Projet ANR-07-BLAN-0287 – Fluo-aa-nt : Labelling of peptides and oligonucleotides by two-color fluorophores for  investigating biomolecular interactions.
Programme : Blanc (BLANC) 2007
Année de financement : 2007
Coordinateur du projet : UNIVERSITE DE STRASBOURG (UNIVERSITE DE STRASBOURG)
Partenaires : Université Nice - Sophia-Antipolis; Université de Strasbourg
Montant : 350000.0 euros
Date de début : 2007
Durée : 36 mois
Résumé : Le séquençage du génome humain et la protéomique ont induit une forte demande pour caractériser et quantifier les interactions protéine/protéine et protéine/acide nucléique afin de comprendre les bases moléculaires de plusieurs maladies et d'établir des essais de criblage à haut débit et de diagnostic. Par sa sensibilité, la spectroscopie de fluorescence est une technique de choix pour atteindre ces objectifs. Cependant, cette technique est limitée par la disponibilité de fluorophores optimisés qui n'affectent pas la structure et les fonctions des séquences marquées et qui reportent de manière sensible, site-spécifique et multi-paramétrique les changements conformationnels lors d'une interaction. Des limitations importantes existent pour les acides nucléiques car les nucléosides naturels ne sont pratiquement pas fluorescents et les analogues fluorescents de nucléosides souffrent d'un faible rendement quantique ou d'une faible sensibilité à leur environnement. Dans les protéines, les Trp ont de nombreuses applications mais des propriétés spectroscopiques limitantes. Des acides aminés fluorescents ont été développés, mais la plupart présentent une bande unique d'émission et fournissent peu d'informations sur leur environnement. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de concevoir des nucléosides et des acides aminés fluorescents à deux couleurs pour marquer des peptides et des oligonucléotides (ODNs) en des positions choisies, lors de la synthèse en phase solide. Cet objectif sera atteint en utilisant des fluorophores de la famille des 3-hydroxychromones (3HC) et 3-hydroxyquinolones (3HQ). Dû à un transfert de protons à l'état excité, ces composés présentent un équilibre entre deux formes donnant deux bandes d'émission largement séparées et différemment sensibles à leur environnement. En conséquence, la position et le rapport d'intensité des deux bandes permet de suivre de manière sensible les changements environnementaux, indépendamment de la concentration locale en sonde. Par ailleurs, les 3HCs et 3HQs sont de petite taille et perturberont probablement moins la structure et les fonctions des séquences marquées que les fluorophores classiques. En outre, la possibilité qu'offre ces composés d'introduire des substituants en différentes positions, permet de moduler finement leurs propriétés de fluorescence et d'optimiser leur encombrement stérique. Ceci devrait conduire à la conception de véritables analogues fluorescents d'acides aminés et de nucléosides permettant un progrès majeur dans la caractérisation et la quantification des interactions de peptides et ODNs avec des protéines et acides nucléiques. En effet, en marquant les peptides et ODNs en des positions choisies, les informations multi-paramétriques fournies par ces fluorophores permettront de caractériser précisément les changements environnementaux au site de marquage lors d'interactions. Ce projet est fondé sur trois axes étroitement imbriqués : i) Conception, synthèse et caractérisation spectroscopique de nouveaux fluorophores de la famille des 3HC et 3HQ, ii) Marquage covalent de peptides pour caractériser les interactions avec des cibles protéiques et nucléiques, et iii) Marquage covalent d'ODNs pour caractériser les interactions avec des protéines. Des essais préliminaires avec une 1ère génération de sondes ont montré qu'un marquage sélectif d'un peptide et d'une protéine n'affecte pas de manière significative leur structure ou fonctions, et permet de suivre de manière sensible des interactions avec des molécules cibles. La validation de la méthodologie sera poursuivie avec des séquences sélectionnées dans des domaines où les équipes participantes sont expertes. Ainsi, elle sera appliquée à la protéine NCp7 de 55 aa du virus VIH-1 ainsi qu'à ses cibles nucléiques, dont la séquence cTAR de HIV-1. Elle sera également appliquée à des peptides interagissant avec des fragments d'anticorps, ainsi qu'à des aptamères dirigés contre une protéine. En utilisant la sp..