[en] Introduction: Inherited platelet disorders [IPD] are a heterogeneous group of rare diseases that affect the platelet count or its functions. The clinical severity is variable, from insignificant to life-threatening. Its genetic diagnosis has been facilitated in recent years with the introduction of high throughput sequencing [HTS]. On the contrary, there have not been major advances in the clinical management of IPD. Objective: To characterize a series of patients with suspected TPC, identify the underlying molecular pathology, and demonstrate the pathogenicity of their molecular variants. Additionally, to explore the value of gene therapy in clinically severe IPD. Methodology: We recruited patients with bleeding diathesis, platelet dysfunction and/orthrombocytopenia to the multicenter project of "Functional and Molecular Characterization of patients with IPD". We re-evaluate their clinical history and family background, studied the platelet phenotype, and addressed their genetic diagnosis by means of HTS of pre-designed panel of genes. The pathogenicity of the candidate variants identified in the patients was evaluated applying the ACMG criteria, and carrying out specific tests in patient samples and cell models. Using CRISPR/Cas9 technology, we generated a model of CD34+ cells of Glanzmann Thrombasthenia [GT] (CD34+ GT-like] phenotype. We designed a viral vector to correct the defect in the CD34+ GT-like cells. Results: We have functionally and molecularly characterized 50 patients from 14 unrelated families. i) We show that the bleeding diathesis in a young girl is caused by the heterozygous presence of the p.Asn143Ser variant in PTGS1 (cyclooxygenase -1 or COX-1). An aspirin-like platelet dysfunction pattern was demonstrated, with a selective platelet aggregation defect for arachidonic acid and a reduced platelet capacity for TXA2 synthesis. Studies in platelets and 293 cells demonstrated that the mutation causes the loss of an N-glycan, generating a hypoglycosylated protein with a dominant negative effect on COX-1 function. ii) We characterize a large pedigree with SRC-RT macrothrombocytopenia, with 7 carriers of the p.E527K variant in Src. We confirmed a platelet aggregation, activation and secretion defect, more marked, but not exclusive, for GPVI agonists; we also found an -granule markers defect by immunfluorescence of blood smears; the gain of function of this mutation caused constitutive tyrosine phosphorylation of platelet proteins including Src, PLC and Btk. We show that in these patients coexist platelets, immune and neurological alterations. The platelet response to splenectomy and steroids, as well as the apparent inflammatory status in some of patients, suggested a certain clinical similarity to immune thrombocytopenia (ITP). iii) We describe the largest series, so far, of patients with TUBB1-RT (9 families), carrying 6 TUBB1 variants (p.Cys12Leufs12 *, p.Thr107Pro, p.Gln423 *, p.Arg359Trp, p.Gly109Glu, and p.Gly269Asp). Incomplete penetrance was observed in these pedigrees, with most carriers presenting with macrothrombocytopenia, few others without thrombocytopenia but with large platelets, and a minority of carriers with normal platelets. We found in a pedigree, for the first time in TUBB1-RT, that the TUBB1 mutation, p.Gly109Glu, causes disease only in homozygosity, highlighting the importance of allelic burden. Platelet studies (expression of GPs, aggregation, activation and secretion, spreading) showed little effect of these mutations on platelet function, consistently with the moderate or absent clinical hemorrhage in patients with TUBB1-RT. The expression of these mutations (only the misssense ones) in CHO cells was shown to significantly affect the expression and localization of1-tubulin. In vitro culture of CD34+ cells from these patients demonstrated that the mutations alter the differentiation/maturation of Mks and proplatelets formation. The data obtained in this series of families and mutations of TUBB1, has allowed us to reclassify the pathogenicity of the identified variants and to define ACGM pathogenicity criteria adapted to utations in TUBB1.iv) Characterization of the platelet phenotype (aggregation, activation, granule quantification by electron microscopy and immunofluorescence), family segregation studies and, most novelty, platelet transcriptome analysis, strongly support the pathogenicity of RUNX1 variants p.Gln268* and p.Thr196Ala, but not that of p.Asn159Ser. Up to 70% of the genes previously described as RUNX1 targets, (including among others MYL9, MYH9, ALOX12, TREML1 and ITGA2),), showed in our array a decreased expression in carriers of the p.Gln268* and p.Thr196Ala variants, compared to healthy controls. These data were confirmed, for some genes, by qPCR-RT. In the case of p.Asn159Ser, only 7% of the genes showed altered expression. We classified the 120 most downregulated genes into 5 groups: genes involved in the cytoskeleton (18%); genes involved in signal transduction (40%); genes related to interaction with DNA; genes involved in the cell cycle; genes associated, at least occasionally, with tumor processes. We also found a large number of overexpressed genes, the first being CA1, the gene that encodes carbonic anhydrase I. Among those overexpressed, there are genes that encode proteins of erythroid origin, membrane transporters, ribosomal proteins and others involved in the synthesis, modification and degradation of proteins. Also LXN, a gene that encodes latexin, a protein recently recognized as a tumor suppressor in hematological neoplasms. v) We developed a cell model with a TG phenotype in which we demonstrated the efficacy of our viral vector to reverse the pathological phenotype. Conclusions: We present the clinical, functional and molecular diagnosis of a large number of patients with suspected IPD, characterizing 11 genetic variants in 4 different genes. We report the third case of platelet dysfunction and bleeding associated with molecular pathology of PTGS1. This patient reveals the importance of N-glycosylation in the function activity of COX-1. We also have characterized the fourth family with the p.E527K mutation and SRC-RT, which reveals the coexistence of platelet, immune and neurological alterations in this pathology. The apparent partial similarity with ITP could help to establish future treatment strategies. The study of the largest series described to date of TUBB1-RT, reveals that incomplete penetrance is a common phenomenon in this disease, highlights the importance of the allelic burden, consolidates the defect in Mks maturation and proplatelets formation caused by TUBB1 mutations, and reflect an almost negligible effect of these mutations on platelet reactivity, consistent with the moderate or absent clinical bleeding in patients with TUBB1-RT. Platelet transcriptome analysis in three cases with suspected RUNX1-RT shows that it can be a useful tool to establish the pathogenicity of new RUNX1 mutations, identified in patients with or without a personal or family history of neoplasia. Finally, we demonstrate the usefulness of CRISPR/Cas9 technology to design IPD models, such as Glanzmann's Thrombasthenia. We also show the efficacy of a viral vector to reverse the GT phenotype in vitro. These pre-clinical data represent an important step forward to the potential clinical use of gene therapy as a curative alternative in severe IPD.

[es] Introducción: Los Trastornos plaquetarios congénitos [TPC] son un grupo heterogéneo de enfermedades raras que afectan al recuento de plaquetas o a sus funciones. Su severidad clínica es variable, desde complicaciones insignificantes a potencialmente mortales. Su diagnóstico genético se ha visto facilitado en los últimos años con la introducción de la secuenciación masiva. Por el contrario, no ha habido grandes avances en su manejo clínico. Objetivo: Caracterizar una serie de pacientes con sospecha de padecer un TPC, identificar su patología molecular subyacente, y demostrar la patogenicidad de sus variantes moleculares. Adicionalmente, explorar el potencial de la terapia génica en los TPC clínicamente severos Metodología: Reclutamos pacientes con diátesis hemorrágica, disfunción plaquetaria y/o trombocitopenia en el proyecto multicéntrico de "Caracterización Funcional y Molecular de pacientes con TPC". Re-evaluamos su historial clínico y antecedentes familiares, estudiamos el fenotipo plaquetario, y abordamos el diagnóstico genético mediante secuenciación masiva de un panel de genes prediseñado. Se evaluó la patogenicidad de las variantes candidatas identificadas en los enfermos, aplicando los criterios de ACMG, y realizando ensayos específicos. Aplicando la tecnología CRISPR/Cas9, generamos un modelo de células CD34+ con fenotipo de Trombastenia de Glanzmann [TG] (CD34+ TG-like). Diseñamos un vector viral como potencial terapia génica para la TG. Resultados: Hemos caracterizado funcional y molecularmente 50 pacientes de 14 familias no emparentadas. i) Demostramos que la diátesis hemorrágica en una niña está causada por la presencia en heterocigosis de la variante p.Asn143Ser en PTGS1 (ciclooxigenasa -1). Se demostró un patrón de disfunción plaquetaria aspirina-like, con defecto de agregación plaquetaria selectivo para ácido araquidónico y reducida capacidad de síntesis plaquetaria de TXA2. Estudios en plaquetas y en células 293THEK, demostraron que la mutación provoca la pérdida de un N-glicano generando una proteína hipoglicosilada con un efecto dominante negativo en la función. ii) Caracterizamos un pedigrí con macrotrombocitopenia tipo SRC-RT, con 7 portadores de la variante p.E527K en Src. Confirmamos un defecto de agregación, activación y secreción plaquetaria, más marcado, pero no exclusivo, para agonistas de GPVI; un defecto de marcadores -granulares mediante inmunfluorescencia en frotis sanguíneos; también la ganancia de función de esta mutación causando fosforilación constitutiva en tirosinas de proteínas plaquetarias incluyendo Src, PLCy2 y BTK. Evidenciamos que en estos pacientes coexisten complicaciones de tipo inmune y neurológico. Su respuesta plaquetaria a la esplenectomía y los esteroides, así como el aparente estado inflamatorio en algunos de ellos, sugiere cierta similitud clínica con la trombocitopenia inmune [PTI]. iii) Describimos la serie más larga, descrita hasta la fecha, de pacientes con TUBB1-RT (9 familias), identificando en ellos 6 variantes en TUBB1 (p.Cys12Leufs12*, p.Thr107Pro, p.Gln423*, p.Arg359Trp, p.Gly109Glu, and p.Gly269Asp). Se observó en ellas una penetrancia incompleta, con una mayoría de pacientes portadores con macrotrombocitopena, otros sin trombocitopenia pero con plaquetas grandes y una minoría de portadores con plaquetas normales. Encontramos en un pedigrí, por primera vez en TUBB1-RT, que la mutación responsable, p.Gly109Glu, causa enfermedad solo en homocigosis, poniendo de manifiesto la importancia de la carga alélica. Los estudios plaquetarios (expresión de GPs, agregación, activación y secreción, spreading) demostraron un escaso efecto de estas mutaciones en la funcionalidad plaquetaria, acorde con la moderada o ausente clínica hemorrágica en pacientes con TUBB1-RT. La expresión de estas mutaciones (solo las misssense) en células CHO demostró que afectan significativamente la expresión y localización de la tubulina-1. Los ensayos de cultivo in vitro de células CD34+ de los enfermos, demostraron que las mutaciones alteran la diferenciación/maduración de los Mks y la formación de proplaquetas. Los datos obtenidos en esta serie de familias y mutaciones de TUBB1, nos ha permitido reclasificar la patogenicidad de las variantes identificadas y definir criterios de patogenicidad ACGM adaptados a mutaciones en TUBB1. iv) La caracterización del fenotipo plaquetario (agregación, activación, cuantificación de gránulos por microscopia electrónica e inmunofluorescencia), los estudios de segregación familiar y, de forma muy novedosa, el análisis del transcriptoma plaquetario, apoyan fuertemente la patogenicidad de las variantes de RUNX1 p.Gln268* y p.Thr196Ala, pero no así de p.Asn159Ser. Hasta el 70% de los genes previamente descritos como diana de RUNX1, (incluyendo entre otros MYL9, MYH9, ALOX12, TREML1 e ITGA2), mostraron en nuestro microarray una expresión alterada en los portadores de las variantes p.Gln268* y p.Thr196Ala, en comparación con controles sanos. Estos datos se confirmaron, para algunos genes, mediante RT-qPCR. En el caso de p.Asn159Ser solo el 7% de los genes mostraron expresión alterada. Clasificamos los 120 genes más infraexpresados en 5 grupos: genes implicados en el citoesqueleto (18%); genes que participan en la transducción de señales (40%); genes relacionados con la interacción con ADN; genes implicados en el ciclo celular; genes asociados, al menos ocasionalmente, con procesos tumorales. También, encontramos un gran número de genes sobreexpresados, siendo el primero CA1, el gen que codifica la anhidrasa carbónica I (Fold change 140.04 vs. controles). Entre los sobreexpresados, hay genes que codifican proteínas de origen eritroide, transportadores de membrana, proteínas ribosomales y otras implicadas en la síntesis, modificación y degradación de proteínas y LXN, gen que codifica la latexina que es una proteína reconocida recientemente como supresor tumoral en neoplasias hematológicas. v) Desarrollamos un modelo celular con fenotipo de TG en el que demostramos la eficacia de un vector viral para revertir el fenotipo patológico. Conclusiones: Presentamos el diagnóstico clínico, funcional y molecular de un amplia número de pacientes con sospecha de TPC, caracterizando 11 variantes genéticas en 4 genes distintos. Reportamos el tercer caso de disfunción plaquetaria y sangrado asociado a patología molecular de PTGS1. Esta paciente revela la importancia de la N-glicosilación en la funcionalidad de la COX-1. Caracterizamos la cuarta familia con la mutación p.E527K y SRC-RT, que pone de manifiesto la coexistencia de alteraciones plaquetarias, inmunes y neurológicas en esta patología. La aparente parcial similitud con la PTI, podrían ayudar a establecer futuras estrategias de tratamiento. El estudio de la serie más larga descrita hasta la fecha de TUBB1-RT, revelan que la penetrancia incompleta es un fenómeno común en esta enfermedad, resalta la importancia de la carga alélica en la enfermedad, consolida el defecto de maduración de Mks, y el escaso efecto deletéreo de estas mutaciones en la reactividad plaquetaria, acorde con la moderada/ausente clínica hemorrágica en pacientes con TUBB1-RT. El análisis de trascriptoma plaquetario en tres casos con sospecha de RUNX1-RT, demuestran que puede ser una herramienta útil para establecer la patogenicidad de mutaciones nuevas de RUNX1, identificadas en pacientes con o sin historial familiar de neoplasia. Por último, demostramos la utilidad de la tecnología CRISPR/Cas9 para diseñar modelos de TPC, como la Trombastenia de Glanzmann. También mostramos la eficacia de un vector viral para revertir in vitro el fenotipo de la TG. Estos datos pre-clínicos son un importante avance en el camino hacia el potencial uso clínico de la terapia génica como alternativa curativa en TPC graves.