Projet ANR-07-MIME-0027 – VIRADAR : Modification génétiques contrôlée comme moyen d'atténuation du virus ARN.
Programme : Microbiologie, immunologie et maladies émergentes (MIME) 2007
Année de financement : 2007
Coordinateur du projet : INSTITUT PASTEUR (INSTITUT PASTEUR)
Partenaires : Institut Pasteur; Institut Pasteur; Institut Pasteur
Montant : 216000.0 euros
Durée : 24 mois
Résumé : Le spectre d'action des interférons sur la restriction virale implique l'action d¿éléments tels l' ARNaseL, la PKR, Mx ou ADAR-1L. Cette dernière voie induite par les IFNa/b génère des hypermutations A->G. Le rôle de cette voie dans la réponse antivirale a probablement été sous-évaluée du fait d'un manque d'outil adéquat pour l'analyser.
La 3DI-PCR permet d'analyser cette voie de restriction. En effet, une application sur des lots vaccinaux ROR (Sanofi-Aventis) ou encore contre la grippe montre la présence de virus hypermutés. A la vue de ces données nous souhaitons:
1) Démontrer qu'ADAR-1L est une voie principale dans la restriction contre les virus à ARN comme les virus de la vallée du Rift, de la rougeole, de la grippe, de la fièvre jaune, le virus West Nile et Chikungunya.
2) Rechercher si les hypermutations A->G sont corrélées avec l'atténuation des vaccins vivants dans l'induction d'une immunogénicité protectrice.
3) Identifier les protéines cellulaires interagissant avec ADAR-1L//Nous avons développé une technique d'amplification sélective par PCR permettant de sélectionner des séquences riches en GC (3DI-PCR). Cette technique a permis d'étudier le taux d'hypermutations A->G au sein de virus à ARN comme les virus de la rougeole (VR) et de la vallée du Rift (VFVR). Le VR ou le VFVRDNs sont utilisés pour infecter des cellules peu permissives MRC5 qui produisent des IFNa/b, et des Vero très permissives défectives pour la synthèse d' IFNa/b. L'analyse par 3DI-PCR des génomes viraux produits dans ces lignées cellulaires a mis en évidence des génomes hypermutés dans les cellules MRC5, et aucun hypermutant n'a été détecté dans les cellules permissives Vero.
1) Afin d'analyser l'importance de la voie ADAR-1L, nous allons créer à partir des cellules Vero une lignée stable exprimant ADAR-1L. Cette lignée cellulaire sera infectée par différents virus à ARN, nous analyserons ainsi l'inhibition de la réplication virale corrélée à l'expression d'ADAR-1L. Cette étude nous permettra d'évaluer la place d'ADAR-1L dans la restriction virale par rapport aux autres voies induites par les IFNa/b
2) ADAR-1L contribue-t-il à l'évolution des virus à ARN? Des virus seront cultivés sur un long terme sur des lignées stables Vero/ADAR-1L. Cette étude nous permettra de voir si ADAR-1L est un élément important dans la genèse de la variabilité des virus à ARN.
3) Une plateforme de criblage par double hybride en levure est en place pour identifier les protéines cellulaires susceptibles d'interagir avec ADAR-1L. ADAR-1L sera cloné par recombinaison in vitro (système Gateway). Cette construction sera ensuite utilisée pour cribler une banque de cDNAs. En modifiant le niveau d'expression des protéines identifiées comme interagissant avec ADAR-1L, par siRNA , nous évaluerons leur capacité à moduler l'activité d'ADAR-1L et donc le taux d'hypermutations lors d'infections par des virus à ARN.//1) Identification du rôle d'ADAR-1L dans la restriction de la réplication des virus à ARN.
2) Evaluation du rôle des formes hypermutées dans l'immunogénicité et la protection induites par les souches atténuées de ces virus. Le vaccin anti-rougeole est produit sur cellules embryonnaires de poulets (CEF). Nous avons observé que ce vaccin contient des formes virales hypermutées. Il n'est pas produit sur cellules Vero car elles présentent un risque tumorigène. D'autre part, il est intéressant de noter que certaines souches virales atténuées du VFVR utilisées pour un objectif vaccinal à usage vétérinaire ou humain peuvent être produites également sur CEF. Il serait donc souhaitable de créer une lignée non tumorigène afin de produire des quantités plus importantes de vaccins. La création d'une telle lignée cellulaire pourrait ainsi s'étendre à d'autres vaccins comme celui contre la grippe.
3) Identification des protéines cellulaires qui modulent par interaction directe l'activité d'ADAR-1L.