[ca] MYC és un factor de transcripció essencial en la biologia humana, regulant processos com la proliferació cel·lular, la diferenciació i el metabolisme. La seva desregulació en la majoria de càncers humans, degut a la sobreexpressió i la pèrdua dels controls reguladors, contribueix al creixement i manteniment dels tumors. Per això, la inhibició de MYC és una diana terapèutica atractiva en oncologia. No obstant, la seva naturalesa desordenada i localització nuclear han dificultat la seva inhibició directa. Al 2021, Peptomyc va portar a la clínica el primer inhibidor directe de MYC en forma de mini-proteïna, Omomyc, que actua com a dominant negatiu, amb propietats de penetració cel·lular intrínseca. Aquest avenç ha obert el camí per al desenvolupament d'una nova classe de proteïnes terapèutiques en forma de dominis b-HLH-LZ, inspirant el disseny de molècules similars. Aquesta tesi té com a objectiu establir les bases per al desenvolupament de nous candidats a fàrmacs basats en Omomyc, a través de l'ús d'eines de caracterització rellevants. Es van explorar dues estratègies per potenciar l'activitat antitumoral d'Omomyc: Primer, es va estudiar la modulació de l'eficiència de penetració cel·lular i la localització nuclear de variants derivades d'Omomyc a través de mutacions curtes i la fusió amb pèptids de penetració cel·lular. Amb un panell de 23 variants d'Omomyc o Max*, es va observar que la fusió de CPPs a les variants millorava la seva cinètica de penetració, i l'eficiència general es potenciava amb la fusió d'una seqüència dirigida al EGFR. No obstant això, aquesta millora va comportar una reducció de l'estabilitat estructural, una vinculació a l'ADN menys específica i una solubilitat reduïda. Les truncacions al domini de la cremallera de leucina també van afectar l'estabilitat de la proteïna, amb truncacions majors que disminuïen l'expressió recombinant i la solubilitat. Finalment, es va concloure que l'ús de HisTag agilitava la purificació de variants, però afectava negativament la capacitat de vinculació a l'ADN, limitant la seva avaluació. La segona part de la tesi va explorar com les modificacions en la càrrega neta de les proteïnes derivades d'Omomyc influïen en la solubilitat, la vinculació a MYC, MAX i l'ADN, i la seva activitat cel·lular. Es va demostrar que les variants amb un pI més baix tenien perfils de solubilitat més avantatjosos a pH neutre i bàsic. Tot i que la seva estabilitat estructural era inferior, aquestes variants mantenien la capacitat de vincular-se a MYC i MAX, indicant que les seves funcions nuclears es preservaven malgrat els canvis estructurals. No obstant això, les variants amb canvis profunds en el pI mostraven una afinitat reduïda per l'ADN, que es recuperava mitjançant l'heterodimerització amb Max*. Sorprenentment, la seva capacitat de penetració cel·lular no correlacionava amb l'eficàcia per inhibir la proliferació cel·lular, suggerint que altres factors, com l'estabilitat intracel·lular o la localització nuclear, podrien influir en l'eficàcia terapèutica. A més, un nou assaig va destacar el comportament diferent de les variants en plasma i sang sencera, indicant que la modulació de la càrrega neta podia influir en el perfil farmacocinètic. En conjunt, els resultats d'aquesta tesi proporcionen informació clau sobre els reptes i oportunitats en el desenvolupament de mini-proteïnes derivades d'Omomyc com a agents terapèutics. Tot i que la fusió de CPPs millora la penetració cel·lular, cal equilibrar els compromisos en estabilitat estructural i funcionalitat. Les mutacions de càrrega mostren potencial per millorar la solubilitat i l'estabilitat, fet que podria millorar la farmacocinètica in vivo. Aquest treball avança la comprensió sobre com es pot aconseguir la inhibició de MYC a través del disseny racional de mini-proteïnes, i estableix les bases per a l'optimització futura de les proteïnes b-HLH-LZ com a teràpies viables contra el càncer.

[es] MYC es un factor de transcripción esencial en la biología humana, regulando procesos como la proliferación celular, la diferenciación y el metabolismo. Su desregulación en la mayoría de cánceres humanos, debido a la sobreexpresión y pérdida de los controles reguladores, contribuye al crecimiento y mantenimiento de los tumores. Por eso, la inhibición de MYC es una diana terapéutica atractiva en oncología. Sin embargo, su naturaleza desordenada y localización nuclear han dificultado su inhibición directa. En 2021, Peptomyc llevó a la clínica al primer inhibidor directo de MYC en forma de mini-proteína, Omomyc, que actúa como dominante negativo, con propiedades de penetración celular intrínseca. Este avance ha abierto el camino para el desarrollo de una nueva clase de proteínas terapéuticas en forma de dominios b-HLH-LZ, inspirando el diseño de moléculas similares. Esta tesis tiene como objetivo sentar las bases para el desarrollo de nuevos candidatos a fármacos basados en Omomyc, a través del uso de herramientas de caracterización relevantes. Se exploraron dos estrategias para potenciar la actividad antitumoral de Omomyc: Primero, se estudió la modulación de la eficiencia de penetración celular y la localización nuclear de variantes derivadas de Omomyc a través de mutaciones cortas y la fusión con péptidos de penetración celular. Con un panel de 23 variantes de Omomyc o Max*, se observó que la fusión de CPPs en las variantes mejoraba su cinética de penetración, y la eficiencia general se potenciaba con la fusión de una secuencia dirigida al EGFR. Sin embargo, esta mejora supuso una reducción de la estabilidad estructural, una vinculación al ADN menos específica y una solubilidad reducida. Las truncaciones en el dominio de la cremallera de leucina también afectaron a la estabilidad de la proteína, con truncaciones mayores que disminuían la expresión recombinante y la solubilidad. Por último, se concluyó que el uso de HisTag agilizaba la purificación de variantes, pero afectaba negativamente a la capacidad de vinculación al ADN, limitando su evaluación. La segunda parte de la tesis exploró cómo las modificaciones en la carga neta de las proteínas derivadas de Omomyc influían en la solubilidad, la vinculación a MYC, MAX y el ADN, y su actividad celular. Se demostró que las variantes con un pI más bajo tenían perfiles de solubilidad más ventajosos a pH neutro y básico. Aunque su estabilidad estructural era inferior, estas variantes mantenían la capacidad de vincularse a MYC y MAX, indicando que sus funciones nucleares se preservaban a pesar de los cambios estructurales. Sin embargo, las variantes con cambios profundos en el pI mostraban una afinidad reducida por el ADN, que se recuperaba mediante la heterodimerización con Max*. Sorprendentemente, su capacidad de penetración celular no correlacionaba con la eficacia para inhibir la proliferación celular, sugiriendo que otros factores como la estabilidad intracelular o la localización nuclear podrían influir en la eficacia terapéutica. Además, un nuevo ensayo destacó el comportamiento distinto a las variantes en plasma y sangre entera, indicando que la modulación de la carga limpia podía influir en el perfil farmacocinético. En conjunto, los resultados de esta tesis proporcionan información clave sobre los retos y oportunidades en el desarrollo de mini-proteínas derivadas de Omomyc como agentes terapéuticos. Aunque la fusión de CPPs mejora la penetración celular, es necesario equilibrar los compromisos en estabilidad estructural y funcionalidad. Las mutaciones de carga muestran potencial para mejorar la solubilidad y la estabilidad, lo que podría mejorar la farmacocinética in vivo. Este trabajo avanza la comprensión sobre cómo conseguir la inhibición de MYC a través del diseño racional de mini-proteínas, y sienta las bases para la optimización futura de las proteínas b-HLH-LZ como terapias viables contra el cáncer.