Projet ANR-12-BSV5-0020 – GLYCOMIME : Glycomimes ciblant Pseudomonas aeruginosa: Synthèse, criblage par une technologie de micropuce à ADN et évaluation sur bactéries
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Jean-Jacques VASSEUR (Institut des biomolécules Max Mousseron)
Partenaires : Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires; Institut des Biomolécules Max Mousseron; Institut des Nanotechnologies de Lyon; Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle
Montant : 520000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : Molécules ciblant les facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa est la troisième bactérie impliqué dans les maladies nosocomiales et la principale cause de mortalité des patients atteint de la mucoviscidose. Elle se caractérise par sa capacité à développer des résistances aux anti-biotiques. Ce projet vise à découvrir de nouvelles molécules ciblant non pas des fonctions vitales de la bactérie mais ses facteurs de virulences
Inhiber les facteurs de virulence : une alternative aux anti-biotiques ?Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie opportuniste gram négative, inoffensive pour les individus en bonne santé, mais dangereuse chez les individus immuno-déprimés. Elle est la troisième cause de maladie nosocomiale après le Staphyllocoque doré  et E. coli. Elle est la principale cause de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de la mucoviscidose. La colonisation des voies respiratoires aboutit souvent à une pneumonie chronique malgré l’utilisation d’antibiotiques. Il est très difficile de l’éradiquer lors de ces infections chroniques du fait de l’apparition de souches résistantes et de l’avantage sélectif que lui procure la formation du biofilm.PA possède tout un arsenal moléculaire de facteur de virulence qui joue un rôle fondamentale dans l’infection. Pour les bactéries, les facteurs de virulence sont des molécules qui sont nécessaires ou qui potentialisent leurs capacités. L’inhibition de ces facteurs par des molécules de synthèse ouvre la voie à des thérapies alternatives à l’utilisation des antibiotiques. Parmi les cibles potentielles, il y a celles impliquées dans l’adhésion de PA aux mucines et aux cellules épithéliales. Cette adhésion implique souvent l’interaction de lectines bactériennes du flagelle (FliD, FliC), des Pili (type IV Pili, Cup B pili) ou solubles (PA-IL, PA-IIL). Même si d’autres groupes de recherche font états de molécules ciblant ces facteurs de virulence  (notamment PA-IL et PA-IIL), à ce jour, leur sélectivité et leurs mécanismes d’action in-vitro et in-vivo restent à éclaircir.Ce projet vise à synthétiser et à sélectionner des ligands de haute affinités pour les sept lectines de PA et d’évaluer in-vitro et in-vivo leurs efficacités comme agent anti-microbien ainsi que de déterminer leurs sélectivités et leurs mécanismes d’action. Un deuxième aspect du travail à potentiel plus risqué visera à découvrir de nouveaux oligosaccharides et lectines impliqués dans l’adhésion et la colonisation des voies respiratoires.
Une approche multidisciplinaire : Chimie-Nanotechnologie-MicrobiologieNotre stratégie pour trouver des molécules de haute avidité pour ces lectines de PA est basée sur une approche de synthèse chimique type «Lego« très simple permettant à partir de briques élémentaires d’accéder à une grande diversité de structures. Un processus de sélection ne nécessitant que quelques nanomoles de glycoclusters grâce aux nanotechnologies permet à chaque étape de synthèse de déterminer les ligands présentant les meilleures affinités pour les protéines bactériennes. Ceux-ci seront alors synthétisés à l'échelle de 100 mg, pour être évalués sur des bactéries entières comme composés anti-adhésifs.La découverte de nouveaux oligosaccharides ou lectines impliqués dans l’adhésion de PA s’appuie sur l’identification de motifs oligosaccharides spécifiques présent préférentiellement chez les patients infectés ainsi que sur l’utilisation de particules magnétiques portant des glycomimes afin de « pêcher » de nouvelles lectines à partir d’extrait cellulaire.
Résumé de la soumission : Pseudomonas aeruginosa (PA) est l’exemple type du pathogène opportuniste, peu dangereuse pour les individus en bonne santé, mais pouvant s’avérer mortelle chez les individus immuno-déprimés. Ainsi, elle est la deuxième cause de maladie nosocomiale après le Staphylocoque doré et est la principale cause de mortalité chez les patients atteints de la mucoviscidose. La colonisation des voies respiratoires aboutit dans la majorité des cas à une pneumonie chronique malgré le recours à l’utilisation d’antibiotiques. Il est en effet très difficile de l’éradiquer lors de ces infections chroniques du fait de l’apparition de souches résistantes et de l’avantage sélectif que lui procure la prolifération en biofilm.PA possède tout un arsenal de facteurs de virulence qui jouent un rôle fondamental dans l’infection. L’inhibition de ces facteurs par des molécules de synthèse ouvre la voie de nouvelles thérapies alternatives à l’utilisation des antibiotiques. Parmi les cibles potentielles, il y a celles impliquées dans l’adhésion de la bactérie aux mucines et aux cellules épithéliales. Cette adhésion implique souvent l’interaction de lectines bactériennes associées au flagelle (FliD, FliC), Pili (type IV Pili, Cup B pili) ou solubles (PA-IL, PA-IIL). De nombreuses publications font état d’inhibiteurs de type glycocluster présentant de forte affinité pour ces lectines (notamment PA-IL et PA-IIL). Cependant, à ce jour leur sélectivité et leurs mécanismes d’action in-vitro et in-vivo restent à éclaircir.Ce projet vise à synthétiser et à sélectionner des ligands de haute affinités pour sept lectines de PA (PA-IL, PA-IIL, FliC, FliD, PilA, PilY1 et CupB6) et d’évaluer in-vitro et in-vivo leurs efficacités comme agents antimicrobien ainsi que de déterminer leurs sélectivités et leurs mécanismes d’action. Un deuxième aspect du travail plus aléatoire visera à identifier de nouvelles lectines impliquées dans l’adhésion et la colonisation des voies respiratoires de PA et caractériser leurs ligands oligosaccharidiques exposés sur les mucines bronchiques Notre stratégie pour trouver des glycomimes de haute avidité pour ces lectines de PA est basée sur une approche de synthèse "Lego" très simple utilisant des glycoside-bras-azides et des composés poly-alcynes. Ceux-ci sont assemblés par chimie click sur un squelette phosphorylé dont la synthèse automatisée s’appuie sur la chimie des oligonucléotides. Un processus de sélection ne nécessitant que quelques nanomoles grâce aux nanotechnologies (Glycoarray et AFM) permet à chaque étape (glycoside ou glycomime) de déterminer les ligands présentant les meilleures affinités pour ces sept lectines. Ceux-ci seront alors synthétisés à l'échelle de ~100 mg, pour être évalués sur des bactéries entières comme composés anti-adhésifs.La découverte de nouvelles lectines impliquées dans l’adhésion de PA aux mucines, s’appuie sur l’utilisation de particules magnétiques portant des motifs saccharidiques usuellement présent sur les mucines bronchiques humaines (antigène de Lewis, groupes sanguins) afin de « pêcher » de nouvelles lectines à partir d’extrait cellulaire bactérien. L’identification de motifs oligosaccharides spécifiques présents sur les mucines bronchiques humaines et facteurs de prédisposition à infection par PA se fera par comparaison des chaînes oligosaccharidiques exposées sur les mucines des patients infectés et des patients sains.Ce projet combine les savoir-faire complémentaires de quatre laboratoires spécialisés dans la synthèse des oligonucleotides et leurs conjugués, la synthèse de glycosides, dans les nanotechnologies (AFM/glycopuces) et dans la glycobiologie et la microbiologie.
Résultats : La stratégie employé dans ce projet a d'ores et déjà permis d’identifier 2 molécules de très fortes affinités pour PA-IL. Les premiers résultats ont démontré la capacité de ces molécules à inhiber l’adhésion bactérienne sur tapis cellulaire. Nous espérons que les nouvelles molécules ciblant les autres protéines de Pseudomanas aeruginosa auront un effet plus important soit en utilisation seule soit en combinaison avec d’autres molécules.
Perspectives : A cours terme nous cherchons à cloner et exprimer les cinq lectines de PA non accessibles commercialement. Ceci nous permettra ensuite de cribler les différents glycoclusters déjà synthétisés et de concevoir de nouveaux glycoclusters présentant des meilleures affinités pour chaque nouvelle lectine.
Un effort important de synthèse est nécessaire pour avoir accès à de nouveaux néoglycoclusters constitués de résidus carbohydrates multiples.
Publications et brevets : Brevet en cours de rédaction. Une publication dans RSC Advances sous presse (2013). 4 Communications orales (3 internationales: Chine, Belgique, Espagne) et 2 par affiche. Une revue dans Current Opinion in Chemical Biology soumise.