[ca] L'interès creixent en l'ús de partícules similivíriques (VLPs) com a candidats vacunals, vectors per a teràpia gènica i càncer, i nanotransportadors per a l'administració de fàrmacs ha incrementat la demanda de plataformes de biomanufactura eficients i escalables. La seva similitud estructural amb els virus, sense els components virals infecciosos, els converteix en candidats excel·lents per a aquestes aplicacions. Tanmateix, la seva fabricació implica processos complexos, incloent la producció mitjançant cultiu cel·lular, purificació i formulació per complir amb els estàndards clínics. Aquesta tesi aborda els desafiaments crítics en el bioprocessament de VLPs en quatre capítols, centrant-se en la purificació, formulació i funcionalització de les VLPs de VIH. La purificació de les VLPs és una fase crucial en el bioprocés per a l'eliminació de contaminants com ara vesícules extracel·lulars, proteïnes de les cèl·lules hoste i ADN. Al Capítol Ú, es comparen diverses tecnologies per optimitzar la purificació de les VLPs. El procés de purificació proposat inclou quatre passos clau: clarificació mitjançant filtració en profunditat i filtració estàndard, concentració i purificació intermèdia a través de filtració de flux tangencial o cromatografia multimodal, captura utilitzant cromatografia d'intercanvi iònic, cromatografia d'interacció hidrofòbica i afinitat per heparina, i poliment amb cromatografia d'exclusió per mida. L'estudi avalua cada pas en base al rendiment, la puresa i l'eficiència en l'eliminació de contaminants. Es defineix un procés de purificació integral basat en els millors resultats obtinguts en cada pas. Aquest procés aconsegueix un rendiment global del 38% i una puresa del 64%, complint amb els estàndards reguladors per a contaminants d'ADN i proteïnes. El Capítol Dos es centra en l'optimització de les formulacions de liofilització per a les VLPs de VIH mitjançant Disseny d'Experiments. S'avaluen diversos excipients, incloent crio-lio protectors, agents de càrrega, tampons, modificadors de tonicitat i surfactants, pel seu impacte en la mida, concentració i qualitat de les VLPs. La formulació optimitzada composta per sacarosa, arginina, TrisHCl, clorur de sodi i polisorbat 80 preserva amb èxit la integritat de les VLPs. Els estudis de termoestabilitat demostren que les característiques d'integritat estructural es mantenen a 4°C durant 4 setmanes, tant en forma liofilitzada com reconstituïda. Al Capítol Tres, els avenços en purificació i formulació s'apliquen per desenvolupar un procés biotecnològic complet, incloent una producció en perfusió seguida per un procés de purificació en tres passos. La producció en perfusió millora 2.4 vegades la productivitat volumètrica de les VLPs en comparació amb resultats anteriors. Els processos de purificació que segueixen, incloent l'aclariment secundari i la cromatografia d'intercanvi aniònic mostren valors aproximats de puresa del 60%. El pas final de liofilització manté la integritat de les VLPs. La funcionalització de les VLPs per a l'administració dirigida de fàrmacs representa una alternativa en la teràpia contra el càncer. Al Capítol Quatre s'explora l'ús de les VLPs de VIH funcionalitzades amb el pèptid T22, un conegut antagonista del receptor CXCR4 associat a diversos càncers. Les VLPs produïdes en cèl·lules HEK293 i purificades mitjançant el procés de purificació proposat al capítol ú es funcionalitzen mitjançant reaccions químiques. Els estudis in vitro demonstren que les VLPs funcionalitzades amb T22 es dirigeixen i penetren en cèl·lules positives per CXCR4 de forma específica, amb un augment notable en la fluorescència intracel·lular en comparació amb les VLPs no funcionalitzades. Aquesta especificitat ressalta el potencial de les VLPs com a nanotransportadors per a l'administració selectiva de fàrmacs. En general, aquesta tesi proporciona una exploració integral de la purificació, formulació i funcionalització de les VLPs de VIH-1, abordant desafiaments clau i obrint el camí per a la seva aplicació clínica com a vacunes i teràpies dirigides contra el càncer.

[en] The increasing interest in using virus-like particles (VLPs) as vaccine candidates, vectors for gene and cancer therapy, and nanocarriers for drug delivery has led to a higher demand for efficient and scalable biomanufacturing platforms. Their structural similarity to viruses, without containing the infectious viral components, makes them excellent candidates for these applications. However, their manufacturing involves complex processes, including production by cell culture, purification, and formulation to meet clinical standards. This thesis addresses the critical challenges in VLP bioprocessing through four chapters, focusing on purification, formulation and functionalization of HIV-1 Gag VLPs. Purification of VLPs is a crucial phase in the bioprocess of these nanoparticles, which ensures the removal of contaminants such as extracellular vesicles, host cell proteins, and DNA. Chapter One delves into the comparison of various downstream processing technologies to optimize the purification of HIV-1 Gag VLPs. The purification process proposed encompasses four key steps: clarification through depth filtration and standard filtration, concentration and intermediate purification via tangential flow filtration or multimodal chromatography, capture using ion exchange, hydrophobic interaction and heparin affinity chromatography, and polishing with size exclusion chromatography. The study evaluates each step based on yield, purity, and contaminant removal efficiency. A comprehensive purification process has been defined based on the best results obtained in each step. This process yielded an overall recovery of 38% and purity of 64% after the polishing step. The levels of DNA and protein contaminants met regulatory standards. Chapter Two focuses on the optimization of lyophilization formulations for HIV-1 Gag VLPs using a Design of Experiments approach. Various excipients, including cryo-lyo protectants, bulking agents, buffers, tonicity modifiers, and surfactants, are evaluated for their impact on VLP size, concentration, and quality. The optimized formulation composed by sucrose, arginine, TrisHCl, sodium chloride and polysorbate 80 successfully preserves the integrity of the VLPs. The thermostability studies show that structural integrity characteristics is maintained at 4°C for 4 weeks, in both lyophilized and reconstituted form. In Chapter Three, the advances in purification and formulation are applied to develop a complete bioprocess for HIV-1 Gag VLPs. This includes a perfusion-based upstream production followed by a three-step downstream purification process. The perfusion-based approach yields a 2.4-fold improvement in VLP volumetric productivity compared to previous results. The subsequent downstream processes, including secondary clarification and anion exchange chromatography show around a 60% purity of VLPs. The final lyophilization step maintained VLP integrity. The functionalization of VLPs for targeted drug delivery represents a significant alternative in cancer therapy. In Chapter Four the use of HIV-1 Gag VLPs functionalized with the T22 peptide, a known antagonist of the CXCR4 receptor associated to various cancers. VLPs produced in HEK293 cells and purified through the DSP proposed in chapter one have been functionalized via click chemistry. In vitro studies have demonstrated that the T22-functionalized VLPs specifically target and penetrate CXCR4-positive cells, with a notable increase in intracellular fluorescence compared to non-functionalized VLPs. This specificity highlights the potential of VLPs as nanocarriers for selective drug delivery. Overall, this thesis provides a comprehensive exploration of the purification, formulation, and functionalization of HIV-1 Gag VLPs, addressing key challenges and paving the way for their clinical application as vaccines and targeted cancer therapies.