Xác định loại vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm gram

Bài viết được tham vấn chuyên môn cùng Thạc sĩ, Bác sĩ Trần Thị Vượng - Bác sĩ Xét nghiệm vi sinh - Khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Hải Phòng. Thực tế có nhiều cách để xác định loại vi khuẩn, trong đó nhuộm gram là phương pháp được sáng chế năm 1884 và vẫn có giá trị cho đến ngày nay để phân loại vi khuẩn nhanh thành 2 nhóm lớn với đặc tính riêng biệt.
 1. Phương pháp nhuộm gram là gì?
 Nhuộm gram là phương pháp dựa trên đặc tính lý hóa của thành tế bào mà phân loại vi khuẩn thành 2 loại là vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương. Nhuộm gram có thể được thực hiện trên cả dịch cơ thể hoặc trên mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn.Nhuộm gram là phương pháp xác định loại vi khuẩn nhanh hơn nuôi cấy có ý nghĩa giúp phân biệt sớm các bệnh do nhiễm khuẩn để xác định hướng điều trị cũng như tiên lượng bệnh. Các thuốc thử cần sử dụng cho phương pháp này gồm có:Dung dịch tím GentianDung dịch LugolTẩy cồn Acetone Dung dịch đỏ Fuchsin     Nhuộm gram có thể xác định được loại vi khuẩn gram âm hay gram dương nhanh hơn phương pháp nuôi cấy  2. Quy trình nhuộm gram
 Quy trình nhuộm gram sẽ gồm các bước sau:Dàn đều bệnh phẩm hoặc vi khuẩn lên lam kính sạch;Cố định mẫu bệnh phẩm bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội;Các bước nhuộm:Đầu tiên phủ dung dịch tím Gentian và để khoảng 30 giây sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. Bước này sẽ giúp nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tímTiếp theo phủ dung dịch Lugol để cố định màu, cũng để khoảng 30 giây rồi rửa dưới vòi nước. Dung dịch sẽ giúp gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tùy thuộc vào loại của nóTẩy màu bằng cồn acetone để khoảng 30 giây và rửa nước. Đây là bước rất quan trọng để phân biệt loại vi khuẩn đã được dung dịch Lugol gắn chắc màu tím vào và loại màu tím bị tẩy trôiCuối cùng phủ dung dịch đỏ Fuchsin để khoảng 30 giây rồi rửa dưới vòi nước sẽ làm các vi khuẩn đã được tẩy hết màu tím bắt lại màu đỏ, những vi khuẩn đã bị nhuộm tím sẽ không bị ảnh hưởng.Để khô tự nhiênSoi dưới vật kính dầu
 3. Cơ chế bắt màu gram của 2 loại vi khuẩn và kết quả thu được
 Vi khuẩn có đặc điểm là lớp peptidoglycan dày ở thành tế bào giúp giữ các phức hợp tím tinh thể nên sau khi nhuộm gram sẽ bắt màu tím sẫm Gentian và không bị tẩy màu sau dùng cồn tẩy 950. Những vi khuẩn này sẽ được phân loại là vi khuẩn gram dương như: tụ cầu, phế cầu, liên cầu,...Vi khuẩn có lớp peptidoglycan mỏng hơn và có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iod và sẽ bị khử màu. Sau đó khi dùng dung dịch Fuchsin phủ lên thì những vi khuẩn này sẽ bắt màu đỏ hoặc hồng. Các vi khuẩn này sẽ được phân loại là vi khuẩn gram âm.Như vậy có thể thấy bước tẩy màu rất quan trọng và cần phải có kỹ năng nhất định vì khả năng bắt màu của Gram dương không phải là tuyệt đối.     Vi khuẩn tụ cầu được phân loại là vi khuẩn gram dương sau khi nhuộm gram  4. Các lưu ý về nguyên nhân gây sai lệch kết quả
 Vi khuẩn gram dương giả do các yếu tố sau:Tiêu bản được cố định khi chưa khô hoặc quá dàyMàu của cặn thuốc nhuộm gây sai lệch kết quảLugol chưa được đổ hết để cố định màuCổn tẩy chưa đủ thời gian để phân biệt chính xácDung dịch Fuchsin quá đậm hoặc nhuộm quá lâuVi khuẩn gram âm giả do các nguyên nhân như không thay Lugol hoặc tẩy cồn quá lâu và không tráng kỹ.  Sự khác nhau giữa vi khuẩn và virus