Projet ANR-10-BLAN-1526 – TOLLREG : Régulation de l’activité des protéases Tolloïdes au cours du remodelage tissulaire: étude structurale des mécanismes impliqués, conception d’inhibiteurs innovants et de sondes de type "activity-based probes"
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Catherine MOALI (CNRS - DELEGATION REGIONALE RHONE-AUVERGNE)
Partenaires : Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives; Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique
Montant : 485000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Vers de nouveaux inhibiteurs des protéases Tolloïdes pour traiter les fibrosesEtude des mécanismes de régulation des protéases Tolloïdes par leurs protéines régulatrices endogènes et application au développement d’inhibiteurs synthétiques
Vers de nouveaux inhibiteurs des protéases Tolloïdes pour traiter les fibrosesLes métalloprotéases Tolloïdes jouent un rôle majeur au cours du développement embryonnaire et de la réparation tissulaire en synchronisant la synthèse de la matrice extracellulaire avec l’activation de certains facteurs de croissance. Le dépôt excessif de matrice extracellulaire, constitué majoritairement de collagènes, est la caractéristique la plus invalidante des pathologies de type fibroses qui constituent l’une des causes majeures de handicap et de mortalité dans le monde. Il paraît donc important de comprendre comment l’activité des Tolloïdes est régulée, au niveau mécanistique et structural, pour proposer de nouvelles voies thérapeutiques. Ce projet est centré sur les molécules régulatrices des protéases Tolloïdes susceptibles d’affecter le dépôt des collagènes fibrillaires, c’est-à-dire les Procollagen C-Proteinase Enhancers (PCPEs) et les protéines de la famille des secreted Frizzled-Related proteins (sFRPs, sizzled). Il propose, par des études structurales et mécanistiques, de caractériser en détail les complexes impliquant les protéines régulatrices, la protéase Tolloïde nommée BMP-1 et/ou les molécules précurseurs des collagènes (procollagènes). Par ailleurs, il propose de concevoir et de développer de nouveaux inhibiteurs synthétiques des protéases Tolloïdes pour les étudier en complexe avec le domaine catalytique de BMP-1, compléter les études in vivo visant à caractériser les rôles des protéases Tolloïdes au cours de la réparation tissulaire et proposer, à terme, de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Des approches structurales vers la conception rationnelle d’inhibiteurs de protéasesLes mécanismes de contrôle de l’activité des protéases Tolloïdes par les protéines régulatrices endogènes (activateurs, inhibiteurs) sont étudiés par des approches structurales (cristallographie, diffusion des rayons X aux petits angles) associées à la mutagenèse dirigée. Les résultats servent à optimiser la structure des inhibiteurs potentiels, obtenus par synthèse chimique et testés en présence des protéases cibles et de substrats fluorescents.
Résumé de la soumission : Les métalloprotéases Tolloïdes jouent un rôle majeur au cours du développement embryonnaire et de la réparation tissulaire en synchronisant la synthèse de la matrice extracellulaire avec l’activation de certains facteurs de croissance. Le dépôt excessif de matrice extracellulaire, constitué majoritairement de collagènes, étant la caractéristique la plus invalidante des pathologies de type fibroses, il paraît important de comprendre comment l’activité des Tolloïdes est régulée, au niveau mécanistique et structural, pour proposer de nouvelles voies thérapeutiques. En effet, à l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement des fibroses, à l’exception du traitement des causes ou de l’inflammation persistante.Les protéases Tolloïdes sont régulées, de façon originale, par de nombreuses protéines activatrices (la plupart étant spécifiques d’un substrat particulier) et par au moins un inhibiteur endogène, décrit chez le Xénope. Ce projet est centré sur les molécules régulatrices pouvant affecter le dépôt des collagènes fibrillaires, c’est-à-dire les Procollagen C-Proteinase Enhancers (PCPEs) et les protéines de la famille des Secreted Frizzled-Related Proteins (SFRPs, Sizzled). Il propose, par des études structurales et mécanistiques, de caractériser en détail les complexes multi-moléculaires impliquant les protéines régulatrices, la protéase Tolloïde nommée BMP-1 et/ou la partie C-terminale du procollagène III (CPTIII). Par ailleurs, il propose de concevoir et de développer de nouveaux inhibiteurs des protéases Tolloïdes, de type peptides phosphiniques, pour les étudier en complexe avec le domaine catalytique de BMP-1 et pour faciliter les études in vivo et compléter la description des rôles des Tolloïdes au cours de la réparation tissulaire. Il résulte de la mise en commun des compétences, parfaitement complémentaires, de trois partenaires académiques : le groupe de C. Moali qui possède une très bonne connaissance des Tolloïdes et des PCPEs, le groupe de N. Aghajari spécialisé dans la caractérisation structurale de protéines, isolées et en complexes, et le groupe de V. Dive qui possède une grande expérience de la conception de pseudo-peptides phosphiniques dirigés contre les métalloprotéases à zinc. De part ses objectifs et ses applications potentielles, ce projet est fortement multi-disciplinaire et se situe à l’interface entre la chimie et la biologie.Plus précisément, les objectifs du projet seront d’abord de résoudre la structure tri-dimensionnelle du domaine CPTIII qui n’a pas d’équivalent dans la Protein Data Bank, seul et en complexe avec PCPE-1, pour mieux comprendre le mécanisme de l’activation et poser les bases permettant d’envisager la conception rationnelle d’agents bloquants. En parallèle, nous étudierons en détail le mécanisme d’inhibition des Tolloïdes par Sizzled, non seulement en réalisant la structure du complexe entre Sizzled et le domaine catalytique de BMP-1 mais aussi en caractérisant biochimiquement des mutants de sizzled et de BMP-1. Ceci pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies d’inhibition des Tolloïdes susceptibles d’être utilisées in vivo. Une autre partie importante du projet consistera à développer des inhibiteurs synthétiques des protéases Tolloïdes, plus stables chimiquement que les inhibiteurs classiques de type hydroxamates et plus spécifiques grâce à une interaction moins forte avec le zinc. De petites librairies de peptides phosphiniques seront ainsi synthétisées, avec différents groupements en position P1’, avant d’être testées sur les Tolloïdes ou utilisées dans les études structurales pour former des complexes avec le domaine catalytique de BMP-1. Les résultats de l’optimisation de ces peptides phosphiniques seront exploités plus avant pour préparer des sondes de type « activity-based probes », capables de discriminer entre les formes actives et inactives des Tolloïdes, en formant des complexes covalents permettant leur détection dans des échantillons biologiques complexes.
Résultats : Plusieurs résultats majeurs ont déjà été obtenus au cours de ce projet. En premier lieu, la première structure cristallographique du domaine C-terminal du collagène III (C-propeptide III) a été obtenue ; elle apporte des informations sur les mécanismes d’assemblage  intracellulaire de ces collagènes et ouvre la voie au développement de stratégies pouvant empêcher la formation des trimères de collagène. Par ailleurs, la structure basse résolution du complexe entre le C-propeptide III et la protéine activatrice PCPE-1 a permis de localiser très précisément le site d’interaction et d’identifier quelques-uns des acides aminés jouant un rôle clé dans cette interaction. 
Le mécanisme d’inhibition des protéases Tolloïdes par la protéine Sizzled a aussi été caractérisé en détail et il s’avère que Sizzled inhibe les 3 principales protéases Tolloïdes humaines avec une grande efficacité et de façon spécifique car elle n’affecte pas les autres types de métalloprotéases testées (astacine, méprines, MMPs). 
En parallèle, plusieurs générations d’inhibiteurs potentiels des protéases Tolloïdes, de type peptides phosphiniques, ont été préparées et testées. De bons résultats ont déjà été obtenus (constantes d’inhibition de l’ordre 100 nM) avec plusieurs molécules qui sont actuellement en cours d’optimisation.
Perspectives : Ce projet apporte des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes de régulation de l’activité des protéases Tolloïdes et ouvre plusieurs pistes sur la façon de manipuler cette activité à des fins thérapeutiques : inhibition des protéases Tolloïdes mais aussi inhibition de l’assemblage intracellulaire des trimères de collagènes et inhibition de l’interaction des collagènes avec les PCPEs. Le développement d’inhibiteurs synthétiques des protéases Tolloïdes constitue une première application possible mais de nombreuses autres sont envisageables (anticorps bloquants, chimères dérivées d’inhibiteurs endogènes…). Ces molécules pourront être rapidement testées in vivo dans les modèles de fibrose et de cicatrisation pathologique de la peau et de la cornée déjà disponibles.
Publications et brevets : -1 demande de brevet d’invention (partenaires 1 et 2) déposée le 16/11/11 portant sur l’utilisation des données structurales pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques
- 2 articles sur la structure du C-propeptide du collagène III dans Nature Struct. Mol. Biol. et Acta Cryst F. (partenaires 1 et 2)
- 1 article sur le mécanisme d’action de Sizzled dans le Journal of Biological Chemistry (partenaires 1 et 3) 
- 1 article sur l’interaction du collagène III avec PCPE-1 dans  le Journal of Biological Chemistry (partenaire 1) 
- 1 chapitre de livre sur les fonctions et la régulation des protéases Tolloïdes (partenaire 1)