Projet ANR-15-CE13-0016 – NovProtMig : Identification de nouvelles protéines qui contrôlent la persistance de migration
Programme : Décryptage des fonctions biologiques élémentaires et de leur intégration (DS0402) 2015
Année de financement : 2015
Coordinateur du projet : Monsieur Alexis GAUTREAU (Ecole Polytechnique)
Montant : 450000.0 euros
Date de début : 2015
Durée : 36 mois
Résumé : La plupart des cellules normales migrent sur leur substrat grâce à des protrusions riches en actine. La migration doit être à la fois efficace et pouvoir répondre rapidement à des signaux qui la guident. Ici nous nous attaquons au défi de comprendre comment les protrusions peuvent être maintenues dans le temps, ou au contraire rétractées rapidement pour arrêter la migration et permettre à la cellule de tourner. Les modélisateurs ont identifié les "feedbacks" positifs et négatifs comme étant responsables de ces régulations versatiles. Malgré leur importance, ces circuits de signalisation sont rarement disséqués à l'échelle moléculaire. Notre projet a donc pour but d'identifier de nouveaux composants des feedbacks, de caractériser leur rôle dans la migration cellulaire, in vitro et in vivo, et de disséquer les mécanismes par lesquels ils contrôlent la persistance cellulaire.
Les feedbacks liés à l'actine impliquent que l'actine soit détectée et qu'elle agisse sur les régulateurs de la polymérisation d'actine. Nous identifierons des senseurs de feedback grâce à leur proximité avec le complexe Arp2/3 qui crée la jonction branchée des filaments d'actine. Pour cela, nous emploierons la biotinylation de proximité combinée à de la protéomique différentielle pour identifier les protéines avoisinant Arp2/3 dans les cellules sauvages qui génèrent des protrusions, mais pas dans les cellules knock-out pour Rac qui ne peuvent pas en générer. Nous identifierons des effecteurs de feedback grâce à leur association différentielle au complexe WAVE qui active Arp2/3 ou à Arpin qui inhibe Arp2/3, quand la polymérisation d'actine est bloquée ou non. Comme alternative à ces cribles protéomiques, nous avons déjà identifié 9 nouveaux effecteurs de Rac grâce à de multiples cribles double-hybride dans des banques de cDNA différentes. 
Les candidats obtenus seront alors testés pour leur importance fonctionnelle dans la migration cellulaire. Ces tests seront réalisés in vitro pour un crible quantitatif rapide et in vivo pour s'assurer de leur importance physiologique. La gastrula de zebrafish permettra des approches de génétique fonctionnelle directes et une excellente imagerie 3D. Nos modèles in vitro et in vivo couvrent des migrations de cellules individuelles et collectives, des marches aléatoires comme des migrations dirigées. Nous avons développé des programmes informatiques qui mesurent l'efficacité de migration et la persistance cellulaire, grâce à des fonctions d'autocorrélation de la vitesse et de la persistance directionnelle. L'inactivation de nos candidats par ARNi, morpholinos, et dans un deuxième temps, CRISPR-Cas9, nous permettra de sélectionner les deux protéines affectant le plus fortement ces paramètres in vitro et in vivo.
L'effet des deux protéines sélectionnées sur la dynamique de la protrusion membranaire et du cytosquelette d'actine sera analysé sur des films à haute fréquence d'acquisition. La localisation dynamique de nos protéines sélectionnées sera analysée grâce à des protéines de fusion GFP. Puis nous rechercherons des corrélations croisées entre ces différents paramètres dynamiques pour voir par exemple si nos protéines participent à la protrusion ou au contraire apparaissent juste avant la rétraction. Finalement, nous examinerons la contribution spécifique de ces protéines aux feedbacks de migration. Pour cela, nous analyserons grâce à un biosenseur comment Rac est activé en réponse à une dose localisée et transitoire de Rac activé, délivrée par optogénétique. Deuxièmement, nous mesurerons l'hystérésis de la migration cellulaire, c'est-à-dire le temps pendant lequel la migration directionnelle persiste quand on éteint un stimulus biophysique qui guide la migration. Ces mesures directes du feedback, dans des contextes sauvages et perte-de-fonction, placeront sans ambiguïté les nouveaux régulateurs identifiés dans des feedbacks positifs ou négatifs.