Projet ANR-10-BLAN-1205 – EpiCentr : Contrôle épigénétique des fonctions du centromère : Le "code histone" du centromère.
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Christian JAULIN (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE BRETAGNE ET PAYS- DE-LA-LOIRE)
Partenaires : Institut de Génétique et Développement de Rennes; Biotechnologie, Biocatalyse et Biorégulation
Montant : 451568.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Décryptage du « code histone » du centromère des chromosomes.La compréhension des mécanismes qui gouvernent la fidélité de la transmission du patrimoine génétique lors de la division cellulaire est un enjeu majeur. Un défaut de fidélité de cette transmission conduit à la mort cellulaire ou à la transformation tumorale.
Quels sont les mécanismes responsables de la fidélité de la transmission des chromosomes ?Lors de la division de la cellule, que ce soit au cours du développement embryonnaire ou lors du remplacement des cellules mortes de l’organisme adulte, les chromosomes sont répartis de façon équitable dans les deux cellules filles. Le contrôle de cette répartition est effectué par des machineries moléculaires localisées à un endroit particulier du chromosome appelé le centromère. Chez l’Homme, lors de la division cellulaire, les chromosomes prennent une forme caractéristique de « X ». Ces chromosomes sont composés de deux parties identiques (les bras du « X», appelés « chromatides sœurs ») reliées entre elles au niveau du point de jonction du « X » appelé « centromère ». Jusqu’à la division cellulaire, les chromatides sœurs sont maintenues jointives au niveau du centromère. Au moment de la division, les chromatides sœurs se séparent et sont réparties dans les cellules filles. Le contrôle de la jonction entre chromatides sœurs et le signal permettant leur séparation, ni trop tôt, ni trop tard, se situe au niveau du centromère. Des complexes moléculaires sont recrutés à cet endroit afin de s’assurer de la bonne cohésion entre chromatides sœurs, jusqu’au signal qui provoque la division de la cellule. Les mécanismes qui permettent de recruter ces complexes sont mal connus. L’ADN des chromosomes est enroulé autour de petites protéines appelées histones. Ces protéines subissent des modifications chimiques (acétylation, méthylation, etc.) à des positions particulières qui définissent un code appelé « code histone » ou « code épigénétique » et qui confèrent à certaines régions du chromosome des propriétés particulières. L’une de ces propriétés est de conférer au centromère la capacité à recruter les complexes moléculaires mentionnés ci-dessus. Notre laboratoire cherche à déchiffrer le « code histone » du centromère afin de comprendre son rôle dans la fidélité de la transmission des chromosomes.
Comment déchiffrer le « code histone » du centromère ?La principale difficulté de ce projet réside dans la purification de l’ADN du centromère et des histones associées. Afin d’obtenir des fractions pures de centromères, nous avons choisi d’utiliser un anticorps qui reconnaît spécifiquement une histone incorporée uniquement au centromère des chromosomes. Cet anticorps est couplé avec des billes magnétiques et incubé avec des chromosomes fragmentés grâce à une enzyme qui digère l’ADN. Une des difficultés à surmonter est de contrôler la fragmentation de l’ADN afin de ne pas obtenir des fragments trop petit (et perdre des histones importantes) ou trop grands (et contaminer l’échantillon avec des histones qui n’appartiennent pas au centromère).Les histones ainsi purifiées sont individuellement isolées par des techniques de biochimie des protéines et analysées par spectrométrie de masse. Cette technique permet de déterminer la masse exacte des fragments d’histones et de déterminer si ces histones portent les modifications chimiques recherchées. Enfin, à terme, après identification des modifications d’histones au centromère, nous rechercherons leur(s) rôle(s) dans les fonctions du centromère et, en particulier, dans la fidélité de la transmission des chromosomes lors de la division cellulaire.
Résumé de la soumission : Les modifications post-traductionnelles des histones (acétylation, méthylation, phosphorylation, etc.) jouent un rôle important dans tous les mécanismes impliquant la chromatine. Certaines combinaisons de modifications particulières, présentes sur une histone ou sur des histones différentes spécifient des fonctions précises en aval. Ce « langage » de la chromatine est connu sous le nom de « code histone ». Les études portant sur la structure et la fonction de ce code ont été concentrées sur son rôle dans la régulation de l’expression des gènes. Toutefois, plusieurs données expérimentales (dont les nôtres) montrent que les modifications post-traductionnelles des histones jouent un rôle important dans des fonctions centromériques majeures telles que la cohésion entre chromatides sœurs ou la ségrégation des chromosomes. Notre projet vise à décrypter le code histone du centromère et à identifier les fonctions associées aux modifications post-traductionnelles des histones centromériques.Deux axes, divisés en trois tâches, sont envisagés :1/ Identification des modifications des histones au centromère (tâche 1).La chromatine centromérique est caractérisée par la présence d’un variant de l’histone H3, CENP-A, spécifique du centromère. De précédentes études ont montré que le centromère est constitué de blocs de nucléosomes contenant CENP-A qui alternent avec des blocs de nucléosomes contenant l’histone H3. Nous comptons tirer profit de la liaison physique entre les nucléosomes CENP-A et H3 afin de purifier la chromatine centromérique. Nous effectuerons des expériences de purification par affinité en tandem (TAP) en utilisant une lignée exprimant une version de CENP-A portant un épitope « TAP ». La chromatine sera digérée de façon ménagée afin de copurifier les nucléosomes H3 centromériques adjacents. Les histones individuels seront ensuite purifiés et leur profil de modifications post-traductionnelles sera établi par une technique récente et performante de spectrométrie de masse : la FT-MS (Fourier Transform-Mass Spectrometry). Les profils de cellules en interphase et en mitose seront comparés et nous devrions ainsi pouvoir dresser la carte des modifications post-traductionnelles des histones centromériques et, à terme, produire des outils pour étudier leurs fonctions.2/ Etude de la fonction des modifications déjà identifiées des histones au centromère (tâches 2 et 3)Nos résultats préliminaires suggèrent un rôle de la phosphorylation de la sérine 7 de CENP-A (CENP-AS7) dans la cohésion entre chromatides sœurs. CENP-A est phosphorylé par Aurora B mais nos résultats préliminaires suggèrent des rôles multiples pour Aurora B dans la cohésion entre chromatides sœurs. Nous construirons une version « Shokat » d’Aurora B de façon à pouvoir précisément identifier les différents rôles d’Aurora B dans la cohésion.Nous avons développé un anticorps dirigé contre une forme acétylée de la lysine 9 de CENP-A (CENP-AK9). Grâce à ce réactif, nous savons que CENP-AK9 est activement déacétylé mais nous ne connaissons pas la fonction de cet équilibre acétylation/déacétylation. Nos premières expériences montrent que certaines substitutions de la lysine 9 de CENP-A sont létales et nous souhaitons construire des lignées exprimant des formes mutées de CENP-A de façon inductible afin de comprendre le rôle de la lysine 9 dans les fonctions associées au centromère.Enfin, notre étude précédente suggère un rôle pour la diméthylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4) au centromère dans la cohésion. Nous avons identifié une méthyl-transférase responsable pour cette modification au centromère et nous voulons comprendre son rôle dans les fonctions centromériques. Nous effectuerons également des expériences de « peptide pull down » avec un peptide H3K4 diméthylé et séparerons les complexes par chromatographie. Les complexes retenus seront ensuite analysés par spectrométrie de masse et leur rôle dans les fonctions du centromère sera étudié.
Résultats : Notre projet en est au stade des mises au point techniques. Nous obtenons des fractions pures de centromères, compatibles avec l’analyse par spectrométrie de masse et nous sommes actuellement en train d’adapter cette technique pour des volumes d’échantillon plus importants (10 litres de cellules en culture).
Perspectives : Ce projet est un projet de recherche fondamentale essentiellement destiné à comprendre les mécanismes moléculaires qui gouvernent la division cellulaire. Les perspectives médicales à moyen ou long terme concernent essentiellement la lutte contre le cancer. En effet, la principale caractéristique d’une cellule cancéreuse est son taux de division rapide. Cette particularité représente une « fenêtre de tir » potentielle pour les traitements. La connaissance des mécanismes qui contrôlent la transmission des chromosomes peut en effet permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. En perturbant ces mécanismes, il devrait être possible de forcer les cellules tumorales à répartir leur matériel génétique de façon erronée dans les cellules filles, ce qui entraînerait la mort de la plupart de ces cellules.
Publications et brevets : Nos études, dans le cadre de ce projet, ont permis de montrer qu’une protéine connue pour son rôle dans la réplication de l’ADN avait également un rôle lors de la division de la cellule. Nous avons récemment publié ce travail :
Rouzeau, S., Cordelieres, F.P., Buhagiar-Labarchede, G., Hurbain, I., Onclercq-Delic, R., Gemble, S., Magnaghi-Jaulin, L., Jaulin, C., and Amor-Gueret, (2012) M. Bloom's syndrome and PICH helicases cooperate with topoisomerase IIalpha in centromere disjunction before anaphase. PLoS One 7(4):e33905.