[en] Tuberculosis (TB) is nowadays the most devastating infectious disease associated with a single pathogen. Despite the existence of the widely administered BCG vaccine, its variable protection against pulmonary TB along with the rising appearance of drug resistant strains makes this disease an alarming global health problem, causing an estimated 1.5 million deaths in 2018. TB is caused in humans and animals by organisms from the Mycobacterium tuberculosis Complex (MTBC), that show more than 99% genetic identity but exhibit distinct host preference and virulence. Unlike the human restriction of M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine TB, has one of the broadest host ranges of all known pathogens and exacts a global tremendous economic burden in both developed and developing countries. Although it mainly infects cattle, M. bovis exhibits transmissibility across many other mammalian species and it has been found to be more virulent than M. tuberculosis in different animal models. However, the molecular genetic changes that underly host specificity and infection phenotype within MTBC members have not been fully elucidated. In this work, we performed a comparison study between M. tuberculosis, M. bovis and M. africanum strains regarding their virulence and dissemination ability in vivo. In addition, we analysed RD900 genomic region across MTBC members using whole genome sequences from different MTBC strains so as to determine its role in the context of MTBC evolutionary history. The RD900 region comprises two homologous genes encoding the serine/threonine protein kinase PknH flanking the tbd2 gene. PknH is involved in the regulation of several bacterial processes and has been associated with virulence in M. tuberculosis. This analysis revealed that RD900 has been independently lost in different MTBC lineages and different strains, resulting in the generation of a single pknH gene. Importantly, all the analysed M. bovis and M. caprae strains carry a conserved deletion within a proline rich-region of pknH genes independent of RD900 presence or absence. We hypothesized that conservation of this deletion in M. bovis may affect PknH function, having a potential role in its virulence and evolutionary adaptation. To explore this hypothesis, we constructed and characterized M. bovis and M. tuberculosis pknH mutant strains. M. bovis knock-in strains containing the M. tuberculosis complete pknH gene revealed a reduced virulence compared to the wild type in the mouse model, suggesting that PknH plays an important role in the differential virulence phenotype of M. bovis vs M. tuberculosis. The failure of BCG to protect against pulmonary TB results in an urgent need for the development of new effective TB vaccines strategies. The use of alternative routes of administration for the delivery of BCG or new vaccine candidates has emerged a renewed interest during the last years. One of the most studied non-canonical routes of administration is the pulmonary delivery, with the rationale of mimicking the natural route of M. tuberculosis infection. In this regard, preclinical studies in different animal models have shown that pulmonary BCG confers significantly improved protection compared to subcutaneous or intradermal vaccination. However, current immunogenicity studies about mucosal immune responses elicited by pulmonary BCG are focused on adaptive responses, with few data of local innate immunity and BCG interaction with lung myeloid cells. In the present study, we pulmonary delivered GFP-expressing virulent and attenuated mycobacteria to characterize infected lung myeloid populations and differences in cellular infection dynamics occurring in vivo in the mouse model. We found profound differences in dissemination patterns between M. tuberculosis and BCG. Whereas BCG mainly remained in the macrophage compartment, M. tuberculosis actively spread from macrophages to neutrophils in a mechanism dependent on RD1-containg genes. BCG presence in lungs leads to the activation of lung macrophages. As a consequence, M. tuberculosis replication and neutrophil dissemination is impaired when M. tuberculosis is engulfed by BCG pre-activated macrophages in pulmonary, but not subcutaneous, vaccinated mice, which correlates with a strong vaccine-induced protection. Furthermore, we show that lung macrophages are activated by pulmonary BCG in a mechanism that required the contribution of CD4 T cells for the induction, but not maintenance, of their activation status. Noteworthy, pulmonary BCG induced long-term activation of alveolar macrophages, which maintain their activation status and early bactericidal capacity long after vaccine clearance, suggesting the generation of a memory-like response in lung macrophages. These results highlight a crucial importance of bacterial cell-to-cell infection dynamics for early M. tuberculosis infection success, and indicate that lung macrophages might crucially contribute to the early protection provided by pulmonary live TB vaccines.

[es] La tuberculosis es actualmente la enfermedad infecciosa asociada a un único patógeno más devastadora, causando alrededor de 1.5 millones de muertes en 2018. A pesar de la existencia de la vacuna BCG y su amplia administración, su protección variable contra las formas respiratorias de la enfermedad junto con la creciente aparición de cepas resistentes a los antibióticos, convierte a la tuberculosis en un alarmante problema de salud global. La tuberculosis es causada en mamíferos por organismos del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MTBC), cuyos genomas presentan más del 99% de homología. Sin embargo, los miembros del MTBC muestran importantes diferencias en cuanto a especificidad de huésped y virulencia. Mycobacterium tuberculosis es el principal agente causal de la tuberculosis en humanos, mientras que otros miembros del MTBC causan tuberculosis en un amplio rango de mamíferos, como Mycobacterium bovis, el principal agente causal de la tuberculosis bovina. La tuberculosis bovina provoca importantes pérdidas económicas a nivel global asociadas al control de la enfermedad y a pérdidas de producción, tanto en países desarrollados como en países en vías de desarrollo. Además, la infección zoonótica causada por M. bovis representa una amenaza para la salud humana. A pesar de su alto grado de homología genómica, M. tuberculosis y M. bovis presentan importantes diferencias fenotípicas. M. bovis ha demostrado ser más virulenta que M. tuberculosis en diferentes modelos animales, y aunque M. tuberculosis no produce enfermedad en el ganado, M. bovis presenta un amplio rango de hospedadores, que incluye diferentes animales mamíferos salvajes y domesticados, así como el ser humano. En este trabajo, hemos caracterizado la infección de diferentes miembros del MTBC en modelo de ratón con el objetivo de definir sus diferencias de virulencia in vivo. Se ha observado que M. bovis presenta mayor virulencia que M. tuberculosis y M. africanum, al inducir mayor patología pulmonar y presentar mayor capacidad de diseminación, así como mayor grado de infectividad en pulmón y mayor infiltración de neutrófilos pulmonares. Sin embargo, a pesar de las diferencias de infección observadas entre M. bovis y M. tuberculosis, los mecanismos genéticos y moleculares responsables de las diferencias en virulencia y especificidad de huésped no son conocidos. La PknH es una serina/treonina quinasa implicada en la regulación de diversos procesos bacterianos en M. tuberculosis que, además, ha sido relacionada con virulencia. La organización genética de la región del genoma que contiene el gen de la pknH (región RD900) presenta gran variación a lo largo de los miembros del MTBC, entre los que se encuentran M. tuberculosis y M. bovis. Con el objetivo de estudiar las consecuencias de estas variaciones, hemos analizado la organización genética de la región RD900 y de los genes pknH en el contexto evolutivo del MTBC, demostrando la existencia de deleciones independientes de la región RD900 en diferentes linajes del MTBC y en diferentes cepas del mismo linaje. Además, se ha observado una deleción en una región correspondiente a un dominio rico en prolinas en el gen de la pknH conservada en M. bovis y M. caprae respecto al resto de especies del MTBC. El posible papel diferencial de la PknH en la regulación de la virulencia de M. bovis como consecuencia de estas variaciones ha sido evaluado mediante la construcción y caracterización de cepas mutantes de la PknH de M. bovis y M. tuberculosis. La inserción de la PknH de M. tuberculosis en el genoma de cepas de M. bovis dio lugar a una reducción de la virulencia de las cepas mutantes respecto a las cepas silvestres de M. bovis. Además, los perfiles de expresión génica de estas cepas mostraron diferencias en la expresión de un amplio conjunto de genes, lo que sugiere un posible papel diferencial de la PknH en la regulación de la virulencia de M. tuberculosis y M. bovis. La falta de eficacia de BCG en la protección contra la tuberculosis pulmonar convierte el desarrollo de nuevas estrategias de vacunación efectivas en una necesidad urgente. El uso de rutas alternativas de vacunación para la administración de BCG o de nuevos candidatos a vacuna ha cobrado un renovado interés durante los últimos años. Una de las rutas alternativas de administración más estudiadas es la ruta pulmonar, cuyo objetivo es mimetizar la vía natural de infección de M. tuberculosis. Diversos estudios preclínicos en diferentes modelos animales han demostrado que la vacunación pulmonar con BCG confiere mejor protección que la vacunación por vía subcutánea o intradérmica. Sin embargo, los estudios de la respuesta inmune inducida por la vacunación pulmonar con BCG realizados hasta el momento están centrados en el estudio de respuestas adaptativas, pero existen pocos datos de la inmunidad innata local y de la interacción de BCG con las células mieloides del pulmón. En este trabajo, hemos administrado micobacterias virulentas y atenuadas que expresan GFP por vía pulmonar, con el objetivo de caracterizar in vivo las poblaciones de células mieloides infectadas en el pulmón y las diferencias en la dinámica de infección en modelo de ratón, observándose grandes diferencias en los patrones de diseminación de M. tuberculosis y BCG. Mientras que BCG permanece principalmente en los macrófagos, M. tuberculosis disemina de forma activa de macrófagos a neutrófilos en un mecanismo dependiente de RD1. La presencia de BCG en los pulmones da lugar a la activación de los macrófagos del pulmón. Como consecuencia, la replicación y diseminación a neutrófilos de M. tuberculosis queda restringida cuando el patógeno es fagocitado por macrófagos pre-activados en ratones previamente vacunados con BCG por vía pulmonar, pero no subcutánea, lo que correlaciona con un elevado nivel de protección. Además, se ha demostrado que el mecanismo de activación de los macrófagos pulmonares inducido por BCG requiere la contribución de las células T CD4 para su generación, pero no para su mantenimiento. De forma relevante, la vacunación pulmonar con BCG induce la activación a largo plazo de los macrófagos alveolares, los cuales mantienen su estatus de activación y capacidad bactericida durante largo tiempo una vez que la vacuna ha sido eliminada del pulmón, lo que sugiere la generación de rasgos de memoria en los macrófagos pulmonares. Estos resultados destacan la gran importancia de la dinámica celular de infección para el éxito de la infección temprana con M. tuberculosis y sugieren que los macrófagos del pulmón contribuyen de manera crucial a la protección temprana contra la tuberculosis inducida por vacunas vivas administradas por vía pulmonar.