Projet ANR-11-JSV8-0005 – StruFunc5A5B : Etude des relations structurales et fonctionnelles entre les protéines NS5A et NS5B du virus de l’hépatite C et la Cyclophiline A humaine.
Programme : JCJC - SVSE 8 - Biochime, biologie moléculaire et structurale (JCJC SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Xavier HANOULLE (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE NORD-PAS-DE-CALAIS ET PICARDIE)
Partenaires : Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle
Montant : 249912.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 36 mois
Résumé : Compréhension des interactions entre les protéines NS5A et NS5B du virus de l’hépatite C et la CypA, une protéine humaineLes protéines virales NS5A et NS5B ainsi que la protéine humaine CypA sont requises pour la réplication du virus de l’hépatite C (VHC). Leurs interactions représentent donc des cibles thérapeutiques potentielles
Comprendre les interactions pour mieux les ciblerLe virus de l'hépatite C (VHC) est un virus à ARN par lequel environ 180 millions d’individus dans le monde sont chroniquement infectés. Le traitement utilisé actuellement a une efficacité limité et engendre des effets secondaires indésirables. Pour développer de nouvelles molécules antivirales, il faut avoir une meilleure connaissance du VHC et de ses interactions avec les facteurs cellulaires, car chacune de ses interactions est une cible potentielle. Par ailleurs, il y a toujours un besoin d’obtenir de nouvelles données structurales qui aideraient à comprendre les mécanismes moléculaires correspondant aux étapes essentielles du cycle de vie du VHC.Le principal but de ce projet est de comprendre les relations, structurales et/ou fonctionnelles, entre deux protéines du VHC, NS5A et NS5B, et une protéine humaine, la Cyclophiline A. NS5A et NS5B sont essentielles pour la réplication de l'ARN viral et pour la production des particules infectieuses. Alors que la structure et la fonction de NS5B, l'ARN-polymérase virale, sont connues les données sur NS5A sont plus limitées. NS5A est une protéine composée de trois domaines. Son domaine 1 (NS5A-D1) est un domaine liant le zinc et dont la structure cristallographique a été résolue. Les domaines 2 et 3 (NS5A-D2 et -D3) sont quant à eux dit intrinsèquement désordonnés, c'est-à-dire qui n’adoptent pas de structures 3D stables. Une activité anti-VHC a été démontrée pour la Cyslosporine A (CsA), un inhibiteur bien connu des Cyclophilines humaines, et des mutations conférant au virus une résistance à la CsA ont été identifiées dans NS5A et NS5B. Ceci suggère que ces protéines virales puissent interagir avec les Cyclophilines cellulaires. Cependant les mécanismes moléculaires sous-jacents restent à élucider. Pour y parvenir, il faut obtenir une caractérisation moléculaire détaillée de chacune de ces protéines puis comprendre les relations structurales et/ou fonctionnelles qui peuvent exister entre elles.
Etude des protéines NS5A, NS5B et CypA par spectroscopie RMNAfin d’étudier les relations entre les protéines NS5A, NS5B du VHC et la Cyclophiline A (CypA) humaine nous utilisons la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN). Cette technique permet de réaliser, en solution et au niveau atomique, des études structurales et/ou fonctionnelles. C’est notamment une méthode particulièrement adaptée à l’étude des protéines intrinsèquement désordonnées qui n’adoptent pas de structures 3D stables mais correspondent plutôt à un ensemble dynamique de conformères. Les domaines 2 et 3 de la protéine NS5A sont désordonnés. Nous poursuivrons leur caractérisation moléculaire notamment en présence de mutations ponctuelles qui confèrent au virus une résistance aux dérivés de Cyclosporine A. Certaines de ces mutations sont situées dans une séquence conservée de NS5A et qui interagit avec les Cyclophilines humaines. La spectroscopie RMN permet également d’étudier, en solution, des processus d’interaction protéine/protéine ou encore des activités enzymatiques comme l’activité peptidyl-prolyl cis-trans isomérase (PPIase) des Cyclophilines. Si la structure 3D de NS5B, l’ARN-polymérase du VHC, a été résolue par cristallographie RX, il n’existe pas de structure de cette protéine en complexe avec une autre protéine. Une étude de NS5B par spectroscopie RMN permettrait donc de caractériser ses interactions avec d’autres protéines, virales (NS5A…) ou humaines (CypA…). Pour cela nous devrons surmonter plusieurs défis scientifiques et techniques. Le premier sera de produire de manière recombinante chez E. coli et purifier toutes ces protéines enrichies en isotopes stables (15N, 13C, 2H). Ces échantillons devront atteindre des critères élevés en termes de pureté et de quantité. Nous serons amenés à étudier des protéines ou des complexes dont le poids moléculaire est très élevé et pour lesquels les techniques classiques de RMN liquide ne sont pas adaptées. Nous utiliserons et adapterons alors des stratégies de marquages isotopiques sélectifs.
Résumé de la soumission : Le virus de l'hépatite C (VHC) est un petit virus à ARN par lequel environ 180 millions d’individus dans le monde sont chroniquement infectés. Le traitement utilisé actuellement n’est pas entièrement satisfaisant car de nombreux patients n’y répondent pas ou souffrent de ces effets secondaires. Pour développer de nouvelles molécules antivirales, il est nécessaire d'avoir une meilleure connaissance du VHC mais également de ses interactions avec les facteurs cellulaires, car chacune de ses interactions est une cible potentielle pour un nouvel antiviral. De plus, il est préférable de cibler les facteurs cellulaires qui sont spécifiquement requis pour la propagation du VHC car le taux très élevé de mutations dans les virus mène vers un phénomène de résistance rapide lorsque la cible est une protéine virale. Par ailleurs, il y a toujours un besoin d’obtenir de nouvelles données structurales qui aideraient à comprendre les mécanismes moléculaires correspondant aux étapes essentielles du cycle de vie du VHC. Actuellement, des données structurales sont disponibles pour au moins la moitié des protéines du VHC et ont quasiment toutes été obtenues par cristallographie. Les protéines restantes appartiennent à deux catégories : les membranaires et celles intrinsèquement non structurées. Ces dernières semblent ne pas adopter de structures tertiaires, voir même secondaires, stables lorsqu’elles sont étudiés par les techniques biophysiques classiques. Afin d’obtenir des informations, au niveau atomique, sur ces domaines intrinsèquement désordonnés, la RMN est la méthode de choix. De plus, jusqu'à présent toutes les petites molécules anti-VHC qui visent des composants viraux ont des protéines bien structurées comme cibles moléculaires (NS5B, NS3), donc si les protéines virales intrinsèquement désordonnées sont mieux étudiées elles pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques. Le principal but de ce projet est de comprendre les relations, structurales et/ou fonctionnelles, entre deux protéines du VHC, NS5A et NS5B, et une protéine humaine, la Cyclophiline A. NS5A et NS5B sont essentielles pour la réplication de l'ARN viral et pour la production des particules infectieuses. Alors que la structure et la fonction de NS5B, l'ARN-polymérase virale, sont connues les données sur NS5A sont plus limitées. NS5A est une protéine composée de plusieurs domaines, son domaine 1 (NS5A-D1) est un domaine liant le zinc et dont la structure cristallographique a été résolue. Par contre, aucune donnée cristallographique n’a été obtenue pour les domaines 2 et 3 (NS5A-D2 et -D3). Très récemment nous avons réalisé des caractérisations structurales et fonctionnelles de ces domaines par RMN, et avons montré que les deux sont intrinsèquement désordonnés. Une activité anti-VHC étant démontrée pour la Cyslosporine A (CsA), un inhibiteur bien connu des Cyclophilines humaines, des mutations conférant au VHC une résistance à la CsA ont été identifiées dans NS5A et NS5B. Ceci suggère que ces protéines virales puissent interagir avec les Cyclophilines cellulaires. Cependant les mécanismes moléculaires sous-jacents restent à élucider. Pour y parvenir, il faut obtenir une caractérisation moléculaire détaillée de chacune de ces protéines puis comprendre les relations structurales et/ou fonctionnelles qui peuvent exister entre elles. Les membres impliqués rassemblent toutes les compétences requises pour achever avec succès ce projet : biologie moléculaire, biochimie des protéines, spectroscopie RMN et développement méthodologique RMN. Ils constituent une nouvelle équipe « HCV_NMR » dans le laboratoire de RMN à Lille où sont présents à la fois un savoir-faire scientifique et technologique reconnu dans la biochimie structurale et fonctionnelle et dans l'étude des protéines non structurées par RMN et également un équipement de haut niveau avec notamment des spectromètres RMN à 600MHz, 800MHz et tout récemment 900MHz.
Résultats : Pour le moment nous sommes parvenus à exprimer puis purifier NS5B, l’ARN-polymérase du virus de l’hépatite C, avec un enrichissement isotopique qui soit compatible avec une étude par spectroscopie RMN. Nous avons également, grâce à l’utilisation d’un spectromètre RMN à très haut champs 900MHz, obtenu un spectre de bonne qualité sur cette protéine dont la masse moléculaire est de 65kDa. Ce spectre représente un outil pour étudier les interactions de NS5B, un cible thérapeutique, avec toutes sortes de molécules (protéines, RNA, inhibiteurs…).
Perspectives : Avec ce projet de recherche nous comptons aboutir à une meilleure compréhension des rôles biologiques joués par les protéines virales intrinsèquement désordonnées et qui sont impliquées dans la pathogénicité du VHC
Publications et brevets : A venir...