Tầm quan trọng của xét nghiệm xác định nồng độ nội độc tố vi khuẩn

Bài viết bởi ThS. Nguyễn Đắc Tú, Trưởng nhóm Đánh giá Chất lượng Sản phẩm Trung tâm Công Nghệ Cao và ThS. Nguyễn Thị Mai, Chuyên viên xét nghiệm nội độc tố vi khuẩn, Trung tâm Công Nghệ Cao
 Nội độc tố vi khuẩn endotoxin khi xâm nhập vào máu hoặc dịch não tủy với nồng độ cao sẽ gây sốt, thậm chí shock nhiễm khuẩn, có thể dẫn tới tử vong. Nội độc tố lại rất phổ biến trong môi trường, không thể loại bỏ bằng các phương pháp khử trùng thông thường nên rất dễ nhiễm vào các sản phẩm như thuốc tiêm truyền, vaccine, thiết bị y tế, các sản phẩm sinh học như tế bào gốc, tế bào miễn dịch, sản phẩm của tế bào...Cần có phương án để kiểm soát, xác định nồng độ nội độc tố trong những sản phẩm này để đảm bảo an toàn khi sử dụng cho bệnh nhân.
 1. Khái niệm nội độc tố vi khuẩn
 Nội độc tố vi khuẩn là một dạng của chất gây sốt (pyrogen), bản chất là các lipopolysaccharides (LPS) có nguồn gốc từ thành ngoài vi khuẩn gram âm. LPS cấu tạo từ 3 phần: kháng nguyên -0 (0- antigen) phía ngoài cùng, lõi trong polysaccharides, và phần Lipid A chứa các axit béo, đây là phần chính quyết định độc lực của nội độc tố. Cấu trúc này rất cần thiết để duy trì tính toàn vẹn của thành tế bào và sự tồn tại của vi khuẩn gram âm. Các vi khuẩn này giải phóng ra môi trường một lượng nhỏ nội độc tố như là sản phẩm của quá trình trao đổi chất của chúng và lượng lớn nội độc tố được giải phóng khi thành tế bào bị hư hại hay khi vi khuẩn gram âm bị chết hoặc bị ly giải.     Nội độc tố vi khuẩn là một dạng của chất gây sốt (pyrogen), bản chất là các lipopolysaccharides (LPS) có nguồn gốc từ thành ngoài vi khuẩn gram âm  2. Sự nguy hiểm của nội độc tố vi khuẩn
 Nội độc tố là một chất kích thích mạnh đối với hệ miễn dịch bẩm sinh. Khi một lượng nội độc tố xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn cơ thể mà vượt quá ngưỡng cho phép theo quy định của FAD Hoa Kỳ, chúng kích hoạt phản ứng miễn dịch, thường là viêm, sản sinh ra các cytokine như interleukin 1 và yếu tố hoại tử khối u. Những tín hiệu tiết này thu hút bạch cầu trung tính di chuyển đến, kích hoạt cơ chế thực bào. Khi bệnh nhân có hệ thống miễn dịch kém, đã có bệnh nền hoặc bị nhiễm lượng lớn nội độc tố thì sẽ biểu hiện triệu chứng trên lâm sàng của shock nhiễm khuẩn gồm sốt, giảm huyết áp, giảm tuần hoàn ở các tổ chức, gây tổn thương các tổ chức mô cơ quan của cơ thể như tim, phổi, gan, thận,..hệ thống miễn dịch tiết ra enzyme tiêu diệt tế bào, rối loạn chuyển hoá do thiếu oxy tế bào, tổn thương tế bào nội mạc, tăng tính thấm thành mạch và có thể dẫn tới tử vong.
 3. Nội độc tố là một trong những mối nguy lớn nhất đối với sản xuất thuốc và sản phẩm sinh học
 Vì có nguồn gốc từ vi khuẩn, nội độc tố rất phổ biến trong không khí, nước, đất. Cộng với đặc tính bền với nhiệt độ (trí nhiệt tố) và khả năng trốn thoát khỏi những màng lọc có kích thước 0.2 μm nên các phương pháp khử nhiễm thông thường không thể loại bỏ được nội độc tố. Điều này có nghĩa là một sản phẩm được chứng nhận là vô khuẩn nhưng hoàn toàn có thể vẫn chứa nội độc tố trong đó. Chính vì sự phổ biến trong môi trường, khả năng bền nhiệt và chịu được các phương pháp khử khuẩn của các quy trình sản xuất dược, thuốc tiêm truyền, vaccine, thiết bị y tế và cả những sản phẩm sinh học như tế bào gốc, tế bào miễn dịch, chất tiết tế bào... kết quả là sản phẩm rất dễ bị nhiễm nội độc tố vi khuẩn. Đó cũng là lý do mà mọi bước trong quá trình sản xuất dược hay các sản phẩm sinh học phải thực hiện kiểm soát nội độc tố tại những thời điểm thích hợp, tối thiểu là sản phẩm cuối cùng trước khi sử dụng trên người.
 4. Những sản phẩm cần được kiểm tra nội độc tố theo quy định của FDA     100% các sản phẩm dược tiêm truyền, thiết bị vật tư y tế cấy ghép, sản phẩm cuối của các quá trình sản xuất sinh học mà có tiếp xúc với máu hay dịch não tuỷ phải xét nghiệm nội độc tố  100% các sản phẩm dược tiêm truyền, thiết bị vật tư y tế cấy ghép, sản phẩm cuối của các quá trình sản xuất sinh học mà có tiếp xúc với máu hay dịch não tuỷ phải xét nghiệm nội độc tố và nồng độ phải nằm trong giới hạn cho phép theo khuyến nghị của FDA. Có thể kể đến:Thuốc tiêm truyền (bao gồm cả nước cất pha tiêm)VaccineThiết bị y tế có tiếp xúc với mạch máuCác sản phẩm sinh học sử dụng đường truyền qua mạch máu hoặc dịch não tủy như tế bào gốc, tế bào miễn dịch, sản phẩm của tế bào, dung dịch protein.
 5. Giới hạn nội độc tố (Endotoxin limit: EL)
 Giới hạn Nội độc tố thường được quy định trong các chuyên luận riêng. Sản phẩm đạt yêu cầu nếu lượng nội độc tố có trong sản phẩm thấp hơn giới hạn qui định theo khuyến nghị của FDA Hoa Kỳ. Giới hạn nội độc tố được tính trên cơ sở liều dùng cho người theo công thức: EL=K/M. trong đó K là ngưỡng nội độc tố tính cho 1 kg cân nặng cơ thể người trong 1 giờ có thể chịu đựng được mà không xảy ra phản ứng độc hại. Liều này được hiểu là liều tối đa. Nếu một sản phẩm có thể được dùng theo cả 2 đường tiếp xúc là tĩnh mạch và dịch não tủy thì giới hạn nội độc tố được tính theo giá trị K của đường tiếp xúc có giới hạn nội độc tố thấp hơn, để khi dùng liều tối đa sản phẩm vẫn đảm bảo an toàn cho bệnh nhân. Giới hạn nội độc tố theo quy định được thể hiện chi tiết trong bảng:     Bảng thể hiện giới hạn nội độc tố theo quy định  6. Tầm quan trọng của xét nghiệm nội độc tố vi khuẩn tại các trung tâm ứng dụng liệu pháp tế bào
 Việc xử lý và nuôi cấy tế bào gốc, tế bào miễn dịch cũng như sản xuất các sản phẩm từ tế bào phục vụ cho trị liệu lâm sàng là một quá trình kéo dài trong đó những sản phẩm này đã tiếp xúc với rất nhiều loại vật tư tiêu hao như chai, đĩa nuôi cấy, pipet, màng lọc và hóa chất như môi trường nuôi cấy, đệm...Đây có thể là nguyên nhân làm tăng nồng độ nội độc tố vi khuẩn trong sản phẩm cuối cùng trước khi sử dụng cho bệnh nhân. Nếu không có biện pháp kiểm soát vấn đề này, sản phẩm tế bào được sử dụng không chỉ không có hiệu quả điều trị mà còn gây nguy hiểm cho người bệnh bởi lượng nội độc tố có trong đó. Đây là lý do mà những tiêu chuẩn quốc tế về liệu pháp tế bào như ISCT, FACT, AABB xếp xét nghiệm xác định nội độc tố vào danh mục bắt buộc cần kiểm tra cho các sản phẩm tế bào trước khi sử dụng cho điều trị. Dựa trên quy định của FDA về giới hạn nội độc tố vi khuẩn cho từng đường truyền và kết quả xét nghiệm xác định nồng độ nội độc tố, các bác sỹ sẽ có đủ cơ sở để tính toán được thời gian truyền thích hợp để đảm bảo sự an toàn cho bệnh nhân.Theo quy định của các tiêu chuẩn quốc tế về trị liệu tế bào như ISCT, FACT, AABB, xét nghiệm xác định nội độc tố được xếp vào danh mục bắt buộc cần kiểm tra cho các sản phẩm tế bào trước khi sử dụng cho bệnh nhân.Để có thể đảm bảo được sự an toàn cao nhất cho khách hàng theo các tiêu chuẩn quốc tế, Trung tâm Công nghệ Cao, Bệnh viện Vinmec Times City đã xây dựng và thực hiện xét nghiệm xác định nồng độ nội độc tố vi khuẩn cho các sản phẩm tế bào gốc và tế bào miễn dịch dựa trên phương pháp được FDA Hoa Kỳ cấp phép. Tài liệu tham khảo:USP, Chapter <85>, Bacterial endotoxin test, 161-167, U.S.Pharmacopeial convention, Rockville, MD,2015.USP 39, Chapter <161>, Medical devices- bacterial endotoxin and pyrogen tets, 219-222 , U>S>Pharmacopeial convention, Rockville,MD, 2016.FDA, guideline on validation of the limulus amebocyte lysate test as an end-product endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological products, and medical devices, 1987.Endotoxin limits for parenteral drug products, Bet white paper vol.1 no.2, 2017The Code of Federal Regulations, 21 CFR 211.167Dược điển Việt Nam, Phép thử nội độc tố Phụ lục 13.2Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Timothy J. Joiner Paul F. Kraus Thomas C. Kupiec, PhD Analytical Research Laboratories, Oklahoma City, Oklahoma. International Journal of Pharmaceutical Compounding Vol. 6 No. 6 November/December 2002