Projet ANR-13-BSV3-0012 – NiCiTy : Interactions entre les rétroélements et la cellule hôte: De l’import nucléaire à l’intégration chromosomique
Programme : Blanc - SVSE 3 - Microbiologie, immunologie, infectiologie (Blanc SVSE 3) 2013
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Madame Pascale LESAGE (Institut National de la santé et de la recherche médicale)
Partenaires : Institut de Biologie et de Technologies de Saclay; Institut national de la santé et de la recherche médicale; Génétique des Génomes
Montant : 600000.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : CONTEXTE SCIENTIFIQUE ET OBJECTIFS
Les rétroéléments (rétrovirus et rétrotransposons à LTR (LTR-RT)) se répliquent par transcription inverse de leur génome ARN en un ADNc, ensuite intégré dans le chromosome de la cellule hôte, réaction catalysée par l'intégrase des rétroélements. Une réplication est productive si l’ADNc transite à travers le cytoplasme, traverse avec l'intégrase la membrane nucléaire et accède à son site d'intégration qui permet la transcription des gènes viraux. Si des progrès importants ont été accomplis dans l’étude du trafic des particules virales dans le cytoplasme, les événements qui se produisent à l'interface entre le cytoplasme et le noyau, jusqu'à leur intégration dans l'ADN de l'hôte, restent largement inconnus. Cette question est fondamentale puisque l'intégration de l’ADNc est essentielle à une infection productive et la persistance virale. Le but du projet est de poser, à différents niveaux, la même question fondamentale de l'interaction entre la réplication de rétroéléments et l'architecture nucléaire, de l'import nucléaire virale à son intégration génomique.
DESCRIPTION DU PROJET/METHODOLOGIE
Les LTR-RT sont omniprésents dans les génomes eucaryotes. L’étude des LTR-RT de levure a contribué à une meilleure connaissance de la biologie des rétrovirus. C’est pourquoi, nous utiliserons le LTR-RT Ty1 de levure, comme modèle d’étude.
L'intégration des rétroéléments n’est pas aléatoire in vivo, et leur spécificité d’intégration dans le génome de la cellule hôte dépend en partie de facteurs de transcription.
Notre premier objectif est d'étudier l'influence de la transcription sur le choix du site d'intégration de Ty1:
- en reconstituant des systèmes d’intégration in vitro sophistiqués, permettant d’étudier l’intégration de Ty1 couplée à une transcription active;
- par des stratégies novatrices afin d'identifier in vivo, de nouveaux cofacteurs de Ty1, impliqués dans l'import nucléaire et l'intégration, en particulier ceux présents au site d’intégration.
Dans le noyau, les chromosomes et les loci individuels affichent des positions préférentielles dynamiques et non aléatoires, qui semblent influencer les processus liés au métabolisme de l'ADN.
Notre deuxième objectif est de déterminer l'impact de l'architecture des chromosomes dans l'intégration rétrovirale, ainsi que l'influence des insertions rétrovirales sur l'organisation tridimensionnelle du noyau:
- en utilisant les outils les plus modernes pour suivre la position des loci Ty1 dans les cellules vivantes et cartographier leur position en deux dimensions dans l'espace nucléaire, et pour comparer la position de plusieurs loci avant et après intégration de Ty1.
Les protéines et l’ADNc des rétrovirus s'accumulent au centrosome, mais la nature des événements qui se produisent à cet organite et leur impact sur l'import nucléaire et l'intégration est inconnue.
Notre troisième objectif est de décrypter la contribution du spindle pole body (le centrosome de levure) et du réseau de microtubules dans la réplication de Ty1:
- en analysant la localisation de Ty1 et des protéines du SPB par microscopie à fluorescence hautement résolutive ;
- en déterminant si un SPB fonctionnel est nécessaire pour  la réplication de Ty1, par des approches génétiques et génomiques.
RESULTATS ATTENDUS
- identifier de nouveaux partenaires cellulaires Ty1;
- décrypter au niveau moléculaire le lien entre la transcription et le processus d'intégration;
- déterminer l'impact de l'organisation tridimensionnelle des chromosomes sur le processus d'intégration;
- acquérir des connaissances sur la contribution du SPB dans la réplication de ty1.
Ce projet devrait aussi ouvrir de nouvelles pistes pour étudier les interactions entre les mécanismes cellulaires et les rétrovirus de mammifères, et avoir donc des implications importantes en thérapie clinique pour le traitement des infections rétrovirales et pour le développement de nouveaux vecteurs rétroviraux pour la thérapie génique.