Projet ANR-11-BSV4-0020 – Brainvasc : Etude du contrôle neuronal de la vascularisation cérébrale locale : Combinaison de l’optogénétique et de l’imagerie ultrasonore  rapide.
Programme : Blanc - SVSE 4 - Neurosciences (Blanc SVSE 4)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Jean ROSSIER (INSERM-PARIS V)
Partenaires : Institut national de la santé et de la recherche médicale; Université Paris Descartes; École supérieure de physique et de chimie industrielles de la ville de Paris
Montant : 162016.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Identification de nouvelles populations d’interneurones impliqués dans la régulation des flux sanguins dans le cerveauNos aborderons cette problématique par une approche originale combinant l’activation de réseaux de neurones spécifiques par optogénétique et l’imagerie fonctionnelle ultrasonore à haute résolution spatio-temporelle.
Comprendre le lien entre l’activité électrique et l’activité vasculaire dans le cerveauDepuis plus d’un siècle nous savons que l'augmentation de l’activité cérébrale locale s’accompagne d'une augmentation du flux sanguin cérébral. Ce phénomène s’appelle couplage neurovasculaire ou encore hyperémie fonctionnelle. Ces variations de perfusion sanguine constituent un signal indirect du fonctionnement neuronal, qui permet grâce aux techniques d’Imagerie cérébrale par Résonance Magnétique (IRMf) de réaliser des images fonctionnelles de l’activation neuronale. Plusieurs neuropathologies, telles que la maladie d’Alzheimer, la migraine ou encore les accidents vasculaires cérébraux, sont associées à des altérations de la perfusion cérébrovasculaire. Cependant, malgré l’importance du bon fonctionnement de la perfusion cérébrale, les mécanismes cellulaires et moléculaires en charge de sa régulation sont encore très mal connus.Depuis de nombreuses années, notre laboratoire s’est attaché à caractériser les interneurones du cortex en associant anatomie, électrophysiologie et biologie moléculaire, ce qui lui a forgé une réputation mondiale pour ses travaux multidisciplinaires. De plus son expertise dans l’étude du couplage neurovasculaire nous a amené à concevoir ce projet, qui a pour objectif de déterminer le rôle de différentes sous population d’interneurones corticaux exprimant des peptides vasoactifs dans la régulation locale du tonus vasculaire.
Activation de réseaux de neurones spécifique par approche optogénétique ciblée et enregistrement de la réponse vasculaire par imagerie fonctionnelle ultrasonore.Ce projet bénéficie de nouveaux outils déjà opérationnels dans notre laboratoire : l’optogénétique, mise en œuvre ex vivo sur des tranche de cortex somatosensoriel, couplé à de la vidéomicroscopie infrarouge ou encore in vivo, couplé à une toute nouvelle méthode d’imagerie ultrasonore que nous avosn développé au laboratoire.L’optogénétique permet de stimuler ou d'inhiber des populations neuronales spécifiques. Pour ce faire, nous utilisons des lignées de souris transgéniques exprimant la Cre recombinase dans un seul type d’interneurones. Des injections locales de vecteurs viraux permettent l’expression de contrôleurs photoactivables dans les interneurones ciblés. Ces contrôleurs transforment des signaux optiques en signaux physiologiques et permettent de contrôler l'activité neuronale d’une population choisie. Les contrôleurs photoactivables sont la channelrhodopsine (ChR2) pour l’activation et l’archeorhodopsine (Arch) pour l’inhibition. In vivo, les variations de flux sanguin seront imagées par une nouvelle méthode d’imagerie ultrasonore rapide que nous développons au laboratoire. Cette méthode permet sur un rongeur anesthésié de visualiser après amincissement du crâne les artères perforantes du cortex ainsi que la vascularisation des zones plus profondes. Notre travail sur le rôle des sous-classes d’interneurones comme contrôleurs des flux sanguins locaux pourrait renforcer l’hypothèse qu’il existe au sein du système nerveux centrale tout un système de contrôle de la vascularisation cérébrale encore bien inconnu. Notre travail aurait plus généralement des répercussions en physiopathologie car ce couplage neurovasculaire est altéré dans les pathologies neurodégénératives.
Résumé de la soumission : Etude du contrôle neuronal de la vascularisation cérébrale locale : Combinaison de l’optogénétique et de l’imagerie ultrasonore rapideDepuis plus d’un siècle nous savons que l'augmentation de l’activité cérébrale locale s’accompagne d'une augmentation du flux sanguin cérébral. Ce phénomène s’appelle couplage neurovasculaire ou encore hyperémie fonctionnelle. Ces variations de perfusion sanguine constituent un signal indirect du fonctionnement neuronal, qui permet grâce aux techniques d’Imagerie cérébrale par Résonance Magnétique (IRMf) de réaliser des images fonctionnelles de l’activation neuronale. Plusieurs neuro-pathologies, telles que la maladie d’Alzheimer, la migraine ou encore les accidents vasculaires cérébraux, sont associées à des altérations de la perfusion cérébrovasculaire. Cependant, malgré l’importance du bon fonctionnement de la perfusion cérébrale, les mécanismes cellulaires et moléculaires en charge de sa régulation sont encore très mal connus.Depuis de nombreuses années, notre laboratoire s’est attaché à caractériser les interneurones du cortex en associant anatomie, électrophysiologie et biologie moléculaire, ce qui lui a forgé une réputation mondiale pour ses travaux multidisciplinaires. De plus son expertise dans  l’étude du couplage neurovasculaire nous a amené à concevoir ce projet, qui a pour objectif de déterminer le rôle de différentes sous population d’interneurones corticaux exprimant des peptides vasoactifs dans la régulation locale du tonus vasculaire.  Ce projet bénéficiera de nouveaux outils déjà opérationnelles dans notre laboratoire : l’optogénétique, mise en œuvre ex vivo sur des tranche de cortex somatosensoriel, couplé à de la videomicroscopie infrarouge ou encore in vivo, couplé à une toute nouvelle méthode d’imagerie ultrasonore rapide.Dans cet objectif, l’optogénétique permettra de stimuler ou d'inhiber des populations neuronales spécifiques. Pour ce faire, nous utilisons des lignées de souris transgéniques exprimant la Cre recombinase dans un seul type d’interneurones. Des injections locales de vecteurs viraux permettent l’expression de contrôleurs photoactivables dans les interneurones ciblés. Ces contrôleurs transforment des signaux optiques en signaux physiologiques et permettent de contrôler l'activité neuronale d’une population choisie. Les contrôleurs photoactivables sont la channelrhodopsine (ChETA) pour l’activation et l’archeorhodopsine (Arch) pour l’inhibition. Nous avons déjà montré ex vivo en résultats préliminaires, que chez des souris VIP-Cre, la stimulation lumineuse de ChETA induit une vasodilatation dans des tranches corticales. In vivo, les variations de flux sanguin seront imagées par une nouvelle méthode d’imagerie ultrasonore rapide développée très récemment à l’Institut Langevin de l’ESPCI par Mathias Fink et Mickael Tanter. Cette méthode permet sur une souris anesthésiée de visualiser après amincissement du crâne les artères perforantes du cortex ainsi que la vascularisation des zones plus profondes. Des expériences préliminaires montrent déjà que des stimulations somato-sensorielles provoquent des augmentations de la perfusion dans les territoires cérébraux correspondants. Grâce à cette nouvelle méthode d’imagerie qui permet d’imager la totalité du cerveau en dissociant les veines des artères, avec une résolution inégalée, nous proposons d'étudier le rôle des interneurones dans le couplage neurovasculaire. Notre travail sur le rôle des sous-classes d’interneurones comme contrôleurs des flux sanguins locaux pourrait renforcer l’hypothèse qu’il existe au sein du système nerveux centrale tout un système de contrôle de la vascularisation cérébrale encore bien inconnu. Notre travail aurait plus généralement des répercussions en physiopathologie car ce couplage neurovasculaire est altéré dans les pathologies neurodégénératives.
Résultats : Au commencement du projet, nous avons été contraint de modifier le calendrier prévisionnel car l’expansion de la lignée transgénique VIP::Cre s’est avérée plus difficile que prévue. Nous avons donc débuté notre projet par l’étude de la lignée PV::Cre (initialement prévue en année 3 du projet) ce qui s’est révélé être une excellente stratégie car nous avons obtenus un grand nombre de résultats nouveaux et qui ouvrent de nouvelles perspectives pour le projet.
En effet, nous avons démontré de manière inattendue que l’activation optogénétique des interneurones à fréquence de décharge rapide et qui expriment la parvalbumine (FS-PV) entraîne une vasoconstriction des artérioles pénétrantes sur tranche de cortex. Ces interneurones sont très étudiés car ils jouent un rôle essentiel dans le maintien des rythmes dans le cerveau (et dans les pathologies comme l’épilepsie). Bien que nous n’ayons pas encore identifié le mode d’action (directe ou indirecte) conduisant à cette contraction, nous avons émis plusieurs hypothèses de travail. La première impliquerait l’inhibition d’autres populations d’interneurones dit vasodilateur comme les interneurones exprimants le VIP ou la NOS. La seconde, plus originale, serait la conséquence de l’activation de populations de cellules pyramidales particulière. En effet, lors de nos expériences, nous avons mis en évidence l’existence de projection cortico-thalamique issues de cellules pyramidales de la couche V (couche de sortie du cortex), qui pourraient être impliquée dans des boucles de rétrocontrôles du type fed-forward entre le thalamus et le cortex. Afin de répondre à ces questions sans ambiguité, nous avons développés une série de nouveaux virus permettant de marquer distinctement soit les interneurones FS-PV soit les cellules pyramidales exprimant la PV.
Perspectives : Notre projet consiste à identifier de nouvelles populations d’interneurones qui pourraient jouer un rôle dans la régulation de la perfusion locale. Après une première partie ex vivo, il s’agira de démontrer la validité des résultats in vivo. Dans cet objectif, nous mettons actuellement au point, l’imagerie fonctionnelle ultrasonore en condition chronique. Nous avons déjà franchi les principales difficultés et après 6 mois de développement, nous avons réalisé les premières images du cerveau d’un rat en condition chronique sur plusieurs semaines. Des expériences préliminaires montrent déjà que des stimulations somato-sensorielles provoquent des augmentations de la perfusion dans les territoires cérébraux correspondants. Grâce à cette nouvelle méthode d’imagerie qui permet de dissocier les veines des artères avec une résolution inégalée, nous proposons d'étudier le rôle des interneurones dans le couplage neurovasculaire.
Publications et brevets : Depuis le début du projet, 3 publications ont déjà été acceptées et publiées.
Le premier travail est une revue sur les techniques de ciblage de populations spécifiques de neurones publiée dans la revue Progress in Brain Research : Urban A and Rossier J, Genetic targeting of specific neuronal cell types in the cerebral cortex, Progress in Brain Research 2012;196:163-92.
Le second travail est une publication décrivant les résultats obtenus sur le rôle des populations de neurones PV(+) dans le contrôle de la perfusion cérébrale locale publiée dans la revue Frontiers in Neuropharmacology Urban A, Rancillac A, Martinez L, Rossier J. Deciphering the neuronal circuitry controlling local blood flow in the cerebral cortex with optogenetics in PV::Cre, Frontiers in Neuropharmacology 2012,doi:10.3389/fphar.2012.00105
En lien avec le développement de notre nouvelle méthode d’imagerie ultrasonore, nous avons publié un travail sur le largage ciblé d’agent dans l’organisme d’un rat de manière non invasive par ultrasons. Ce travail a fait la couverture du journal Medical Physics Couture, O., A. Urban, A. Bretagne, L. Martinez, M. Tanter and P. Tabeling. In vivo targeted delivery of large payloads with an ultrasound clinical scanner. Med Phys. 39. 5229-5237. 2012