[en] The discover in 1997 of the presence of cell free fetal DNA in maternal plasma opened new perspectives in prenatal diagnosis, allowing accessing fetal genetic material without the risk of fetal loss associated to invasive techniques such as amniocentesis or chorionic villus sampling. In the late 90s, PCR techniques were already sensitive enough to detect few copies of a specific fetal sequence in a high background of maternal DNA. However, the application of real-time PCR allowed achieving levels of sensitivity and specificity suitable for clinical application of cfDNA analysis. The detection of the SRY gene, used as the first fetal DNA marker, in maternal plasma, allows the non-invasive determination of fetal sex. Based on the same principle of detecting DNA sequences of paternal origin absent in the mother, fetal RHD genotyping in RhD negative pregnant women was the first clinical application of non-invasive prenatal diagnosis. The introduction of next generation sequencing (NGS) for cfDNA analysis in 2008 also allowed, non invasive detection of fetal aneuploidies for the first time. However, this type of genetic tests have mostly been limited to few highly specialized diagnostic units, mainly due to the difficulties in accessing new technologies, developing appropriate protocols and obtaining samples for proper performance evaluation studies, which are needed before the introduction of new tests in clinical practice. Two automated protocols for non-invasive fetal sex determination and RhD genotyping have been developed and validated during this study. Their performance was evaluated in 430 samples, demonstrating efficiency and sensitivity to be suitable for the implementation in a diagnostic setting. Non-invasive fetal sex determination has than been applied in 1,251 and non invasive fetal RhD genotyping in 284 consecutive clinical cases. During this study, a novel NGS approach for the detection of fetal chromosome aneuploidies has also been introduced and its performance evaluated, for the first time, in 1709 plasma samples from selected pregnancies. This new method proved to be highly efficient, allowing detecting trisomies at extremely low false positives rate (0.03%) while also eliminating the need of a lower limit of fetal fraction for reliable reporting of the results. This new method has than been successfully introduced in clinical practice and applied to screen 2,828 consecutive pregnancies, collected between October 2015 and February 2016, for fetal chromosomal aneuploidies.

[es] El descubrimiento del DNA fetal libre circulante, en 1997, abrió nuevas perspectivas en el diagnóstico prenatal, al permitir el acceso a material genético fetal sin el riesgo de pérdida asociado a técnicas invasivas como la amniocentesis o la biopsia corial. A finales del siglo pasado ya se disponía de técnicas de PCR lo bastante sensibles como para poder detectar pocas copias de una secuencia fetal específica en un elevado background de DNA de origen materno. A partir del año 2000 la aplicación de la cuantificación por PCR a tiempo real ha permitido alcanzar los niveles de sensibilidad y especificidad necesarios para la aplicación clínica de su análisis. El primer marcador de DNA fetal ha sido el gen SRY, cuya detección en plasma materno permite la determinación no invasiva del sexo fetal. La primera aplicación de diagnóstico prenatal no invasivo, basado en la detección de secuencias de DNA heredadas del padre, no presentes en la madre, ha sido la detección del gen RHD en gestantes RhD negativas. La aparición de la secuenciación de nueva generaccion (NGS) y su aplicación al cfDNA en 2008, abre una nueva ventana para la detección no invasiva de aneuploidías fetales. Sin embargo, la introducción de este tipo de ensayos se ha visto relativamente limitada a pocos laboratorios altamente especializados, principalmente debido a la dificultad de desarrollar protocolos diagnósticos específicos, robustos, reproducibles y con acceso a las muestras adecuadas para poder validar los mismos satisfactoriamente antes de su aplicación clínica. En esta tesis doctoral se han desarrollado y validado dos protocolos automatizados para la determinación prenatal no invasiva del RhD y del sexo fetales, llevándose a cabo su aplicación clínica. Los resultados obtenidos en los ensayos de validación de estos dos métodos en un total de 430 muestras han probado su eficiencia y sensibilidad para su implementación en la rutina clínica. La determinación no invasiva del sexo fetal se ha aplicado en 1.251 muestras clínicas consecutivas, y la determinación no invasiva del grupo RhD fetal en 284. Así mismo, se ha validado un nuevo método de detección de aneuploidías fetales que incorpora por primera vez en este tipo de screening la secuenciación masiva bidireccional. La validación se ha llevado a cabo en un total de 1.709 muestras evidenciando que el nuevo método es altamente eficiente, permitiendo la detección de trisomías con una tasa de falsos positivos extremadamente baja (0,03%) y una tasa global de fallos del 0,5%; y sin necesidad de establecer un límite mínimo de fracción fetal para el análisis de las muestras. La detección no invasiva de aneuploidías fetales mediante este ensayo se ha implementado con éxito en la rutina clínica del laboratorio, en 2.828 muestras clínicas entre Octubre de 2015 y Febrero de 2016