Projet ANR-12-BSV8-0018 – VARIZOME : Analyse structurale et fonctionnelle des mechanisms de deposition/echange de l’histone H2AZ.
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur ALI HAMICHE (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire)
Partenaires : Institut Albert Bonniot - Ontogenèse et Oncogenèse Moléculaire; Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire
Montant : 500000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : VariZomeStructural and functional analysis of the histone variant H2AZ deposition/exchange mechanisms.
Specialized nucleosomes to control genome function in normal and pathologic situationsThe genome is organized within cell in association with proteins to form chromatin that is controlling genome activity. Genome activity is influenced by past events that occurred during organism development and adult life thanks to epigenetic memory. When epigenetic memory fails, cells dysfunction, and this can lead in particular to cancer. Chromatin is one of the key player of epigenetic memory. The local replacement of regular nucleosomes by specialized nucleosomes containing histone variants result in highly significant structural alterations of chromatin that modify the way the underlying genome is interpreted. To understand the function of this epigenetic memory and to analyze its dysfunction in cancer, we have characterized the machineries that are allowing the replacement of standard nucleosomes by the H2AZ variant and we have mapped the regions of the genomes where this histone variant is enriched. Our initial prediction was that we should identify in this way key players of tumorigenesis allowing a better understanding of their role in cancer. Our results fulfilled our prediction.
Combination of genomic and biochemical approachesTo study the machineries responsible for the deposition of the histone variant H2AZ, we have used biochemical approaches based upon the purification of protein complexes associated to this histone variant followed by mass spectrometry characterization. This was allowed by the expression in cells of tagged histone variant that carried a specific motif allowing its immunopurification. We have also used this tagged variant to identify the genomic regions where it is enriched. This was achieved through immunopurification of the chromatin and high-throughput sequencing of the corresponding DNA. We have also studied the consequence of the inactivation of the gene coding for one of the deposition factors to identify genomic regions where this factor was playing a key role in the deposition of this variant.
Résumé de la soumission : Les histones variantes sont des isoformes non alléliques des histones conventionnelles, qui sont déposées sur la chromatine par des complexes de déposition hautement spécialisés. Ces complexes sont souvent composés de chaperonnes d'histones et de facteurs de remodelage de la chromatine. Ce projet vise une meilleure compréhension du rôle de l'histone variante H2AZ et de ses machineries de déposition ou d’échange, dans le contrôle de l'activité épigénétique du génome des mammifères. Du'un point de vue fonctionnel, H2AZ est l'une des variantes d’histones les plus étudiées durant ces dernières années. Les informations fonctionnelles recueillies à ce jour, suggèrent un rôle physiologique important dans l'établissement et le maintien des différents états chromatiniens. H2AZ est une protéine hautement conservée, indispensable à la survie de divers organismes. Cependant, la fonction de cette histone variante reste, extrêmement controversée. H2AZ joue un rôle important dans le remodelage de la chromatine lors de la transcription et la réparation de l'ADN. Toutefois, son rôle n'est pas clair et il reste beaucoup à faire pour comprendre sa fonction dans ces divers processus biologiques. Dans ce projet, nous proposons d'étudier la fonction biologique de H2AZ en utilisant des approches biochimiques combinées à des études structurales et fonctionnelles. Nous visons à mieux comprendre le rôle joué par H2AZ dans la régulation des gènes, l'intégrité du génome et les phénomènes épigénétiques. Nous souhaitons particulièrement comprendre le mécanisme de déposition / échange de H2AZ au niveau des régions spécifiques de la chromatine et clarifier le rôle des chaperonnes d’histones dans ces phénomènes. La nouveauté du projet réside dans la combinaison de différentes expertises qui devraient permettre d'aborder des questions importantes qui n’ont eu, jusqu’à présent, que des réponses fragmentaires. Une compréhension des mécanismes moléculaires de déposition / échange de H2AZ est nécessaire pour acquérir une vue pertinente sur sa fonction, en particulier dans le contrôle épigénétique de l'expression génique et l'intégrité du génome. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les dérégulations épigénétiques survenant dans certaines maladies humaines comme le cancer.
Résultats : We have purified protein complexes associated to both standard histone H2A, as well as its variant H2AZ that is specifically associated with gene promoters. We have identified proteins that are specifically associated to each of these histones, in particular AN32 for H2AZ and NAP-1 for H2A and have shown that they were playing a chaperon function to favor either eviction or deposition. We have mapped sites of H2AZ enrichment within the genome using high-throughput sequencing and have observed enrichment in silenced or poised promoter. Interestingly H2AZ is released from these promoters during transcription activation a prerequisite for the recruitment of PolII. We have also identified large genomic domains where H2AZ enrichment depends on AN32. We have also characterized the structure of the H2AZ/H2B dimer in association with AN32 and dissected their mode of interaction.  We have also analyzed the structural and functional consequences of AN32 binding to H2AZ nucleosomes that results in the eviction of H2AZ from the nucleosome. Altogether, these characterizations allow a better understanding of how the structural alterations of the nucleosome have an impact on genome function.
Perspectives : Our observations that different sets of genomic regions are affected by mutation of these different factors improve our understanding of the differences between the various tumoral phenotypes. Our structural and functional characterization of certain nucleosomal states offers a mechanistic perspective to better understand the consequences of modifications of the epigenetic memory in both normal and pathologic situations. Understanding the mechanisms involved improves our ability to devise targeted therapeutic approaches.
Publications et brevets : Most of our results have resulted in a scientific publication that is in revision for publication. The additional obtained results are being prepared for publication. 
An32, a histone chaperone specialized in the removal of H2A.Z from chromatin. Arnaud Obri1*, Khalid Ouararhni1*, Marie-Laure Diebold2, Kiran Padmanabhan3, Christophe Papin1, Martin Marek2, Isabelle Stoll1, Stefan Dimitrov3,§, Christophe Romier2, § and Ali Hamiche1,§.