Projet ANR-12-BSV2-0015 – GABAplEx : RCPG oligomériques: Faits et fonction dans le cas du récepteur GABAB
Programme : Blanc - SVSE 2 - Biologie cellulaire et biologie du développement (Blanc SVSE 2) 2012
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur Jean-Philippe Pin (Institut de Génomique Fonctionnelle)
Partenaires : Centre de Biochimie Structurale; CISBIO BIOASSAYS; Institut de Génomique Fonctionnelle
Montant : 554895.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 48 mois
Résumé : Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) sont des protéines clés de la communication cellulaire. Bien qu’ils soient capables d’activer les protéines G sous une forme monomérique, ces récepteurs ont la capacité de former des dimères ou des oligomères d’ordre supérieur générant ainsi des complexes ayant des propriétés spécifiques. Cependant, la pertinence physiologique de l’oligomérisation reste peu caractérisée en systèmes natifs. Le récepteur GABAB - RCPG du principal neurotransmetteur inhibiteur GABA – constitue un modèle de choix pour l’étude de l’oligomerisation des RCPGs. En effet, ce récepteur est non seulement un hétérodimère obligatoire constitué des sous-unités GABAB1 et GABAB2, mais il peut également former des entités oligomériques via l’interaction directe des sous-unités GABAB1 comme nous l’avons récemment démontré dans des cellules transfectées et dans des extraits de cerveau.
Le but de ce projet est 1) d’identifier les diverses stoechiométries possibles pour les oligomères de GABAB à différentes localisations subcellulaires et 2) de déterminer la signification fonctionnelle de ces différents oligomères.
Le premier objectif nécessite la mise en œuvre de technologies innovantes dont les microscopies de FRET en temps-résolu et de fluctuation de fluorescence à deux photons. Le marquage des sous-unités GABAB sera réalisé soit, pour les sous-unités natives, par des ligands et anticorps fluorescents, soit à l’aide de substrats fluorescents pour le marquage covalent des sous-unités fusionnées aux snap et exprimées dans les cultures par vecteurs lentiviraux. L’effet sur l’oligomérisation de différents facteurs, tels la phosphorylation du récepteur ou les protéines d’interaction intracellulaires, sera étudié.
Le second objectif inclue le développement d’outils moléculaires qui empêchent la formation des oligomères du récepteur GABAB soit en mutant l’interaface GABAB1-GABAB1, soit en caractérisant des peptides de compétition. Les propriétés fonctionnelles et pharmacologiques des dimères stricts et des oligomères seront alors analysées. D’abord, en développant un senseur FRET d’activation du récepteur GABAB, nous analyserons l’influence, au sein de l’oligomère, de l’activation d’un dimère sur le processus d’activation du second. Ensuite, une analyse systématique de l’ensemble des voies de signalisations activées par le récepteur GABAB sera réalisée. Enfin, des animaux transgéniques exprimant uniquement les hétérodimères stricts du récepteur GABAB seront générés. La stoechiométrie des complexes sera vérifiée par TR-FRET et microscopie de fluctuation de fluorescence à deux photons puis les conséquences fonctionnelles seront examinées par études comportementales et en enregistrant les effets dépendants du récepteur GABAB sur l’activité synaptique.
En utilisant des technologies et des outils de pointe développés en partenariat avec une biotech, cette étude apportera la première démonstration claire et l’existence et de la pertinence physiologique des oligomères du récepteur GABAB. Ce projet apportera également de nouvelles stratégies pour aborder de telles problématiques pour les autres protéines multimériques de la surface cellulaire.