Projet ANR-10-BLAN-1415 – Opto-Rhythms : Manipulation optogénétique des rythmes neuroendocrines
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes :  Neurosciences (Blanc SVSE 4)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Monsieur Patrice Mollard (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; MRC Medical Research Council; UH University Hamburg
Montant : 481237.0 euros
Durée : 48 mois
Résumé : Manipulation optogénétique des rhythmes neuroendocrinesDans les organismes supérieurs, la sécrétion coordonnée des hormones hypophysaires est essentielle pour la régulation de fonctions de base. Les sécrétions hypophysaires sont principalement sous le contrôle des neurones hypothalamiques hypophysiotropes qui libèrent leurs facteurs dans les vaisseaux porte au niveau de l’éminence médiane.Cependant, nous n’avons encore que peu d’information sur les rythmes d’activité neuronale hypothalamique qui contrôlent ces sécrétions hormonales.
ObjectifsA notre connaissance, ce projet fournira la première base de compréhension des mécanismes d'intégration des signaux hypothalamiques par les réseaux de cellules GH et PRL et de leur mode de libération d'hormones dans le sang
application des outils optogénétiquesDéveloppement d'une approche Cre-Lox pour contrôler l'activité cellulaire via l'expression ciblée d'opsinesDans ce but, des souris Cre (DAT ou GHRH) sont croisées avec des souris R26 floxées pour la ChR2 et des pulses de lumière bleue peuvent déclencher des activités électriques à plus de 25Hz dans des neurones enregistrés en patch-clamp. Des contrôles optiques des neurones TIDA/GHRH sont réalisés in vivo via des fibres optiques de 200um implantées dans le 3ème ventricule près de l'éminence médiane tandis des micro-aliquots de sang sont collectés à la veine de la queue pour être dosés par des kits Elisas pour mPRL ou mGH.
Résumé de la soumission : Dans les organismes supérieurs, la sécrétion coordonnée des hormones hypophysaires est essentielle pour la régulation de fonctions de base comme la croissance corporelle, la reproduction et la lactation. Les sécrétions hypophysaires sont principalement sous le contrôle de neurones hypothalamiques hypophysiotropes qui libèrent leurs facteurs dans les vaisseaux porte au niveau de l’éminence médiane. Des défauts de niveaux et de rythmicité de sécrétion de ces hormones sont la signature de nombreux problèmes de santé publique (nanisme, infertilité, désordres métaboliques…). Cependant, nous n’avons encore que peu d’information sur les rythmes d’activité neuronale hypothalamique qui contrôlent ces sécrétions hormonales. De même, l’hypophyse est une énigme en ce qui concerne comment les cellules endocrines perçoivent et répondent in vivo aux stimuli hypothalamiques et également comment ces hormones sécrétées sont collectées par la microcirculation hypophysaire.Durant le précédent projet Pit-Net (ANR-blanc), nos groupes de Montpellier et de Londres ont changé la perception de l’organisation fonctionnelle des cellules GH et PRL dans l’hypophyse. Dans le passé, cette glande était considérée comme une mosaïque hétérogène de cellules endocrines distinctes, si bien que la compréhension fonctionnelle de ces cellules apparemment dispersées était basée sur le nombre et l’activité de ces cellules. En utilisant la microscopie 2-photons et des approches fonctionnelles sur des souris transgéniques exprimant des étiquettes fluorescentes sélectives (GH-eGFP, PRL-DsRed…)(développées par le groupe de Londres et d’autres collaborateurs), nous avons démontré que l’hypophyse était en fait composée de réseaux de cellules endocrines (PNAS 2005, J. Endoc. 2009, Endocrinology 2010). Un autre fait marquant du projet Pit-Net a été notre récent développement d’une approche in vivo du flux sanguin local, de la pression d’oxygène et d’activités cellulaires avec une résolution cellulaire dans des hypophyses de souris anesthésiées. Cette technique est basée sur une imagerie in vivo avec des objectifs à longue distance de travail de l’hypophyse en vue ventrale du cerveau (Lafont et al., PNAS en révision, voir aussi http://ipam.igf.cnrs.fr/).Nous prévoyons maintenant d’utiliser l’imagerie cellulaire in vivo et d’autres approches fonctionnelles pour comprendre comment les réseaux de cellules hypophysaires reçoivent et décodent leurs signaux hypothalamiques natifs. Deux systèmes vont être étudiés : 1) les cellules GH qui forment un pulse d’hormone en réponse au GHRH hypothalamique, et 2) les cellules PRL qui ont leur activité basale négativement régulée par la dopamine (libérée par les neurones TIDA). Avec notre collaborateur de Londres (P. Le Tissier), nous (P. Mollard) proposons une collaboration avec le groupe d’Ulrich Boehm (Hambourg). Ce dernier vient de développer des modèles de souris ROSA26 floxées pour des rhodopsines photoactivables : ChR2 qui dépolarise en réponse à une lumière bleue et NpHR qui hyperpolarise en réponse à une lumière jaune. ChR2 et NpHR sont également étiquetées avec les protéines fluorescentes respectives YFP et mCherry.  Le groupe de Boehm a déjà validé les souris R26-NpHR-mCherry avec des modèles neurohormone-Cre lors de manipulations hormonales. La lignée R26-ChR2-YFP est également en cours de test. Basé sur la synergie et la complémentarité d’expertises et de connaissances de nos trois groupes, nous proposons d’aborder les questions suivantes : 1) quels profils de (photo)stimulation hypothalamique contrôlent les sorties hormonales hypophysaires, et 2) quels sont les rôles des réseaux cellulaires endocrines et de leurs relations avec la microcirculation hypophysaire dans ces sorties hormonales.
Résultats : 1/ nous avons généré une nouvelle lignée de souris transgénique GHRH-Cre utilisables maintenant pour les expérimentations d'optogénétique
2/ nous avons développé un nouveau Kit Elisa pour la mPRL adapté au suivi des profils hormonaux dans nos souris sous contrôle optogénétique
3/ nous avons réussi à contrôler via l'expression d'outils optogénétiques dans des péricytes, le flux sanguin hypophysaire
Perspectives : Sur la base des nouveaux modèles animaux/outils développés, nous allons être en mesure d'identifier:
1/ quels sont les patrons d'activité électrique des neurones GHRH/TIDA qui contrôlent les sorties d'hormones hypophysaires
2/ le rôle des péricytes dans la genèse des pulses d'hormones hypophysaires
Publications et brevets : Premiers expériences prometteuses sur les modèles/techniques développées. Nous planifions de soumettre 2 manuscrits à publication prochainement.