Projet ANR-10-BLAN-1332 – TSSP : Etude fonctionnelle et structurale de TSSP, une nouvelle protéase à serine qui diversifie le répertoire fonctionnel des cellules T CD4 et contrôle le développement de diabète autoimmun chez la souris NOD.
Programme : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Microbiologie, immunologie, infectiosité (Blanc SVSE 3)
Année de financement : 2010
Coordinateur du projet : Madame Sylvie GUERDER (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE - Délégation régionale Midi-Pyrénées Limousin)
Partenaires : Stress Cellulaire; Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan; Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques
Montant : 570000.0 euros
Date de début : 2011
Durée : 36 mois
Résumé : Etude de TSSP, une protéase ayant un rôle clé dans le développement de diabète autoimmun.En combinant des approches structurales et fonctionnelles, ce projet vise à comprendre la fonction de TSSP, une molécule critique dans le développement du diabète. Ces données pourraient conduire au développement de stratégies permettant de neutraliser son activité et ainsi de contrôler le développement de diabète autoimmun.
Caractériser la fonction de TSSP en vue de son ciblage en santé humaineTSSP est une nouvelle protéase qui contrôle, par des mécanismes encore inconnus, le développement de certaines cellules T autoréactives directement impliquées dans le développement de diabète autoimmun. Les objectifs de ce projet sont d’une part de préciser la fonction de TSSP et d’autre part d’identifier des substrats de TSSP.  Outre des connaissances fondamentales sur les mécanismes de tolérance centrale, ce projet permettra d’identifier des modulateurs de TSSP qui pourraient avoir un intérêt clinique.
Etude structure/fonction de TSSPCe projet combine des approches de cristallographie, une étape essentielle à la compréhension des propriétés enzymatiques d’une protéase, nature des substrats et conception d’inhibiteurs, ainsi que des approches d’enzymologie et de biologie in vitro et in vivo afin d’avoir une analyse intégrée de la fonction de cette protéase.
Résumé de la soumission : Le répertoire fonctionnel des lymphocytes T est façonné dans le thymus par la sélection positive et négative par interaction avec les complexes MHC/peptide présentés par les cellules épithéliales thymiques et les cellules dendritiques (DC). La taille et la diversité du compartiment T CD4 sont déterminées par la complexité du répertoire des peptides du soi présentés par les molécules du MHC de classe II. Plusieurs cystéine et aspartic proteases sont impliquées dans la génération de complexes MHC classe II/peptide, mais des évidences indirectes suggèrent que des serine et métallo-protéases pourraient aussi participer à la présentation antigénique.Nous avons identifié une nouvelle serine protéase nommée TSSP qui est fortement exprimée dans le compartiment endosomal des cellules épithéliales corticales thymiques et modérément dans les cellules B et les DC dérivées de la moelle osseuse. TSSP fut initialement décrite comme un gène lié à la susceptibilité au diabète chez l’homme.Nous avons montré que les souris déficientes pour TSSP (TSSP-/-) expriment un niveau normal de MHC de classe II et présentent des nombres normaux de toutes les cellules immunitaires, y compris les cellules CD4. Tandis que la déficience en TSSP n’affecte pas quantitativement le développement des cellules T CD4 exprimant un répertoire TCR polyclonal, nous trouvons que TSSP est nécessaire au développement intrathymique de certaines spécificités CD4. En effet la sélection positive de cellules T CD4 Marilyn et OTII (I-Ab restreintes) est abolie chez les souris B6-TSSP-/-. Comme TSSP est liée a un locus de susceptibilité au diabète, nous avons analysé si la déficience en TSSP pourrait affecter le développement d’un répertoire T CD4 fonctionnel chez des souris NOD-TSSP-/-. Nous avons testé la réponse de ces souris à 6 antigènes (Ags) étrangers et montré que la réponse T CD4 au HEL est sévèrement diminuée. Une analyse comparative du répertoire TCR HEL-spécifique a montré que TSSP est nécessaire à la diversification de ce répertoire et au développement de clones de haute affinité pour HEL. Nous avons ensuite testé la réponse des souris NOD-TSSP-/- à des peptides immunodominants des Ags des ilôts de Langerhans et montré une tolérance envers un épitope de la Phogin (IA2ß755), sur 6 Ags testés. La tolérance dans ce cas résulte de la sélection négative de cellules T CD4 spécifiques dans le thymus. Ces analyses suggèrent que le développement de 15% (2 sur 13 Ags) du répertoire T CD4 fonctionnel requiert la fonction de TSSP dans le thymus. L’impact limité de TSSP sur le développement T CD4 suggère un rôle de TSSP dans l’édition du répertoire peptidique présenté par les molécules du MHC de classe II dans le thymus. Une telle fonction a des conséquences physiologiques importantes. En effet, nous observons que les souris NOD-TSSP-/- sont complètement protégées du diabète et de l’insulite. Cette protection résulte d’un défaut du développement intrathymique de cellules T diabétogènes.Ainsi, TSSP est le premier exemple de serine protéase qui joue un rôle dans l’établissement d’un répertoire T CD4 fonctionnel à travers son implication dans l’édition du répertoire peptidique dans le thymus.Dans ce projet nous proposons de décrypter la fonction moléculaire de TSSP et son impact sur le développement du répertoire T CD4 fonctionnel. En combinant des études structurales et fonctionnelles nous chercherons particulièrement à caractériser les substrats de TSSP, certains pouvant être des autoAgs des ilôts tolérés par les souris NOD-TSSP-/-. Ainsi, tout en apportant des connaissances fondamentales sur cette nouvelle protéase, ce projet permettra d’identifier des nouveaux Ags des ilôts pouvant être essentiels pour l’initiation ou le développement du diabète dans les souris NOD.
Résultats : Nous avons réussi à produire la protéine TSSP recombinante, la base pour l’analyse de sa structure tridimensionnelle et de son activité enzymatique. De plus nous avons identifié différents substrats de TSSP qui nous permettront de développer un test enzymatique.  Nos travaux préliminaires pointent vers une fonction originale et inattendue de TSSP dans la présentation des antigènes qui sera précisée dans ce projet.
Perspectives : Les progrès dans l’analyse cristallographique et enzymatique sont essentiels pour évaluer la fonction de TSSP chez l’homme et définir de nouvelles stratégies d’immuno-intervention dans le développement de diabète autoimmun. .  Nos observations sur la fonction de TSSP ouvrent de nouvelles perspectives, à développer dans de futurs projets, sur les mécanismes contrôlant la maturation fonctionnelle des cellules présentatrices d’antigènes.
Publications et brevets : Ce projet a contribué à la publications de 3 articles scientifiques ainsi que d’une revue.