Projet ANR-10-BLAN-1230 – PARP-3 : Caractérisation de la PARP-3 dans la stabilité du génome et la plasticité épithéliale.
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Françoise DANTZER (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ALSACE)
Partenaires : Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; Centre national de la recherche scientifique; Institut de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire
Montant : 458240.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Caractérisation de PARP-3 dans l’intégrité du génome et la plasticité épithélialeNos travaux visent à déterminer l'implication de PARP-3 dans le maintien de l'intégrité du génome et établir les mécanismes moléculaires mis en jeu.
PARP-3 pourrait-elle être une nouvelle cible en thérapie du cancer ?La poly(ADP-ribosyl)ation est un mécanisme de régulation de l'activité des protéines directement impliqué dans la surveillance et le maintien de l'intégrité du génome. Cette réaction enzymatique a été découverte par Pierre Chambon dans le laboratoire Strasbourgeois de Paul Mandel il y a presque 50 ans. Très rapidement, l'intérêt thérapeutique d'inhiber cette activité s'est révélé prometteur, pour potentialiser l'effet cytotoxique ou antiprolifératif de drogues antitumorales ciblant l'ADN, en chimiothérapie ou en radiothérapie. Les Poly(ADP-Ribose) Polymérases (PARPs), enzymes qui synthétisent le Poly(ADP-ribose), forment une famille de 17 membres, dont plusieurs on été identifiés au laboratoire. Jusqu'à présent, seules deux PARPs ont été montrées comme directement impliquées dans la surveillance de l'intégrité du génome et la réparation de l'ADN: PARP-1 et PARP-2. En combinant des études biochimiques, structurales et génétiques, par le développement de souris mutantes notre laboratoire a grandement contribué à la compréhension de la fonction de PARP-1 et PARP-2 dans ces processus, ce qui a favorisé le développement d'inhibiteurs chimiques de ces enzymes et de voies stratégiques pour leur utilisation en thérapeutique. De nombreux laboratoires et sociétés pharmaceutiques sont maintenant engagés dans le développement de ces inhibiteurs de PARP pour augmenter la cytotoxicité des chimio- ou radiothérapies et en monothérapie pour cibler des cancers (sein, ovaires, prostate) portant une mutation BRCA1 ou BRCA2 (essais cliniques de phase I-III en cours). Notre laboratoire étudie depuis peu d'autres membres encore peu caractérisés dont PARP-3. Nos objectifs sont de décortiquer l’implication de cette protéine dans la surveillance de l'intégrité du génome, la prolifération cellulaire ou encore dans la plasticité cellulaire
Caractérisation de modèles animaux et cellulaires perte de fonction. Caractérisation biochimique de PARP3Pour explorer les propriétés biochimiques de la protéine, nous exprimons la protéine en grande quantité dans les cellules d’insectes, puis nous la purifions. Ses propriétés enzymatiques (synthèse de poly(ADP-ribose) sont étudiées in vitro. Les interactions protéiques sont identifiées par immunoprécipitation de la protéine à l’aide d’un anticorps spécifique puis analyse des partenaires par spectrométrie de masse. Pour évaluer les propriétés fonctionnelles de PARP-3, nous avons généré un modèle de souris perte de fonction, la protéine n’est plus exprimée et nous explorons le phénotype de ce modèle animal. Nous utilisons également des lignées cellulaires humaines dans lesquelles nous déplétons PARP-3 par la méthode du siRNA et nous exploitons les conséquences de cette déplétion sur un ensemble de processus cellulaires.
Résumé de la soumission : La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionelle de protéines médiée par les poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs). Ces enzymes utilisent le NAD+ comme substrat et catalysent la synhèse d’un polymère branché d’ADP-ribose sur un ensemble de protéines acceptrices. PARP-1, a longtemps été considérée comme la seule protéine catalysant la réaction de poly(ADP-ribosyl)ation en réponse aux dommages dans l'ADN, favorisant leur réparation.  Les inhibiteurs de PARP-1 ont rapidement prouvé leur intérêt pharmacologique, pour potentialiser l'effet antitumoral de certaines chimio- et radiothérapies (essais cliniques de phase 1 à 3 en cours). La découverte de nouveaux membres de la famille PARP, qui en contient maintenant 17, certains catalysant une réaction de mono(ADP-ribosyl)ation, souligne le potentiel de l’ADP-ribose à contrôler un nombre croissant de fonctions biologiques variées telles que la réparation de l'ADN, la régulation transcriptionnelle, la division cellulaire, la différenciation, la mort cellulaire, le transport intracellulaire,le métabolisme lipidique ou encore la tumorigenèse [1-3][7]. Il est donc d’un intérêt majeur de déterminer les propriétés enzymatiques et fonctionnelles de chacun de ces membres.  La plupart des études récentes visant à élucider la fonction du poly(ADP-ribose) se sont focalisées sur le membre fondateur, PARP-1 et sur PARP-2. Par des études biochimiques et en générant des souris déficientes en PARP-1 ou en PARP-2, notre laboratoire a révélé des fonctions à la fois redondantes et plus spécifiques de chaque enzyme dans le système de réparation par excision de bases et de cassures simple-brins (BER/SSBR) et dans la maintenance de l'intégrité de l'hétérochromatine. PARP-3, une autre PARP dépendante de l'ADN, identifiée au laboratoire, est encore très peu étudiée. Les données actuelles décrivent l’existence d’une isoforme nucléaire et d’une isoforme centrosomale et ont mis en évidence une association de PARP-3 avec des protéines de réparation de l’ADN et des protéines impliquées dans la répression transcriptionnelle [4, 5]. Nos résultats préliminaires suggèrent un rôle de la PARP-3 dans la réponse cellulaire aux dommages d’une part, et révèlent une augmentation significative de l’expression de PARP-3 lors de la transition d’un état épithélial vers un état mésenchymateux d’autre part.Dans ce projet, nous associons trois expertises dans le but d’élucider les propriétés biochimiques et fonctionnelles de PARP-3 en portant une attention particulière à sa contribution dans la stabilité du génome et la plasticité épithéliale. Par des approches in vitro, nous allons spécifier les propriétés enzymatiques de PARP-3. En générant et caractérisant des modèles animaux et cellulaires perte de fonction, nous souhaitons comprendre le rôle de PARP-3 dans la maintenance de l’intégrité du génome et la division cellulaire. Enfin, nous allons explorer un rôle nouveau de PARP-3 et de son activité enzymatique dans la transition épithélio-mésenchymateuse et l’impact sur les propriétés invasives du cancer du sein.Nous espérons que ces travaux permettront de définir si PARP-3, comme PARP-1, pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer.[1]	V. Schreiber et al.  Nat Rev Mol Cell Biol 7 (2006) 517-528.[2]	H. Kleine et al. Cell 139 (2009) 17-19.[3]	A. Hakme et al. EMBO reports 9 (2008) 1094-1100.[4]	A. Augustin et al. J Cell Sci 116 (2003) 1551-1562.[5]	M. Rouleau et al. J Cell Biochem 100 (2007) 385-401.
Résultats : Les avancées actuelles du projet toujours en cours ont permis d’identifier PARP-3 comme un nouvel acteur de la réponse cellulaires aux cassures double brin et de la progression mitotique. PARP-3 est recrutée sur les sites de cassures dans l’ADN. Son absence sensibilise les cellules humaines aux radiations ionisantes car les cassures double brin sont moins bien réparées et entraine un délai significatif dans la division mitotique. Nos travaux récents permettent maintenant de définir PARP-3 comme un acteur de la réparation des cassures par recombinaison non homologue. 
Nous avons également mis en évidence un rôle important de cette protéine dans la réparation des cassures physiologiques induites lors de la maturation lymphocytaire.
Enfin, nos données actuelles permettent de proposer un rôle de cette protéine dans la transition épithélio-mésenchymateuse.
L’ensemble de ces résultats font de cette protéine un acteur important de la tumorigénèse et permettent d’envisager son inhibition comme un bénéfice thérapeutique.
Perspectives : Nous poursuivons ce travail en décortiquant le rôle de PARP-3 dans le processus de la recombinaison non homologue. Nous étudions les conséquences de son absence dans la maturation lymphocytaire et plus particulièrement la recombinaison V(D)J, processus assurant la diversité antigénique. Nous explorons en détail l’impact de son expression dans la transition épithélio-mésenchymateuse. Enfin, nous étudions les conséquences de sa déplétion dans des lignées tumorales humaines.
Publications et brevets : Nos résultats actuels définissant PARP-3 comme un nouvel acteur de la réponse cellulaire aux cassures double-brin et de la division cellulaire (mitose) ont fait l’objet d’une publication dans PNAS (2011), Cell Cycle (2011) et d’une brève « En direct des labos » au CNRS