Projet ANR-07-MIME-0026 – VANORANA : Identication des anaérobies comme réservoir de gènes de résistance à la vancomycine. Caractérisation du mécanisme de transfert du transposon Tn1549 de type VanB.
Programme : Microbiologie, immunologie et maladies émergentes (MIME) 2007
Année de financement : 2007
Coordinateur du projet : UNIVERSITE DE PARIS XI [PARIS- SUD] (UNIVERSITE DE PARIS XI [PARIS- SUD])
Partenaires : Institut Pasteur; Université Paris-Sud
Montant : 200000.0 euros
Durée : 24 mois
Résumé : Nous avons décrit divers types de résistance à la vancomycine chez les entérocoques, un problème majeur de santé publique. Les anaérobies du tube digestif pourraient constituer un réservoir de gènes de résistance. Les types de résistance VanB et VanG ont été détectés chez Clostridium. Nous étudierons le phénotype dû au groupe de gènes apparenté à VanG dans le chromosome de C. difficile et la régulation de son expression. Tn1549, organisé en transposon conjugatif est responsable de la dissémination de la résistance de type VanB chez les entérocoques. Tn1549 a été détecté chez C. symbiosum et nous avons obtenu son transfert à Enterococcus in vitro et chez la souris. Nous déterminerons si i) cet élément est autotransférable ou mobilisable, ii) la vancomycine induit le transfert de sa propre résistance, et iii) étudierons les fonctions de transfert et de transposition. Ces études contribueront à une évaluation du rôle des anaérobies en tant que réservoir de gènes de résistance.//Le phénotype de résistance aux glycopeptides de Clostridium difficile 630 sera soigneusement réexaminé après culture avec et sans vancomycine. La transcription du locus vanG mesurée par RT-PCR en temps réel, les proportions relatives des précurseurs tardifs du peptidoglycane et les activités enzymatiques responsables de la  résistance seront quantifiées sans ou après induction par la vancomycine. Le locus vanG, délété des gènes du système de régulation à deux composantes vanRG/SG sera cloné dans un vecteur navette afin d¿évaluer l¿expression hétérologue chez Enterococcus. Le senseur et le régulateur seront purifiés et leur activité enzymatique étudiée. Le site de départ de la transcription du locus vanG sera déterminé par extension d¿amorce. Des mutants résistants de C. difficile 630 seront sélectionnés et les mutations caractérisées. Le locus vanG sera recherché par PCR chez un grand nombre de souches cliniques de C. difficile incluant des isolats du PCR-ribotype 027 virulent et épidémique. L¿aptitude de la vancomycine à augmenter le transfert de Tn1549 n¿est pas mesurable par numération des transconjugants en raison de la très faible fréquence de transfert et du manque de reproductibilité. Nous quantifierons et comparerons la transcription des gènes appartenant aux trois domaines fonctionnels, conjugaison, résistance et transposition, de Tn1549 en l¿absence et en présence de concentrations subinhibitrices de vancomycine. L¿étude du transfert inclura l¿identification de l¿origine de transfert et du domaine de liaison à l¿ADN et du site de coupure de la relaxase. L¿homologie entre les gènes int et xis de transposition et entre les répétitions directes aux extrémités de Tn1549 et de Tn916 suggère la possibilité d¿une trans-complémentation. La trans-complémentation de la mobilisation sera évaluée chez Bacillus subtilis et celle de la transposition par conduction plasmidique chez E. coli à l¿aide d¿un système plasmidique tripartite.//Ce travail étudiera, à propos d¿une résistance d¿importance majeure en santé publique le rôle des anaérobies du tube digestif des mammifères en tant que réservoir de déterminants de résistance pour les bactéries pathogènes. Deux groupes de gènes de résistance à la vancomycine, vanB et vanG, ont été détectés chez des Clostridium isolés chez l¿homme. Nous avons montré in vitro et chez la souris que le transposon Tn1549 porteur de vanB est transférable de Clostridium à entérocoque. Nous étudierons les mécanismes de transfert et de transposition de cet élément et l¿influence éventuelle de la vancomycine sur la dissémination de sa propre résistance. Il n¿existe aucune information sur le locus vanG de C. difficile. La fonction des gènes et la régulation de leur expression seront étudiées. Les résultats donneront des informations sur les mécanismes de transfert génétique horizontal entre les bactéries et sur l¿origine et l¿expression hétérologue de gènes de résistance aux antibiotiques.