[en] Considerable rich literature has accumulated concerning biochemical, physiological, and genetic aspects of polyhydroxybutyrate (PHB) intracellular accumulation in bacteria. The costs of substrates and processing, including the extraction of the polymer accumulated in intracellular granules, still hampers a more widespread use of this family of polymers. The PHB monomeric unit, (R)-3- hydroxybutyric acid (R3HBA) has found uses at the biomedical, chemical and supplement industries. The literature shows that two main process engineering and metabolic engineering strategies have been identified aimed at the production of chiral R3HBA: (i) production from the accumulated polymer (polymerization and depolymerization system, PDS); (ii) by bypassing the accumulation of PHB using metabolically engineered bacteria. The later includes the use of thioesterases (thioesterase shortcut system, TSS) that removes CoA from R3HBA-CoA, resulting in the R3HBA release to extracellular medium. This PhD thesis aims at broadening the understanding of the genetic and operational factors leading to PHB polymerization and R3HBA production in Azohydromonas lata DSM 1123, Cupriavidus necator H16 and Methylocystis parvus OBBP. Results showed that the growth associated PHB production observed in A. lata mimics an overflow metabolism, additionally, a successful PHB depolymerization in a two stage chemostat was obtained. The feasibility of producing R3HBA through in-vivo depolymerization of the intracellularly accumulated PHB in M. parvus was investigated. A PHB to R3HBA conversion of 77.2 ± 0.9% (R3HBA titer of 0.153 ± 0.002 g L&#8315;1) can be attained in a mineral medium containing 1.0 g L&#8315;1 KNO&#8323; at 30 °C with shaking at 200 rpm and a constant pH of 11 for 72 hours. Nitrogen deprivation, oxygen limitation, the supplementation with exogenous R3HBA and neutral or acidic pHs strongly reduced the excreted R3HBA concentration and yield. The implementation of the TSS system in M. parvus and C. necator by the construction of an expression vector containing tesB was hampered by inconsistencies in the constructed plasmids pLY01 and pLY02. Finally, the production of R3HBA by redirecting fluxes in the PHB metabolic pathway was investigated in C. necator; two mutant strains were constructed using the suicide vector pT18mobsacB: C. necator &#916;phaC and C. necator &#916;phaC &#916;hbd, both unable to polymerize PHB and the last one incapable to transform R3HBA into acetoacetate. The mutant strains released pyruvate and R3HBA, suggesting that a native thioesterase of C. necator may play a role in the release of R3HBA by removing CoA from R3HBA-CoA. A protein homology on the genome of C. necator showed an enzyme encoded as WP_037025319.1 with a percent identity of 44 % in comparison with Ycia that may trigger R3HBA release. The results obtained in this work demonstrated the feasibility of R3HBA production by reducing or eliminating the fluxes of the reactions consuming R3HBA via operational manipulation as described in M. parvus and A. lata or via gene knock outs in C. necator.

[es] Se ha acumulado una abundante literatura sobre los aspectos bioquímicos, fisiológicos y genéticos de la acumulación intracelular de polihidroxibutirato (PHB) en bacterias. Los costos de los sustratos y procesamiento, incluida la extracción del polímero acumulado en los gránulos intracelulares, dificultan un uso más generalizado de esta familia de polímeros. La unidad monomérica del PHB, ácido (R)-3-hidroxibutírico (R3HB), ha encontrado usos en la industria biomédica, química y de suplementos. La literatura muestra que se han identificado dos estrategias principales de ingeniería de procesos e ingeniería metabólica para la producción de R3HB: (i) producción a partir del polímero acumulado (sistema de polimerización y despolimerización, SPD); (ii) evitando la acumulación de PHB utilizando bacterias modificadas metabólicamente. Este último incluye el uso de tioesterasas (sistema acceso-directo con tioesterasas, SADT) que elimina el CoA de R3HB-CoA, lo que da como resultado la liberación extracelular de R3HB. Esta tesis doctoral tiene como objetivo ampliar la comprensión de los factores genéticos y operativos que conducen a la polimerización de PHB y la producción de R3HB en Azohydromonas lata DSM 1123, Cupriavidus necator H16 y Methylocystis parvus OBBP. Los resultados mostraron que la producción de PHB está asociada con el crecimiento en A. lata e imita un metabolismo de desbordamiento; además, se obtuvo una despolimerización exitosa de PHB en un quimiostato de dos etapas. Se estudio la viabilidad de producir R3HB a través de la despolimerización in-vivo del PHB acumulado intracelularmente en M. parvus. La conversión de PHB a R3HB de 77.2&#8201;±&#8201;0.9&#8201;% (concentración R3HB de 0.153 ± 0.002 g L&#8315;1) se pudo lograr en un medio mineral que contiene 1.0&#8201;g&#8201;L&#8315;1 KNO&#8323; a 30 °C con agitación a 200 rpm y un pH constante de 11 por 72 horas. La privación de nitrógeno, limitación de oxígeno, suplementación con R3HB exógeno y los pHs neutros o ácidos redujeron fuertemente la concentración y el rendimiento de R3HB excretado. La implementación del sistema SADT en M. parvus y C. necator mediante la construcción de un vector de expresión que contenía tesB se vio afectada por inconsistencias en los plásmidos construidos pLY01 y pLY02. Finalmente, se investigó la producción de R3HB mediante la redirección de flujos en la ruta metabólica de PHB en C. necátor; se construyeron dos cepas mutantes utilizando el vector suicida pT18mobsacB: C.&#8201;necator &#8710;phaC y C.&#8201;necator&#8201;&#8710;phaC&#8201;&#8710;hbd, ambas incapaces de polimerizar PHB y el último incapaz de transformar R3HB en acetoacetato. Las cepas mutantes liberaron piruvato y R3HB, lo que sugiere que una tioesterasa nativa de C. necator puede desempeñar un papel en la liberación de R3HB mediante la eliminación de CoA de R3HB-CoA. Una homologación proteica en el genoma de C. necator mostró una enzima codificada como WP_037025319.1 con un porcentaje de identidad del 44 % con Ycia, la cual puede desencadenar la liberación de R3HB. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron la viabilidad de producir R3HB al reducir o eliminar los flujos de las reacciones que consumen R3HB a través de manipulaciones operacionales como se describe en M. parvus y A. lata o mediante la deleción de genes en C.&#8201;necator.