Projet ANR-10-BLAN-1309 – HYDROPHOBIN : HYDROPHOBINE DES CONIDIES d’Aspergillus fumigatus : ANALYSE STRUCTURALE ET REPONSE IMMUNE
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Microbiologie, immunologie, infectiosité (Blanc SVSE 3)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Jagadeesh BAYRY (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE - DELEGATION PARIS VI)
Partenaires : Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut Pasteur; Institut Pasteur; Institut Pasteur
Montant : 360000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Rôle des protéines hydrophobine fongiques dans la biologie des champignons, de la santé publique et de la thérapieL’air que nous respirons contient des milliers de spores fongiques (conidies). Bien que ces spores constituent un vaste réservoir d’antigènes et d’allergènes, la couche de «rodlets« hydrophobes à la surface des conidies masque l’immunogénicité des spores. Le projet explore le rôle des hydrophobines du cycle de vie des champignons et son potentiel thérapeutique.
Bases moléculaires et immunologiques de la nature inerte des hydrophobines fongiques et les applications potentielles.Nous avons récemment montré que la couche de «rodlets« hydrophobes présente à la surface des conidies jouait un rôle essentiel dans la reconnaissance des conidies par le système immunitaire (2009, Nature 460: 1117-21). Ce projet ANR s’inscrit dans la continuité de ces travaux. Nous souhaitons (1) analyser la structure et l’auto-assemblage de l’hydrophobine RodAp en couche de rodlets, (2) comprendre les bases moléculaires expliquant l’inertie immunologique de la couche de rodlets, (3) identifier chez le champignon et son hôte les facteurs qui dégradent l’hydrophobine après phagocytose et durant les premières étapes de la germination conidienne et (4) explorer l’utilisation thérapeutique potentielle des hydrophobines.
Caractérisation structurale et immunologique des protéines recombinantes de hydrophobine Aspergillus fumigatusLe génie génétique d'hydrophobine et des conidies d’Aspergillus fumigatus. L'analyse structurale des hydrophobines en utilisant des techniques biophysiques, y compris la résonance magnétique nucléaire, dichroïsme circulaire, de Fourier-spectroscopie infrarouge à transformée, d'électrons et microscopies à force atomique. Pour étudier l'immunogénicité des hydrophobines (sauvage et mutant) et de masquage de l’immunogénicité des protéines thérapeutiques en utilisant des cellules dendritiques humaines, les cellules T et dans le modèle expérimental in vivo de l'hémophilie A.
Résumé de la soumission : L’air que nous respirons contient des milliers de spores fongiques (conidies) qui proviennent de plus d’une centaine d’espèces de champignons appartenant principalement aux genres Cladosporium, Penicillium, Alternaria et Aspergillus. Bien que ces spores constituent un vaste réservoir d’antigènes et d’allergènes, les raisons pour lesquelles la microflore fongique de l’air n’ induit pas des réactions inflammatoires immédiates consécutivement à leur inhalation, ni n’active de manière permanente les cellules immunes innées, restaient inexpliquées. Des travaux réalisés récemment par les membres du présent consortium sur le champignon pathogène opportuniste Aspergillus fumigatus ont montré que la couche de "rodlets" hydrophobes présente à la surface des conidies jouait un role essentiel dans la reconnaissance des conidies par le système immun inné. L’hydrophobine de classe I RodAp (qui forme la couche de rodlets) n’est en effet pas reconnue par le système immun et n’induit ni la maturation ni l’activation des cellules immunitaires humaines ou murines. En revanche, l’élimination de la couche de rodlets par des approches de biochimie et de génétique génère des morphotypes fongiques qui déclenchent immédiatement la réponse immune. Bien que les hydrophobines fongiques soient connues depuis plus de 30 ans, notre article (Aimanianda et al.,2009, Nature 460: 1117-21 ) décrit pour la première fois l’inertie immunologique de cette protéine de surface et son role dans l’absence de reconnaissance des spores fongiques aériennes par le système immunitaire humain.Ce projet ANR s’inscrit dans la continuité de ces travaux. Nous souhaitons (1) analyser la structure et l’auto-assemblage de l’hydrophobine RodAp en couche de rodlets,   (2) comprendre les bases moléculaires expliquant l’inertie immunologique de la couche de rodlets,  (3) identifier chez le champignon et son hôte les facteurs qui dégradent l’hydrophobine après phagocytose et durant les premières étapes de la germination conidienne et (4) explorer l’utilisation thérapeutique potentielle des hydrophobines. Le projet est centré sur A. fumigatus, pathogène fongique opportuniste responsable de pathologies pulmonaires graves et souvent mortelles chez les patients immunocompétents et immunodéprimés. Etudier la structure et l’auto-assemblage des hydrophobines et les bases moléculaires expliquant l’inertie immunologique des rodlets peut conduire à une meilleure compréhension de la libération des molécules fongiques in situ et de leur role à la fois en pathologie infectieuse et allergique. D’autres applications peuvent également être envisagées. Sachant que la germination des conidies est liée à la dégradation des hydrophobines, on peut imaginer que les agents qui inhibent leur dégradation bloquent aussi la germination, et puissent aboutir au développement d’ une nouvelle génération d’antifongiques. On peut aussi envisager d’utiliser l’inertie immunologique de l’hydrophobine pour masquer l’immunogénicité de protéines thérapeutiques telles que le Facteur VIII qui entrainent habituellement la formation d’anticorps spécifiques capables de neutraliser leur efficacité.
Résultats : Les protéases sécrétées Aspergillus pendant à la germination sont responsables de la dégradation de la couche de «rodlets« hydrophobes à la surface des conidies.
La structure de l'hydrophobine est résolue en utilisant la protéine RodA doublement marquée (15Nand 13C). 
Mise en place du système expérimental (in vitro et in vivo) afin de déterminer l'immunogénicité des hydrophines recombinantes et hydrophobine-mutant conidies
A établi une collaboration avec le Dr Margaret Sunde, l'Université de Sydney, Australie, pour l'analyse structurelle des hydrophoibines.
Perspectives : Etudier la structure et l’auto-assemblage des hydrophobines et les bases moléculaires expliquant l’inertie immunologique des rodlets peut conduire à une meilleure compréhension de la libération des molécules fongiques in situ et de leur rôle à la fois en pathologie infectieuse et allergique. D’autres applications peuvent également être envisagées. Sachant que la germination des conidies est liée à la dégradation des hydrophobines, on peut imaginer que les agents qui inhibent leur dégradation bloquent aussi la germination, et puissent aboutir au développement d’une nouvelle génération d’antifongiques. On peut aussi envisager d’utiliser l’inertie immunologique de l’hydrophobine pour masquer l’immunogénicité de protéines thérapeutiques telles que le Facteur VIII qui entrainent habituellement la formation d’anticorps spécifiques capables de neutraliser leur efficacité.
Publications et brevets : Un commentaire/éditorial sur les structures, l'immunogénicité et les perspectives d’applications des hydrophobines (PLoS Pathog 2012, 8:. E1002700).
Un éditorial sur l'axe chimiokine comme une cible thérapeutique pour améliorer le recrutement des cellules T régulatrices, les cellules immunosuppresseurs pour traiter des maladies auto-immunes et inflammatoires (Immunotherapy 2012, 4: 9-12).
Diffusion des résultats préliminaires sur l'analyse structurale de la protéine hydrophobine (Une affiche à la Conférence internationale sur la résonance magnétique des systèmes biologiques (ICMRBS), Lyon, France, 19-24 Août 2012)