Projet ANR-11-EMMA-0024 – b-ACTIPROD : beta-CN(94-123), un peptide bioactif issu des laits fermentés renforçant la protection intestinale: vers de nouveaux traitements des pathologies intestinales
Programme : Emergence de produits, technologies, ou services à fort potentiel de valorisation (Emergence)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame Pascale PLAISANCIE (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES AUVERGNE)
Partenaires : INRA TRANSFERT; Science et Technologie du Lait et de l'Oeuf; Toxicologie Alimentaire; Cardiovasculaire, Métabolisme, Diabétologie et Nutrition
Montant : 248911.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 24 mois
Résumé : Un peptide bioactif du lait pour lutter contre les pathologies intestinalesLe peptide ß-CN(94-123), découvert dans les laits fermentés, est une nouvelle molécule à fort potentiel santé, ciblant les défenses de l’intestin. L’objectif du projet b-ACTIPROD était d’évaluer la pertinence de ce peptide ou d’une matrice laitière le contenant, lors de pathologies intestinales.
Un peptide des laits fermentés pour maintenir ou réparer la barrière intestinaleLe peptide ß-CN(94-123), issu de la ß-caséine bovine et identifié dans les yaourts, est un nouveau peptide ciblant deux populations de cellules jouant un rôle majeur dans la défense intestinale: les cellules à mucus et de Paneth. Administré par voie orale chez le rat, le peptide ß-CN(94-123) induit en effet l’expansion de ces deux types cellulaires le long de l'intestin grêle et augmente l’expression des mucines (MUC2 et MUC4) et de facteurs antibactériens (lysozyme, rdefa5). Toutefois, les preuves attestant de son efficacité lors d’altérations de la barrière intestinale restaient à apporter.Le projet b-ACTIPROD avait pour objectifs: 1 - d’évaluer la pertinence du peptide ß-CN(94-123) testé seul (perspective de développement pharmaceutique) dans des modèles de pathologies intestinales (tâche 2). 2 - de déterminer si le peptide reste actif lorsqu'il est administré dans un environnement complexe comme un lait fermenté (perspective de développement d’un aliment fonctionnel) (tâche 3).3 - de rechercher, in vivo, la séquence minimale active (tâche 4).
Effet protecteur du peptide lors d'altérations intestinales (in vivo, in vitro)Les effets protecteurs du peptide ß-CN(94-123) ont été testés chez le rat dans un modèle d’inflammation intestinale (indométhacine) ainsi que dans un modèle de stress néonatal par séparation maternelle (SMN), connu pour induire des dysfonctionnements gastro-intestinaux mimant ceux du syndrome de l’intestin irritable. Des modèles in vitro (blessure, stress thermique) ont permis en outre d’étudier les effets du peptide dans un environnement contrôlé. La barrière et l’intégrité intestinales ont été évaluées grâce à des techniques de chambre de Ussing, d’immunohistochimie, de western blot et de RT-qPCR. Afin de déterminer si le peptide ß-CN(94-123) reste actif quand il est administré dans un milieu complexe, il a été introduit dans une matrice laitière qui en est dépourvue, et testé dans les modèles in vivo cités précédemment. Enfin des digestats d’animaux ayant reçu le peptide par voie orale sont en cours d’analyse grâce à des techniques HPLC couplées à la spectrométrie de masse afin de rechercher les formes actives courtes.
Résumé de la soumission : Une séquence peptidique issue de la beta-caséine bovine, le peptide beta-CN(94-123) que nous avons identifié dans les laits fermentés, représente une nouvelle molécule à fort potentiel santé, ciblant spécifiquement les mécanismes de défense et de protection de l’intestin. L’arsenal défensif de notre intestin forme la barrière intestinale, une structure complexe organisée autour de la monocouche de cellules épithéliales et de leurs jonctions serrées. Ce système de défense protège le milieu intérieur d'agents délétères présents dans la lumière et joue également un rôle essentiel dans la prévention de la translocation bactérienne et l'initiation des réponses inflammatoires qui peuvent être à l’origine de pathologies intestinales (diarrhées, maladies inflammatoires chroniques, entérocolite nécrosante…) ou systémiques (diabète, obésité, syndrome métabolique…). Deux populations de cellules épithéliales occupent une position stratégique dans la mise en place de cette barrière défensive: les cellules à mucus qui produisent la mucine MUC2 à l’origine de la formation du gel de mucus qui recouvre la muqueuse, et les cellules de Paneth qui libèrent dans la lumière intestinale des molécules à vocation antibiotique telles que les alpha-défensines. Nous avons montré que l'administration orale de très faibles doses du peptide beta-CN(94-123) à de jeunes rats augmente le nombre de cellules à mucus et de cellules de Paneth le long de l'intestin grêle. Ces effets étaient associés notamment à une expression accrue des mucines intestinales (MUC2 et MUC4) et des facteurs antibactériens (lysozyme, rat defensin5). Ces résultats que nous avons protégés (brevet international WO2010130956), sont prometteurs en termes de valorisation et permettent d’envisager le développement de médicaments ou d’aliments santé visant la prévention ou le traitement de pathologies intestinales. Toutefois, les preuves attestant de l'efficacité du peptide lors d’altérations de la barrière intestinale, qui sont d'une importance capitale, restent à apporter. Pour cela, des expériences doivent être menées dans des modèles animaux appropriés.Dans le projet b-ACTIPROD, nous proposons:1 - d’évaluer la pertinence du peptide beta-CN(94-123) dans deux modèles représentatifs de pathologies gastro-intestinales associées à une barrière intestinale défectueuse. Pour cela, le peptide sera testé seul (perspective de développement pharmaceutique), d’une part, dans le modèle de stress néonatal par séparation maternelle (bien décrit pour induire une altération de la barrière et des désordres intestinaux) et, d'autre part, dans le modèle d'inflammation intestinale induite, chez le rat, par l'indométhacine.2 - de déterminer si le peptide reste actif lorsqu'il est administré dans un environnement complexe comme un lait fermenté (perspective de développement d’un aliment fonctionnel).3 - de rechercher, in vivo, la séquence peptidique minimale active. Elle permettra le développement d'analogues stables. Cette phase complètera également le schéma d'action du peptide.Si les effets du peptide se confirment dans ces modèles physiopathologiques, la stratégie de valorisation proposée sera d’établir un partenariat (industrie pharmaceutique ou agro-alimentaire) afin de procéder à des études cliniques chez l'homme et d'examiner l'effet de la matrice si nécessaire (aliment fonctionnel).
Résultats : La tâche 2a fait émerger des résultats forts qui attestent de l'efficacité du peptide ß-CN(94-123) en physiopathologie. En effet, le peptide, testé seul à la concentration de 0.01 microM, a aboli l’hyperperméabilité jéjunale et la déplétion des cellules à mucus engendrées par le stress néonatal par séparation maternelle aux deux temps étudiés (24 jours et 12 semaines). L’analyse de prélèvements réalisés dans l’iléon et le côlon a révélé que le peptide reste actif dans la partie distale de l’intestin et permet de prévenir la déplétion des cellules à mucus induite par le SMN mais cette fois la concentration efficace était de 100 microM.
Dans le modèle d'inflammation induite par l'indométhacine, le peptide ß-CN(94-123) a diminué fortement l’activité de la myéloperoxydase (p<0,001) ainsi que l’expression de cytokines pro-inflammatoires (TNFalpha et Il-1ß) lorsqu’il était administré à la concentration de 100 microM. Il a également empêché ou considérablement réduit les altérations de la muqueuse intestinale. En revanche, les plus faibles doses du peptide (0.01 et 1 microM) n'ont pas eu d’effet significatif sur la sévérité de l’entérite. 
La réalisation de la tâche 3 du projet a nécessité l’obtention d’une matrice laitière dépourvue de peptide d’intérêt et inactif sur la muqueuse intestinale. Pour cela, il a été nécessaire de préparer un mélange de caséines déplétées en caséine ß (tache 3.1a), puis d’élaborer une matrice laitière proche d’un lait fermenté à partir de ce mélange (tache 3.1b). Ces deux points ont été réalisés avec succès. Le peptide ß-CN(94-123) a alors été introduit (ou non) dans cette matrice et testé dans les modèles in vivo précédemment cités. Les premières données obtenues lors de la réalisation de la tâche 3 révèlent que le peptide d'intérêt garde son activité lorsqu'il est administré dans une matrice complexe.
Perspectives : Le peptide ß-CN(94-123) prévient les altérations de la barrière épithéliale intestinale induite par un stress chronique ou une entérite chimio-induite ainsi que la sévérité de cette dernière, suggérant une application prometteuse dans le traitement de pathologies intestinales. 
Suite à ces résultats, l'action de valorisation de notre projet a été tournée vers la recherche d'un partenariat avec l'industrie pharmaceutique ou agroalimentaire. Dans ce domaine, une demande de bourse CIFRE et un contrat de collaboration avec le groupe Ingredia, acteur majeur du secteur des ingrédients et en particulier des ingrédients laitiers, sont en cours d’instruction ou finalisation. Ils porteront sur une étude de faisabilité de l'utilisation du peptide ß-CN(94-123) en tant qu’ingrédient bioactif.
Publications et brevets : Brevet européen n°EP 2430044(A1) publié le 21/03/2012, en cours d’examen par l’Office Européen des Brevets ; Brevet Français n°2945537 délivré le 09/07/2012.
Les résultats de la tâche 2 du projet feront l'objet d'une présentation orale prévue lors des Journées Francophones d'hépato-gastroentérologie et d'Oncologie digestives (Paris, mars 2014).