Projet ANR-10-BLAN-1601 – Phospho-Cav : Spectrométrie de masse et analyses fonctionnelles pour une étude globale de la phosphorylation du canal calcique de type T, Cav3.2
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Philippe LORY (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 354099.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : Identification de nouvelles voies de modulation des canaux calciques de type TIdentifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter l’épilepsie, la douleur, dépend de notre capacité à caractériser de nouvelles cibles. Les canaux calciques de type T en font partie et le challenge relevé par ce projet est d’identifier l’impact de la phosphorylation sur les propriétés fonctionnelles des canaux calciques de type T
La spectrométrie de masse est une approche innovante pour étudier la modulation des canauxL’objectif de Phospho-Cav est l’étude de la phosphorylation des canaux calciques de type T. S’il est aujourd’hui reconnu que ces canaux T sont régulés fonctionnellement par des sérine/thréonine kinases, les modalités de cette régulation sont encore inconnues. Le challenge relevé par le projet Phospho-Cav est d’étudier la phosphorylation de Cav3.2 par une approche de spectrométrie de masse quantitative, permettant l’identification et l’analyse des résidus (sérine/thréonine) effectivement phosphorylés par des kinases modulant ces canaux.    Les trois objectifs majeurs sont :1) d’établir une carte des résidus Ser/Thr effectivement phosphorylés du canal Cav3.2 recombinant par une approche de spectrométrie de masse ; d’étudier la spécificité et la dynamique de phosphorylation de ces résidus.2) de caractériser l’impact de la phosphorylation de ces résidus sur les propriétés électrophysiologiques et le trafic cellulaire des canaux Cav3.2 en expression hétérologue (mutagénèse dirigée, études en patch-clamp).3) d’identifier par spectrométrie de masse, l’état de phosphorylation des canaux Cav3.2 neuronaux (natifs) et d’évaluer l’impact de cette phosphorylation dans la différenciation neuronale et dans un modèle d’épilepsie.
Spectrométrie de masse et électrophysiologie pour l’étude des canaux calciques de type TLe projet Phospho-Cav s’appuie sur le savoir-faire de la plateforme de protéomique de Montpellier (PPM), ainsi que sur l’expertise en électrophysiologie des canaux calciques de l’équipe du coordinateur, pour l’analyse moléculaire de la phosphorylation des canaux calciques de type T.
Résumé de la soumission : La phosphorylation est la modification post-traductionnelle la plus importante et la plus fréquente comme mécanisme de régulation de l’activité des protéines. Les canaux calciques activés par la dépolarisation membranaire (Cav) dont l’activité est associée à de nombreuses fonctions physiologiques dites « excitables »  sont finement régulés par phosphorylation. C’est le cas des Cav de type T (famille Cav3) et tout particulièrement les canaux Cav3.2 qui jouent un rôle prépondérant dans l’excitabilité neuronale, l’intégration sensorielle ou encore la sécrétion d’hormones. Comprendre la modulation de ces canaux est donc un enjeu majeur aux implications multiples en physiologie et physiopathologie (épilepsie, douleur neuropathique, cancer…). Plusieurs études récentes ont révélé que les canaux Cav3.2 sont directement modulés par plusieurs serine/thréonine kinases. Ces données ouvrent la voie à un nouveau champ d’étude : la phosphorylation de ces canaux, en particulier la recherche des résidus phosphorylés et l’analyse des conséquences fonctionnelles de leur phosphorylation. C’est l’objectif de ce projet.Les canaux Cav3.2, qui font l’objet de nombreuses études chez le partenaire 1 présentent la caractéristique d’être directement phosphorylés (résultats préliminaires) et modulés fonctionnellement par plusieurs protéines kinase (PKA, PKC, …) en expression hétérologue. Les approches classiques, n’ont pas permis d’identifier avec confiance les résidus effectivement phosphorylés et responsables d’effets physiologiques sur ces canaux. Aujourd’hui, l’étude de la phosphorylation peut bénéficier d’une approche par spectrométrie de masse, pour identifier les résidus effectivement phosphorylés. Cette stratégie, développée par le partenaire 2, a récemment été utilisée avec succès pour caractériser l’état de phosphorylation d’autres canaux ioniques (Kv).Le projet "Phospho-Cav" visera à (1) mettre en place une approche de systématique pour identifier les résidus potentiellement importants pour la régulation de Cav3.2 (immuno-purification, établissement d’une carte des résidus phosphorylés par spectrométrie de masse). Pour cette partie du projet un canal Cav3.2 étiqueté avec un tag hemagglutinine (HA-Cav3.2) sera utilisé. (2) Une approche SILAC sera mise en place pour estimer la nature différentielle de la phosphorylation sur ces résidus, en présence d’activateurs/inhibiteurs de protéines kinases ou de phosphatases. (3) La fonctionnalité de ces résidus sera étudié. Des mutants (Ser(Thr)/Ala, Ser(Thr)/Asp) seront générés par mutagénèse dirigée et étudiés en expression hétérologue en cellule de mammifère (propriétés électrophysiologiques, trafic cellulaire…). (4) Des anticorps spécifiques de Cav3.2 seront caractérisés afin de réaliser l’immuno-purification des canaux Cav3.2 natifs, à partir i) d’une lignée neuroblastome (NG108-15) pour laquelle les canaux Cav3.2 jouent un rôle dans la différenciation ; ii) de l’hippocampe de souris dans lequel l’expression des canaux Cav3.2 est augmentée sur un modèle d’épilepsie du lobe temporal. (5) La spectrométrie de masse sera ici utilisée pour identifier l’état de phosphorylation de Cav3.2 dans le contexte physiologique et pathologique. (6) L’identification de nouveaux résidus phosphorylés dans ces situations physiologiques et physiopathologiques fera également l’objet d’études en expression hétérologue comme décrit précédemment (3).Ce projet permettra d’établir la première carte de phosphorylation, "phospho-map", d’un canal calcique, Cav3.2. Les régulations différentielles sur les résidus identifiés comme effectivement phosphorylés, "sites actifs ", seront validées fonctionnellement, en expression hétérologue. La mise en place d’une approche globale de l’étude de la phosphorylation de Cav3.2 permettra une analyse compréhensive de cette régulation et devrait une meilleure interprétation de la régulation de ces canaux dans un ensemble de situations physiologiques et pathologiques.
Résultats : Ce projet de recherche fondamentale en cours de développement. Aucun résultat ne peut actuellement faire l’objet d’une communication vers le grand public.
Perspectives : Phospho-Cav est un projet pionnier concernant l’étude globale de la phosphorylation des canaux calciques de type T. Une perspective majeure de ce programme est une meilleure compréhension des mécanismes responsables de maladies neurologiques associées à ces canaux, en particulier l’épilepsie et la douleur.
Publications et brevets : En préparation