Projet ANR-14-CE09-0022 – AsymLip : Asymétrie lipidique des bicouches membranaires: mécanisme moléculaire du transport de lipides et rôle de ce transport dans le trafic membranaire
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401) 2014
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Monsieur Guillaume Lenoir (Service de Bioénergétique, Biologie Structurale et Mécanismes, Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives)
Partenaires : Laboratoire public
Montant : 263536.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 60 mois
Résumé : Les lipides membranaires remplissent de nombreuses fonctions cellulaires essentielles et leur répartition asymétrique entre les deux feuillets de certaines des membranes eucaryotes (avec le feuillet cytosolique enrichi en phosphatidylsérine (PS) et phosphatidyléthanolamine (PE) et le feuillet exoplasmique enrichi en sphingolipides) est impliquée dans des processus cellulaires fondamentaux. La dissipation de cette asymétrie, résultant du « flip-flop » des phospholipides, est par ailleurs associée à de nombreux processus (patho)-physiologiques, tels que la reconnaissance par les macrophages des cellules en apoptose ou encore l’activation des cascades réactionnelles de coagulation du sang. 
	Les membres de la sous-famille P4 des ATPases de type P (ATPases P4) sont à ce jour les meilleurs candidats à l'établissement et au maintien de cette asymétrie (autant que l’on puisse en juger par l’utilisation d’analogues fluorescents de lipides), mais les ATPases P4 sont également impliquées dans la formation de vésicules d’exo/endocytose. En outre, les ATPases P4 interagissent avec les protéines de la famille Cdc50, essentielles pour l’adressage correct des ATPases P4. Le rôle exact des différents partenaires dans le transport des lipides reste néanmoins à établir. 
	Le projet proposé se situe à l’interface entre biochimie, biologie cellulaire, et biophysique. Il a pour but la caractérisation fonctionnelle et structurale des complexes moléculaires que forment les ATPases P4 et les protéines Cdc50, ainsi que l’élucidation du lien entre le transport des lipides par les ATPases P4, le trafic membranaire, et les pathologies associées. Pour ce faire, nous nous intéresserons dans un premier temps à une ATPase P4 de levure, la protéine Drs2p, et à sa sous-unité associée, Cdc50p ; Drs2p est en effet l’ATPase P4 pour laquelle existent les données les plus convaincantes quant à son implication dans le trafic membranaire et le transport de lipides. Dans un second temps, nous démarrerons l’étude d’un complexe humain, le complexe des protéines ATP8B1 et CDC50A, dont les mutations conduisent à la cholestase intrahépatique. Nous étendrons également notre champ d’investigations à l’étude de flippases du parasite P. falciparum, car ces flippases pourraient constituer des cibles nouvelles pour le traitement de la malaria.
	Ces complexes seront surexprimés dans la levure S. cerevisiae. Les membranes isolées constitueront notre matériel de départ pour une étude préliminaire du cycle de transport catalysé par les complexes Drs2p/Cdc50p et ATP8B1/CDC50A, et pour une étude structure/fonction visant à identifier les résidus ou domaines importants pour cette activité. C’est dans ce cadre que nous examinerons notamment les conséquences, sur le fonctionnement d’ATP8B1, des mutations identifiées chez les patients atteints de cholestase intrahépatique. Les complexes ATPase P4/protéine Cdc50 seront également purifiés par chromatographie d’affinité, pour une étude fonctionnelle détaillée du cycle de transport. 
	Dans le même temps, les complexes purifiés (Drs2p/Cdc50p, ATP8B1/CDC50A, ou les flippases de P. falciparum) seront étudiés par cristallographie aux rayons X, en collaboration avec le laboratoire de P. Nissen à Aarhus, afin de déterminer leur structure à haute résolution, préalable nécessaire à la compréhension du mécanisme moléculaire du transport des lipides et à son contrôle dans des situations pathologiques.
	Indépendamment, les complexes purifiés seront reconstitués en vésicules géantes (GUVs), en collaboration avec le laboratoire de J. Holthuis à Osnabrück. Par ce biais, nous souhaitons observer, par microscopie optique, les déformations membranaires associées au transport de lipides naturels d’un feuillet à l’autre des vésicules. En effet, selon l’hypothèse émise par Sheetz & Singer, une faible augmentation de l’aire d’un des deux feuillets par rapport à l’autre doit pouvoir induire une courbure de la membrane et un bourgeonnement vésiculaire.