Projet ANR-12-BSV3-0007 – SARS-RNA-SPA : Activités de synthèse et de modification des ARNs du SARS coronavirus
Programme : Blanc - SVSE 3 - Microbiologie, immunologie, infectiologie (Blanc SVSE 3)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Etienne DECROLY (UMR 7257-AFMB)
Partenaires : Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille; Institut des Biomolécules Max Mousseron; Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques
Montant : 480462.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Mécanismes de réplication du SARS-Coronavirus et nouvelles stratégies antiviralesNous étudions les mécanismes de régulation de l’activité polymérase du complexe de réplication et avons découvert un mécanisme de correction des erreurs unique chez les virus à ARN. De plus, nous caractérisons les enzymes virales impliquées dans l’addition de la «coiffe» présente en 5’ des ARNm, afin de permettre leur traduction en protéines virales tout en évitant leurs reconnaissances par les mécanismes de l’immunité innée.
Etude des activités polymérase et de «capping» du complexe de réplication du SARS-CoV .La compréhension des mécanismes de réplications du SARS-CoV est essentielle au développement de nouvelles stratégies antivirales. Nous tentons de comprendre comment les différentes activités enzymatiques du complexe de réplication sont interconnectées afin d’assurer la réplication fidèle du génome et l’addition d’une structure coiffe en 5’. Cette structure permet  leur traduction en protéines virales et empêche  la reconnaissance des ARN viraux par des senseurs de l’immunité innée.
Caractérisation structurale et fonctionnelle des enzymes réplicatives et de cappingL’expression de plusieurs enzymes virales à partir de gènes synthétiques permet de purifier des complexes multi-enzymatiques actifs. Nous étudions la régulation des activités enzymatiques virales par des méthodes biochimiques et nous tentons de cristalliser les protéines seules ou en complexe afin de résoudre leur structure. Les résidus catalytiques sont identifiés par mutagenèse dirigée et des expériences de génétique inverse démontrent le rôle clé de ces enzymes dans la réplication virale.
Résumé de la soumission : En 2003, un nouveau coronavirus humain a émergé de Chine provoquant plus de 8000 cas du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère (SRAS). Le SARS-Coronavirus (SARS-CoV) se propagea rapidement à travers le monde et entraina une mortalité très élevée (plus de 10%). Les coronavirus sont des virus à ARN de polarité positive dont le génome est d’une taille exceptionnellement longue pour des virus à ARN (~ 30 000 nt). De plus, la machinerie de réplication virale assure une stabilité génétique remarquable. Le complexe de réplication/transcription (RTC) viral est formé d’un ensemble original de protéines beaucoup plus complexe que chez la plupart des autres virus à ARN. Le RTC est composée I) d’activités ARN polymérase et ARN primase assurant la synthèse de l'ARN génomique et des ARNm subgénomiques, II) d’un ensemble d'enzymes de modification des ARNs impliqués dans la formation de la structure coiffe tels que l'ARN hélicase/triphophatase, et les N7-guanine et 2'O-méthyltransférases et enfin III) des activités de modifications de l'ARN, uniques aux Coronavirus. Parmi ces activités, nsp14 est une enzyme bifonctionnelle portant une activité N7-guanine méthyltransférase (MTase) et une activité 3’-5’ exoribonucléase. L’activité N7-MTase est impliquée dans la formation de la coiffe. La coiffe assure non seulement la traduction des ARNm viraux en protéines mais également empêche la reconnaissance des ARN viraux par les mécanismes de l'immunité innée de la cellule hôte. L’activité exoribonucléase pourrait, elle, être impliquée dans la correction des erreurs de polymérisation lors de la réplication virale assurant ainsi la stabilité génétique. Tout porte à croire que l’acquisition du gène codant la protéine nsp14 par les coronavirus est strictement corrélée à l’augmentation de la taille du génome. En effet, les Arterivirus (famille de virus appartenant au même ordre viral que les coronavirus) possèdent un génome de taille inférieure à 22 000 nt et ne possèdent pas cette enzyme. Enfin, il est important de noter que la protéine nsp14 interagit avec la protéine nsp12 portant l’activité ARN polymérase ARN-dépendante, ainsi qu'avec la protéine nsp10. La protéine nsp10 a été identifiée comme une protéine stimulant l’activité 2'O MTase virale (portée par nsp16). Nsp14 constitue donc une protéine centrale coordonnant probablement des activités essentielles du complexe de réplication/transcription. Nsp14 joue certainement le rôle de chef d’orchestre des processus de polymérisation, de réparation des mésappariements et de formation de la coiffe.Nous proposons dans ce programme de recherche de répondre aux questions spécifiques suivantes:1. Comment les activités primase et polymérase assurent la synthèse hautement processive de l'ARN génomique et des ARNm subgénomiques viraux?2. Comment la protéine bifonctionnelle nsp14 (exoribonuclease/N7-méthyltransférase) assure la correction des erreurs lors de la réplication virale?3. Comment la synthèse de la structure coiffe des ARN viraux est-elle couplée au processus de réplication?Afin de répondre à ces trois questions spécifiques, nous proposons d'utiliser des approches pluridisciplinaires associant l'analyse biochimique et structurale des protéines virales impliquées afin d’explorer les processus fondamentaux, tels que la stabilité génétique et la formation de la structure coiffe à l’extrémité 5’ des ARNm viraux. Nous désirons notamment comprendre l’enjeu de ces processus non seulement car ils fourniront des bases moléculaires pour le développement de molécules antivirales, mais aussi car ils jouent des rôles déterminants pour le processus d’évolution des virus et d’échappement au système de l’immunité innée. Enfin, la mise en évidence d’un système de réparation des erreurs lors de la polymérisation serait unique et inédit dans le monde des virus à ARN.
Résultats : Nous avons identifié et caractérisé deux partenaires associés à la polymérase et essentiels à la réplication virale. Il s’agit d’une part d’un facteur de processivité essentiel à la réplication du génome et d’autre part d’une exonucléase capable d’exciser les erreurs de réplication afin d’assurer la stabilité génétique du virus. Les essais développés permettront de rechercher des inhibiteurs de la polymérase.
Perspectives : L’obtention d’un test enzymatique permettant d’étudier la polymérase du SARS-CoV devrait permettre l’identification d’inhibiteurs spécifiques. Nous pourrons également évaluer comment l’exonucléase nsp14 limite l’action des inhibiteurs. Nous espérons également obtenir la structure de la polymérase en présence d’ARN et de son facteur de processivité.
Publications et brevets : Un article scientifique est en cours de rédaction. Nous décrivons les mécanismes de régulation de l’activité exonucléase nsp14 par le facteur nsp10.