Projet ANR-11-JS08-0014 – IMAPIST : Une approche Metabolomique multi-analytique et multi-compartimentée innovante preservant l'intégrité de tous les types d'échantillons
Programme : JCJC - SIMI 8 - Chimie du solide, colloïdes, physicochimie (JCJC SIMI 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Madame LAETITIA SHINTU (UNIVERSITE AIX-MARSEILLE III)
Partenaires : Institut des Sciences Moléculaires de Marseille
Montant : 228996.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Une approche métabolomique innovante multi-analytique et multi-compartimentée respectant l’intégrité de tous les échantillonsCe projet vise à développer et tester un protocole intégré en métabolomique pour la recherche de biomarqueurs potentiels explicant de façon plus fiable les processus biologiques observés. Le protocole sera basé sur l’analyse en parallèle des tissus et des fluides biologiques par RMN (HRMAS et à l'état liquide) et par spectrométrie de masse.
Améliorer la pertinence des marqueurs identifiés par MétabolomiqueLa plupart des études de métabolomique ont porté sur les variations métaboliques résultant des réponses d'une petite partie du métabolisme (généralement un seul type d'échantillon, à savoir l'urine, le sang, les organes ....) à des stimuli environnementaux ou pathologiques, se basant sur l'hypothèse que cela suffit pour fournir des informations pertinentes sur le phénomène biologique étudié. La découverte de marqueurs est donc réalisée à partir d'un ensemble restreint de métabolites détectés, qui sont peu représentatifs du métabolisme global étudié. Cependant, il a été montré que des connexions systémiques existent entre les différents compartiments biologiques et que l’explicitation de celles-ci pourrait permettre d’étendre la connaissance des mécanismes biologiques impliqués.Le présent projet vise à renforcer l'importance des biomarqueurs potentiels distingués par la métabolomique, et ainsi de simplifier l'interprétation métabolique de la réponse du métabolisme. Ce résultat sera atteint en mettant au point le plus haut degré d'intégration à la fois sur les aspects analytiques et d'échantillonnage. Le premier degré de l'intégration se fera par l'analyse des tissus, qui fournit une description localisée des variations métaboliques, et celle des biofluides, qui fournissent une description globale de ces variations.La stabilité et les performances du protocole sera testé sur deux importants cas d’études : la recherche des interactions symbiotiques entre hôte et microbiote chez les souris gnotobiotiques et l'évaluation de la malignité du cancer de la thyroïde dans une étude préclinique.
Préservation de l'intégrité des échantillons et fusion des données analytiquesUne partie de nos analyses sera effectuée sur des tissus animaux ou humains. L'une des techniques les plus adaptée pour ce type d'analyse est la RMN à rotation à l'angle magique ou RMN HRMAS. En effet, celle-ci permet d'analyser des tissus intacts sans extraction préalable. Cependant, cette technique, de part son principe, implique le rotation de l'échantillon à l'angle magique à des vitesses de plusieurs kHz correspondant à une force centrifuge ressentie supérieur à 100 000g. Dans le cas de tissus délicat, l'échantillon est détérioré au cours de l'analyse. Afin de préserver l'état de l'échantillon, nous allons procéder à l'analyse HRMAS des échantillons à rotation lente (400Hz). La sélection de la géométrie du rotor dans lequel l'échantillon est placé devrait permettre d'obtenir des spectres 1D 1H non  ou peu perturbés par la présence de bandes de rotation.Concernant les autres types d'échantillons (biofluides) les protocoles expérimentaux RMN liquide et LC/MS sont bien connus. Pour chaque échantillon, une approche Métabolomique classique sera appliquée afin de déterminer les métabolites permettant soit la discrimination des tumeurs de la thyroïde en fonction de leur malignicité, soit la mise en évidence du rôle de la bactérie Ruminnococcus gnavus E1 sur l'intestin en fonction du régime alimentaire. Dans un second temps, toutes les données (pour chaque application) seront fusionnées dans l'optique de générer un modèle statistique plus performant et d'identifier des biomarqueurs plus pertinents.
Résumé de la soumission : Ce projet vise à développer et tester un protocole intégré pour la découverte de biomarqueurs potentiels ayant une meilleure significativité biologique. Le protocole s'appuiera sur l'étude en parallèle de tissus et de fluides biologiques par RMN (HRMAS et à l'état liquide) et par spectrométrie de masse, outils autorisant l'analyse automatisée d'un grand nombre d'échantillons, y compris pour les échantillons semi-solides grâce à l’utilisation du deuxième passeur d’échantillons HRMAS réfrigéré mis sur le marché mondial. La stabilité et les performances du protocole seront testées sur deux très intéressant cas d’études: 1) la caractérisation des interactions symbiotiques entre intestin et microbiote dans un modèle de souris gnotobiotiques, 2) l’évaluation de la malignité de cancers de la thyroid. Les deux études sont bien caractérisées par d'importants travaux préliminaires et le projet en cours contribuera à fournir une information précise sur les métabolites pertinents. La métabolomique a rencontré un succès croissant, basé sur l’augmentation des performances des outils analytiques et statistiques et sur une approche globale qui ne requiert pas de connaissances a priori des métabolites recherchés. La plupart des études métabolomiques porte sur la quantification des variations métaboliques, en réponse à un stimulus environnemental ou pathologique, d’une partie réduite du métabolisme (un seul type d’échantillon) se basant sur l'hypothèse que cela est suffisant pour fournir des informations pertinentes. La découverte de marqueurs est par conséquent réalisée à partir d'un ensemble restreint de métabolites détectés, qui peuvent être peu représentatifs du métabolisme global étudié et par conséquent, ne décrire qu’une partie de la réponse du système. Toutefois, des approches systémiques (analyse de plusieurs types d'échantillons) ont été montrées comme permettant de dévoiler des biomarqueurs additionnels qui peuvent compléter l'information sur la réponse métabolique induite. Le présent projet vise donc à renforcer l'importance biologique des biomarqueurs détectés grâce à l’analyse métabolomique de différents compartiments biologiques. Ces biomarqueurs, détectés parmi un ensemble de métabolites fortement représentatifs du metabolisme global devrait faciliter l’interprétation de la réponse du système biologique. Ce résultat sera atteint par l'élaboration d’un protocole mettant en jeu l’analyse d’échantillons donnant des information complémentaires, c’est-à-dire l’analyse simultanée des tissus, qui fournissent une version localisée de la réponse, et des biofluides. Ces échantillons seront étudiés par un ensemble de techniques analytiques permettant la détection d’un très grand nombre de métabolites.Les objectifs méthodologiques sont :  1. Développer un protocole permettant l’analyse des échantillons par RMN HRMAS à rotation lente, compatible avec la préservation de l’intégrité morphologique des tissus et l’analyse haut débit d’une grande variété de tissus biologiques. 2. Mettre en œuvre un protocole intégré d’analyse de tissus/ biofluides par RMN et spectrométrie de masse afin d'améliorer l'importance de la significativité des biomarqueurs potentiels et de simplifier la compréhension des mécanismes biologiques mis en jeu.Pour tester le potentiel de notre protocole, nous allons l’utiliser au cours de deux études distinctes:1. Nous allons appliquer notre protocole intégré pour la recherche de marqueurs mettant en évidence les interactions symbiotiques entre des bactéries Gram positive et les parois intestinales chez la souris. 2. Nous allons appliquer notre protocole intégré pour évaluer le degré de malignité de cancers thyroïdiens.
Résultats : RMN HRMAS à rotation lente : l'utilisation d'un rotor de 12 ul permet de réduire l'apparition des bandes de rotation pour les liquides (solution de phénylalanine) et pour les solides (foie de génisse). Il est aussi possible de faire des spectres « CPMG » par RMN HRMAS proton à haute résolution à une vitesse de 400 Hz en utilisant la séquence PROJECT. Cela nécessite cependant une préparation d’échantillons extrêmement spécifique mais peut être appliqué avec des rotors de 12ul ou des inserts jetables de 30ul.
RMN HRMAS sur les cellules CaCO2 : la lyse des cellules CaCO2 est nécessaire pour obtenir une spectre proton de haute résolution. 48 h de contact entre le milieu de culture de Ruminococcus gnavus E1 et les cellules épithéliales CACO2 sont nécessaires pour observer une modification du métabolisme de ces cellules. 
Effet de FOS sur le métabolisme des souris : La présence de FOS (prébiotique) permet de réduire le stockage de gras chez les souris conventionnelles. Les fèces montrent que le prébiotique accélère l’activation bactérienne, ce qui augmente la production d’acétate et de butyrate aux niveaux des intestins. De plus, on note une activation de la bile salt hydrolase qui est responsible de la dégradation de l’acide tauro-beta-muricholique, de la déconjugaison des acides biliaires et de l’altération du métabolisme lipidique.
Métabolomique sur les cytoponctions  de patients ayant une tumeur bénigne ou maligne de la thyroïde : L’analyse statistique supervisée OPLSDA des ponctions de tumeurs de la thyroïde conduit à un modèle robuste discriminant les lésions bénignes des lésions malignes avec un taux de prédiction de 89%, ce qui en fait un modèle plus prédictif que ceux existants (génomique ou protéomique).
Perspectives : Les modèles in vitro et in vivo permettant la caractérisation des interactions hôte/Ruminnococcus gnavus E1 doivent être mise en place (in vitro en cours, in vivo prévu en Novembre 2014).
Les échantillons de tissus des souris conventionelles soumis à un régime riche en gras ou riche en gras +FOS doivent être analysées par RMN HRMAS. Les données LC/MS sur les biofluides doivent être traitées statistiquement.
Publications et brevets : Publication
Torregrossa, L.*; Shintu, L*; Chandran, JN ; Tintaru, A; Ugolini, C ; Magalhaes, A ; Basolo, F ; Miccoli, P ; Caldarelli, S. Toward the Reliable Diagnosis of Indeterminate Thyroid Lesions: A HRMAS NMR-Based Metabolomics Case of Study Journal of Proteome Research, 2012, 11(6), 3317-3325
Marie Renault, Laetitia Shintu, Martial Piotto, and Stefano Caldarelli * Slow-spinning low-sideband HR-MAS NMR spectroscopy: delicate analysis of biological samples, Scientific Report, 2013
André, Marion; Dumez, Jean-Nicolas; Shintu, Laetitia; Rezig, Lamya; Piotto, Martial; Caldarelli, Stefano A complete protocol for slow-spinning High-Resolution Magic-Angle Spinning NMR analysis of fragile tissues Analytical chemistry, 2014, resoumis après révision
Conférence invité
L. Shintu – Conférence Invitée – Iode et Cancer – Nice -27 Juin 2014
Poster:
XXVth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems 
19-24 Aout 2012
NMR-based Metabolomics analysis of plasma samples for the diagnosis of thyroid cancer
L. Rezig, L. Shintu, L. Torregrossa, C. Ugolini, M. Minuto, F. Basolo, P. Miccoli, S. Caldarelli
Slow-spinning low-sideband HR-MAS NMR spectroscopy: delicate analysis of biological samples
M. Renault, L. Shintu, M. Piotto, S. Caldarelli
EUROMAR 2012, Dublin (Irlande)
1-5 Juillet 2012
Metabolomics Analysis of targeted multi-compartmental samples for the diagnosis of thyroid cancer
L. Shintu, L. Torregrossa, J. Nambiath Chandran, M. Renault, C. Ugolini, M. Minuto, F. Basolo, P. Miccoli, S. Caldarelli
NMR based Metabolomics for the diagnosis of thyroid cancer - Lamya Rezig, , Adele Servadio, Liborio Torregrossa , Fulvio Basolo, Paolo Miccoli, Laetitia Shintu Stefano Caldarelli – Metabomeeting 2014 – 10-12 Septembre 2014
NMR based Metabolomics for the diagnosis of thyroid cancer - Lamya Rezig, , Adele Servadio, Liborio Torregrossa , Fulvio Basolo, Paolo Miccoli, Laetitia Shintu Stefano Caldarelli – 8ème journées du RFMF 2014 – 19-21 Mai 2014