[en] Oocyte in vitro maturation (IVM) is a limiting step for in vitro embryo production (IVEP) which negatively affects oocyte competence for embryo development. Our objective was to analyze the epidermal growth factor receptor (EGFR) as marker of competence in prepubertal goat oocytes, and to promote the expression of this protein during IVM to increase embryo developmental competence. Two IVM strategies have been used: (1) attenuating spontaneous meiotic resumption using meiotic inhibitors in a biphasic IVM system (CAPA-IVM) and (2) promoting competence acquisition in vitro by adding exogenous oocyte-secreted factors BMP15 and GDF9. In the first study, we quantified the EGFR expression in prepubertal goat and sheep oocytes obtained from small (<3 mm, SF) and large (≥3 mm, LF) follicles. EGFR was quantified in cumulus cells (CC) by western blotting and in oocytes by immunofluorescence. In both species, EGFR expression in CC and oocytes was higher in LF than SF. We conclude that EGFR expression in prepubertal goat cumulus-oocyte complexes (COCs), both in oocytes and CC, increases with follicle size, suggesting it is related with oocyte developmental competence. In the second study, we assessed the effect of CAPA-IVM on oocyte competence of prepubertal goat oocytes from SF and LF. In experiment 1, oocytes were cultured for 6h in pre-IVM with 200 nM C-type natriuretic peptide (CNP) and 10 nM estradiol as meiotic inhibitors, and germinal vesicle (GV) rate was higher in CNP groups than control (69% vs 28%, and 67% vs 31%, SF and LF, respectively). In experiment 2, oocytes were cultured in conventional IVM (c-IVM) or CAPA-IVM (pre-IVM + c-IVM) and EGFR protein expression, intra-oocyte reactive oxygen species (ROS) and blastocyst development were assessed. In LF, EGFR expression after CAPA-IVM was higher compared to c-IVM in oocytes and CC, and intra-oocyte ROS levels were lower in CAPA-IVM. In SF these differences were not observed. c-IVM and CAPA-IVM produced similar blastocyst rates in SF (3.7% vs 2.6%, respectively) and LF (8.3% vs 2.5%, respectively). Overall, CAPA-IVM enhanced EGFR expression for EGF peptide signaling and antioxidant capacity in oocytes from LF but oocytes from SF were too immature to benefit from it. In the third study, we assessed the effect of adding BMP15 and GDF9 to IVM medium of prepubertal goat oocytes. COCs were in vitro matured in absence (control group) or presence of 100 ng/mL of BMP15, GDF9, or both. To determine cumulus-oocyte communication, transzonal projections (TZP) density at 0 h, 6 h, 12 h and 24 h of IVM were evaluated. After IVM, EGFR expression in oocytes and CC, cumulus expansion and mitochondrial activity were measured. Finally, blastocyst rates after parthenogenetic activation (PA) and IVF were assessed. IVM supplementation with BMP15 increased the TZPs density during the first 6 hours of culture. After IVM, BMP15 increased EGFR expression in oocytes and CC, cumulus expansion, oocyte mitochondrial activity and blastocyst production following PA (15.5% vs 6.3%) compared to control. No differences were observed on blastocyst production following IVF. IVM supplementation with GDF9, with or without BMP15, did not improve any parameters. In conclusion, IVM medium supplementation with BMP15, but not GDF9, improves cytoplasmic maturation and PA-blastocyst production of prepubertal goat oocytes. To summarize, we concluded that EGFR expression in prepubertal goat COCs, both in oocytes and CC, increases with follicle size and therefore with oocyte developmental competence. We proved that IVM strategies such as biphasic IVM (CAPA-IVM) and addition of BMP15 to IVM media promote EGFR expression in oocytes and CC from prepubertal goats. Finally, we improved developmental competence of prepubertal goats by adding BMP15 to IVM medium, however CAPA-IVM was not able to improve embryo production regardless of follicle size.

[es] La maduración in vitro de los ovocitos (IVM) es un paso limitante para la producción de embriones in vitro (IVEP), ya que afecta negativamente la competencia de los ovocitos para el desarrollo embrionario. El objetivo de este estudio fue analizar el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como marcador de competencia en ovocitos de cabras prepúberes y promover la expresión de esta proteína durante la IVM para mejorar la competencia de los ovocitos en el desarrollo embrionario. Se emplearon dos estrategias de IVM: (1) atenuar la reanudación meiótica espontánea con inhibidores meióticos en un sistema bifásico (CAPA-IVM) y (2) promover la adquisición de competencia mediante la adición de los factores BMP15 y GDF9, secretados por el ovocito. En el primer estudio, cuantificamos la expresión de EGFR en ovocitos de cabras y ovejas prepúberes obtenidos de folículos pequeños (<3 mm, SF) y grandes (≥3 mm, LF). La expresión de EGFR en las células del cúmulo (CC) se midió mediante western blotting y en ovocitos mediante inmunofluorescencia. En ambas especies, la expresión de EGFR fue mayor en LF que en SF, tanto en ovocitos como en CC. Esto sugiere que la expresión de EGFR aumenta con el tamaño del folículo y se relaciona con la competencia de desarrollo de los ovocitos. En el segundo estudio, evaluamos el efecto de CAPA-IVM sobre la competencia de los ovocitos de cabras prepúberes obtenidos de SF y LF. En el primer experimento, los ovocitos se cultivaron durante 6 horas en pre-IVM con 200 nM de péptido natriurético tipo C (CNP) y 10 nM de estradiol como inhibidores meióticos. La tasa de vesícula germinal (GV) fue mayor en los grupos CNP que en el control (69% vs 28% en SF y 67% vs 31% en LF). En el segundo experimento, los ovocitos se cultivaron con IVM convencional (c-IVM) o CAPA-IVM (pre-IVM + c-IVM) y se evaluaron la expresión de EGFR, los niveles de especies reactivas de oxígeno intraovocitarias (ROS) y el desarrollo de blastocistos. En LF, la expresión de EGFR y los niveles de ROS fueron mejores tras CAPA-IVM, pero estas diferencias no se observaron en SF. La tasa de blastocistos fue similar en SF (3,7% vs 2,6%) y LF (8,3% vs 2,5%). En resumen, CAPA-IVM mejoró la expresión de EGFR y la capacidad antioxidante en ovocitos de LF, pero los ovocitos de SF eran demasiado inmaduros para beneficiarse. En el tercer estudio, se evaluó el efecto de añadir BMP15 y GDF9 al medio de IVM de ovocitos de cabras prepúberes. Los complejos cúmulo-ovocito (COCs) se cultivaron in vitro en ausencia (grupo control) o presencia de 100 ng/mL de BMP15, GDF9 o ambos. Para evaluar la comunicación entre cúmulo y ovocito, se determinó la densidad de las proyecciones transzonales (TZP) a las 0 h, 6 h, 12 h y 24 h de IVM. Tras la IVM, se midió la expresión de EGFR, la expansión del cúmulo y la actividad mitocondrial. Finalmente, se evaluó la producción de blastocistos tras la activación partenogenética (PA) y la fecundación in vitro (FIV). La adición de BMP15 incrementó la densidad de TZP durante las primeras 6 horas y mejoró la expresión de EGFR, la expansión del cúmulo, la actividad mitocondrial y la producción de blastocistos tras PA (15,5% vs 6,3%). No se observaron diferencias en la producción de blastocistos tras FIV. La suplementación con GDF9, sola o combinada con BMP15, no mejoró ningún parámetro. En conclusión, la adición de BMP15 al medio de IVM mejora la maduración citoplasmática y la producción de blastocistos en ovocitos de cabras prepúberes, pero CAPA-IVM no mejoró la producción de embriones.