[ca] Les malalties virals que impacten l'aqüicultura necessiten ser controlades de manera barata i eficientment. La vacunació és la principal eina preventiva per combatre malalties virals altament infeccioses que afecten els peixos de cultiu. En aquest estudi, presentem una innovadora plataforma modular recombinant de vacunes de subunitat per a administració oral, nanoestructurades com a cossos d'inclusió (IBs, Inclusion bodies). Les plataformes modulars inclouen la proteïna antigènica recombinant del virus unida a un His-tag a la part C-terminal. A més, per l'extrem N-terminal unim l'antigen viral recombinant amb un pèptid espaiador a un Interferó gamma recombinant com a adjuvant per avaluar si el domini IFN indueix un augment de la resposta immune. De la mateixa manera, unim l'antigen viral amb IFN a una seqüència lligant, per avaluar si el lligand seleccionat té el potencial de dirigir la vacuna a cèl·lules o òrgans de rellevància immunològica, i estimular una resposta immune local i/o sistèmica. Per a l'estudi, seleccionem el virus de la virèmia primaveral que afecta la carpa (SVCV) i el virus de la necrosi pancreàtica infecciosa que afecta salmònids (IPNV), espècies que en conjunt representen prop del 86% de la producció total de peixos cultivats a nivell mundial. Per primera vegada, dissenyem i produïm proteïnes recombinants nanoestructurades de la glicoproteïna G3 de SVCV, G3 de SVCV unit a IFN[Gamma] (SVCV-IFN), proteïna VP2 d'IPNV unit a IFN[Gamma] (IPNV-IFN) i VP2 d'IPNV unit a IFN[Gamma] lligant CCR5 (IPNV-IFN-CCR5). Realitzem la caracterització morfològica de les plataformes modulars per microscòpia electrònica d'escombrada (FESEM) i demostrem que les nanoestructures són internalitzades per cèl·lules hepàtiques de peix zebra (ZFL), per cultius primaris de macròfags de ronyó anterior de truita arcoiris (RT-HKM) i per cèl·lules d'intestí de truita (RTgutGC), mitjançant citometria de flux i microscòpia confocal. A nivell in vitro, els mòduls nanoestructurats van induir l'expressió de gens associats a la immunitat innata a cèl·lules de ZFL, RTgutGC i RT-HKM. En experiments in vivo amb larves de peix zebra (D. rerio) demostrem que els nanopellets SVCV i SVCV-IFN fluorescents són absorbits a nivell intestinal i en pàncrees. A més, demostrem que els peixos zebra adults vacunats amb SVCV-IFN i desafiats amb el virus SVC, presenten un excel·lent nivell de protecció, indicant el potencial adjuvant del mòdul IFN[Gamma]. En assaigs in vivo amb truita arcoiris (O. mykiss) administrats per intubació oral, demostrem que els nanopellets IPNV i IPNV-IFN fluorescents són absorbits en el tracte intestinal, biodistribuïts al ronyó anterior i endocitats per macròfags del ronyó. En experiments in vivo, truites juvenils van ser intubades de forma oral amb IPNV-IFN i IPNV-IFN-CCR5 i vam observar l'expressió de marcadors de gens de resposta immune en intestí posterior, melsa i macròfags del ronyó anterior el dia 1, 3, 15 i 21 després de la intubació. A més, sèrums obtinguts 21 dies post intubació amb el mòdul lligand (IPNV-IFN-CCR5) van mostrar una inducció significativa d'anticossos específics del virus IPN en comparació a IPNV-IFN i els grups control, cosa que podria indicar que el lligand CCR5 pot estar promovent la migració cel·lular i conseqüentment la inducció d'anticossos específics del virus d'IPN. Els resultats en conjunt mostren que les vacunes orals de subunitat que inclouen els mòduls interferó gamma i/o lligant poden estimular la resposta immune innata-adaptativa i protegir els peixos contra el virus de SVC i IPN.

[en] It is of great importance to control viral diseases affecting aquaculture in an efficient and cost-effective manner. Vaccination represents the primary preventive measure against highly infectious viral diseases that affect farmed fish. This study presents an innovative recombinant modular platform of subunit vaccines for oral administration, nanostructured as inclusion bodies (IBs). The modular platforms include the recombinant antigenic virus protein bound to a His-tag at the C-terminal part. Furthermore, at the N-terminal end, we have attached the recombinant viral antigen with a spacer peptide to a recombinant gamma interferon as an adjuvant in order to assess whether the IFN domain induces an increase in the immune response. Similarly, we have attached the viral antigen with IFN to a ligand sequence in order to assess whether the selected ligand has the potential to target the vaccine to immunologically relevant cells or organs, and to stimulate a local and/or systemic immune response. The study selected two viral pathogens affecting fish: spring viraemia virus affecting carp (SVCV) and infectious pancreatic necrosis virus affecting salmonids (IPNV). These two pathogens collectively account for approximately 86% of the total production of farmed fish worldwide. For the first time, we designed and produced nanostructured recombinant proteins of SVCV G3 glycoprotein (SVCV), SVCV G3 bound to IFN[Gamma] (SVCV-IFN), IPNV VP2 protein bound to IFN[Gamma] (IPNV-IFN) and IPNV VP2 bound to IFN[Gamma] and a CCR5 ligand (IPNV-IFN[Gamma]-CCR5). Morphological characterisation of the modular platforms was performed by scanning electron microscopy (FESEM), which demonstrated that the nanostructures are internalised by zebrafish liver cells (ZFL), by primary cultures of rainbow trout anterior kidney macrophages (RT-HKM) and by trout intestine cells (RTgutGC). This was achieved by flow cytometry and confocal microscopy. In vitro, the nanostructured modules induced the expression of innate immunity-associated genes in ZFL, RTgutGC and RT-HKM cells. In vivo experiments with zebrafish (D. rerio) larvae demonstrated that fluorescent SVCV and SVCV-IFN nanopellets are taken up in the intestine and pancreas. Furthermore, we demonstrate that adult zebrafish vaccinated with SVCV-IFN and challenged with SVC virus exhibit an excellent level of protection, indicating the adjuvant potential of the IFN[Gamma] module. In in vivo assays with rainbow trout (O. mykiss) administered by oral intubation, we demonstrate that fluorescent IPNV and IPNV-IFN nanopellets are absorbed in the intestinal tract, biodistributed to the anterior kidney and endocytosed by kidney macrophages. In vivo experiments were conducted on juvenile trout, which were orally intubated with IPNV-IFN and IPNV-IFN-CCR5. The expression of immune response gene markers was observed in hindgut, spleen and anterior kidney macrophages at days 1, 3, 15 and 21 post-intubation. Furthermore, sera obtained 21 days post-intubation with the ligand module (IPNV-IFN-CCR5) demonstrated a significant induction of IPN virus-specific antibodies in comparison to IPNV-IFN and control groups. This suggests that the CCR5 ligand may be promoting cell migration and consequently the induction of IPN virus-specific antibodies. In conclusion, the results demonstrate that oral subunit vaccines comprising gamma interferon and/or ligand modules can elicit an innate-adaptive immune response and protect fish against SVC and IPN virus.