Projet ANR-11-BSV4-0025 – MirPain : Les micro-ARNs : de nouveaux candidats pour le contrôle des douleurs chroniques
Programme : Blanc - SVSE 4 - Neurosciences (Blanc SVSE 4)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Marc LANDRY (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION  AQUITAINE LIMOUSIN)
Partenaires : Institut Interdisciplinaire de Neurosciences; Institut Interdisciplinaire de Neurosciences
Montant : 344000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Définir le rôle causal des microARN dans la sensibilisation aux douleurs chroniquesNous cherchons à montrer le rôle de microARN dans l’hyperexcitabilité des neurones de la moelle épinière en conditions de douleurs neuropathiques. Nous voulons également identifier des microARN candidats qui seraient susceptibles de représenter de nouvelles cibles thérapeutiques, contrôlant en amont l’expression de molécules clés dans la physiopathologie des douleurs chroniques.
Mise en évidence du rôle des miRNA sur des modèles animaux de douleurs neuropathiquesL’incidence des douleurs chroniques est estimée à 20-25% de la population mondiale. Ces douleurs représentent donc un réel problème de santé publique. Toutefois, peu de patients obtiennent un soulagement complet à l’aide des traitements actuellement disponibles, et seulement la moitié de ces patients décrivent un soulagement qui reste médiocre. Le maintien à long terme des douleurs chroniques implique une modification des circuits de la nociception De telles modifications à long terme reposent essentiellement sur des changements d’expression génique, qui affectent largement la moelle épinière en conditions douloureuses. Les microARN (miRNA) représentent une nouvelle classe d’acides nucléiques capables de réguler la synthèse des protéines.Les objectifs initiaux du projet étaient de démontrer le rôle spécifique de certains micro ARNs (miRNAs) dans le contrôle de l’excitabilité neuronale qui sous-tend la sensibilisation à la douleur dans la moelle épinière. L’objectif secondaire était d’évaluer le potentiel thérapeutique des miRNAs dans le cadre d’études précliniques sur modèles animaux de douleurs neuropathiques. Le projet visait à combiner un ensemble de techniques complémentaires pour étudier les effets de miRNAs sur l’expression et la fonction de récepteurs et de canaux membranaires dans des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière.Le contrôle exercé par les miRNA est susceptible d’exercer un ajustement fin de l’expression génique dans les neurones spinaux. Dans cette perspective, notre projet se proposait d’être pionnier dans  l’étude expérimentale du rôle fonctionnel des miRNA dans l’excitabilité des neurones spinaux, et plus particulièrement des neurones de projection qui intègrent les entrées douloureuses spinales. Il visait également à tester sur l’animal les conséquences comportementales de traitements visant à moduler le taux des miRNAs candidats.
Un ensemble de méthodes complémentairesLes études proposées ici reposent sur une vaste palette de techniques complémentaires, de l’étude in vitro sur cultures cellulaires, à l’étude comportementale in vivo sur des modèles animaux de douleurs chroniques.Les méthodes de biologie moléculaire permettent de réaliser des constructions génétiques nécessaires à l’expression de protéines recombinantes, et à l’étude des miRNAs. Les cultures cellulaires offrent la possibilité de tester ces mêmes constructions et d’analyser les effets de ces protéines recombinantes sur la physiologie cellulaire. Les approches d’électrophysiologie permettent des études fonctionnelles sur plusieurs types de préparations biologiques, depuis les cultures cellulaires jusqu’aux neurones spinaux enregistrés chez l’animal anesthésié. Enfin, les tests sensoriels donnent une mesure du comportement douloureux chez des animaux contrôles et chez des modèles de douleurs neurpathiques.
Résumé de la soumission : La douleur physiologique a un rôle protecteur. Au contraire, la douleur chronique repose sur une plasticité inadaptée qui induit une sensibilisation des neurones de la moelle dorsale. Ces modifications durables résultent d’un changement global de l’expression génique. Mais la manière dont les lésions nerveuses participent à ce changement et contribuent aux douleurs chroniques reste peu connue.Notre projet vise à savoir comment le contrôle traductionnel de canaux clés de la membrane plasmique est impliqué dans l’hyperexcitabilité neuronale et les douleurs chroniques. Nous considérerons des micro-ARNs (miARNs) qui répriment la traduction en se liant à leurs ARNm cibles. Nous démontrerons leur rôle causal dans l’hyperexcitabilité à long terme dans un modèle de douleurs neuropathiques chez le rat. Nous ciblerons deux types de mécanismes complémentaires, la plasticité synaptique et la plasticité neuronale intrinsèque.Ce projet comprend 3 tâches et impliquera 3 partenaires : Marc Landry (miARN et propriétés intrinsèques), Olivier Thoumine (récepteurs AMPA (AMPARs) et plasticité synaptique), et Yves De Koninck (délétion des miARNs dans les neurones de projection spinaux).Tâche 1 (O. Thoumine) : Au niveau synaptique, les récepteurs glutamatergique AMPA relaient les entrées nociceptives. Des changements dans la synthèse et le trafic de leurs sous-unités jouent un rôle critique dans les douleurs chroniques. Par des analyses bioinformatiques nous avons sélectionné des miARNs susceptibles de réguler la synthèse des sous-unités des AMPARs. Nous voulons identifier lesquels d’entre eux sont impliqués dans les modifications d’expression lors de douleur chronique. Nous avons restreint notre criblage en montrant que l’ajustement homéostatique, une forme de plasticité synaptique dépendante des AMPARs, est corrélée à la diminution d’expression de quelques miARNs. Nous allons rechercher ceux qui se lient effectivement aux ARNm des AMPARs à l’aide d’un test à la Luciférase. L’impact des miARNs retenus sera évalué sur l’expression et la fonction synaptique des sous-unités AMPARs en cultures primaires. Enfin, des injections intrathécales de ces miARNs, ou de leurs inhibiteurs, seront réalisées chez des rats Sham ou neuropathiques, et le comportement douloureux sera mesuré afin d’évaluer la capacité des miRNAs à réguler les seuils douloureux.Tâche 2 (M. Landry) : Nous avons démontré le rôle critique des canaux calciques L Cav1.2 dans la régulation des propriétés intrinsèques de décharge, et de l’expression génique dans les neurones spinaux. Nous avons identifié un miARN, miR103, susceptible de réguler de façon intégrée les trois sous-unités des canaux Cav1.2. MiR103 diminue ainsi dans la moelle épinière de rats neuropathiques, et son injection intrathécale réduit la sensibilisation douloureuse. Notre objectif est de déchiffrer le mode d’action de miR103, et s’il passe par la modulation des trois sous-unités de Cav1.2. Nous confirmerons d’abord la liaison de miR103 aux trois ARMm. Nous étudierons ensuite, la répression par miR103 de la synthèse des sous-unités de Cav1.2 après transfection de cultures neuronales avec miR103 ou son inhibiteur. L’imagerie calcique dans ces cultures documentera la régulation fonctionnelle de Cav1.2 par miR103. Les effets de miR103 sur l’expression de Cav1.2 in vivo seront évalués après injection intrathécale de miARN ou son inhibiteur, chez des rats shams ou neuropathiques.Tâche 3 (Y. De Koninck) : Nous ciblerons des modifications d’expression de miARNs dans des neurones spinaux de projection. Pour cela, nous injecterons dans le thalamus des constructions virales exprimant des miARNs ou leur inhibiteur, qui seront transportés de façon rétrograde dans les neurones de projection spino-thalamiques. Nous évaluerons leurs effets sur le comportement douloureux.Nos travaux seront les premiers à démontrer l’implication fonctionnelle des miARNs dans la douleur chronique par un contrôle intégré de plusieurs cibles.
Résultats : Les résultats obtenus à mi-parcours sont encore partiels. En ce qui concerne la tâche 3, nous maîtrisons désormais les outils nécessaires à l’étude des miRNAs dans une sous-population de neurones de la moelle épinière qui projettent l’information douloureuse vers le cerveau. Nous pouvons en particulier injecter un virus porteur d’une construction génétique dans un site de projection du cerveau, le thalamus ou l’aire parabrachiale, puis laisser ce virus migrer vers les corps cellulaires d’origine. C’est dans ces neurones que le virus pourra s’exprimer et modifier le contenu en miRNA.
Les activités liées à la tâche 2 sont en très grande partie achevées. Nous avons ainsi démontré le rôle causal de miR-103 dans l’hyperexcitabilité des neurones spinaux. En conditions normales, miR-103 réprime l’expression du canal calcique Cav1.2. En conditions neuropathiques, ce blocage est levé et le canal calcique est surexprimé. Nous avions déjà montré que cette surexpression est responsable d’une activation exagérée des neurones spinaux, en particulier des neurones de projection. Nous démontrons ici que la diminution d’expression de miR-103 en conditions douloureuses a les mêmes conséquences. De plus, les effets de miR-103 sont spécifiques du sous-type Cav1.2 mais le miRNA n’affecte pas le fonctionnement d’autres canaux calciques, tels que le sous-type Cav1.3, pourtant très proche structurellement. Enfin, les modifications d’expression de miR-103 ont des conséquences majeures sur le comportement douloureux des modèles animaux testés dans notre éude.
Les résultats obtenus ont permis à notre équipe d’être invitée à de nombreuses conférences nationales et internationales depuis deux ans. Ils nous ont également valu de participer à un consortium international qui a obtenu un important financement européen dans le cadre d’un appel d’offre dédié aux douleurs chroniques.
Perspectives : Nos travaux posent les bases de l’utilisation des miRNAs comme cibles thérapeutiques dans le traitement des douleurs chroniques.
Publications et brevets : Nous avons publié un article important dans EMBO Journal sur le rôle de miR-103 dans le contrôle de l’expression des canaux calciques Cav1.2, et du comportement douloureux. Ces données pré-cliniques démontrent le rôle causal des miRNA dans les douleurs chroniques. Cet article représente l’une des toutes premières publications à l’appui de ce nouveau concept.