多重退火循環擴增法

多重退火循環擴增法 (Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles，縮寫MALBAC) 是一種準線性的全基因組擴增方法。與非線性或指數的傳統DNA擴增方法不同（在每個循環中，複製的DNA可以作為後續循環的模板），MALBAC利用特殊引物使擴增子具有互補末端以形成環狀，防止DNA被指數複製。這導致僅擴增原始基因組DNA，因此減少了擴增偏差。 MALBAC“用於鳥槍法生成有重疊、涵蓋大部分基因組的擴增子”。為了進行下一代測序，MALBAC完成後再進行常規PCR進一步擴增。

**技術平臺**
在進行MALBAC之前，需要通過各種方法分離單個細胞，包括激光捕獲顯微切割、微流體裝置、流式細胞術或微量移液，然後裂解。MALBAC單細胞全基因組擴增需要進行5個循環地淬滅、延伸、解鏈和成環。

**MALBAC引物**
MALBAC的主要優點是DNA幾乎呈線性擴增。使用專門的引物可以使擴增子形成環，從而防止它們在MALBAC的後續循環中進一步擴增。這些引物有35個核苷酸長，有8個可變核苷酸與模板互補結合，還有27個共有核苷酸。共有的核苷酸序列為：GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG。8個可變核苷酸與單鏈基因組DNA分子隨機退火結合。一次延伸後，產生僅在5'末端包含共有核苷酸序列的“半擴增子”。半擴增子後面用作另一輪延伸的模板，然後產生全擴增子，即3'端與5'端序列互補的擴增子。

**鏈取代**
MALBAC引物具有可變部分，可以隨機結合模板DNA。這意味著在任何循環的單個片段上，都可能有多個引物與該片段退火結合。DNA聚合酶，如源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的DNA聚合酶（Bst聚合酶），能夠取代遇到的沿同一方向延申的另一條鏈的5'末端上游的鏈。

**錯誤率**
Bst DNA聚合酶的錯誤率為1/10000鹼基。

**實驗工作流程**
MALBAC實驗的工作流程概述。
# 單細胞分離和裂解 – 從單細胞中分離出的pg級基因組DNA片段（10至100kb）用作模板。
# 熔解 – 在94°C時，雙鏈DNA分子會熔解成單鏈形式。
# 淬滅 – 熔解後，反應立即淬滅至0°C，並將MALBAC引物添加到反應中。
# 延伸 – Bst DNA聚合酶（大片段）在65°C下將引物延伸2分鐘，產生半擴增子。
# 熔解 – 將反應加熱至94°C，以將半擴增子與基因組DNA模板分離。
# 淬滅 – 反應在0°C下快速淬滅，然後加入相同的聚合酶混合物。MALBAC引物有效結合半擴增子和基因組DNA模板。
# 延伸 – Bst DNA聚合酶（大片段）在65°C下延伸引物2分鐘。在這一步，以半擴增子為模板的擴增為全擴增子，以基因組DNA為模板擴增為半擴增子。
# 熔化 – 將反應加熱至94°C以將擴增子與模板分離。
# 循環 – 對於完整的擴增子，3'末端序列現在與5'末端互補。在58°C時，兩端雜交形成環狀DNA。這可以防止完整的擴增子在隨後的MALBAC循環中用作模板。
# 重複步驟6-9 – 5輪的MALBAC線性擴增循環。
# 常規PCR – MALBAC產物通過PCR進一步擴增。通過使用27個常見核苷酸作為引物，只擴增完整的擴增子。
在PCR結束時，pg級的遺傳物質被放大為mg級的DNA，足以進行DNA測序。

**應用**
使用MALBAC檢測耐藥基因。
MALBAC提供了一種從單個細胞擴增DNA的無偏差方法。這種單細胞測序方法具有廣泛的應用，其中許多還有待開發。MALBAC可用於分析法醫標本、產前遺傳疾病篩查、瞭解生殖細胞的發育或闡明腫瘤的複雜性。在其基礎上，這項技術允許研究人員通過單個細胞觀察突變累積的頻率。此外，它允許檢測細胞內和細胞之間的染色體異常和基因拷貝數變異（CNV），並進一步幫助檢測導致單核苷酸多態性的不常見突變。
MALBAC在癌症研究領域有很多應用。它可用於檢查腫瘤內異質性，識別可能賦予侵襲性或轉移性表型的基因，或評估腫瘤產生耐藥性的可能性。MALBAC的一項開創性應用發表在2012年12月的《科學》期刊上，描述了使用該技術測量結腸癌細胞系SW4802的突變率。通過對三個同源結腸癌細胞與來自不同譜系的無關結腸癌細胞平行的擴增DNA進行測序鑑定了SNP，沒有檢測到假陽性。還觀察到在SNP中，嘌呤-嘧啶顛換的發生頻率很高。單個結腸癌細胞的拷貝數和單核苷酸變異的特徵突出了腫瘤內存在的異質性。
MALBAC被用作一種檢查生殖細胞之間遺傳多樣性的方法。通過對來自匿名捐贈者的99個人類精子細胞的基因組進行測序，MALBAC被用於檢查涉及單個配子的基因重組事件，來研究基因重組動態及其對男性不育的意義。此外，在單個精子中，MALBAC識別出重複或缺失的染色體，以及可能對生育能力產生負面影響的SNP或複製數變異。

**優點**
與其他單細胞測序技術相比，MALBAC取得了許多重大進展，最重要的是它可以報告一個人類細胞93%的基因組。該技術的一些優勢包括減少擴增偏差和增加基因組覆蓋率、需要很少的模板DNA、以及低假陽性和假陰性突變率。

**減少擴增偏差 增加基因組覆蓋率**
MALBAC擴增後進行全基因組測序，通過使用預擴增的準線性步驟減少了與指數PCR擴增相關的偏差。MALBAC利用5個循環的預擴增和包含27個核苷酸的共有序列、8個核苷酸的可變序列的引物來產生擴增的DNA片段（擴增子），這些片段會自我成環，防止額外的複製和交叉雜交。MALBAC期間，這些環不能用作擴增的模板，因此減少了與PCR中對DNA片段不均勻指數擴增產生的相關擴增偏差。MALBAC被描述為比其他單次測序方法（例如多重置換擴增，簡稱MDA）具有更好的擴增均勻性。MDA以指數方式擴增DNA，導致了偏差。因此，其他單細胞測序方法相關的擴增偏差導致了基因組的低覆蓋率。與其他單細胞測序方法相比，與MALBAC相關的偏差減少，使基因組序列覆蓋率上升。

**只需要很少的模板DNA**
當只有一個或幾個細胞可用時，MALBAC 可用於擴增DNA並隨後對其進行測序，例如用於分析血液中篩選出的腫瘤細胞、產前篩查或法醫樣本。啟動該過程只需要少量起始模板（pg級的DNA），因此它是對單個人體細胞進行測序的理想方法。

**假陽性、假陰性突變發生率低**
單細胞測序通常具有很高的假陰性突變率。假陰性突變率是指未檢測到真正突變的概率，這可能是由於等位基因丟失或脫落導致的擴增偏倚造成的。與其他單細胞測序技術相比，MALBAC的序列覆蓋均勻性增強了SNP的檢測並降低了等位基因丟失率。 當雜合子的等位基因無法擴增，導致檢測出“假純合子”時，等位基因丟失率會增加。這可能是由於DNA模板濃度低，或者模板擴增不均勻導致雜合子的一個等位基因被複制更多。與等位基因丟失率大約為65%的MDA相比，MALBAC要低得多（大約 1%）。與批量測序相比，MDA有41%的SNP檢測效率，而MALBAC有76%的SNP檢測效率。 據報道，MALBAC的假陽性率也很低。 MALBAC產生的假陽性突變主要是由 DNA聚合酶在第一個擴增循環中引入的錯誤造成的，並在隨後的循環中進一步複製。通過對源自單個細胞的譜系中的2-3個細胞進行測序以驗證SNP的存在，以及通過對來自單獨譜系的無關細胞進行測序來消除測序和擴增錯誤，可以消除假陽性。

**侷限**
 由於只需要少量的模板DNA，操作者或環境對目標DNA的汙染可能會混淆測序結果。- 為了完全排除假陽性，有必要將細胞測序結果與從同一譜系內的2-3個細胞獲得的結果以及來自不相關譜系的細胞進行比較。- 用於擴增模板DNA的DNA聚合酶容易出錯，並且會在MALBAC的第一個循環中引入測序錯誤，錯誤在後面的擴增中複製。- 使用MALBAC在單細胞水平上的基因組覆蓋率不如批量測序統一。雖然MALBAC提高了單細胞測序的檢測效率，但與批量測序相比，它無法檢測大約三分之一的SNP。

**參考資料**

**外部鏈接**
  Search: MALBAC - NCBI database-  Yikon Genomics: Whole Genome Amplification (WGA) and Multiple Annealing and Looping-based Amplification Cycles (MALBAC)