Projet ANR-12-BSV4-0011 – RhythmDev : Développement embryonnaire des réseux rhythmogènes moteurs
Programme : Blanc - SVSE 4 - Neurosciences (Blanc SVSE 4)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame Muriel THOBY-BRISSON (Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine)
Partenaires : Institut de Neurosciences de la Timone; Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine
Montant : 511889.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Mise en place anatomique et fonctionnelle des commandes nerveuses des activités rythmiques au cours du développement embryonnaire.Le projet RhythmDev s'intéresse à l'étude au cours des phases finales du développement embryonnaire des bases neurobiologiques du développement des réseaux neuronaux qui contrôlent des comportements rythmiques tels que la locomotion et la respiration.
Améliorer les connaissances sur le développement prénatal des réseaux de neurones générateurs de rythme impliqués dans des fonctions physiologiques importantes.Les objectifs principaux du projet sont de mieux connaître les processus développementaux qui sous-tendent la mise en place fonctionnelle de groupes de neurones qui génèrent et contrôlent des activités motrices rythmiques organisées telles que la locomotion et la respiration. En nous intéressant plus particulièrement à la période prénatale nous focalisons notre recherche sur une partie critique du développement au cours de laquelle tout dysfonctionnement pourra avoir de graves conséquences à la naissance. Ainsi, dans un contexte pathologique, nos résultats devraient permettre une meilleure appréhension des conséquences sur le fonctionnement des circuits neuronaux et les activités physiologiques qu’ils contrôlent. Ainsi, de par notre collaboration avec un service clinique et en se basant sur notre recherche fondamentale, nous devrions pouvoir participer à l'amélioration de diagnostique et de prise en charge des anomalies précoces du développement des réseaux moteurs chez l'enfant.
Enregistrement et analyse des signaux neuronaux sur des préparations réduites du système nerveux isolé obtenues à partir d’embryons et de nouveau-né de souris.Les réseaux neuronaux contrôlant la respiration et la locomotion peuvent être étudiés in vitro des préparations réduites (tronc cérébral isolé, moelle épinière isolée, tranche transversale de tronc cérébral) du système nerveux central. Le tissu nerveux est obtenu à partir d’embryon de souris (sauvages ou transgéniques) et est prélevé à différents stades de développement. Sur ces préparations, les réseaux neuronaux sont fonctionnels et capables de générer spontanément des activités rythmiquement organisées. Ces activités neuronales sont détectées soit par des enregistrements électrophysiologiques soit par imagerie calcique, soit une combinaison des deux.
Résumé de la soumission : Ce projet a pour objectif d’examiner pendant les phases finales du développement embryonnaire, les bases neurobiologiques cellulaires, synaptiques et intégrées sous-tendant les mécanismes du développement fonctionnel de réseaux neuronaux générateurs d’activités motrices rythmiques. Deux réseaux organisés en générateur central d’activité motrice (Central Pattern Generator, CPG) seront analysés: le CPG locomoteur localisé dans la moelle épinière et le CPG respiratoire localisé dans le tronc cérébral. En plus de contrôler des fonctions importantes (locomotion et respiration), ces deux réseaux présentent l’avantage de pouvoir être étudiés in vitro sur des préparations réduites et de générer une activité organisée dès les stades embryonnaires. Nous émettons l’hypothèse encore jamais testée selon laquelle la maturation fonctionnelle de ces réseaux est associée à une maturation des systèmes inhibiteurs impliquant le chlore, concomitante à la mise en place de populations de neurones possédant des propriétés pacemakers, et que ces processus sont activité-dépendants. Par des enregistrements des activités neuronales (cellules individuelles en patch clamp ou imagerie calcique, racines nerveuses ou populations neuronales par macroélectrodes) sur des préparations embryonnaires in vitro (tranche transversale de tronc cérébral ou tronc cérébral/moelle épinière isolé) nous rechercherons à différents stades embryonnaires quels types d’activités sont générés par chacun de ces CPGs. On cherchera à déterminer si leur maturation fonctionnelle est associée à une maturation des connexions synaptiques impliquant le chlorure pour lesquelles il est établi que leur influence excitatrice aux stades précoces du développement devient inhibitrice aux stades matures (analyse de l’expression des co-transporteurs de chlore par immunohistochimie et western blot; caractérisation électrophysiologique des évènements synaptiques associés au chlore). Par ailleurs, les deux CPGs sont connus pour contenir des neurones possédant des propriétés de pacemakers dont le rôle n’est pas toujours bien défini. En étudiant spécifiquement ces neurones (isolation pharmacologique) nous chercherons à montrer une corrélation entre leur intégration dans le réseau et l’émergence des activités motrices organisées. Nous testerons également l’hypothèse selon laquelle ces processus de maturation fonctionnelle des CPGs sont activité-dépendants (rôle des afférences excitatrices sérotoninergiques et de la signalisation aigüe associée aux facteurs trophiques (BDNF). Une interaction fonctionnelle entre les deux CPGs sera également recherchée pendant cette période de développement. Les expériences proposées reposent sur des résultats préliminaires obtenus par nos équipes et sur l’utilisation de lignées de souris transgéniques que nous possédons déjà pour la plupart.De plus, en association avec le service de néonatologie dirigé par le Pr Simeoni à l’hôpital de la Timone à Marseille nous développerons une investigation clinique inédite dans laquelle nous examinerons les paramètres locomoteurs et respiratoires de nouveau-nés humains nés soit prématurément (système nerveux central immature), soit de mères sous traitements médical pendant leur grossesse (développement embryonnaire affecté) afin de définir des facteurs à risque pour la mise en place fonctionnelle des réseaux neuronaux chez l’homme. Ainsi, en associant nos connaissances respectives des deux CPGs, nos compétences expérimentales complémentaires, des modèles transgéniques différents, nous pensons aboutir à une meilleure compréhension des mécanismes centraux requis pour la mise en place fonctionnelle des réseaux neuronaux au cours du développement embryonnaire. En comparant les résultats obtenus sur les modèles animaux avec les observations faites sur les nouveau-nés humains nous devrions pouvoir proposer un diagnostique des anomalies précoces du développement des réseaux moteurs afin de prévenir de futures déficits chez les enfants.
Résultats : Les expériences sur le réseau respiratoire chez l’embryon ont d'ores et déjà montré que ce réseau acquiert progressivement au cours du développement la capacité de générer spontanément plusieurs types d'activité liées à la fonction respiratoire. Cette maturation fonctionnelle est associée à une maturation des propriétés membranaires des neurones respiratoires ainsi que celle des connexions qui les relient entre eux. Nous nous intéressons maintenant aux neurones qui possèdent des propriétés particulières: celle d’oscillateur endogène (neurones dits pacemaker). Nous cherchons à la caractériser et définir leur rôle dans la rythmogenèse respiratoire chez l'embryon.
Les expériences réalisées sur les réseaux spinaux isolés in vitro ont montré un changement de nature des activités spontanés (AS) qui passent d’une forme non oscillantes à oscillantes au cours du développement. De même, ces oscillations qui sont en phase à P0 deviennent de plus en plus alternées à P2. La maturation des AS intra-segmentaires précèderait celle des AS inter-segmentaires.
Enfin nous avons découvert une nouvelle classe de pacemakers au sein du réseau locomoteur dont la spécificité est d’être robuste, exprimée en forte proportion et dont le courant sodique persistant (INap) qui la sous-tend, est indispensable à la genèse du rythme locomoteur. Pour déterminer la nature du canal sodique responsable de Inap nous utilisons maintenant une souris transgénique dépourvue du canal Nav1.6. Nos premiers résultats montrent qu’au-delà de la première semaine postnatale, leur motricité se détériore rapidement à la fois dans sa composante dynamique (locomotion) et statique (posture). Ces déficits moteurs s’accompagnent d’une altération des capacités de décharges des neurones du réseau locomoteur (interneurone et motoneurone) en raison d’une perturbation de INap.
Perspectives : La perspective de notre projet est d’améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la mise en place de réseaux de neurones rythmogènes fonctionnels afin de pouvoir mieux adapter l’approche thérapeutique utilisée dans des cas de naissance prématurée ou d’anomalies fonctionnelles à la naissance.
Publications et brevets : Un article (Chapuis et al.,)décrivant les mécanismes d'émergence fonctionnelle et de genèse de l'activité de soupir au cours du développement embryonnaire a été publié dans Journal of Physiology (London): 592, 2169-2181, 2014.
Un second article (Bouhadfane et al.,) décrivant le rôle du courant sodique persistant dans les propriétés de décharge des motoneurones lombaires a été publié dans Journal of Neuroscience: 33, 15626-15641, 2013. 
Article de vulgarisation: Viemari J-C et al. Médecine et Sciences: 2013 10:875-82.
Participation à 4 congrès internationaux.