Projet ANR-14-CE09-0001 – RiboFLEX : Etudes structurales de complexes ribosomaux contenant des peptides naissants préparés à l’aide de flexizymes
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401) 2014
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Monsieur Axel INNIS (ARN: Régulations Naturelle et Artificielle (ARNA) - U869)
Partenaires : Laboratoire public; Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets; University of Munich; UIC University of Illinois at Chicago
Montant : 309920.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 48 mois
Résumé : Les ribosomes sont de grands complexes ribonucléoprotéiques chargés de décoder et de traduire l'information génétique en protéines. Durant le processus de traduction, les peptides naissants doivent transiter par le long tunnel de sortie qui traverse la grande sous-unité du ribosome afin d’atteindre le milieu intracellulaire. Initialement jugé comme un simple conduit à protéines, ce tunnel est désormais élevé au rang de microenvironnement fonctionnel dans lequel des signaux codés par certains peptides naissants sont relayés vers le site actif du ribosome pour en moduler l’activité. Dans certains cas, la chaîne naissante peut provoquer l’arrêt complet de la traduction, conduisant ainsi à la formation d’un complexe ribosomal bloqué sur l'ARNm. L’arrêt de la traduction par le peptide naissant dépend avant tout de la séquence du peptide en cours de synthèse, mais peut également nécessiter une petite molécule telle qu'un antibiotique ou un acide aminé agissant comme cofacteur. Ce phénomène a été observé chez les procaryotes et les eucaryotes, où il régule l'expression de divers gènes en facilitant ou en bloquant leur accès par l’appareil traductionnel.
Ce projet porte sur deux des exemples les mieux caractérisés de régulation de la traduction par le peptide naissant: (i) l’arrêt de la synthèse des peptides Erm en réponse aux antibiotiques de la famille des macrolides, et (ii) l’arrêt du ribosome sur des tronçons de l'ARNm codant pour des prolines consécutives et sa délivrance par le facteur de traduction EF-P. Nos connaissances actuelles dans ce domaine proviennent de deux sources majeures: les études biochimiques et la cryo-microscopie électronique à résolution moyenne (cryo-EM). Diverses études ont ainsi montré que les peptides d'arrêt sont structurés dans le tunnel de sortie, forment des interactions spécifiques avec le ribosome et altèrent la géométrie du site actif du ribosome afin de bloquer la formation de la liaison peptidique ou l’hydrolyse du peptidyl-ARNt par les facteurs de terminaison. Cependant, un certain nombre de questions demeure concernant la façon dont se déroule le processus d'arrêt. Par ailleurs, un portrait complet de cet aspect fondamental de la biologie du ribosome pourrait permettre la conception d'antibiotiques améliorés qui ciblent le ribosome en imitant les propriétés physico-chimiques des peptides naissants inhibiteurs et de leurs cofacteurs. Des structures à résolution atomique de complexes ribosomaux comportant divers peptidyl-ARNt sont donc nécessaires pour accéder à une compréhension plus approfondie de ce phénomène.
Le but de ce projet est d'obtenir de telles structures par la méthode de la cristallographie aux rayons X et d’utiliser les connaissances tirées de ces structures pour guider des études structure-fonction visant à comprendre comment le ribosome détecte et répond à différentes chaînes naissantes. Jusqu'à présent, de tels complexes ont été préparés à partir de systèmes de traduction in vitro provenant d'un extrait cellulaire ou reconstitués à partir de facteurs de traduction purifiés. Bien que ces méthodes permettent de préparer des complexes ribosomaux en grandes quantités, elles présentent cependant un certain nombre d'inconvénients pour la cristallographie aux rayons X, à commencer par une certaine hétérogénéité moléculaire. Afin de surmonter ces problèmes, nous proposons d'attacher des peptides activés synthétiques à des ARNt à l'aide de petits ribozymes connues sous le nom de flexizymes. En jumelant un groupe partant approprié sur le substrat peptidique avec un flexizyme compatible, pratiquement n'importe quel acide aminé ou peptide peut être fixé sur un ARNt avec une extrémité 3' intacte. Les peptidyl-ARNt obtenus de cette manière peuvent ensuite être ajoutés au ribosome en trans pour mener à bien des études structurales, contournant de ce fait une partie des problèmes associés à la synthèse des peptides en cis par le ribosome.
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