การหาลำดับแบบไอออนเซมิคอนดักเตอร์

เป็นวิธีการหาลำดับดีเอ็นเอ โดยอาศัยการตรวจจับไอออนไฮโดรเจน(H+)ที่ถูกปล่อยออกมา ในระหว่างที่เกิดปฏิกิริยาพอลิเมอร์ไรเซชัน (Polymerization) ของ DNA วิธีการนี้จะเรียกว่า "การหาลำดับโดยการสังเคราะห์" ซึ่งเกิดในระหว่างการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่(complementary strand) โดยจะอาศัยลำดับของสายเทมเพลต (template strand)เป็นแม่แบบ
หลุมขนาดเล็ก (Microwell) ที่มีสายดีเอ็นเอแม่แบบอยู่จะถูกหาลำดับโดยการเติมดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟต (dNTP) เพียงชนิดเดียวในแต่ละรอบ ถ้า dNTP นั้นเกิดการเข้าคู่สมกับนิวคลีโอไทด์ในเทมเพลต ก็จะเกิดการสร้างสายใหม่ที่เป็นคู่สมกับดีเอ็นเอแม่แบบขึ้น เป็นเหตุให้มีการหลั่งไฮโดรเจนไอออน(H+)ออกมาแล้วถูกไอออนเซ็นเซอร์ ISFET ตรวจจับได้ ซึ่งบ่งชี้ว่าเกิดปฏิกิริยาพอลิเมอร์ไรเซชันขึ้น ถ้าเกิดว่าในสายดีเอ็นเอแม่แบบมีเบสที่เป็นชนิดเดียวกันซ้ำกันเยอะๆ ก็จะเกิดการนำ dNTP มาต่อสายที่มากกว่าหนึ่งตัวในหนึ่งรอบส่งผลให้เกิดการปล่อยไฮโดรเจนจำนวนมากและเกิดสัญญาณมากกว่าปกติ
เทคโนโลยีนี้จะแตกต่างจากเทคโนโลยีการหาลำดับโดยการสังเคราะห์อื่น ๆ โดยวิธีนี้จะไม่มีการใช้นิวคลีโอไทด์ที่ถูกดัดแปลง หรือเลนส์ (optics)  วิธีการหาลำดับแบบไอออนเซมิคอนดักเตอร์ อาจจะถูกเรียกว่า Ion Torrent sequencing, pH-mediated sequencing, silicon sequencing, หรือ semiconductor sequencing

**ประวัติการพัฒนาเทคโนโลยี**
เทคโนโลยี ดังกล่าว ได้รับใบอนุญาตจาก DNA Electronics Ltd ซึ่งถูกพัฒนามาจากระบบ Ion Torrent และถูกเผยแพร่ในเดือนกุมภาพันธ์ 2010  ซึ่งระบบ Ion Torrent มีการทำการตลาดเครื่องจักรที่เกิดขึ้นอย่างรวดเร็ว เนื่องจากระบบ Ion Torrent มีความกะทัดรัดและประหยัด ซึ่งสามารถนำไปใช้ในห้องปฏิบัติการจำนวนมากได้ ในลักษณะที่เป็นเครื่องตั้งโต๊ะ บริษัท 454 Life Sciences ของโรช ได้ร่วมมือกับ DNA Electronics ในการพัฒนาความสามารถในการอ่านให้สามารถอ่านลำดับได้ยาวขึ้น โดยมีการนำรูปแบบการหาลำดับที่มีการเพิ่มเซมิคอนดักเตอร์ให้หนาแน่นมากขึ้นมาใช้เทคโนโลยีนี้

**เทคโนโลยี**
ในธรรมชาติ การเข้าคู่สมระหว่าง dNTP กับสายดีเอ็นเอแม่แบบในการสร้างสายดีเอ็นเอ จะเกิดการสร้างพันธะโควาเลนต์ และเกิดการปลดปล่อยไพโรฟอสเฟต (Pyrophosphate) และไฮโดรเจนไอออน(H+)ที่มีประจุบวกออกมา dNTP จะเกิดการเข้าคู่กับดีเอ็นเอเทมเพลตในกรณีที่เป็นคู่สมกันเท่านั้น การหาลำดับโดยวิธีไอออนเซมิคอนดักเตอร์จึงใช้ประโยชน์จากสิ่งที่ โดยพิจราณามีการปลดปล่อยไฮโดรเจนไอออน(H+) ออกมาหรือไม่เมื่อมีการให้ dNTP เข้าไปในปฏิกิริยา
หลุมขนาดเล็กบนแผ่นชิปเซมิคอนดักเตอร์จะมีโมเลกุลของดีเอ็นเอแม่แบบสายเดี่ยวจำนวนมากที่จะถูกหาลำดับอยู่ จากนั้นเอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส จะนำเบส A, T, C หรือ G ซึ่งเป็น dNTP ต่างๆที่ไม่ได้ดัดแปลงเข้ามาต่อ ถ้า dNTP ที่นำเป็นเบสคู่สมกับสายดีเอ็นเอแม่แบบ ก็จะเกิดการต่อสายและสร้างสายดีเอ็นเอขึ้นมาได้โดยการทำงานของดีเอ็นเอพอลิเมอร์เรส แต่ถ้า dNTP ที่นำไม่ใช่คู่สมกับสายดีเอ็นเอแม่แบบก็จะไม่เกิดปฏิกิริยาทางชีวเคมี ไฮโดรเจนไอออน(H+)ที่ถูกปลดปล่อยออกมาในปฏิกิริยาจะไปเปลี่ยนแปลงค่าพีเอชของสารละลาย ซึ่งจะถูกตรวจพบโดยเซนเซอร์ ISFET  โมเลกุลของ dNTP ที่ไม่ได้จับเข้าคู่ก็จะถูกล้างออกไป ก่อนเริ่มปฏิกิริยาครั้งใหม่ซึ่งจะมีการให้ dNTP อีกชนิดเข้าไป

**การตรวจจับสัญญาณ**
ภายใต้ชั้นของ microwells ซึ่งเป็นชั้นที่มีความไวต่อไอออน และในด้านล่างของชั้นนี้จะเป็นเซ็นเซอร์ ISFET ion ตัวชั้นทั้งหมดจะถูกบรรจุไว้ใน CMOS semiconductor chip ซึ่งจะมีลักษณะคล้ายกับที่ใช้ในอุตสาหกรรมอิเล็กทรอนิกส์ โดยในแต่ละชิปมี array หรือชุดข้อมูล ของ microwells พร้อมกับเครื่องตรวจจับ ISFET ที่ทำงานสอดคล้องกัน โดยไฮโดรเจนไอออน(H+)ที่ถูกปล่อยออกมาแต่ละตัว จะถูกตรวจวัดด้วย ISFET ion sensor และเกิดการส่งสัญญาณคลื่นไฟฟ้าเป็นชุดๆจากชิปไปยังคอมพิวเตอร์และแปลเป็นลำดับ DNA  โดยไม่ต้องมีการแปลงเป็นสัญญาณระหว่างทาง  เพราะว่า ในการเกิดการเข้าคู่ของนิวคลีโอไทด์สามารถวัดได้โดยตรงจากอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์ และในการวัดควรหลีกเลี่ยงการใช้นิวคลีโอไทด์ที่มีฉลากและการวัดด้วยแสง  ซึ่งการประมวลผลของสัญญาณและการประกอบ DNA สามารถดำเนินการในซอฟต์แวร์ได้

**ลักษณะการหาลำดับ**
ความแม่นยำพื้นฐานที่สามารถทำได้ในบ้าน โดย Ion Torrent ต่อลำดับ Ion Torrent Ion semiconductor ณ เดือนกุมภาพันธ์ ปี2554 พบว่าอยู่ที่ 99.6% จากการอ่านจำนวนเบส 50 ครั้ง ด้วย 100 Mb ต่อหนึ่งรอบ โดยมีความยาวการอ่าน 100 คู่เบส มีความแม่นยำในการหาลำดับที่มีเบสที่ซ้ำกัน 5 ซ้ำ คือ 98 % ต่อมาได้แสดงความยาวในการอ่านได้ 400 คู่เบส ซึ่งยังไม่มีการตรวจสอบจากบริษัทภายนอก 

**ข้อดี**
ข้อดีที่สำคัญของวิธี ion semiconductor sequencing คือ การตรวจจับอย่างรวดเร็ว ขั้นตอนไม่ซับซ้อนและต้นทุนต่ำ โดยไม่มีการดัดแปลงนิวคลีโอไทด์และการวัดแสง 
เนื่องจากระบบจะบันทึกเหตุการณ์การรวมตัวของนิวคลีโอไทด์ตามธรรมชาติโดยพอลิเมอเรส การหาลำดับสามารถเกิดขึ้นได้แบบเรียลไทม์ ซึ่งในความเป็นจริงการหาลำดับจะถูกจำกัดด้วยการไหลเวียนของนิวคลีโอไทด์ของสารตั้งต้นผ่านระบบ  โดยบริษัท Ion Torrent Systems Inc. ทางผู้พัฒนานั้นได้อ้างว่า การวัดการรวมตัวแต่ละครั้งจะใช้เวลา 4 วินาทีและรันแต่ละครั้งจะใช้เวลาประมาณ1 ชั่วโมง ระหว่างการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ยาว 100-200 คู่เบส ซึ่งหากSemiconductor chipsได้ถูกพัฒนา(ตามการคาดการณ์จากกฎของมัวร์) จำนวนการอ่านต่อซิป(แต่ละการดำเนินการ)จะเพิ่มขึ้น
ค่าใช้จ่ายในการซื้อ pH-mediated sequencer จาก Ion Torrent Systems Inc. ในช่วงเปิดตัวมีราคาประมาณ $ 50000 USD ไม่รวมอุปกรณ์การเตรียมตัวอย่างและเซิร์ฟเวอร์สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล โดยค่าใช้จ่ายต่อการรันนั้นจะต่ำกว่าวิธีการAutomated sequencingอย่างมีนัยสำคัญด้วยค่าใช้จ่ายประมาณ $ 1000

**ข้อจำกัด**
ถ้ามีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่มีการซ้ำกันของเบสที่เหมือนกันเป็นสายยาว (เช่น TTTTT) ปรากฏอยู่บนสายแม่แบบ(สายที่จะใช้หาลำดับ) ก็จะเกิดการต่อสายนิวคลีโอไทด์ที่มากกว่าหนึ่งตัวในหนึ่งรอบและไฮโดรเจนไอออน (H+ )จำนวนมากที่เกิดขึ้นจะถูกปลดปล่อยออกมาพร้อมกันในรอบเดียว ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของค่าพีเอชที่สูงขึ้นและให้สัญญาณออกมามากกว่าปกติตามไปด้วย นี่เป็นข้อจำกัดของระบบที่ทำให้ยากที่จะระบุหรือหาลำดับของเบสที่ซ้ำกันยาวๆได้ โดยข้อจำกัดนี้ยังพบได้กับเทคนิคอื่นๆ ด้วย เช่น pyrosequencing สัญญาณที่สร้างจากจำนวนซ้ำที่สูงๆ นั้นยากที่จะแยกความแตกต่างจากการซ้ำที่คล้ายกันแต่จำนวนต่างกันได้ เช่น ลำดับที่มีเบสที่เหมือนกันซ้ำกัน 7 ซ้ำ ยากที่จะแยกความแตกต่างออกจากลำดับที่มีเบสที่ซ้ำกัน 8 ซ้ำ เป็นต้น
ข้อจำกัดอื่นของระบบนี้ คือ ความยาวในการอ่านสั้น เมื่อเทียบกับวิธีการหาลำดับอื่นๆ เช่น Sanger sequencing หรือ pyrosequencing การอ่านลำดับได้ที่ละยาวๆ จะเป็นประโยชน์สำหรับในการประกอบจีโนมขึ้นใหม่ เครื่องมือในการหาลำดับแบบ Ion Torrent semiconductor มีความยาวเฉลี่ยในการอ่านได้ประมาณ 400 นิวคลีโอไทด์ต่อหนึ่งครั้งของการอ่าน 
ปริมาณในการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ขณะนี้ยังต่ำกว่าเทคโนโลยีการหาลำดับอื่นๆ ที่มีความสามารถในการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ในปริมาณที่มากกว่า แม้ว่าผู้พัฒนาหวังว่าจะสามารถเปลี่ยนแปลงสิ่งนี้ได้โดยการเพิ่มความหนาแน่นของชิป

**การประยุกต์ใช้**
นักพัฒนาของ Ion Torrent semiconductor sequencing ได้ทำการตลาดอย่างรวดเร็ว เป็นเครื่องหาลำดับที่มีขนาดกะทัดรัดและประหยัดที่สามารถใช้ได้ในจำนวนมากในห้องปฏิบัติแบบเป็นเครื่องตั้งโต๊ะ บริษัท หวังว่าระบบของพวกเขาจะใช้หาลำดับนอกพื้นที่เฉพาะไปจนถึงโรงพยาบาลและห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก บทความจากหนังสือพิมพ์ New York Times ฉบับเดือนมกราคม 2554 เรื่อง "การหาลำดับดีเอ็นเอเพื่อมวลชน" เป็นการตอกย้ำความทะเยอทะยานนี้ 
เนื่องจากสามารถเป็นวิธีการทางเลือกหนึ่งที่ใช้ในการหาลำดับเพื่อให้ได้ความยาวการอ่านที่มากขึ้น (ดังนั้นจึงเหมาะสมกว่าการวิเคราะห์จีโนมทั้งหมด) เทคโนโลยีนี้อาจเหมาะสมที่สุดสำหรับการประยุกต์ใช้กับงานขนาดเล็ก เช่น การหาลำดับจีโนมของจุลินทรีย์ ,การหาลำดับทรานสคริปโตม(transcriptome)ของจุลินทรีย์ ,การหาลำดับเป้าหมาย ,การหาลำดับแอมพลิคอน(amplicon)หรือสำหรับการทดสอบคุณภาพของคลังลำดับต่างๆ 
หมวดหมู่:เทคโนโลยีชีวภาพ
หมวดหมู่:ชีววิทยาโมเลกุล