Projet ANR-12-BSV6-0007 – asSUPYCO : Régulation de la maturation et de la dégradation de l'ARN par les ARN antisens
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame Isabelle IOST (ARN : Régulations Naturelle et Artificielle)
Partenaires : Acides Nucléiques : Régulations Naturelles et Artificielles; Expression Génétique Microbienne; Expression Génétique Microbienne
Montant : 415000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Rôles et mécanismes d’action des petits ARNs chez les bactériesMécanismes de régulation de l’expression génétique par des petits ARN bactériens
Caractérisation fonctionnelle de petits ARN bactériensLes petits ARN non codants jouent des rôles essentiels dans la régulation de l’expression génétique chez tous les organismes vivants. Chez les bactéries, ces petits ARNs sont impliqués dans l’adaptation aux changements environnementaux, la réponse aux stress ou encore la virulence. Ils agissent le plus souvent en se fixant à leur ARN messagers cibles par appariement de bases pour moduler leur traduction et leur dégradation. Ces dernières années, les nouvelles techniques de séquençage à haut débit ont permis d’explorer le répertoire complet des petits ARN chez de nombreuses bactéries et ont révélé l’existence d’une pléthore de petits ARNs potentiellement régulateurs. Ces études soulèvent de nombreuses questions, en particulier: quel est le rôle physiologique de ces ARNs? Comment agissent-ils ? Est-ce que les différentes bactéries utilisent les mêmes mécanismes de régulation ? Dans ce projet, nous proposons de déterminer le rôle et le mécanisme d’action de nouveaux petits ARNs récemment découverts dans trois bactéries phylogénétiquement distantes: les organismes modèles représentatifs des bactéries à Gram-négatif et à Gram-positif Escherichia coli et Bacillus subtilis et la bactérie pathogène pour l’homme, Helicobacter pylori. Nous nous attendons à découvrir de nouvelles fonctions pour les petits ARNs et de nouveaux mécanismes de régulation. La bactérie H. pylori peut provoquer des ulcères gastro-duodénaux ou des cancers gastriques, tandis que B. subtilis et E. coli sont d'excellents modèles pour des bactéries pathogènes apparentées. Une meilleure compréhension des mécanismes de régulation dans ces organismes pourrait conduire à la découverte de cibles potentielles pour de nouveaux médicaments. 
Approches utilisées pour déterminer le rôle et le mécanisme d’action des petits ARNsParmi l’ensemble des petits ARN récemment découverts dans les bactéries E. coli, B. subtilis et H. pylori, nous avons choisi d’étudier quelques exemples spécifiques qui nous serviront de modèles. Pour étudier la fonction précise de ces petits ARNs in vivo, nous utilisons une approche génétique : des mutations génétiques visant à inactiver ou au contraire à surproduire ces petits ARNs sont introduites dans les bactéries. Les conséquences de cette inactivation/surproduction sur l’expression des ARNs cibles sont alors analysées grâce aux techniques de biologie moléculaire qui permettent d’apprécier la quantité et la qualité des ARNs. L’activité régulatrice des petits ARNs repose en grande partie sur leur capacité à moduler la dégradation de leurs cibles par des ribonucléases. Les trois espèces bactériennes utilisées possèdent un jeu de ribonucléases différent. Pour connaître le rôle de ces différentes enzymes dans la régulation par les petits ARNs, nous utilisons des souches bactériennes dans lesquelles les différentes ribonucléases sont inactivées par des mutations. Les nouvelles techniques de séquençage à haut débit sont utilisées pour déterminer leur contribution à l’échelle du génome. Enfin, des expériences de reconstitution in vitro des systèmes de régulation devraient permettre de mieux comprendre le mécanisme de régulation et le rôle de chaque partenaire dans les moindres détails.
Résumé de la soumission : La régulation de l'expression génétique par les petits ARN régulateurs a suscité un intérêt croissant ces dix dernières années. La plupart des études se sont focalisées sur les petits ARNs ‘trans’ codés à un locus génomique distinct de leurs ARNm cibles et agissant sur leur traduction. Cependant, des études récentes ont mis en évidence un mode d'action alternatif de régulation dans lequel les petits ARN régulateurs contrôlent directement la stabilité des ARNm. Dans ce projet, nous proposons de mettre l'accent principalement, mais non exclusivement, sur des petits ARN codés sur le brin d'ADN complémentaire à leur ARN cible (‘ARN cis’ ou ‘antisens’) et de déterminer leur rôle et leur mécanisme d’action dans le contrôle de la maturation et/ou de la stabilité de leurs cibles. Ces études seront réalisées dans trois organismes phylogénétiquement distants possédant différentes machineries de dégradation des ARN : les organismes modèles représentatifs des bactéries à Gram-négatif et à Gram-positif Escherichia coli et Bacillus subtilis qui ont chacun un répertoire varié de ribonucléases et la bactérie pathogène pour l’homme, Helicobacter pylori qui possède un nombre limité d'enzymes de dégradation et de maturation de l’ARN. Des données récentes d’analyse de transcriptome ont mis en évidence un grand nombre de petits ARN régulateurs potentiels chez ces organismes. Cependant, les études mécanistiques quant à leur mode d'action sont rares. Nous proposons donc d'étudier des exemples spécifiques de régulation par des ARN antisens dans les trois espèces bactériennes. Nous étudierons des ARN antisens complémentaires aux ARNm codant pour la ribonucléase PNPase, pour des protéines associées à la traduction ou au ribosome ou encore pour des peptides toxiques. De plus, nous avons identifié une nouvelle classe de petits ARN régulateurs complémentaires à des ARN stables (ARNr et ARNt) et nous analyserons leur rôle dans la maturation/dégradation et la biogenèse des ribosomes. Pour tous ces exemples d’ARN antisens, nous proposons de déterminer le mode d'action et d'identifier les RNases impliquées. Pour finir, nous analyserons le transcriptome de mutants de ribonucléases ou de cofacteurs comme la poly(A)polymérase pour déterminer leur rôle global dans le métabolisme des petits ARN régulateurs.
Résultats : Nous avons confirmé l’expression d’un certain nombre de petits ARN antisens chez les bactéries E. coli, B. subtilis et H. pylori. Nous avons identifié les RNases impliquées dans leur dégradation et déterminer, pour certains d’entre eux, la fonction et le mécanisme d’action. A titre d’exemple, chez B. subtilis, deux petits ARNs sont impliqués dans l’inhibition de l’expression d’ARN messagers codant pour des protéines toxiques. Dans les deux cas, le petit ARN et l’ARNm toxine s’apparient et l’hybride ainsi formé est dégradé par la RNase III, une ribonucléase spécifique des ARN double-brins. Grâce à ce mécanisme, les toxines codées par ces ARNm ne sont pas produites, maintenant ainsi la survie de la bactérie. Cette étude explique pourquoi la RNase III est essentielle chez B. subtilis alors qu’elle n’est pas indispensable chez un grand nombre de bactéries.
Perspectives : Les résultats montrant que la RNase III est nécessaire pour dégrader des ARNm codant pour des toxines chez B. subtilis ouvrent de nouvelles pistes pour étudier le caractère essentiel de certaines ribonucléases chez d’autres bactéries. 
L’analyse de l’ensemble des transcrits (« transcriptome ») de souches bactériennes dépourvues de certaines RNases ou de cofacteurs de RNases a permis de découvrir de nouveaux petits ARNs potentiellement régulateurs. Une des perspectives de ce travail est donc de déterminer si ces nouveaux ARNs ont une fonction régulatrice et par quel mécanisme ils agissent.
Publications et brevets : Articles :
- Durand, S., Gilet, L. and Condon, C. (2012) The essential function of B. subtilis RNase III is to silence foreign toxin genes. PLoS Genet, 8(12): e1003181. doi: 10.1371/journal.pgen.1003181
- A. Maes, C. Gracia, D. Bréchemier, P. Hamman, E. Chatre, L. Lemelle, P. N. Bertin & E. Hajnsdorf (2013) “Role of polyadenylation in regulation of the flagella cascade and motility in E. coli“ Biochimie, 95, 410-418. 
- P. Régnier and E. Hajnsdorf (2013) «The interplay of Hfq, poly(A) polymerase I and exoribonucleases at the 3' ends of RNAs resulting from Rho-independent termination: a tentative model« RNA Biology 10(4).
- P. Boudry, C. Gracia, M. Monot, J. Caillet, L. Saujet, E. Hajnsdorf, B. Dupuy, I. Martin-Verstraete  & O. Soutourina «Pleiotropic role of the RNA chaperone protein Hfq in the human pathogen Clostridium difficile« J. Bacteriol sous presse.
- J. Caillet J., C. Gracia C., F. Fontaine and E. Hajnsdorf «Clostridium difficile Hfq can replace Escherichia coli Hfq for most of its function« RNA sous presse
- Iost, I., Bizebard, T. and Dreyfus, M. (2013) Functions of DEAD-box proteins in bacteria: Current knowledge andpending questions. Biochim Biophys Acta, 1829, 866-877.