كان المرشح المثالي لزواج من إيزابيلا هو شارلكان ابن خالتها الملكة خوانا الأولى وزوجها فيليب الرابع دوق بورغندي، أن هذا الزواج سيجلب تحالف قوي بين ممالك اسبانيا والبرتغال وكان وفقا لرغبات أجدادهم إيزابيلا الأولى من قشتالة وفرناندو الثاني من أراغون: سيؤدي ذلك إلى تسهيل مواصلة استكشاف المحيطات دون تكبد الاشتباكات، بحيث أن البرتغال هي القوة البحرية الوحيدة التي يمكن أن تشكك بتفوق إسبانيا في المحيط الأطلسي، بالإضافة إلى أن شارلكان كان ملكًا لممالك متعددة، كان من الضروري أن تقع البرتغال (أغنى ممالك في العالم المسيحي) في مدار إسبانيا وليس فرنسا كما حدث في حرب الخلافة القشتالية،، نظرًا لأن شارلكان نشأ في بورغندي ، فقد أصر النبلاء ورعاياه الإسبان على الزواج أميرة من شبه الجزيرة الأيبيرية، ومع ذلك لم يكن الملك البالغ من العمر ثمانية عشر عامًا على عجلة من أمره للزواج، فبدلاً من ذلك أرسل أخته إليونور للزواج من والدها الأرمل في عام 1518، لاحقاً تم إقناعه من قبل مستشاريه وخاصة الفلمنكي ويليام دي كروي باستبدال التحالف البرتغالي بتحالف مع إنجلترا، وبذلك أصبح في عام 1521 مخطوباً لابنة خالتها ماري تيودور ابنة هنري الثامن وخالتهم كاثرين والتي كانت تصغرها بعديد من السنوات وما زالت طفلة آنذاك، سعى قراره بتكوين تحالف بين إنجلترا وفرنسا الذي صاغه الكاردينال الطموح توماس وولسي، في البرتغال اعتبر الكثيرون رفضها لانفانتا بمثابة إهانة، ولكن إيزابيلا ظلت مصممة على أنها لن تتزوج إلا من ابن خالتها القوي وإلا ستدخل الدير، بحلول عام 1525 لم يعد شارلكان مهتمًا بالتحالف مع إنجلترا وبحيث لم يعد بإمكانه الانتظار حتى تكبر ماري لأنه كان مصممًا على إنجاب أبناء. وبذلك تم إلغاء خطوبته وتخلي عن تحالفه مع إنجلترا، وسعى أخيرًا للزواج من إيزابيلا. كان هناك العديد من مزايا - كانت أقرب إليه في العمر (كانت تصغره بثلاث سنوات فقط) وكانت تتقن الإسبانية بطلاقة، وقدمت مهرًا قدره 900000 كروزادو برتغالي أو فولدز قشتالية وهي أكثر من المتوقع، وكان كافٍ لحل العديد من مشاكله المالية بسبب الحرب الأخيرة، لم يهدر شارلكان أي وقت في الحصول على إعفاء بابوي من الزواج أبناء العمومة الأوائل وتم عقد الزواج من أجل التحالف مع البرتغال، وكذلك تزوج شقيقها جواو الثالث ملك البرتغال من أخته الصغرى كاثرين من النمسا، كان الإمبراطور الشاب عازماً على ترك زوجته تحكم كوصية في بينما ذهب إلى أوروبا الوسطى للتعامل مع المشاكل السياسية والدينية هناك، مع يناير 1526 سافرت إيزابيلا إلى إسبانيا لدى وصولها التقت مع دوق كالابريا ورئيس أساقفة طليطلة ودوق بيخار على الحدود الاسبانية البرتغالية الذين رافقوها حتى إشبيلية وانتظرت شارلكان لمدة أسبوع، في النهاية أقيم حفل زفافهما في اليوم التالي مباشرة بعد منتصف ليلة 11 مارس في قصر المورق بإشبيلية، على الرغم من أن زواجهما كان مرتباً سياسيًا، إلا أن إيزابيلا أسرت زوجها الذي مكث معها لفترة أطول مما كان متوقعًا بحيث قضوا شهر العسل لعدة أشهر في قصر الحمراء بغرناطة، حيث أحضر معه شارلكان بذور زهرة فارسية لم يسبق لها مثيل في إسبانيا. نمت البذور في النهاية إلى القرنفل الأحمر والتي أسعدت إيزابيلا كثيراً أمر زوجها بزراعة آلاف منها تكريماً لها، وأصبح لاحقاً القرنفل الأحمر زهرة إسبانيا الوطنية، على الرغم من المودة المتبادلة بين الزوجين، إلا أن زواجهما لم يكن سهلاً، استمر غياب شارلكان من عام 1529 إلى أبريل 1533، وبقى في إسبانيا لمدة عامين، ثم غادر مرة أخرى في ديسمبر 1536. على الرغم من عودته لفترة وجيزة في عام 1538 إلا أنه غادر على الفور تقريبًا وعاد في نوفمبر 1539، وفقًا لما اتفق عليه النبلاء نشأ أطفالهم في إسبانيا بحيث أشرفت إيزابيلا على تعليمهم وبحيث علمتهم اللغات منها اللغة البرتغالية، وكانت تكتب إلى زوجها بانتظام، ولكنها غالبًا ما تقضي شهورًا دون تلقي رسائل.