[en] DNA replication is a risky process for the cell. Chromosomal DNA synthesis takes place at specialized structures (replication forks), which present intrinsic fragility and are preferred substrates of unscheduled recombination events. When replication fork progression is hampered, they can collapse priming DNA breaks and genomic rearrangements. Collision of replication forks with actively transcribed genes is a potential main determinant of replication fork stalling and a number of pathways have been involved in transcribed genomic regions protection. In budding yeast, DNA topoisomerase II (Top2) has been proposed to organize architectural domains to prevent DNA breaks following transcribed regions replication. Factors acting in the interface between transcription and mRNA export, like the THO/TREX complex, also suppress the accumulation of DNA:RNA hybrids forming at negatively supercoiled segments behind transcription bubble. DNA:RNA hybrids, when engaged by replication forks, prime aberrant recombination events and chromosomal abnormalities. Over 26 years ago, a topoisomerase-like catalytic active site was described in the Hpr1 THO component, raising the possibility that the complex modulates transcribed regions topology. To address this point, we mutagenized Hpr1 topoisomerase-like catalytic tyrosine to generate an hpr1-Y590A mutant allele. We found that hpr1-Y590A cells are sensitive to treatment with the replication inhibitor hydroxyurea, suggesting that Hpr1 might play a topological role in promoting replication fork stability. The hpr1-Y590A allele shows synthetic growth defects in combination with top2 mutations, and hpr1-Y590A top2-1 cells accumulate checkpoint activation signals following S-phase completion. This evidence suggests a degree of coordination between Hpr1 and Top2 in resolving topological stress and preventing chromosomal breaks at sites of replication transcription interference. Moreover, putative Hpr1 catalytic tyrosine mutation leads to the accumulation of negatively supercoiled topoisomers in Top1 compromised cells. We propose that the topoisomerase like catalytic tyrosine residue of Hpr1 contributes to modulate DNA topology at transcribed chromatin thus alleviating deleterious collisions between DNA replication and gene transcription machineries. Formation of secondary structures on the template DNA can also destabilize replication forks and prime chromosome rearrangements. Human minisatellite repeats, which show highly dynamic changes in repeat number, are prone to form G-quadruplexes, a four-stranded structure in which guanines within a single stranded DNA stretch pair and stack. Using budding yeast model system we have studied the replication of the human sub-telomeric minisatellites CEB25 and c-MYC. By 2D gel electrophoresis, we found that aberrant replication intermediates accumulate at CEB25 harboring regions in cells lacking Pif1 helicase. Likewise during the replication of c-MYC human minisatellite, we observed the accumulation of recombination intermediates in cells in which Pif1 activity is compromised. These defects observed are consistent with the proposed role of Pif1 in unwinding G-quadruplexes. We propose that these replication defects upon G-quadruplex stabilization in Pif1-ablated cells repeats reflect strand discontinuities in CEB25 minisatellite, while they determine fork breakage and unscheduled recombination repair attempts within the c-MYC minisatellite.

[es] La replicaci?n del ADN es un proceso peligroso para la c?lula. La s?ntesis del ADN cromos?mico tiene lugar en las estructuras especializadas (horquillas de replicaci?n), las cuales presentan una fragilidad intr?nseca y son sustrato frequente de eventos de recombinaci?n no programados. Cuando se impide la progresi?n de las horquillas de replicaci?n, pueden llegar colapsar y originar roturas del ADN y reordenamientos gen?micos. La colisi?n de horquillas de replicaci?n con genes activamente transcritos es un importante determinante potencial del bloqueo de las horquillas de replicaci?n y un gran n?mero de rutas celulares se ven involucradas en la protecci?n de regiones gen?micas transcritas. En la levadura en gemaci?n, se ha propuesto que la topoisomerasa de ADN II (Top2) organiza dominios arquitect?nicos para prevenir las roturas de ADN derivadas de la replicaci?n de regiones transcritas. Algunos factores que act?an en la conjunci?n entre la transcripci?n y la exportaci?n de ARNm, como el complejo THO/TREX, tambi?n previenen la acumulaci?n de h?bridos de ADN y ARN que se forman en segmentos superenrollados negativamente detr?s de la burbuja de transcripci?n. Cuando las horquillas de replicaci?n encuentran h?bridos de ADN y ARN se originan eventos de recombinaci?n aberrantes y anomal?as cromos?micas. Hace unos 26 a?os, se describi? un sitio activo catal?tico similar a la topoisomerasa en el componente Hpr1 del complejo THO, planteando la posibilidad de que este complejo modulase la topolog?a de las regiones transcritas. Con esto en mente, mutamos la tirosina catal?tica similar a la de topoisomerasa para generar un alelo mutante hpr1-Y590A. Descubrimos que los c?lulas hpr1-Y590A son sensibles al tratamiento con el inhibidor de replicaci?n hidroxiurea, lo que sugiere que el Hpr1 puede desempe?ar un papel topol?gico a la hora de fomentar la estabilidad de las horquillas de replicaci?n. El alelo hpr1-Y590A muestra defectos de crecimiento sint?tico en combinaci?n con mutaciones top2, y las c?lulas hpr1-Y590A top2-1 acumulan se?ales de activaci?n de puntos de control tras la finalizaci?n de la fase S. Esta evidencia sugiere un grado de coordinaci?n entre Hpr1 y Top2 a la hora de aliviar estr?s topol?gico y prevenir roturas cromos?micas en los lugares donde interfieren replicaci?n y transcripci?n. Adem?s, la tirosina catal?tica putativa de Hpr1 conduce a la acumulaci?n de topoisomeros superenrollados negativamente en c?lulas comprometidas en la actividad de Top1. Proponemos que el residuo de la tirosina catal?tica topoisomerase similar a la de topoisomerasa de Hpr1 contribuye a la modulaci?n de la topolog?a del ADN en la cromatina transcrita, paliando as? colisiones da?inas entre las maquinarias de replicaci?n del ADN y de transcripci?n g?nica. La formaci?n de estructuras secundarias en el molde de ADN puede desestabilizar a las horquillas de replicaci?n y dar lugar a reordenamientos de cromosomas. Las repeticiones de minisat?lites humanos, que muestran cambios muy din?micos en el n?mero de repeticiones, tienden a formar quadruplexes de Gs, estructuras de cuatro cadenas en las que las guaninas de un tramo de ADN monocatenario se emparejan y se apilan. Mediante el sistema de levadura en gemaci?n, hemos estudiado la replicaci?n de los minisat?lites subtelom?ricos humanos CEB25 y c-MYC. A trav?s de electroforesis en gel de 2D observamos que los intermediarios replicativos aberrantes se acumulan en las regiones donde se ubica CEB25 en c?lulas carente de la helicasa Pif1. Del mismo modo, durante 3 la replicaci?n del minisat?lite humano c-MYC, observamos acumulaciones de putativos intermediarios de recombinaci?n en c?lulas en las que la actividad Pif1 se encuentra comprometida. Estos defectos son coherentes con la funci?n propuesta de Pif1 a la hora de desenrollar quadruplexes de Gs. Proponemos que estos defectos de replicaci?n en la estabilizaci?n de quadruplexes de Gs en repeticiones de c?lulas con ablaci?n de Pif1 reflejan discontinuidades de cadena naciente en el minisat?lite CEB25, mientras determinan roturas de horquillas e intentos no programados de reparaci?n de mediante recombinaci?n en el minisat?lite c-MYC HIP?TESIS DE TRABAJO Con los datos obtenidos, formulamos la hip?tesis de que la subunidad Hpr1 del complejo THO presenta una actividad equivalente a topoisomerasa para aliviar el estr?s torsional acumulado detr?s de la maquinaria transcripcional, que de no concluir favorece la formaci?n de h?bridos ARN:ADN, a los que se les atribuye el bloqueo de la replicaci?n de horquillas. De la misma manera, postulamos tambi?n que se requiere espec?ficamente la helicasa Pif1 para determinar las estructuras quadruplexes de Gs formados por los minisat?lites humanos CEB25 y c-MYC. OBJETIVOS GENERALES El objetivo principal de esta tesis es investigar los mecanismos que impiden la inestabilidad de las horquillas de replicaci?n en los contextos de 1) un conflicto entre las maquinarias de replicaci?n con la transcripci?n g?nica activa y 2) durante la progresi?n de replicaci?n a lo largo de estructuras secundarias del ADN formando quadruplexes de Gs. Los principales objetivos son: 1) definir el papel de la subunidad Hpr1 del complejo THO a la hora de modular la topolog?a de la cromatina transcrita y de proteger la integridad de la replicaci?n de horquillas; 2) estudiar la contribuci?n de la helicasa Pif1,esencial para la replicaci?n de diferentes quadruplexes de Gs y la formaci?n de secuencias de minisat?lites humanos. CONCLUSIONES GENERALES Teniendo en cuenta los datos presentados en este estudio, concluimos lo siguiente: I) un residuo de tirosina catal?tica similar a la de topoisomerasa est? bien conservada en ort?logos Hpr1 desde levaduras hasta eucariotas superiores. II) el residuo catal?tico topoisomerase-like de Hpr1 es necesario para que las c?lulas protejan las horquillas de replicaci?n en condiciones de estr?s replicativo. III) Hpr1 y Top2 probablemente comparten una funci?n topol?gica solapante a la hora de favorecer el crecimiento celular y de mantener la estabilidad de horquillas bloqueadas. IV) Es posible que el residuo catal?tico similar a topo Hpr1 coopere con Top2 a la hora de evitar conflictos entre la replicaci?n y la transcripci?n para proteger la integridad cromos?mica. V) el residuo de tirosina catal?tica de Hpr1 podr?a actuar como topoisomerasa para aliviar estr?s torsional acumulado detr?s de la maquinaria ARN polimerasa II durante la transcripci?n g?nica. VI) la replicaci?n del minisat?lite humano CEB25 en ausencia de la helicasa Pif1 probablemente de lugar a discontinuidades en las cadenas nacientes dentro de la secuencia de repetici?n. VII) la replicaci?n del minisat?lite humano c-MYC en c?lulas con ablaci?n de la actividad Pif1 conduce a la acumulaci?n de intermediarios consistentes con intentos de reparaci?n de recombinaci?n hom?logos de las horquillas de replicaci?n colapsadas.