Projet ANR-08-JCJC-0046 – NuDSB : Impact de l'organisation du noyau sur la réparation de l'ADN et la stabilité du génome
Programme : Jeunes chercheuses et jeunes chercheurs (JCJC) 2008
Année de financement : 2008
Coordinateur du projet : COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE - DIRECTION DU CENTRE DE FONTENAY-AUX-ROSES (COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE - DIRECTION DU CENTRE DE FONTENAY-AUX-ROSES)
Partenaires : Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
Montant : 174845.0 euros
Date de début : 2009
Durée : 36 mois
Résumé : 1. Contexte scientifique Le génome des cellules eucaryotes est organisé en domaines chromatiniens occupant des positions particulières dans le noyau. Diverses études ont révélé l'importance de la compartimentation du noyau dans la régulation de la transcription, de la réplication et plus récemment pour la stabilité du génome. L'intégrité du génome est constamment remise en cause par la formation de cassures double brin (CDB). En réponse à cette menace les cellules activent les points de contrôle du cycle cellulaire (checkpoint) et les voies de réparation. Jusqu'à présent, la plupart des études concernant la signalisation et la réparation des cassures double brin ont été réalisée sur des population de cellules asynchrones. Bien qu'elles aient permit de définir les grandes lignes des voies d'activation des checkpoints et de réparation, ces études ne permettent pas de préciser la cinétique de événements se produisant à l'échelle d'une cellule. De plus l'importance de l'organisation nucléaire pour la détection, la signalisation et la réparation des cassures double brin n'a pas été abordée. Nous proposons définir la dynamique et la position d'une CDB au sein du noyau au cours de l'activation des checkpoints et de la réparation de déterminer les conséquences fonctionnelles d'une localisation intranucléaire particulière sur ces deux événements chez S. cerevisiae par des approches de microscopie avancée in vivo. 2. Système expérimental De manière a suivre la dynamique et la position d'une CDB dans le noyau, nous avons développé une souche dans laquelle nous pouvons induire une CDB de façon contrôlée à des loci marqués par le système lacOp/GFP-LacI et visualiser l'enveloppe nucléaire marquée par la protéine Nup49-GFP. En utilisant ce système nous avons put montrer qu'une CDB irréparable induite par l'endonuclease HO au locus MAT se relocalise à la périphérie du noyau. Cette relocalisation se produit tout au long du cycle cellulaire et dépend de la PI3 kinase Mec1ATM. La localisation périnucléaire de la CDB nécessite l'activité kinase de Mec1 mais pas l'activation complète des checkpoints suggèrant qu'une protéine liée à la CDB et modifiée par Mec1 est impliquée dans l'ancrage de la CDB à la périphérie. Le but de ce projet et d'élucider les mécanismes conduisant à cette relocalisation et de déterminer son importance pour l'activation des checkpoints, la réparation de l'ADN et la stabilité du génome. Pour cela nous aborderons trois questions : -Quels évènements, activation des checkpoints ou réparation de l'ADN se produisent au moment de la relocalisation ? -Quelles protéines permettent l'ancrage de la CDB à la périphérie ? -Quelles est la conséquence fonctionnelle de la localisation d'une CDB dans le noyau ? 3. Résultats attendus Tache 1. Quels évènements, activation des checkpoints ou réparation de l'ADN, se produisent au moment de la relocalisation ? Pour déterminer les protéines liées à la CDB et les évènements se produisant au moment de la relocalisation, nous suivrons la position de la CDB concomitamment i, au recrutement des protéines de checkpoint ou de réparation ; ii, à la recombinaison ; iii à l'activation des checkpoints. Ceci nous permettra de définir les protéines potentiellement impliquées et le rôle de l'ancrage des CDB à la périphérie du noyau. Tache 2. Quelles protéines permettent l'ancrage de la CDB à la périphérie ? Pour définir les protéines impliquées dans l'ancrage de la CDB à la périphérie nous analyserons la localisation des CDB dans des mutants affectant les protéines liées au moment de la relocalisation. Nous testerons aussi des mutants affectant des protéines associées à l'enveloppe nucléaire. Nous déterminerons si ces protéines sont suffisantes pour ancrer un locus chromosomique à la périphérie nucléaire en utilisant un test dédié. Tache 3. Quelles est la conséquence fonctionnelle de la localisation d'une CDB dans le noyau ? Finalement nous testerons la conséquence fonctionnelle de la position dans le noyau s