Projet ANR-11-BSV2-0014 – RetroWASH : Remodelage des membranes endosomales par deux machines moléculaires en interaction, le Retromer et le complexe WASH
Programme : Blanc - SVSE 2 - biologie cellulaire et biologie du développement (Blanc SVSE 2) 2011
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Alexis GAUTREAU (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Institut Curie; Institut Curie
Montant : 400000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Les protéines cargos des endosomes précoces suivent diverses voies de recyclage, de dégradation ou rétrograde. Les mécanismes de ce tri sont encore mal compris. La voie rétrograde des endosomes précoces au TGN joue un rôle clé dans de nombreuses situations physiologiques (gradient de morphogène Wnt, trafic de transporteurs, ...) et pathologiques (maladie d'Alzheimer, l'entrée de toxines dans les cellules, ...). Le complexe protéique rétromère est d'une importance cruciale dans tous ces cas-là. Sur la base d'expériences de biologie cellulaire, différents modèles de la fonction du rétromère, en partie contradictoires, ont été proposés. Le modèle du manteau prédit que le rétromère recrute les protéines cargos et génère la courbure, alors que le modèle de scission prédit que le rétromère permet le détachement des intermédiaires du transport rétrograde à partir des endosomes précoces. Les deux modèles ont des prédictions claires que nous testerons directement en reconstituant le processus de tri rétrograde sur membranes modèles. Nous émettons l'hypothèse que le rétromère favorise la scission d'une manière dépendante de l'actine en recrutant le complexe WASH, un facteur de nucléation de l'actine. 
Le rétromère est un complexe multiprotéique qui consiste en un sous-complexe SNX, qui reconnaît les membranes courbes et un sous-complexe VPS, dont on pense qu'il reconnaît les cargos rétrogrades. Le complexe WASH active le complexe Arp2/3, et génére ainsi des réseaux d'actine branchés à la surface des endosomes. En outre, le complexe WASH contient la Protéine de Coiffe, un inhibiteur majeur de la dynamique des filaments d'actine. Le rétromère et le complexe WASH interagissent directement et forment une unité fonctionnelle. En effet, nos groupes ont rapporté que les endosomes précoces tubulaient en réponse à la déplétion de l'une ou de l'autre de ces machineries. Ceci suggère que le rétromère et le complexe WASH collaborent pour favoriser la scission membranaire. WASH recrute la dynamine. Cependant, nos données récentes, et d'autres, étayent l'hypothèse selon laquelle le rétromère, WASH, et le réseau d'actine branché, réorganisent les lipides dans des domaines endosomaux distincts, ce qui favorise la scission membranaire, à cause des forces générées au interfaces.
Ce modèle sera évalué sur des membranes modèles. Le rétromère et le complexe WASH seront obtenus grâce à notre nouvelle technique versatile de purification de complexes multiprotéiques marqués à partir de cellules de mammifères. Ces complexes seront recrutés à la surface des GUVs mimant la composition lipidique des endosomes. Pour générer la courbure des GUVs, des pinces optiques seront utilisées pour tirer un nanotube de lipides de rayon contrôlé, qui mime l'intermédiaire du transport rétrograde. Le recrutement hiérarchisé des différentes machineries marquées et la formation de domaines lipidiques sera suivie par microscopie confocale en fonction de la courbure. En combinant l'extraction de tube avec la FCCS, nous examinerons comment les membranes courbes favorisent l'hétérodimérisation des sous-complexes SNX et VPS, et l'homo-oligomérisation du rétromère complet.
Nous allons reconstituer le réseau d'actine branché particulièrement dense organisé par le complexe WASH à la surface de ces membranes modèles, en utilisant un ensemble minimal de protéines purifiées qui maintiennent la dynamique de l'actine. Nous allons évaluer si l'incorporation de la Protéine de Coiffe dans le complexe WASH est responsable du réseau d'actine dense qui réorganise les domaines lipidiques plutôt que de propulser les endosomes par des comètes d'actine. Nous supposons que le recrutement de WASH sur des membranes courbes va entraîner la polymérisation de l'actine, la formation de domaines lipidiques, et la scission spontanée, déclenchée par les forces générées au interfaces. Nous nous attendons à ce que ce modèle ait un large impact conceptuel sur la communauté de biologistes s'interessant aux membranes.