[en] Acute leukemia and multiple myeloma include a group of hematological malignances with a noticeable incidence among the population and causing a high mortality per year. The main causes of this high mortality rate are due to treatment refractoriness and disease relapse. Despite new therapeutic approaches, most patients eventually relapse or show treatment refractoriness and these diseases become still incurables. Functional cytomics is a discipline that allows a multiparametric analysis of the cellular heterogeneity and cytomes, and connects genomics and proteomics with cell dynamics and function. This technology can provide new insights for refractory cells detection due to samples can be minimally manipulated and physiological conditions can be maintained. These characteristics can contribute to a more efficient detection of these cells and to the development of new approaches for prognosis and for the study of relapse or refractoriness risk prediction. The aim and main purpose of the Doctoral Thesis was to develop novel alternative systems to study and to identify cell populations involved in treatment refractoriness in hematological malignances based on advanced cytomic approaches allowing functional and phenotypic studies with a minimal sample perturbation. The first study involved the development of a functional cytomics based technology for a prospective alkaline phosphatase activity determination in acute leukemia stem cells subpopulations and their evaluation as a potential method to detect cell populations associated with a higher treatment refractoriness. CD34+\/ALPhigh cell populations were detected at disease follow up in patients diagnosed with refractory acute leukemia. Our results suggested that CD34+\/ALPhigh cells appeared to sustain leukemogenesis over time. To explore cellular alkaline phosphatase activity significance in acute myeloid leukemia, we performed a prospective study including 43 newly diagnosed patients. Alkaline phosphatase determination at diagnosis appeared to be an independent event-free survival prognostic factor and could be included in current disease risk stratification models. In the second study, we designed and evaluated a novel functional cytomics based methodology to identify myeloid-derived suppressor cells expressing PD-L1 in multiple myeloma patients with the aim to predict immunotherapy targeting PD-1\/PD-L1 checkpoint success. The key point of this methodology was the use of living cells and the maintenance of the physiological conditions. PD-L1 immunophenotyping determination combined with cell stimulation revealed molecular reactivity differences among 35 multiple myeloma patients. Observed differences suggested a great molecular steric plasticity that may contribute to explain heterogeneous immunotherapeutic treatment responses. In conclusion, the studies here developed provide novel evidences about the importance of functional cytomics in the study of hematological malignances. Moreover, these methodologies, in addition to current approaches, may contribute to a better comprehension of disease evolution.

[es] La leucemia aguda y el mieloma múltiple son neoplasias hematológicas con una incidencia notable en la población y una elevada mortalidad. Una de las principales causas de la mortalidad es la refractariedad al tratamiento y la recaída. A pesar de los grandes avances terapéuticos, la mayoría de pacientes experimenta recaídas o refractariedad, haciendo que estas enfermedades sean incurables. La citómica funcional es una disciplina que permite el análisis multiparamétrico de la heterogeneidad celular y de los citomas, relacionando la genómica y la proteómica con la dinámica y función celular. Esta tecnología podría ser clave para detectar células relacionadas con la refractariedad, permitiendo la manipulación mínima de los especímenes de estudio, así como la mimetización de las condiciones fisiológicas. Todo ello puede contribuir a detectar eficientemente dichas células y a desarrollar nuevas aproximaciones para el estudio de las implicaciones pronósticas y de la predicción de riesgo de recaída o enfermedad refractaria. \r\nEl objetivo de la Tesis Doctoral residió en desarrollar nuevos sistemas alternativos para estudiar e identificar poblaciones celulares refractarias, aplicando aproximaciones citómicas avanzadas que permitían realizar estudios a nivel fenotípico y funcional, con una perturbación mínima del espécimen. En el primer trabajo se desarrolló una tecnología basada en citómica funcional para determinar la actividad fosfatasa alcalina en subpoblaciones de células madre de la leucemia aguda evaluándose como método potencial para detectar subpoblaciones refractarias. En los pacientes diagnosticados de leucemia aguda refractaria, se determinaron poblaciones CD34+\/ALPhigh en distintos seguimientos que podrían estar asociadas con la leucemogénesis a lo largo del tiempo. Para explorar la significancia de la actividad fosfatasa alcalina celular en el momento del diagnóstico de leucemia mieloide aguda, se realizó un estudio prospectivo en 43 pacientes. Se demostró que la detección de la actividad fosfatasa alcalina se mostraba como un factor pronóstico independiente de supervivencia libre de eventos, pudiendo ser incluida en la estratificación de riesgo actual de la enfermedad. En segundo trabajo, mediante la utilización de la citómica funcional, se trató de dise\u00F1ar y evaluar una nueva metodología para identificar las células supresoras de origen mieloide con expresión de PD-L1 en pacientes con mieloma múltiple, con el objetivo predecir el éxito de la inmunoterapia con inhibidores de PD-L1. La clave de la metodología desarrollada residió en la utilización de células vivas y en el propósito de mimetizar las condiciones fisiológicas, para tratar de comprender los mecanismos de regulación del ligando. La combinación de la detección inmunofenotípica de PD-L1 con la estimulación celular reveló diferencias en la reactividad de la molécula en los 35 pacientes estudiados. Las diferencias observadas, sugirieron una gran plasticidad estérica de la molécula que podría contribuir a explicar la gran heterogeneidad en el grado de respuesta a la inmunoterapia. En conclusión, gracias a los trabajos desarrollados en la Tesis Doctoral se han aportado nuevas evidencias de la importancia de la citómica funcional en el estudio de la neoplasia hematológica, proporcionando abordajes complementarios a las tecnologías actuales en la comprensión de la evolución de la enfermedad.