Projet ANR-13-BSV6-0004 – eNergiome : N-terminome des organelles de conversion de l'énergie: Une meilleure comprehension de la maturation des protéines impliquées dans ces organelles
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Willy BIENVENUT (Institut des Science du Végétal)
Partenaires : Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux; Institut des Sciences du Végétal; Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien
Montant : 394015.0 euros
Durée : 42 mois
Résumé : Mieux comprendre la production d’énergie chez l’Homme et Arabidopsis (mitochondries et photosynthèse)Caractérisation des modifications N-terminales des protéines codées par le génome nucléaire impliquées dans la conversion de l’énergie dans les organites (mitochondries et chloroplastes) et développement d’une nouvelle génération d’outils de prédiction du statut N-terminal des protéines matures et fonctionnelles.
Mieux comprendre la maturation des protéines chloroplastiques et mitochondriales.Alors que les maladies mitochondriales sont bien connues et que l’utilisation des chloroplastes pour la production de protéines recombinantes à usage thérapeutique présente un intérêt majeur, le devenir des protéines impliquées dans ces organites reste peu connu. Il s’agit donc de mieux comprendre le devenir de ces protéines via leurs N-terminal et de développer des outils de modélisation de ces phénomènes de maturation des protéines dans les  organites de conversion de l’énergie.
Cibler les organites pour mieux caractériser les modifications des protéinesLe fractionnement subcellulaire a permis d’obtenir des mitochondries et des chloroplastes purifiés dont l’analyse détaillée par spectrométrie de masse améliore nos connaissances du N-terminal des protéines impliqué dans le fonctionnement de ces organites. Outre la caractérisation des sites de maturation des protéines, il a également été possible d’identifier et de quantifier certaines modifications telles que l’acétylation N-terminal des protéines qui apparait être une modification majeure dans le stroma des chloroplastes.
Résumé de la soumission : Contrairement à d’autres compartiments sous-cellulaires, les organites liés à la conversion énergétique (ECO) tels que les mitochondries (Mt) et les chloroplastes (Cp) sont des compartiments endo-symbiotiques d’origine bactérienne. Ces deux organites conservent une petite partie de leur matériel génétique d'origine tandis que 2500-3000 protéines sont codées par le génome nucléaire puis importées grâce à une séquence de transit leur permettant de cibler le compartiment adéquate. A l’issus de l’importation de ces protéines dans les ECO, cette séquence de ciblage est clivée et des phénomènes de maturation peuvent se produire tels que l’acétylation des protéines au niveau du N-term dans le Cp comme nous l'avons récemment mis en évidence. Alors que les mécanismes d'import des protéines dans l'ECO sont connus et bien décrits, l'emplacement exact du site de clivage du peptide de transit (TP) et d'éventuelles modifications post-traductionnelles (PTM) qui y sont associés sont très peu décrits. Bien que des outils de prédiction existent pour proposer la localisation subcellulaire et le site de clivage du TP, leurs résultats sont au mieux imparfaits. Une meilleure connaissance des PTM associées à ces mécanismes d’import est essentielle pour comprendre la composition, la dynamique et l'homéostasie du protéome de ces organites. En outre, sachant que la production de protéines recombinantes dans les Cp des plantes est un défi économique crucial et que de nombreuses maladies sont également associées aux Mt, une meilleure connaissance de la maturation des protéines importées dans les ECO est cruciale. L'enjeu de ce projet est d'améliorer nos connaissances dans ce domaine en utilisant les compétences de trois équipes de recherche capables de réaliser ces investigations qui nécessitent la préparation d'échantillons et leur analyse par spectrométrie de masse (MS), le traitement bio-informatique des données pour finir par des validations expérimentales de certains types de données.Tout d'abord, ce projet nécessitera la caractérisation expérimentale des peptides N-term des protéines matures impliquées dans ces ECO en utilisant des analyses protéomiques à haut débit. Ensuite, un système de base de données fournira la structure nécessaire à un système de stockage permettant par la suite de développer d'une nouvelle génération d'outils de prédiction. Cette base de données sera également enrichie d'informations disponibles dans d’autres banques beaucoup plus orientées vers la localisation des protéines ou leur activité comme par exemple AT-CHLORO, MitoRes, ou NextProt. Ces données expérimentales, après organisation et validation, seront partagées avec d'autres bases de données telles qu’UniProtKB et mises à la disposition de la communauté des biologistes sur un site web dédié. Troisièmement, puisque des données expérimentales ont montré que certaines protéines importées dans le Cp ou la Mt étaient identifiées avec plusieurs sites de clivage du TP, il s’agira de caractériser et de quantifier la distribution de ces clivages récessifs pour déterminer le rendement du clivage pour chaque position à l'aide d‘analyses ciblées par MS dite "SRM". Enfin, certaines protéines, non encore décrites comme étant localisées dans les ECO, ont d’ores et déjà été caractérisés de façon répété avec un N-terminus expérimental en aval du N-term prédit. En utilisant des protéines de fusion ou des techniques d’histologie associées à la microscopie confocale, il faudra déterminer la localisation exacte de ces protéines permettant l'identification d'un nouvel ensemble de protéines relocalisées dans ces organites. Pour conclure, ce projet devrait fournir de précieux indices pour mieux comprendre la maturation des protéines dans les ECO et de comparer les différences / similitudes entre les Mt humaines et végétales, une question qui n'a jamais été abordé auparavant à une telle échelle.
Résultats : Les premiers résultats obtenus ont permis de clarifier le statut N-terminal de plusieurs centaines de protéines mitochondriales et chloroplastiques. Ainsi, l’acétylation N-terminale présente dans le chloroplaste est absente dans la mitochondrie humaine. De plus, les mécanismes de maturation N-terminale des protéines génèrent un grand nombre de protéoformes qui coexistent. Cette diversité pourrait jouer un rôle prépondérant au niveau de la régulation de la dégradation de ces protéines.
Perspectives : Nous continuons la collecte des informations sur les N-terminaux des protéines d’organites chez l’Homme et Arabidopsis. Les données déjà obtenues, conjuguées aux échantillons en cours de traitement, nous permettront d’avoir un panel représentatif des N-terminaux matures des protéines de ces organites ainsi que de développer dans un deuxième temps des outils de prédictions plus fiables que les outils actuels, afin de mieux comprendre le métabolisme des protéines de ces organites.
Publications et brevets : Mise en évidence de la première acetylase spécifique du chloroplaste : Dinh TV et al. Molecular identification and functional characterization of the first Na-acetyltransferase in plastids by global acetylome profiling. Proteomics. 2015.
Caractérisation de plusieurs centaines de N-termini matures du protéome mitochondrial humain : Vaca Jacome SA et al. N-terminome analysis of the human mitochondrial proteome. Proteomics. 2015.