Projet ANR-08-BLAN-0201 – PneumoPG : Reconstitution in vitro de la synthèse du peptidoglycane du pneumocoque
Programme : Blanc (BLANC) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-ALPES SECTEUR ALPES)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique
Montant : 263802.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 36 mois
Résumé : Reconstitution in vitro de la synthèse du peptidoglycane du pneumococque. La résistance aux beta-lactamines du pneumocoque résultant de modifications des 'penicillin-binding proteins' (PBPs) est bien connue, mais les réactions physiologiques catalysées par les PBPs restent largement ignorées. Comprendre ces réactions aidera à combattre la résistance en résolvant paradoxe suivant. Comment les PBPs modifiées gardent leur fonction, alors qu'elles ne réagissent pas avec les beta-lactamines qui pourtant miment les substrats naturels? Pour aborder cette question, nous allons reconstituer in vitro les étapes finales de l'assemblage du peptidoglycane. Le peptidoglycane est composé de chaînes de disaccharides répétés, réticulées par des ponts peptidiques. L'assemblage est catalysé par les penicillin-binding proteins (PBPs) à partir d'un disaccharide pentapeptide lié à un lipide (lipid II). Les PBPs de classe B sont monofonctionnels permettent probablement la formation de liens peptidiques entre chaînes glycane. Les indications de cette activité sont limitées et indirectes, et la réaction n'a jamais été reproduite in vitro avec des substrats ressemblant de près aux véritables substrats. Les PBPs de classe A sont bifonctionnels, et il a été montré qu'ils peuvent polymeriser les chaînes glycane à partir du précurseur lipide II, et former les ponts peptidiques inter-chaînes. Les protéines SEDS (pour 'shape, elongation, division and sporulation') sont des protéines membrannaires intégrales qui participent vraissemblablement à l'assemblage du peptidoglycane avec les PBPs de classe B, ce qui est suggéré par divers arguments génétiques. Nous faisons l'hypothèse que les PBPs de classe B requièrent la présence de protéines SEDS. Les PBPs de classe B de S. pneumoniae, PBP2x et PBP2b seront produites de façon recombinante, avec leur protéines SEDS respectives, FtsW et RodA. L'activité sera recherchée avec des chaînes glycane prépolymerisées, ou en incluant une PBP de classe A et le lipide II précurseur. Des essais seront mis au point, avec nos collaborateurs, en solution en présence de détergents, avec des vésicules reconstituées et sur des membranes lipidiques fixées sur surface solide. Les rôles possibles de protéines de régulation, telles que les complexes DivIB/FtsL/DivIC ou MreC/MreD, seront étudiés également. Le rôle de substrats alternatif dans l'expression de la resistance aux beta-lactamines médiée par des altérations des PBPs sera également étudié. Ce projet est un défi en ce que toutes les protéines impliquées sont membranaires. Un obstacle important à surmonter sera l'obtention de quantité suffisante de matériel. Néanmoins, il faut désormais aborder les formes membranaires des protéines de la synthèse de la paroi bactérienne pour avancer biochimiquement de façon significative. La reconstitution in vitro de l'assemblage du peptidoglycane catalysé en partie par les PBPs de classe B ouvrira la voie à l'étude des fonctions des différentes PBPs de classe A et B, des protéines SEDS (FtsW, RodA), des mécanismes enzymatiques, des rôles possibles de protéines accessoires (DivIB/FtsL/DivIC et MreC/MreD). Nous désirons identifier les éléments qui maintiennent l'activité enzymatiques des PBPs modifées qui ont une faible réactivité avec les beta-lactamines, que ce soient des caractéristiques des substrats ou la présence de protéines accessoires.