Projet ANR-12-BSV6-0017 – INFERNO : Hérédité épigénétique transgénérationnelle chez les ciliés : mécanismes et conséquences évolutives
Programme : Blanc - SVSE 6 - Génomique, génétique, bioinformatique et biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2012
Coordinateur du projet : Monsieur MEYER Eric (CNRS Institut de Biologie de l'Ecole Normale Superieure)
Partenaires : Centre de Génétique Moléculaire; Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure; Laboratoire public; Laboratoire public; Biométrie et Biologie Évolutive
Montant : 570000.0 euros
Date de début : 2013
Durée : 48 mois
Résumé : Hérédité épigénétique chez les ciliés : mécanismes et conséquences évolutivesDes petits ARN maternels sont requis pour l’élimination des transposons et séquences uniques dérivées au cours du développement du noyau somatique. Leur mode d’action permet l’hérédité non mendélienne de réarrangements alternatifs du génome, donc de phénotypes différenciés, mais devrait aussi causer de la dysgenèse hybride lors du croisement de souches présentant des polymorphismes d’insertion.
Génomes micronucléaires des 15 espèces P. aurelia: insertions polymorphes et impact évolutifDes petits ARN sont très souvent utilisés chez les eucaryotes comme ‘système immunitaire’ du génome permettant le contrôle des éléments transposables. Ils sont aussi impliqués dans des phénomènes d’hérédité non mendélienne chez des organismes très divers. Nous proposons d’utiliser le cilié P. aurelia pour apporter un éclairage phylogénétique nouveau à l’impact évolutif de ces mécanismes, encore mal connu. Chez cet unicellulaire, les fonctions germinales sont assurées par les micronoyaux diploïdes et les fonctions somatiques par les macronoyaux polyploïdes, dont le génome est réarrangé pour éliminer les transposons et les séquences uniques qui en dérivent (IES). Ces séquences sont ciblées au cours du développement par les scnRNA, petits ARN germinaux d’origine maternelle qui sondent d’abord le génome somatique maternel pour y identifier les séquences manquantes, et reproduisent ensuite les mêmes délétions dans le macronoyau zygotique. Ce mécanisme permet l’hérédité maternelle de réarrangements alternatifs pendant la conjugaison, et il a été co-opté pour assurer la transmission épigénétique de caractères différenciés. Mais il pose théoriquement un problème de dysgenèse hybride lors du croisement entre souches présentant des polymorphismes d’insertion d’IES: une souche dépourvue d’une IES donnée ne peut produire de scnRNA homologues, et ne pourra exciser cette IES introduite par voie paternelle; si l’IES est insérée dans un gène essentiel, les descendants héritant de cet allèle ne seront pas viables. Une fraction significative des ~45.000 IES de P. tetraurelia a probablement été acquise depuis la divergence des 15 espèces jumelles du groupe P. aurelia. Nous proposons de préciser le mécanisme d’action des scnRNA et de séquencer le génome micronucléaire de différentes espèces pour reconstruire l’histoire évolutive des transposons, IES, et centromères micronucléaires, et évaluer leur possible contribution au phénomène de spéciation.
Séquençage de génomes micronucléaires et défauts de réarrangements chez les hybridesUne difficulté technique majeure est la purification de micronoyaux en quantité suffisante pour permettre le séquençage et l’assemblage des génomes, y compris leur fraction répétée. Nous avons mis au point une méthode basée sur la cytométrie en flux de micronoyaux marqués par un colorant fluorescent de l’ADN et par une protéine de fusion (CenH3-GFP) fluorescente absente des macronoyaux. Celle-ci permet d’obtenir suffisamment d’ADN pour obtenir une bonne couverture des génomes par les techniques de séquençage à haut débit, mais pas pour générer les liens clones nécessaires à un assemblage complet des séquences répétées. Pour obtenir ces liens clones, nous utiliserons l’ADN de macronoyaux différenciés après déplétion de l’endonucléase Pgm (dont le génome est amplifié à forte ploïdie mais pas réarrangé), qui peut être obtenu en quantité bien plus importante. Après assemblage par des procédés standard, les IES seront identifiées par comparasion avec les génomes macronucléaires des mêmes souches (séquencés en collaboration avec Michael Lynch, Indiana University). L’annotation des éléments transposables sera réalisée en collaboration avec H. Quesneville à l’aide d’un pipeline dédié et de curation manuelle. L’identification des centromères repose sur l’immunoprécipitation de chromatine avec des anticorps dirigés contre l’histone centromérique CenH3, le séquençage et l’analyse bioinformatique des séquences obtenues. La déplétion de Pgm (et d’autres facteurs potentiellement impliqués dans les réarrangements ou dans la voie des scnARN) utilise une technique simple et efficace d’ARN interférence, qui consiste à nourrir les cellules avec des bactéries produisant de l’ARN double-brin homologue au gène à inactiver. Nous testerons alors notre hypothèse centrale en séquençant le génome macronucléaire d’hybrides F1 inter-souches et inter-espèces, pour évaluer la fréquence des défauts d’excision d’IES polymorphes dans des gènes potentiellement essentiels.
Résumé de la soumission : Recent developments in epigenetics suggest the widespread use of small-RNA pathways as a genomic immune system allowing eukaryotes to control molecular parasites such as transposable elements (TEs). Small RNAs have also been shown to mediate non-Mendelian inheritance in divergent species, resurrecting the Lamarckian idea of inheritance of acquired traits. To understand the basic biological logic that may underlie the connection between these themes, and identify fundamental aspects despite the confounding diversity of mechanisms uncovered in different phyla, we propose to address this issue from a phylogenetically unique angle. The ciliate Paramecium tetraurelia – at an equal evolutionary distance from plants and animals – was one of the first organisms in which transgenerational epigenetic inheritance was clearly demonstrated, and recent molecular studies have shown that many cases can be explained by the role of a meiosis-specific class of small RNAs, the scnRNAs, in epigenetic regulation of the genome rearrangements that occur during the development of the somatic macronucleus (MAC) from the germline micronucleus (MIC), in each sexual generation.Rearrangements include the elimination of all TEs as well as the precise excision of ~45.000 single-copy Internal Eliminated Sequences (IESs), which are believed to be degenerate remnants of ancient TE insertions. MIC centromeres may also be eliminated since they are not active in the MAC, which divides by a non-mitotic mechanism. During meiosis, scnRNAs are produced from the entire MIC genome and mediate a genome-wide comparison of germline and somatic sequences, allowing the zygotic MAC to eliminate any germline sequence not present in the maternal MAC. The system has probably evolved as an efficient mechanism to detect any new TE insertion in the germline, and has further been co-opted to ensure the non-Mendelian inheritance of essential phenotypic polymorphisms, such as mating types. But the mechanism should also in principle make any new insertion potentially lethal if it is introduced by conjugation into a naive cell - an effect that is reminiscent of hybrid dysgenesis in Drosophila, the devastating effects of TEs introduced by the male gamete when the mother cannot produce homologous piRNAs to repress transposition.By comparing the IES content of paralogous gene pairs of different ages derived from 3 successive whole-genome duplications, we recently obtained evidence that a substantial fraction of IESs have been acquired since the last duplication. This is the time when the Paramecium ancestor underwent numerous speciation events, resulting in a group of 15 sibling species that are morphologically indistinguishable but sexually incompatible. This raises the possibility that the scnRNA-based mechanism for recognition and elimination of TEs, which decreases the burden on host fitness and allows them to persist in the genome and degenerate into single-copy IESs, has been a major force driving speciation.The main objectives of this project are to reconstruct the evolutionary history of IESs and other MIC specific sequences such as TEs and centromeres, and to experimentally test the hypothesis that polymorphisms in these elements result in sexual incompatibility. We propose to (i) sequence and assemble the entire MIC genome of P. tetraurelia, since very little is currently known about the diversity and copy number of TEs; (ii) explore further the scnRNA pathway mechanism, by testing the role of known protein factors in the recognition of the genome-wide set of ~45,000 IESs, by identifying new ones, and by deep-sequencing scnRNA populations during sexual events to describe their dynamics; (iii) identify IESs and centromeres in different strains and species to study their evolution; and (iv) experimentally determine the effects of IES polymorphisms (presence/absence, divergence of sequences) on genome rearrangements in sexual progeny of interstrain or interspecies crosses.
Résultats : L’ADN de micronoyaux de P . tetraurelia purifiés par le partenaire 2 a été séquencé et est en cours d’assemblage au Génoscope. Ceci constitue la phase pilote du projet France Génomique, qui nous permettra d’ajuster la méthodologie à employer pour les autres souches et espèces. En parallèle, nous avons commencé à séquencer l’ADN micronucléaire d’autres espèces, et à préparer des échantillons d’ADN macronucléaire de 2 souches par espèce, et d’hybrides F1 entre ces souches. Concernant les centromères, un premier essai de ChIPseq CenH3 a été réalisé et analysé; d’autres essais ont été prévus. Les mutants obtenus par nos cribles visant la voie des siRNA ou celle des scnRNA sont en cours d’identification et d’étude, ainsi que le rôle de facteurs candidats. Une étude plus ciblée du croisement entre les souches 32 et 51 de P. tetraurelia a montré que le phénomène de rétention d’une IES chez les hétérozygotes F1 dérivant du parent naïf peut être généralisé à au moins une autre IES, parmi les 7 IES présentes dans une souche mais absente dans l’autre. De la même manière que pour l’IES du gène mtB, la rétention est plus forte du côté naïf mais elle est également détectable de l’autre côté, ce qui ne peut s’expliquer par un défaut de scnRNA maternels. Nous faisons l’hypothèse que la nature hémizygote de ces séquences dans les F1 résulte en un autre problème affectant l’excision, possiblement apparenté au ‘Meiotic Silencing of Unpaired DNA’. Des résultats préliminaires suggèrent qu’il s’agit bien de deux effets distincts: l’inactivation de Ptiwi03, paralogue de fonction inconnue des protéines chargeant les scnARN, semble augmenter la rétention spécifiquement du côté naïf, suggérant qu’elle pourrait être impliquée dans l’échange de scnARN entre conjugants, tandis que celle de Dcl5, protéine putativement impliquée dans un mécanisme d’amplification de l’action des scnARN pendant le développement, augmente cette fréquence des deux côtés.
Perspectives : La validation de notre hypothèse centrale représenterait une avancée majeure: le mécanisme impliqué serait remarquablement similaire à la dysgenèse hybride observée chez la drosophile, et qui résulte de la nécessité de piRNA maternels pour contrôler les tranposons introduits par le gamète paternel. Il pourrait donc s’agir d’un mécanisme général contribuant à la spéciation chez de nombreux eucaryotes. Des résultats préliminaires suggèrent l’existence d’un phénomène distinct, dû à la nature hémizygote des séquences concernées plutôt qu’au défaut de petits ARN maternels, mais qui contribuerait de la même manière à la dysgenèse hybride. L’évidence préliminaire que de nouveaux facteurs semblent contrecarrer ces effets délétères suggèrent l’hypothèse très intéressante que les espèces du groupe P. aurelia se sont adaptées à ces difficultés, en inventant de nouveaux mécanismes, impliquant possiblement de nouvelles voies de petits ARN, qui permettent l’échange d’informations épigénétiques, et non pas seulement du génome mendélien, entre partenaires sexuels.
Publications et brevets : 1.	Singh, D.P., Saudemont, S., Guglielmi, G., Arnaiz, O., Goût, J.F., Prajer, M., Potekhin, A., Przybòs, E., Aubusson-Fleury, A., Bhullar, S., Bouhouche, K., Lhuillier-Akakpo, M., Tanty, V., Blugeon, C., Alberti, A., Labadie, K., Aury, J.M., Sperling, L., Duharcourt, S., Meyer, E. (2014) Genome-defence small RNAs exapted for epigenetic mating-type inheritance. Nature 509:447-452. Epub 2014 May 7. Selected by Faculty of 1000.
Cette étude de l’hérédité maternelle des types sexuels chez 3 espèces P. aurelia montre que si le type E est toujours déterminé par l’expression de la protéine transmembranaire mtA, les mécanismes développementaux produisant des clones de type O diffèrent : P. tetraurelia et P. octaurelia excisent le promoteur de mtA comme une IES, tandis que P. septaurelia excise des segments de séquence codante du gène mtB, qui code un facteur de transcription spécifiquement requis pour l’expression de mtA. Ce sont les premiers exemples de co-optation de la voie des scnRNAs et de la machinerie d’excision des IES pour la régulation de gènes cellulaires et l’hérédité épigénétique de polymorphismes phénotypiques essentiels.
2.	Marker, S., Carradec, Q. , Tanty, V., Arnaiz, O., and Meyer, E. (2014) A forward genetic screen reveals essential and non-essential RNAi factors in Paramecium tetraurelia. Nucleic Acids Res. 42:7268-7280. Epub 2014 May 23.
3.	Marmignon A, Bischerour J, Silve A, Fojcik C, Dubois E, et al. (2014) Ku-Mediated Coupling of DNA Cleavage and Repair during Programmed Genome Rearrangements in the Ciliate Paramecium tetraurelia. PLoS Genet 10(8): e1004552. doi:10.1371/journal.pgen.1004552. eCollection 2014 Aug.
4.	Lhuillier-Akakpo M*, Frapporti A*, Denby Wilkes C, Matelot M, Vervoort M, Sperling L, Duharcourt S. (2014). Local effect of Enhancer of Zeste-like reveals  cooperation of epigenetic and cis-acting determinants  for zygotic genome rearrangements. PLoS Genet. In press. (http://www.plosgenetics.org/doi/pgen.1004665)