[en] The developed self-assembling platform allows the engineering of protein-only nanoparticles (NPs) capable to target and act selectively over cancer cells by means of the interaction with overexpressed receptors. The stability of the spherical NP structures and their adequate size, in combination with the involved targeting peptides, enhance their specificity. Also, the novel incorporation of toxin and venom segments have improved the therapeutic effects of these fully biocompatible materials, without the need of any external carrier or added material, thus fulfilling the newfangled concept for precision medicines that involve self-assembled, self-targeted and efficient vehicle-free recombinant drugs. A modified version of the catalytic ricin A chain, with the ability to diminish the undesired vascular leak syndrome side effects but retaining its natural cytotoxicity, was adapted to the protein platform. The design was developed with the peptide T22 in the N-terminal, which binds CXCR4, and a his-tag in the C-terminal. This was combined with a furin cleavable site fragment in order to release the protein intracellularly, and a KDEL sequence to avoid endoplasmic reticulum secretion. Purified soluble CXCR4-targeted ricin A chain NPs with an average diameter of 11 nm, reached a 100-fold cytotoxic improvement with an IC50 of 13 ± 0.5 x 10 -9 M in HeLa cells. Also, insoluble 400-600 nm inclusion bodies were produced by recombinant methods and purified, with partial cytotoxic results. The receptor-dependent mechanism of T22-mRTA-H6 was verified and evaluated in an acute myeloid leukemia (AML) mouse model by systemic administration through a vein tail injection where an important blockage of the leukemic cells was verified without side systemic or histological toxicity in healthy organs. In a similar way, chlorotoxin (CTX) was also incorporated to the protein platform in order to take advantage of its targeting and therapeutic effect in glioblastoma (GBM), both functions in one peptide. Two versions that target protein Annexin-2 and the matrix metalloproteinase MMP-2 were engineered, namely CTX-GFP-H6 and CTX-KRKRK-GFP-H6. The soluble NPs of an average dimeter of 12 nm were incubated with HeLa cells, overexpressing annexin-2, and in U87MG cells, overexpressing MMP2. Both versions were fully fluorescent but CTX-GFP-H6 presented mild cytotoxic effects, whereas CTX-KRKRK-GFP-H6 showed to be more cytotoxic in U87MG cells than in HeLa cells. The selective affinity of CTX was confirmed by means of evaluating its targeting using a monoclonal antibody and a polyclonal serum against the cell surface protein, acting as a CTX receptor.

[es] La plataforma desarrollada de ingeniería de proteínas autoensamblables permite diseñar nanopartículas únicamente proteicas (NPs) capaces de atacar y actuar selectivamente sobre las células cancerosas mediante la interacción con receptores que se sobreexpresan. Las estructuras esféricas estables de las NPs desarrolladas y su tamaño adecuado, en combinación con los péptidos de direccionamiento involucrados, mejoran su especificidad. Además, la novedosa incorporación de segmentos de toxina y veneno ha mejorado los efectos terapéuticos de estas estructuras que son totalmente biocompatibles y que no tienen ningún portador externo o material agregado, cumpliendo de esta manera con el concepto emergente para medicamentos de precisión que involucra un fármaco recombinante libre de vehículo, autoensamblado, auto-dirigido y eficiente. Una versión modificada de la cadena catalítica de ricina A, con la capacidad de disminuir los efectos secundarios no deseados del síndrome de derrame vascular, pero conservando su citotoxicidad natural, se adaptó a la plataforma de proteínas. El diseño se desarrolló con el péptido T22, que se une a CXCR4, en el extremo N-terminal, y una cola de histidinas en el extremo C-terminal, en combinación con un fragmento del sitio escindible de furina para liberar la proteína intracelularmente, y una secuencia KDEL para evitar secreción del retículo endoplásmico. Las NPs de cadena de ricina A solubles purificadas dirigidas a CXCR4, con un diámetro promedio de 11 nm, alcanzaron un incremento de 100 veces en su citotoxicidad con un IC50 de 13 ± 0,5 x 10 -9 M en células HeLa. Pero también se produjeron por métodos recombinantes y se purificaron cuerpos de inclusión insolubles de 400-600 nm, con resultados citotóxicos parciales. El mecanismo de entrada dependiente del receptor de T22-mRTA-H6 se verificó y evaluó en un modelo de ratón con leucemia mieloide aguda (AML) mediante la inyección sistémica en la vena de la cola, donde se verificó un bloqueo importante de las células leucémicas sin toxicidad sistémica o histológica lateral en los órganos sanos. De manera similar, la clorotoxina (CTX) también se incorporó a la plataforma de proteínas con el fin de aprovechar su direccionamiento y efecto terapéutico en glioblastoma (GBM), ambas funciones en un solo péptido. Se diseñaron dos versiones que se unen a la proteína anexina-2 y la metaloproteinasa de matriz MMP-2; CTX-GFP-H6 y CTX-KRKRK-GFP-H6. Lss NPs solubles, de un diámetro promedio de 12 nm, se incubaron en células HeLa sobreexpresando anexina-2, y en células U87MG, sobreexpresando MMP2. Ambas versiones eran completamente fluorescentes, pero CTX-GFP-H6 presentó efectos citotóxicos leves, mientras que CTX-KRKRK-GFP-H6 mostró ser más citotóxico en las células U87MG que en las células HeLa. La afinidad selectiva de CTX se confirmó mediante la evaluación de su direccionamiento utilizando anticuerpos monoclonales y un suero policlonal contra la proteína de la superficie celular, actuando como un receptor de la CTX.