Projet ANR-12-BSV8-0007 – IronPath : Specificités et complexicité des voies d’acquisition du fer chez Pseudomonas aeruginosa.
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame Isabelle Schalk (Biotechnologie et Signalisation Cellulaire)
Partenaires : Institut de Recherche de L’École de Biotechnologie de Strasbourg
Montant : 299000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 36 mois
Résumé : IronPathCe projet fait partie du réseau « Dynamics of Bacterial Membrane Proteins » regroupant sept laboratoires allemand,  un groupe suisse et notre équipe . La dynamique des protéines membranaires bactériennes est le centre d’intérêt de tous. Au sein de ce consortium, notre groupe se focalisera sur l’étude du transport membranaire du fer chez Pseudomonas aeruginosa, et plus particulièrement sur l'acquisition du fer par les sidérophores pyoverdine (Pvd) et pyochéline (Pch).
Spécificités et complexité des voies d'acquisition du fer chez Pseudomonas aeruginosaAvec IronPath, nous proposons de nous intéresser à d’autres aspects de ce transport impliquant plutôt des protéines de membrane interne, plus difficiles à manipuler que les protéines de membrane externe. Notre équipe a ces derniers mois identifié un complexe de 4 protéines de membrane interne, FpvGHJK, intervenant dans l’étape de dissociation du métal de la Pvd. Nous avons également identifié un transporteur ABC, FpvCDEF, probablement impliqué dans le transport du fer du périplasme vers le cytoplasme pour la voie Pvd. La particularité de ce transporteur ABC est d’avoir deux protéines périplasmiques associées. Le projet que nous présentons s’intéressera à ces deux nouveaux complexes membranaires. Nous essayerons de comprendre par des études in vivo et in vitro, les mécanismes moléculaires impliqués dans leur fonction biologique. Dans ce projet, nous étudierons également la localisation et distribution cellulaires d’autres enzymes impliquées dans la biosynthèse de la Pvd et la Pch, ainsi que des protéines impliquées dans l’acquisition du complexe ferrisidérophore. Nous étudierons la dynamique des protéines impliquées dans l’assimilation du fer par les voies Pvd et Pch et la dynamique des interactions protéiques par des approches de microscopie de fluorescence à haute résolution (protéines de fusion fluorescentes, FRET et FRAP). L’ensemble de cette étude permettra de cartographier toutes les interactions entre les différentes protéines impliquées dans le transport du fer, leur organisation et leur distribution dans la paroi et le long de la paroi bactérienne. Une étude de ce type n’a jamais été réalisée même chez E. coli.
Stratégie proposée dans le cadre du projetLe programme scientifique est divisé dans 7 sections (incluant le management).1. Nous étudierons par microscopie à haute résolution, le degré d'organisation intracellulaire de la biosynthèse des sidérophores Pvd et Pch, nous chercherons l'existence d'un «siderosome« et analyserons sa composition en protéines. 2. En parallèle, avec la même approche nous examinerons aussi la distribution cellulaire et la co-localisation des différentes protéines impliquées dans l'assimilation de fer par la Pvd et la Pch chez P. aeruginosa.3. Nous essayerons de comprendre, en utilisant des protéines de fusion fluorescentes, quels sont les facteurs exogènes qui vont induire l'utilisation de la voie Pvd ou la voie Pch par P. aeruginosa. Nous étudierons également le temps nécessaire pour « switcher » de l’utilisation de la voie Pvd à la voie Pch et vice versa. 4. L'utilisation de protéines de fusion fluorescentes permettra aussi d'étudier par FRAP la dynamique des protéines de la voie Pvd et de la voie Pch.5.	Le mécanisme de dissociation du complexe Pvd-Fe dans le periplasme sera étudié. Ce mécanisme implique une réduction de fer qui est probablement effectué par le complexe de membrane interne FpvCDEF. Le mécanisme enzymatique impliqué dans ce processus sera examiné in vivo et in vitro avec un système reconstitué et la réaction enzymatique sera suivie par l'utilisation de la fluorescence de la Pvd (l’apo Pvd étant fluorescente et le complex Pvd-Fe étant non-fluorescent). La capacité du système FpvCDEF à dissocier des métaux autre que le fer de la Pvd sera aussi étudiée. Le rôle du transporteur ABC FpvGHJK dans la dissociation Pvd-Fe sera examiné aussi. 6.	Toutes les protéines impliquées dans une voie d’acquisition du fer doivent former de grandes machineries protéiques avec des interactions protéiques successives. Pour comprendre le fonctionnement de ces systèmes complexes, ces machines seront aussi examinées dans leur ensemble in vivo et in vitro avec des protéines purifiées.
Résumé de la soumission : Ce projet fait partie du réseau « Dynamics of Bacterial Membrane Proteins » regroupant sept laboratoires allemand de l’université Albert-Ludwig-Universität de Fribourg, une équipe de l’université d’Heidelberg (Ruprecht-Karls-Universität-Heidelberg) un groupe suisse du Biozentrum (Bâle) et notre équipe (Université de Strasbourg-CNRS). La dynamique des protéines membranaires bactériennes est le centre d’intérêt de tous. Ce réseau a été financé par la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) et l’ANR ces trois dernières années. En janvier 2011, la DFG a à nouveau évalué très positivement ce consortium pour un renouvellement de trois ans de financement. Des raisons administratives ne permettent pas à la DFG de financer une équipe française, malgré une évaluation très positive de IronPath par cet organisme. Pour permettre à notre équipe de participer à ce réseau et de réaliser notre projet de recherche, nous devons trouver un financement français.Au sein de ce consortium, notre groupe se focalisera sur l’étude du transport membranaire du fer chez Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste. Le fer est essentiel à la vie de tout organisme vivant. Pour l’acquérir, les microorganismes synthétisent et sécrètent des sidérophores -molécules de faible poids moléculaire ayant une très forte affinité pour le fer ferrique-. Les deux sidérophore majeurs produit par P. aeruginosa sont la pyoverdine (Pvd) et la pyochélin (Pch). Après chélation du fer, l’acquisition des complexes ferrisiderophores du milieu extracellulaire par les bactéries implique des machineries membranaires complexes. Ces dernières années, c’est le transport des complexes ferrisidérophores du milieu extracellulaire vers le périplasme qui a surtout attiré l’attention de la communauté scientifique travaillant dans le domaine. Avec IronPath, nous proposons de nous intéresser à d’autres aspects de ce transport impliquant plutôt des protéines de membrane interne, plus difficiles à manipuler que les protéines de membrane externe. Notre équipe a ces derniers mois identifié un complexe de 4 protéines de membrane interne, FpvGHJK, intervenant dans l’étape de dissociation du métal de la Pvd. De manière surprenante ce complexe n’a pas d’homologie avec des réductases connues à ce jour. Nous avons également identifié un transporteur ABC, FpvCDEF, probablement impliqué dans le transport du fer du périplasme vers le cytoplasme pour la voie Pvd. La particularité de ce transporteur ABC est d’avoir deux protéines périplasmiques associées. Le projet que nous présentons s’intéressera à ces deux nouveaux complexes membranaires. Nous essayerons de comprendre par des études in vivo et in vitro, les mécanismes moléculaires impliqués dans leur fonction biologique. Il a été clairement montré ces dernières années que les bactéries ont un haut degré d’organisation intracellulaire, avec des protéines données, localisées en des sites particuliers dans la bactérie. Dans ce projet, nous étudierons également la localisation et la distribution cellulaires des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la Pvd et la Pch, ainsi que des protéines impliquées dans l’acquisition du complexe ferrisidérophore. Nous étudierons également la dynamique dans la cellule des mouvements des protéines impliquées dans l’assimilation du fer par les voies Pvd et Pch et la dynamique de ces interactions protéiques par des approches de microscopie de fluorescence à haute résolution (protéines de fusion fluorescentes, FRET et FRAP). L’ensemble de cette étude permettra de cartographier toutes les interactions entre les différentes protéines impliquées dans le transport du fer, leur organisation et leur distribution dans la paroi et le long de la paroi bactérienne. Une étude de ce type n’a jamais été réalisée même chez E. coli.
Résultats : Les premiers résultats sont en cours et seront publiés sur ce site après publication dans un journal scientifique
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