Projet ANR-11-BSV3-0014 – MeniViruCarb : Rôle de la protéine HPr, composant du PTS, dans la corrélation entre métabolisme du carbone et virulence chez Neisseria meningitidis
Programme : Blanc - SVSE 3 - Microbiologie, immunologie, infectiologie (Blanc SVSE 3)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Josef DEUTSCHER (INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - CENTRE DE RECHERCHE DE JOUY-EN-JOSAS)
Partenaires : Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé Humaine; Institut Pasteur
Montant : 340000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Métabolisme du carbone et virulence chez Neisseria meningitidisDes composants du système phosphotransférase, qui catalyse le transport et la phosphorylation des sucres, affectent la virulence de Neisseria meningitidis. Nous voulons étudier les mécanismes moléculaires contrôlant la corrélation entre métabolisme du carbone et virulence chez cet organisme pathogène.
Commensalité/virulence transition chez Neisseria meningitidisNeisseria meningitidis est un pathogène strictement humain représentant une menace majeure en santé humaine. En Europe, 10 à 15% de la population sont porteurs sains de cette bactérie commensale du nasopharynx. En réponse à des signaux spécifiques non identifiés à ce jour, N. meningitidis traverse les cellules épithéliales et passe dans la circulation sanguine. Certaines sources de carbone pourraient jouer un rôle essentiel dans cette transition commensalité/virulence. Le glucose et le maltose sont les seuls sucres utilisés par cet organisme. N. meningitidis ne possède en outre qu’un système de phospho-transfert PEP:sucre (PTS,  impliqué dans le transports de certains sucres et dérivés) incomplet, incapable de transporter les sucres. Cependant, des résultats obtenus récemment suggèrent que les composants du PTS de Neisseria seraient impliqués dans la régulation de la virulence.
Le rôle de composants du système phosphotransférase dans la virulence des méningocoquesLa protéine du PTS HPr semble jouer un rôle fondamental dans la corrélation entre métabolisme du carbone et virulence chez Neisseria. L’inactivation du gène correspondant provoque une diminution de la production de la capsule et une augmentation de l’adhésion cellulaire. En outre, l’expression du gène crgA, qui code pour le régulateur transcriptionnel des opérons médiant la synthèse de la capsule et des pili, est augmentée dans un mutant ptsH. Nous avons montré que HPr interagit avec CrgA et affecte probablement ses propriétés de fixation aux séquences cibles d’ADN.  Nous étudierons quelles formes d’HPr (non phosphorylée, phosphorylée sur l’Histidine 15 ou sur la Sérine 46, ou doublement phosphorylée) sont responsables des effets observés. A cet effet, nous construirons une série de mutants synthétisant une HPr non phosphorylable ou portant des mutations phosphomimétiques sur les sites de phosphorylation. Des mutants d’inactivation des gènes codant l’EIIAFru et l’EIIAMan  du PTS de Neisseria ou YhbJ, une protéine liant l’ATP de fonction inconnue dont le gène est organisé en opéron avec les gènes codant l’EIIAFru et HPrK seront également construits. Les effets de ces mutations sur la virulence seront testés sur un modèle animal (souris exprimant la transferrine humaine) et  en culture cellulaire sur cellules épithéliales humaines. Une analyse transcriptomique du mutant ptsH sera réalisée afin d’identifier les mécanismes moléculaires de la voie de régulation connectant métabolisme carboné et virulence chez Neisseria. Les gènes dont l’expression est significativement altérée dans le mutant ptsH par rapport à la souche sauvage seront étudiés en détail. Nous tenterons également d’identifier des partenaires protéiques des protéines du PTS sous leur forme phosphorylée ou non grâce à des expériences  d’immunoprécipitation et de SPINE.
Résumé de la soumission : Neisseria meningitidis est un pathogène strictement humain représentant une menace majeure en santé humaine. En Europe, 10 à 15% de la population sont porteurs sains de cette bactérie commensale du nasopharynx. En réponse à des signaux spécifiques non identifiés à ce jour, N. meningitidis traverse les cellules épithéliales et passe dans la circulation sanguine. Certaines sources de carbone pourraient jouer un rôle essentiel dans cette transition commensalité/virulence. Le glucose et le maltose sont les seuls sucres utilisés par cet organisme. N. meningitidis ne possède en outre qu’un système de phospho-transfert PEP :glucose (PTS,  impliqué dans le transports de certains sucres et dérivés) incomplet, incapable de transporter les sucres. Cependant, des résultats obtenus dans une collaboration en cours suggèrent que les composants du PTS de Neisseria seraient impliqués dans la régulation de la virulence.La protéine du PTS HPr semble jouer un rôle fondamental dans la corrélation entre métabolisme du carbone et virulence chez Neisseria. L’inactivation du gène correspondant provoque une diminution de la production de la capsule et une augmentation de l’adhésion cellulaire. En outre, l’expression du gène crgA, qui code pour le régulateur transcriptionnel des opérons médiant la synthèse de la capsule et des pili, est augmentée dans un mutant ptsH. Nous avons montré que HPr interagit avec CrgA et affecte probablement ses propriétés de fixation aux séquences cibles d’ADN.  Nous étudierons quelles formes d’HPr (non phosphorylée, phosphorylée sur l’Histidine 15 ou sur la Sérine 46, ou doublement phosphorylée) sont responsables des effets observés. A cet effet, nous construirons une série de mutants synthétisant une HPr non phosphorylable ou portant des mutations phosphomimétiques sur les sites de phosphorylation. Des mutants d’inactivation des gènes codant l’EIIAFru et l’EIIAMan  du PTS de Neisseria ou YhbJ, une protéine liant l’ATP de fonction inconnue dont le gène est organisé en opéron avec les gènes codant l’EIIAFru et HPrK seront également construits. Les effets de ces mutations sur la virulence seront testés sur un modèle animal (souris exprimant la transferrine humaine) et  en culture cellulaire sur cellules épithéliales humaines. Une analyse transcriptomique du mutant ptsH sera réalisée afin d’identifier les mécanismes moléculaires de la voie de régulation connectant métabolisme carboné et virulence chez Neisseria. Les gènes dont l’expression est significativement altérée dans le mutant ptsH par rapport à la souche sauvage seront étudiés en détail. Nous tenterons également d’identifier des partenaires protéiques des protéines du PTS sous leur forme phosphorylée ou non grâce à des expériences  d’immunoprécipitation et de SPINE.
Résultats : Nous avons construit un mutant de Neisseria meningitidis portant une délétion du gène ptsH. Afin de complémenter cette souche avec des différents allèles du gène ptsH, des allèles du gène ptsH portant des diverses mutations (His15Ala, His15Asp, Ser46Ala, Ser46Asp et des doubles mutations) one été construits et insérés dans un plasmide permettant l’insertion dans le génome de N. meningitidis. Des tests sur l’effet de ces mutations sur l’activité de CrgA, sur la survie de la bactérie dans un modèle animal et dans des cultures cellulaires ainsi que sur l’apoptose sont actuellement en cours. Dans un deuxième temps, les mutants que nous avons construits seront utilisés pour des expériences en transcriptomique.
Nous avons également testé des interactions de la protéine HPr avec CrgA par des expériences « yeast two hybrid » en collaboration avec l’équipe de Philippe Noirot, INRA de Jouy en Josas. Les protéines sauvages n’ont pas donné de signal positif d’interaction. Nous testerons actuellement des interactions de CrgA avec HPr portant des diverses mutations dans ses sites de phosphorylation (His15Asp, Ser46Asp et la protéine doublement mutée). 
Nous avons également amélioré la purification et le rendement des protéines HPr et CrgA, qui ont tendance à former des corps d’inclusion, afin de faire des tests d’interaction de ces deux protéines in vitro ainsi que des tests d’interaction de CrgA ou CrgA/HPr avec le site opérateur (CrgA box avec et sans CREN).
Perspectives : Des mutations affectant des gènes codant des composants du système phosphotransférase incomplet de Neisseria meningitidis montrent un effet sur la synthèse de la capsule. Ce composant de la surface de la bactérie joue un rôle important dans l’adhésion cellulaire. Parce que Neisseria meningitidis représente une menace majeure en santé humaine, comprendre les mécanismes fondamentales de la corrélation entre métabolisme du carbone et virulence devrait permettre un meilleur traitement avec des médicament déjà existant et/ou servir comme base pour le développement des nouveaux agents antimicrobiens.
Publications et brevets : Nous avons construit un mutant de Neisseria meningitidis sérogroupe C portant une délétion du gène ptsH. Nous avons également construits des nombreuses allèles du gène ptsH portant des mutations remplaçant les acides aminés des sites de phosphorylation de la protéine HPr par des acides aminés non-phosphorylable ou par des acides aminés mimant une phosphorylation. Nous avons construit plusieurs vecteurs pour les tests double hybride et des plasmides de surexpression et purification des protéines CrgA et HPr.