[en] Lactose is a milk disaccharide produced by nearly all mammalian species. For its digestion, it must be hydrolysed to galactose and glucose by lactase (EC 3.2.1.23), which is normally produced by the cells that line the small intestine. Deficiency or low levels of lactase (hypolactase) can cause common symptoms including bloating, abdominal pain or cramps, flatulence and diarrhea. Evaluation of enzyme deficiency is important in pediatrics and gastroenterology due to the high frequency of genetic predisposition (65%). Many of the standard diagnostic procedures are invasive, quite drastic and not applicable to infants and young childen. A non-invasive method was developed based on the use of 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-xylose (gaxilose), a structural analogue of lactose (it only lacks the hydroxymethyl group at position 5). This compound is substrate of the lactase enzyme in vivo, yielding D-galactose and D-xylose. The latter is passively absorbed from the small intestine and is eliminated in the urine where it can be quantified by a colorimetric procedure. Chemical synthesis of gaxilose requires the addition of protective groups and suffers from long, tedious reaction sequences with low overall productivity (9%). The biosynthetic route involving galactosyltransferase enzymes implies technical difficulties (unstable and expensive enzymes) and high costs. Glycosidases have been shown to catalyse the formation of glycosides by transglycosylation at low cost. Disadvantatges of this approach include yield limitations due to competing hydrolysis reactions, and purification problems because of the formation of other regioisomers and by-products. Escherichia coli β-galactosidase was selected to produce gaxilose at industrial level. After an enzymatic reaction and several purification steps, a yield of 20-23% is reached. The present work aims to increase gaxilose production yield by different strategies. First, enzymatic conditions were modified to increase enzymatic gaxilose production. On ther other hand, other enzymes were searched to be used as gaxilose biocatalysts. Bibliographic and experimental studies allowed to find one enzyme able to increase gaxilose yield up to 35% using 3.3-fold less enzyme, and thus diminishing the production costs). Despite the higher transglycosidase activity of the new enzyme, its hydrolase activity did not allow the increase of gaxilose prodution. Protein engineering (random and rational approaches) was used to modify the enzyme activity and increase gaxilose synthesis.

[es] La lactosa es un disacárido de la leche producido por casi todos los mamíferos. Para su digestión debe ser hidrolizado per la enzima lactasa (EC. 3.3.1.23), que es producida por las células epiteliales del intestino delgado, dando lugar a glucosa i galactosa. Su deficiencia o baja concentración (hipolactasia) puede producir diversos síntomas como son hinchazón, dolor abdominal, flatulencias y diarrea. La evaluación de la deficiencia de la lactasa es importante en pediatría y gastroenterología por la elevada frecuencia de esta alteración genética (65%). La mayoría de los métodos de diagnóstico son invasivos y drásticos y no son adecuados para su uso en población infantil. Frente a esta situación, se desarolló un nuevo método no invasivo. Éste se basa en la administración de 4-O-β-D-galactopiranosil-D-xilose (gaxilosa), un análogo estructural de la lactosa. Este compuesto también es sustrato de la lactasa y es hidrolizado dando lugar a galactosa y xilosa. El segundo se absorbe pasivamente a través del intetsino delgado y se elimina a través de la orina donde puede ser detectado por un método colorimétrico senzillo. La síntesi química de la gaxilosa requiere del uso de grupos protectores y de largos y complejos pasos de síntesis para llegar a rendimientos de producción bajos (9%). La ruta biosintética utilizando galactosyltransferasas comporta dificultades técnicas y costes elevados. Por otro lado, las glicosidasas tienen la capacidad de síntesis de glicósidos por transglicosidación con costes bajos. La principal desventaja de esta metodologia son los bajos rendimientos por la actividad hidrolítica de la enzima y los problemas de purificación por la formación de regioisómeros y/u otros productos. La β-galactosidasa de Escherichia coli fue seleccionada, entre otras enzimas, para la producción de gaxilosa a nivel industrial. Después de varios pasos de purificación el rendimiento es del 20-23%. Este trabajo pretende aumentar el rendimiento de la producción de gaxilosa. Primero se modificaron las condiciones de reacción para aumentar la activitat enzimática de transglicosidación. Por otro lado, se buscó otra enzima para la producción industrial. Estudios bibliográficos y experimentales permitieron la selección de una nueva enzima capaz de sintetitzar más gaxilosa, llegando a un rendimiento del 35% utilizando 3,3 veces menos enzima (con la consecuente disminución de los costes de producción). Aunque la nueva enzima presentaba una actividad de transglicosidación mayor, la actividad hidrolítica remanente no permite aumentar el rendimento. Para modificar la actividad enzimática y aumentar la síntesis de gaxilosa se decidió modificar la enzima mediante ingeniería de proteínas (racional y aleatoria).