sou · GRB3107 · 2004-01-01 00:00:00 — Vidare måste man testa åtminstone 20 avkommor från djuret för att resultatet skall kunna anses vara statistiskt säkerställt. 1 lagar är de regler för nedärvning som den österrikiska munken formulerade och som bildar grunden för ärftlighetsforskningen. Jag har redan nämnt ett exempel för att illustrera dessa lagar, nämligen hur anlag för blå respektive brun ögonfärg nedärvs. När man beskriver dominanta och recessiva anlag brukar det dominanta anlaget betecknas med stor bokstav, t.ex. B, medan det recessiva betecknas med liten bokstav, i detta fall b. Dominansen hos ett dominant anlag kan vara fullständig så att de egenskaper som Bb ger upphov till inte kan skiljas från dem som BB ger upphov till. Men dominansen kan också vara ofullständig så att de egenskaper som Bb ger upphov till kan skiljas från dem som BB ger upphov till, varvid Bb blir mer lik BB än bb. En ärftligt betingad dominant egenskap överförs till hälften av avkomman om anlagsbäraren har uppsättningen . Om modern t.ex. har bruna ögon (Bb) och fadern blå (bb) kommer av barnen att ha bruna ögon. Karaktärisering - en kontroll av om den genetiska modifieringen lyckats Alternativt kan man för att analysera genöverföringen använda sig av en s.k. paqman-teknik. Vilken vävnad som helst kan användas för analysen så länge cellerna i vävnaden innehåller en cellkärna. När det gäller möss sker DNA-kontrollen oftast genom att man klipper av den yttersta biten av svansspetsen på djuren. Ett sådant svansprov kan tas från det att musen är . Ingreppet sker med en för ändamålet anpassad sax. Tagande av vävnad på detta sätt kan orsaka stress, smärta och obehag för djuren. I vilken omfatt- ning lidande eller obehag uppstår för djuren varierar enligt experter på området, bl.a. beroende på hur gamla djuren är vid ingreppet. Delade meningar råder om smärtlindring eller bedövning skall användas för att minska djurens lidande. Vissa som utför svans- klippning söver djuret före ingreppet eller ger det en lokal bedöv- ning. Andra gör klippet utan bedövning eller sövning då de anser att dessa förfaranden medför ett lika stort lidande eller obehag för djuret som svansklippet i sig. Det finns även andra metoder än svansklippning för att genotypa möss. Man kan bl.a. klippa av en bit av den yttersta delen på musens öra (öronklippning) eller den yttersta falangen av en tå (tåklippning) eller ta blod från svansen på djuren. Man kan också ta saliv, avföring eller hårstrån (med hårsäckar) från djuren. Vidare kan man i vissa fall redan under fosterstadiet (från det att embryot endast består av ett fåtal celler) undersöka om genen har överförts. I dessa fall kan dock de embryon som använts inte fortsätta att utvecklas till levande individer. Det saknas systematiska studier av hur de olika genotypnings- metoderna påverkar djuren. Med stöd av sunt förnuft kan man dock dra slutsatsen att metoderna där man tar saliv, avföring eller hårsäckar är betydligt lindrigare åtgärder för djuren än de andra metoderna. Trots det har de lindrigare metoderna inte fått någon bredare spridning. Metoderna för analys av DNA är olika säkra och kräver tillgång till olika mycket DNA. Southern blotting tekniken är säkrare och kräver mer DNA än PCR tekniken. För viss typ av analys är det nödvändigt att använda den säkrare metoden, bl.a. är det endast Southern blotting tekniken som kan visa hur många kopior av en gen som har tagits upp i djurets arvsmassa. Detta är förklaringen till att det framför allt är biopsier som används för DNA analys. De lindrigare metoderna för DNA-insamling kan vidare vara svåra att använda då det finns en risk för att DNA:t orenas av Karaktärisering - en kontroll av om den genetiska modifieringen lyckats DNA från en annan individ, t.ex. DNA från hår från ett kull- syskon. on Refinement2 som arbetar med att förbättra djurskyddet och minska lidandet för försöksdjur har lämnat ett antal rekommendationer för genotyp- ning av genetiskt modifierade djur. Arbetsgruppen rekommenderar att sådana lindrigare metoder för genotypning som kan ske utan ingrepp på djuren (saliv, avföring eller hårstrån) skall övervägas och användas i första hand. Öronklippning och blodprov är enligt arbetsgruppen också att föredra framför svansklippning. Svans- klippning bör användas endast om de här nämnda lindrigare metoderna inte kan användas (på grund av att det behövs mer DNA eller av något annat skäl). Om svansklippning måste användas rekommenderar arbetsgruppen att klippningen utförs när mössen är mellan , att ingreppet sker under sövning och att adekvat smärtlindring ges efter ingreppet. Tåklippning bör enligt arbetsgruppen endast användas om det är absolut nödvändigt (vilket kan vara fallet om djuret är under och tåklippningen dessutom är avsedd att fun- gera som en för framställningen/experimentet nödvändig id-märk- ning av djuret). Arbetsgruppens rekommendationerna är publice- rade i ett supplement till tidskriften animal Science and Welfare, vol. 37, suppl. 1, juli, 2003, s. 27–33. 7.2Fenotypning – kontroll av om och hur genen uttrycks En analys av hur djurens genetiska uppsättning och den genetiska förändringen samspelar med miljön kallas för fenotypsanalys. Det finns många olika sätt att analysera samspelet mellan den genetiska bakgrunden och miljön. Vilken eller vilka metoder man använder varierar, bl.a. beroende på vilken gen man har att göra med, vilken förändring man förväntar sig att genen skall resultera i 2 on Refinement är en grupp som består av ett antal organisationer inom forskningen och från olika djurskyddsorganisationer – (), Fund for experiments (FRAME), Royal to Animals (RSPCA) och () – och som arbetar med att förbättra djurskyddet och minska lidandet för försöksdjur. Karaktärisering - en kontroll av om den genetiska modifieringen lyckats och vilka rutiner och vilken utrustning som den som framställer eller använder djuren har. Analys av djuren bör för att vara så rättvisande som möjligt ske vid flera olika tillfällen under djurens levnad och på flera gene- rationer av djuren. Djuren utvecklas såväl kroppsligt som mentalt under sin levnad och i vissa fall kan effekten av den genetiska modifieringen eller biverkningar av denna uppenbara sig först eller först efter att ett antal generationer med modi- fieringen har fötts. Fenotypsanalysen görs inte nödvändigtvis på alla djur som framställs. Det är vanligt att endast ett visst antal, t.ex. 10 stycken av de djur som har den rätta genetiska sammansättningen går igenom de olika testerna (, Karaktärisering av kliniska och etologiska parametrar hos genmodifierade möss, artikel i Transgena djur ur djurskyddssynpunkt, CFN:s skriftserie nr 51, 2003, s. 23–24). Den fenotypsanalys som det redogörs för i detta kapitel beskriver en mönsterbild av karaktärisering. Enligt uppgifter från forskare verksamma inom området är analyserna av djuren sällan så omfattande. 7.2.1Fungerar genen i sin nya miljö? Ett första steg i analysen är att försöka ta reda på om den aktuella genen verkligen fungerar hos det mottagande djuret. Detta kan bl.a. studeras genom att titta på om genen sätter i gång en produktion av proteiner eller liknande ämnen i de vävnader där man förväntar sig att genen skall vara aktiv. 7.2.2Vad medför den genetiska modifieringen? Det är även viktigt att göra mer förutsättningslösa tester så att man kan upptäcka oväntade effekter av den genetiska modifieringen. Testerna bör syfta till att kontrollera om djuret har några defekter, om det är friskt, om det har ont eller uppvisar några avvikande beteenden. Kontroll av effekterna av en genetisk modifiering bör helst omfatta hela djurets livsspann, från dess embryonala utveckling till dess död. Hur många djur föds i förhållande till det antal äggceller/embryon som har opererats in? Karaktärisering - en kontroll av om den genetiska modifieringen lyckats mamman må bra? Dör några djur redan innan de hunnit bli avvanda och hur många i så fall? Utvecklas djuren på ett normalt sätt, får de tänder och päls, öppnar ögonen osv. som icke-modifierade djur av samma ras? Är djuren fertila, växer de och åldras på ett normalt sätt? Efter djuren avlidit bör en ingående undersökning av deras organ och vävnader utföras. Olika typer av kontroller och beteendetester kan utföras för att försöka ta reda på vad den genetiska modifieringen innebär för dju- ren. Faktorer som är av intresse att studera är bl.a.: djurens allmäntillstånd (kroppshållning, pälskondition, färg på slemhinnor, hud, öron och trampdynor, kroppstemperatur) viktökningar och/eller viktminskningar, förekomst av skador, sjukdomssymptom, skakningar, kramper eller dyl., djurens spontana beteende, dvs. om detta står i överens- stämmelse med beteendet hos andra djur av samma art (putsar päls, agerar socialt med andra djur, är nyfikna på sin omgivning, bygger bon), och förekomst av eventuella avvikande beteenden (onormal akti- vitet/passivitet, onormal aggressivitet, stereotypa beteenden). Sådana kontroller och beteendetester är de som fungerar bäst om man skall kunna upptäcka långsiktiga konsekvenser för djurens hälsa och välfärd (D. M. Broom, Assessing the Welfare of Modified or Treated Animals artikel i , 35, 1993, s. 48). Blod, urin och avföring från djuren är vanligt att analysera, bl.a. för att se om matsmältningen fungerar som den skall. Hjärt- frekvens och andningsfrekvens hos djuren kan också studeras, liksom om djuren har nedsatt immunförsvar eller bär på mikro- biologiska organismer som vissa typer av bakterier, virus eller parasiter. Kontrollen av djuren bör också innehålla olika tester av djurens sinnen, reflexer och motorik. Exempel på tester som kan användas för att kontrollera en mus sinnen är: att mäta den tid det tar för musen att sträcka ut tassarna för att ta emot sig när man sänker ned musen mot en väl avgränsad yta (syntest), Karaktärisering - en kontroll av om den genetiska modifieringen lyckats att studera musens reaktion när man utsätter den för en lätt luftpuff (känseltest), att studera musens reaktion på olika ljud (hörseltest), att mäta hur det tar för en mus att lokalisera en tuss med bäddmaterial från en mus av motsatt kön som lagts i musens bur (luktsinne). För att testa en mus reflexer kan man t.ex. placera djuret på rygg och sedan släppa det och mäta den tid det tar för djuret att vända sig rätt igen. För att kontrollera motoriken kan bl.a. låta testa musens gripförmåga. Detta kan man bl.a. göra genom att sätta musen på ett galler och sedan, när musen gripit tag om gallret, sakta vända gallret upp och ned och hålla det så . En normal mus klarar av att gripa sig fast för en sådan tid. Fördjupade tester, med inriktning mot de förändringar som man förväntar sig bli effekten av den aktuella genetiska modifieringen bör också ingå i kontrollen av djuren. Effekterna av den genetiska modifieringen kan vara små och svåra att observera. Det kan därför krävas omfattande tester för att upptäcka dem. Om djuret visar sig ha avvikelser i sina funktioner i några av de tester som utförts på djuret bör fördjupade tester göras om det är nödvändigt för att fastställa vad avvikelserna beror på eller hur de påverkar djuren. 7.2.3Vikten av standardiserade tester För att inte få missvisande resultat är det viktigt, precis som vid all annan användning av djur i forskning, att betingelserna vid testningen av djuren är standardiserade, dvs. lika för alla djur som testas. Det är således viktigt att ta hänsyn till att andra faktorer som miljö och hantering av djuren kan påverka analysen. Faktorer av intresse är t.ex. djurens ålder och kön, djurens egna genetiska bakgrund och sjukdomar eller skador som har sin orsak i andra förhållanden än den genetiska modifieringen, t.ex. skador eller smitta som uppkommit genom kontakt med andra djur på avdelningen. För att få så tillförlitliga resultat som möjligt är det viktigt att testa inte bara de genetiskt modifierade djuren utan även deras Karaktärisering - en kontroll av om den genetiska modifieringen lyckats icke-modifierade kullsyskon och andra djur som är av samma genetiska bakgrund som djuret. Vissa raser bär på rasspecifika anlag. För att få så goda verktyg som möjligt vid utvärderingen av genetiska förändringar är det därför viktigt att arbeta med att kartlägga den grundläggande genetiska uppsättningen hos de stam- mar av försöksdjur som används i forskningen. 8Avel med genetiskt modifierade djur När man har genomfört en genetisk modifiering och en levande avkomma har fötts och uppnått könsmogen ålder korsar man avkomman med andra möss. Korsning sker egentligen i två syften. Dels för att kunna kontrollera om musen kan föra det nya anlaget vidare i arv och dels för att få fram fler djur som har den aktuella genetiska sammansättningen. Om den genetiska förändringen går ut på att föra över en ny, dominant gen så kan man använda i princip vilken annan mus som helst i den vidare aveln. Eftersom anlaget är dominant räcker det ju med att avkomman får det från en förälder. Vid överföring av recessiva gener eller vid utslagning av gener går det oftast inte att para den genetiskt modifierade musen med vilken annan mus som helt. Recessiva gener eller utslagna gener ger ofta uttryck först när förändringen finns i dubbel upplaga (homozygot form) hos individen. För att få fram ett djur som har förändringen i båda kromosomerna i ett kromosompar måste man därför först korsa den genetiskt förändrade musen (mosaiken/chimären) med en annan mus så att man får fram flera möss som bär på den genetiska förändringen i enkel upplaga. Dessa möss korsas sedan med varandra så att avkomman får anlaget i dubbel upplaga. Den ena upplagan av anlaget härstammar då från honans könsceller och den andra från hanens. I några fall har forskare dock lyckats med att redan på det stadium när genen förs över till ES-cellen ersätta eller slå ut generna i ES-cellen i dubbel upplaga. Redan det första djur som föds bär i dessa fall anlagen i homozygot form. När man väl har en avkomma som har konstaterats kunna föra det aktuella anlaget vidare korsar man denna med andra möss så att man kan få fram så många individer med den aktuella genetiska ändringen som man behöver. En normal laboratoriemus har en genomsnittlig livstid på ca 1½– . För att hålla en stam av djur vid liv före, under och efter ett med genetiskt modifierade djur forskningsprojektet krävs det därför relativt ofta att man konti- nuerligt fortsätter att avla på djuren i stammen. En del av de djur som föds och som har den efterfrågade genetiska förändringen används därför i avel för att föra arvsanlaget vidare till nya gene- rationer. Andra djur med den efterfrågade förändringen används i de studier som var syftet med att framställa djuren. Hur många djur som behövs för att framställa genetiskt modi- fierade djur och hålla stammar med sådana djur levande varierar kraftigt. Variationen beror bl.a. på hur hög kvalitet som DNA:t som förs över har, hur hög kvalitet som de äggceller/ES-celler och embryon som används håller, hur skickliga de som utför de olika momenten i framställningen är och hur fruktsamma de genetiskt förändrade djuren är. Det är inte ovanligt att djur som har recessiva anlag i homozygot form har problem med fruktbarheten. I flera av dessa fall är det dock möjligt att så att säga återanvända den generation djur som endast har förändringen i enkel upplaga (heterozygot form) i aveln genom att på nytt korsa dem med var- andra så att man på så sätt kan få flera kullar efter samma avelspar. Avkommor i de nya kullarna som har den eftersökta genetiska förändringen i dubbel upplaga används sedan direkt i de studier som utgör syftet med framställningen av djuren. En del av de djur som föds men som inte har fått den aktuella genetiska förändringen används som kontrolldjur. Kontrolldjuren används för att testa samma saker som man testar på de genetiskt modifierade djuren. Eftersom djuren kommer från samma genetiska bakgrund kan man kontrollera att eventuella förändringar hos djuren beror just på genförändringen och inte på några egen- skaper som djuren haft med sig i sin egen genetiska bakgrund eller från den miljö de kommer ifrån. Andra djur kan i vissa fall användas i aveln trots att de inte själva bär på det eftersträvade anlaget. De kan t.ex. användas som avels- partner vid överföring av dominanta gener eller som steriliserad hane för att göra fostermödrar skendräktiga. Djur som inte används som kontrolldjur eller avelsdjur avlivas normalt sett efter att man har konstaterat att de saknar den eftersträvade förändringen. Det behövs många djur för att få fram genetiskt modifierade djur som kan användas och det ligger betydande investeringar , arbetsinsatser och pengar i framställningen. Det har vidare i flera fall visat sig att en viss stam med en särskild genetisk modifiering är användbar även för studier inom andra områden än det ursprung- med genetiskt modifierade djur De som skapar genetiskt modifierade djur försöker därför behålla dem även efter det att det antal djur har använts som behövs för att utföra den aktuella forskningen. Djuren behålls även om det vid tiden för slutförandet av ett projekt inte finns några andra projekt planerade där de aktuella djuren kan användas. De behålls för att den särskilda genetiska sammansättningen de har skall kunna bevaras och eventuellt användas vid senare tillfälle i utvärderingar eller i nya studier. Djuren kan antingen behållas i levande stammar genom fortsatt, kontinuerlig avel med dem eller genom att man fryser ned biologiskt material från dem. 9Fryslagring av genetiskt modifierade djur För att kunna hålla en stam med en viss genetisk modifiering levande, måste man som jag tidigare nämnt, kontinuerligt korsa de genetiskt modifierade djuren så att det med jämna mellanrum föds nya kullar. Om man inte avlar på djuren kommer de genetiska förändringar man lyckats åstadkomma försvinna i takt med att de ursprungliga, modifierade djuren dör. Ett alternativ för att spara de speciella genetiska ändringarna är dock att med en särskild teknik, s.k. kryopreservering, frysa ned och lagra spermier, ägg, befruktade ägg (embryon) eller hela äggstockar. Materialet sparas i en sådan omfattning att man med hjälp av vissa andra tekniker senare kan tina upp det och använda det för att framställa levande individer med den aktuella genetiska uppsättningen. Det biologiska materialet kan lagras i fruset skick i varje fall (vi vet egentligen inte hur länge man kan bevara materialet men har det fungerat . Det var för ungefär så sedan som tekniken introducerades). Med hjälp av kryopreservering kan man alltså spara och förvara unikt genetiskt material. Ett annat skäl till att frysa ner det biologiska materialet är att man spar utrymme. Om stammar av alla de genetiskt modifierade djur som framställts skulle hållas vid liv skulle det bli svårt att få plats med alla djur. Att hålla levande djur är också dyrt. Även av djurskyddsskäl är kryopreservering intressant. Om man använder den tekniken kan man hålla ner antalet djur som föds. Om den genetiska modifieringen i sig orsakar djuren lidande eller obehag minskar också det antal djur som utsätts för lidande och obehag eftersom kontinuerlig avel inte behöver bedrivas. Den tid djur som skall användas i forskningen behöver utsättas för lidande och obehag kan också minskas eftersom man kan vänta med att tina upp och framställa djuren till dess att de behöver användas. Kryoperservering kan också medföra att färre levande djur behöver Fryslagring av genetiskt modifierade djur utsättas för transport. I de fall olika inrättningar behöver beställa djur från andra inrättningar kan man beställa biologiskt material i stället för levande djur. startade ett europeiskt samarbetsprojekt – (European Mouse Mutant ). samlar in, fryser ner och lagrar biologiskt material (sperma och embryon) från stammar av djur som är av generellt vetenskapligt intresse. hanterar inte bara material från genetiskt modifierade möss utan även material från andra möss, t.ex. musstammar med spontana muta- tioner i arvsmassan eller musstammar med mutationer i arvsmassan framkallade genom strålning eller kemikalier. Tanken med är att andra organisationer än den som tog fram den särskilda stammen skall kunna få tillgång till att använda den i sin forskning. För att underlätta spridning och användning av de framtagna stammarna håller biobanken på att kompletterats med en databas i vilken man kan söka efter intressanta stammar att använda. I databasen klassificeras och beskrivs alla stammar som har i lager med avseende på stammens genetiska samman- sättning, dess yttre fysik och dess egenskaper. är icke-kommersiellt och arbetar framför allt med att sprida kunskap (bl.a. hålls utbildningar i metoder för fryslagring) och att tina upp det biologiska materialet och fram- ställa levande djur av det till forskare som efterfrågar en i banken aktuell stam. distribueras mest levande djur men projektet arbetar för att i allt större utsträckning distribuera ned- fryst material och låta forskarna själva tina upp materialet och av det framställa levande djur. Projektet reglerar inte de immaterialrättsliga aspekterna av användning av djuren. Den som önskar använda material från bio- banken bör därför kontrollera vem som ursprungligen framställde djuren och fråga om det är möjligt att få nyttja djur från stammen i den egna forskningen. är delvis finansierat av EU:s ramprogram för forskning och teknisk utveckling. I övrigt finansieras det av de myndigheter och organisationer som är samarbetspartners i pro- jektet. är medlem i projektet och samarbetspartnern här är . Övriga deltagarländer är , , och . Projektet samarbetar även med andra länders aktörer på området, bl.a. för att se till att man får till stånd en Fryslagring av genetiskt modifierade djur gemensam terminologi och bestämmelser på området som är inter- nationellt accepterade. Det finns även andra banker för uppsamling och distribution av biologiskt material och djur. i och Mammalian Genetics Unit i är exempel på företag och institut som bedriver omfattande verksamhet på området. 10Verksamhet med genetiskt modifierade djur i 10.1Enkätundersökning om framställning och användning av genetiskt modifierade djur En av huvuduppgifterna i utredningens uppdrag är att beskriva verksamheten med framställning av genetiskt modifierade djur och om möjligt utreda i vilken omfattning genetiskt modifierade djur är utsatta för lidande. förs inte någon särskild statistik över antalet genetiskt modifierade djur som finns i . Dessa djur ingår endast som en del i den generella statistiken över antalet använda försöksdjur som CFN sammanställer. Av CFN:s samman- ställningar över prövade ansökningar i de djurförsöksetiska nämnderna kan dock utläsas hur många ansökningar rörande genetiskt modifierade djur som prövas av de djurförsöksetiska nämnderna . Av handlingarna framgår att under den senare halvan av prövades, 35 ansökningar, 62 ansökningar, 136 ansökningar, 181 stycken och 222 ansökningar. , 2001 och uppgick antalet prövade ansökningar till 274, 334 och 331 stycken. (Se Prövade ansökningar i de djurförsöksetiska nämnderna, 1995–1999 och 1998–2002, CFN:s dnr 5/00 och 9/03.) gjorde CFN en särskild sammanställning över antalet ansökningar avseende genetiskt modifierade djur (CFN:s dnr 1/01). Sammanställningen omfattar de flesta ansökningar om användning och framställning av genetiskt modifierade djur som de djurförsöksetiska nämnderna prövade . Sammanställ- ningen skickades till utredningen tillsammans med en skrivelse i vilken CFN pekade på att antalet ansökningar om att få framställa och använda genetiskt modifierade djur har ökat . Enligt CFN innebär det ökade antalet prövade ansökningar att framställningen och användningen av sådana djur också ökat. Verksamhet med genetiskt modifierade djur i Sammanställningen överlämnades till utredningen för de över- väganden som utredningen finner påkallade.