Projet ANR-11-BSV8-0018 – EJCbirth : Impacts de la transcription par l’ARN polymérase II sur l’assemblage de l’EJC
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Hervé LE HIR (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS B)
Partenaires : Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure; Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier
Montant : 350000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Assemblage de l’EJC sur les mRNPImpacts de la modulation de l’activité de l’ARN polymérase II sur l’assemblage des particules mRNPs
Le dépôt différentiel de l’EJC peut-il être modulé par la transcription ?L’EJC (Exon Junction Complex) est assemblé sur les ARN messagers (ARNm) lors de la réaction d’épissage 24nt en amont de la jonction exon-exon. La liaison de l’EJC est cruciale pour le devenir des mRNPs : l’export, la traduction et la stabilité des ARNm peuvent être affectés par la présence ou l’absence de ce complexe. Récemment, il a été montré que le dépôt de l’EJC n’est pas constitutif : certaines jonctions exon-exon en sont dépourvues. L’assemblage de l’EJC est donc un phénomène régulé.Lorsque la transcription est affectée, l’épissage de certains exons est modifié et on observe de l’épissage alternatif. Comme le dépôt de l’EJC est concomitant à l’épissage, la transcription pourrait également avoir un impact sur le dépôt différentiel de l’EJC sur les ARN messagers.L’objectif de ce projet de recherche est, grâce à nos connaissances des structures et fonctions de l’EJC ainsi qu’aux outils développés récemment au laboratoire, de découvrir si des variations de la transcription peuvent dicter le devenir des ARNm en influençant la qualité des protéines qui leur sont liées. 
Etude de l’influence de la transcription sur le dépôt de l’EJC in vivo grâce à l’utilisation de gènes rapporteursL’EJC, lorsqu’il est présent en aval du codon stop de la traduction, déclenche un phénomène de dégradation des ARN. Afin de savoir si une séquence dépose un EJC ou non, nous avons cloné la séquence d’intérêt en aval du codon stop d’un gène permettant de suivre aisément la quantité d’ARN (ici, nous avons choisi le gène rapporteur codant pour la luciférase). Si un EJC est déposé, l’ARN est dégradé, l’expression de la luciférase diminue, s’il n’y a pas d’EJC, l’ARN n’est pas dégradé, l’expression de la luciférase n’est pas affectée. Après avoir construit ces plasmides rapporteurs et mis au point les conditions de leur transfection dans les cellules humaines, nous avons sélectionné des jonctions chargeant ou non un EJC et criblé un grand nombre de conditions transcriptionnelles pour essayer de moduler ces dépôts de l’EJC. Nous avons par exemple utilisé des drogues inhibant la transcription, des modificateurs de chromatine, des promoteurs variables ou encore des ARN polymérases donc la vitesse est affectée. Les résultats positifs sur la modulation du dépôt de l’EJC seront par la suite  confirmés par d’autres techniques (immunoprécipitation). Nous étudierons aussi ces effets à plus grand échelle (étude à l’échelle du génome).
Résumé de la soumission : La destinée d’un ARNm est déterminée par les protéines associées et acquises à chaque étape de son voyage depuis sa transcription. Le complex EJC (Exon Junction Complex) déposé par la macherie d’épissage illustre de manière intéressante l’importance de l’histoire nucléaire d’un ARNm sur ses fonctions. Cette acteur clé de la vie des ARNm les accompagne dans le cytoplasme et influence leur maturation, leur transport, leur traduction ainsi que leur qualité par le processus de NMD (Nonsense-mediated mRNA decay). Nous avons récemment découvert que l’EJC n’est pas déposé à chaque événement d’épissage mais qu’il est assemblé de manière variable. Des données préliminaires de séquençage haut débit (CLIP-seq) confirment cette variabilité dans les cellules humaines.	L’assemblage de l’EJC est intimement lié à la réaction d’épissage et débute par le recrutement de ses composants par le spliceosome. In vivo, de nombreux événements d’épissage sont initiés co-transcriptionnellement et régulés par l’ARN pol II. En effet, celle-ci affecte le recrutement des facteurs d’épissage et la période de temps nécessaire à la reconnaissance des sites d’épissage proximaux. Le recrutement des protéines de l’EJC qui débute co-transcriptionnellement est donc probablement influencé par la transcription. L’objectif de ce projet de recherche original est de découvrir si la modulation de la transcription a un impact sur les fonctions des particules mRNP via l’assemblage de l’EJC. A l’aide de nouveaux outils développés par chaque partenaire, ce projet sera abordé sous trois angles complémentaires.	(i) La transcription affecte-t-elle l’assemblage de l’EJC sur des ARNm rapporteurs ? Nous dessinerons une série de rapporteurs luciferase portant dans leur 3’UTR différentes séquences contenant des introns (ICS) sélectionnées d’après les données de CLIP-seq. Si une ICS conduit au dépôt d’un EJC, l’ARNm sera dégradé par le NMD. L’assemblage de l’EJC sera déterminé en mesurant l’activité luciférase et l’abondance des ARNm puis sera contrôlé par co-immunoprécpitation. Les rapporteurs seront exprimés dans des cellules HeLa sous le contrôle de 5 promoteurs connus pour affecter différemment l’épissage. De plus, les cellules seront traitées par des drogues comme le DRB et la camptothécine qui modulent la vitesse d’élongation et la processivité de l’ARN pol II.	(ii) Analyse de l’effet de la transcription sur le dépôt de l’EJC à l’échelle du transcriptome. En parallèle, nous affecterons l’activité globale de l’ARN pol II à l’aide de drogues ou par irradiation aux UV et nous établierons une carte des sites de liaison de l’EJC à l’échelle transcriptomique par CLIP-seq. Ainsi, nous obtiendrons une vue étendue des effets de la transcription sur l’EJC et comment elle affecte l’expression de gènes particuliers régulés par le NMD via l’EJC. Basé sur cette nouvelle carte, nous ciblerons à l’aide d’ARN interférents spécifiques des modifications de la structure chromatinienne et déterminerons ainsi si des marques épigénétiques de modification de la chromatine influencent localement la transcription et par voie de conséquence, l’assemblage de l’EJC.  	(iii) Détermination des paramètres cinétiques de la transcription en relation avec l’assemblage de l’EJC. La mesure des cinétiques de transcription est délicate. Nous avons développé des outils qui permettent de mesurer les fréquences d’initiation, les taux d’élongation et les pauses de l’ARN pol II. Ces méthodes nécessitent la visualisation de molécules uniques dans des cellules fixées ou vivantes par hybridation in situ et de nouvelles étiquettes fluorescentes. Elles peuvent ainsi fournir une mesure directe de l’activité de la pol II sur des gènes rapporteurs en copie unique. Nous obtiendrons alors une image précise de la synthèse des ARNm associés ou non à un EJC afin d’éclaircir les mécanismes conduisant à son assemblage.
Résultats : L’utilisation des plasmides rapporteurs s’est avérée beaucoup plus délicate que prévue : la mise au point des conditions de transfection permettant d’étudier la dégradation des ARN via des tests luciférase a été fastidieuse. Sur la vingtaine de jonctions clonée dans ces plasmides d’études, une bonne partie d’entre eux a été éliminée suite à différents contrôles : épissage incorrect, expression insuffisante, dégradation non dû à l’EJC.  Lors de l’étude des modulateurs transcriptionnels, la plupart n’a eu aucun effet (ou non reproductible) ou affectait trop les cellules physiologiquement pour permettre une interprétation. Une condition a tout de même permis de moduler le dépôt de l’EJC sur nos rapporteurs: la vitesse de l’élongation de la transcription. Ces résultats n’ont pu être confirmés par immunoprécipitation et la mise au point de cette technique est en cours. La faible quantité d’ARN liés à l’EJC rend leur détection très délicate même par PCR quantitative. Afin de s’affranchir de l’étape de transfection et pour s’éloigner du bruit de fond, nous avons entrepris l’établissement de lignées stables exprimant ces gènes rapporteurs. Afin de confirmer les effets de la vitesse de transcription sur le dépôt de l’EJC, nous construisons également des lignées cellulaires exprimant stablement des polymérases plus ou moins rapides. Ces lignées nous permettront d’effectuer des études à grande échelle de la liaison de l’EJC aux ARN lorsque la vitesse de la polymérase est affectée.
Perspectives : Les lignées stables développées exprimant les rapporteurs pourront être utilisées pour d’autres applications au sein du laboratoire. Nous pourrons ainsi étudier le rôle de l’EJC dans la traduction (test de différentes conditions traductionnelles). Les lignées exprimant les polymérases lentes et rapides constitueront une étape important pour l’étude à grande échelle du dépôt de l’EJC.
Publications et brevets : Pas de production à ce stade