Projet ANR-14-CE05-0019 – cellutanol : construction d'une souche d'E. coli à cellulosomes pour la conversion de la cellulose en butanol
Programme : Transformations et inter-conversions énergétiques (DS0203)
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Monsieur Henri-Pierre Fierobe (Centre National de la Recherche Scientifique délégation Provence et Corse _ Laboratoire de Chimie Bactérienne)
Partenaires : Laboratoire public; Laboratoire public
Montant : 456654.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 60 mois
Résumé : Vers un colibacille capable de convertir la cellulose en un biocarburant, le butanolLe projet vise à modifier sur une large échelle une bactérie très connue et très étudiée, le colibacille afin de la rendre capable d’utiliser la cellulose comme seule source de carbone et de transformer son métabolisme afin qu’elle ne produise pratiquement plus qu’un alcool pouvant servir de biocarburant, le butanol.
Vers la création d’un microorganisme capable de produire du butanol cellulosiqueLe butanol est un alcool primaire plus énergétique, moins hygroscopique et présentant un indice d’octane bien meilleur que l’éthanol. Il constituerait donc un biocarburant de choix. Cependant ses coûts de production par voies chimique ou biologique demeurent à l’heure actuelle trop onéreux pour une application de ce type. Le projet Cellutanol vise donc à modifier sur une grande échelle une bactérie très connue et pour laquelle de nombreux outils génétiques sont disponibles pour la rendre capable de convertir directement en butanol une source de carbone très bon marché, la cellulose qui constitue le biopolymère le plus abondant sur terre. Cette bactérie, Escherichia coli, n’est à l’état naturel pas capable de dégrader la cellulose et ne produit pas de butanol. Le projet consiste donc à la doter d’une voie métabolique exogène permettant la production de butanol tout en éliminant les autres voies métaboliques compétitrices. En parallèle, le projet vise à implanter un « système cellulolytique » a minima lui permettant de dégrader et d’utiliser la cellulose comme seule source de carbone. Si ces deux objectifs sont atteints, la combinaison des deux phénotypes (cellulolytique et butanologène) sera effectuée lors de l’étape ultime du projet cellutanol.
Ingénierie à grande échelle du colibacilleLe colibacille n’étant ni cellulolytique ni butanologène, la réalisation de chacun des deux objectifs nécessite une ingénierie de grande ampleur de la bactérie, c’est-à-dire le clonage et l’expression d’un nombre conséquent de gènes issus d’autres organismes, et l’élimination de gènes résidents. Pour l’essentiel, ces gènes sont directement intégrés dans le chromosome, ce qui permet de générer des souches plus stables génétiquement. Cependant, avant leur intégration chromosomique, l’utilité des gènes hétérologues envisagés pour l’approche métabolique ou l’approche cellulolytique est préalablement testée par clonage dans un vecteur réplicatif. D’autre part, afin de limiter le nombre de gènes exogènes nécessaires à l’acquisition du phénotype cellulolytique, la technique des minicellulosomes hybrides est envisagée : il s’agit de complexes artificiels constitués de 3 enzymes (cellulases) dégradant la cellulose regroupées dans un complexe ordonné, ce qui permet d’augmenter considérablement leur activité sur ce substrat récalcitrant. Lorsque le meilleur complexe aura été identifié, il devra alors être sécrété dans le milieu extérieur par le microorganisme, en se basant sur les approches récemment décrites dans la littérature permettant la sécrétion de protéines exogènes par le colibacille.
Résumé de la soumission : Le projet Cellutanol a pour objectif final de construire, en quatre ans, un colibacille capable de convertir directement la cellulose cristalline en butanol à un rendement élevé, et exploitable pour la production de biocarburant de 3ème génération, le butanol possédant un meilleur indice d’octane que l’éthanol. Il repose sur les expertises complémentaires de deux groupes académiques en matières de cellulolyse (Partenaire 1, CNRS, Marseille) et de biologie synthétique couplée à l’ingénierie métabolique (Partenaire 2, INSA, Toulouse). L’originalité de ce projet réside dans le choix de l’hôte qui n’est ni cellulolytique ni producteur de butanol. En effet la plupart des projets concurrents visent à exploiter un producteur naturel de butanol comme Clostridium acetobutylicum pour fermenter des hydrolysats de biomasse végétale obtenus grâce à un cocktail commercial d’enzymes de Trichoderma reesei. Bien que des progrès aient été accomplis au cours de la dernière décade (diminution de la synthèse de coproduits, amélioration des cocktails commerciaux), ces procédés restent loin d’être économiquement viables. Le Partenaire 2 a récemment construit et breveté une souche d’E. coli, exprimant une voie métabolique hétérologue nouvelle permettant  de produire en culture discontinue  9,5 g/L butanol et 0,9 g/L d’éthanol à partir de glucose à un rendement de 0,3 g de butanol/g de glucose, soit 73 % du rendement théorique maximal. Pour réduire drastiquement les coûts, le projet propose i) d’améliorer le rendement, le titre et la productivité de cette souche et ii) d’y introduire un système cellulolytique efficace pour une conversion directe de la cellulose en butanol dans un procédé de type Consolidated BioProcessing. L’introduction simultanée des deux phénotypes (cellulolyse et production de butanol) chez cette bactérie n’a jamais été réalisée et requiert un travail d’ingénierie à grande échelle. Cependant E. coli est la mieux caractérisée des bactéries, croît rapidement, et peut être facilement modifiée grâce aux nombreux outils génétiques disponibles. De plus, à notre connaissance la construction d’une souche cellulolytique d’E. coli surproductrice de butanol n’a pas fait l’objet de brevets. Le projet implique i) la production d’un système cellulolytique optimisé axé sur les cellulosomes artificiels mis au point par le Partenaire 1 dans la souche modifiée déjà construite par le Partenaire 2, ii) l’augmentation du rendement de conversion glucose/butanol par l’inactivation d’autres voies compétitrices (en plus de celles déjà supprimées) récemment découvertes, et iii) l’amélioration de la tolérance au butanol afin de pouvoir produire du butanol en continu à un titre final supérieur à 10 g/l. Chez la nouvelle souche homo-butanologene d’E. coli croissance et consommation de glucose sont couplées à la production de butanol ce qui permettra de développer une stratégie d’évolution in vivo pour améliorer ses performances en termes de titre final, tolérance au butanol et productivité. Lorsque le phénotype amélioré aura été obtenu, un ou plusieurs clones évolués seront isolés, caractérisés et leur génome sera séquencé. Cette stratégie permettra d’identifier et caractériser les cibles génétiques de l’évolution, et la contribution de chaque mutation dans le phénotype amélioré sera évaluée et brevetée. Enfin, pour atteindre une production extracellulaire des cellulosomes suffisante pour générer un phénotype cellulolytique, cinq stratégies différentes pour la sécrétion/exposition pouvant éventuellement être combinées sont envisagées. La phase finale prévoit la combinaison des deux phénotypes par intégration de tous les gènes hétérologues nécessaires à la cellulolyse dans le chromosome de la souche surproductrice de butanol. Le résultat final escompté sera une souche prototype d’E. coli sécrétant un système cellulolytique performant, et ayant une productivité et une tolérance au butanol élevées mais ne synthétisant pratiquement aucun autre produit.
Résultats : -Une souche de colibacille produisant du butanol comme produit majeur de fermentation (à partir de glucose) a été obtenue par le partenaire INSA. Le titre en butanol de cette souche est le plus élevé jamais obtenu chez le colibacille et avoisine celui des meilleurs producteurs naturels comme la bactérie Clostridium acetobutylicum.
-une deuxième génération de souche de colibacille chez laquelle la production de butanol à partir de glucose est dépendante d’un complexe protéique couplant la synthèse d’ATP à la réduction du NAD+ a été construite. Sa capacité à produire du butanol est évaluée.
-une cellulase très efficace issue d’une bactérie cellulolytique a été identifiée, qui peut même accroître la capacité d’une bactérie cellulolytique à consommer la cellulose (CNRS/INSA).
-la composition du meilleur minicellulosome hybride sur cellulose a été établie (CNRS).
-des difficultés inattendues liées à la sécrétion des cellulases chez la souche de colibacille sélectionnée ont été rencontrées. En effet, des taux de sécrétion bien plus faibles qu’attendus au vu des publications à ce sujet ont été obtenus. Cela nous amène à nous intéresser à ses dispositifs de sécrétion et à la structure de ses membranes, que nous envisageons de modifier afin de rendre la sécrétion des cellulases par cette souche plus aisée (CNRS).
Perspectives : La réalisation d’une souche de colibacille ne produisant à partir de sucre simple que du butanol, sans autre coproduit que le dioxyde de carbone, présentera un intérêt dans le secteur chimique. La construction d’une souche d’E. coli capable de croître sur cellulose comme seule source de carbone peut aussi avoir un intérêt dans différents secteurs : en effet cette bactérie est actuellement utilisée comme plateforme pour la production de divers composés, mais à partir de sources de carbone onéreuses. L’emploi d’une souche cellulolytique permettrait de réduire leur coût de production. Enfin si notre objectif final est atteint, une souche capable de convertir directement la cellulose en butanol, le prototype ainsi obtenu devrait être facilement adaptable pour la production de biobutanol cellulosique à faible coût dans le secteur de l’Energie.
Publications et brevets : (1)	Un brevet décrivant la première souche d’E. coli produisant du butanol à haut rendement a été déposé par l’INSA en 2015 : New polypeptide having ferredoxin-NADP+ reductase activity, polynucleotide encoding the same and uses thereof. PCT EP15306225. 
(2)	Un article conjoint CNRS/INSA sur la forte activité d’une cellulase issue d’une bactérie cellulolytique a été publié en 2015: « Combining free and aggregated cellulolytic systems in the cellulosome-producing bacterium Ruminiclostridium cellulolyticum. Biotechnol Biofuels. 8:114. 
(3)	Un article sur la forte activité d’une seconde cellulase en complexe a été publié en 2016 par le CNRS Mechanisms involved in xyloglucan catabolism by the cellulosome-producing bacterium Ruminiclostridium cellulolyticum. Sci Rep. srep22770.