Projet ANR-06-PCVI-0015 – IMFOVIR : Imagerie structurale et fonctionnelle des complexes de réplication rétroviraux
Programme : Physique et Chimie du Vivant (PCV) (PCV) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : ECOLE NORMALE SUPERIEURE CACHAN (ECOLE NORMALE SUPERIEURE CACHAN)
Partenaires : École normale supérieure de Cachan; École normale supérieure de Cachan; École normale supérieure de Cachan; École normale supérieure de Cachan
Montant : 400000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : 1-Contexte scientifique et objectifs du projet : -  L'émergence récente et répétée de maladies à virus, notamment des virus à ARN au premier rang desquels le VIH, impose de trouver de nouvelles approches pour l'identification de cibles pharmacologiques. De ce point de vue, l'identification des composants des complexes réplicatifs viraux, de leurs interactions et l'élucidation de la dynamique d'assemblage de ces complexes au cours du cycle réplicatif nécessite le développement de nouvelles méthodes permettant leur observation directe à l'échelle d'un virus unique dans les cellules infectées. Dans ce contexte, ce projet vise à développer une série de méthodes innovantes basées sur la fluorescence résolue en temps, l'imagerie par résonance de plasmons de surface et des lasers pulsés ultra-rapides pour déterminer la dynamique structurale et fonctionnelle des complexes réplicatifs. Cette stratégie nécessite la présence d'un observable impliqué dans l'architecture structurale et fonctionnelle de tels complexes. Dans le cas particulier du VIH-1, les phases précoces de la réplication conduisent à l'intégration du génome viral dans l'ADN cellulaire par un complexe nucléoprotéique pré-intégratif (CPI) contenant a minima l'intégrase rétrovirale. Nous proposons donc d'utiliser celle-ci comme marqueur à partir d'une innovation critique consistant en un marquage sélectif au sein d'une particule virale de façon à suivre l'évolution d'un complexe unique dont nous déterminerons par ailleurs la compostion. -  -  2-Description du projet, méthodologie : -  Le premier objectif est le développement d'une approche novatrice de marquage enzymatique de l'intégrase permettant i) une étude in vitro à très basse concentration des interactions entre composants du CPI et ii) une approche cellulaire produisant des virions fonctionnels marqués soit par un fluorophore soit par une étiquette permettant la récupération et la caractérisation des complexes réplicatifs. Nous utiliserons pour ce faire l'activité spécifique de la transglutaminase exprimée soit in vitro soit dans les cellules productrices d'un virus codant pour une intégrase portant un signal de modification spécifique. Les complexes réplicatifs étiquetés seront isolés par immuno-affinité. Nous proposons d'appliquer les techniques émergeantes suivantes pour en déterminer la composition : le SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation) et un système propriétaire comprenant un appareil de résonance plasmonique de surface (SPR) en amont de dispositifs d'analyse par spectrométrie de masse. Les assemblages des différents partenaires seront caractérisées par l'imagerie de résonance plasmonique de surface (SPRi), par anisotropie de fluorescence résolue en temps, par spectroscopie de corrélation et de corrélation croisée de fluorescence, l'évaluation des distances entre partenaires étant déterminée par mesure des transferts d'énergie. Les virions contentant l'enzyme étiquetée seront utilisés pour une étude par imagerie intra-cellulaire. La présence des complexes et leurs trajectoires sera mise en évidence par imagerie cellulaire en intensité de fluorescence à champ large avec une caméra CCD sensible. Nous chercherons également à caractériser la réorganisation du CPI résultant des interactions entre l'intégrase et les autres composantes du complexe lors des différentes étapes du transit du virion vers le noyau. Pour cela, nous utiliserons l'anisotropie de fluorescence et la mesure des temps de vie de fluorescence en cellule, qui renseigneront sur la dynamique rapide au sein complexe. La mesure des coefficients de diffusion latérale nous renseignera sur la taille des assemblages. Enfin la stratégie de marquage intracellulaire sera étendue aux ligands du CPI en utilisant différent fluorophores permettant l'étude des interactions entre partenaires par spectroscopie de corrélation croisée. L'ensemble de cette méthodologie est destinée à être appliqué d'une part pour la caractérisation des défauts réplicat