[en] One of the more difficult stages in the development of an analytical method is the sample preparation. For this reason, an important part of the Analytical Chemistry research is focused towards the simplification of this step. In this sense, miniaturization and automation are key trends in the improvement of different practical aspects of the suitability of analytes for their instrumental measurement. Microextraction techniques can be divided into two large groups, those that isolate analytes into a solid phase, solid-phase microextraction (SPME), and those that extract them into a liquid phase, liquid-phase microextraction (LPME). Research in this PhD Thesis has focused on the development of procedures based on LPME, specifically dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME), liquid-liquid microextraction (LLME) and cloud point extraction (CPE). Chromatographic techniques are very suitable for the analysis of extracts obtained through miniaturized sample treatment techniques, since they allow the separation of compounds with very similar molecular structures, which could not be differentiated in any other way. In this Doctoral Thesis, all the analytical methods developed involve liquid chromatographic (LC) separations, as they are the best option for the organic compounds studied. On the other hand, fluorimetric detection (FLD) and mass spectrometry (MS) have been the techniques selected for the monitoring of compounds separated by LC, taking into account the high sensitivity and selectivity provided by these detection systems. In this Thesis, MS in tandem (MS/MS) has been used, by means of the use of a triple quadrupole (QqQ) as mass analyzer, which has allowed the identification of the analytes without possibility of doubt, thanks to the characteristic fragmentation patterns under the selected conditions. Research presented focuses on the analysis of samples of very different nature involving problems that in one way or another concern society, since it deals with the detection of compounds of interest in the food and pharmaceutical industries, contaminants in different environmental compartments and biomarkers in biological fluids. Thus, plants, water and soil from different sources, as well as human urine have been the matrices under analysis. The compounds determined have been three forms of vitamin K (phylloquinone, menaquinone and menadione), herbicides (glyphosate, glufosinate and aminomethylphosphonic acid (AMPA)), inhibitors of the enzyme phosphodiesterase-5 (sildenafil, tadalafil, vardenafil and N-desmethylsildenafil) and biomarkers (glyoxal and methylglyoxal). The presentation of the developed work has been structured in five chapters: Chapter I. Determination of the glyoxal and methylglyoxal biomarkers, previously derivatized by reaction with 2,3-diaminonaphthalene to form the corresponding α- quinoxalines, which are preconcentrated in 1-undecanol by DLLME assisted by the surfactant Triton X-114. The analysis of the extracts obtained from urine is carried out by LC-FLD. Chapter II. Determination of four phosphodiesterase-5 inhibitors in waters and human urines. The analytes are preconcentrated by DLLME and the enriched extract is analysed by LC-ESI-QqQ-MS/MS. Chapter III. Microwave-assisted CPE application, using Triton X-114, for the preconcentration of three forms of vitamin K, previously extracted from plant samples by ultrasound assisted extraction. The LC-ESI-QqQ-MS/MS combination was used for instrumental measurement. Chapter IV. Determination of glyphosate and its metabolite AMPA in waters and plants using LC-FLD. The herbicides were derivatized with 9-fluorenylmethyl chloroformate and pre-concentrated in methyl isobutyl ketone in the form of ionic pairs by means of LLME. Chapter V. Determination of glyphosate, glufosinate and AMPA in waters, plants and soils, applying the derivatization and preconcentration methodology developed in chapter IV and carrying out the analysis by LC-ESI-QqQ-MS/MS. The five methods of analysis presented have been validated following the International Guidelines for the validation of analytical methods.

[es] En el desarrollo de un método analítico, una de las etapas más complejas es la preparación de la muestra. Por ello, una parte importante de la investigación en Química Analítica se focaliza en el desarrollo de nuevos procedimientos para simplificar el tratamiento de la muestra. La miniaturización y automatización son tendencias clave en la mejora de diferentes aspectos prácticos para la determinación de los compuestos de interés en la muestra utilizando métodos instrumentales. Las técnicas de microextracción se dividen en dos grandes grupos, las que aíslan los analitos en una fase sólida, microextracción en fase sólida (SPME), y las que los extraen en una fase líquida, microextracción en fase líquida (LPME). Las investigaciones en esta Tesis Doctoral se han centrado en el desarrollo de procedimientos basados en LPME, concretamente microextracción dispersiva líquido-líquido (DLLME), microextracción líquido-líquido (LLME) y extracción en punto de nube (CPE). Las técnicas cromatográficas resultan muy adecuadas para el análisis de los extractos obtenidos a través de las técnicas miniaturizadas de tratamiento de muestra, ya que permiten la separación de compuestos de estructuras moleculares muy similares, que no podrían ser diferenciados de otra forma. En esta Tesis Doctoral, todos los métodos analíticos desarrollados implican separaciones mediante cromatografía líquida (LC), por resultar la mejor opción para los compuestos orgánicos estudiados. Por otra parte, las técnicas seleccionadas para la monitorización de los compuestos separados por LC han sido la detección fluorimétrica (FLD) y espectrometría de masas (MS), teniendo en cuenta las elevadas sensibilidad y selectividad proporcionadas por estos sistemas de detección. En esta Tesis se ha empleado MS en tándem (MS/MS), mediante el uso de un triple cuadrupolo (QqQ) como analizador de masas, que ha permitido la identificación de los analitos sin posibilidad de duda, gracias a los patrones de fragmentación característicos bajo las condiciones seleccionadas. La presente Tesis Doctoral se centra en el análisis de muestras de muy diferente naturaleza implicando problemas que en una u otra medida preocupan a la sociedad. Así, las muestras objeto de análisis han sido alimentos vegetales, aguas y suelos de distinta procedencia, así como orina humana. Los compuestos determinados han sido tres formas de la vitamina K (filoquinona, menaquinona y menadiona), herbicidas (glifosato, glufosinato y ácido aminometilfosfónico (AMPA)), inhibidores de la enzima fosfodiesterasa-5 (sildenafil, tadalafil, vardenafil y N-desmetilsildenafil) y biomarcadores (glioxal y metilglioxal). La presentación del trabajo desarrollado se ha estructurado en cinco capítulos: Capítulo I. Determinación de los biomarcadores glioxal y metilglioxal, previamente derivatizados por reacción con 2,3-diaminonaftaleno para formar las correspondientes α-quinoxalinas, que son preconcentradas en 1-undecanol mediante DLLME asistida por el surfactante Tritón X-114. El análisis de los extractos obtenidos a partir de orina se lleva a cabo mediante LC-FLD. Capítulo II. Determinación de cuatro inhibidores de la fosfodiesterasa-5 en aguas y orina humana. Los analitos son preconcentrados mediante DLLME y el extracto enriquecido se analiza mediante LC-ESI-QqQ-MS/MS. Capítulo III. Aplicación de CPE asistida por microondas, usando Tritón X-114, para la preconcentración de tres formas de la vitamina K, previamente extraídos de las muestras vegetales mediante extracción asistida por ultrasonidos. Se empleó la combinación LC-ESI-QqQ-MS/MS para la medida instrumental. Capítulo IV. Determinación de glifosato y su metabolito AMPA en aguas y vegetales mediante LC-FLD. Los herbicidas fueron derivatizados con cloroformiato de 9-fluorenilmetilo y preconcentrados en metil isobutil cetona en forma de pares iónicos mediante LLME. Capítulo V. Determinación de glifosato, glufosinato y AMPA en aguas, vegetales y suelos, empleando la metodología de derivatización y preconcentración desarrollada en el capítulo IV y llevando a cabo el análisis mediante LC-ESI-QqQ-MS/MS. Los cinco métodos de análisis presentados en esta Memoria han sido validados siguiendo las Guías Internacionales de validación de métodos analíticos.