[en] Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is a human pathogen that can colonize the upper respiratory tract and can cause invasive infections such as pneumonia, meningitis and empyema, and noninvasive as otitis media, sinusitis and bronchitis, especially in children, the elderly and immunocompromised. It is the leading cause of death in children under 5 years worldwide, especially in developing countries. There are more than 90 different serotypes described according to the composition of the polysaccharide capsule and, although there are commercial capsule-based vaccines, their effectiveness is limited and are expensive. Thus, both the recent emergence of multidrugresistant strains to antibiotics such as phenomena arising from the introduction of the polysaccharide vaccines, thanks to the adaptability of the pneumococcus, is an urgent need to develop new, more efficient and cheaper vaccine serotype-independent. This new vaccine should be protein based to reduce the cost of production, and candidates, surface-exposed, antigenically conserved, presents in the most prevalent serotypes, highly expressed, its function must be essential for pathogenicity and capable of stimulating cellular response. In order to discover new protein candidates, both for vaccination and for the development of rapid diagnostic tools purposes, during this thesis two lines of work were developed: The surface digestion with proteases of living ("shaving") (1) and production and characterization of extracellular vesicles.Research content First, optimization of "shaving" of live pneumococcal cells with proteases (2) was carried out and then it was applied to a set of clinical isolates from adult (3) and children in order to describe the "pan-surfome" (set of surface proteins present in a collection of different strains). This confirmed this technique as a rapid and powerful approach to surface protein identification (4, 5). Furthermore, the recent description of the production of extracellular vesicles in a Gram-positive bacteria, prompted us to characterize pneumococcus vesicles because such structures are enriched, presumably, in membrane proteins. So, 40 clinical isolates (corresponding to 29 different ST) without evolutionary relationships, as well as reference strains R6 and TIGR4, were analyzed by the "shaving" approach. In addition, other 4 serotypes, with different capabilities of invasion (serotypes 1, 6B, 8 and 23F) were used for the characterization of the extracelluar vesicles (5, 6). All of this allowed to select 95 proteins and tested their immunoreactivity against sera of convalescent and healthy patients (some of them,

[es] Streptococcus pneumoniae (neumococo) es un patógeno humano que puede colonizar el tracto respiratorio superior o puede causar infecciones invasivas como neumonía, meningitis y empiema, y no invasivas como otitis media, sinusitis y bronquitis, principalmente en niños, ancianos e inmunodeprimidos. Es la principal causa de muertes en niños menores de 5 años a nivel mundial, sobre todo en los países en vías de desarrollo. Existen más de 90 serotipos diferentes de acuerdo a la composición de la cápsula polisacarídica y, aunque existen vacunas comerciales basadas en la cápsula, su eficacia es limitada y son caras. Así, tanto por la reciente aparición de cepas multirresistentes a antibióticos como por fenómenos derivados de la introducción de las vacunas polisacarídicas gracias a la gran capacidad de adaptación del neumococo es de urgente necesidad desarrollar nuevas, más eficientes y más baratas vacunas serotipo-independientes. Esta nueva vacuna debe ser de base proteica para reducir el coste de producción, y los candidatos, estar expuestos en superficie, antigénicamente conservados, presentes en los serotipos más prevalentes, altamente expresados, su función debe ser esencial en patogenicidad y ser capaces de estimular repuesta celular. Con el fin de descubrir nuevos candidatos proteicos, tanto con fines vacunales como para el desarrollo de herramientas de diagnóstico rápido, durante la presente tesis se ha desarrollado dos líneas de trabajo principalmente: La digestión superficial de células vivas con proteasas (1) y la producción y caracterización de vesículas extracelulares. 2. Contenido de la investigación En primer lugar se llevó a cabo la optimización de la técnica del "pelado" de células vivas de neumococo con proteasas (2), tras lo cual se aplicó a una batería de aislados clínicos de adultos (3) y de niños con el fin de describir los "pan-surfomas" (conjunto de proteínas de superficie presentes en una batería de distintas estirpes), confirmando a esta técnica como una rápida y potente aproximación para la identificación de proteínas de superficie (4, 5). Por otro lado, la reciente descripción de la producción de vesículas extracelulares en organismos Gram-positivos, nos llevó a caracterizar las vesículas de neumococo debido a que dichas estructuras están enriquecidas, presuntamente, en proteínas de membrana. Así, 40 aislados clínicos (correspondientes a 29 diferentes ST) sin relaciones evolutivas, además de las estirpes de referencia R6 y TIGR4, se analizaron mediante la aproximación de la digestión superficial de células vivas. Además, otros 4 serotipos, relacionados con diferentes capacidades de invasión (serotipos 1, 6B, 8 y 23F), se usaron para la caracterización de las vesículas derivadas de la membrana. Todo ello permitió seleccionar 95 proteínas, cuya inmunoreactividad se probó frente a sueros de pacientes enfermos y sanos (algunas de ellas, mediantes diferentes técnicas). Esto nos permitió seleccionar un conjunto de pocas proteínas (Spr0561, Spr0247, Spr1431, Spr1754 and Sph_0062) para desarrollar un test de enfermedad neumocócica rápido, fiable, barato y fácil de usar en niños de 0->5 años, que resolvería los problemas de los métodos de diagnóstico usados hasta el momento. Por otro lado, se llevaron ensayos de supervivencia usando una estirpe virulenta del serotipo 8 como agente de infección, lo cual nos permitió describir la capacidad protectora de 7 nuevas proteínas. Además, se demostró que las vesículas de membrana producidas por este mismo serotipo conferían un alto grado de protección a los ratones inmunizados...