Projet ANR-10-JCJC-1604 – ESSOR : Contrôle épigénétique par des petits ARN ovariens
Programme : JCJC : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (JCJC SVSE 6)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Séverine CHAMBEYRON (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
Partenaires : Institut de Génétique Humaine
Montant : 213761.0 euros
Date de début : 2010
Durée : 36 mois
Résumé : Les petits ARN non codants : garde-fou de l’intégrité du génome.Le maintien de l’intégrité du génome est essentiel pour l’identité cellulaire. Comprendre le rôle et la biogenèse des piRNA dans la répression des éléments transposables, séquences d'ADN capables de se multiplier et de se déplacer aléatoirement et de manière autonome dans le génome, est donc primordial.
Caractérisation de la biogénèse et du mode d’action des piRNA,  une classe de petits ARN non codants.Les éléments transposables sont des séquences d'ADN capables de se multiplier et de se déplacer aléatoirement et de manière autonome dans le génome. En s'insérant au hasard, ils peuvent interférer avec le contrôle de l'expression des gènes de la cellule et provoquer des dérégulations cellulaires importantes. Ils sont maintenus sous silence dans les cellules germinales par des petits ARN non codants (ne déterminant pas des protéines), les piRNA (Piwi interacting-RNA). Ils sont décrits comme intervenant dans la répression des éléments transposables en induisant la dégradation de leurs ARN messagers. Notre projet a pour objectif de caractériser la biogénèse et le mode d’action de cette nouvelle classe de petits ARN non codants dans les tissus ovariens de drosophile, l’un des modèles d’étude le plus pertinent actuellement.  Nous souhaitons étudier les mécanismes impliqués dans la coupure du grand transcrit précurseurs des piRNA. Pour cela nous avons développé deux approches basées sur l’implication d’un gène candidat, drosha, et des croisements génétiques. Nous souhaitons aussi comprendre pourquoi et comment une femelle de drosophile qui vieillit confère à sa descendance une meilleure capacité à lutter contre l’invasion de son génome par les éléments mobiles. Nous voulons étudier l’implication des piRNA dans cette transmission épigénétique qui ne semble pas être codée par la chromatine (structure de l’ADN).
Séquençage des populations de petits ARN non codants et croisements génétiques.Notre projet s’appuie principalement sur des croisements génétiques et sur des techniques de séquençage à haut débit de populations de petits ARN non codants. Durant les six premiers mois du projet, nous avons acquis l’expertise pour extraire les populations de petits ARN non codants des tissus ovariens et des embryons de drosophile. Nous avons aussi appris à traiter les données de séquençage et sommes devenus autonomes en ce qui concerne les analyses de ce type de données.
Résumé de la soumission : Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes de contrôle des éléments transposables (ET), fondamentaux pour le maintien de l’intégrité des génomes. Ils font intervenir une classe de petits ARN, les piRNA (« Piwi-interacting RNA »). La voie de silencing associée aux piRNA est très largement inconnue, et le présent projet propose d'en caractériser les étapes essentielles dans l’ovaire de drosophile. Les piRNA sont des éléments clés d’une sorte de système immunitaire à deux composantes: une composante génétique codée par des loci hétérochromatiques contenant des copies défectives d'ET ("piRNA clusters") produisant des piRNA antisens, et une composante adaptative correspondant aux piRNA produits par les copies fonctionnelles des ET localisées dans l'euchromatine, selon le modèle suivant: des piRNA antisens primaires, produits par un mécanisme inconnu à partir des piRNA clusters, ciblent les transcrits des ET fonctionnels qui sont clivés pour produire les piRNA sens; ces derniers guident le complexe de silencing vers les transcrits des piRNA clusters qui sont clivés pour produire des piRNA antisens secondaires. Nos résultats montrent l'existence très vraisemblable de cette boucle d'amplification dans la lignée germinale femelle, et que cette amplification n’existe pas dans les cellules somatiques de l’ovaire où seuls les piRNA primaires sont présents. En se basant sur nos connaissances portant sur le contrôle de deux ET, l'élément I dans le germen et gypsy dans le soma, nous éluciderons la biogenèse des piRNA primaires, le mode d’action des piRNA dans la répression des ET, et les mécanismes épigénétiques de transmission héréditaire de ce mode de silencing.Nous étudierons la biogenèse des piRNA primaires dans le tissu somatique de l’ovaire, vraisemblablement produits à partir d’un grand transcrit hétérochromatique antisens. Nous déterminerons si l’endonucléase Drosha, impliquée dans la production des miRNA, est responsable de la maturation de ces grands transcrits en piRNA, en utilisant notamment des mutants dominants négatifs que nous avons déjà obtenus. Nous étudierons aussi le rôle des siRNA des ET dans le processing des précurseurs de piRNA. Nous testerons la possibilité que les piRNA réduisent la production des siRNA en réprimant l'expression d'ARN double-brin par les ET. Cette étude nous permettra de mettre en évidence l’existence d’un éventuel mécanisme de dialogue entre les siRNA et les piRNA permettant de maintenir une efficacité optimale de répression des ET. Le niveau de répression de l’élément I dans la lignée germinale femelle dépend de l’âge, varie en fonction de facteurs environnementaux comme la température, et est transmis maternellement de génération en génération. Les mécanismes moléculaires de cette transmission épigénétique restent inconnus et les piRNA (dont certains sont déposés par la mère dans l'embryon) peuvent être des facteurs épigénetiques maternellement transmis. Nous caractériserons quantitativement et qualitativement les populations de piRNA déposées maternellement dans l’embryon, par séquençage à haut débit des petits ARN présents dans les ovaires et déposés dans les embryons, en utilisant des souches isogéniques ne différant que par leur capacité à réprimer l’élément I. Nous déterminerons si ces souches diffèrent aussi par la présence de marques épigénétiques présentes sur la chromatine au niveau des piRNA clusters. Afin de déterminer le rôle des piRNA déposés maternellement, nous tenterons de modifier le niveau de répression de l'élément I en micro-injectant des embryons avec des piRNA identifiés par les séquençages réalisés précédemment. Si un effet est observé, nous regarderons s’il est aussi associé à  des modifications de marques chromatiniennes.Ce projet permettra de comprendre les mécanismes responsables du maintien de l’intégrité des génomes déterminés par les piRNA, ainsi que la nature des mécanismes épigénétiques de caractères transmis maternellement au cours des générations.
Résultats : Toutes les tâches du projet ont commencé et se déroulent dans une fourchette de temps qui permet d’envisager que le projet soit délivré en temps et en heure. De plus, l’une des tâches que nous avons proposée a déjà porté ses fruits puisqu’un article concernant le rôle des piRNA dans la transmission de caractères acquis, fait l’objet d’une publication dans la revue scientifique Genome Research ayant un facteur d’impact de 13,5. Ce travail démontre que les petits ARN non codants peuvent être transmis de la mère à sa fille et peuvent influencer la régulation des éléments transposables dans la descendance. En d’autres termes, les marques épigénétiques ne sont pas seulement portées par la chromatine mais peuvent aussi être véhiculées au travers des générations par des petits ARN non codants.
Perspectives : Le rôle joué par les petits ARN non codants semble sous-estimé chez les eucaryotes pluricellulaires si l'on se base sur les données fondamentales obtenues chez les plantes et la levure. Nous souhaitons montrer que les piRNA ont un rôle crucial pour le maintien de l’intégrité des génomes. L’étude de leur biogénèse et leur mode d’action pourrait nous permettre de comprendre pourquoi dans certains cancers, comme le cancer du colon, du col de l’utérus et de l’intestin,  les protéines qui chargent ces petits ARN non codants se trouvent à nouveau exprimées comme dans les populations de cellules non différenciées.
Nos travaux ouvrent également de nouvelles perspectives dans le domaine de l’épigénétique car ils montrent que l’information épigénétique n’est pas seulement la résultante de marques sur la chromatine mais peut aussi être véhiculée par des petits ARN non codants.
Publications et brevets : Grentzinger T, Armenise C, Brun C, Mugat B, Serrano V, Pelisson P, Chambeyron S. (2012)
piRNA-mediated transgenerational inheritance of an acquired trait.  Genome Research May 3. [Epub ahead of print].
Cet article montre pour la première fois que des petits ARN non codants peuvent transmettre des informations d’une mère à sa fille qui auront une importance majeure sur la régulation des éléments mobiles à travers les générations.