Projet ANR-10-BLAN-1617 – EPIGENOME : Formation, dynamics and epigenetic functions of 5-hydroxymethylcytosine residues in DNA.
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Murat SAPARBAEV (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR EST)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut Nanosciences et Cryogénie
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Étude des mécanismes moléculaires de la régulation épigénétiqueEtude du rôle des protéines TET et des enzymes impliquées dans la réparation de l’ADN sur la formation et la dynamique des marqueurs chimiques présents sur l'ADN tels que 5-méthylcytosines et 5-hydroxyméthylcytosines. Implications pour la reprogrammation épigénétique vers la pluripotence et les modifications épigénétiques dans le cancer.
La compréhension des mécanismes de déméthylation active de l'ADNCe projet vise à étudier la fonction des 5-hydroxyméthylcytosines (5hmC) dans les changements épigénétiques et l’instabilité génétique. Nos objectifs seront structurés en 4 tâches : i) Rôle des protéines TET2, du stress oxydatif et des enzymes impliquées dans la réparation de l’ADN sur la formation et la dynamique des 5-hmC dans l’ADN. Ainsi, cette étude pourra donner des idées sur la nature des mécanismes moléculaires intervenant dans la déméthylation active restant encore peu comprise ; ii) Identifier et caractériser les protéines humaines interagissant spécifiquement avec les 5-hmC. Cette étude permettra de cartographier les protéines interagissant avec les 5hmc et de définir les mécanismes de réparation de l’ADN impliqués ; iii) Etudier le rôle des protéines TET et des 5-hmC sur l’instabilité génétique et la réparation d’ADN. Cette étude pourra ainsi expliquer pourquoi les mutations tet2 sont trouvées dans de nombreuses hémopathies ; iv) Etudier le rôle des protéines TET sur l’expression génique dans les lignées cellulaires humaines en particulier les cellules ES humaine. Le contrôle épigénétique dans ces lignées est d’un intérêt crucial puisque récemment, la protéine AID intervenant dans la déamination des cytosines a été impliquée dans la reprogrammation vers la pluripotence via des processus de déméthylation.
Etude par des approches biophysiques, biochimiques et de génomique fonctionnellePour étudier les mécanismes de la déméthylation active de l'ADN nous utilisons quatre approches complémentaires: (i) une approche biophysique utilisant la spectrométrie de masse pour quantifier les résidus 5-hydroxyméthylcytosines dans l’ADN cellulaire pour élucider le rôle de la protéine TET2 et des enzymes de réparation de l'ADN dans la déméthylation active; (ii) une approche biochimique in vitro, en reconstituant un système de réparation avec des protéines purifiées et des oligonucléotides variés contenant de 5mC, 5hmC, 5hmU et 5caC. Cela nous permettra d’analyser et de mesurer les constantes cinétiques de l'élimination de marqueurs chimiques de l'ADN; (iii) une approche dite de «ligand fishing« utilisant des sondes nucléiques contenant 5hmC et fixées sur des billes magnétiques. Les protéines retenues sont identifiées à l’aide d’outils protéomiques. Les candidats retenus sont validés par les différentes approches complémentaires telles que la méthode du gel retard; (iv) une approche in situ utilisant la technologie dit de «microarray» pour identifier les gènes dérégulés à partir de cellules sur-exprimant ou non la protéine TET2 pour moduler les niveaux de 5hmC.
Résumé de la soumission : La méthylation des cytosines en position 5 (5mC) est une modification post-réplicative de l’ADN courante à la fois chez les procaryotes et les eucaryotes. La méthylation de l’ADN contient les informations épigénétiques qui régule des aspects importants des fonctions des organismes. Le profil de méthylation des régions régulatrices et des gènes dans les cellules différenciées est très stable et maintenu au cours des divisions. En revanche, chez les mammifères, il se produit au cours du développement notamment dans les cellules germinales et chez l’embryon une reprogrammation du profil de méthylation résultant en un large potentiel de développement pour les cellules. Les cellules souches peuvent également recourir à une reprogrammation épigénétique pendant la différentiation. Enfin, les changements des profils de méthylation sont généralement associés à des changements épigénétiques dans les cancers humain. En effet, un certain nombre de cancers présentent souvent une hypométhylation générale concomitante avec une hyperméthylation spécifique de certains gènes suppresseur de tumeurs. Ainsi, des altérations des profils de méthylation peuvent conduire à une instabilité génétique causée par un remodelage chromatinien. Ainsi, la compréhension de la dynamique de la méthylation pendant le développement et l’oncogenèse requiert d’étudier attentivement les processus de déméthylation. 	La perte rapide de la méthylation en un seul cycle cellulaire soutient l’existence d’enzymes permettant d’éliminer ou de modifier les résidus de 5mC. Récemment, le laboratoire du Partenaire 2 ainsi que d’autres laboratoires ont identifié des mutations sur 1 ou 2 allèles du gène tet2 dans les syndromes myéloprolifératifs (SMP) et d’autres hémopathies. TET2 appartient avec les homologues TET1 et TET3 à une même famille et l’équipe de Tahiliani a montré récemment que la protéine TET1 avait une activité enzymatique dependante du 2-oxoglutarate et du fer II conduisant a convertir les 5mC en 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) à la fois in vitro et dans des cultures de cellules souches embryonnaires (ES) murines. Ces données indiquent un nouveau mécanisme du contrôle épigénétique via l’oxydation des 5mC en 5-hmC, ce dernier pouvant être un intermédiaire de déméthylation active reconnu par des mécanismes de réparation d’ADN. Il est donc plausible de penser que les enzymes impliquées dans la réparation par excision de bases (BER) et incision de nucléotide (NIR) représentent des candidats possibles dans la déméthylation active de part leur capacité à réparer des résidus de cytosines oxydées. 	L’objectif général de ce projet est d’évaluer la formation et la régulation de la 5-hmC en déterminant ces partenaires. Ce projet vise également à étudier la fonction des 5-hmC dans les changements épigénétiques et l’instabilité génétique. Ainsi, nos objectifs seront structurés en 4 tâches : i) Rôle des protéines TET, du stress oxydatif et des enzymes impliquées dans la réparation de l’ADN sur la formation et la dynamique des 5-hmC dans l’ADN. Ainsi, cette étude pourra donner des idées sur la nature des mécanismes moléculaires intervenant dans la déméthylation active restant encore peu comprise ; ii) Identifier et caractériser les protéines humaines interagissant spécifiquement avec les 5-hmC. Cette étude permettra de cartographier les protéines interagissant avec les 5hmc et de définir les mécanismes de réparation de l’ADN impliqués ; iii) Etudier le rôle des protéines TET et des 5-hmC sur l’instabilité génétique et la réparation d’ADN. Cette étude pourra ainsi expliquer pourquoi les mutations tet2 sont trouvées dans de nombreuses hémopathies ; iv) Etudier le rôle des protéines TET sur l’expression génique dans les lignées cellulaires humaines. Le contrôle épigénétique est d’un intérêt crucial puisque récemment, la protéine AID intervenant dans la déamination des cytosines a été impliquée dans la reprogrammation vers la pluripotence via des processus de déméthylation.
Résultats : - Nous avons mis en évidence que le système de réparation des mésappariements de bases (MMR) est impliqué dans l'élimination des cytosines méthylées. 
- Nous avons obtenu la structure tridimensionnelle du complexe formé par l'ADN glycosylase MBD4 (impliquée dans la déméthylation active) et l'ADN contenant 5-hydroxyméthyluracile (le produit intermédiaire de la déméthylation). 
- Nous avons montré que le niveau de 5hmC chute en présence d’un shARN dirigé contre TET2 
- Nous avons montré que TET2 est un gène clé impliqué dans le développement de l’hématopoïèse à partir des ES humaines.
- Nous avons montré que les rayonnements ionisants ont un impact limité sur le taux global de 5hmC dans l’ADN.
- nous avons montré que le régulateur transcriptionnel ZBTB2 a une affinité diminuée pour la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) en comparaison avec la 5-méthylcytosine (5mC).
Perspectives : Dans les perspectives 
- nous allons étudier si les protéines TET2 et AID peuvent initier l'élimination des résidus 5hmC par la voie de réparation des mésappariements de bases (MMR);
- nous voudrions résoudre la structure tridimensionnelle du complexe de la protéine hTDG entière avec ses substrats d'ADN; 
- nous allons étudier la mutagenèse induite par la surexpression de TET2 dans les cellules déficientes en système de réparation de l'ADN par excision de base; 
- nous allons étudier si le phénotype hématopoïétique est dépendant ou indépendant de sa fonction sur les 5-hydroxyméthylcytosines (5hmC). 
- nous allons optimiser le protocole de HPLC-MS-MS pour mesure de la 5-carboxydeoxycytidine, autre produit d’oxydation de la 5hmC et potentiel intermédiaire de déméthylation de l’ADN. 
- nous allons valider les résultats ZBTB2 et rechercher d’autres interactions protéines / 5hmC / 5mC en criblant d’autres modèles cellulaires (cellules UT7 exprimant ou non TET2 – fournies par partenaire 2).
Publications et brevets : 1. Pronier, et al., Ravanat JL, et al., Plo I, Delhommeau F.  et al. (2011) Inhibition of TET2-mediated conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine disturbs erythroid and granulomonocytic differentiation of human hematopoietic progenitors. Blood, 118, 2551-2555. (Ce travail montre que la déficience en TET2 soit par shARN soit dans des patients mutés conduit à une baisse des 5hmC ainsi qu’en un biais de différenciation granulo-monocytaire. C'est un travail collaboratif des partenaires 2 et 3). 
2. Quivoron, C., et al., Plo, I., et al., (2011) TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell 20, 25-38. (Ce travail décrit le phénotype des souris TET2 knock-out qui conduit à une Leucémie myélomonocytaire chronique). 
3. Zlatanou, A., et al., Ishchenko, A. A. and Kannouche, P. L. (2011) The hMsh2-hMsh6 Complex Acts in Concert with Monoubiquitinated PCNA and Pol eta in Response to Oxidative DNA Damage in Human Cells. Mol Cell 43, 649-662. Ce travail montre que la voie de réparation des mésappariements de bases (MMR) est impliqué dans la déméthylation active de l'ADN. 
4. Morera, S., et al., Saparbaev, M., Ishchenko, A.A. (2012) Biochemical and structural characterization of the glycosylase domain of MBD4 bound to thymine and 5-hydroxymethyuracil (5hmU)-containing DNA. Nucleic Acids Res., (sous presse). Dans ce travail nous avons établi le mécanisme de reconnaissance de dérivés 5-hydroxyméthylcytosine par désamination.