[en] Neuronal specification is a protracted process that begins with progenitor commitment and culminates with the generation of mature and functional neurons. Transcription factors (TF) are the main orchestrators in the acquisition of neuron type-specific transcriptomes which confer neuron-type specific functionalities. Terminal selectors are TF that directly activate the expression of the genes that allow for neuron-type-specific functions such as ion channels, neurotransmitter receptors, biosynthesis enzymes (called effector genes). Terminal selector expression is necessary throughout the life of the neuron not only for the establishment, but also for the maintenance of the neuronal gene expression profile. In this work, we studied dopaminergic (DA) neuron terminal differentiation. DA neurons synthetize and use dopamine as neurotransmitter. In mammals, these cells have a crucial role in the central nervous system regulating several cerebral circuits, thereby alteration of this homeostasis result in psychiatric disorders such as schizophrenia or depression. DA neurons are present in all animal groups, and their effector genes are also phylogenetically conserved. Studies in the nematode C. elegans have shown that least three terminal selectors are needed for DA terminal differentiation; CEH-20 (PBX Homeodomain family), AST-1 (ETS transcription factor family) and CEH-43 (Distalless homeodomain family). In mammals, DA neurons are located in the midbrain, diencephalon and the telencephalic structure known as the olfactory bulb (OB). OB dopaminergic neurons are the most ancestral in evolution. Importantly, these neurons have the particularity of being, generated throughout the life of the animals by adult neurogenesis. Previous work described the expression and function of AST-1 and CEH-43 orthologs (ER81 and DLX2 respectively) in the differentiation of OB DA neurons. Here we aimed to test if mammalian orthologs for CEH-20, the third terminal select for nematode DA neuron specification, are involved in DA terminal specification in the OB. We used conditional mutant mice which preserve PBX1 expression in progenitors and migrating neuroblast but not in terminally differentiating DA neurons. We confirmed that late Pbx1 removal didn't affect neurogenesis or neuroblast migration. However, we found unspecific recombination events due to germ line CRE recombinase activity, and transient recombinase activity in specific tissues during embryonic development. Fortunately, we were able to detect them combining different phenotyping and genotyping strategies and discarded unspecifically recombined animals from our experiments. Mutant analysis showed a drastic reduction in tyrosine hydroxylase (Th) positive neurons, a marker for DA neurons in the OB. We found that Pbx1 controls both, embryonic and adult-generated OB DA-neuron differentiation, and its function in dispensable for survival of this neurons. PBX1 removal leads to ectopic expression of Calretintin, another interneuron OB subpopulation, suggesting a new role of terminal selectors repressing alternative neuron fates, and therefore avoiding acquisition of close linages. Analysis of expression of other TFs required for DA specification, such as COUP-TF1, PAX6, MEIS2, and the two terminal selectors DLX2 and ETV1 shows that Pbx1 acts downstream of or in parallel to these TFs. Additionally, we found MEIS2, a classic PBX1 co-factor, requires PBX1 for protein stability but not for mRNA expression. Pbx1 mutants had a dramatic decrease in DA effector genes expression, supporting its role as terminal selector. Moreover, ChIP analysis showed the direct binding of Pbx1 to Th regulatory regions. Notably, we found morphological defects in Pbx1 mutant DA neurons, as they are more immature and simpler, suggesting a new role for terminal selectors in morphological acquisition. Finally, Pbx1 mutants display altered olfactory function demonstrating the important role of DA interneurons in olfaction. In summary, our results show that Pbx1 acts as a terminal selector of DA OB mice neurons, suggesting a phylogenetically conserved role for PBX TFs in DA terminal specification. Furthermore, our data expand the known repertoire of terminal selection actions not only in the direct activation of effector genes but also in the morphological maturation and repression of alternative fates.

[es] La especificación neuronal es un proceso que se inicia con la determinación de los progenitores hacia su destino neuronal y que culmina con la generación de las neuronas maduras y funcionales. Los factores de transcripción (FT) tienen un papel crucial en el proceso de activación del transcriptoma específico de cada tipo neuronal que es el encargado de conferir sus funcionalidades concretas. Los selectores terminales son FT que regulan de manera directa y coordinada la expresión de los genes necesarios para la adquisición de las características fenotípicas de cada tipo de neurona madura (genes efectores). Estos FT mantienen su expresión a lo largo de la vida de la neurona siendo necesarios, no solo para el establecimiento, sino también para el mantenimiento del perfil de expresión génica de la neurona. En este trabajo nos hemos centrado en el estudio del programa de diferenciación terminal de las neuronas dopaminérgicas (DA). Las neuronas DA sintetizan y usan el neurotransmisor dopamina. En mamíferos, las neuronas dopaminérgicas tienen gran importancia en el sistema nervioso central ya que regulan muchos de los circuitos cerebrales, siendo la alteración de la homeóstasis de la DA una de las causas relacionadas con trastornos psiquiátricos como la esquizofrenia o la depresión, por lo que estudiar cómo se adquieren las características de estas neuronas es de vital importancia. Las neuronas DA están presenten en todos lo grupos animales. Además, los genes efectores encargados de la biosíntesis y captación de DA están también filogenéticamente muy conservados. Estudios en el nemátodo C. elegans han revelado que la diferenciación terminal de las neuronas dopaminérgicas (DA) necesita al menos de tres FT que actúan como selectores terminales; CEH-20 (Familia Homeodominio PBX), AST-1 (Familia ETS) y CEH-43 (Familia homeodominio distalless). En mamíferos, diferentes núcleos del mesencéfalo, diencéfalo y el bulbo olfatorio (BO) contienen neuronas DA. Sin embargo, las que se encuentran en el BO constituyen evolutivamente las más ancestrales, y por tanto podrían considerarse las más cercanas a C. elegans. Además, presentan una característica importante y es que se generan a lo largo de toda la vida de los mamíferos mediante neurogénesis adulta. Trabajos previos han descrito la expresión y funcionalidad de los ortólogos de AST-1 y CEH-43 (ER81 y DLX2, respectivamente) en la diferenciación terminal de estas neuronas. En cambio, cuando empezamos el presente trabajo, no se había descrito ortólogos de CEH-20, el tercer FT descrito en el nemátodo, que lleven a cabo la misma función en vertebrados. El principal objetivo de esta tesis, por tanto, ha sido determinar si PBX1 (homólogo de CEH-20) ejerce como selector terminal de las neuronas DA del BO de ratón. Para ello usamos un modelo de ratón condicional que elimina Pbx1 de las células del linaje DA en el periodo de diferenciación terminal pero no en progenitores ni durante la migración. Nuestros estudios confirmaron que la eliminación de Pbx1 durante los últimos estadios no altera la neurogénesis ni la migración de los neuroblastos. Sin embargo, durante la caracterización en profundidad de estos animales, encontramos fenómenos de recombinación inespecífica debidos a una actividad recombinasa durante la formación de las células germinales, más acrecentado en las hembras, así como una actividad transitoria de la CRE recombinasa en algunos tejidos durante el desarrollo embrionario. Afortunadamente, mediante estrategias de fenotipado y genotipado hemos sido capaces de detectarlas y descartar estos animales para nuestros experimentos posteriores. Los análisis de estos mutantes muestran que la eliminación de Pbx1 disminuye drásticamente el número de neuronas que expresan la proteína tirosina hidroxilasa (Th), imprescindible en la producción de dopamina. Además, identificamos que este FT parece regular la diferenciación terminal tanto de las neuronas DA que se generan durante la embriogénesis, como las que se producen mediante neurogénesis en la etapa adulta. Determinamos también que las células que carecen de Pbx1 en estadios de diferenciación terminal y dejan de expresar la proteína TH, no mueren. Es decir, Pbx1 es necesario para la diferenciación terminal de las neuronas DA del BO, pero no para su supervivencia. Además, hemos observado que un pequeño porcentaje de las células mutantes que carecen de Pbx1 expresan ectópicamente Calretinina, un marcador de otra subpoblación de interneuronas del BO, sugiriendo un papel represor de este FT evitando el destino celular hacia otros linajes cercanos y no deseados. Por otra parte, hemos analizado los FT implicados en la adquisición del fenotipo DA, COUP-TF1, PAX6 y MEIS2, incluyendo los dos selectores terminales previamente descritos DLX2 y ETV1. Los resultados de las triples inmunohistoquímicas revelan que Pbx1 no es necesario para la expresión de ninguno de estos factores, indicando que, o bien actúa en paralelo, o posteriormente a estos factores. La excepción es MEIS2 co-factor clásico de PBX1, que necesita a este factor para estabilizarse y no ser degradado, tal y como se ha descrito en otros sistemas. Así mismo, hemos podido demostrar que PBX1 ejerce como selector terminal de las neuronas DA del BO, ya que los mutantes de Pbx1 presentan defectos de expresión en la mayoría de los genes efectores de la DA, y no específicamente de Th. Además, el ChIP revela la unión directa de PBX1 a regiones reguladores del gen Th. Adicionalmente, hemos detectado alteraciones morfológicas en las neuronas mutantes de Pbx1 que parecen ser más simples e inmaduras, lo que asigna un papel a los selectores terminales también en establecer una correcta morfología neuronal. Finalmente, realizamos estudios comportamentales que revelan que los déficits en diferenciación DA en el BO provocado por la ausencia de PBX1 durante su diferenciación terminal, provoca una alteración funcional de la olfacción, siendo incapaces de detectar los olores a las concentraciones a las que un ratón control es capaz. Por lo tanto, concluimos que Pbx1 actúa como un selector terminal de las neuronas DA del BO de ratón, sugiriéndolo como homólogo funcional de CEH-20 en C. elegans. Por tanto, nuestros resultados sugieren que el papel de los FT PBX en la diferenciación DA esta conservado a lo largo de la evolución. Además, nuestros resultados amplían las funciones de los selectores terminales, requeridos en este caso para la maduración morfológica, así como para reprimir linajes alternativos.