Projet ANR-10-BLAN-1602 – Duplex-Omics : Exploration Globale des interactions ARN-ARN chez les bactéries
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur DANIEL GAUTHERET (UNIVERSITE DE PARIS XI [PARIS- SUD])
Partenaires : Université Paris-Sud; Université Paris-Sud
Montant : 417690.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Comprendre les interactions entre molécules d’ARN à l’échelle de la celluleLa cellule bactérienne est contrôlée par un ensemble complexe d’interactions entre ADN, ARN, protéines et petites molécules. Nous essayons ici de comprendre le rôle du partenaire ARN dans ce processus.
Modéliser le mécanisme de reconnaissance ARN-ARNContrairement à l’action des microARN eucaryotes, celle des ARN régulateurs bactériens (aussi appelés small RNA - sRNA) a été très peu étudiée en termes de conservation, de contraintes de reconnaissance ou de thermodynamique. Le jeu d’interactions sRNA-cible réellement démontrées reste extrêmement réduit et les programmes de prédiction de cibles utilisent des règles thermodynamiques obsolètes et ne tiennent pas compte de l’environnement moléculaire spécifique (chaperons, etc.). Ces programmes produisent un taux élevé d’erreurs lorsqu’on les applique aux ARN bactériens. Nous estimons que le manque de connaissance sur la structure et la dynamique des duplex ARN  limite notre capacité à comprendre les régulations par les ARN bactériens et, au-delà, le fonctionnement de la cellule dans son ensemble. C’est à cette question que nous allons répondre en apportant de nouveaux concepts et de nouvelles données.
Une approche alliant bioinformatique et séquençage de nouvelle générationAfin d’affiner notre compréhension des interactions ARN-ARN chez les bactéries, nous allons d’abord réaliser une analyse détaillée des relations sRNA-cibles et identifier les contraintes évolutives s’exerçant sur le sRNA et le mRNA. Nous développerons ensuite un nouveau protocole expérimental, sur la base de méthodes antérieures de capture par affinité, permettant de caractériser les limites exactes de la région duplex de plusieurs couples sRNA-cible de deux espèces modèles. Cette analyse se distingue de la plupart des efforts de détection actuels, qui se concentrent sur la caractérisation fonctionnelle des cibles. Ici, nous disséquerons le mécanisme d’interaction ARN-ARN. Enfin, nous utiliserons l’analyse de séquences pour étudier la structure des interactions et analyser l’impact des appariements de bases canoniques et non-canonique sur la reconnaissance des cibles.
Résumé de la soumission : Les génomes bactériens encodent plusieurs dizaines, voire des centaines de petits ARN non codant (small RNA ou sRNA) impliqués dans la régulation de l’expression d’autres gènes, principalement via des interactions ARN-ARN. Malgré leurs nombreuses fonctions cellulaires, les sRNA sont pratiquement absents des modèles actuels de réseaux de régulation bactériens. Une des principales raisons de cette carence est notre difficulté à prédire et à confirmer les véritables cibles des sRNA. Bien que ces interactions soient en principe faciles à prédire par complémentarité de séquence, elles restent largement inconnues. Contrairement aux interactions des microARN eucaryotes, les interactions impliquant les sRNA ont été très peu étudiées en termes de conservation, de contraintes d’appariement ou de thermodynamique, et n’ont pas été soumises à des cribles systématiques. Le jeu d’interactions sRNA-cible réellement démontrées reste extrêmement réduit. D'autre part, les programmes de prédiction de cibles utilisent des règles thermodynamiques qui n’ont pas été revues depuis plusieurs années et ne tiennent pas compte de l’environnement moléculaire spécifique (chaperons, etc.) des ARN bactériens et eucaryotes. Ils produisent un taux élevé de faux positifs et de prédictions non congruentes lorsqu’on les applique aux sRNA. Nous estimons que le manque de connaissance sur la structure et la dynamique des duplex ARN  limite notre capacité à comprendre les régulations par les ARN bactériens. C’est à cette question que nous allons répondre en apportant de nouvelles idées et de nouvelles données.  Afin d’affiner notre compréhension des interactions ARN-ARN chez les bactéries, nous allons d’abord réaliser une analyse détaillée des relations sRNA-cibles et identifier les contraintes évolutives s’exerçant sur le sRNA et le mRNA. Pour cet aspect du projet, nous nous appuierons sur notre expérience des profils phylogénétiques qui révèlent des ensembles de sRNA et mRNA en co-évolution. Parallèlement, nous développerons un nouveau protocole expérimental, sur la base de notre méthode antérieure de capture par affinité, permettant de caractériser les limites exactes de la région duplex de plusieurs couples sRNA-cible de deux espèces modèles. Cette analyse se distingue de la plupart des efforts de détection actuels, qui se concentrent sur la caractérisation fonctionnelle des cibles. Ici, nous disséquerons le mécanisme d’interaction ARN-ARN. Enfin, nous utiliserons l’analyse de séquences pour étudier la structure des interactions et analyser l’impact des appariements de bases canoniques et non-canonique sur la reconnaissance des cibles. Cela se fera en partie sur la base des données publiées sur certaines paires sRNA-cibles, et d’autre part sur les nouvelles données expérimentales générées par ce projet. Sur ces bases, nous établirons un jeu de « règles d’appariement » pour la reconnaissance sRNA-cibles que nous implémenterons dans un programme de prédiction. Le succès du projet Duplex-Omics devrait ouvrir la voie à d’importantes applications. Premièrement, le projet permettra de développer de nouveaux outils informatiques plus performants pour la prédiction des cibles des sRNA, et ces outils faciliteront à leur tour l’intégration des ARN non-codants dans les réseaux de régulation cellulaires. D’autres retombées significatives sont attendues, tels qu’un design amélioré d’ARN régulateurs synthétiques ou une meilleure compréhension des autres types d’interactions ARN-ARN (cis-régulation, ARN régulateurs eucaryotes, etc.). Nos développements expérimentaux doivent également permettre la mise au point d’une méthode permettant de détecter toutes les interactions ARN-ARN dans une cellule en une seule expérience de deep sequencing, ce qui serait un progrès considérable pour la biologie systémique des bactéries.
Résultats : A mi-parcours, le projet Duplex-Omics a permis de faire progresser significativement les méthodes de détection des ARN régulateurs bactériens.  
Les deux laboratoires participants ont développé des méthodes bioinformatiques et expérimentales de prédiction des couples sRNA-cible qui devraient permettre d’éclairer de manière beaucoup plus détaillées les réseaux de régulation géniques bactériens.
Perspectives : Le projet permettra de développer de nouveaux outils informatiques plus performants pour la prédiction des cibles des sRNA, et ces outils faciliteront à leur tour l’intégration des ARN non-codants dans les réseaux de régulation cellulaires. D’autres retombées significatives sont attendues, tels qu’un design amélioré d’ARN régulateurs synthétiques ou une meilleure compréhension des autres types d’interactions ARN-ARN (cis-régulation, ARN régulateurs eucaryotes, etc.). Nos développements expérimentaux doivent également permettre la mise au point d’une méthode permettant de détecter toutes les interactions ARN-ARN dans une cellule en une seule expérience de séquençage, ce qui serait un progrès considérable pour la biologie systémique des bactéries.
Publications et brevets : Trois articles scientifiques ont été produits (1-3) concernant la découverte de nouveaux ARN régulateurs dans les bactéries. Un article a été publié (4) sur l’effet de l’environnement (protéine chaperone) sur la régulation par les petits ARN.
1.	Ott A, et al. NAPP: the Nucleic Acid Phylogenetic Profile Database. Nucleic Acids Res. 2012, 40:D205-9.
2.	Felden B et al. The Staphylococcus aureus RNome and its commitment to virulence. PLoS Pathog. 2011 Mar;7(3):e1002006.
3.	Toffano-Nioche C et al. Transcriptomic profiling of the oyster pathogen Vibrio splendidus opens a window on the dynamics of the small RNA repertoire in the Vibrio genus. (article en revision).
4.	Rochat T et al. Lack of interchangeability of Hfq-like proteins. Biochimie. 2012, 94:1554-9.