Projet ANR-06-PCVI-0006 – CMIDT : Controlled Membrane Interaction and Destabilisation for DNA Transfer
Programme : Physique et Chimie du Vivant (PCV) (PCV) 2006
Année de financement : 2006
Coordinateur du projet : CNRS DR PARIS A (CNRS DR PARIS A)
Partenaires : Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Centre national de la recherche scientifique; Institut national de la santé et de la recherche médicale
Montant : 412948.0 euros
Date de début : 2006
Durée : 36 mois
Résumé : Les méthodes de transfert de gène présentent un point commun : l'induction d'une modification de la membrane cellulaire afin de permettre l'internalisation de l'ADN. Ainsi, les vecteurs viraux ou chimiques sont-ils capables de fusionner avec la membrane lipidique et/ou être internalisés par endocytose, l'utilisation de forces physiques permet de déstabiliser transitoirement la membrane cellulaire.  Ce projet s'inscrit dans le cadre du transfert de gène par l'étude de l'interaction entre la membrane cellulaire et l'ADN et la destabilisation transitoire contrôlée de cette membrane cellulaire. Cette destabilisation sera induite soit par des dérivés chimiques, par l'utilisation d'un champ électrique ou par la combinaison des deux.   Une part importante de l'étude sera basée sur les études de la modification de la membrane, les structures formées facilitant l'internalisation de l'ADN, les interactions de certains domaines membranaires avec l'ADN, ceci dans le but de mettre au point une méthode de transfert de gène adaptée à des applications qui n'y ont pas accès aujourd'hui. Une deuxième part sera basée sur l'application des méthodes mises en jeu sur deux modèles in vivo pertinents, le muscle squelettique dans le cadre de la myopathie de Duchenne et le muscle ciliaire, dans le cas d'uvéites sévères.  L'électrotransfert d'ADN dans les cellules est relié à deux effets du champ électrique :  - la déstabilisation de la membrane cellulaire révélée par sa perméabilisation aux petites molécules et  - l'électrophorèse de l'ADN. L'originalité de notre approche sera de combiner les actions d'un champ électrique et de composés chimiques.  Dans cette nouvelle procédure de transfection, la destabilisation de la membrane à l'aide de composés chimiques serait associé à l'application d'un champ électrique d'intensité faible dont la fonction serait uniquement de permettre l'électrophorèse de l'ADN. Une telle procédure pourrait être moins lésionnelle.   De plus, l'analyse des interactions des composés associés ou non à l'ADN avec la membrane permettra de déterminer les propriétés nécessaires à leur efficacité (interactions avec les "rafts", fluidification de la phase lipidique, permeabilisation ...) et ainsi trouver les composés les plus appropriés qui pourraient être utilisés sans association avec l'électrophorèse de l'ADN.  Pour cela on évaluera des lipides neutres comme les polythiourées, des diblock polythiourée, différents copolymères et peptides, l'acide phosphatidique, le cholestérol, des phospholipides insaturés, des polymères de différentes natures qui pourraient se lier à différentes parties de la membrane cellulaire.  Les études in vitro, en microscopie de fluorescence sur cellules CHO, permettront d'analyser le rôle des adjuvants (associés ou non à l'ADN) sur les interactions de l'ADN avec la membrane, son internalisation et la perméabilisation de la membrane sous différentes conditions de champs électriques. Notre modèle d'étude in vivo sera le muscle tibial cranial de la souris.  Suite aux informations obtenues in vitro, nous évaluerons in vivo l'effet de différentes formulations de l'ADN et/ou traitement par des adjuvants, sous l'effet ou non d'impulsions électrophorétiques, sur la transfection des muscles par un plasmide codant la luciférase. Nous privilégierons les méthodes d'études non invasives. Ainsi, la comparaison des niveaux de transfection sera réalisée par imagerie optique. La perméabilisation du muscle sera étudiée par IRM.  Les procédures mises au point seront évaluées pour le transfert de gènes thérapeutiques dans le muscle myopathe afin d'évaluer leur efficacité sur un tissu fragile et sur le muscle ciliaire afin d'obtenir un effet local de longue durée.  Nous attendons de cette étude  - la compréhension des interactions ADN/membrane lors de l'induction de l'électrotransfert - la mise au point de nouvelles méthodes de transfert de gène dans le muscle par la compréhension des mécanismes impliqués dans ce transfert au nive