Projet ANR-13-KBBE-0002 – SEEDS : Yield enhancement in oilseed rape
Programme : Food & Feed: crop yiels and nutrition security in the context of clinate change (PLANT-KBBE)
Année de financement : 2013
Coordinateur du projet : Monsieur Bernard Pelissier (Bayer SAS)
Partenaires : BAYER SAS
Montant : 52000.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 36 mois
Résumé : SEEDS: augmentation du rendement chez le colzaLes cytokinines sont considérées comme régulateur dans le rendement de la graine. L'université libre de Berlin travaille sur les gènes CKX et leur rôle dans le développement et le rendement depuis très longtemps. Chez Arabidopsis des mutations simultanées du gène CKX3 et d'au moins un des gènes CKX2, 4, 5 ou 6 entraîne de plus gros méristèmes floraux aboutissant à un plus grand nombre de siliques.
On souhaite vérifier si le rendement des graines de colza peut être augmenté en utilisant les données obtenues sur les cytokinines chez Arabidopsis.L 'objectif majeur d'augmenter le rendement est propsé en deux approches:Work Package 1: utilisation de la transgenèse. Cette approche inclus l'analyse de lignées générées par l 'université et la création/analyse de nouvelles lignées impactant la production de CKX. (1) Des plantes antiCKX3/5, affectant les méristèmes, seront générées. Cette down régulation localisée a pour but d'éviter des effets secondaires. (2) Chez Arabidopsis, l'association de mutants CKX2, 4 ou 6 avec CKX3 donne une plus grande production de silique, mais moindre que celle obtenue avec l'association CKX3 et 5. Afin de mieux observer ces phénomènes, des plantes seront générées comprenant des down régulations de CKX3 en combinaison avec CKX2, 4 ou 6. (3) Afin de tester l’intérêt de AHP6 dans son rôle de régulation sur le rendement, une hairpin anti AHP6 sous promoteur inductible sera utilisée pour transformer différents colzas (sauvage, mutants CKX3, 5 et le double mutant CKX3/5).Work Package 2 : utilisation d’approches par mutagenèse. Mutants et associations de mutants seront identifiés. Il seront testés systématiquement. L’identification des mutants de TILLING sera réalisée par BCS. L’université contribuera à identifier les acides aminés des mutants CKX ainsi que les pénotypes observés. 
Sont utilisées les méthodes de clonages et de séquençage, la création de vecteurs, la transformation génétique du colza, l'identification d'événements de transformation, leur caractérisationL'ensemble des séquences nécessaires aux clonages et transformation sont disponibles. L'ensemble de ces constructions a été transféré dans le colza via la technologie de Agrobacterium. Les événements ont été caractérisés et les simples copies ont été transférés à l'université pour développement, production de graines et analyses.
Résumé de la soumission : The main goal of the SEEDS project is to transfer knowledge on seed yield-regulating genes obtained inArabidopsis thaliana to its close relative, the crop plant oilseed rape (Brassica napus), and use it forpractical breeding. Oilseed rape is one of the most recently domesticated major crop species, and dueto intensive breeding has become the most important oilseed crop in Europe. Germany and France arethe main producers and cover together more than 50% of the European production. Yield per hectarevaries in different countries, reflecting different input levels and production efficiency. Rapeseed is thuslikely to respond strongly to programs aimed at selectively enhancing genetic variation for key economicinput and output traits. Indeed, its future sustainable use requires a substantial increase in productivity.The objective of this proposal is to increase productivity of commercial varieties of oilseed rape byenhancing the capacity to form seeds which is currently limited by the activity, size and number of thereproductive structures. Increased productivity will be achieved primarily by increasing the size of theinflorescence and floral meristems, which determines pod number. The activity of the ovule-formingplacenta tissue will be enhanced to increase the seed number per pod. Finally, research will beundertaken to increase the seed size which is expected to enhance the sink capacity.Recent research has shown that the hormone cytokinin has a central role in regulating these traitsquantitatively. The genes involved have been identified and various tools to change the cytokinin statusof plants in a targeted fashion have been developed. Proof-of-concept has been obtained in modelspecies as well as in oilseed rape and further work to extend the knowledge on cytokinin-related genesinvolved in regulating seed yield in oilseed rape is planned by transgenic and non-transgenicapproaches. The availability of the B. napus genome sequence and highly efficient TiLLING proceduresare prerequisites to implement these research results in practical plant breeding as a contribution to asustainable use of oilseed rape. The collaboration between a research laboratory that has discoveredthe cytokinin yield genes in Arabidopsis and an international commercial oilseed rape breeding companyis ideal for the commercial exploitation of the results obtained by the SEEDS project. The consortium iscompleted by one SME performing oilseed rape transformation and analysis.
Résultats : WP1: Augmentation du rendement par approche de transgenèse.
(1) Trois hairpins ciblant CKX3 et 5 sous 3 différents promoteurs (35S, STM-SAM spécifique et KLUH-SAM spécifique ont été construites. Le transfert dans le colza est prévu pour octobre 2015.
(2) Trois hairpins anti CKX3 en association avec CKX2, 4 et 6 ont été transférées dasn le colza. 20 événements simples copies ont été transférés à l'université pour la production de graines.
Deus hairpins ciblant AHP6 sous le contrôle du promoteur 35S ou STM seront transférées dans le colza sauvage ainsi que dans les mutants CKX3 et 5 ou encore dans les combinaisons CKX3/5 pour mieux étudier leur effet sur AHP6. Le vecteur contenant l’hairpin AHP6 sous 35S est prêt pour la transformation dans 4 fonds génétiques : sauvage, CKX3, 5 et CKX3/5. Le stransformations seront effectuées en octobre. La cible est de générer 15 événements monolocus par vecteur.
WP2 : Approche par mutagenèse
L’effort a été porté sur l’identification des mutants CKX3 et 5. L’analyse du génome de Brassica permet de montrer qu’il y a 4 copies (A1, A2, C1, C2) pour le gène CKX3 et deux copies (A1, C1) pour le gène CKX5. Cela nécessite l’étude de mutants dans 6 allèles différents et l’association génétique des différents allèles. Les mutants (stop codons) ont été identifiés dans toutes les copies ciblées. Les mutants contenant des codons stop dans tous les allèles de CKX3 et 5 ont été créés et combinés pour avoir une down régulation CKX3/5. Ces mutants et les équivalents sauvages ont été menés au champ en Belgique (3 sites et 4 réplications par site) ainsi qu’au Canada avec les mêmes répétitions.
Les essais au champ de Belgique ont été récoltés et l’analyse des résultats est en cours. Les essais au Canada sont terminés et les plantes récoltées.
Perspectives : WP1 : Augmentation du rendement par approche transgénique
(1) Trois hairpins ciblant CKX3 et 5 sous 3 différents promoteurs (35S, STM-SAM spécifique et KLUH-SAM spécifique) : prochaines étapes : compléter le clonage avec STM, démarrer les transformations dans le colza (quatrième trimestre 2015), et transférer tous les événements transgéniques à l’université.
(2) Trois hairpins anti CKX3 en association avec CKX2, 4 et 6 : prochaine étapes : commencer les backcrosses au quatrième trimestre 2015, réaliser une mutiplication de la génération T1 pour produire les T1S1 pour tous les événements correspondants aux trois hairpins (deuxième trimestre 2016), sélection des ségrégants T1S1 (azygotes/homozygotes) pour phénotypage et production de semences (quatrième trimestre 2016).
Deus hairpins ciblant AHP6 sous le contrôle du promoteur 35S ou STM seront transférées dans le colza sauvage ainsi que dans les mutants CKX3 et 5 ou encore dans les combinaisons CKX3/5 pour mieux étudier leur effet sur AHP6 : prochaines étapes : création des événements pour le construit 35S dans les quatre fonds génétiques (premier/second trimestre 2016) et transfert des événements à l’université pour culture, multiplication et backcrosses (troisième trimestre 2016).
WP2 : Approche par mutagenèse : prochaines étapes : analyse des données du champ (premier trimestre 2016), planification des essais au champ pour 2016 (premier trimestre 2016), production des semences pour les essais au champ (premier trimestre 2016), planification des essais champs 2016 en Belgique et au Canada (quatrième trimestre 2016).
Publications et brevets : Les résultats des essais au champ de 2015 pour CKX3 et 5 double mutant pourront être utilisés pour déposer un brevet avec Thomas Schmülling sur la protection des mutants.