领域：学术论文 · 自然科学

TERT在调控核苷酸添加持续性中发挥作用这一观点已获得充分支持。大量分析得出的核心结论是，在核苷酸添加持续性的决定因素方面，TERT与典型逆转录酶（RTs）在机制上具有高度的保守性。
对逆转录病毒RTs的既往研究表明，保守的RT基序1、2、B、C、E以及“拇指”结构域均参与持续性调控。除少数例外情况，TERT中相应的类似结构已被证实在持续性控制中具有相似作用。
TERT中三个保守的RT基序对维持最佳持续性至关重要，其中两个位于推测的“手指”结构域（基序1和2），一个位于“手掌”与“拇指”结构域的界面（基序E）。酵母和四膜虫中这些基序的许多点突变，都会导致连续核苷酸添加出现预期的功能损伤。重要的是，在保守位置上，端粒酶和逆转录病毒RTs要优化持续性，都需要完全相同的残基，这表明二者在机制上具有高度的保守性。例如，将酵母TERT的基序E中两个残基替换为HIV-1 RT对应位置的氨基酸，会使酵母端粒酶的持续性增强。HIV-1 RT转录复合物的晶体结构显示，保守的RT基序要么与三磷酸核苷酸结合（基序1和2），要么与引物末端结合（基序E），它们通过促进底物结合来调控持续性，这一作用机制不难理解。
对保守基序C的分析显示，其在机制保守性方面的情况更为复杂。该基序包含两个恒定的天冬氨酸（Asp）残基，这些残基对金属离子结合和聚合酶化学反应至关重要。逆转录病毒RTs中，Asp对前的两个残基通常是大型疏水氨基酸，但在TERTs中变异性更大。将四膜虫TERT第813位（位于两个保守天冬氨酸前两位）的亮氨酸替换为逆转录病毒RTs特有的酪氨酸，得到的酶持续性增强。相反，将Est2p中Asp对前的两个残基替换为酪氨酸和苏氨酸，会导致持续性显著降低。这些结果表明，基序C对持续性的影响是通过其整体构象和化学反应介导的，而非单个氨基酸。在HIV-1 RT的晶体结构中，Asp对前两位的酪氨酸与DNA引物中倒数第二个核苷酸结合，这为其影响持续性提供了一种合理机制。将TERT中两个天冬氨酸前的残基替换为甲硫氨酸（HIV-1 RT中存在该残基且与引物末端相互作用），这一实验值得关注。不过，HIV-1 RT中该残基的突变似乎不影响聚合功能，但会降低DNA合成的保真度。
另一组与核苷酸添加持续性相关的残基位于C端结构域。尽管该区域的序列保守性较弱，但酵母和人类TERT的该结构域中，多个突变都会损伤核苷酸添加持续性，这与功能保守性相符。与典型RTs类比，TERT的该结构域被认为构成端粒酶的“拇指”结构域。C端突变对Km值、端粒酶-底物稳定性的影响，以及酵母TERT该结构域具有弱核酸结合活性的证实，进一步支持了这一观点。由于重复添加持续性是端粒酶特有的生化属性，自然会推测端粒酶特异性结构负责这一活性。事实上，已证实能促进重复添加的三组TERT残基，虽分布于RT结构域内外，但主要局限于端粒酶特异性基序中。以下将分别对这些残基进行讨论。
首先，如前所述，与典型RTs相比，TERT的RT结构域在保守基序A和B之间存在一个大的插入片段，即IFD（插入结构域）。在酵母端粒酶中，该结构域的特定突变会导致重复添加缺陷，并显著降低端粒酶对DNA底物的Km值。然而，酵母端粒酶在体外的重复添加水平天然极低。因此，评估四膜虫和人类等持续性更强的端粒酶中，相应残基的作用具有重要意义。
第二组与重复添加相关的残基位于人TERT（hTERT）的C端结构域。如前所述，该结构域被认为构成端粒酶的“拇指”结构域。尽管酵母和人类TERT的C端结构域中，许多突变主要损伤核苷酸添加持续性，但hTERT该结构域的几个缺失突变也会降低重复添加，这表明人类端粒酶的“拇指”结构域具有额外功能。
最后一组有助于重复添加持续性的残基，定位于hTERT的RID1结构域和酵母TERT的同源N-GQ结构域。多项研究表明，该结构域的缺失和点突变会选择性损伤重复添加持续性，并降低端粒酶延伸部分或完全非端粒引物的能力。突变体对端粒DNA的表观Km值也会降低，这再次表明RID1/N-GQ结构域有助于DNA结合。
与TERT促进重复添加的作用相关的，是端粒酶酶学中的一个经典问题，即锚定位点的身份。对纤毛虫和人类端粒酶的早期功能分析表明，端粒酶包含第二个不依赖模板的DNA底物结合位点。该位点（也称为锚定位点）的存在，是通过5' DNA底物序列对酶的重复添加持续性、结合亲和力和催化速率的影响推断得出的。随后，利用绿草履虫（*E. aediculatus*）和酿酒酵母（*S. cerevisiae*）来源的酶进行的交联实验，确定了TERT大小的蛋白质负责与DNA的5'区域物理接触。进一步研究表明，锚定位点在功能上可分为模板近端和模板远端位点，且可能只有前者对重复添加持续性是必需的。RID1/N-GQ结构域对重复添加持续性和DNA底物识别的作用表明，该结构域可能构成模板近端锚定位点。酵母TERT上DNA交联位点的近期蛋白水解图谱支持了这一观点。已知hTERT的RID1结构域是与端粒酶RNA的假结-模板区域相互作用的位点，该区域也与促进重复添加持续性有关。蛋白质和RNA结构域在锚定位点功能中的相对作用及其相互影响，值得进一步研究。
由于端粒酶合成端粒DNA重复序列需要TERT和RNA组件，因此这两个组件的稳定组装对酶活性至关重要。已证实TERT的两个结构域介导与端粒酶RNA的相互作用。一个亲和力较高的RNA结合结构域对应于N端延伸区（NTE）的C端部分，该部分包含三个保守的端粒酶特异性基序，分别命名为CP、QFP和T。在酵母、人类和四膜虫中，NTE的这部分已被证明与端粒酶RNA相互作用。令人惊讶的是，尽管该结构域在所有TERT中显然构成高亲和力RNA结合结构，但在不同生物中，它似乎与端粒酶RNA的不同靶标相互作用。在酵母中，包含潜在茎环/假结结构的区域被确定为TERT结合所必需；在人类中，远离模板的保守CR4-CR5区域是高亲和力结构域的靶位点；在四膜虫中，TERT结合需要RNA模板5'侧的几个核苷酸以及茎II，且似乎不涉及保守的假结。保守的蛋白质结构域识别明显不同的RNA结构，这一现象难以解释。一种可能的解释是，CP基序N端的蛋白质区域发挥了作用。酵母、人类和四膜虫TERT的高亲和力RNA结合结构域似乎延伸到这一保守性较低的区域，该区域具有物种特异性特征。因此，高度保守的基序可能形成一个共同的支架，物种特异性结构附着其上，以介导对不同RNA靶标的识别。除了促进端粒酶RNP的稳定组装外，四膜虫的RNA结合结构域还有一个额外作用：帮助确定模板的5'边界。减弱这种相互作用会导致逆转录显著超出正常模板边界。探究其他TERT中的类似突变是否也会影响模板边界的确定，将是一件有趣的事。
第二个亲和力较低的RNA相互作用显然由RID1/N-GQ结构域介导。同样，不同生物中该结构域的RNA靶标也不同。四膜虫的RNA靶标包含一个茎环和模板3'端紧邻的一段区域（称为模板识别元件）；人类的靶标似乎位于假结-模板结构域，而酵母的靶标尚未确定。如前文所述，RID1/N-GQ结构域已被证明能促进重复添加持续性和酶互补，还需进一步研究以确定RNA相互作用在这些功能中的作用。



翻译考点：
考点1： “逆转录酶” 推荐译为 “reverse transcriptase (RT)”
考点2：“三磷酸核苷酸” 推荐译为 “nucleotide triphosphate”
考点3： “端粒DNA” 推荐译为 “telomere DNA”
考点4：文中的 “典型逆转录酶” 描述的是逆转录酶中的原型代表，在原文的语境中强调酶的“原型和典型”，需要翻译为 “prototypical RTs”，不可以翻译为 “canonical reverse transcriptases”。
考点5： “HIV-1 RT转录复合物” 推荐译为 “HIV-1 RT reverse transcription complex”，避免将“逆转录”误译为“转录”。
考点6： 首次出现“三磷酸核苷酸”应使用“nucleotide triphosphate”，不要用“nucleoside triphosphate”除非上下文明确强调核苷而非核苷酸。
考点7： “IFD” 全称推荐译为 “insertion in fingers domain (IFD)” 或 “insertion domain (IFD)”，首次出现需给出全称及缩写并全文统一。