Projet ANR-12-BSV5-0021 – FORCELL : Influence de la force de l'interaction substrat-ligand sur l'adhésion cellulaire.
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame Liliane GUERENTE (Département de Chimie Moléculaire-Université Joseph Fourier)
Partenaires : Département de Chimie Moléculaire; Biomatériaux et Ingenerie Tissulaire; Institut Charles Sadron; Laboratoire de Chimie Physique et Microbiologie pour l'Environnement
Montant : 449999.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : Nouvelle approche permettant d’évaluer les forces exercées par les cellules pour sonder les propriétés mécaniques de leur substrat d’adhésion.Par quel mécanisme la cellule perçoit-elle la rigidité de son substrat d’adhésion ? Notre contribution est de proposer un modèle chimique pour comprendre comment lors de la formation de la liaison récepteur-ligand, une cellule déposée sur un substrat peut sonder son environnement.
Mise en évidence du rôle de la liaison récepteur-ligand dans le transfert de l’information entre une cellule et son substrat d’adhésionL’ingénierie tissulaire est un domaine pluridisciplinaire émergent impliquant notamment la biologie et la science des matériaux. L’ingénierie tissulaire a pour but d’élaborer des tissus artificiels en utilisant des cellules et des matrices supports à l’adhésion. Ces substituts de tissus sont conçus en incorporant des cellules dans des matrices synthétiques ou en ensemençant un matériau support assurant un environnement favorable à la fonction cellulaire. Comprendre comment une cellule sonde son environnement et en particulier comment l’information sur les propriétés mécaniques du matériau d’adhésion cellulaire transite entre sa surface et la cellule, présente également un intérêt dans le développement de l’ingénierie tissulaire. L’acquisition de ces connaissances représente un enjeu majeur pour la santé publique mais permettrait également d’envisager le développement de nouveaux types d’implants.Nous proposons de concevoir de nouveaux substrats modèles permettant de comprendre comment lors de la formation des liaisons ligand-récepteur cellulaire, une cellule déposée sur un substrat peut sonder son environnement. L’objectif du projet est d’étudier l’effet de synergie entre les propriétés mécaniques (de module d’Young variable) et les interactions non-covalentes des liaisons ligands-substrat sur le mécanisme d’adhésion cellulaire et du devenir cellulaire.
Conception de substrats modèle de rigidité variable permettant d’évaluer l’influence de la rigidité du substrat sur les interactions ligand-récepteur.Nous proposons de concevoir de nouveaux substrats modèles de rigidité variable décorés de ligands d’adhésion. Ces ligands, des séquences peptidiques (Arginine-Glycine-Acide aspartique) seront fixés au substrat par des liaisons de force modulable (liaisons covalentes et non-covalentes). L’objectif est d’étudier l’effet de synergie entre les propriétés mécaniques (de module d’Young variable) et les forces d’interactions non-covalentes des liaisons ligands-substrat sur le mécanisme d’adhésion cellulaire et le devenir cellulaire. Le choix des interactions non-covalentes s’est porté sur les interactions hôte-invité entre la beta-cyclodextrine et des molécules invitées hydrophobes comme le ferrocène et l’adamantane. La stabilité des complexes d’inclusion est fonction de la nature de la molécule invitée et de la valence de l’interaction. Une série de molécules multivalentes susceptibles d’interagir avec les beta-cyclodextrine fixées sur des substrats de rigidité variable sera synthétisée. Les substrats de rigidité contrôlée seront mis en œuvre, il s’agira de concevoir des matrices polymère dont les propriétés mécaniques seront bien caractérisées.Les forces d’interaction entre les molécules multivalentes invitées et les substrats fonctionnalisées par la molécule hôte ?-cyclodextrine seront mesurées par spectroscopie de force (AFM). Nous étudierons le processus d’adhésion cellulaire sur les substrats de rigidité variable. Nous essaierons en particulier de comprendre si les cellules déposées sur un substrat rigide recouvert de ligands liés de façon non-covalente se comportent de la même manière que celles déposées sur un substrat mou avec des ligands fixés de façon covalente. Cette étude apportera des informations quantitatives sur les forces exercées par les cellules pour sonder la rigidité de leur support d’adhésion. Notre projet devrait conduire au développement d’une nouvelle famille de substrats parfaitement caractérisés pour des applications en ingénierie tissulaire.
Résumé de la soumission : L’ingénierie tissulaire est un domaine pluridisciplinaire émergent impliquant notamment la biologie et la science des matériaux. L’ingénierie tissulaire a pour but d’élaborer des tissus artificiels en utilisant des cellules et des matrices supports à l’adhésion. Ces substituts de tissus sont conçus en incorporant des cellules dans des matrices synthétiques ou en ensemençant un matériau support assurant un environnement favorable à la fonction cellulaire. La conception de tels supports pour l’élaboration de tissus artificiels requiert une connaissance précise de la réponse et du devenir des cellules consécutifs à leur interaction avec leur environnement. En effet, les propriétés chimiques mais aussi les propriétés mécaniques du substrat d’adhésion ou plus généralement du matériau environnant semblent jouer un rôle central. Le devenir des cellules dépend en effet des conditions d’ancrage à leur environnement. Jusqu’à présent les études ont porté sur des matériaux interagissant avec les cellules par un mécanisme non-spécifique ou par le biais d’interactions ligand-récepteur où les ligands étaient liés de façon covalente à la matrice d’adhésion. Dans ce projet, nous proposons de concevoir de nouveaux substrats où les ligands d’adhésion cellulaire seront greffés au substrat par des liaisons non-covalentes (interactions multivalentes hôte-invité). En agissant sur la multivalence (le nombre de liaisons) et sur la nature des molécules invitées, les forces d’interaction de ces ligands avec le substrat d’adhésion seront modulées. La rigidité du matériau, support sous-jacent au tissu cellulaire, constituera également une variable. Nous utiliserons ce système modèle pour étudier l’influence de la rigidité des substrats sur la force de l’interaction hôte-invité, un problème central dans la compréhension du devenir cellulaire des cellules adhérentes. Ce système modèle permettra également la comparaison des mécanismes d’adhésion et du devenir des cellules souches mésenchymateuses sur des substrats où les ligands sont fixés de façon non-covalente. Les cellules vont-elles sonder de la même manière des substrats rigides sur lesquels les ligands sont fixés par des liaisons faibles (liaisons non-covalentes hôte-invité) et des substrats mous sur lesquels les ligands sont fixés par des interactions fortes (liaisons covalentes)? Répondre à cette question permettrait d’obtenir des informations quantitatives sur la manière dont la cellule perçoit la rigidité d’un substrat ce qui permettrait de comprendre davantage les mécanismes d’adhésion cellulaire. Finalement ces systèmes constituent la base d’une nouvelle famille de substrats modulables et parfaitement caractérisés pour la culture cellulaire et l’ingénierie tissulaire.
Résultats : Sur cette première période le développement des substrats d’adhésion s’est déroulé selon 2 axes:
-	Mise au point d’une plateforme rigide fonctionnalisée par la beta-cyclodextrine qui consiste en une monocouche autoassemblée d’alcanethiols. 
-	Conception d’hydrogels de polymère de rigidité variable et modifiables en surface. Plusieurs stratégies ont été menées en parallèle. Le projet prévoyait initialement l’utilisation de gels d’agarose, mais la présence de pores était rédhibitoire pour les tests cellulaires.  Deux stratégies alternatives sont en cours de validation. La première concerne les films multicouches réticulés de polymère (poly-L-lysine /Acide Hyaluronique) et la seconde approche concerne les films de polyacrylamide.
Parallèlement à ces travaux,  une série de molécules multivalentes a été synthétisées. Leur architecture se base sur la technologie du châssis moléculaire cyclodécapeptidique dont les 2 faces d’adressage sont fonctionnalisées par des molécules de nature différentes et en nombre variable permettant d’adapter la valence en molécules invitées.  Des châssis décorés de molécules  invitées ou de ligands d’adhésion ou encore des molécules bi-fonctionnelles ont ainsi été synthétisées. La caractérisation des interactions hôte-invité de ces molécules sur les substrats rigides fonctionnalisés par les molécules hôte a débuté.
Les mesures par spectroscopie de force des interactions entre les molécules invitées greffées sur la sonde AFM et les beta-cyclodextrine des surfaces rigides ont été réalisées avec succès. Un article concernant le comportement multivalent est actuellement en préparation. 
Les propriétés mécaniques des hydrogels de polymère ont été caractérisées. Leur fonctionnalisation par des ligands peptidiques ou par beta-cyclodextrine est en cours.
Les tests cellulaires réalisés avec les fibroblastes 3T3 ont débuté sur ces derniers substrats. Ces tests permettront de valider la fonctionnalisation par les ligands d’adhésion.
Perspectives : La compréhension des voies de communications entre les cellules d’un organisme et son environnement permettrait la conception d’une nouvelle famille de substrat d’adhésion ce qui constituerait une avancée importante dans le domaine de l‘ingénierie tissulaire.
Publications et brevets : La valorisation des premiers travaux de synthèse et des résultats en spectroscopie de force dynamique est en cours de rédaction.