亞硫酸鹽定序

亞硫酸鹽定序（英語：bisulfite sequencing）是一種利用亞硫酸鹽處理，測定DNA甲基化情形的方法。DNA甲基化是最早被發現的表觀遺傳標記，也是被研究最為深入的表觀遺傳改變。原理在於亞硫酸鹽可使DNA上的胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U），同時已受甲基化的5-甲基胞嘧啶則不受影響。如此一來，就可以使實驗者得知DNA序列上甲基化的情形(Figure 2)。 對動物而言，DNA甲基化主要是指對CpG位點中胞嘧啶的五號碳上增加一個甲基的過程。DNA位點的甲基化可能對該基因的轉錄活性起到抑制作用。
使用亞硫酸鹽處理DNA會將胞嘧啶殘基轉化成尿嘧啶，但被甲基化的胞嘧啶殘基則不受影響；因此，被亞硫酸鹽處理後的DNA片段只保留甲基化的胞嘧啶。基於此原理，亞硫酸鹽能在單個核苷酸水平上揭示DNA的甲基化情況。有多種檢測方法可以實現對亞硫酸鹽處理後DNA序列的分析，分析的實際問題就是亞硫酸鹽使鹼基從C到U最終到T造成的區別（Figure 1）。

**方法**
亞硫酸鹽定序法是常見的檢測CpG位點甲基化情況的方法。其他非測序的檢測DNA甲基化策略主要是針對某個位點或全基因組水平的甲基化情況。所有的檢測策略都基於亞硫酸鹽已將全部未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶的前提。理論上說，檢測結果能將一對等位基因的甲基化情況分別展示出來。除下文介紹的檢測方法外，還有Combined bisulfite restriction analysis和甲基化DNA免疫沉澱等方法。
檢測亞硫酸鹽處理後DNA甲基化情況的手段仍在不斷發展中。檢測方法的研究方向分兩類，區別是是否採用甲基化特異性的PCR。（Figure  3&4）。以微陣列為基礎的檢測方法使用非甲基化特異性的PCR。

**基於非甲基化特異性PCR的檢測方法**

**直接定序**
第一個被報道的利用亞硫酸鹽檢測DNA甲基化的實例使用的方法。引子被設計成既有DNA序列特異性也有亞硫酸鹽特異性（也就是說引子序列中含有非CpG位點的胞嘧啶，這樣引子就不能和未經亞硫酸鹽處理的DNA片段結合），和需要檢測的甲基化位點臨近但不交叉。這樣設計的引子會同時擴增甲基化和非甲基化的序列（和甲基化特異性PCR不同）。PCR結束後，所有未甲基化的胞嘧啶都被顯示為胸腺嘧啶，而反義鏈的對應位置則是腺嘌呤。直接測序要求PCR的克隆產物prior to測序（為了獲得足夠的靈敏度），因此這種方法費時費力，且通量較低。巢式PCR（nested PCR）能提高擴增產物質量。
之後所有的檢測DNA甲基化技術都源於Frommer等人的成果。儘管有些其他方法都不是真正的測序技術，但“亞硫酸鹽測序”一般被用來指代此類檢測DNA甲基化的技術。

**焦磷酸測序**
焦磷酸測序也是非甲基化特異性PCR測序的一種類型。在PCR擴增目的片段之後，焦磷酸測序可以檢測出被亞硫酸鹽作用而改變的CpG位點。發生了從C到T轉變的位點可以由C和T的數量變化推出。該技術的主要問題在於成本較高且無法應用於高通量篩選。
對於此項技術的改進由wong等人報道：使用等位基因特異性的引物進行PCR，可以把單鏈和雙鏈的結果區分開來。這項技術對於基因銘印的檢測非常有效。

**甲基化敏感的單鏈構象檢測**
這項技術是以單鏈構象多態性檢測（single-strand conformation polymorphism, SSCA）為基礎發展而來。因為序列不同的DNA在未變性前會形成不同的二級和三級結構，SSCA可以將長度相同但序列不同的單鏈DNA在不變性的情況下通過凝膠電泳分離。SSCA對於只有一個核苷酸發生改變的兩條DNA鏈的敏感性較低；但在DNA甲基化的檢測中，往往有很多個胞嘧啶被轉化成胸腺嘧啶，所以SSCA的敏感度接近100%。同時該檢測手段還能根據DNA鏈的結合強度提供DNA的甲基化程度。這種方法主要獲得的是某個區域的總體而非某一具體位點的甲基化情況。

**高分辨率熔解分析**
高分辨率熔解（high resolution melting， HRM）分析是另一種從序列總體水平分析DNA甲基化水平的技術。HRM分析首先將PCR產物用飽和熒光染料充分染色。在對PCR的擴增產物逐漸升溫過程中，擴增子逐漸解鏈，隨著雙鏈DNA結構逐漸減少，熒光強度也逐漸降低，從而得出樣本的溶解曲線。將溶解曲線和標準曲線對比就可以得到目的片段的甲基化情況。

**甲基化敏感的單核苷酸引物擴增**
在使用亞硫酸鹽處理DNA片段後，設計亞硫酸鹽特異性的引物，使PCR反應恰好停止在第一個CpG位點的C位。由於非甲基化位點已變為T而甲基化位點仍是C，PCR產物中C和T的比例可以衡量該位點甲基化與否。
分析CT比例有很多方法。最開始使用的是放射標記的ddNTP，熒光標記和焦磷酸測序也被使用。此外，基質輔助激光解吸/電離（MALDI）高通量分析法、高效液相色譜法（HPLC）等技術也能用於區分引物擴增產物。

**鹼基特異性切割/基質輔助激光解吸-電離**
該技術是由Ehrich等人報道的。首先，通過在PCR引物中加入RNA聚合酶啟動子將目的DNA片段轉錄為RNA片段。向產物中加入dTTP和dCTP後，使用RNase A切割C、T和U的3’端。由於RNase A對dTTP和dCTP沒有切割效果，最後的結果是隻有被甲基化的胞嘧啶的3’端被切割。通過MALDI法對切割產物的分析可以得到甲基化的具體位點。這種方法可以用於高通量篩選，具有高效和低成本的優點。

**甲基化特異性PCR**
甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR, MSP）可以免除對目的片段的測序。 這種PCR的引物被設計為只和甲基化的胞嘧啶互補，或者是隻和被亞硫酸鹽從胞嘧啶轉化為的胸腺嘧啶互補（“非甲基化”特異性）。由於引物中CpG位點的增加能增強檢測的特異性，這種方法對高密度CpG位點的區域尤為實用。把CpG位點置於引物的3’端能增強敏感度。一般來說，MSP和其相關方法被認為是檢測單個位點甲基化敏感度最高的方法，可達到檢測出低至0.1%的甲基化比例。
MethyLight是基於MSP的技術，能進行定量測定。該方法使用甲基化特異性引物和甲基化特異性熒光報告探針。如果需要區分相關CpG位點，引物或探針則可以低非甲基化特異性的。
還有學者使用改良的MSP法分析DNA片段—— 溶解曲線分析法（Mc-MSP）。這種方法同時擴增原序列和亞硫酸鹽處理後的序列，通過對不同峰值的比較得到定量關係。將mc-MSP和定量PCR結合則可以對低水平的甲基化進行精確測定。

**基於微陣列的檢測方法**
基於微陣列的檢測方法是對上述各種方法的邏輯延伸，可用於對整個基因組甲基化水平的檢測。DNA微陣列檢測使用針對目標CpG位點的寡核苷酸雜交探針，分別與原序列和亞硫酸鹽處理後的序列互補。探針同樣也是亞硫酸鹽特異性的以避免和反應不完全的DNA序列結合。Illumina Methylation Assay是常用的使基於陣列檢測全基因組甲基化情況的全套手段。

**侷限**

**5-羥甲基胞嘧啶**
5-羥甲基胞嘧啶是一種新的哺乳動物DNA鹼基。亞硫酸鹽會把5-羥甲基胞嘧啶轉化為5-甲基磺酸胞嘧啶，而5-甲基磺酸胞嘧啶則在測序中被認為是胞嘧啶。也就是說，通過亞硫酸鹽測序得到的甲基化結果實際上是5-甲基胞嘧啶和5-甲基磺酸胞嘧啶的總和。Chuan He等人設計的新方法已經可以在單鹼基水平上區分以上兩種胞嘧啶。
轉化反應不完全
亞硫酸鹽測序要求反應必須完全——每一個未被甲基化的胞嘧啶都被轉化為尿嘧啶。如果轉化反應不完全則會導致結果出現假陽性。此外，由於只有在單鏈DNA中的胞嘧啶才能被亞硫酸鹽攻擊，DNA的變性也是至關重要的。對於實驗條件的控制，如溫度和鹽濃度也是是反應完成的重要因素。將DNA在瓊脂糖膠中反應可使DNA片段互相分離而提高反應質量。

**DNA的降解**
另一個影響測試結果的原因是DNA在反應過程中被降解。那些使轉化反應完全的必要條件，如長時間孵育、提高溫度和高亞硫酸鹽濃度，會導致多達90%的DNA被降解。由於反應起始時的DNA總量不多，這種降解會影響到最終的檢測。降解會導致DNA脫嘌呤，形成隨機的斷裂。因此，PCR的擴增序列越長，完整模板分子的期望就越低。這可能導致PCR擴增失敗或者因DNA樣本數太少而失去數量的準確性。因此，在設計測序實驗過程中要考慮反應條件對DNA降解的影響。一些技術能降低DNA的降解，如設置孵育溫度循環。

**其他問題**
一個潛在的問題是由於鹼性不夠導致的嘧啶脫磺酸基不完全。這可能會抑制某些DNA聚合酶，最終導致PCR產物合成困難。這種現象可以通過調整反映環境的PH值來避免。
最後一個問題是亞硫酸鹽處理會大大降低樣本的複雜性，這在多個PCR反應同時進行時會導致問題：引物設計更加困難，錯誤的雜交頻率也會提高。

**應用：全基因組甲基化檢測（WGBS）**
亞硫酸鹽測序正在取代限制性標記基因組掃描，成為檢測全基因組甲基化情況的主流技術。人類的表觀基因組正在逐步完善中。表觀基因組的信息對於基因序列的應用和調控功能的理解十分重要。
表觀基因組的穩定性比基因組低，因此對它的瞭解也更困難。一個個體的表觀基因組和年齡、組織相關，被環境所調控，在疾病發生時會出現異常。對於表觀基因組的研究可以對正常表觀遺傳和疾病相關的改變做出深入瞭解。
表觀基因組圖譜研究的直接好處之一就是克隆技術的提高。諸多研究表明，對正常的生物進行克隆失敗的原因是表觀遺傳信息的錯誤。基因的甲基化異常在多種腫瘤中存在。全基因組的低甲基化會導致基因組的不穩定，而局部的抑癌基因啟動子高甲基化則會導致基因失活。特定位點的甲基化對腫瘤的診斷和治療有指導作用。
大規模的表觀遺傳圖譜繪製已在全球展開。由於亞硫酸鹽全基因組測序費用高昂，它只應用於小部分高精確度的測序中，其他更粗略的分析法則應用較為廣泛。

**外部鏈接**
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC38513/ date=20160521201541  - PNAS- http://www.epigenome.org/ date=20210101171119  - Human Epigenome Project- https://web.archive.org/web/20070124172616/http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/epigenome/ - Sanger Institute- https://web.archive.org/web/20070929211948/http://www.methylogix.com/genetics/protocols.shtml.htm - Bisulfite Sequencing Protocols

**參考文獻 ==