, C. Chipot, E. Pebay-Peyroula (2012) ACS Chem Bio, in press
2.	« Production of UCP1 a membrane protein from the inner mitochondrial membrane using the cell free expression system in the presence of a fluorinated surfactant » I. Blesneac, S. Ravaud, C. Juillan-Binard, L.-A. Barret, M. Zoonens, A. Polidori, B. Miroux, B. Pucci, E. Pebay-Peyroula (2012) BBA Biomembranes 1818, 798-805.