Projet ANR-14-CE19-0006 – CONNECT : La communication intercellulaire chez les plantes: implication des radeaux membranaires dans le fonctionnement des plasmodesmes.
Programme : Une nouvelle représentation du vivant (DS0401)
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Madame emmanuelle bayer (Laboratiore de Biogenèse Membranaire)
Partenaires : Laboratoire public
Montant : 228592.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 48 mois
Résumé : LA COMMUNICATION INTERCELLUAIRE CHEZ LES PLANTESLa communication intercellulaire chez les plantes: implication des radeauxmembranaires dans le fonctionnement des plasmodesmes.
le role des microdomaines membraneuse dans le fonctionnement des plasmodesmesChez les plantes, la communication de cellule à cellule se fait en grande partie grâce aux plasmodesmes (PD), des canaux membranaires spécialisés traversant la paroi pectocellulosique et créant ainsi une continuité symplastique entre cellules. Les PD jouent un rôle essentiel dans le développement des plantes ainsi que dans l’orchestration des mécanismes de défense. Ils constituent également des portes d’accès privilégiées pour les virus, qui les exploitent afin de transporter leur génome de cellule à cellule et ainsi établir une infection systémique de la plante. Malgré leur implication dans de nombreux processus physiologiques clés chez les plantes, la régulation des échanges intercellulaires via les PD reste énigmatique. L’une des principales raisons réside dans le fait que leur composition moléculaire reste très peu connue. En particulier, leur composition lipidique reste à ce jour totalement inexplorée. Les PD sont pourtant des structures membranaires, définies par des domaines membranaires spécialisés du réticulum endoplasmique, le desmotubule et de la membrane plasmique, PD-MP. L’identité et la fonction de leur constituants lipidiques restent malgré tout entièrement inconnues.  Le projet CONNECT a pour ambition d’établir s’il existe un lien fonctionnel entre les PD et les radeaux membranaires, en particulier dans le contexte de l’infection virale. modèle.
biochemistry; lipidomics; proteomics; high-resolution microscopyEn utilisant des approches complémentaires et variées comme la lipidomique, analyse spectrométrique et microscopie haute résolution nous nous proposons de déterminer si la membrane plasmique délimitant les PD est de type “radeau membranaire”. En particulier, présente-elle un enrichissement en stérols, sphingolipides ? Pour cela, les PD seront purifiés à partir de suspensions cellulaires et leur composition lipidique déterminée. Nous mesurerons également le degré d’ordre des membranes de PD, à l’aide de sondes fluorescentes. Les microdomaines de type raft sont caractérisés par un arrangement très ordonnés et compact des lipides les constituant. Nous étudierons le rôle des lipides dans le ciblage des PD ainsi que dans le maintien de la ségrégation latérale existant au niveau de la PD-MP, en modifiant par exemple leur teneur en stérols. Le rôle des radeaux membranaires et de la Rémorine dans le contrôle de la propagation virale du virus PVX sera examiné en utilisant Nicotiana benthamiana comme plante
Résumé de la soumission : Chez les plantes, la communication de cellule à cellule se fait en grande partie grâce aux plasmodesmes (PD), des canaux membranaires spécialisés traversant la paroi pectocellulosique et créant ainsi une continuité symplastique entre cellules. Les PD jouent un rôle essentiel dans le développement des plantes ainsi que dans l’orchestration des mécanismes de défense. Ils constituent également des portes d’accès privilégiées pour les virus, qui les exploitent afin de transporter leur génome de cellule à cellule et ainsi établir une infection systémique de la plante. Malgré leur implication dans de nombreux processus physiologiques clés chez les plantes, la régulation des échanges intercellulaires via les PD reste énigmatique. L’une des principales raisons réside dans le fait que leur composition moléculaire reste très peu connue. En particulier, leur composition lipidique reste à ce jour totalement inexplorée. Les PD sont pourtant des structures membranaires, définies par des domaines membranaires spécialisés du réticulum endoplasmique, le desmotubule et de la membrane plasmique, PD-MP. L’identité et la fonction de leur constituants lipidiques restent malgré tout entièrement inconnues.  Pourtant, de récentes données expérimentales suggèrent que les PD sont fortement apparentés aux radeaux membranaires, des microdomaines spécialisés de la membrane plasmique caractérisés par un enrichissement en stérols, sphingolipides, et acides gras saturés leur conférant des propriétés physicochimiques uniques à l’origine de leur mode de fonctionnement. Ainsi, la Rémorine, une protéine membranaire, premier marqueur des radeaux membranaires mis en évidence chez les plantes, a été localisée au niveau de la membrane plasmique per se mais également le long des PD. Une modulation de son niveau d’expression chez la tomate influe la propagation virale et plus particulièrement le mouvement intercellulaire du virus Potato virus X (PVX ; potexvirus). Ces résultats impliquent non seulement un rôle physiologique de la protéine Rémorine et des radeaux membranaires dans la propagation des virus via les PD, mais encore suggèrent que la membrane plasmique (ou une partie) délimitant les PD est de type “radeau membranaire”. Le projet CONNECT a pour ambition d’établir s’il existe un lien fonctionnel entre les PD et les radeaux membranaires, en particulier dans le contexte de l’infection virale. En utilisant des approches complémentaires et variées comme la lipidomique, analyse spectrométrique et microscopie haute résolution nous nous proposons de déterminer si la membrane plasmique délimitant les PD est de type “radeau membranaire”. En particulier, présente-elle un enrichissement en stérols, sphingolipides ? Pour cela, les PD seront purifiés à partir de suspensions cellulaires et leur composition lipidique déterminée. Nous mesurerons également le degré d’ordre des membranes de PD, à l’aide de sondes fluorescentes. Les microdomaines de type raft sont caractérisés par un arrangement très ordonnés et compact des lipides les constituant. Nous étudierons le rôle des lipides dans le ciblage des PD ainsi que dans le maintien de la ségrégation latérale existant au niveau de la PD-MP, en modifiant par exemple leur teneur en stérols. Le rôle des radeaux membranaires et de la Rémorine dans le contrôle de la propagation virale du virus PVX sera examiné en utilisant Nicotiana benthamiana comme plante modèle.
Résultats : we isolated PD-enriched membrane fractions from Arabidopsis suspension cells and analyzed their lipid composition.  Extensive characterisation of the PD-enriched fraction revealed that the level of purity required to conduct a reliable and accurate lipidomic analysis has been reached. In particular, we show that the cellular membrane compartments continuous with the PD pores, namely the ER and the PM, are excised during the purification process and do not significantly contaminate the final fraction.
 Using MS-based comparative lipidomic analysis, we could show that the PD-PM domain has a distinct lipid profile when compared to the cellular PM. In particular our data indicate that the PD-PM is enriched in sterols, highly glycosylated sphingolipids harbouring very long chain fatty acids (Glycosyl Inositol Phosphoryl Ceramides; GIPCs) and phospholipids containing fatty acids with reduced degree of desaturation. Intriguingly, this lipid profile is reminiscent of  “raft” domains and therefore suggests that the PD membranes cluster sterol- and sphingolipid-enriched domains.  
We next explore the potential for lipids and especially sterols to organise PD-specialed membrane domains and regulate cell-to-cell connectivity. Employing pharmacological approaches, we were able to demonstrate that alteration of the membrane pool of sterols strongly interferes with the ability of PD-Callose Binding Protein1 and the ß1-3 glucanase PdBG2, which are both GPI-anchored proteins, to associate with primary PD. Inhibition of PD targeting under sterol inhibitor treatment was correlated with a modification of both callose deposition and PD permeability. 
Altogether, our data do not only provide a comprehensive analysis of the lipid constituents of PD but also identifies a role for sterols in modulating cell-to-cell connectivity possibly by establishing and maintaining positional specificity of callose modifying GPI-proteins at PD.
Perspectives : Détermination des propriétés physiquechimiques des membranes de plasmodesmes en function de leur composition lipidique et l'impact sur le connectivité intercellulaire durant l'infection virale
Publications et brevets : • Pérez-Sancho J., Tilsner J., Samuels L.A., Botella M.A., Bayer E.M. and Rosado A. Stitching organelles: Organization and function of plant membrane contact sites. Trends in Cell Biology (accepted for publication). 
• Faulkner C and Bayer E.M. * Isolation of plasmodesmata. Methods in Molecular Biology edition “The Isolation of Plant Organelles and Structures: Methods and Protocols” (accepted for publication). 
• Tilsner J, Nicolas W. Rosado A and Bayer E.M. * Staying tight : plasmodesmal membrane contact sites and the control of cell-to-cell connectivity in plants. Annual Review of Plant Biology 67:23.1-23.28  
• Grison MS, Brocard L, Fouillen L, Nicolas W, Wewer V , Dörmann P, Nacir  H, Benitez-Alfonso Y, Claverol S, Germain V, Boutté Y, Mongrand S and Bayer EM* (2015). Specific membrane lipid composition is important for plasmodesmata function. The plant Cell 27(4):1228-50