กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วม

หลักการทำงานของกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วม
กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วม (Confocal microscope; Confocal microscopy) เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้เทคนิคทางแสงบริเวณจุดโฟกัสในการถ่ายภาพเพื่อเพิ่มความละเอียดภาพ และความเปรียบต่าง ของภาพถ่าย โดยใช้แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดและรูขนาดเล็กเพื่อกำจัดแสงบริเวณนอกจุดโฟกัส ซึ่งเทคนิคการถ่ายภาพลักษณะนี้สามารถสร้างภาพของโครงสร้างในรูปแบบสามมิติได้ โดยใช้ภาพจากระนาบโฟกัสต่าง ๆ มาประกอบกัน เทคนิคนี้ได้รับความนิยมในวงการวิทยาศาสตร์และอุตสาหกรรม โดยทั่วไปกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วม ถูกใช้งานอยู่ในวงการวิทยาศาสตร์สำหรับสิ่งมีชีวิต, ชีววิทยา, วิทยาศาสตร์สำหรับสารกึ่งตัวนำ, และวัสดุศาสตร์

**หลักการพื้นฐาน**
ภาพหลักการทำงานของการถ่ายภาพแบบโฟกัสร่วมที่ได้รับการจดสิทธิบัตรเมื่อปี ค.ศ. 1957 โดย มาวิน มินสกี้
หลักการทำงานของการถ่ายภาพแบบโฟกัสร่วมนั้นได้รับการจดสิทธิบัตรเมื่อปี ค.ศ. 1957 โดย มาร์วิน มินสกี การถ่ายภาพแบบโฟกัสร่วมนี้มีจุดประสงค์เพื่อแก้ไขปัญหาข้อจำกัดต่าง ๆ ของกล้องจุลทรรศน์แบบวาวแสงแบบมุมมองกว้าง (wide-field fluorescence microscope) ซึ่งเป็นแบบดั้งเดิม โดยกล้องจุลทรรศน์แบบวาวแสงแบบมุมมองกว้างนั้นจะใช้แสงฟลูออเรสเซ็นต์ความยาวคลื่นหนึ่งส่องไปบนทุกส่วนของชิ้นเนื้อตัวอย่าง และชิ้นเนื้อตัวอย่างนั้นจะสะท้อนแสงฟลูออเรสเซ็นต์อีกความยาวคลื่นหนึ่งมายังตัวรับแสง (photodetector) ดังนั้นตัวรับแสงจะรับแสงฟลูออเรสเซ็นต์ที่สะท้อนมาทั้งหมด ซึ่งรวมถึงแสงที่ไม่ได้อยู่ที่จุดโฟกัส ในทางตรงกันข้ามกันกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมใช้แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซ็นต์แบบจุด (เกี่ยวข้องกับฟังก์ชันกระจายจุด) และใช้เลนส์โฟกัสแสงไปบนชิ้นเนื้อตัวอย่างและรับแสงสะท้อนจากชิ้นเนื้อตัวอย่างมาผ่านรูขนาดเล็กเพื่อกำจัดแสงที่ไม่ได้อยู่บริเวณจุดโฟกัสก่อนที่แสงจะไปสู่ตัวรับแสง ดังนั้นจะมีแสงที่จุดโฟกัสเท่านั้นที่นำมาสร้างเป็นสัญญาณภาพ ด้วยเหตุนี้เองภาพที่ได้จึงมีความละเอียดสูงขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งความละเอียดของภาพทางด้านความลึก เนื่องจากแสงจากบริเวณที่ตื้นหรือลึกกว่าจุดโฟกัสจะถูกกำจัดโดยรูขนาดเล็กก่อนที่จะมาถึงตัวรับแสง แต่ถึงอย่างไรการใช้รูขนาดเล็กในการจำกัดแสงที่รับเข้ามาจะทำให้ภาพมีความเข้มของแสงลดลงตามไปด้วย ดังนั้นในการใช้กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมจึงจำเป็นต้องเพิ่มเวลาในการเปิดหน้ากล้องให้นานขึ้น
เมื่อการรับแสงเป็นการรับแสงแบบทีละจุดจากจุดโฟกัส ดังนั้นการที่จะได้ภาพ 2 มิติ จำเป็นต้องทำการสแกนการรับภาพทางแนวราบทั้งชิ้นเนื้อตัวอย่างชิ้นเนื้อแล้วนำมาประกอบกันเป็นภาพ 2 มิติที่สมบูรณ์ ในทำนองเดียวกันถ้าต้องการสร้างภาพ 3 มิติ จำเป็นต้องมีการสแกนการรับภาพทั้งทางแนวราบและแนวดิ่ง หลังจากนั้นนำข้อมูลมาสร้างเป็นภาพ 3 มิติ ที่สมบูรณ์ 
ความละเอียดทางด้านความลึกของจุดโฟกัสของกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วม หมายถึง ความหนาของบริเวณที่กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมยอมให้แสงผ่านเข้าไปยังตัวรับแสง ค่านี้ส่วนมากจะถูกกำหนดโดยผลลัพธ์ของความยาวคลื่นแสงหารด้วยค่ารูรับแสงเชิงตัวเลขของเลนส์ใกล้วัตถุของกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมยกกำลังสองและคุณสมบัติทางแสงของชิ้นเนื้อ จากที่กล่าวมาการจำกัดแสงสะท้อนทางด้านความลึกของชิ้นเนื้อทำให้เราสามารถสร้างภาพ 3 มิติ โดยการเลื่อนจุดโฟกัสไปยังตำแหน่งต่าง ๆ ทั้งทางด้านแนวราบและแนวดิ่งนั่นเอง

**เทคนิคที่ใช้ในการสแกนในแนวราบของกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วม**
มีกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมอยู่ 3 ชนิดที่มีอยู่ในท้องตลาดปัจจุบัน- กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน (Confocal laser scanning microscpoes) กล้องชนิดนี้ใช้กระจก (โดยทั่วไป 2-3 ชิ้น) สแกนลำแสงเลเซอร์แบบเชิงเส้นทั้งในแกน x และแกน y ให้ทั่วทั้งชิ้นเนื้อตัวอย่าง โดยที่รูขนาดเล็ก (pinhole) และตัวรับแสง (photodetector) ไม่เคลื่อนที่- กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดจานหมุน (จานนิพโค)  (Spinning-disk (Nipkow disk) confocal microscope) ใช้ชุดจานหมุนซึ่งมีรูขนาดเล็ก (pinhole) จำนวนมากในแผ่นจานในการสแกนลำแสงให้ทั่วทั้งชิ้นเนื้อตัวอย่าง ในขณะที่แผ่นจานนั้นหมุน- กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดอาเรย์ที่สามารถโปรแกรมได้ (Programmable Array Microscopes ; PAM) เป็นการใช้สัญญาณอเล็คทรอนิคส์ควบคุมอุปกรณ์สำหรับปรับแต่งลำแสง (Spatial Light Modulator (SLM)) ซึ่งอุกรณ์นี้ทำหน้าที่เสมือนรูขนาดเล็กจำนวนมากที่สามารถเคลื่อนที่ได้ โดยอุปกรณ์ปรับแต่งลำแสงนี้ประกอบด้วยกระจกขนาดเล็กจำนวนมาก (microelectromechanical mirrors) ที่วางเรียงกันในรูปแบบตาราง โดยที่กระจกขนาดเล็กนี้สามารถปรับการหมุนและการสะท้อนด้วยสัญญาณทางไฟฟ้า กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดนี้ใช้ CCD เป็นตัวรับสัญญาณแสง
กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมแต่ละชนิดมีข้อดีข้อเสียแตกต่างกันไป โดยที่ระบบของกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมทุกชนิดพยายามปรับแต่งให้ระบบมีความเหมาะสมทั้งในด้านความเร็วในการบันทึกภาพและความละเอียดของภาพ โดยที่กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นสามารถปรับแต่งความถี่ในการเก็บสัญญาณภาพและความละเอียดในการเก็บสัญญาณภาพ ในขณะที่กล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดจานหมุน (จานนิพโค) และกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดอาเรย์ที่สามารถโปรแกรมได้มีความถี่ในการเก็บสัญญาณภาพและความละเอียดในการเก็บสัญญาณภาพคงที่ แต่มีความเร็วในการเก็บสัญญาณภาพสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน ขณะนี้ในท้องตลาดนั้นกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดจานหมุน (จานนิพโค) สามารถเก็บภาพด้วยความเร็วมากกว่า 50 ภาพต่อวินาที ซึ่งความเร็วดังกล่าวเป็นที่ต้องการเมื่อต้องการจับภาพความเคลื่อนไหวของเซลล์สิ่งมีชีวิตขณะมีชีวิตอยู่
การพัฒนาที่สำคัญที่เป็นจุดเปลี่ยนที่สำคัญของกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนที่ทำให้ความเร็วในการเก็บภาพสูงขึ้นได้มากกว่ามาตรฐานวิดีโอ (60 ภาพต่อวินาที) โดยการนำเอากระจกขนาดเล็กมาใช้ในการสแกนลำแสงเลเซอร์ซึ่งกระจกขนาดเล็กนี้เป็นผลของการพัฒนาของระบบไฟฟ้าเครื่องกลจุลภาค (Microelectromechanical Systems ; MEMS)
การเอ็กซ์เรย์โดยใช้เทคนิคและหลักการเดียวกันกับการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วมโดยใช้แสงฟลูออเรสเซ็นต์ เป็นเทคนิคใหม่ที่สามารถควบคุมความลึกของการเอ็กเรย์ได้ ตัวอย่างการใช้งานของการเอ็กเรย์ด้วยเทคนิคใหม่นี้คือการหาชั้นของพื้นผิวที่ถูกเขียนทับ ภายใต้ภาพเขียน

**ภาพที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์แบบโฟกัสร่วม**
คอนโฟคอล
คอนโฟคอล
หมวดหมู่:กล้องจุลทรรศน์

**อ้างอิง**

**แหล่งข้อมูลอื่น**
  Molecular Expressions:   Laser Scanning Confocal Microscopy-  Emory’s Physics Department date=2010-09-11 . Introduction to confocal microscopy and fluorescence.-  The Science Creative Quarterly's overview of confocal microscopy - high res images also available.-  Programmable Array Microscope - Confocal Microscope Capabilities.-  Introduction to Confocal Microscopy (video) date=2013-07-18  by Kurt Thorn (UCSF)