Projet ANR-12-BSV8-0004 – ESCRT-ARC : Caractérisation structurale et fonctionnelle des protéines ESCRT-III-like de Metallospherae sedula
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame Patricia RENESTO (Unit of Virus Host Cell Interactions)
Partenaires : Laboratoire public
Montant : 199118.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 24 mois
Résumé : Protéines ESCRT-III d'archéesHomologie  entre la machinerie ESCRT-III eucaryote et les protéines Cdv d’archées/Ce projet repose sur l’utilisation des protéines Cdv d’archées comme modèle pour mieux comprendre comment  les complexes ESCRT-III orchestrent la fission membranaire chez les eucaryotes et aussi indirectement contribuer à la compréhension de leur infection par des particules virales.
Analyse structurale de CdvB (ESCRT-III like)  et de CdvC (Vps4-like)Les différents objectifs du projet dont les enjeux sont indiqués ci-dessus sont :1-	Structure cristallographique de CdvB (ESCRT-III-like) et/ou de ce2-	Bases structurales de la poymérisation de CdvB3-	Structure cristallographique de CdvC (AAA-ATPase) et     caractérisation de l’interaction avec CdvB4-	Analyse des déformation de membranes artificielles5-	Evaluation du rôle des protéines Cdv in vivo
Purification et Cristallisation des protéinesConcernant CdvB, nous avons tenté d’optimiser les protocoles de purification afin d’augmenter la concentration de protéine soluble. Différents paralogues et  des formes délétées  en C-terminal  ont également été testées sans amélioration significative. Nous envisageons maintenant de produire des mutants ponctuels afin de tenter de bloquer la polymérisation de la protéine et d’obtenir un échantillon monodisperse. L’analyse des mutations à générer est actuellement en cours.Concernant CdvC, nous avons suivi la même stratégie. Cette AAA-ATPase  forme un dodécamère correspondant à deux hexamères empilés l’un sur l’autre. Différentes mutations ont été générées afin de bloquer l’AAA-ATPase dans un seul état conformationnel (ouvert ou fermé). Nous avons en outre effectué des purifications en présence d’ATP ou d’ADP afin de stabiliser les complexes. Plusieurs cristaux ont été obtenus mais leur limite de diffraction est de 8.  A partir de mutants délétés en N-terminal  (MIT domaine), nous avons produit des cristaux qui ont diffractés à une résolution de 3.5 A.  Dans ces conditions nous avons non plus un dodécamère mais un hexamère qui est formé. Nous allons reprendre les constructions pour voir si le linker permet de restaurer l’association de 12 sous-unités.
Résumé de la soumission : Les archées représentent le troisième domaine du Vivant avec les Eucayotes et les Bactéries et sont divisées en trois phyla majeur, Euryarchaeota, Crenarcheaota et Thaumarchaeota qui présentent des différences essentielles pour certains mécanismes moléculaires dont la réplication de l'ADN ou la division cellulaire. Ainsi la division des  Euryarchaeota et des  Thaumarchaeota met en jeu la protéine ubiquitaire FtsZ,  tandis que chez les Crenarchaeota où FtsZ est absent, la  cytokinèse dépend d’une machinerie Cdv (pour  Cell division) récemment découverte. Deux des 3 protéines Cdv sont des homologues de protéines eucaryotes  de la machinerie  “endosomal sorting complex required for transport III (ESCRT-III)” qui catalyse le processus de fission membranaire commun au bourgeonnement viral, à la formation des vésicules et à la cytokinèse. CdvB est homologue aux protéines ESCRT-III impliquées dans la fission membranaire et  CdvC est homologue à l’ATPase Vps4 nécessaire au désassemblage des complexes d’ESCRT-III.  La troisième protéine codée par le même cluster de gènes, soit  CdvA, est exclusive aux archées. Nos propres expériences soutiennent l’hypothèse  que CdvA pourrait être une protéine ancestrale du cytosquelette impliquée dans la division cellulaire.Les données dont nous disposons plaident en faveur d’une forte conservation entre les protéines Cdv d’archées et leurs homologues eucaryotes, incluant la présence d’un domaine MIM (MIT domain interacting motif) dans la région C-terminale de CdvB et qui interagit avec CdvC. Cette région de  CdvB contient en outre un domaine responsable de l’interaction de cette protéine avec CdvA, les interactions CdvA/CdvB et CdvB/CdvC  n’étant pas mutuellement exclusives.  Si les interactions entre les protéines codées par le cluster Cdv ont été largement étudiées, rien n’est connu à propos des paralogues  de  CdvB  dispersés dans  les génomes de  Crenarcheota.  De plus, nous ne disposons d’aucune donnée fonctionnelle, mécanique ou structurale qui permettrait de comprendre comment ces protéines catalysent la cytokinèse.  Dans le but d’établir les bases structurales des déformations membranaires  par les protéines CdvB nous nous sommes fixés 5 objectifs distincts : 1- Résoudre la structure cristallographique de CdvB, ce qui servira de base pour comprendre l’activation et la polymérisation de cette protéine. 2- Comprendre comment les sous-unités de CdvB s’associent  et déterminer la structure de l’interface d’interaction, ce qui devrait nous éclairer quant à l’ancrage membranaire du polymère et la déformation qui en découle. Ces deux premiers objectifs seront élargis aux homologues de CdvB présents dans le génome et au regard de leurs propres interactions avec CdvB ou CdvC. 3- Analyser le mécanisme de désassemblage des polymères de CdvB par l’AAA-ATPase CdvC,  la première étape indispensable à la compréhension de ce phénomène  étant la résolution de  la structure cristallographique des dodécamères  formés par cette protéine. 4- Etudier la capacité de CdvB à déformer les membranes in vitro en utilisant le modèle de GUVs en collaboration avec P. Bassereau (Institut Curie, Paris). Enfin, nous envisageons  5- de valider les données structurales acquises dans ce travail par la construction de mutants d’archées dont le cycle réplicatif sera suivi  en collaboration avec  R. Bernander (Uppsala, Sweden). Ce projet devrait contribuer à obtenir  une vision complète des bases structurales à l’origine de la déformation des membranes d’archées impliquée dans le phénomène de cytokinèse.  Compte tenu de l’importance des protéines ESCRT-III au cours de divers processus eucaryotes, ce travail est réalisé en complément d’études menées  dans le laboratoire sur les protéines ESCRT-III eucaryotes et devrait contribuer à une meilleure compréhension de la manière dont les complexes ESCRT-III orchestrent la fission membranaire chez les eucaryotes et ouvrir  de nouvelles perspectives relatives à la biologie des virus.
Résultats : Plusieurs constructions de CdvB ont été clonées et  purifiées en utilisant différents protocoles. Toutefois, nous ne sommes actuellement  pas en mesure de produire une protéine recombinante qui puisse être concentrée  pour des tests de cristallisation.
Le résultat majeur de ce premier semestre est d’avoir pu résoudre la structure de l’AAA-ATPase d’archées CdvC sous sa forme hexamérique  (cf image ci-dessous). L’affinement est encore en cours, mais nous pouvons déjà dire que nous avons affaire à un dimère de trimères. Il s’agit là des premières données structurales obtenues par cristallographie aux rayons X. Toujours concernant CdvC, nous avons déterminé les concentrations d’acides nucléiques qui induisaient la stabilisation des complexes. Enfin, nous avons montré que l’association des deux anneaux de l’AAA-ATPase était dépendante de la concentration de sels dans le tampon. Ce sont là des éléments clefs qui devraient nous aider à cristalliser le dodécamère.
Perspectives : Comme mentionné ci-dessus, nous allons pour chacune des deux protéines d’intérêt poursuivre le clonage de nouveaux mutants afin d’améliorer la solubilité de CdvB et de cristalliser le dodécamère de CdvC.  Nous allons également aborder l’étude de CdvB par SAXS ce qui demande des quantités moindre de matériel que la cristallographie aux rayons X et peut donc être envisagée.
Publications et brevets : aucune