Projet ANR-06-BLAN-0107 – BioRab : Study of Rab6 and Rab27 Function Using Novel In vivo Biotinylation Approach
Programme : Programme blanc (BLANC) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : INSTITUT CURIE - SECTION DE RECHERCHE (INSTITUT CURIE - SECTION DE RECHERCHE)
Partenaires : Institut Curie; Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 240000.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 36 mois
Résumé : Les GTPases de la famille Rab sont des régulateurs essentiels du transport intracellulaire. Sous leur forme active (lié au GTP), les protéines Rab interagissent avec un grand nombre d'effecteurs impliqués dans des fonctions cellulaires diverses. Rab6 est associée avec les membranes de l'appareil de Golgi et régule des voies de transport rétrograde connectant les endosomes et le réticulum endoplasmique via l'appareil de Golgi. Trois isoformes de Rab6 sont connues, deux exprimés de façon ubiquitaire (Rab6A et Rab6A', produits par épissage alternatif d'un même gène) et une isoforme, Rab6B, exprimée préférentiellement dans les cellules neuronales. De nombreux effecteurs de Rab6 ont été identifiés. Parmi eux: GAPCenA, une GAP (« GTPase activating protein ») de Rab6, Rab6IP1 qui lie aussi Rab11, Rab6IP2 (ou ELKS) qui interagit avec plusieurs protéines de la zone active des synapses, la protéine adaptatrice Mint3/X11g connue pour lier APP (« amyloid precursor protein ») et la 5'phosphatase OCRL (protéine mutée dans le syndrome de Lowe). Plusieurs protéines lient aussi les vésicules de transport contenant Rab6 aux microtubules par l'intermédiaire du complexe dynéine/dynactine (Bicaudal et p150Glued) et un moteur de type kinesine (Rabkinesine-6/MKlp2). Cependant, la contribution exacte de chaque isoforme dans la régulation du transport, la nature exacte des molécules transportées et les moteurs moléculaires mis en jeu restent encore mal connus. Rab27a a été la première Rab associé à une pathologie chez l'homme, le syndrome de Griscelli, caractérisé par un disfonctionnement des cellules T cytotoxiques. Rab27a joue un rôle essentiel dans l'exocytose des granules lytiques présents dans ces cellules. Après stimulation antigénique, Rab27a est recruté sur les granules et régule leur transport polarisé vers la synapse immunologique. Ce processus fait intervenir des effecteurs impliqués dans le mouvement et/ou l'ancrage des granules avec la membrane plasmique. Une protéine récemment identifiée, Munc13- 4, est un effecteur important permettant de rendre les granules compétents pour la fusion. Mais d'autres protéines qui restent encore à identifier jouent aussi un rôle. Pour étudier plus avant et mieux caractériser les structures membranaires contenant Rab6 et Rab27a, nous nous proposons de développer une nouvelle approche permettant de biotinyler in vivo les protéines d'intérêt. La liaison de la biotine à l'avidine est de plusieurs ordres de magnitude plus affine que la liaison antigène-anticorps, classiquement utilisée dans les techniques d'immunoisolation de compartiments intracellulaires. Une biotinylation de type enzymatique permet aussi d'obtenir un ciblage spécifique sans avoir recours à des agents chimiques de pontage. Nos résultats préliminaires indiquent que plusieurs protéines peuvent être effectivement biotinylées dans les cellules vivantes en culture sans altération de leur fonction. Ces protéines peuvent être ensuite enrichies sur des billes recouvertes de steptavidine et éluées en utilisant la protéase TEV. A l'aide de cette approche, nous nous proposons de i) caractériser les sous-domaines de l'appareil de Golgi contenant les protéines Rab6A et Rab6A' et d'identifier de nouveaux partenaires par une analyse comparative des protéines éluées et ii) d'isoler ces domaines membranaires pour sélectionner des anticorps recombinants par la technique du « phage display ». Dans une deuxième étape, nous déterminerons les molécules (« cargos ») transportées dans les vésicules contenant Rab6 biotinylée en les isolant sur des billes recouvertes de streptavidine. Nous mettrons ensuite au point des essais in vitro et semi in vitro reconstituant le transport de ces vésicules le long des microtubules pour identifier les moteurs moléculaires impliqués dans leur mouvement. Nous développerons enfin un essai in vitro de formation des vésicules de transport à partir de membranes golgiennes purifiées contenant Rab6 biotinylée. Dans l'autre partie de cett