Projet ANR-14-CE13-0035 – PEP-FOR-HD : Amélioration de l'activité d'un peptide actif P42 contre la maladie de Huntington et développment d'une approche combinée de traitement contre cette maladie
Programme : Innovation biomédicale (DS0404)
Année de financement : 2014
Coordinateur du projet : Madame Florence MASCHAT (U710- INSERM)
Partenaires : Institut des Biomolécules Max Mousseron; MEDESIS PHARMA S.A.; University School of Life Sciences The Chinese University of Hong Kong; Laboratoire public; Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier
Montant : 297887.0 euros
Date de début : 2014
Durée : 60 mois
Résumé : Amélioration de la bioactivité d’un peptide thérapeutiqueLe projet est de mieux caractériser les modes d’action du peptide P42, dans le but de son utilisation dans des bithérapies contre la maladie de Huntington
Préparation d’outils performants pour une bitherapie contre la maladie de HuntingtonLa maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare, mais pour laquelle aucune médication permettant de ralentir ou stopper la maladie n’existe. L’expression d’une protéine Huntingtine (Htt) mutante contenant une expansion anormale du domaine polyQ est responsable de cette maladie très dévastatrice. L’expression de protéines mutantes va induire la formation d’agrégats, mais va aussi conduire à un déficit du facteur neurotrophique BDNF dont la fonction est cruciale pour l’activité des neurones du striatum. Ce déficit est probablement responsable de la dégénérescence des neurones du striatum et rend compte des différents symptômes moteurs, cognitifs et psychiatriques associés à cette maladie. Enfin outre les agrégats, la quantité de protéine polyQ-Htt soluble pourrait aussi présenter une certaine toxicité.Le projet proposé est donc de développer des stratégies en combinant 2 peptides présentant un potentiel thérapeutique contre la maladie de Huntington. Ces peptides auront des actions complémentaires puisqu’ils agissent à des niveaux différents, soit en inhibant les agrégats formés par la protéine mutante polyQ-Htt, grâce au peptide P42 (23aa), soit en modulant la transcription des ARNm et donc la quantité de protéine mutante polyQ-Htt et en diminuant la toxicité induite par l’ARNm mutant, grâce au peptide P3 (13aa). Les objectifs sont donc d’une part de mieux déterminer l’action de P42 non seulement sur le processus d’agrégation mais aussi sur les autres phénotypes défectueux dans la maladie.   Enfin nous avons aussi comme but de développer les technologies qui nous permettront de mesurer l’avantage thérapeutique des effets combinés de P42 et P3.
Préparation des outils et des technologies pour tester la bithérapie P42/P31- Construction de vecteurs: Afin de tester l’effet inhibiteur de P42 sur le processus d’agrégation, nous avons construit une série de vecteurs exprimant P42, l’exon1 ou le domaine N17 avec différents tags, pour des tests de co-immunoprécipitation. Des constructions ont été également effectuées avec des demi-GFP, permettant de tester les interactions avec P42 grâce à la reconstruction d’une GFP fluorescente dans des cellules HeLa. 2- Tests de viabilité de neurones du striatum avec polyQ normal (Q17) ou étendu (Q111): Evaluation du taux de mort neuronale en présence ou en absence de peptides, en dosant par colorimétrie le sel de tétrazolium MTT précipité par les mitochondries des cellules vivantes. 3 - Préparation de microtubules: P42 étant une partie de la Htt, nous avons pu montrer que la Htt liait les microtubules, via P42. Nous avons identifié un rôle de P42 dans le transport de vésicules le long des axones, chez la drosophile. Afin de conclure sur cette fonction de P42, nous avons construit des mouches transgéniques exprimant une Htt délétée de P42. 4- Tests de plasticité synaptique par électrophysiologie: Ce rôle de P42 sur la physiologie des neurones a conduit à analyser l’effet de P42 sur le facteur neurotrophique BDNF, que l’on trouve augmenté en présence de P42. L’effet de P42 sur la plasticité synaptique a d’autre part été testé par électrophysiologie.5- Tests d’activité neuronale: Nous avons pu montrer que P42 induisait une activité calcique sur des neurones hippocampiques de rat en culture, signe d’une augmentation de l’activité neuronale. Nous testerons si l’activité de P42 s’effectue via le BDNF.
Résumé de la soumission : La maladie de Huntington (HD) est provoquée par l'expansion anormale de triplets CAG, codant pour des poly-Glutamines (polyQ) dans la région codante du locus IT15 du génome humain et codant pour la protéine Huntingtine (hHtt). Il est généralement admis que la toxicité de la protéine polyQ-Htt soit due à un repliement anormal des protéines et à leur agrégation. L’agrégation de la polyQ-hHtt mutante déclenche une série d’événements délétères affectant surtout les neurones et pouvant aboutir à un dysfonctionnement neuronal et une mort cellulaire. En 2013, l’équipe de F. Maschat a identifié un peptide  de 23aa, P42, qui possède la capacité de 1) réduire l'agrégation des protéines mutantes polyQ-hHtt responsables de la HD, 2) de sauver des phénotypes neuronaux de la HD, y compris le transport axonal et les défauts de l'appareil locomoteur, et 3) de rallonger in vivo le temps moyen de survie des mouches transgéniques exprimant la protéine polyQ-hHtt mutante. Les effets protecteurs de P42 ont également été observés dans un modèle souris de la HD. Outre la toxicité de la protéine, il a été rapporté que les ARNm, correspondant aux transcrits mutants contenant une expansion anormale de CAG, contribuent à la neurotoxicité dans la dégénérescence des maladies à polyQ, y compris la HD. L’équipe de E. Chan a montré le rôle de la toxicité de l'ARN messager dans la pathogenèse de la HD, et a identifié un peptide de 13aa, P3, inhibiteur de la toxicité induite par l’ARNm muté (ARN-CAG). Ce peptide possède l'activité de supprimer 1) les défauts de transcription des pré-ARNr 45s, 2) l’induction du stress nucléolaire et 3) la neurodégénérescence causée in vivo par la toxicité  de l’ARN-CAG. Dans la mesure où à la fois les protéines polyQ-hHtt et l’ARN-CAG hHtt contribuent à la pathogenèse de la HD, nous envisageons de développer une stratégie thérapeutique qui ciblera simultanément ces deux espèces toxiques, ce qui serait idéal pour un traitement de la HD. Nos objectifs dans cette proposition sont (1) d'optimiser les activités biologiques de ces peptides inhibiteurs en les modifiant; (2) de mettre au point des systèmes efficaces d'administration des peptides pour co-délivrer les peptides inhibiteurs et les cibler dans le cerveau des souris modèles de la HD; et (3) d’analyser l'effet thérapeutique du co-traitement contre la toxicité de la protéine et de l'ARN mutés afin de traiter des souris modèles de la HD. À long terme, notre travail devrait permettre d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques contre cette maladie.
Résultats : Dans le but d’une bithérapie P42/P3, l’enjeu est de mieux caractériser P42 et P3. Concernant P3, son identification a été publiée en 2016 par le groupe d’Edwin Chan de Hong Kong, partenaire de ce projet (Zhang et al., Disease Models & Mechanisms, 2016). En tant que partie de la Htt, le rôle physiologique de P42 a été étudié. Cette étude a montré que P42 jouait un rôle important dans le transport axonal, et avait un effet sur la plasticité et l’activité neuronale. Ainsi P42 pourrait être protecteur de la maladie de Huntington, non seulement en diminuant l’effet négatif de la protéine mutante polyQ-Htt en inhibant la formation d’agrégats, mais aussi en augmentant l’activité de la protéine normale Htt, ce qui donne à P42 un potentiel thérapeutique particulièrement intéressant dans le cadre de cette maladie.
Perspectives : Les perspectives sont donc d’améliorer P42 dans un but thérapeutique et de développer des tests d’activité des peptides en amont des traitements chez la souris
- L’amélioration passe par une meilleure connaissance des modes d’action de P42 qui clairement agit de différentes manières et qui sont en cours d’analyse.
- Afin d’évaluer l’effet protecteur de P42, P42-TAT a été ajouté dans la nourriture des larves de drosophile, mais la reproductibilité des données doit être améliorée. 
- La viabilité des cellules Q111 par dosage MTT est affectée par rapport à Q17 et sera analysée en présence de peptide P42-TAT.
- L’élimination de P42 dans l’organisme est en cours d’analyse par imagerie sur petit animal.
- Les perspectives sont de tester la bithérapie P42/P3 dans un modèle souris de la maladie.
Publications et brevets : Un article concernant l'effet protecteur de P42 dans un modèle souris de la maladie de Huntington a été publié en 2014 (Arribat et al., (2014). Systemic delivery of P42 peptide: a new weapon to fight Huntington’s disease. Acta Neuropathologica Communications, 2:86) 
Les récentes données obtenues nous ont permis d’obtenir en 2015 une désignation de médicament orphelin par l’EMA (agence européenne du médicament : WC500188876), plébiscité par le CNRS (lettre innovation et viméo https://vimeo.com/152021281), ainsi que par l’Inserm. Cette étude a conduit à la publication d’une revue (Marelli, C., Maschat, F. (2016). P42: a novel and promising peptide-based therapy for Huntington’s disease. Orphanet Journal of Rare Diseases. 11:24.).