Projet ANR-15-CE12-0003 – sRNA-FIT : Adaptation par ARN régulateurs chez Staphylococcus aureus
Programme : Génétique et génomique: relation génotype-phénotype, interactions génome-environnement, épigénétique (DS0405) 2015
Année de financement : 2015
Coordinateur du projet : Monsieur Philippe BOULOC (Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC))
Montant : 450000.0 euros
Date de début : 2015
Durée : 48 mois
Résumé : Staphylococcus aureus est responsable de nombreuses pathologies humaines et animales dont les traitements sont souvent rendus difficiles par l’émergence de souches multi-résistantes aux antibiotiques. Notre projet vise à caractériser des ARN régulateurs (ARNrég) de S. aureus impactant sa virulence et la résistance aux antibiotiques.
Les réseaux de régulation géniques sont sous l’influence de nombreux effecteurs et les ARNrég jouent souvent un rôle de modulateurs fins (fine tuning). En conséquence, les phénotypes associés aux ARNrég sont souvent difficiles à détecter. Par exemple, aucun phénotype n’est actuellement connu pour l’absence de RsaE, un ARNrég bactérien conservé qui diminue la quantité des ARN messagers du cycle de Krebs et du métabolisme du folate. Néanmoins, des phénotypes mineurs conférant un avantage modeste peuvent émerger comme un caractère dominant après quelques générations sous une pression sélective comme une croissance dans l’hôte ou en présence d’antibiotique. Dans ce projet, la première étape sera l’identification de phénotypes associés à la disruption de gènes d’ARNrég ; ils seront l’élément déterminant du choix des ARNrég à étudier. 
Le fitness d’une bactérie est la faculté à optimiser sa survie en compétition dans un milieu donné. De faibles différences sont difficiles à observer par cultures "en batch" mais elles peuvent être plus facilement révélées par des expériences de compétition. Ainsi, des phénotypes dépendant d’ARNrég peuvent être mis en évidence en cultivant plusieurs mutants ensembles et en mesurant l'évolution de la proportion de chaque souche au cours du temps. De plus, la croissance en mélange reflète une condition plus naturelle, puisque le fitness d’un mutant peut être affecté par les souches génétiquement différentes présentes dans son environnement. Ces expériences peuvent aussi révéler des patterns d’interaction et épistasie entre différents mutants, certaines combinaisons pouvant-être synergiques ou antagonistes. 
La découverte de phénotypes dus à l’absence d’ARNrég requière habituellement de tester de nombreuses conditions pour chaque mutant, sans assurance de succès. Nous proposons une alternative innovante à ce problème. La substitution de gènes par des séquences d’ADN spécifiques de chaque mutant permet de suivre de nombreux mutants simultanément. Ces codes-barres ADN sont identifiables et quantifiables dans des cultures mixtes. Cette technique développée pour la levure est aussi utilisée pour les bactéries. Dans les études publiées, l’ADN chromosomique des populations de mutants a été extrait, les codes-barres ont été amplifiés par PCR puis quantifiés par hybridation sur des matrices dédiées (micro/macro-array). Ces expériences sont souvent fastidieuses puisque chaque condition nécessite une matrice. Nous avons adapté ce protocole au séquençage massif et créé des amorces spécifiques pour chaque condition permettant d'amplifier tous les codes-barres d’une population. Nos premières expériences montrent que cette approche permet un gain de temps, une meilleure linéarité de la réponse et une réduction importante des coûts puisque nous testons de multiples conditions dans un seul «run» DNA-seq. Nous avons testé 13 conditions de croissance en triplicats avec 40 mutants d’ARNrég : 13 délétions conduisant à l’accumulation ou la disparition des souches les portants dans au moins une condition testée ont été identifiées. 
Par des expériences de mesure de fitness en compétition, nous évaluerons le rôle des ARN régulateurs sur la croissance en présence de différents antibiotiques et dans deux modèles d’infection animale. Nous identifierons les ARNrég impliqués dans la résistance aux agents antibactériens et dans la virulence du Staphylocoque doré. Les cibles de ces ARNrég seront identifiées et le mécanisme moléculaire de leur action déterminé par de techniques novatrices que nous maitrisons, permettant ainsi un décryptage des réseaux de régulation contrôlés par ces ARNrég.