Projet ANR-11-CHEX-0005 – TRACC : Importance des structures de type « R-loops » pour la condensation mitotique des chromosomes
Programme : Chaires d’excellence (CHEX)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Vincent VANOOSTHUYSE (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-AUVERGNE)
Partenaires : Laboratoire de Biologie et Modélisation de la Cellule
Montant : 480000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 48 mois
Résumé : Importance des hybrides ADN:ARN pour la condensation mitotique des chromosomesDes observations contradictoires suggèrent qu’il existe des liens fonctionnels étroits entre transcription et condensation des chromosomes. Mes données préliminaires obtenues chez S. pombe permettent de réconcilier ces observations et d’expliquer la coordination entre transcription et condensation en début de mitose. En effet, j’ai montré que des hybrides ADN::ARN générés par la transcription facilitent le recrutement sur la chromatine du complexe Condensin qui est essentiel à la condensation.
Montrer la colocalisation entre Condensin et hybrides ADN:ARN1. Montrer qu'au moins certains des loci génomiques occupés par Condensin sont capables d'accumuler des hybrides ADN:ARN2. Montrer qu'une séquence exogène capable de former des hybrides ADN:ARN recrute Condensin.3. Mutagéniser une séquence endogène de façon à abolir sa capacité à former des hybrides. Etablir l'effet de ces mutations sur le recrutement de Condensin.4. Etablir si Condensin intéragit de façon directe avec un hybride ADN:ARN synthétique5. Identifier les protéines qui reconnaissent les hybrides ADN:ARN6. Etablir des méthodes qui permettront de cartographier à l'échelle génomique les sites qui accumulent préférentiellement des hybrides ADN:ARN
Mise en évidence des hybrides ADN:ARN par des techniques in vivo and in vitro1. Clonage de quelques séquences qui accumulent ou non Condensin dans des plasmides permettant la transcription in vitro. L'accumulation d'hybrides ADN:ARN lors de la transcription in vitro modifie la topologie des plasmides. La présence de ces hybrides dans les réactions de transcription in vitro est validée (1) par dot blot en utilisant l'anticorps S9.6 qui reconnaît spécifiquement les hybrides et (2) par digestion à la RNase H qui digère spécifiquement les hybrides.2. Clonage d'une séquence humaine (AIRN) connue pour accumuler des hybrides in vivo. Intégration de cette séquence dans le génome de S.pombe. Etablir par ChIP si Condensin est recrutée sur cette séquence exogène quand elle est transcrite.3. Synthèse d'un gène synthétique codant pour la protéine Adh1, un site majeur de recrutement de Condensin: la séquence en bases azotées est mutée de façon à réduire le % de GC et de supprimer les clusters de C tout en codant pour la protéine sauvage. Ces mutations devraient réduire la capacité d'Adh1 à former des hybrides. 4. Purification de Condensin par affinité et incubation du complexe purifiée en présence d'un hybride synthétique: l'hybride est-il retenu spécifiquement sur la colonne?5. Génèse d'un hybride synthétique et fixation de cet hybride sur colonne  d'affinité: purification des protéines de S.pombe qui se lient de façon préférentielle à l'hybride.6. Purification de l'ADN génomique et des ARNs associés. Retrotranscription et séquençage haut débit des produits rétrotranscrits.
Résumé de la soumission : Les anomalies chromosomiques sont des facteurs prédisposant à plusieurs maladies graves, tels certains troubles développementaux ou certains cancers. Comprendre les origines de ces altérations chromosomiques est un enjeu primordial de santé publique. Je m’intéresse aux mécanismes qui, en permettant l’assemblage et la transmission des chromosomes en mitose, empêchent les aberrations chromosomiques. Chez tous les eucaryotes, la chromatine se compacte en début de mitose et s’organise de façon à former des chromosomes parfaitement individualisés. Cette métamorphose, appelée « condensation mitotique », est réversible et essentielle à la transmission fidèle des chromosomes en anaphase et à la stabilité du génome nucléaire. Le caractère primordial de la condensation mitotique est également démontré par le fait que Rb, un gène suppresseur de tumeurs, régule la condensation des chromosomes et que cette fonction participe à son activité anti tumeur. La condensation des chromosomes en mitose a été observée pour la première fois à la fin du XIXème siècle. Malgré cela, les mécanismes moléculaires par lesquels la chromatine s’organise pour former un chromosome condensé restent méconnus.De nombreuses données expérimentales suggèrent que la compaction de la chromatine est incompatible avec la transcription des gènes. L’interprétation qui prévaut généralement est que la compaction de la chromatine offre une barrière physique à la transcription, ce qui pourrait en partie expliquer la réduction de l’activité transcriptionnelle en mitose. Toutefois, des données publiées récemment suggèrent que la machinerie de transcription elle-même peut réguler directement le niveau de compaction de la chromatine, ce qui montre que les liens fonctionnels entre transcription et condensation sont plus complexes que ce qui est couramment envisagé. Mon hypothèse de travail, qui s’appuie sur des résultats préliminaires solides, postule que la réorganisation de la machinerie de transcription en début de mitose est un préalable nécessaire à la condensation des chromosomes. Mes données suggèrent que des changements de la composition de la machinerie de maturation des ARNs s’opérant en mitose contribuent à la condensation des chromosomes. Cette réorganisation est stimulée par un complexe protéique très conservé et aurait pour conséquence de générer transitoirement de l’ADN simple brin dans le génome. Cet ADN simple brin aiderait le recrutement sur la chromatine du complexe Condensin, qui représente l’activité principale de condensation de la chromatine en mitose. Ces données établissent un lien fonctionnel jusque-là insoupçonné entre une altération transitoire de l’activité transcriptionnelle des gènes, la production d’ADN simple brin et la compaction du génome. Le but de mon projet est de décortiquer ce nouveau mécanisme de régulation qui coordonne activité transcriptionnelle et condensation des chromosomes. La recherche a tendance à se diviser en champs d’investigation indépendants qui communiquent assez peu entre eux. De façon à bâtir une vision holistique des phénomènes biologiques, il est essentiel d’établir des ponts entre disciplines. Le projet présenté ci-dessous participe de ce processus et contribuera à donner une vision globale des transitions qui s’opèrent sur les chromosomes au cours du cycle cellulaire.
Résultats : 1. 15 séquences qui recrutent ou non Condensin ont été clonées. Transcription in vitro et dot blot confirment que des hybrides se forment au locus Adh1 qui recrute fortement Condensin. D'autres loci sont en cours d'étude.
2. Intégration en cours de la séquence humaine AIRN dans un locus de S.pombe qui ne recrute pas Condensin
3. Le gène synthétique (Adh1 muté) a été intégré dans le génome de S.pombe en remplacement du gène sauvage. Les premiers tests in vitro suggèrent que les mutations effectuées réduisent mais n'abolissent pas la formation des hybrides. La situation in vivo est en cours d'étude.
4. Deux hybrides synthétiques différents ont été générés et incubés en présence du complexe Condensin. Condensin semble capable de démanteler l'hybride. Etudes plus approfondies en cours.
5. Hybrides synthétisés. Tests préliminaires de purification en cours.
6. Mises au point de techniques de purification de l'ADN génomique qui préservent les hybrides. Validation par dot blot. Protocole à améliorer.
Perspectives : Nous anticipons que nous allons améliorer les méthodes pour visualiser la formation des hybrides à la fois in vivo et in vitro dans l'année qui vient. Ceci permettra de cartographier les hybrides in vivo dans le génome de S.pombe et d'établir si ces hybrides colocalisent de façon significative avec Condensin.
Publications et brevets : Un manuscrit en cours de révision avec Molecular Cell.