Projet ANR-10-BLAN-1506 – BIsP : Réduction des quinones et organisation en supercomplexe: les deux énigmes des complexes Rieske/cytb
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Frauke BAYMANN (CNRS - DELEGATION REGIONALE PROVENCE)
Partenaires : Institut de Biologie Physico-Chimique; Laboratoire de Biologie Physico-Chimique des Protéines Membranaires; Bioénergétique et Ingénierie des Protéines
Montant : 329522.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : BIsP : Réduction des quinones et organisation en supercomplexe: les deux énigmes des complexes Rieske/cytbL’étude comparative du complexe Rieske/cytb de trois organismes issus de phyla voisins, Heliobactéries, Bacilli et Chloroplats est choisi afin d’étudier l’implication de cet enzyme dans la formation de supercomplexes et ses interactions avec les quinones, plus particulièrement la réduction des quinones en présence de l’hème ci .
Compréhension du rôle de l'hème ci et caractéristiques d'un supercomplexePurification des complexes et/ou supercomplexes de Geobacillus et des Heliobactéries devrait être suivi de leur caractérisation par spectroscopie UV/VIS et RPE et leur cristallisation. La cristallisation d'un spercomplexe n'a jamais encore été réussi est nécessite une mis au point d'une préparation homogène. Le rôle de l'hème ci dans le site de réduction des quinones reste énigmatique. L'étude comparative des complexes des organismes photosynthèse anaérobie et respiration aérobie en comparaison avec le complexe bien caractérisé de l'algue verte Chlamydomonas est choisi. Des mutants du complexe b6f de Chlamydomonas, censé mimer le site de fixation des quinones des Héliobactiéries compléteront ce volet de l’étude. En parallèle les chaînes bioénergétique des Héliobactéries de (Geo)Bacillus font objet d’une étude de leur cinétiques de transfert d’électrons in vivo. Pour les bactéries non-photosynthétiques cette technique nécessite une mis au point.
Études des complexes et supercomplexes de différent organismes des la cellule entière à l'enzyme cristallisé-mis au point de la purification du supercomplexe de Geobacillus par choix de détergent et de support de chromatographie- tentative d'une mis au point de purification du complexe Rieske/cytb des Heliobactéries -conception et construction d'un porte-cuve thermostatable équipe des LEDs d'excitation a 800nm pour le JTS-étude de la chaîne bioénergétique des Héliobactéries in vivo par le JTS-expérimentation de différent conditions de culture et de luminosité pour influer sur l'état redox de la chaîne bioénergétique des Héliobactéries-enrichissement et titration d'une ferrédoxine des Héliobactéries-expression hétérologue et caractérisation par titrage redox suivi de spectroscopie RPE de la protéine de Rieske de Heliobacterium modesticaldum-développement d’une approche de étiquetage des enzymes de Bacillus et de Geobacillus- construction des mutants de Chalmydomonas- développement d'uneapproche par cinétique en vivo de la chaîne bioénergétique de Géobacillus-essaies de cristallisation du supercomplexe de Geobacillus-étude par microscopie électronique du supercomplexe de Geobacillus
Résumé de la soumission : La transduction de l'énergie est essentielle pour les organismes et le gradient électrochimique de proton en est le pivot. Il est généralement maintenu par la respiration ou la photosynthèse. Cela implique des réseaux complexes, finement réglés, de transfert de protons et d'électrons. Les concepts classiques d’optimisation de la catalyse ont plus récemment été bousculés par des hypothèses insistant sur la prévention de court-circuits électroniques. Les court-circuits d'une chaîne bioénergétique mal ajustée induisent la formation de radicaux et donc, directement ou indirectement, des processus pathophysiologiques. Une compréhension plus profonde de ces mécanismes de transfert d’électrons est le point de départ de ce projet.L'apparition de l'oxygène sur terre a accru les contraintes sur les protéines redox. Cette molécule oxydante peut adopter plusieurs états redox, dont certains sont très réactifs et délétères pour les protéines, l'ADN et les lipides. Une source de ces espèces réactives de l'oxygène (ROS) se trouve dans les sites redox des protéines où les transferts d'électrons basculent d'un donneur à un électron à un accepteur à deux électrons et réciproquement. L'état simplement réduit d’un donneur/accepteur à deux électrons est généralement réactif vis-à -vis de l'oxygène. Les organismes ont dû développer des stratégies pour se protéger.Une classe d'enzyme procure un système expérimental idéal pour aborder ces stratégies: les complexes Rieske/cytochrome b (Rieske/cytb) qui se trouvent aussi bien dans les chaînes respiratoires que photosynthétiques, chez les organismes aérobie ou anaérobie, dans des chaînes rédox à quinones de haut ou de bas potentiel redox.La protéine la mieux caractérisée de cette famille, le complexe III des mitochondries a été démontrée supprimer la production des ROS en stabilisant une semi-quinone dans le site de réduction de quinones par modulation des potentiels rédox des couples Q/SQ/QH2. Plusieurs décennies de recherche ont montré que le pendant du complexe III dans les cyanobactéries et les chloroplastes, le complexe b6f, n’emploie pas la même stratégie et que l’équilibre électrochimique des composés rédox diffère entre les deux complexes. Nous avons déterminé la structure du complexe de l'algue Chlamydomonas (Stroebel et al. Nature 2003) et démontré que son site de réduction des quinones était unique parmi les sites de quinone car il possède un hème (hème ci) avec un site de coordination du fer libre (hème ci). Nous avons étudié plus en détail ce site pour comprendre son mécanisme (Alric et al., PNAS 2005, Baymann et al., PNAS 2007) par des études à l'échelle moléculaire et cellulaire, mais la complexité des états ne nous a pas encore permis de conclure. D’un point de vue de la phylogénie le complexe b6f fait partie d’un cluster d’enzymes homologues, présents aussi bien dans des organismes phototrophes anoxygéniques que dans des organismes non-phototrophes. Afin de comprendre les propriétés exceptionnelles du complexe b6f nous proposons dans ce projet d’élargir nos études à des organismes hors cyanobactéries et chloroplastes, plus précisément aux Heliobactéries, qui vivent en anaérobie de façon phototrophe sans produire de l’oxygène, et aux Bacilli, qui peuvent obtenir leur énergie de la respiration de l’oxygène. La présence de l’hème ci dans le complexe Rieske/cytb de tous ces organismes a été soit démontrée (Ducluzeau, BBA 2008) soit fortement soupçonnée et leur étude devrait nous permettre de progresser dans la compréhension du mécanisme de la réduction des quinones employé par ces complexes. De plus, l’organisation avérée (Bacillus) ou possible (Heliobactéries) du complexe Rieske/cytb en supercomplexe devrait nous permettre d’étudier des unités fonctionnelles membranaires complètes par cristallographie aux rayons X.
Résultats : - purification du supercomplexe de Geobacillus stéarothermophilus : cette préparation nous a permis de déterminer les spectres et potentiels redox de tous les co-facteurs, important pour la compréhension de la fonction des enzymes. Notamment des potentiels redox inhabituellement bas ont été trouvés pour les hèmes b ce qui est un fait important pour l’interprétation du fonctionnement du cycle Q.
- la PFO de Héliobactéries est capable d’oxyder le pyruvate mais aussi le former à partir de l’acétate en fixant le CO2 
- détermination du potentiel redox de la protéine de Rieske et d’une des ferrédoxines de Heliobacterium modesticaldum. Ces potentiels redox étaient les inconnus dans la chaîne photosynthétique de la bactérie et sont indispensable à l’interprétation des données obtenus pour le turnover in vivo.
- Cristallisation du complexe II de Geobacillus.
Perspectives : -Amélioration de l'homogénéité de la préparation du supercomplexe de Geobacillus en vu de sa cristallisation
-mis au point d'un test d'activité du supercomplexe
-retour vers le système membranaire afin d'étudier les propriétés de l'hème ci de Geobacillus et des Héliobactéries en présence des quinones naturelles dans différent états redox
-déconvolution des cinétiques obtenus in vivo et leur interprétation en fonction des potentiels redox et des caractéristique spectrales de tous les cofacteurs
- caractérisation de l’hème ci des mutants de Chlamydomonas par spectroscopie RPE
Publications et brevets : Bergdoll, L., Point, E., Bayann, F., Picot, D. congrès du GfB 2013 : ‘Study of a respiratory supercomplex from the low GC firmicutes Geobacillus sterothermophilus’ 
F.Baymann : EBEC 2012 ‘Evolution of Rieske/cytb complexes