Projet ANR-10-BLAN-0805 – MASS-IMAGE : Nouvelles méthodes en imagerie par spectrométrie de masse pour l'étude de la maladie d'Alzheimer
Programme : Sciences de l'information, de la matière et de l'ingénierie : Chimie du solide, colloïdes, physicochimie (Blanc SIMI 8)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Alain Brunelle (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD)
Partenaires : Institut de Chimie des Substances Naturelles; Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 285000.0 euros
Durée : 36 mois
Résumé : Imagerie par spectrométrie de masse : développements et application à la maladie d’AlzheimerNouvelles méthodes en imagerie par spectrométrie de masse pour l'étude de la maladie d'Alzheimer
Développements méthodologiques en imagerie biologique par spectrométrie de masse pour l’étude in situ de lipides impliqués dans la maladie d’AlzheimerL’imagerie par spectrométrie de masse TOF-SIMS (Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry) donne accès à la composition chimique de la surface d’un échantillon avec une précision de l’ordre du micron, et ce sans aucun a priori sur les espèces cartographiées.L’objectif principal de ce projet était d’améliorer grandement à l’aide de la chimie analytique les performances de l’imagerie biomédicale par spectrométrie de masse, de rapprocher cette méthode de la recherche clinique, et d’en faire une méthode de choix pour l’histopathologie en neuropathologie humaine. Trois premières tâches du projet visaient à rendre compatible cette méthode avec l’histologie, à réaliser une identification structurale in situ (directement sur les coupes), ou à défaut à construire des bases de données de lipides, et enfin à tester une méthode dite de G-SIMS. Dans une quatrième et dernière tâche, ces nouvelles méthodes devaient être utilisées pour l’étude d’échantillons provenant de malades décédés de la maladie d’Alzheimer.
Développements méthodologiques : compatibilité avec l’histologie, méthode d’identification des lipides, étude préliminaire sur l’analyse en 3-DDans un premier temps, la compatibilité entre des colorations histologiques et l’imagerie par spectrométrie de masse a été testée, puis des méthodes mises au point afin d’optimiser cette compatibilité. Ensuite, à défaut d’un analyseur TOF/TOF qui aurait été destiné à des analyses structurales de lipides, in situ, en SIMS, une base de données de lipides a été constituée et validée par des analyses complémentaires développées en MALDI-TOF. L’arrivée sur le marché des instruments de nouvelles sources d’agrégats massifs d’argon a permis de tester, en adaptant la méthode de « dual beam depth profiling », des analyses en 3-D dans des coupes de cerveau de rat, puis à montrer que cette méthode peut servir à grandement augmenter la sensibilité de l’imagerie par spectrométrie de masse. Enfin la reproductibilité et la répétabilité de cette méthode d’analyse de surface ont été caractérisées sur des coupes identiques de cerveau de rat, et se sont révélées excellentes.
Résumé de la soumission : L’imagerie par spectrométrie de masse TOF-SIMS (Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry) donne accès à la composition chimique de la surface d’un échantillon avec une précision de l’ordre du micron, et ce sans aucun a priori sur les espèces cartographiées.L’objectif principal de ce projet est d’améliorer grandement à l’aide de la chimie analytique les performances de l’imagerie biomédicale par spectrométrie de masse, faisant vraiment de cette méthode une « histologie moléculaire », totalement compatible avec les protocoles d’histologie et d’immunohistochimie en travaillant avec les mêmes échantillons. Notre souhait est de rapprocher cette méthode de la recherche clinique, d’en faire une méthode de choix pour l’histopathologie dans les hôpitaux, au plus près du bloc opératoire.Bien que plusieurs applications biologiques et biomédicales de l’imagerie par spectrométrie de masse aient déjà été publiées dans différents domaines (Dystrophie Musculaire de Duchenne, Stéatose hépatique non-alcoolique, Maladie de Fabry, plaques d’athérome), la nécessité d’une identification in situ des espèces moléculaires fait toujours face à ces résultats. Sans cela l’imagerie ionique ne peut pas prétendre être une méthode analytique valable ni robuste. Au contraire, la combinaison de l’imagerie et de l’identification des espèces moléculaires, au moyen d’une spectrométrie de masse en tandem et/ou de bases de données de spectres standards sera une inestimable force pour l’imagerie par spectrométrie de masse. Une base de données de spectres TOF-SIMS de lipides standards n’existe pas.Un analyseur SIMS TOF-TOF, complètement nouveau, fera réellement émerger l’imagerie TOF-SIMS en faisant disparaître son principal défaut en comparaison avec d’autres méthodes. Bien que la technique soit prête pour une telle amélioration instrumentale, le constructeur doit la concevoir entièrement. Ceci représente un risque qui ne peut pas être négligé, et pour cette raison une solution alternative est présentée, par l’étude de fragmentations en source, conjointement à une bibliothèque de spectres TOF-SIMS de lipides. Le G-SIMS (Gentle-SIMS) est une amélioration analytique introduite il y a quelques années par Gilmore et collaborateurs, et qui sera évaluée avec des échantillons biologiques. Elle a pour but de tirer avantage des différents taux de fragmentations des ions en utilisant comme projectile respectivement un ion monoatomique léger, un ion monoatomique lourd, et un ion polyatomique . Un nouvel émetteur composé d’un alliage de bismuth-manganèse permet avec la même optique d’avoir des faisceaux de manganèse et d’agrégats de bismuth qui irradient alternativement la même surface du même échantillon, pour générer ensuite les spectres G-SIMS. De tels spectres n’ont pour l’instant été enregistrés que sur des films de polymères. Ils sont bien plus informatifs que les spectres TOF-SIMS usuels, avec un meilleur rapport signal-sur-bruit pour les ions moléculaires et aussi des fragments caractéristiques qui ne sont pas noyés par une foule de pics non spécifiques. Cette méthode, qui sera appliquée à des lipides, à partir de standards et aussi à partir de coupes de tissus, aidera beaucoup aussi à l’identification des lipides par la génération de spectres plus simples et plus informatifs.Ces nouvelles méthodes seront enfin utilisées pour l’étude d’échantillons provenant de malades décédés de la maladie d’Alzheimer. Nous choisirons les échantillons par le type de lésion et leur sévérité. Les plaques seront révélées par immunohistochimie en utilisant des anticorps spécifiques dirigés contre le C-terminal des peptides A-beta 42 et 40. Les altérations neurofibrillaires seront visualisées par un anticorps AT8 anti-tau. Une série d’échantillons témoins, cas jeunes et normaux, patients âgés avec des altérations minimales (considérés normaux pour leur âge) et patients âgés atteints d’autres maladies neurodégénératives seront utilisés.
Résultats : Outre les développements de méthodes cités dans le paragraphe précédent, et qui constituent les trois-quarts du projet, des échantillons congelés de cerveaux de patients décédés de la maladie d’Alzheimer ont été analysés, montrant une surcharge en cholestérol dans le cortex des cerveaux malades. Enfin, après avoir mis au point une méthode pour analyser des échantillons provenant de cerveaux fixés au paraformaldéhyde, les dernières expériences ont montré une potentielle diminution des sulfatides dans les plaques séniles, dont la taille n’est que de quelques dizaines de microns.
Perspectives : Du point de vue des développements analytiques, des méthodes de préparation d’échantillon qui permettent d’allier l’histologie et l’imagerie par spectrométrie de masse ont été mises au point. Une base de données de spectres de lipides a été produite. Une nouvelle source d’agrégats massifs d'argon a été testée, qui ouvre des perspectives très intéressantes dans l’avenir pour réaliser des analyses en trois dimensions et pour augmenter la sensibilité de l’imagerie TOF-SIMS. Enfin concernant l’analyse d’échantillons de coupes de cerveau de patients décédés de la maladie d’Alzheimer, des changements dans la composition en cholestérol et en sulfatides ont été détectés in situ. Pour cela une méthode d’analyse des échantillons fixés a été mise au point, et une étude de répétabilité a été menée.
Publications et brevets : Ce projet a donné lieu à 9 publications dans des journaux internationaux à comité de lecture, 1 chapitre de livre, 8 conférences, 8 communications orales, et 4 communications par affiche.