Projet ANR-11-BSV8-0020 – IntegraMed : Etude integrative de la fonction du Médiateur dans la regulation de la transcription.
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Michel WERNER (COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES  - DIRECTION DU CENTRE DE FONTENAY-AUX-ROSES)
Partenaires : Institut de Biologie et de Technologies de Saclay
Montant : 350000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Compréhension des mécanismes fondamentaux de la régulation de la transcription des gènes.Le Médiateur de la transcription est un coactivateur essentiel requis pour le recrutement de l’ARN polymérase II et de certains de ses facteurs généraux. Il est constitué de 25 protéines dont 10 sont essentielles à la vie chez la levure. Sa grande complexité a empêché de comprendre les détails de son fonctionnement. Le projet vise à l’étudier par des méthodes innovantes de biologie intégrative.
Le projet IntégraMed vise à comprendre comment une molécule complexe, le Médiateur de la transcription, contrôle l’expression des gènes en situation normale ou pathologiqueLe projet IntégraMed vise à comprendre comment une molécule complexe, le Médiateur de la transcription, contrôle l’expression des gènes en situation normale ou dans des pathologies telles que les cancers ou des maladies congénitales touchant le développement.La régulation de la transcription constitue un mécanisme clé dans la régulation de l’expression des gènes et donc dans le fonctionnement de la cellule. Ce processus est hautement régulé pour assurer une réponse appropriée de la cellule à son environnement extérieur ou tissulaire.La dérégulation de la transcription est une cause majeure de maladie et mène à des pathologies congénitales du développement et aux cancers. Chez les organismes eucaryotes, dont l’homme fait partie, la transcription requiert outre l’ARN polymérase des facteurs généraux de la transcription et des coactivateurs. Le Médiateur est un coactivateur particulier en ce sens qu’il est requis, comme nous l’avons montré au laboratoire, pour le recrutement de l’ARN polymérase II et de certains des facteurs de transcription. Le projet IntegraMed vise à comprendre en détail et à l’échelle du génome comment le Médiateur exerce sa fonction dans le recrutement de l’ARN polymérase II et de ses facteurs. Il tend également à étudier comment le processus de transcription est intégré avec celui de la réparation de l’ADN couplée. La compréhension de la fonction du Médiateur permettra de décrire les mécanismes de la régulation de la transcription et comment leur altération peut mener à des cancers.
Biologie intégrative de la régulation de la transcripition des gènes in vivo et in vitro.Le projet IntegraMed utilise la levure de bière et les cellules humaines comme modèles. Le médiateur comporte 25 sous-unités protéiques dont 10 dont essentielle à la survie de la levure. Nous avons obtenu des mutants de six des sous-unités essentielles qui touchent la fonction du Médiateur. Nous étudions l’effet de ces mutations sur la mise en place des complexes de préinitiation par la technique d’immuno-précipitation de la chromatine couplée à la PCR ou au séquençage à très haut débit. Nous utilisons également des approches de biochimie pour étudier la mise en place des complexes de préinitiation et la transcription in vitro. Enfin, nous étudions l’impact des mutations affectant la fonction du Médiateur et touchant des résidus conservés dans des lignées de cellules humaines par des approches similaires.
Résumé de la soumission : La transcription est la première étape de l’expression génétique chez tous les organismes vivants. Chez les eucaryotes, trois ARN polymérases (Pol) transcrivent le génome. Pol II, une enzyme de douze sous-unités, transcrit non seulement les gènes codant les protéines mais aussi un grand nombre d’ARNs non-codants, dont certains sont cryptiques et instables. L’ensemble des protéines exprimées à un moment donné, dans un tissu particulier, une situation développementale ou environnementale particulière varie de manière importante. Par conséquent, l’activité de chacun des milliers de gènes d’un organisme doit être strictement régulée.La Pol II, comme les autres ARNs polymérases eucaryotiques, est incapable de reconnaître les promoteurs des gènes sans l’aide de protéines appelées facteurs généraux de la transcription (GTFs appelés TFIIA, -B, -D, -E, -F et -H). Deux de ces GTFs, TFIIH et TFIID sont composés de respectivement 10 et 15 sous-unités. Bien que cette machinerie, comme la Pol II, soit extrêmement compliquée, elle n’est pas suffisante pour permettre la réponse aux centaines d’activateurs de la transcription présents dans la cellule eucaryote. Un certain nombre de complexes multi-protéiques supplémentaires, appelés co-activateurs, permet à la machinerie de transcription par la Pol II de répondre aux co-activateurs. Certains de ces co-activateurs agissent sur la chromatine en modifiant, d’autres en déplaçant les nucléosomes. Un autre co-activateur, composé de 25 sous-unités, le Médiateur joue un rôle central dans l’activation de la transcription et transmets les signaux depuis les activateurs vers la Pol II. Ce complexe est conservé chez tous les eucaryotes et requis pour l’expression de l’ensemble des gènes de classe II. Certaines mutations le touchant peuvent provoquer des maladies génétiques graves du développement ou des cancers.Depuis quelques années, nous avons entrepris la caractérisation approfondie du fonctionnement du Médiateur in vivo. Nous avons décidé de concentrer nos efforts sur l’étude des dix sous-unités essentielles chez S. cerevisiae car elles sont parmi les plus conservées et sont donc selon toute vraisemblance responsables de ses fonctions les plus fondamentales. Le choix de la levure est justifié par la possibilité d’utiliser de puissantes approches de biologie intégrative qui combinent biologie moléculaire et génétique avec génomique fonctionnelle et biochimie. L’approche générale que nous avons utilisé est de produire tout d’abord des collections de mutations conditionnelles des gènes qui codent les sous-unités essentielles du Médiateur. Nous évaluons ensuite in vivo leur effet sur l’assemblage des complexes de préinitiation (PIC) comprenant les GTFs et la Pol II sur des gènes spécifiques ou sur l’ensemble du génome. Nous étudions ensuite comment ces mutations affectent l’interaction de ces sous-unités avec leurs partenaires dans et en dehors du Médiateur et sur la transcription.En utilisant cette approche générale, nous avons démontré contrairement aux modèles d’assemblage du PIC présentés dans les « textbooks », que le Médiateur, et non la Pol II, recrute TFIIH. Nous avons également récemment trouvé que le Médiateur est essentiel in vivo pour le recrutement de la Pol II sur l’ensemble du génome au travers d’une interaction directe entre les deux complexes.Nous voulons maintenant étendre notre analyse à de nouvelles sous-unités essentielles du Médiateur pour découvrir de nouveaux mécanismes par lesquels il contribue à la régulation de la transcription. Nous enrichirons nos approches de nouvelles méthodes biochimique et de génomique fonctionnelle qui nous permettront de mieux comprendre le fonctionnement du Médiateur. Nous pensons que ce projet nous permettra de mettre en évidence des mécanismes fondamentaux de la régulation de la transcription inconnus à ce jour.
Résultats : Néant. Le projet a commencé il y a six mois.
Perspectives : Ce projet est à visée cognitive. Les retombées seront des publications scientifiques dans des journaux internationaux à comité de lecture. Les meilleurs journaux seront visés. Il permettra également de comprendre comment certaines mutations du Médiateur peuvent affecter l’expression des programmes génétiques dans des cancers.
Publications et brevets : Néant. Le projet ayant six mois d’existence, il est normal qu’aucune publication ou brevet n’existe.