Projet ANR-11-BSV8-0006 – SSOTR : Mécanisme de biosynthèse de protéine dans procaryotes et eucaryotes étudié par analyse des rayons X.
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Gulnara Yusupova (CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE - CERBM)
Partenaires : Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire
Montant : 520000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 48 mois
Résumé : Mécanisme de la biosynthèse des protéines au sein du ribosome étudié par des approches cristallographiques.Les résultats du projet fourniront de nouvelles connaissances pour la compréhension des mécanismes de la synthèse des protéines dans la cellule au niveau atomique, aideront à expliquer certains processus de régulation de l'expression des gènes et donneront de précieux renseignements sur le développement de médicaments ciblant les virus, les protozoaires, les champignons et les bactéries.
L'objectif global de nos recherches vise à comprendre comment la structure atomique du ribosome détermine sa fonction.Notre étude permettra d'améliorer nos connaissances du ribosome - principale usine cellulaire responsable de la fabrication des protéines. Par la suite, ces travaux permettront de nous rapprocher de l'objectif final à savoir la compréhension du ribosome humain, sa structure et les détails biochimiques de la synthèse des protéines au sein des cellules humaines. Il existe de nombreux exemples impliquant le ribosome dans les maladies humaines, y compris le cancer, les infections virales et bactériennes et les mutations génétiques.La structure cristallographique du ribosome eucaryote dans ses états fonctionnels (en présence de ligands fonctionnels) facilitera l'élucidation des relations entre la structure et la fonction de ses composants au niveau atomique et fournira un cadre moléculaire pour l’étude des caractéristiques uniques de la machinerie de traduction chez les eucaryotes. En parallèle, la poursuite de l’étude des mécanismes de la synthèse protéique à partir d’un modèle plus simple comme le ribosome bactérien fournira des informations précieuses pour la compréhension des principes fondamentaux de la synthèse des protéines, communs à toutes les cellules du Vivant. 
Notre analyse repose sur la méthode de cristallographie par diffraction des rayons X.La cristallographie par diffraction des rayons X est une technique expérimentale permettant de déterminer l’arrangement spatial des atomes dans un cristal, par l’intermédiaire d’un faisceau de rayons X projeter sur le cristal induisant un phénomène de diffraction dans différentes directions. Cependant, la principale limitation des études cristallographiques réside dans l’obtention de cristaux capables de diffracter, par ailleurs, les informations de dynamique de la molécule restent limitées à partir d’une seule et même expérience de diffraction. La cible principale de notre projet est le ribosome, le plus gros complexe macromoléculaire retrouvé au sein des cellules. Le ribosome doit d’abord être cristallisé afin de déterminer sa structure, durant de nombreuses années il n’y avait pas de cristaux capables de diffracter. Nous sommes la première équipe à avoir résolu la structure du ribosome bactérien dans son état fonctionnel. La préparation de chaque nouveau type de cristaux (par exemple du ribosome avec un inhibiteur ou un ligand fonctionnel) peut prendre plusieurs mois et parfois des années. Une complication supplémentaire provient du fait que les cristaux de ribosome, comme souvent constaté en cristallographie de l’ARN, diffractent faiblement ayant pour conséquence des cartes de densité électronique parfois imprécises et difficiles à interpréter.
Résumé de la soumission : Le ribosome est un assemblage ribonucléoprotéique cellulaire géant (masse moléculaire de 2x106 à 4.5x106 Da) responsable de la traduction du code génétique en protéine dans les cellules vivantes. De nombreuses études ont démontré que des altérations à différentes échelles de la machinerie traductionnelle sont responsables d'un nombre important et toujours croissant de pathologies humaines. A titre d’exemple, des défauts retrouvés au sein de protéines ribosomiques ont été associés à une variété de troubles sanguins et des tissus conjonctifs, incluant l'anémie de Blackfan-Diamond, de plus, des anomalies de pseudouridylation de l'ARN ribosomique ont été mises en relation avec la dyskératose congénitale. La compréhension complète de la biosynthèse protéique nécessite la connaissance de la structure du ribosome dans son ensemble sous sa forme fonctionnelle en présence de ses ligands naturels tels que les ARN de transfert entiers, l'ARN messager et les facteurs de traduction dans leur contexte biologique réel.Ainsi, l'étude du ribosome se révèle importante non seulement pour l'enrichissement des connaissances fondamentales mais aussi pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant le ribosome.A l'heure actuelle, une seule technique permet d’obtenir des informations structurales à haute résolution à l’échelle du ribosome : la cristallographie par diffraction des rayons X. Les récentes structures cristallographiques des sous-unités ribosomiques procaryotes, du ribosome 70S de Thermus thermophilus et des complexes ribosomiques fonctionnels ont fourni de nouvelles informations concernant l'aspect fonctionnel du ribosome, mais malgré tout, l'observation expérimentale des nombreuses étapes impliquées dans le processus de traduction reste encore incomplète. Nous travaillons avec l'organisme procaryote T. Thermophilus depuis 1993, nous étions la première équipe à introduire cet organisme thermophile dans le domaine de la cristallographie du ribosome et à obtenir les premiers cristaux de la sous-unité 30S et du ribosome 70S de T. Thermophilus capables de diffracter. Nos protocoles bien établis pour la détermination des structures de complexes du ribosome 70S de T. thermophilus nous fournissent une excellente base pour la poursuite des investigations de la machinerie de la biosynthèse des protéines bactériennes.Jusqu'à présent, aucune structure du ribosome eucaryote (ou d'une de ses sous-unités) n'était disponible. Cette année, notre équipe a déterminé la première structure du ribosome eucaryote 80S complet de la levure Saccharomyces cerevisiae. L'objectif général de nos recherches vise à comprendre comment la structure atomique du ribosome dans son ensemble détermine en définitive sa fonction. À cette fin, nous employons une combinaison de méthodes de biochimie, de biophysique et de génétique moléculaire appliquées aux organismes modèles procaryotes (Thermus thermophilus) et eucaryotes (la levure Saccharomyces cerevisiae).
Résultats : Pour l’étude cristallographique du ribosome, ce dernier étant un complexe très volumineux composé de plus de 150 000 atomes, il est important de s’assurer que les échantillons sont homogènes pour la réussite de sa cristallisation. Un autre pré-requis important : le ribosome doit être fonctionnellement actif. En d’autres termes, nous devons obtenir des instantanés du ribosome fonctionnel à différentes étapes de la synthèse des protéines, quand le ribosome est en complexe avec différents partenaires de la biosynthèse, comme par exemple, un ARN messager (qui renferme l’information encodée de la future protéine).
Une autre condition importante est l’obtention d’une grande quantité de ribosomes purs nécessaire à la mise en place d’essais de cristallisation à grande échelle. Actuellement, nous sommes en train de développer des méthodes de purification de ribosomes eucaryotes fonctionnels et actifs (les eucaryotes sont des cellules à noyaux renfermant le matériel génétique ; les cellules humaines appartiennent à la branche des eucaryotes supérieurs). Nous sommes aussi en train des développer des modèles de complexes fonctionnels du ribosome qui nous permettrons d’obtenir la première structure du ribosome eucaryote fonctionnel.
Perspectives : La majorité des antibiotiques inhibant la traduction bactérienne cible le ribosome bloquant la traduction à différentes étapes, couvrant l’initiation, l’élongation, la terminaison et le recyclage.
L’analyse et la comparaison des sites de liaisons de différents composés entre le ribosome bactérien et eucaryotes à l’échelle atomique fournira de précieux renseignements pour le développement de médicaments ciblant les virus, les protozoaires, les champignons et les bactéries.
L’élucidation des mécanismes de la biosynthèse des protéines au sein du ribosome nous apportera la connaissance des mécanismes moléculaires impliqués par exemple, dans le vieillissement ou les maladies liées à l’apparition de protéines tronquées (anormales).
Publications et brevets : En conséquence des 5 premiers mois d'activité il n'y a pas de publications liées à ce projet ANR.