[en] The cause of Crohn's Disease (CD) remains uncertain. It is generally hypothesized that inflammatory bowel disease is triggered by the enteric microflora in genetically predisposed patients with an immune dysregulation in the gastrointestinal tract. The specific pathways leading to mucosa damage are not completely understood. In recent years, the role of oxidative stress as a potential etiological and/or triggering factor for IBD has been the subject of increasing interest. The chronic gut inflammation in CD has been associated with an increase in oxidative stress and an imbalance in antioxidant enzymes (AOEs). Aims: We have characterized the reactive oxygen species (ROS) generated in immune cells (peripheral white mononuclear cells (PWMCs)) of CD patients, as well as their antioxidant enzyme status and the presence of oxidative damage. We have analyzed the status of the main AOEs (catalase (CAT), manganese SOD (MnSOD) and copper-zinc SOD (CuSOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) at multiple levels (activity, mRNA expression and protein concentration) in PWMCs of CD patients. We have also analyzed whether single nucleotide polymorphisms (SNPs) of CAT and MnSOD genes were associated with CD. Mitochondrial function has been analyzed for a possible origin of ROS. In addition, we have tried to relate the activity of the AOEs with the apoptotic capacity in the peripheral blood lymphocytes T in CD patients. Methods: Peripheral blood was obtained from patients at onset of disease, prior to any treatment (A-CD). Experiments were repeated in clinical remission (R-CD). A set of experiments was carried out in a group of CD patients with persistent morphological remission (I-CD). Controls were healthy volunteers who were not under any treatment. The generation of superoxide, hydrogen peroxide, nitric oxide and the mitochondrial membrane potential as well as the apoptosis capacity was measured by cytometric assays. The oxidative damage was assessed by the concentration of malondyaldehyde (MDA) and 8-oxo-deoxyguanosine (8-oxo-dG) measured by HPLC.The mRNA levels of TNF-α was determined by quantitative real-time PCR. Enzymatic activity and protein levels of the AOEs were measured spectrophotometrically by enzymatic assays and western blot respectively with the use of suitable monoclonal antibodies. The expression of mRNA and genotyping analysis was carried out using the appropriate applications of the Sequenom MassArray® platform. Results: Hydrogen peroxide production was significantly increased during aCD but they return back to controls levels in remission. Mitochondrial membrane potential was inhibited during active CD and although it returns back to control, its recovery takes longer that clinical remission. The level of TNF-α was increased in aCD and was negatively correlated to mitochondrial membrane potential. The levels of MDA and 8-oxo-dG were permanently elevated. CAT activity was permanently inhibited during CD, independently of disease activity. MnSOD and GSH-Px activity were significantly higher in active CD compared to control subjects. CuSOD activity did not display statistically significant differences among CD and healthy subjects. Protein levels of CAT were permanently reduced in active and inactive disease, whereas protein levels of CuSOD, MnSOD and GSH-Px were greater in active CD compared to control patients. The down-regulation of CAT gene expression was persistent in both active CD and inactive CD. MnSOD was specifically up-regulated during flare. The mRNA levels of CuSOD did not show significant differences among aCD, iCD and control patients. CD was found to be associated with the CAT gene rs1001179 SNP (p= 0.038), whereas no association was observed with MnSOD polymorphism. The addition of CD3/CD28 and Fas Ab significantly increased the percentage of apoptotic control lymphocytes vs CD (P<0.005). Analysis of inhibition CAT in control cells showed a lower apoptotic capacity. Conclusions: Oxidative Stress during active CD depends on hydrogen peroxide production. The inhibition of mitochondrial membrane potential suggests this organelle to be a possible source of ROS. Persistent oxidative damage is detected what may have implications in the evolution of the disease. Inhibition of CAT activity in PWMCs of CD patients is related to a low concentration of CAT protein caused by the down regulation of CAT-gene transcription. The rs1001179 SNP of CAT gene may be linked to the development of CD through the inhibition of CAT activity. The increase of SOD in CD patients depends primarily on MnSOD and supports the idea that ROS has a mitochondrial origin. The increase in both GSH-Px activity and protein levels in aCD patients suggests its additional role in the response against oxidative stress. The permanent lower CAT activity is related to the persistent apoptotic resistance observed in peripheral lymphocytes of CD patients.

[es] Aunque la causa exacta de la enfermedad de Crohn (EC) es desconocida, la teoría más aceptada es que se produce por la activación inadecuada y perpetuada del sistema inmune frente a un patógeno intraluminal, probablemente la propia flora bacteriana comensal, que acontece en sujetos genéticamente predispuestos. El mecanismo específico que provoca el daño en la mucosa sigue siendo desconocido, sin embargo en los últimos años se ha implicado al estrés oxidativo como un posible factor en la etiopatogenia de la enfermedad. Se ha descrito un aumento de daño oxidativo así como un desequilibrio en las defensas antioxidantes. Objetivos: Caracterizar la producción basal y estimulada de especies reactivas de oxígeno (ERO) en las células inmunes de sangre periférica (CMSP) de los pacientes con EC, así como el estado de las enzimas antioxidantes (EAOs) y la presencia de daño oxidativo. En el presente trabajo se ha analizado el estado de las principales EAOs (catalasa (CAT), superóxido dismutasa manganeso (SOD-Mn) y SOD cobre-zinc (SOD-Cu/Zn) y glutation peroxidasa (GPx) a diferentes niveles (actividad, expresión de ARNm y concentración de proteína) en las CMSP de pacientes con EC. Se ha analizado también si existe alguna mutación (polimorfismo genético (SNPs)) que limite la actividad de las EAO y otros genes relacionados con la EC. La función mitocondrial ha sido analizada como posible origen de la producción de ERO. Además se ha relacionado la actividad de las EAOs con la capacidad apoptótica de los linfocitos T en sangre periférica de pacientes con EC. Métodos: Se obtuvieron muestras de sangre periférica de pacientes con EC al debut de la enfermedad, antes de administrarles cualquier tratamiento que pudiese interferir en las determinaciones (EC-A). Los experimentos se repitieron cuando el paciente alcanzó remisión clínica (EC-R). Otros experimentos se llevaron a cabo en pacientes inactivos de forma mantenida, con remisión clínica y morfológica (EC-I). Los controles fueron voluntarios sanos que no tomaban ningún tipo de medicación. La generación de superóxido, peróxido de hidrógeno y potencial de membrana mitocondrial así como la capacidad apoptótica fueron medidos por citometría de flujo. El daño oxidativo cuantificado por las concentraciones de malondialdehído (MDA) y 8-oxo-diguanosina (8-oxo-dG) fueron medidos por HPLC. Los niveles de TNF-α fueron cuantificados por real-time PCR (ARNm). Las actividades y los niveles de proteína de las EAOs fueron medidos por espectofotometría y western blot respectivamente, usando los respectivos anticuerpos monoclonales. La expresión de ARNm y el análisis del genotipado fueron llevados a cabo en las respectivas aplicaciones de la plataforma Sequenom MassArray®. Resultados: La producción de peróxido de hidrógeno estaba significativamente aumentada cuando en el paciente con EC-A y regresó a los niveles control cuando el paciente alcanzó remisión (EC-R). El potencial de membrana mitocondrial se encontró inhibido en el paciente con EC-A y aunque retornaba a niveles control cuando el paciente estaba en remisión (EC-R), sólo se recuperó cuando el paciente estaba inactivo de forma mantenida (EC-I). Se observó una correlación negativa entre el potencial de membrana mitocondrial y la concentración de TNF-α, estando éste aumentado en los EC-A y recuperándose a valores control sólo cuando el paciente estaba inactivo. Los niveles de MDA y 8-oxo-dG permanecieron elevados permanentemente. La actividad CAT se encontró inhibida permanentemente, independientemente de la actividad de la enfermedad. La actividad de SOD-Mn y GPx estaba significativamente aumentada en el paciente con EC-A. La actividad SOD-Cu/Znno mostró diferencias estadísticamente significativas respecto a los controles. Los niveles de proteína CAT permanecieron reducidos en los pacientes activos e inactivos, mientras que los niveles de proteína de SOD-Cu/Zn, SOD-Mn y GPx fueron superiores en los pacientes con EC-A que en los controles. La baja expresión del gen de CAT fue persistente en EC-A y EC-I, mientras que la expresión de SOD-Mn estaba sólo aumentada durante el brote de la enfermedad. Los niveles de expresión de SOD-Cu/Zn no mostraron diferencias significativas entre los pacientes con EC-A, EC-I y controles. La EC se asoció al SNP de CAT rs1001179 (p= 0.038), mientras que no se encontró ninguna asociación con los SNPs de SOD-Mn estudiados. Los linfocitos de los pacientes EC mostraron una resistencia a la apoptosis mantenida, a pesar de la activación con CD3/CD28 y de la adición de Fas. Además al inhibir la actividad CAT en células control éstas mostraron una menor capacidad para iniciar el proceso de apoptosis. Conclusiones: Los pacientes con EC presentan un estrés oxidativo permanente en sangre periférica, que depende de un exceso de producción de peróxido de hidrógeno. La inhibición del potencial de membrana mitocondrial apunta al posible origen mitocondrial de las ERO. La inhibición de la actividad CAT es secundaria a una disminución de la concentración de proteína que depende de una menor expresión génica del gen correspondiente. El polimorfismo para la CAT rs1001179 se asocia significativamente con la enfermedad. La elevación significativa de la enzima SOD-Mn sitúa a la mitocondria como organela participante en la génesis del estrés oxidativo detectado. El incremento de GPx en los pacientes con EC-A es insuficiente para mantener las concentraciones de peróxido de hidrógeno, por lo que el papel de esta enzima es adicional en la respuesta contra el estrés oxidativo. La permanente inhibición de la actividad de CAT, podría estar relacionada con la persistente resistencia a la apoptosis observada en los linfocitos de sangre periférica de los pacientes con EC.