Projet ANR-10-BLAN-1528 – PHENOWALL : Complexité du métabolisme phénolique chez les végétaux : exploration de nouvelles voies de biosynthèse des précurseurs de la paroi cellulaire
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Danièle WERCK-REICHHART (CNRS - DELEGATION REGIONALE ALSACE)
Partenaires : Institut de Biologie Moléculaire des Plantes; Systèmes Membranaires, Photobiologie, Stress et Détoxication; Institut Jean-Pierre Bourgin; Université de Strasbourg
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : Nouveaux outils pour améliorer la production des biocarburantsLa lignine est un obstacle à la production de biocarburants et du papier, ainsi qu’à la bonne  digestibilité des fourrages. Une amélioration des cultures pour modifier la qualité ou les quantités de lignine nécessite une bonne compréhension de sa voie de biosynthèse.
Fonctions respectives des cytochromes P450 du métabolisme phénolique chez les graminéesLes cytochromes P450 catalysent les étapes limitantes et irréversibles du métabolisme phénolique (étapes d’oxydation). Certains d’entre eux se sont dupliqués au cours de l’évolution précoce des plantes à graines et des monocotylédones (céréales, graminées). Ces duplications ont été conservées chez la plupart des espèces végétales. Notre objectif est de déterminer les bases fonctionnelles de ces duplications afin d’être en mesure d’optimiser les flux vers la biosynthèse des phénols solubles (antioxydants) et des différents monolignols (monomères composant le polymère de la lignine) pour en optimiser la composition et la digestibilité. Le modèle végétal utilisé pour ce projet est Brachypodium distachyon, la plante modèle pour les graminées tempérées, pour laquelle des outils génétiques ont été mis en place et sont toujours en cours de développement. Les résultats obtenus génèrent des outils pour améliorer la composition de la graine pour des applications alimentaires, ainsi que pour optimiser la composition de la lignine pour la production de biocarburants, de pâtes à papier, ou pour améliorer la digestibilité des fourrages.
Analyse fonctionnelle des P450s impliqués dans le métabolisme phénolique et des monolignolsLes enzymes cibles ont été exprimées dans des microorganismes afin d’en préciser les fonctions spécifiques. Les profils d’expression dans la plante ont été déterminés. Le rôle de chacun dans la plante a été étudié à l’aide de mutants de sous- ou de surexpression analysés pour leur phénotype développemental et leur composition en lignine et phénols solubles. Ce travail a été permis par le récent développement de collections de mutants (IJPB, USDA).
Résumé de la soumission : The plant phenolic metabolism converts phenylalanine into building blocks of cell-wall biopolymers (lignin, suberin, sporopollenin, cross-linkers) and into a large diversity of abundant soluble compounds (phenolic esters, phenolamides, flavonoids, coumarins, etc) with antioxydant or organoleptic properties. The pathways leading to phenolic compounds are still not completely understood despite their economical importance and extensive genetic engineering recently undertaken for improving biomass saccharification, paper production or nutritional qualities of the plants. In fact, biochemical analysis of genetically engineered plants suggests that some branches in the pathway have been overlooked so far. The aim of PHENOWALL is to reveal some of these branch pathways, using as reporters the cytochrome P450 hydroxylases of the phenolic ring.The CYP73 and CYP98 families of P450 enzymes have been reported to catalyze the 4- and 3-hydroxylations of the phenolic rings. CYP73s accept free cinnamic acid as a substrate. Recent data suggest that CYP98s catalyze meta-hydroxylation of a range of hydroxycinnamic esters and amides, some with broad specificity, while others narrowed their substrate selectivity. Phylogenetic reconstructions indicate a major and early duplication in each gene family both in monocots and dicots, prior to their divergence in the case of CYP73s. Early divergences are indicative of the acquisition of specific functions, most likely in different branches of the phenolic pathway. We thus propose to investigate the specific biochemical and biological functions of the CYP73 and CYP98 paralogues using in parallel screening of recombinant enzyme catalytic activities and functional analysis using the grass Brachypodium distachyon as a model. Brachypodium is a close relative of the temperate grass crops such as wheat and barley, and a good model for second generation biofuel crops. Its stature and generation time are compatible with lab work. This plant is now the focus of international efforts to establish it as a genetic model, including sequencing and mutant collections. Our workplan includes the annotation and phylogeny of the CYP73 and CYP98 genes in the Brachypodium genome for identification of the members of each clan. Relevant candidates will then be extensively characterized for catalytic activity of the recombinant enzymes expressed in yeast. This work will be supported by the synthesis of a broad set of candidate substrates representative of the phenolic derivatives present in the plant and by homology modeling of the proteins for prediction of the active site divergence and docking of the hit compounds. In parallel, functional characterization will be carried out by 1) a detailed description of the expression patterns of the different paralogues via transcriptomics, q-PCR and promoter::GUS constructs visualization, 2) isolation of a set of TILLING mutants for each candidate and full analysis of gene impact on plant fertility and development, biopolymers and soluble phenolic composition.This work will be carried out by a multidisciplinary consortium assembling competencies in enzymology and functional genomic of cytochromes P450, Brachypodium genetics and lignin/cell-wall analysis, synthetic chemistry, bioinformatics and structural biology in order to provide an extensive picture of the phylogeny/expression/structure/function (catalytic and biological) relationship of the different CYP73 and CYP98 hydroxylases. This investigation should reveal additional complexity in the phenolic metabolism with potential applications in plant improvement for biofuel and paper production, and nutritional and organoleptic value. It should provide novel routes to obtain building blocks for natural and artificial polymers.
Résultats : Les résultats de PHENOWALL démontrent que les duplications de la seconde enzyme du métabolisme phénolique au cours de l’évolution ont conduit à une diversification de fonction sans modification de l’activité enzymatique principale: l’hydroxylation de l’acide cinnamique est effectuée avec des efficacités comparables par les différentes duplicats (paralogues) en dépit de différences significatives dans la structure de leurs sites actifs. La localisation subcellulaire des différents paralogues exprimés en système hétérologue (cellules épidermiques de feuille) semble être la même (les membranes du réticulum endoplasmique), bien que nos résultats indiquent des modes d’ancrage différents modifiant leur topologie membranaire. De plus, nos résultats indiquent une glycosylation potentielle de l’un des paralogues. L’analyse de leurs profils d’expression au cours du développement de la plante montre que certains d’entre eux ont des fonctions plus spécifiquement racinaires, liées à la reproduction, ou associées à certains types cellulaires. L’analyse des mutants de sous- ou de surexpression est en cours. Les résultats préliminaires disponibles jusqu’ici indiquent soit un impact modéré de la suppression individuelle ou de la surexpression de nos gènes cibles sur le développement ou la composition en lignine, soit une totale abolition de la viabilité de la plante. La production de doubles mutants est en cours pour révéler des redondances fonctionnelles. L’analyse de mutants effectuée au cours de ce travail a cependant permis de révéler la fonction d’autres gènes dans la lignification.
PHENOWALL a permis d’amorcer diverses collaborations des partenaires avec le Canada (projet Working On Wood), la Belgique, l’Allemagne et les USA.
Nouveaux projets initiés sur les bases de PHENOWALL :
-	Projet METABEVO
-	Projet PEACH
-	Projet BRAVO.
Perspectives : Le projet PHENOWALL identifiera des marqueurs pour modifier la composition phénolique et la réticulation de la lignine et ainsi améliorer la production de biocarburants à partir des résidus de récolte, ainsi que la digestibilité des fourrages. Il va aussi révéler des moyens d’optimiser la composition phénolique des fleurs et des graines/fruits. Les résultats préliminaires laissent également présager un impact sur le développement de la plante, les dates de floraison, et la fertilité. Ces autres aspects permettent d’envisager diverses applications, mais restent cependant à valider.
Publications et brevets : Annotation complète des gènes de cytochromes P450 chez Brachypodium et remise en contexte : Nelson D, Werck-Reichhart D. (2011)  A P450-centric view of plant evolution. Plant J. 66:194-211.
Nouvelles approches pour l’analyse des interactions protéine-protéine dans le métabolisme phénolique : Bassard JE, Richert L, Geerinck J, Renault H, Duval F, Ullmann P, Schmitt M, Meyer E, Mutterer J, Boerjan W, De Jaeger G, Mely Y, Goossens A, Werck-Reichhart D. (2012) Protein-Protein and Protein-Membrane Associations in the Lignin Pathway. Plant Cell 24:4465-4482.
Publication du TILLING des gènes P450 : Dalmais M, Antelme S, Ho-Yue-Kuang S, Wang Y, Darracq O, Bouvier d’Yvoire M, Cézard L, Légée F, Blondet E, Oria N, Troadec C, Brunaud V, Jouanin L, Höfte H, Bendahmane A, Lapierre C, Sibout R (2013). A TILLING Platform for Functional Genomics in Brachypodium distachyon. Plos One. 8: e65503.
Découverte du premier mutant chez une graminée n’ayant plus de fonction p-coumaryl monolignol transferase : Petrik DL, Karlen SD, Cass CL, Padmakshan D, Lu F, Liu S, Le Bris P, Antelme S, Santoro N, Wilkerson CG, Sibout R, Lapierre C, Ralph J, Sedbrook JC (2014). p-Coumaroyl-CoA:monolignol transferase (PMT) acts specifically in the lignin biosynthetic pathway in Brachypodium distachyon. Plant J. 77:713-26.