Projet ANR-12-MALZ-0004 – HuntAbeta : Huntingtine et la régulation du traffic d’APP/Abeta dans la maladie d’Alzheimer
Programme : Maladie d'Alzheimer et Maladies Apparentées (MALZ)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Frédéric SAUDOU (INSTITUT CURIE)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Laboratoire public; Fondation de recherche
Montant : 575047.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Régulation du trafic d’APP/Abeta dans la maladie d’AlzheimerLa maladie d’Alzheimer se caractérise par un excès d’amyloïde beta (Abeta) neurotoxique et des défauts de transport axonal de la protéine précurseur d’amyloïde (APP). Le projet HuntAbeta vise à identifier le rôle des protéines du transport axonal sur le transport d’APP et sur la production d’Abeta.
Control du trafic neuronal d’APP et régulation de la production d’AbetaLa fonction normale de la protéine APP n’est pour l’instant pas établie. Comme APP est le précurseur de l’Abeta dont les niveaux sont cruciaux dans le développement de la maladie d’Alzheimer, le clivage de l’APP a été largement étudié. Cependant, la régulation du trafic d’APP dans les neurones, du corps cellulaire vers la membrane plasmique des synapses et de la membrane plasmique vers les compartiments intracellulaires où l’APP est clivée en Abeta, n’est pas connue. En particulier, quels sont les mécanismes qui contrôlent le transport d’APP dans les axones et les dendrites ? Quels sont les impacts des défauts de transport d’APP sur la production d’Abeta et la maintenance des synapses ? Peut-on réduire la production d’Abeta dans les modèles de la maladie en modulant le transport d’APP ?Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent le trafic d’APP dans les neurones. Cette approche pourra également mettre en évidence de nouveaux mécanismes de régulation de la production d’Abeta et identifier de potentielles cibles thérapeutiques. 
Trafic neuronal d’APP, production d’Abeta1) Afin d’étudier la contribution de protéines régulatrices du transport dans transport d’APP et sur la formation des synapses, les neurones de souris mutantes pour ces protéines sont ensemencées dans des dispositifs microfluidiques, permettant l’isolement des axones et des synapses, et sont ensuite analysés par vidéo-microscopie confocale. 2) La production d’Abeta peut être quantifiée par dosage ELISA sur le milieu de culture des neurones. La technologie « multiscale discovery » utilisé pour ce projet permet de doser l’Abeta sur des échantillons de milieu provenant des dispositifs microfluidiques.3) les conséquences des défauts d’expression de ces protéines vont être analysées in vivo par croisement de souris modèle de la maladie d’Alzheimer avec des souris qui n’expriment pas des protéines régulatrices du transport dans les neurones de l’hippocampe. Ces souris seront caractérisées au niveau comportemental, cellulaire et moléculaire.
Résumé de la soumission : La maladie d'Alzheimer (MA) est caractérisée par le trafic et le clivage anormaux de la protéine précurseur amyloïde, l'APP, dont la fonction est encore mal comprise. Comme APP est le précurseur de l’Abeta dont les niveaux sont cruciaux pour la MA, le clivage de l’APP a été largement étudié. Cependant, on sait peu de choses sur la façon dont l'APP est transporté du corps cellulaire vers la synapse. En particulier, quels sont les mécanismes qui contrôlent le transport d’APP dans les axones et les dendrites? Quels sont leur impact sur la production d’Abeta et la maintenance des synapses? Peut-on réduire la production d’Abeta dans les modèles de MA en modulant le transport d’APP?Notre laboratoire ainsi que d'autres groupes ont identifié la huntingtine (htt)- qui lorsque mutée provoque la maladie de Huntington (HD) - comme une protéine clé qui régule le transport intracellulaire (Gauthier et al Cell 2004.). Nous avons constaté que htt régule le transport de l'APP et que la phosphorylation de la htt en sérine 421 dicte la directionnalité de son transport à l'intérieur des axones. (Colin et al. EMBO J 2008). Notre expertise sur la fonction de la htt dans le transport axonal, notre savoir-faire dans l'étude des mécanismes moléculaires du transport dans les neurones, de leur altération dans la maladie, et des conséquences sur la fonction et la survie neuronale, nous place dans une position privilégiée pour étudier l'influence de htt sur la traffic d’APP en condition physiologique et dans la MA.1) Nous allons étudier la contribution de l’htt dans le transport axonal de l'APP. Nous utiliserons des techniques d'imagerie de pointe et dispositifs microfluidiques pour clarifier sur le rôle de la htt et sa phosphorylation sur le transport axonal et dendritique de l'APP dans les neurones hippocampiques. Nous allons analyser la contribution de htt et de sa phosphorylation sur la formation/maintenance des synapses et la production d’Abeta en utilisant des co-cultures dans les chambres microfluidiques.2) La huntingtine est également connue pour réguler l'endocytose. Nous allons examiner si la phosphorylation de l’htt pourrait avoir un impact sur l'endocytose APP et la production d’Abeta. Nous allons étudier le rôle de l’htt dans l'endocytose de l’APP et son association avec les sécrétases.3) Nous allons étudier les conséquences in vivo de l'expression et la phosphorylation d’htt sur la production d’Abeta en croisant des souris MA (TgAPPswe, PSEN1DE9) avec des souris invalidées de manière inductible pour l’htt dans l'hippocampe (montrant un transport axonal réduit) ainsi qu’avec des souris HdhS421A HdhS421D . Nous allons ensuite étudier ces souris sur le plan neuropathologique et comportemental à l'aide des tests cognitifs. La production d’Abeta, la formation d'amyloïde et les marqueurs synaptiques seront évalués.Nous pensons que cette proposition conduira à une meilleure connaissance des mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôle le traffic d’APP des compartiments intracellulaires vers les membranes plasmiques au niveau des synapses et, de la membrane aux compartiments d'endocytose. Ces approches pourraient donc révéler de nouveaux mécanismes régulant la production d’Abeta et permettre d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Enfin, notre travail pourrait aussi révéler un lien inattendu entre la MA et HD et ouvrir de nouvelles avenues de recherche sur les processus neurodégénératifs.
Résultats : Pour réaliser ce projet, des outils biologiques et techniques ont été mis en place: un dispositif microfluidique pour isoler les axones et les synapses, des plasmides APP avec un ou plusieurs marqueurs fluorescents, un croisement de souris modèle de la maladie d’Alzheimer avec des souris mutantes pour les régulateurs du transport ont été initiés.
Les neurones corticaux transfectés avec une construction APP fluorescente ont été ensemencés dans des dispositifs microfluidiques dans lesquels les axones traversent les microcanaux de 450µm de long et font des contacts synaptiques. Nous avons pu observer le trafic de l'APP dans la partie distale des axones. Le suivi des vésicules APP fluorescentes révèle une majorité de transport axonal antérograde rapide (environ 3µm/sec). La vitesse des vésicules APP est modulée par les régulateurs du transport axonal rapide. De plus, la production d’Abeta est modifiée dans les neurones de souris mutantes pour les régulateurs du transport. Ces résultats suggèrent que la régulation du trafic axonal d’APP permet de modifié la production d’Abeta.
Perspectives : La principale perspective du projet est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie d’Alzheimer.
Publications et brevets : Aucune production scientifique et brevets sur ce projet à ce jour