Projet ANR-10-BLAN-1236 – MARCHxIRAP : Rôle de l’ubiquitination dans la régulation du trafic intracellulaire des molécules de classe I du CMH et la présentation croisée
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Evelina Gatti (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE - DELEGATION PACA)
Partenaires : Institut national de la santé et de la recherche médicale; Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 380000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : MARCHXIRAPRôle de l’ubiquitination dans la régulation du trafic intracellulaire des molécules de CMH I et la présentation croisée
Role de MARCH 9 dans la présentation antigéniquePour obtenir une réponse immunitaire efficace et induire des cellules T CD8 + effectrices, un amorçage par les cellules dendritiques (DCs) est nécessaire. Dans le cas des agents pathogènes qui n’infectent pas directement les DCs, une voie de présentation alternative appelée «présentation croisée» est requise pour internaliser les antigènes exogènes circulant et permettre leur présentation par les molécules de CMH I. Bien qu'une grande attention ait été accordée aux mécanismes cellulaires régissant la rencontre entre la machinerie de chargement des CMH I et les antigènes internalisés, peu d'informations sont disponibles sur le contrôle du transport des molécules de CMH I elles même vers les compartiments d'endocytose. L'équipe 1 a récemment caractérisé une nouvelle famille de ligases E3 de l’ubiquitine, appelés MARCH (pour Membrane-Associated RING-CH) et leurs rôles dans la régulation du transport intracellulaire du CMH dans les DCs. En particulier, l'équipe 1 a démontré le rôle de la ligase MARCH 9 dans une nouvelle voie de transport permettant aux molécules de CMH I de rejoindre un sous-type d’endosome contenant la syntaxine 6. L'équipe 2 a démontré que dans les DCs, l'aminopeptidase régulée par l’insuline (IRAP) est localisée dans un compartiment endosomal, qui contient la petite GTPase Rab 14 et la syntaxine 6. De plus, IRAP a été démontré par l’équipe de 2, comme étant nécessaire à la présentation croisée. Les deux équipes proposent d'associer leurs expertises pour étudier la coordination spatio-temporelle de la présentation croisée et comprendre comment les DCs régulent le transport intracellulaire du CMH I en réponse aux stimuli microbiens.
Existence d'une régulation de la fonction de IRAP and du CMH I par MARCH 9La présentation croisée  est nécessaire pour permettre aux antigènes (Ag) extracellulaires d’accéder la machinerie de chargement de molécules de CMH I. La présentation croisée dépend fortement de la dynamique des organelles endocytiques et sa régulation est directement liée à la plasticité du trafic intracellulaire en réponse à la détection des pathogènes. Bien que le mécanisme de chargement des CMH I avec les Ag internalisés ait été longuement étudiés, nous ne connaissons pas encore les détails du transport des molécules des MHC I vers les endosomes et sur l’apprêtement des peptides antigéniques dans ces compartiments. Notre objectif est d’identifier des nouveaux mécanismes moléculaires qui régulent le transport du CMH I dans différents systèmes expérimentaux. Nous proposons que l'ubiquitination des molécules du CMH I, médiée par l’ubiquitin-ligase MARCH IX, soit responsable du co-adressage des molécules de CMH I et IRAP dans un sous-ensemble spécialisé d’endosomes où la présentation croisée se produit. Notre travail se concentrera sur les conséquences immunologiques de ce mécanisme de régulation dans les cellules humaines. Il est organisé en cinq tâches principales : 1)Coordination du projet 2) Ubiquitination du CMH I et le IRAP et régulation par MARCH IX. 3) Rôle de MARCH IX dans le transport, localisation et fonction de CMH I et IRAP. 4) Pertinence physiologique de l'ubiquitination et de MARCH IX pour la présentation croisée. 5) Rôle d’ IRAP et MARCH IX dans la présentation croisée d’Ag internalisés par les récepteurs de phagocytose. Nous étudierons ce mécanisme dans le système humain grâce aux MoDCs qui se prêtent davantage à la manipulation (par exemple en utilisant l'RNAi), ainsi que grâce à des souris MARCH IX knock-out.
Résumé de la soumission : Les lymphocytes T CD8 + scannent le répertoire de peptides présentés par les molécules de CMH de classe I (CMH I) à la surface des cellules et détectent l'expression de gènes étrangers ou anormaux pour éliminer les cellules tumorales ou infectées par des virus. Cette voie de présentation antigénique permet de charger les molécules du CMH I avec des milliers de peptides endogènes différents. Cet objectif est atteint par la fusion de deux voies distinctes de transport intracellulaire: l'une dédiée à la génération de formes de  CMH I capable d’accommoder les peptides dans le réticulum endoplasmique (RE) et une autre spécialisée dans la génération de ces peptides antigéniques dans le cytoplasme. Ces deux voies fusionnent, lors du transfert des peptides cytoplasmiques vers la lumière du RE par les transporteurs liés au traitement des antigènes (TAP), qui interagissent aussi avec les molécules du CMH I vides. La dégradation des antigènes est en général effectuée par le protéasome dans le cytosol, mais nécessite aussi fréquemment une protéolyse complémentaire de leurs extrémités N-terminale, qui est-elle entreprise par les aminopeptidases residents du RE (ERAP).Pour obtenir une réponse immunitaire efficace et induire des cellules T CD8 + effectrices, un amorçage par les cellules dendritiques (DCs) est nécessaire. Dans le cas des agents pathogènes qui n’infectent pas directement les DCs ou pour les déterminants moléculaires non-exprimés par ces cellules, une voie de présentation alternative appelée « présentation croisée» est requise pour internaliser les antigènes exogènes circulant et permettre leur présentation par les molécules de CMH I. La présentation croisée dépend fortement de la dynamique des endosomes et de sa régulation qui est liée directement à la plasticité du trafic intracellulaire en réponse à la détection des pathogènes. Bien qu'une grande attention ait été accordée aux mécanismes cellulaires régissant la rencontre entre la machinerie de chargement des CMH I et les antigènes internalisés, peu d'informations sont disponibles sur le contrôle du transport des molécules de CMH I elles même vers les compartiments d'endocytose. L'équipe 1 a récemment caractérisé une nouvelle famille de ligases E3 de l’ubiquitine, appelés MARCH (pour Membrane-Associated RING-CH) et leurs rôles dans la régulation du transport intracellulaire du CMH dans les DCs humaines. En particulier, L'équipe 1 a démontré le rôle de la ligase MARCH IX dans une nouvelle voie de transport permettant aux molécules de CMH I de rejoindre la surface cellulaire, en transitant par un sous-type d’endosome contenant la molécule d’adressage syntaxine 6. En parallèle, L'équipe 2 a démontré que dans les DCs, l'aminopeptidase régulée par l’insuline (IRAP) est localisée dans un compartiment endosomal, que l’on peut qualifier de spécialisé pour la présentation croisée et qui contient à la fois la petite GTPase Rab 14 et la syntaxine 6. De plus, IRAP interagit avec les molécules du CMH I et a été démontré par l’équipe de 2, comme étant nécessaire à la présentation croisée. Les deux équipes proposent d'associer leurs expertises pour étudier la coordination spatio-temporelle de la présentation croisée et comprendre comment les DCs régulent le transport intracellulaire du CMH I en réponse aux stimuli microbiens. Le rôle de l'ubiquitination et des ligases MARCH dans la rencontre des molécules du CMH I et d’IRAP permettant ainsi le chargement des peptides exogènes sera au centre du projet. Notre objectif principal sera de démontrer l'existence d'une voie de présentation croisée dépendante de MARCH IX, qui pourrait contrôler l'entrée des complexes nouvellement synthétisés de CMH I et d’IRAP dans un sous-type specialisé d’endosome, dont la nature devra être déterminée précisément. Une combinaison d’approches de biologie cellulaire et d’immunologie sera ainsi utilisée pour disséquer cette nouvelle étape de la présentation antigénique restreinte par le CMH I dans les DCs.
Résultats : Les cellules inactivées pour MARCH 9 montrent une répartition anormale et de transport des molécules du  CMH I avec une accumulation dans le réseau Trans-Golgien et un accès réduit aux endosomes positifs pour la Syntaxin 6. Lors de la co-transfection de MARCH9 et de IRAP dans les cellules HeLa, une co-localisation des ces deux molécules avec le CMH I a été observé dans ces vésicules d'endocytose. MARCH9 favorise donc la rencontre entre IRAP et du CMH I dans les endosomes et potentiellement pourrait favoriser la présentation antigénique croisée. Des expériences d’immunoprécipitation ont montré que l'interaction de IRAP et de CMH I est perturbée par MARCH 9, dont la surexpression abolit la co-immunoprécipitation de ces 2 molécules. Nous avons traité avec de la rapamycine des MODCs afin d'explorer davantage le rôle de l'IRS-2 dans l'organisation des voies de transport spécialisées vers les endosomes. Nos observations suggèrent qu'en effet, l'inhibition de mTOR modifie la répartition d’IRAP dans ces cellules. Nous sommes en train de caractériser les détails de cette réorganisation, qui est en accord avec nos récentes observations sur la capacité de la cytokine IL-4 à augmenter la dynamique des endosomes tardifs et augmenter le flux autophagique, ce qui conduit à une réorganisation des structures des membranes endosomales et à la modification de la capacité de présentation de l'antigène des cellules traitées. Nous avons besoin maintenant d'explorer fonctionnellement les conséquences de ces transformations majeures.
Perspectives : Nous planifions de continuer le projet comme prévu avec une focalisation sur les conséquences physiologiques de la délétion de  MARCH 9 sur la cross présentation en utilisant différents essais de présentation au cellules T à la fois chez la souris et l'homme.
Publications et brevets : Revues à comité de lecture	
1.	TLR-dependent regulation of MHC transport is orchestrated by MARCH E3 ligase-dependent ubiquitination in antigen presenting cells. Gatti E.  Molecular Immunology (2012) 51, 1.
2.	De Gassart A., De Angelis-Rigotti F., Pierre P. and Gatti E. Molecular Biology of the Cell (2012) 22S 
Ouvrages ou chapitres d’ouvrage	
1.	 MHC ubiquitination. De Gassart A., De Angelis Rigotti F., and Gatti E. “Methods in Antigen Processing and Presentation approaches” in Methods in Molecular Biology (2012) in press.
Communications (conférence)	1.	Workshop on immunobiology of  dendritic cells Cargèse, France - October 19- 22, 2011 - Ubiquitination and MARCH E3 ubiquitin ligases regulate the intracellular trafic of antigen presenting MHC molécules. Oral presentation.
2.	Institut Curie, Paris, France - May 4th, 2011. Antigen présentation and ubiquitination. Invited talk