Projet ANR-10-BLAN-1216 – MOLADCEL : Bases moléculaires et évolutives des fonctions d’adhésion cellulaire des alpha/beta-hydrolases non-catalytiques
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Biologie cellulaire, développement (Blanc SVSE 2)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Pascale MARCHOT (UNIVERSITE AIX-MARSEILLE II  [DE LA MEDITERRANEE])
Partenaires : DCC INRA INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - CENTRE DE MONTPELLIER; Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques; Centre de Recherche en Neurobiologie - Neurophysiologie de Marseille
Montant : 527941.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Des molécules d’adhésion cellulaire qui ressemblent à des enzymes.Comprendre pourquoi certaines macromolécules qui ressemblent à des enzymes de la famille des alpha/beta-hydrolases sont des molécules d’adhésion cellulaire, et comment elles fonctionnent. Utiliser ces informations pour prédire la fonction (enzyme ou adhésion?) de nouveaux membres de la famille.
Trouver et caractériser de nouvelles protéines d’adhésion cellulaire de type alpha/beta-hydrolase.Nos travaux antérieurs ont porté sur (i) la définition de la superfamille des protéines organisées selon une structure 3D de type alpha/beta-hydrolase, et les relations évolutives de ces protéines à l’intérieur de la base de données ESTHER, (ii) la caractérisation structurale et fonctionnelle de deux membres distincts de cette famille, l’enzyme acétylcholinestérase et la molécule d’adhésion cellulaire neuroligine. Notre nouvel objectif est de caractériser les autres molécules d’adhésion connues de cette famille, en définir les relations structure-fonction, et trouver et caractériser d’autres molécules apparentées. La fabrication de formes artificielles des molécules déjà connues et de celles que nous identifierons nous permettra de rechercher et identifier/caractériser leurs partenaires d’adhésion cellulaire via une combinaison de méthodes complémentaires. Cette démarche permettra de comprendre pourquoi certaines macromolécules qui ressemblent à des enzymes sont des molécules d’adhésion cellulaire, et comment elles fonctionnent. Elle conduira également à rassembler de nouvelles informations que la base de données ESTHER pourra exploiter pour tenter de prédire une fonction d’enzyme ou d’adhésion cellulaire à de nouvelles protéines de type alpha/beta-hydrolase de fonction encore non caractérisée.
Des approches complémentaires associant ordinateurs (bioinformatique), tubes à essai (biochimie) et rayons X (biophysique).Les principales étapes de ce projet sont de:1- Fabriquer des formes artificielles mais biologiquement représentatives des molécules d’adhésion cellulaire déjà connues (et du partenaire connu de l’une d’elles) pour en déterminer les structures biophysiques (3D) et en déduire des relations structure-fonction,2- Utiliser ces molécules d’adhésion artificielles comme hameçon pour pécher leur partenaire naturel inconnu dans des préparations biologiques sélectionnées,3- Améliorer le contenu et les outils bioinformatiques que la base de données ESTHER propose pour analyser et classifier les fonctions d’enzyme et d’adhésion cellulaire des alpha/beta-hydrolases,4- Confronter les informations biologiques, biophysiques et bioinformatiques rassemblées pour prédire la fonction (enzyme ou adhésion cellulaire?) de nouvelles alpha/beta-hydrolases,5- Fabriquer des formes artificielles/représentatives de ces nouvelles protéines et les analyser aux plans structural et fonctionnel pour confirmer/infirmer nos hypothèses.(Ordre non contractuel.)
Résumé de la soumission : Les membres de la famille des protéines d’adhésion neuronales connues sous le nom de “molécules d’adhésion cellulaire de type cholinesterase (ChE)” partagent un domaine fonctionnel extracellulaire structuralement apparenté au domaine catalytique des ChEs. Une collaboration de long terme entre les partenaires 1 et 2 du présent programme a conduit à documenter en détails les bases et déterminants structuraux responsables des fonctions et dysfonctions des ChEs et, plus récemment, ceux responsables de la reconnaissance des neurexines pour les molécules de type ChE, les neuroligines. Une collaboration occasionnelle entre les partenaires 3 et 1 du présent programme avait permis la mise a jour de la base de données ESTHER, dédiée à la collecte et l’annotation de toutes les données disponibles concernant les membres de la famille des protéines repliées selon un motif de type alpha/beta-hydrolase, representées par les ChEs.Notre nouvel objectif est d’étudier d’autres molécules de type ChE, seules et en complexes avec leurs partenaires physiologiques. Le developement du système nerveux est une operation complexe qui requiert des événements d’adhésion cellulaire et de guidage axonal. En plus de la caractérisation structurale de ces protéines et du complexe de l’une d’entre elles avec l’unique partenaire actuellement identifié, la disponibilité de formes recombinantes solubles des ces molécules de type ChE nous permettra de traquer et identifier/caractériser les partenaires encore inconnus via des stratégies de ligand-fishing et protéomique, ou d’autres stratégies si cela est préférable ou requis. Cette démarche conduira à la caractérisation fonctionnelle et structurale de plusieurs complexes diversifiés entre une molécule d’adhésion cellulaire de type ChE et son partenaire spécifique. Cela conduira également à la mise à disposition de nouvelles informations que la database ESTHER pourra exploiter pour annoter les déterminants structuraux des fonctions d’adhésion et pour prédire l’association de nouvelles fonctions d’adhésion cellulaire ou fonctions duales à la famille structurale des alpha/beta-hydrolases. Le réseau et la réciprocité entre les approches de neurobiologie structurale et bioinformatique constitue un avantage certain pour chacune des équipes individuelles impliquées dans ce projet ainsi que pour l’ensemble du projet lui-même.
Résultats : Des formes recombinantes de 2 des 3 molécules d’adhésion cellulaire ciblées par ce projet et du partenaire connu de l’une d’entre elles ont été générées dans des cellules eucaryotes. Les paramètres cinétiques de la formation du complexe « 1e molécule d’adhésion-partenaire connu » ont été déterminés, ils sont en accord avec une fonction d’adhésion; des modèles 3D théoriques de ces molécules ont été générés; les expériences visant à déterminer la structure 3D de chacun des partenaires et du complexe sont en cours. La 2ème molécule d’adhésion est sur le point de servir d’hameçon pour pêcher son/ses partenaires non connus à partir de préparations de tissus biologiques sélectionnés. En vue d’une stratégie similaire nous tentons de produire la 3ème molécule d’adhésion, encore réfractaire.  La base de donnée ESTHER a été mise à jour (« fond ») et améliorée (« forme » et nouveaux outils); le serveur en version beta est disponible en test progressif depuis juillet 2011 et sera mis en service en août 2012. Les outils mis en place permettent de définir de nouvelles cibles pour une approche structurale de familles encore peu connues et/ou dont les membres sont susceptibles de porter de nouvelles fonctions ou des fonctions doubles. Un premier examen a pointé sur des séquences d’alpha/beta-hydrolases susceptibles d’être de nouvelles molécules d’adhésion. Trois candidats d’origine eucaryote et procaryote ont été sélectionnés et soumis à des essais d’expression dans la bactérie.
Perspectives : L’ensemble des informations que nous espérons réunir documenteront les mécanismes moléculaires par lesquels le motif structural « alpha/beta-hydrolase », un motif ancien porteur d’une activité enzymatique bien caractérisée, a pu évoluer vers une activité de reconnaissance de partenaire protéique, et d’adhésion cellulaire. Cela nous permettra de comprendre comment et pourquoi certaines alpha/beta-hydrolases portent deux types d’activités, ou ont perdu la première alors que la seconde n’a pas été décelée. Cela nous permettra enfin de (tenter de) prédire la fonction (enzyme ou adhésion?) de nouveaux membres de la famille (ce qui restera à être démontré expérimentalement).
Publications et brevets : - Publication en février 2012 d’un numéro spécial de la revue Protein Pept Lett, édité et alimenté par les partenaires de ce projet et comprenant 8 chapitres sur les alpha/beta-hydrolases (http://www.benthamscience.com/contents-JCode-PPL-Vol-00000019-Iss-00000002.htm).
- Une présentation orale et une présentation affichée lors d’un congrès international (http://www.11che.ru/home.html).
- Un article original soumis en juillet 2012 pour publication dans Chem Biol Interact.
- Un article original en préparation, à soumettre en sept 2012 pour publication dans Nucleic Acids Res, Database Issue 2013.