sou · GRB3107 · 2004-01-01 00:00:00 — ningar som t.ex. nedsatt fruktsamhet, ökad dödlighet och infek- tionskänslighet samt uppkomst av skador av olika slag, t.ex. magsår och led- och leverskador (se t.ex. A. , Transgena djur i husdjursaveln, artikel i djur ur djurskyddssynpunkt, CFN:s skriftserie nr 51, 2003, s. 21, Genteknik – växter och djur, Ds 1990:9, s. 30, , Genteknik, livsmedel och säkerhet, utredningsserie, 1998, s. 26, M. Sarvas, Användning av genetiskt modifierade organismer, Gen- tekniskt modifierade organismer – etiska och juridiska debatter i , Nordiske Seminar- og Arbejdsrapporter, 1993:604, , 1993, s. 24, och Djur med nya gener, , , 1992, s. 49–50). Fisk är sannolikt det djurslag där forskning inriktad på att öka produktionskraften har lyckats bäst. Fisk är också ett av de djurslag som är lättast att bedriva genteknisk forskning på. De har stora ägg som befruktas utanför honans kropp. Forskning som har lett till positiva resultat är t.ex. försök att få fiskar att växa året om. Normalt sett växter de flesta fiskar långsamt . En av orsakerna till det är att produktionen av tillväxthormon upphör eller avtar under den säsongen. Regnbågsforellen producerar dock relativt mycket tillväxthormon även . Försök har därför gjorts att överföra den gen som styr produktionen av tillväxthormon hos regnbågsforellen till andra fiskarter, t.ex. karp (Genteknik, ekologi och etik, , Genteknik- nämndens informationsserie, nr. 1, 1997, s. 36 och Genteknik – växter och djur, Ds 1990:9, s. 31). Vissa framgångar har även nåtts med att förändra gensamman- sättningen hos höns för att göra dem resistenta mot en inom hönsuppfödningen besvärlig form av blodcancer (aviär leukos) (J. , Genteknik – den nya biotekniken, Kemifakta nr 7, Kemikontoret och för Bioteknik, 1991, s. 40). Det finns även rapporter om genetiskt modifierade får med förbättrad ullkvalitet och om genetiskt modifierade grisar som genom att få en gen för produktion av ett särkskilt enzym (fytas) klarar av att bryta ner sitt foder på ett bättre sätt. Den förbättrade nedbrytningen av foder leder till att grisarnas avföring innehåller mindre fosfor, vilket i sin tur leder till ett minskat utsläpp av fosfor i miljön (A. , Transgena djur i husdjursaveln, artikel i Transgena djur ur djurskyddssynpunkt, CFN:s skriftserie nr 51, 2003, s. 19). Det är få grupper i världen som framställer genetiskt modifierade husdjur. Kanske främst av ekonomiska skäl. Det är dyrt att framställa sådana djur, bl.a. av utrymmesskäl och på grund av att många av husdjuren har relativt långa dräktighetstider. De flesta egenskaper hos djur som är av ekonomisk betydelse är också komplexa till sin natur. De påverkas sannolikt inte av en enda gen utan av ett stort antal gener. Man har ännu inte lyckats identifiera vilka de generna är. Ännu så länge rör det sig bara om forskning. Några produkter från genetiskt modifierade djur finns inte i våra butiker och om sådana livsmedel kommer att produceras är osäkert. Genteknik kan naturligtvis användas på andra djur än djur som används i produktionen. Man kan t.ex. tänka sig att man kan försöka ta fram djur som har ett utseende eller andra egenskaper som människan tycker är attraktiva på något sätt, t.ex. sällskapsdjur utan svans eftersom det är förbjudet att svanskupera hundar, sällskapsdjur som är icke-allergena, dvs. saknar gener för de pro- teiner som de flesta djurallergiker reagerar mot, eller sportdjur som kan springa mycket snabbt. 6Metoder för att framställa genetiskt modifierade djur Med framställning av genetiskt modifierade djur avses här de tekniska metoder som leder till att det föds ett djur som bär på ett arvsanlag som är förändrat till följd av en genetisk modifiering. Resterande delar i den successiva process som framtagning av genetiskt modifierade djur innebär benämns avel. Genetiskt modifierade djur kan framställas genom flera olika metoder. De kan framställas genom: användning av retrovirus, användning av embryonala stamceller (ES-celler), sammanslagning av embryon, och Valet av metod beror bl.a. på vilken djurart man använder och om en gen skall läggas till, ersättas eller tas bort. Den absolut största mängden genetiska modifieringar som utförs på djur görs på möss. Det är också på möss som de allra flesta metoderna för framställning har utarbetats. var mus det enda djurslag man över huvud taget lyckades slå ut gener hos. För ett eller lyckades man dock slå ut gener även på gris och get. Hur man framställer genetiskt modifierade djur kan i viss utsträckning skilja sig åt beroende på vilket djurslag man arbetar med. Till exempel används ES-cell metoden när man vill slå ut gener hos mus men vid utslagning av gener hos större däggdjur används metoden med somatisk kärnöverföring. För att undvika en alltför lång utläggning om tekniker för att framställa genetiskt modifierade djur och för att göra redogörelsen lättförståelig begränsar jag mig till att beskriva metoderna för framställning av det vid modifiering mest frekvent använda djur- slaget – mus. Metoder för att framställa genetiskt modifierade djur Metoden används för att föra in en ny gen i arvsmassan hos en individ. Genom att föra in en ny gen kan man bl.a. studera hur nytt genetiskt material fungerar, studera dominanta gener (se mer om dominanta och recessiva gener i avsnitt 2.4 och sådana avsnitt i arvsmassan som styr aktiviteten hos olika gener (hur generna sätts av och på). Proceduren börjar med att man behandlar en mushona med hormoner så att hon producerar extra många ägg (superovalution). Vid en vanlig ägglossning kan en mushona släppa ca 8–10 ägg men efter en hormonbehandling kan hon släppa upp till mellan 20 och 50 ägg. Honan paras med en hane och efter parningen avlivas honan och de befruktade äggen plockas ut från honans äggledare. De befruktade musäggen placeras under ett mikroskop och med hjälp av en mycket tunn glasnål sprutar man in den främmande genen direkt i äggets cellkärna, i den ena s.k. prokärnan. Det finns två prokärnor i ett befruktat ägg, en som stammar från honans äggcell och en som stammar från hanens spermie. Därefter söver man en annan honmus (en fostermoder) och frilägger genom ett kirurgiskt ingrepp äggledarna eller livmodern på fostermodern. Befruktade ägg sprutas därefter försiktigt in i äggledaren eller livmodern, honan sys ihop och får sedan vakna. Fostermodern har innan ingreppet gjorts skendräktig genom att man parar henne med en steril hane. Hos möss ger nämligen själva parningen de hormonella förändringar som är nödvändiga för att honan skall kunna ta emot äggen. Då man för in en främmande gen på ett så tidigt stadium att ägget endast består av en enda befruktad äggcell finns en möjlighet att den främmande genen tas upp i arvsmassan hos denna den första äggcellen. När denna cell sedan delar sig för att bilda kroppens alla celler (cellen delar sig först till 2 celler, sedan till 4, 8, 16, 32 celler osv.) följer den nya genen med till de nya cellerna. Det är möjligt att den nya genen inte hinner införlivas i den första äggcellens arvsmassa innan äggcellen hunnit dela sig. I själva verket är det ganska vanligt att så sker. Om genen tas upp först efter att ett antal celldelningar har skett får man en mus som har den nya genen i vissa celler men saknar den nya genen i andra celler. Man har alltså fått en mus som består av två genetiskt skilda celltyper (celler med olika arvsmassa). Djur som består av två eller flera celler med olika arvsmassa kallas för mosaikdjur eller Metoder för att framställa genetiskt modifierade djur Mosaikdjuren är, med ett undantag (jämför med vad som sägs nedan om sammanslagning av embryon) oftast i sig inte intressanta från forskningssynpunkt eftersom de inte har fått den nya genen i alla celler utan bara i vissa. Mosaikdjurens avkomma kan dock vara intressanta som avelsdjur om de har fått den nya genen i sina könsceller. Se mer om mosaikdjur i avsnitt 6.3 samt i kap. 7 och 8. I genomsnitt utvecklas endast mellan 10–av de ägg som utsatts för en mikroinjicering till fullgångna individer. Hos de ägg som utvecklas fullt ut tas dock den nya genen inte alltid upp. Cirka 10–av musungarna som föds har tagit upp den nya genen. Detta betyder att endast mellan 1–av de ägg som mikro- injicerats leder till ett genetiskt modifierat djur (M. , Transgenesis and Animal Welfare, Implications of transgenic procedures for the well-being of the laboratory mouse, , , 2001, s. 16, J. Hau och G. L. van Hoosier, red., Handbook of Laboratory Animal Science, uppl. 2, vol. 1, Essential Principles and Practices, CRC Press, 2003, s. 207 och J. och T. B. Mepham, Transgenesis and Animal Welfare, artikel i . 23, 1995, s. 385). finns det med mikroinjiceringsmetoden inte möjlighet att närmare kontrollera det antal kopior av en gen som tas upp och var i arvsmassan de hamnar. Hos de möss som tagit upp den nya genen inlemmas genen därför i olika antal och på olika plats i arvsmassan. I vilken mängd och var i arvsmassan en gen hamnar har betydelse för det uttryck som genen ger. Detta medför att varje avkomma hos vilken den genetiska modifieringen lyckats i princip är unik. De avkommor som ger ett uttryck av den nya genen som är intressant från forskningssynpunkt används därför som grundare (s.k. founder) av en egen separat linje att avla vidare på. Djuren inom en linje har alla genen på samma plats i arvsmassan. Genuttrycket är också detsamma hos djuren i linjen. En schematisk bild av framställning av djur med metoden med mikroinjicering finns på betänkandets omslag. En annan metod för att föra in en främmande gen i arvsmassan hos en organism är att använda s.k. retrovirus. Retrovirus är en familj virus som kan smitta ryggradsdjur. När man använder denna metod Metoder för att framställa genetiskt modifierade djur sätter man med hjälp av en viss teknik in den nya genen (eller DNA:t) i generna på ett virus. Ett embryo tas genom operation ut ur en mushona och infekteras med viruset. Det nya DNA:t förs alltså över och integreras i embryots arvsmassa med virusets hjälp. Efter att embryot infekterats sätts det in i en annan mushona (en fostermoder) som sedan kan föda fram ungarna på naturlig väg när embryot är färdigutvecklat. 6.3Användning av embryonala stamceller – ES- cellmetoden ES-cellmetoden används framför allt när man vill ersätta eller slå ut en gen hos en individ. Metoden kan dock användas även om man vill föra över en ny gen men eftersom metoden är både tidskrävande och komplicerad brukar oftast någon av de tidigare nämnda metoderna användas när målet är att enbart föra över en ny gen. De huvudsakliga skälen till att man vill byta ut eller slå ut gener är att man vill kunna studera hur en organism fungerar om den helt saknar vissa gener och att kunna studera hur s.k. recessiva gener fungerar. För att en dominant gen skall komma till uttryck behöver den endast finnas i en av kromosomerna i ett kromosompar. När man vill studera dominanta gener räcker det därför ofta att tillföra djuret en dominant gen som kan ta över funktionen från individens egna gener. För att kunna studera recessiva gener räcker det dock inte att föra över nytt DNA utan individens egna gener måste också slås ut eller ersättas. För att kunna studera recessiva gener måste man därför kunna föra in gener på ett mer preciserat sätt. Det är möjligt med hjälp av ES-cell metoden tillsammans med en metod som kallas riktad genöverföring. Framställning av möss med hjälp av dessa metoder är dock en lång och omständlig process som innehåller många steg. När ES-cell metoden används utnyttjar man embryonala stamceller, s.k. ES-celler, för att föra över den nya genen till ett mottagande djur. ES-cellerna kommer ursprungligen från mus- embryon som befinner sig i ett tidigt stadium av sin utveckling. För att få tag i ES-celler avlivas en befruktad hona och embryona operas ut. Från den inre cellmassan hos dessa embryon isoleras sedan ES- cellerna. ES-cellerna kan odlas – dvs. mångfaldigas och hållas vid liv Metoder för att framställa genetiskt modifierade djur i glaskärl – om man håller cellerna under betingelser som är gynnsamma för dem. Det är svårt att ta fram ES-celler och därför väljer många forskare att köpa sina ES-celler från företag eller laboratorier som har specialiserat sig på sådan cellodling. Själva överföringen av den nya genen görs i ett provrör eller ett glaskärl genom att man låter kopior av genen simma tillsammans med ES-cellerna i en vätska. En elektrisk stöt skickas genom vätskan och stöten förmår ES-cellerna att öppna sina cellmembran så att den främmande genen kan tas upp i ES-cellens egna arvs- massa. För att få den överförda genen att hamna på en bestämd plats arvsmassan använder man sig av riktad genöverföring (homolog rekombination). Vid riktad genöverföring utnyttjar man en naturlig egenskap hos kromosomer att byta motsvariga (homologa) DNA-avsnitt med varandra. Genom att tillsammans med den nya genen föra över ett exakt likadant avsnitt av DNA som omger den gen som man vill föra över till den mottagande ES-cellen kan man få den nya genen att söka sig till den bestämda plats i ES-cellens arvsmassa där motsvarande DNA-avsnitt finns. Tekniken är så precis att man kan få den nya genen att söka sig till en bestämd plats i en kromosom eller till och med till ett bestämt baspar. Om man vill kan man genom att föra in en ny gen ersätta djurets befintliga gener. Den nya genen som man för över till djuret måste då vara mycket lik den gen man vill ersätta. Om den är det kan den nya genen helt enkelt byta plats med den ursprungliga genen och ta över den ursprungliga genens funktion. Om man istället vill slå ut den ursprungliga genen görs detta genom att man ersätter den ursprungliga genen med en ny gen som är skadad eller på annat sätt inte fungerar. Till den målsökande genkonstruktionen som förs över till ES- cellerna fogar man en s.k. selektionsmarkör. En sådan markör består av en gen som tillför någon form av motståndskraft som gör att cellerna reagerar när man tillför dem det ämne som genen är motståndskraftig mot. De celler som reagerar analyseras sedan med DNA-analystekniker (Southern blotting eller PCR-metoden, se mer om dessa i kap. 7) så att man kan se hur många kopior av genen som cellen har tagit upp och var i arvsmassan som de har hamnat. Även om ett byte av en naturlig, ursprunglig gen mot en ny målsökande gen inträffar mycket sällan (i av fallen) har Metoder för att framställa genetiskt modifierade djur ES-cell metoden en fördel i förhållande till mikroinjiceringen och användningen av retrovirus. Den gör det möjligt att kontrollera hur stort antal gener som tagits upp av varje cell och om den nya genen tagits upp på avsett ställe i cellens kromosomer. Eftersom genöverföringen sker i en cellkultur kan man nämligen redan i provröret skilja ut de celler som har tagit upp genen på rätt ställe i arvsmassan och endast använda dem när nästa steg påbörjas i processen med att framställa de genetiskt modifierade djuren (M. , Transgenesis and Animal Welfare, Implications of transgenic procedures for the well-being of the laboratory mouse, , , 2001, s. 18). Sådana ES-celler som tagit upp genen på avsett ställe i arvs- massan injiceras i ett nytt, växande musembryo som är några dygn gammalt. Embryot tas från en på naturlig väg befruktad hona som avlivas i samband med att embryot opereras ut. Till varje embryo injiceras ca 10–15 ES-celler. Rent tekniskt liknar injektionen den mikroinjektion som har beskrivits tidigare. Vid ES-cellmetoden används dock en grövre glasnål. Det växande embryot som alltså delvis består av ES-celler med den nya genen, opereras in i livmodern på en ny mushona (fostermoder) och honan kan sedan föda fram ungarna på naturlig väg. En önskvärd kullstorlek är 5–10 avkommor. Om en mushona får färre ungar än så kan avkommorna bli så stora att honan skadas och vissa honor bryr sig inte om ungarna om kullen är för liten. Om kullen blir för stor kan några av ungarna bli underviktiga vilket kan leda till att de blir sterila. Normalt sett behöver man föra över mellan 12–25 embryon per fostermoder för att uppnå den önsk- värda kullstorleken (BVAAWF/FRAME/RSPCA/on Refinement, Refinement and reduction in production of genetically modified mice, supplement 1, till Laboratory Animals, vol. 37, juli, 2003, s. 25). En del av de över- förda embryona kommer nämligen inte att klara sig. Hur många som klarar sig beror bl.a. på vilken gen som berörts av den genetiska modifikationen och var genen har hamnat i genomet. I en studie genomförd på 17 olika linjer av djur framställda med ES-cell metoden överlevde och utvecklades i genomsnitt av de injicerade embryona till levande individer (J. och T. B. Mepham, Transgenesis and Animal Welfare, artikel i . 23, 1995, s. 385). En musunge från ett med ES-celler injicerat embryo blir en s.k. mosaik eller chimär, dvs. en individ vars organ och vävnader är Metoder för att framställa genetiskt modifierade djur sammansatta av två typer av celler med olika arvsmassa. En del celler härstammar ju från embryot självt medan andra härstammar från de ES-celler som injicerades i embryot innan de fördes över till fostermodern. Cirka 25–av de embryon som leder till fullt utvecklade individer resulterar i en mosaik/chimär (M. , Transgenesis and Animal Welfare, Implications of transgenic procedures for the well-being of the laboratory mouse, , , 2001, s. 19 och J. och T. B. Mepham, Transgenesis and Animal Welfare, artikel i . 23, 1995, s. 385). Hos några av dessa ungar kommer de modifierade ES-cellerna att hamna i könscellerna. De djur som har fått ES-celler i sina könsceller kan, om de paras, föra den nya genen vidare till sin avkomma. En schematisk bild av framställning av djur med ES-cellmetoden finns på betänkandets baksida/omslag. Denna metod för att modifiera djurs arvsmassa används främst för att studera hur olika celler i kroppen specialiseras – blir till nerv- celler, hudceller, etc. – under utvecklingen från befruktat ägg till en fullt utvecklad individ. Man opererar från livmodern på möss ut befruktade ägg som endast har hunnit genomgå ett litet antal delningar, mellan 4–6 del- ningar, så att embryot endast består av mellan 8–32 celler. Två sådana cellklumpar som kommer från två skilda individer med olika föräldrar fogas samman till en cellboll som opereras in i livmodern hos en fostermoder. Där utvecklas en unge som alltså har fyra biologiska föräldrar och en fostermoder. Musungen kommer att bestå av två typer av celler, en uppsättning celler från vardera embryot som i sin tur har fått hälften av sina arvsanlag från vardera föräldern, precis som vid framställning av mosaiker med ES-cell- metoden. Med metoden är det inte bara möjligt att göra mosaiker bestående av celler från samma art utan även mosaiker som har celler från två olika arter, t.ex. får–get och får–ko (SOU 1984:88, s. 36). Metoder för att framställa genetiskt modifierade djur Det är också möjligt att genom en viss metod för kloning, s.k. somatisk kärnöverföring, framställa genetiskt modifierade djur. Själva tekniken för somatisk kärnöverföring beskrivs i kapitlet om kloning. Tekniken innebär i korthet att man tar ut cellkärnan från ett obefruktat ägg och i ägget för in en cellkärna från en vanlig kroppscell, t.ex. en juvercell som i fallet med det klonade fåret . Ägget med den nya cellkärnan förmås att dela på sig och leda till utvecklingen av ett embryo. Embryot opereras in i en fostermoder som, när avkomman är fullt utvecklad, kan föda fram den på naturlig väg. När tekniken används för att framställa genetiskt modifierade djur använder man cellkärnor från celler som odlats i provrör och vars arvsmassa har förändrats genom genöverföring under odlingen. Somatisk kärnöverföring kan möjligen bli av stort intresse för framställningen av genetiskt modifierade djur då den på samma sätt som ES-cell metoden utförs i provrör med odlade celler där celler som har fått den eftersökta förändringen kan identifieras. Problemet är dock att denna metod, likväl som de andra metoderna för kloning, är mycket ineffektiv (H. Rodriguez- , Kloning av djurceller – önskvärda och möjliga tillämp- ningar?, artikel i skogs- och lantbruksakademiens tid- skrift nr 12, 2002, s. 16). 7Karaktärisering – kontroll av om den genetiska modifieringen lyckats När man har genomfört någon form av genetisk modifiering av ett djur behöver man innan individen kan användas i forskning dels kontrollera att en genetisk förändring verkligen har skett och dels att denna förändring också fungerar (uttrycks) hos individen. I detta ingår bl.a. att försöka utröna om djuret är användbart för den forskning som det är framställt för att användas i. Kontroller av detta slag kallas med en gemensam beteckning för karaktärisering. Det är viktigt att förstå att frågan om genen alls har tagits upp, ersatts eller slagits ut är skild från frågan om och i så fall hur väl genen verkligen kommer till uttryck. Även om själva ändringen av ett djurs genetiska sammansättning lyckats är det inte säkert att det nya genetiska materialet kommer att fungera hos djuret. Om genen t.ex. hamnar på ett olämpligt ställe i arvsmassan, exempelvis på ett sådant ställe att den klyver en annan gen, kan de effekter man ser hos djuret bero på detta snarare än på den nya genen i sig. Om genen tas upp på en olämplig plats i arvsmassan kan den ge upphov till skadliga förändringar hos djuret, t.ex. aktivera vilande sjuk- domsframkallande gener hos det. Det är därför viktigt att under- söka om de eventuella effekter man ser hos djuret orsakats av någon annan faktor än genförändringen i sig. 7.1Genotypning – kontroll av den genetiska uppsättningen Kontrollen av om införandet, ersättandet eller utslagningen av en gen har lyckats görs genom att man analysera djurets genetiska uppsättning (genotyp). När djur med förändrad arvsmassa framställs genom ES- cellmetoden eller genom sammanslagning av embryon är den första generationen avkommor s.k. mosaiker/chimärer. Om man vid framställningen använder sig av djur med olika pälsfärg kan man Karaktärisering - en kontroll av om den genetiska modifieringen lyckats med blotta ögat se vilka av avkommorna som i denna den första generationen har fått den eftersökta modifieringen i sin arvsmassa eftersom även anlag för pälsfärg är dominanta respektive recessiva. pälsfärg är t.ex. dominant över svart pälsfärg. Om man t.ex. väljer att ta ES-cellerna från musföräldrar med brun pälsfärg och det mottagande embryot från musföräldrar med en annan pälsfärg, t.ex. svart, kommer avkommorna som har celler från båda föräldraparen (mosaikerna/chimärerna) att bli fläckiga. Hos någon av de fläckiga ungarna kommer de modifierade ES- cellerna att hamna i könscellerna och dessa djur kan då föra den genetiska förändringen vidare i arv till sina avkommor. Andra djur än mosaikdjur/chimärdjur (och deras avkommor i första generationen) kan man inte kontrollera enbart genom att titta på pälsfärgen. Hos de andra djuren måste man undersöka arvsmassan för att se om förändringen har lyckats. Detta görs framför allt genom att man tar en liten bit vävnad (biopsi) från djuren och analyserar dess DNA. DNA:t analyseras med någon av de särskilda analysteknikerna som finns för ändamålet, Southern blotting eller PCR-metoden. Analysteknikerna ger svar i form av synliga band på en bild. Om den nya genen har tagits upp i cellerna hos avkomman kan man se den nya genen som ett streck på bilden. Om en befintlig gen har slagits ut kan man konstatera att det ställe på bilden där den aktuella genen borde ha visat sig saknar ett streck. Om ett streck saknas vet man med säkerhet att man har lyckats slå ut den aktuella genen. För att vara säker på i vilken omfattning en ny gen har slagit igenom använder man sig av de mendelska arvslagarna1 och låter para djuren för att studera hur många av avkommorna som ärver förändringen. Endast om djurets samtliga avkommor bär på den nya genen kan man vara säker på att det är homozygot.