Projet ANR-11-BSV8-0024 – BRONCHIOLITEASER : Etude structurale et fonctionnelle du complexe polymérase du virus respiratoire syncytial et recherche d’inhibiteurs
Programme : Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale (Blanc SVSE 8)
Année de financement : 2011
Coordinateur du projet : Monsieur Jean-François ELÉOUËT (INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - CENTRE DE RECHERCHE DE JOUY-EN-JOSAS)
Partenaires : Institut de Chimie des Substances Naturelles; Institut national de la recherche agronomique; Institut Pasteur
Montant : 259800.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : BRONCHIOLITEASERÉtude structurale et fonctionnelle du complexe polymérase du virus respiratoire syncytial et recherche d’inhibiteurs
Enjeux et objectifsLe virus respiratoire syncytial (VRS) est le principal agent responsable des pneumonies et bronchiolites chez le nouveau-né ainsi que chez le veau. Il n'existe pas de vaccin à ce jour pour l'homme et les antiviraux restent à développer. Ce projet vise à mieux caractériser au niveau structural et fonctionnel le complexe ARN polymérase de ce virus. Ce complexe représente une cible de choix pour le développement d'antiviraux.
MéthodologieLes différents composants du complexe ARN polymérase viral seront exprimés sous forme recombinante, purifiés et les domaines fonctionnels seront caractérisés en étudiant les interactions protéine-protéine in vitro et in vivo. Les protéines entières ou les domaines seront étudiés soit par cristallographie, soit par RMN afin de résoudre leur structure atomique. Les résidus critiques pour ces interactions seront caractérisés à l'aide de mutants.
Résumé de la soumission : Contexte scientifique Le virus respiratoire syncytial (VRS ou RSV) est le principal agent responsable de maladies respiratoires graves chez les bovins ainsi que chez l’homme, causant à lui seul plus de 70% des bronchiolites chez les deux espèces. En effet, 100% des veaux et des enfants sont infectés avant l’âge de trois ans. Ainsi, 460 000 enfants sont infectés chaque année en France, 40% développent une bronchiolite, et environ 5% sont hospitalisés. Les traitements à la fois préventifs et curatifs sont insuffisants. Chez l’homme, il n’existe pas de vaccin, et les antiviraux se limitent à la Ribavirine, un analogue de nucléotide toxique et tératogène, et à un anticorps monoclonal très coûteux (palivizumab, Synagis, 5000€ par patient) qui est efficace à 50%. Si la mortalité chez les jeunes enfants est faible en France (< 0,1 %), elle est généralement de 2 à 20% chez les jeunes bovins. Mais le VRS n'en demeure pas moins le virus le plus mortel pour les enfants de moins de deux ans en particulier pour les prématurés. Le VRS serait aussi responsable d’asthme récurrent chez les enfants. Le complexe ARN polymérase du virus respiratoire syncytial se compose des protéines L (large), P (phosphoprotéine), M2-1, M2-2 et N (nucléoprotéine). Ce complexe réplique l’ARN génomique viral et transcrit les gènes viraux. Il est très spécifique du virus et n’a pas d‘équivalent dans la cellule hôte. Il représente donc une cible de choix pour des antiviraux. Parmi ces 5 protéines, seule la structure atomique de la protéine N a été résolue en 2009 par les équipes 1 et 3 (publié dans la revue « Science »). Les partenaires cellulaires de cette machinerie complexe sont inconnus. Descriptif du projet Ce projet vise à d’une part à acquérir des données structurales et fonctionnelles sur le complexe ARN polymérase du VRS, essentielles pour comprendre le fonctionnement du complexe ARN polymérase viral du VRS, et d’autre part développer des antiviraux spécifiques. Pour celà, 3 équipes très complémentaires s’associent pour résoudre la structure du co- facteur de transcription M2-1, celle du complexe P-N, et rechercher des inhibiteurs d’interactions entre ces protéines. La structure des protéines M2-1 et des complexes P-N produites par les équipes 1 + 2 sera déterminée respectivement par RMN (équipes 1+ 2) et cristallographie (équipes 1+3). En retour, le fonctionnement de ces protéines sera analysé par mutagenèse par l’équipe 1. Lors d’un criblage utilisant les protéines P et N recombinantes (équipes 1 + 2), nous avons déjà identifié cinq molécules capables d’inhiber l’interaction entre P et N. Les équipes 1 et 2 ont déjà déterminé que ces molécules ne se fixent pas sur la protéine P par RMN. Parmi ces 5 molécules, trois appartiennent à deux séries de composés naturels, extraits de plantes tropicales. D’autres molécules appartenant à la même famille, et isolées de plantes, seront testées quant à leur capacité à fixer N, afin de sélectionner les plus affines. Nous co-cristalliserons (équipes 1+3+2) ces molécules avec la protéine N afin de déterminer la structure des complexes {N+substances}, voir où elles se fixent et déterminer ainsi comment elles agissent. Résultats attendusLes données structurales et fonctionnelles, que nous obtiendrons sur ces molécules ainsi que la comparaison du site de fixation de P sur N avec le site de fixation des inhibiteurs criblés au hasard permettront de mieux comprendre comment se réplique le VRS, et au-delà les virus à ARN négatif simple brin, et donnerons des bases pour développer des antiviraux très spécifiques ciblant ce complexe enzymatique.
Résultats : La structure RMN du domaine central du facteur de transcription M2-1 du VRS a été résolue par RMN. Les résidus impliqués dans les interactions avec le cofacteur P de la polymérase et l'ARN ont été caractérisés par RMN ainsi que par mutagenèse et tests fonctionnels. Le domaine de la nucléoprotéine interagissant avec la protéine P a été identifié et les résidus impliqués caractérisés. Des cristaux de ce domaine complexé au domaine de la polymérase en interaction sont en cours.
Perspectives : La co-cristallisation de la nucléoprotéine avec le co-facteur principal de la polymérase, la phosphoprotéine P, permettra d'identifier des zones cibles pour des inhibiteurs potentiels. Différentes molécules potentiellement inhibitrices de l'activité ARN polymérase vont être testées en utilisant un test fonctionnel. L'analyse structurale par RMN des différents domaines de P et de M2-1, seuls ou en interaction avec leurs partenaires, sont en cours.
Publications et brevets : La caractérisation du domaine de la nucléoprotéine interagissant avec la phosphoprotéine est acceptée pour publication dans the Journal of Virology.
La structure RMN du domaine core de M2-1 est acceptée pour publication dans PLoS Pathogens