Projet ANR-12-BIME-0006 – Biomines : Exploration de la Biodiversité Microbienne pour l'Identification de Nouvelles Enzymes et Souches CBP
Programme : Bio-Matières et Energies (Bio-ME)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Madame Senta BLANQUET (IFP Energies nouvelles)
Partenaires : Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques; Laboratoire de Chimie Bactérienne; Institut français du pétrole Energies nouvelles
Montant : 786175.0 euros
Date de début : 2012
Durée : 48 mois
Résumé : Identification de nouveaux biocatalyseurs pour la dégradation de la biomasseLe projet Biomines vise à explorer des environnements spécialisés dans la dégradation de la matière végétale, par des approches microbiologique et moléculaire, afin d'identifier des nouvelles enzymes et bactéries capables de dégrader efficacement la lignocellulose, dans le cadre d'une production de bioethanol de seconde génération.
Améliorer l'efficacité de l'hydrolyse de la lignocellulose par des nouvelles enzymes et souchesLe développement des biocarburants de seconde génération, produit à partir de la biomasse lignocellulosique, est une voie importante pour la réduction des émissions des gaz à effet de serre tout en évitant une compétition des terres avec les usages alimentaires. Or, les schémas de procédés de production de bioéthanol à partir de ces matières premières sont trop onéreux pour constituer une solution viable. Notamment, l'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose est une étape peu efficace et à faible rendement. Une alternative est un schéma de procédé que l'on appelle «Consolidated Bioprocessing« (CBP), où un seul organisme est employé pour l'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique et la fermentation de sucres libérés, permettant potentiellement de réduire le coût total du procédé. Aujourd'hui, aucun microorganisme capable d'utiliser tous les sucres contenus dans la paroi végétale et de catalyser efficacement l'hydrolyse de la lignocellulose n'est disponible. C'est pourquoi nous proposons dans le présent projet d'isoler, à partir de milieux spécifiques et adaptés, des micro-organismes et des enzymes (hémi)cellulolytiques qui pourront mener au développement d'un biocatalyseur CBP efficace.Pour identifier de micro-organismes et d'enzymes adaptés, des enrichissements de microflores issus de milieux de dégradation de la biomasse végétal seront mis en place. Par cette approche, la probabilité d'isoler des souches ou enzymes pertinentes, est fortement augmentée. Un séquençage haut-débit permettra ensuite de couvrir une grande partie de la biodiversité et d'identifier des enzymes performantes et efficaces.
L'identification de biocatalyseurs est réalisée par deux approches complémentairesAfin de maximiser la probabilité d’isoler des souches efficaces, nous prévoyons d'enrichir des microflores provenant de sol ou de compost sur la biomasse lignocellulosique. A partir de ces enrichissements seront isolés des microorganismes par une approche microbiologique classique. L'emploi de substrats ciblés et des conditions bien définies permettra d'isoler les souches les mieux adaptées, pouvant mener à des biocatalyseurs efficaces en conditions industrielles. La capacité de ces souches de produire de l'éthanol ou des alcools plus lourds sera également testée.Sachant que la majorité de souches de l'environnement n'est pas cultivable, les enrichissement vont aussi servir de source pour une exploration de la partie non-cultivable du potentiel (hémi)cellulolytique par une approche métagénomique. L'ADN de la totalité des microorganismes présents dans les cultures sera extrait et analysé par séquençage à haut-débit. Par ce moyen, une base de données comprenant des séquences codantes pour des enzymes catalysant une large gamme de réactions sera créée. Une analyse bioinformatique et des tests enzymatiques, après expression des enzymes dans des organismes hôte adaptés, permettra ensuite d'identifier les enzymes les plus intéressantes. Le potentiel des bactéries identifiées à être employées dans un procédé industriel sera évalué.
Résumé de la soumission : Dans le monde entier, il y a des efforts importants pour promouvoir le développement durable, y compris par le remplacement d’une partie croissante de carburants d’origine fossile par les biocarburants. Le bioéthanol est le biocarburant le plus répandu au monde, mais les matières premières utilisées actuellement pour sa production, les plantes sucrières et amylacées, ne peuvent pas être produites en quantité suffisante pour répondre à la demande croissante. Le développement de biocarburants de seconde génération, produit à partir de la biomasse lignocellulosique, est une alternative prometteuse qui permet une réduction importante des émissions des gaz à effet de serre et d'éviter la concurrence pour des terres destinées aux usages alimentaires. Néanmoins, les schémas de procédés appliqués actuellement, et particulièrement la production d'enzymes cellulolytiques sont trop onéreux pour constituer une solution viable. Dans une configuration de procédé appelée "Consolidated Bioprocessing" (CBP), un seul organisme est employé pour l'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique et la fermentation de sucres libérés, permettant potentiellement de réduire le coût total du procédé. De plus, pour une production économique, tous les constituants de la biomasse lignocellulosique, et notamment les pentoses, doivent être utilisés. Aujourd'hui, aucun microorganisme capable d'utiliser tous les sucres contenus dans la paroi végétale et de catalyser efficacement les deux étapes n'est disponible. C'est pourquoi nous proposons dans le présent projet d'isoler, à partir de milieux spécifiques et adaptés, des micro-organismes et des enzymes (hémi)cellulolytiques qui pourront mener au développement d'un biocatalyseur CBP efficace.Afin de maximiser la probabilité d’isoler des souches efficaces, des enrichissements sur biomasse lignocellulosique vont être réalisés, inoculés avec des microflores provenant de milieux naturels dégradant la biomasse végétale. L'emploi de substrats ciblés et des conditions bien définies permettra d'isoler les souches les mieux adaptées, pouvant mener à des biocatalyseurs efficaces en conditions industrielles. En complément de cette exploration, une collection de souches incluant des espèces thermophiles et hyper-thermophiles, sera criblée. La capacité de ces souches de produire de l'éthanol et des alcools plus lourds sera également testée.Sachant que la majorité de souches de l'environnement n'est pas cultivable, les enrichissement vont aussi servir de source pour une exploration par une approche métagénomique de la partie non-cultivable des communautés microbiennes avec potentiel (hémi)cellulolytique. Par ce moyen, une base importante d'enzymes, représentant une diversité beaucoup plus large, sera créée. Afin d'isoler des gènes d'intérêt avec le plus haut taux de succès possible, des analyses TGGE et de séquençage 16S des cultures d'enrichissement seront réalisées pour définir le meilleur échantillon pour l'extraction d'acides nucléiques. L'ADN métagénomique sera criblé par pyroséquençage direct et par criblage fonctionnel ciblant les activités cellulolytiques et hémicellulolytiques. Une analyse bioinformatique permettra ensuite d'identifier les enzymes actives sur carbohydrates (CAZymes) et guidera le choix des enzymes à caractériser après expression hétérologue. L'expression dans la souche modèle Clostridium cellulolyticum permettra une première évaluation des gènes concernant leur aptitude d'être intégrés dans un microorganisme CBP.
Résultats : Des enrichissements à partir de sol ou de compost comme inoculum ont été réalisés en condition aérobie et anaérobie. Le suivi de la production de CO2 en condition aérobie a montré une activité de dégradation de la biomasse plus élevée dans les enrichissements issus de compost par rapport à ceux contenant du sol. D'autre part, une analyse de la microflore par séquençage 16S révèle une composition bien distincte selon le type d'enrichissement et la température de la culture. Plusieurs souches capables de dégrader la lignocellulose à différentes températures ont été isolées à partir des enrichissements de sol et de compost et leurs activités cellulosique et/ou hémicellulosique ont été mises en évidence sur substrats modèles. L'identification par séquençage du gène codant pour l'ARN 16S ainsi qu'une caractérisation plus fine de ces souches est en cours.
Les deux meilleurs enrichissements ont été choisis pour l'extraction de l'ADN métagénomique total. Du pyroséquençage 454 nous a fourni plus d'un million de reads pour chaque échantillon. Un enrichissement en CAZymes et en glycoside hydrolases a été observé sur les cultures de compost sur biomasse lignocellulosique et milieu poreux, mais pas dans les culture en suspension. En parallèle, le criblage fonctionnelle des banques métagénomiques a permis d'obtenir une trentaine de clones abritant des glycoside hydrolases qui sont maintenant en cours de sous-clonage et de caractérisation.
Perspectives : Pour la partie microbiologie, nous continuons à caractériser les souches.  La capacité à dégrader différents substrats cellulosiques modèles tels que le CMC ou l'Avicel mais aussi la biomasse lignocellulosique prétraitée est testée, et des cinétiques d'hydrolyse sont établies. Leur capacité à produire des alcools va également être testée.
La caractérisation des enzymes, issues des banques métagénomiques et exprimée chez E. coli avec un tag Histidine, se poursuit. Leurs activités spécifiques sur plusieurs substrats ainsi que les conditions réactionnelles optimales seront déterminées.
Publications et brevets : Les résultats vont être présentés lors des congrès scientifiques et publiés dans des revues à comité de lecture.