Projet ANR-11-BSV8-0002 – MAFUR : Machinerie de fusion des rhabdovirus
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Yves GAUDIN (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Université Paris-Sud
Montant : 400000.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Etude de la machinerie de fusion des rhabdovirusÉtude structurale et fonctionnelle de la glycoprotéine des rhabdovirus en tant que modèle des glycoprotéines de fusion virale des virus enveloppés.
Etude des structures prises par la machinerie de fusion durant sa transition structurale.L'objectif de ce projet est d'obtenir une compréhension détaillée au niveau moléculaire des mécanismes de fusion membranaire en utilisant les rhabdovirus et leur glycoprotéine en tant que système modèle. Nous avons déjà caractérisé deux structures de la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (les formes dites post- et pré-fusion). Nous travaillons actuellement sur d’autres glycoprotéines (celles du virus de la rage, du virus Chandipura, du virus de la fièvre éphémérale bovine) afin de déterminer le chemin suivi par la glycoprotéine pour transiter d’une forme à l’autre. Ce travail est mené par radiocristallographie.      Simultanément, la structure de la protéine dans son environnement naturel (à la surface la particule virale) est aussi caractérisée par microscopie électronique. Un des objectifs est de visualiser des intermédiaires de fusion que nous savons piéger in vitro.Enfin, la construction de mutants et la caractérisation de leur propriété de fusion permettra de valider (ou non !) les hypothèses issues de l’analyse structurale.
Biologie structurale des machineries de fusionLes approches utilisées sont classiques dans le domaine. Nous utilisons la radiocristallographie afin d’avoir la structure des protéines à haute résolution (quelques Angströms). Comme cette technique nous donne une vision statique de la machinerie, nous utilisons aussi la diffusion des rayons X aux petits angles afin d’avoir accès à des aspects plus dynamiques.Enfin, nous utilisons la microscopie électronique sur des particules virales afin d’avoir accès à la structure de la glycoprotéine dans son environnement naturel. Nous effectuons aussi de la tomographie qui nous permet de reconstruire la structure tridimensionnelle des particules virales à moyenne résolution (2 à 3 nm)
Résumé de la soumission : Bien que la fusion membranaire puisse se produire spontanément, la composition des membranes biologiques fait qu’elle ne peut survenir sur des échelles de temps raisonnables. Il existe donc des machineries spécialisées et finement régulées qui catalysent la fusion membranaire.Les machineries de fusion les mieux caractérisées sont celles des virus  enveloppés. Ceux-ci libèrent leur génome dans le cytoplasme de la cellule hôte en fusionnant leur membrane avec une membrane cellulaire. La réaction de fusion est catalysée par des glycoprotéines virales transmembranaires. Ces glycoprotéines subissent une transition structurale de grande amplitude déclenchée par des stimuli spécifiques (abaissement du pH, liaison d’un récepteur, etc). Cette transition favorable d’un état pré-fusion vers un état post-fusion est couplée à la formation des intermédiaires lipidiques de haute énergie que l’on rencontre durant la réaction de fusion.Au cours de ce changement de conformation, les glycoprotéines exposent un motif hydrophobe qui va aller s’ancrer dans la membrane cible et la déstabiliser.Trois classes de glycoprotéines de fusion ont été mises en évidence. Bien que les glycoprotéines appartenant à des classes distinctes aient des structures différentes, leur mode d’action est semblable. Au sein de la troisième classe, on trouve la glycoprotéine G des rhabdovirus, la glycoprotéine gB des herpesvirus et la glycoprotéine gp64 du baculovirus. Parmi toutes les structures déterminées de protéines de cette classe, on ne trouve qu’une seule structure pré-fusion, celle de la glycoprotéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV). Bien qu’on connaisse les structures pré- et post-fusion d’un nombre croissant de glycoprotéines virales, la façon dont ces protéines catalysent la réaction est encore mal connue. En particulier, on ignore:1) Quelles sont les structures intermédiaires adoptées par ces protéines au cours de la transition structurale.2) Comment ces glycoprotéines coopèrent entre elles au cours du processus.3) Quelles est l’organisation structurale du domaine transmembranaire dont on sait qu’il joue un rôle décisif dans les étapes tardives de la réaction.Le projet qui regroupe 4 équipes, une de virologues spécialistes des rhabdovirus, une de cristallographes, une de microscopistes électroniques et une experte en SAXS vise à répondre à ces questions en travaillant sur la machinerie de fusion des rhabdovirus, considérés ici comme des virus modèles. Pour cela, nous souhaitons caractériser la structure de nouvelles glycoprotéines de rhabdovirus. Nous travaillerons en particulier :1) Sur l’ectodomaine de G du virus Chandipura que nous avons déjà cristallisé et dont les cristaux diffractent à 3Å. Tout indique que la forme dans le cristal est distincte des structures pré- et post-fusion déjà obtenues de G de VSV.2) Sur l’ectodomaine soluble de la glycoprotéine du virus de la rage que nous savons cliver à la surface des virions et que nous chercherons à cristalliser seul ou en complexe avec des partenaires que nous exprimons aussi.3) Sur les ectodomaines solubles des deux glycoprotéines, structurale et non structurale, du virus de la fièvre éphémérale bovine qui sont homologues mais dont l’une a perdu ses propriétés de fusion. Nous travaillerons aussi sur les glycoprotéines complètes (avec leur domaine transmembranaire) du VSV et du virus de la rage après solubilisation et purification en présence de détergent. A côté des essais de cristallogenèse, la structure de ces protéines fera aussi l’objet d’études en solution (par SAXS).Simultanément, la structure de la protéine dans son environnement naturel (à la surface de la particule virale) sera aussi caractérisée par microscopie électronique. Un des objectifs est de visualiser des intermédiaires de fusion que nous savons piéger in vitro.Enfin, la construction de mutants et la caractérisation de leur propriété de fusion permettra de valider les hypothèses issues de l’analyse structurale.
Résultats : Le projet vient de démarrer. Nous avons néanmoins déjà obtenu des résultats majeurs puisque nous venons de cristalliser la glycoprotéine du virus Chandipura dans deux conformations intermédiaires qui nous permettent de proposer un chemin pour la transition structurale entre les formes pré- et post-fusion.
Perspectives : L'obtention de ces deux structures est une avancée importante dans le domaine. Ceci est une première toutes glycoprotéines virales de fusion confondues.
Ces intermédiaires ne sont pas en accord avec le chemin qui était postulé. la transition structurale s'effectue donc de façon significativement différente de ce qui était proposé.   
Ceci ouvre de nouvelles pistes de réflexion dans le domaine.
Publications et brevets : Un article est actuellement soumis pour publication : 
«Snapshots of intermediates in viral glycoprotein transition during membrane fusion«