Projet ANR-10-BLAN-1512 – TELOLOOP : Rôle de la protéine TRF2 et de ses partenaires dans la formation et la stabilité de la t-loop des télomères humains
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Marie-Josèphe GIRAUD-PANIS (CNRS - DELEGATION REGIONALE COTE D'AZUR)
Partenaires : Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; CENTRE EUROPEEN DE RECHERCHE EN BIOLOGIE ET EN MEDECINE; Laboratoire de Biologie et Pathologie des Génomes; Institut de Biologie et de Technologies de Saclay; Instabilité du Génome et Cancérogenèse
Montant : 534705.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Connaître et comprendre la structure de l’extrémité des chromosomes humains pour élucider son rôle dans la genèse et la progression des cancersLe but de notre étude est de comprendre comment la protéine TRF2 contrôle la structure des extrémités des chromosomes humains (les télomères), la nature de ces structures et leur modification dans les cellules cancéreuses.
La structure en boucle des télomères humains, formation, stabilité et rôle de la protéine TRF2L’extrémité des chromosomes humains porte une structure appelée Télomère qui joue un rôle crucial dans le cancer et dans le vieillissement. En effet, cette structure est un des garants de la stabilité du génome. Or, les télomères raccourcissent à chaque division de la cellule jusqu’à une taille critique à laquelle ils ne sont plus fonctionnels, entraînant un arrêt de la division des cellules (vieillissement) ou des altérations du génome (formation de tumeurs). De plus, l’allongement des télomères dans les cellules cancéreuses par l’enzyme télomérase (ou de façon minoritaire par recombinaison) est une des étapes clef dans la progression tumorale. L’accès de la télomérase aux télomères, leur protection et donc la vitesse à laquelle ils raccourcissent sont régis par des interactions complexes entre différents acteurs: des protéines spécifiques et un ADN de séquence répétitive. Il a été proposé qu’un des paramètres importants soit la capacité de cet ADN de se replier sous la forme d’une boucle appelée T-loop. Cette boucle permettrait de protéger l’extrémité des chromosomes et de réguler l’accès de la télomérase. Elle serait produite par l’action d’une des protéines des télomères, la protéine TRF2. Le but de notre recherche est de comprendre par quels mécanismes TRF2 est capable de produire cette boucle, quels sont les partenaires de TRF2 qui aident ou inhibent cette propriété, quelle est la stabilité de cette boucle dans les noyaux et quels processus permettent de les éliminer. Nous espérons ainsi pouvoir déterminer les étapes et les acteurs clefs de ce processus de repliement, nous permettant de décrire plus précisément l’organisation et la dynamique des télomères et, peut-être, de définir de nouvelles cibles pour des thérapie anti-cancéreuses futures.
Une approche multidisciplinaire pour un problème complexeNotre étudie allie diverses techniques de la biologie structurale, moléculaire, cellulaire et de la biochimie. Dans les cellules, nous étudions la formation de la T-loop, son élimination et les protéines participant à ces processus. Pour les mécanismes précis, nous construisons des modèles et étudions ces mêmes réactions dans le tube à essai (Biochimie). Enfin les structures 3D sont étudiées par différentes méthodes biophysiques.
Résumé de la soumission : S’il est maintenant acquis que les télomères jouent un rôle crucial dans la stabilité du génome et dans la viabilité des cellules, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces fonctions sont encore à élucider. De nombreuses données attestent du rôle majeur joué par les télomères dans le développement et le maintien des cancers ainsi que dans le vieillissement des organismes. En effet, les télomères raccourcissent à chaque division cellulaire entraînant la sénescence dite réplicative, un phénomène considéré comme anti-tumoral et que l’on pense impliqué dans le vieillissement. Toutefois, ce n’est pas tant la taille des télomères qui définit la fonctionnalité de ces éléments chromosomiques mais d’autres paramètres sont également cruciaux tels que leur repliement et la dynamique des complexes protéiques qui les composent. Dans les cellules humaines, un de ces complexes est particulièrement impliqué  il est nommé shelterin ou télosome. Ce complexe est constitué de 6 protéines télomériques, TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1, POT1. Toutefois, il n’est pas le seul intervenant dans les fonctions télomériques puisque d’autres sous-complexes ont pu être identifiés et il a pu être montré que certaines des protéines qui le composent présentent des fonctions autonomes. Ainsi TRF1 est impliqué dans la régulation de la taille des télomères et POT1 participe à la fois à cette régulation et à la protection des télomères. TRF2 et ses partenaires empêchent la reconnaissance des extrémités télomériques par les protéines de point de contrôle et les recombinases. Le repliement des télomères sous la forme d’une boucle appelée T-loop est pressentie comme un mécanisme important dans cette protection. Cette structure a été observée par microscopie électronique sur des télomères extraits de cellules diverses et se forme in vitro en présence de TRF2 et d’ADN télomérique portant une extrémité simple brin. Certaines données laissent suggérer que la formation de cette boucle implique une invasion en cis de l’extrémité simple brin dans la double hélice. Il se créé ainsi au pied de la boucle une structure complexe portant une « D-loop » (sorte de bulle d’ADN) et une jonction de Holiiday (structure à quatre brins d’ADN connue comme un intermédiaire de la recombinaison génétique homologue). Le partenaire 1 a récemment publié deux articles (Amiard et al., Nature Struct. & Mol. Biol. 2007, Poulet et al., EMBO J 2009) révélant , par des expériences in vitro, deux propriétés intrinsèques de TRF2 qui pourraient participer à la formation et à la maintenance des T-loops: i) TRF2 est capable de stimuler l’invasion d’un simple brin télomérique dans une double hélice par un phénomène de modification de la topologie de l’ADN. ii) Par la fixation de son domaine N-terminal au centre de la jonction de Holliday, TRF2 protège cette structure contre la coupure par les résolvases de la recombinaison homologue. Basé sur ces deux publications, le projet TELOLOOP que nous présentons propose d’explorer à la fois in vitro et dans les cellules la formation de la T-loop, sa sensibilité à différentes activités nucléolytiques et le rôle de TRF2 et de ces partenaires dans ces processus. Organisé en 4 tâches très interdépendantes, ce projet implique 4 partenaires amenant des compétences très variées permettant d’allier ainsi des expériences de biologie cellulaire (Partenaire 1 et 2), de Biochimie (Partenaire 1), de molécule unique (Partenaire 3), de Biologie Structurale (Partenaire 4). L’originalité de ce projet tient d’une part dans cette multidisciplinarité, peu fréquente dans le domaine des télomères, et d’autre part dans l’aspect novateur des concepts qui le sous-tendent. Ainsi nous pensons que le projet TELOLOOP devrait générer des avancées scientifiques à la fois conceptuelles et technologiques importantes.
Résultats : Les études que nous avons réalisées pendant ces derniers 18 mois ont été particulièrement dédiées à la mise en place des techniques et à la production d’outils nécessaires à la suite de notre projet. Nous avons aussi obtenus des résultats significatifs :
- Des résultats que nous avons publiés dans un journal international (Nucleic Acids Research) montrent le rôle important joué par le premier domaine de la protéine TRF2. Ce domaine, suivant sa nature et les modifications qu’il peut subir, peut transformer radicalement les propriétés de cette protéine.
- Nous avons révélés un rôle important de trois protéines dans l’élimination de la T-loop, GEN1, Mus81, SLX4.
- Nous avons mis au jour des domaines fonctionnels dans la protéine SLX4, une des protéines impliquées dans l’élimination de la T-loop qui pourraient jouer un rôle important dans ses fonctions aux télomères.
- Nous avons obtenu l’image 3D à faible résolution de la protéine TRF2 et du complexe entre TRF2 et son partenaire RAP1.
Perspectives : Durant les prochains 18 mois, l’accent sera donné sur quatre axes principaux:
- Les outils biochimiques produits (protéines et ADN) seront utilisés pour élucider le mécanisme de formation des T-loops. Nous espérons ainsi décrire quels domaines de la protéine TRF2 sont impliqués et quels partenaires de cette protéine participent à la réaction.
- Un mutant de TRF2 que nous avons produits va nous permettre de déterminer le rôle exact des T-loop dans la protection des télomères.
- A l’aide de mutants, nous étudierons le rôle des domaines fonctionnels de la protéine SLX4, que nous avons découverts, dans l’élimination des T-loops.
- Nous tenterons d’obtenir des structures 3D des protéines TRF2 et RAP1 seules ou en interaction avec l’ADN à faible et haute résolution (résolution atomique)
Publications et brevets : Nous avons publié un article en commun dans un journal international :
Poulet A, Pisano S, Faivre-Moskalenko C, Pei B, Tauran Y, Haftek-Terreau Z, Brunet F, Le Bihan YV, Ledu MH, Montel F, Hugo N, Amiard S, Argoul F, Chaboud A,  Gilson E, Giraud-Panis MJ. The N-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Research, 2012, 40, 2566-2576.