Projet ANR-10-BLAN-1329 – FluMA : Conformations différentes de la protéine de matrice M1 du virus de la grippe et leur rôle dans l’entrée et bourgeonnement du virus
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Microbiologie, immunologie, infectiosité (Blanc SVSE 3)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Winfried Weissenhorn (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES)
Partenaires : European Molecular Biology Laboratory
Montant : 200000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 30 mois
Résumé : Conformations différentes de la protéine de matrice M1 du virus de la grippe et leur rôle dans l’entrée et bourgeonnement du virusDétermination de la structure cristallographique de la protéine M1 à différents pH et étude du mécanisme de polymérisation de M1 dans un environnement membranaire.
Détermination des bases structurales de la protéine M1 dans les processus d’entré et bourgeonnement du virus de la grippeLe bourgeonnement du virus de la grippe est indépendant du système ESCRT-III et notre hypothèse est que la protéine matrice M1 joue un rôle majeur et similaire aux protéines ESCRT-III. Notre premier objectif est la détermination des bases structurales de l’assemblage de M1. Le désassemblage de M1 pendant l’entrée virale est réglé par le pH endosomal. Notre second objectif est la détermination de la structure M1 à bas pH afin de comprendre les changements de conformation de M1 associés au cycle viral.
Cristallogenèse de M1 et expériences avec des GUVNotre but est la cristallogenèse de la protéine M1 du virus de la grippe. En parallèle nous avons établi le protocole pour la formation du complexe entre M1 et des fragments d’anticorps Fab spécifiques pour faciliter la cristallogenèse. Les cristaux permettront la détermination de la structure du M1 par cristallographie. Dans une deuxième partie nous étudions la formation de la capside par M1 en utilisant le système GUV et des liposomes traités par M1 et étudies par la microscopie électronique.
Résumé de la soumission : Les virus Influenza sont des virus enveloppés à ARN simple brin segmenté à polarité négative qui appartiennent à la famille des Orthomyxoviridae. Leur génome code pour trois compartiments viraux majeurs soient l’enveloppe virale qui contient l’hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA) et le canal ionique formé par la protéine tétramérique M2,  un manteau protéique sous-membranaire formé par la protéine matricielle M1, et au centre la ribonucléocapside virale constituée par l’association entre la nucléoprotéine avec l’ARN génomique et le complexe polymérase (RNP, Ribo-nucléo-complexes). Les virus Influenza pénètrent dans la cellule par endocytose et l’acidification du compartiment endosomal  induit en effet un changement de conformation de la molécule  HA qui permet la fusion des membranes virales et cellulaire. En même temps l’acidification de l’intérieur du virion, médiée par le canal ionique M2, est nécessaire à leur propagation et responsable de la dissociation des RNP viraux de la couche de protéine matricielle M1 qui tapisse la face interne de la membrane virale. La protéine M1 joue elle aussi un rôle essentiel lors de l’assemblage et du bourgeonnement des virions dans le milieu extracellulaire. Ce rôle semble être indépendant de la machinerie ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) dont le recrutement par de nombreux virus enveloppés en favorise le bourgeonnement. La base structurale du rôle joué par la protéine M1 au cours de ces évènements (dissociation à pH acide, assemblage et bourgeonnement) est peu connue. Ce projet a pour objectif l’étude structurale exhaustive de la protéine matricielle M1. Bien que la structure cristallographique du domaine N-terminal soit connue, aucune information n’est disponible quant au domaine C-terminal. Notre hypothèse de travail est  que la connaissance de la structure de la protéine M1 dans son intégralité devrait nous apporter des informations précieuses quant à sa fonction au cours des étapes clefs de la réplication virale que sont la dissociation M1-RPN à pH acide, l’assemblage et le bourgeonnement. Notre objectif se décline en deux points essentiels : (i) Déterminer la structure cristallographique de la protéine M1 à pH neutre et à un pH acide mimant le compartiment endosomal  (ii) caractériser les déterminants structuraux nécessaires à la polymérisation de M1 et à la formation du manteau protéique. Ce travail devrait nous permettre de comprendre quels sont les changements conformationnels  de M1 qui accompagnent  la dissociation de M1 des RNP viraux au cours de l’endocytose. Les détails structuraux de M1 à pH neutre ou acide pourront ensuite être exploités pour développer  des agents anti-viraux inhibiteurs de la fusion et l’entrée.  De plus, nos résultats  nous permettrons de déterminer si, comme nous pensons que c’est le cas, la protéine M1 possède des analogies structurales avec les protéines de la machinerie ESCRT-III. L’approche mise en œuvre permettra en effet d’obtenir des images à faible résolution des polymères de M1 et de la formation du manteau. Les données structurales qui seront obtenues à partir de l’analyse de ces images devraient nous permettre de comprendre pourquoi et comment les virus Influenza peuvent bourgeonner dans le milieu extracellulaire indépendamment de la machinerie ESCRT. Les données structurales de la protéine M1 à pH neutre seront aussi utiles au développement d’agents anti-viraux  susceptibles de bloquer l’assemblage des particules virales.
Résultats : Les protocoles de purification de M1 de trois souches différentes et la formation de complexes entre M1 et des fragments FAB ont été établis. Les différentes protéines M1 ont été analysées par SAXS et des enveloppes à basse résolution ont été construites.  L’incubation de la protéine M1, marquée par un fluorophore, avec de vésicules géantes unilamellaires (GUVs) a révélé la formation de tubes induits par M1 à pH neutre.
Perspectives : Nous allons poursuivre nos efforts pour obtenir des informations structurales à haute résolution sur la protéine entière M1. Les essais de cristallogenèse vont continuer et dans le cas où nous n’obtiendrions pas de cristaux, l’étude par RMN sera initiée. 
Nous allons continuer l’analyse de l’effet de M1 sur les vésicules membranaires en utilisant des GUVs et la microscopie confocale. La formation d’assemblages par la protéine M1 sera étudiée plus en détail par microscopie électronique.
Publications et brevets : Production scientifique et brevets depuis le début du projet : Aucun manuscrit ou brevet n’est actuellement en cours de rédaction. La rédaction est prévue pour la deuxième période.