Projet ANR-11-BSV5-0013 – SeediEPR : Spectroscopie par résonance paramagnétique électronique haut champ d'organismes entiers
Programme : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Sun Un (COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES)
Partenaires : Institut des Sciences du Végétal; Institut de Biologie et de Technologies de Saclay
Montant : 197562.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Hauts champs magnétiques et microondes hautes fréquences pour l’étude d’organismesUtilisation de la résonance paramagnétique électronique haut champ pour l’identification et la quantification in situ d’espèces Mn(II) dans des organismes intacts
Identification et quantification d’espèces manganèse dans les bactéries et les grainesLe manganèse joue un rôle important dans les organismes vivants, incluant la production de l’oxygène planétaire et la protection des organismes contre les effets nocifs des espèces réactives formées à partir d’oxygène. Pourtant, la distribution chimique du manganèse dans les organismes vivants est mal connue. L’objectif principal de ce projet est de caractériser la distribution des espèces dérivées du Mn dans des graines végétales et chez Deinococcus radiodurans. Cette bactérie accumule des concentrations très élevées de manganèse, environ 1000 fois plus que l’homme, ce qui l’aiderait à résister aux radiations ionisantes. Le Mn stocké dans les graine est nécessaire pour démarrer rapidement la photosynthèse lors de la germination. Notre outil principal sera la résonance paramagnétique électronique haut champ (RPE) qui est parfaitement adaptée à la quantification du manganèse.
Application de spectroscopies de pointe en résonance paramagnétique électroniqueL’utilisation de très hauts champs magnétiques (10 T, soit 50000 fois le champ magnétique terrestre) et de microondes à fréquence très élevées (95 à 300 GHz comparé à 1 GHz pour les téléphones portables) nous permet d’obtenir des données très détaillées sur le manganèse à l’intérieur des protéines et des cellules. Il existe très peu de laboratoires au monde capables de faire de telles mesures.
Résumé de la soumission : Le nombre de techniques spectroscopiques capables de suivre des processus biochimiques impliquant des ions métalliques et des radicaux dans des organismes entiers est très limité. Ce projet explore les possibilités d’utilisation des techniques de résonance paramagnétique électronique haut champ (RPEHC) et haute fréquence microonde à cette fin. Le premier système qui sera étudié sera la graine de la plante modèle Arabidopsis thaliana, en particulier son homéostase et sa chimie radicalaire. Le manganèse joue un rôle crucial dans de nombreux processus, tels que la production photosynthétique d’oxygène et la défense contre le stress oxydant tandis que les radicaux présents dans les graines reflètent des lésions oxydatives. La RPE est idéale pour étudier ces deux espèces paramagnétiques très différentes. Il a déjà été bien établi que la RPEHC est bien supérieure à la RPE 9 GHz classique pour l’étude de radicaux et d’ions Mn(II), la forme prédominante du manganèse dans les organismes. Des mesures préliminaires sur les graines d’Arabidopsis ont montré que des signaux RPEHC bien définis et de haute qualité pouvaient être détectés à partir de ces deux types de centres paramagnétiques. L’objectif principal du projet est de développer des techniques pour élucider très en détail l’identité et la structure électronique de ces centres qui contribuent aux spectres RPEHC. A cette fin, une approche comparative sera suivie et une base de données de petits complexes Mn(II) sera établie. Nous possédons déjà une telle base pour les radicaux, à partir de nos travaux antérieurs. Cette approche comparative sera complétée par l’utilisation de la double résonance électronique nucléaire haut champ 95 GHz (ENDORHC), une technique qui fournit une carte RMN des spins nucléaires (e.g. protons, atomes de phosphore, d’azote) à proximité des centres paramagnétiques. Dans le cas du Mn(II), une structure détaillée de la sphère de ligands autour des centres métalliques sera obtenue, et dans le cas des radicaux, des informations sur l’identité des radicaux et leurs interactions avec leur environnement (e.g. liaisons hydrogène). Une fois que nous aurons établi une base pour les graines d’Arabidopsis, cette connaissance sera utilisée pour étudier les différences et la modification de la spéciation du Mn(II) dans les graines d’autres plantes en fonction d’effets physiologiques tels que l’hydratation/imbibition. L’effet des protéines de transport des métaux sur la spéciation du manganèse sera aussi examiné, en particulier les protéines nramp qui contrôlent le flux du Mn(II) sortant des vacuoles des plantes. Pour les radicaux, l’effet de diverses mutations affectant la biosynthèse des quinones, acides gras et flavonoïdes sera analysé afin d’identifier les radicaux et déterminer leur rôle dans l’apparition des lésions oxydatives et la résistance des graines contre ce stress. Ces mesures seront ensuite étendues à d’autres organismes, notamment : 1) Saccharomyces cerevisiae pour lequel une approche similaire a récemment été entreprise, mais à des fréquences bien plus basses et 2) Deinococcus radiodurans dont il a été montré qu’il possède une capacité exceptionnelle de concentrer de grandes quantités de Mn(II) vacuolaire (> 30 mM). Les approches décrites seront les premières à des fréquences aussi élevées et donneront des informations bien plus détaillées que les études précédentes à fréquences plus faibles. Elles définiront les modalités d’utilisation des techniques RPE haut champ appliquées à l’étude d’organismes entiers.
Résultats : Nous avons déterminé la distribution in situ du manganèse(II) dans des cellules intactes de Deinococcus radiodurans. Ce type d’analyse sur un organisme entier n’a été tenté qu’une seule fois auparavant. Contrairement à cette première analyse, nos mesures sont suffisamment résolues pour nous permettre de détecter le Mn(II) lié aux protéines. Ces mesures nous permettrons de comprendre la fonction de certaines espèces chimiques contenant du manganèse et comment le manganèse pénètre et est transporté à l’intérieur des cellules. Ces travaux sont importants parce que le manganèse est impliqué dans de nombreux processus biologiques majeurs tels que la production d’oxygène par le phostosystème 2 chez les plantes et la protection contre les espèces chimiques réactives. Nos analyses préliminaires montrent aussi que le même type de mesures peut être fait aussi sur des graines.
Perspectives : Ce projet a débuté il y a moins de 6 mois. Il est par conséquence difficile d’apprécier précisément quel sera son impact.
Publications et brevets : Un article sur nos résultats initiaux sur l’identification des espèces manganèse dans Deinococcus radiodurans et comment elles changent en fonction du temps a été soumis dans la revue Journal of the American Chemical Society.