[en] The proliferative verrucous leukoplakia (PVL) is a malignant variant of an oral leukoplakia (OL), a lesion that is detected as hyperkeratotic white plaques in the human oral cavity. PVL plaques are detected in higher prevalence in women over 60 years of age. Most derive into a type of agresive oral cancers, the oral squamous cell carcinoma (OSCC). Association to tocacco or alcohol consumption has been discarded and, to this date, PVL lesions have no identified aetiological agent, which is believed may have a viral origin, due to the high rate of recurrence of the lesion and its multifocality (it commonly returns in different areas of the oral cavity after treatement, which usually consists on the total removal of the affected area). With the objective of finding a potential aetiological agent for the lesion, two independent studies were carried out with biopsies from patients diagnosed with PVL, OL, OSCC and controls. The first consisted on the search for oncogenic viruses in biopsies for which a PCR was carried out to survey viruses from a pool of differnent primers directed towards the amplification of ample groups Herpesviruses (including Epstein-Bar Virus, Polyomaviruses (including Merkel cell polyomavirus) and Papillomavirus, mainly human types 16 and 18 and other high risk types), which include some of the best known oncoviruses. The result was negative for all types of viruses as no matching fragments could be identified. This was the justification of a second, wide-spectrum study. This was caried out by sequencing the bacterial and viral fractions in a new cohor of patients employing techniques of the 16S rRNA profiling for studying to observe the corresponding bacteria, as well as a complete metagenomics analysis for studying viruses, both using the RNA as the DNA fractions. The 16S rRNA was amplified by PCR targeted at hypervariable regions V1-V3 using the extracted bacterial DNA, and later pyrosequenced using Roche's 454 platform. DNA and RNA viruses were extracted with commercial kits for the viric straction, afer which the viral DNA was enriched with a multiple displacement amplification (MDA) with Genomiphi. The viral RNA fraction was used for the retrotranscription using a modified version of the protocol for Single Indepentent Single Primer Amplification (SISPA). Both sets of reactions were sequenced using Paired-end sequencing in an Illumina MiSeq platform (2x 200 in the case of RNA and 2x300 for the DNA In order to improve taxonomc assignation, multiple bioinformatic tools were developed and databases were compiled from the different domains in life, specifically created for the exploration of the actual sequenced material. The study was expanded to include the fungal, bacterial and archaeal fraction that may exist as DNA and RNA in the whole genome sequencing (WGS) sets. Furthermore, the taxonomy for the viral database was personalized to cope with the assignation problems of empty ranked categories in the taxonomy, also appending an aditional category for the type of virus and the Baltimore classification. After very specific data processing procedures hindered by sequence amplification introducing methodological artefacts (specialy in the RNA set), sequences were cleansed and the taxonomic assignation was carried out using programs that and search methods tailored for this end that compensate the short length of some of the sequences by using a last common ancestor algoritm, this assignating the basal taxonomic level when there is a conflict of assignation. Thus, the confidence of the assignation is obtained as the method does not compromise to any "best" result as every single one that is used is used and a consensus taxonomy is retrieved per group. Only sequences without multiple result in the different tables were selected. As a result, sequences from each domain were found for all samples, after filtering human sequence homologs, which in this case account for the majority of the data. Once contingency tables were obtained, the study of the viral, bacterial, and fungal fraction was determined and the evaluation of the diversity within samples (alpha diversity) and the one between different sample (beta diversity) was carried out. These evaluated the relationship of composition and abundance per groups. No statistically significant differences was detected among the different lesion groups. The analysis of differentially abundant markers did not show statistically supported organism that may allow to definitely determine a virus in the RNA or DNA fraction that may be a potential aetiological agent for the PVL or OSCC. Consequently, the global result of the study is that no agent can be proposed. However, this study has been the first to address the fungal taxonomy for these types of lesions. Plus, different non-viral markers have been identified as features that explain variation among the groups, most of them in the bacterial fractions. These data are in accordance to the analyses of the different fractions.

[es] Estudio del viroma y microbioma oral asociados con la leucoplasia verrugosa proliferativa La leucoplasia verrugosa proliferativa (LVP) es una forma maligna de leucoplasia oral (LO) que se manifiesta como parches blanquecinos hiperqueratóticos en la cavidad oral humana. Éstas son detectadas prevalentemente en mujeres de la tercera edad. La mayor parte de las LVP con el tiempo derivan en un tipo agresivo de cánceres orales, principalmente el carcinoma oral de célula escamosa (COCE). Las asociaciones con tabaco y alcohol han sido descartadas previamente y hasta la fecha, la lesión de LVP continúa sin un agente etiológico identificado, el cual se cree pudiera ser de origen vírico debido a la alta tasa de recurrencia de la lesión y su multifocalidad (ésta reaparece en áreas distintas de la boca tras el tratamiento, el cual consiste en la remoción total del área afectada). Con la finalidad de detectar un potencial agente causal de la lesión, se han desarrollado dos estudios independientes con biopsias de pacientes diagnosticados con LVP, LO, COCE y controles. El primero, consistió en la búsqueda de virus oncogénicos en biopsias de pacientes usando la amplificación de reacción en cadena de la polimerasa para llevar a cabo un barrido de virus usando una batería de cebadores dirigidos a la amplificación de grupos amplios de Herpesvirus (incluyendo los oncovirus Epstein-Bar y el virus de carcinoma de Kaposi), Polyomavirus (incluyendo el oncovirus de carcinoma de célula de Merkel) y Papillomavirus (incluyendo los papillomavirus de humano tipo 16 y 17 y otros identificados de alto riesgo), que incluyen algunos de los oncovirus mejor conocidos. El resultado fue negativo para todos los tipos de virus debido a que no se amplificaron fragmentos que pudieran ser identificados como pertenecientes a tales virus, con lo cual se justificó la necesidad de un segundo estudio de más amplio espectro. Este se llevó a cabo mediante la secuenciación de la fracción bacteriana y vírica de una nueva cohorte de pacientes empleando técnicas de perfilado de la subunidad 16S del ARN ribosómico para estudiar la fracción bacteriana pertinente, así como un análisis meta genómico completo para estudiar los virus tanto de la fracción de ARN como de ADN. El 16S del ARN ribosómico fue amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa dirigido a las regiones hipervariables V1-V3 del extraído bacteriano, tras lo cual fue pirosecuenciado en una plataforma 454 de Roche. Los virus de ADN y ARN fueron procesados mediante la utilización de kits comerciales para la extracción vírica, tras lo cual la fracción de virus de ADN fue enriquecida mediante un protocolo de amplificación de múltiples desplazamientos con GenomiPhi. La fracción de ARN viral fue sujeta a retrotranscripción mediante una modificación del protocolo de amplificación de cebador único independiente de secuencia. Ambas fracciones fueron secuenciadas mediante librerías de extremos pareados en plataformas MiSeq de Illumina (2x 200 en el caso del conjunto de ARN y 2x300 para los de ADN. Con la meta de mejorar la asignación taxonómica, se desarrollaron múltiples herramientas bioinformáticas y se compilaron bases de datos de distintos dominios del árbol de la vida, específicamente creadas para la exploración del material genético secuenciado. Se decidió ampliar el estudio para también incluir la fracción de hongos, bacterias y arqueas que pudieran existir entre las secuencias de ADN y ARN secuenciada como metagenomas completos. De igual manera, la taxonomía de la base de datos de virus fue personalizada para lidiar con problemas de asignación de rangos taxonómicos vacíos, agregando además una categoría adicional consistente en el tipo y método de replicación de los virus, la clasificación de Baltimore. Tras un muy específico procesamiento de los datos, debido a que la amplificación de las secuencias introdujo artefactos metodológicos (particularmente en el conjunto de ARN), se lograron limpiar las secuencias y se llevó a cabo la asignación taxonómica mediante la utilización de programas y métodos de búsqueda creados para tal fin que compensan la escasa longitud de algunas secuencias utilizando un algoritmo de último ancestro común para así sólo asignar el nivel taxonómico basal cuando existe un conflicto de asignación. De tal manera, existe una mayor confianza en la asignación taxonómica ya que no se corre el riesgo de seleccionar el "mejor" resultado puesto que todos ellos son empleados y una taxonomía consenso se alcanza para cada grupo. Únicamente las secuencias que no tenían resultados en distintas tablas fueron seleccionadas. Como resultado, se logró así identificar secuencias de cada tipo de dominio para todas las muestras. Tras el filtrado de secuencias humanas, que en este caso ocupan una gran mayoría de los datos. Una vez obtenidas tablas de contingencia, se procedió al estudio de la composición de las fracciones viral, bacteriana y fúngica, además de desarrollar la evaluación de la diversidad a nivel de muestra (diversidad alfa), así como entre ellas (diversidad beta), buscando la relación existente entre la composición y la separación por grupos, misma que no ha sido significativa para los grupos patológicos propuestos. El análisis de biomarcadores diferencialmente abundantes no ha arrojado información soportada estadísticamente que permita definir sin lugar a dudas algún virus de la fracción de ARN o ADN como agente etiológico de las lesiones o el carcinoma. Por lo tanto, el resultado global del estudio es que no se ha podido encontrar un agente causal para la LVP. Sin embargo, este estudio es el primero en abordar la taxonomía de hongos para estas patologías. Además, distintos marcadores no virales han sido identificados como diferencialmente distribuidos en los distintos grupos, la mayor parte de ella en la fracción bacterias. Los datos son congruentes con análisis similares de las distintas fracciones.