[en] Embryonic stem cells (ESCs) can have at least two states of pluripotency: naïve and primed, with an expression profile resembling that of the preimplantation and postimplantation epiblast, respectively. Naïve ESCs have some advantages over primed ESCs that make them more suitable for potential clinical uses, such as a greater differentiation potential and a greater proliferation capacity and clonogenicity. They are also a better in vitro model than primed hESCs for the study of preimplantation developmental events. However, the existence of intermediate states of pluripotency has been recently reported, and therefore pluripotency should indeed be considered as a continuum where different types of ESCs are allocated according to their characteristics. Human ESCs (hESCs) traditionally derived from blastocyst stage embryos show a primed pluripotency state, but hESCs can also be derived from single blastomeres of 8-cell embryos, although their pluripotency state is unclear. Since they are obtained from embryos at an early stage of development, they could be more prone to present naïve pluripotency characteristics. Therefore, the objective of this thesis was to determine the pluripotency state of hESCs derived from single blastomeres. In a first study, the initial objective was to derive new hESC lines from single blastomeres (bm-hESCs) and from whole blastocysts (bc-hESCs) with the highest possible efficiency. The results indicated that the use of inhibitors of GSK3β and ROCK had a positive effect on hESC derivation efficiencies. We also observed that single blastomeres, like blastocysts, organized to form a post-inner cell mass intermediate (PICMI) during the first days of the derivation process. Next, different naïve pluripotency indicators were analysed in bm-hESCs, bc-hESCs (primed control), and a naïve-converted hESC line (naïve control). Our bm-hESCs showed a significantly higher clonogenicity than bc-hESCs, although lower than naïve hESCs, and also showed a significantly higher expression of some naïve pluripotency marker genes in early culture passages. No differences were observed between bm-hESCs and bc-hESCs for the rest of the indicators analysed, whereas naïve hESCs were significantly different. These results indicated that bm-hESCs would be in a primed state of pluripotency, although closer to the naïve end of the pluripotency continuum than bc-hESCs. Finally, in order to continue the previous work, the last objective was to analyse the transcriptome and the differentiation potential of bm-hESCs. First, we observed that the transcriptional profile of bm-hESCs was similar to that of bc-hESCs but significantly different from that of naïve hESCs. However, bc-hESCs overexpressed genes related to nervous system development, embryonic pattern specification, and embryonic epithelial morphogenesis with respect to bm-hESCs, whereas bm-hESCs overexpressed mitochondrial genes involved in cellular respiration. These results were consistent with those obtained in the first work with regards to the pluripotency state of hESCs. Referring to the differentiation potential, no differences were observed between bm-hESCs, bc-hESCs and naïve hESCs when treated as groups, but a large heterogeneity was observed between different hESC lines. All in all, the results obtained in this thesis indicate that bm-hESCs present a pluripotency state slightly closer to the naïve end of the pluripotency continuum than bc-hESCs, which makes single blastomeres an interesting alternative as a source for hESC derivation.

[es] Las células madre embrionarias (ESCs) pueden presentar al menos dos estados de pluripotencia: naïve y primed, con un perfil de expresión génica similar al del epiblasto preimplantacional y postimplantacional, respectivamente. Las ESCs naïve presentan algunas ventajas respecto a las primed que las hacen más adecuadas para posibles usos clínicos, como por ejemplo un mayor potencial de diferenciación y una mayor capacidad de proliferación y de expansión clonal. También constituyen un mejor modelo in vitro para el estudio de los eventos del desarrollo preimplantacional. Sin embargo, recientemente se ha demostrado la existencia de estados de pluripotencia intermedios y, por lo tanto, la pluripotencia debe considerarse como un espectro continuo donde los diferentes tipos de ESCs se posicionan en función de sus características. Las ESCs humanas (hESCs) tradicionalmente derivadas a partir de embriones en estadio de blastocisto presentan pluripotencia primed. Las hESCs también pueden ser derivadas a partir de blastómeros aislados de embriones a 8 células, pero no se conoce con certeza su estado de pluripotencia. Teniendo en cuenta que provienen de embriones en un estadio de desarrollo temprano, podrían ser más propensas a presentar características de pluripotencia naïve. Por eso, el objetivo de esta tesis ha sido determinar el estado de pluripotencia de las hESCs derivadas a partir de blastómeros aislados. En un primer trabajo, el objetivo inicial fue derivar nuevas líneas de hESC a partir de blastómeros aislados (bm-hESCs) y de blastocistos enteros (bc-hESCs) con la mayor eficiencia posible. Los resultados obtenidos indicaron que el uso de los inhibidores de GSK3β y ROCK tuvo un efecto positivo en las eficiencias de derivación de hESCs. También se observó que los blastómeros aislados, como los blastocistos, se organizaban formando un post-inner cell mass intermediate (PICMI) durante los primeros días del proceso de derivación. A continuación, se analizaron diferentes indicadores de pluripotencia naïve en las bm-hESCs, las bc-hESCs (control primed) y una línea de hESCs convertida en naïve (control naïve) Las bm-hESCs presentaron una clonogenicidad significativamente superior a la de las bc-hESCs, aunque inferior a la de las hESCs naïve, y también presentaron una expresión significativamente superior de algunos genes marcadores de pluripotencia naïve en pasajes tempranos de cultivo. En el resto de los indicadores no se observaron diferencias entre las bm-hESCs y las bc-hESCs, mientras que las hESCs naïve fueron significativamente distintas. Estos resultados indicaron que las bm-hESCs se encontrarían en un estado de pluripotencia primed, aunque más cercano al extremo naive del espectro de la pluripotencia que las bc-hESCs. Por último, para continuar con el trabajo anterior, el último objetivo consistió en analizar el transcriptoma y el potencial de diferenciación de las bm-hESCs. Primero, se observó que el transcriptoma de las bm-hESCs era similar al de las bc-hESCs pero significativamente diferente al de las hESCs naïve. Sin embargo, las bc-hESCs sobreexpresaron genes relacionados con el desarrollo del sistema nervioso, la especificación de patrones embrionarios y la morfogénesis del epitelio embrionario respecto a las bm-hESCs, mientras que las bm-hESCs sobreexpresaron genes mitocondriales involucrados en la respiración celular. Estos resultados fueron en la línea de los obtenidos en el primer trabajo en referencia al estado de pluripotencia de las hESCs. En cuanto al potencial de diferenciación, no se observaron diferencias entre las bm-hESCs, las bc-hESCs y las hESCs naive como grupos, pero sí se observó una gran heterogeneidad entre diferentes líneas. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis indican que las bm-hESCs presentan un estado de pluripotencia ligeramente más cercano al extremo naive del espectro de la pluripotencia que las bc-hESCs, lo que convierte a los blastómeros aislados en una alternativa interesante como punto de partida para la derivación de hESCs.