Projet ANR-08-BLAN-0224 – AdoMet : Structure/function relationships in the maturation of protein active sites by radical S-Adenosyl-L-Methionine enzymes
Programme : Blanc (BLANC) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES (COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES)
Partenaires : Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives; Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives; Institut national de la recherche agronomique
Montant : 465392.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 36 mois
Résumé : La chimie radicalaire est au centre de nombreux processus biologiques fondamentaux. Récemment, plusieurs protéines qui utilisent la chimie radicalaire ont été reconnues comme faisant partie de la superfamille de métallo-enzymes reliées dans l'évolution dite « radical S-adénosyl-L-méthionine (SAM ou AdoMet) » (Sofia et al., Nucleic Acids Res (2001) 29, 1097). La présence répandue de ces protéines dans les trois domaines de la vie reflète probablement une ancienne approche mécanistique pour une chimie complexe, irréalisable par des réactions classiques à deux électrons. Elles sont souvent impliquées dans les étapes clés de voies de biosynthèse, très étudiées mais encore non expliquées, de cofacteurs majeurs, des précurseurs de l'ADN, des antibiotiques et des vitamines. Elles jouent aussi un rôle dans la réparation de l'ADN, dans la maturation du tARN et de protéines telles que les nitrogénases et les hydrogénases, et dans l'activation d'autres protéines. Plus de 600 membres de la superfamille des protéines « radical AdoMet » ont été identifiés à ce jour, lesquels initient des réactions radicalaires impliquant un centre Fe4S4 et AdoMet. Le radical 5'-déoxyadénosyl radical (5'-dA•) est généré par le clivage réducteur du cofacteur faisant intervenir le centre FeS. Le mécanisme catalytique dépendra alors de la réaction effectuée. L'insertion d'un atome de soufre, catalysée par la biotine synthétase (BioB) et la synthétase d'acide lipoïque (LipA), est une des réactions les plus remarquables effectuée par des enzymes dépendantes du radical AdoMet. Bien que des structures tridimensionnelles de quelques unes de ces protéines soient disponibles, jusqu'à présent il a été difficile d'établir leur mécanisme catalytique. Un des problèmes majeurs est leur sensibilité à l'oxygène. Les enzymes AdoMet recombinantes peuvent être obtenues à partir de cultures d'Escherichia coli en aérobie. Toutefois, après reconstitution du centre FeS et fixation de AdoMet, certaines protéines sont instables en solution et doivent être manipulées dans des conditions strictes d'anoxie. Nous envisageons de résoudre la structure de six de ces protéines afin de déterminer les éléments qui déterminent la spécificité de leur réaction et les caractéristiques communes de la chimie radicalaire sous-jacente: HydE et HydG sont deux des trois protéines récemment identifiées comme responsables de la maturation du site actif des hydrogénases à [FeFe]; HmdB est probablement impliquée dans la maturation de l'hydrogénase dépourvue de centre FeS; NifB fait partie des nombreuses protéines impliquées dans la maturation du cofacteur FeMo de la nitrogénase; PylB génère un acide aminé modifié appelé pyrrolysine qui a été observé dans le site actif des méthyltransférases d'archées méthanogènes; et anSME appartient à une classe d'enzymes qui oxyde les sulfatases qui contiennent une serine ou une cystéine. Dans certains cas, bien que les caractéristiques générales des réactions soient claires, la nature du substrat n'est pas connue. Ceci est particulièrement vrai pour les maturases HydE et HydG impliquées dans la synthèse du site actif de l'hydrogénase à [FeFe] qui nécessite probablement l'insertion d'un atome de soufre sur un carbone aliphatique. Nous avons très récemment obtenu la structure à haute résolution de HydE mais la nature des réactifs reste inconnue. La recherche des substrats sera effectuée en solution et dans les cristaux en utilisant les molécules inspirées des résultats de « docking » in silico. Les molécules qui ne sont pas disponibles seront synthétisées dans le consortium. Quand la structure d'une ou plusieurs des enzymes sélectionnées sera résolue, la mutagenèse dirigée sera utilisée pour déterminer les résidus essentiels à la catalyse et a la fixation des substrats/produits. Cet effort concerté devrait apporter un nouvel éclairage sur la chimie passionnante effectuée par cette famille d'enzymes.