[ca] Introducció. La medicina personalitzada promet el diagnòstic i el tractament de malalties a nivell individual i depèn en gran manera de la qualitat de les mostres clíniques i els assajos de diagnòstic. A mesura que es disposa d'opcions de tractament més específiques, es requereixen proves per a múltiples marcadors tumorals i es necessita optimitzar l'ús de mostres per a permetre un flux de treball de diagnòstic complet. A més, la caracterització de l'estat immunitari dels pacients es torna cada vegada més important per a la inmunooncología. L'extracció d'informació i els coneixements biològics requerits a partir de portaobjectes de teixit continua sent un desafiament amb els mètodes tradicionals basats ​​en teixits. Les dades de recerques recents han demostrat que els cicles iteratius de tinció i descoloració es poden realitzar en un sol portaobjectes de teixit sense perdre antigenicitat. No obstant això, la metodologia proposada era manual, laboriosa i lenta, la qual cosa limitava la seva aplicabilitat fora d'un entorn de recerca. Objectius. Planegem desenvolupar i validar panells de NGI específics compostos per diferents biomarcadors dissenyats per a abordar a) la quantificació del biomarcador KI67 en cèl·lules tumorals de manera reproduïble i automatitzada; b) la caracterització del microambient tumoral; i c) la caracterització dels fenotips de les cèl·lules tumorals de càncer de mama, heterogeneïtat i interaccions espacials amb cèl·lules T citotòxiques. Resultats. En el primer estudi es va dissenyar un panell NGI compost per KI67 per a la informació de proliferació i PanCK per a reconeixement de cèl·lules tumorals; el que ens va permetre, juntament amb l'anàlisi d'imatges, quantificar el KI67 en les cèl·lules tumorals de manera automàtica i solucionar els problemes de reproducibilitat que té la cuantificació del KI67. En el segon estudi es va dissenyar un panell compost per diferents biomarcadors per a explorar les cèl·lules T: CD3 (cèl·lules T), Foxp3 (cèl·lules T reguladores), CD4 (cèl·lules T auxiliars), CD8 (cèl·lules T citotòxiques), KI67 (marcador de proliferació), PanCK (reconeixement de células tumorals) que ens va permetre quantificar els diferents subtipus de cèl·lules T en la mostra, la seva distribució espacial i la seva anàlisi de proliferació. En el tercer estudi, un panell compost per KI67, receptor d'estrogen (ER), receptor de progesterona (PR), HER2 (receptor 2 del factor de creixement epidèrmic humà) i PanCK va proporcionar informació sobre l'expressió de cada biomarcador a nivell cel·lular; el que va permetre l'anàlisi de coexpresió en la mateixa cèl·lula, la seva distribució, la seva interacció espacial (cèl·lula tumoral-cèl·lula tumoral, cèl·lula tumoral-cèl·lules immunes) i els seus canvis durant el tractament anti-Her2. Conclusions. NGI ha estat desenvolupat, validat i utilitzat en diferents estudis. Pot ser utilitzat en qualsevol laboratori de patologia o recerca que estigui equipat per a patologia digital, d'una forma relativament senzilla i econòmica. Utilitza un únic portaobjectes per a cadascun dels panells, estalviant material per a anàlisis posteriors. NGI proporciona resultats reproduïbles que són comparables als IHC estàndard. NGI quantifica diferents biomarcadors a nivell d'una sola cèl·lula, proporcionant anàlisis de coexpresión i espacials; informació que ajuda a comprendre millor la biologia i la complexitat del tumor. Aquesta informació podria usar-se per a la predicció de la resposta a tractaments i per a identificar nous o millors biomarcadors per a predir la resposta al tractament i recolzar una millor estratificació dels pacients cap a diferents immunoteràpies o combinacions de teràpies.

[en] Introduction. Personalized medicine promises diagnosis and treatment of disease at the individual level and relies heavily on clinical specimen and diagnostic assay quality. As more targeted treatment options become available, testing for multiple tumor markers is required and optimization of sample use is needed to allow for a complete diagnostic workflow. In addition, characterization of the immune status of patients becomes increasingly important to immuno-oncology. The required extraction of information and biological insights from tissue slides remains challenging using traditional tissue-based methods. Recent research data have shown that iterative cycles of staining and destaining can be performed in a single tissue slide without losing antigenicity. However, the methodology proposed was manual, labor-intensive and time-consuming, thus limiting its applicability outside a research environment. Hypothesis. We have developed an innovative, simple, robust and automatized methodology, Next Generation Immunohistochemistry (NGI), to sequentially determine the expression of multiple individual biomarkers in a single tissue section. NGI may fill the actual limitations of the current approaches and become one of the multiplexed imaging technologies that could be used in different pathology and research laboratories to improve biomarker analyses in precision oncology. NGI may allow for a comprehensive characterization of biological tissue samples at cellular level while maintaining important spatial distribution/interaction between tumor and its microenvironment, information necessary to understand tumor biology and complexity. Objectives. We plan to develop and validate specific NGI panels composed of different biomarkers designed to address the a) quantification of KI67 biomarker in tumor cells in a reproducible and automated way; b) characterization of the tumor microenvironment; and c) characterization of breast cancer tumor cell phenotypes, heterogeneity and spatial interactions with cytotoxic t-cells. Results. In the first study, an NGI panel composed of KI67 for proliferation information and PanCK for tumor cell recognition was designed, which allowed us together with image analysis, to quantify KI67 in the tumor cells automatically and solve the reproducibility issues that KI67 index has. In the second study a panel composed of different biomarkers to explore the t-cells was designed: CD3 (t-cells), Foxp3 (regulatory t-cells), CD4 (helper t-cells), CD8 (cytotoxic t-cells), KI67 (proliferation marker), PanCK (tumor recognition) that allowed us the quantification of the different t-cell subtypes in the sample, their spatial distribution and their proliferation analyses. In the third study a panel composed of KI67, estrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR), HER2 (human epidermal growth factor receptor-2) and PanCK provided information on the expression of each biomarker at a single-cell level, allowing analysis of their co-expression in the same cell, their distribution, their spatial interaction (tumor cell-tumor cell, tumor cell-immune cells) and their changes during anti-Her2 treatment. Conclusions. NGI has been developed, validated and used in different studies. It can be used in any pathology or research laboratory that is equipped for digital pathology, in a relatively simple and inexpensive way. It only uses a single slide for each of the panels saving material for further analyses. NGI provides reproducible results that are comparable to standard IHCs. NGI quantifies different biomarkers at a single cell level, providing co-expression and spatial analyses, information that helps deeper understand the tumor biology and complexity; information that could be used for response prediction and for identifying better or new biomarkers to predict response to treatment and supporting better patient stratification towards different immunotherapies or therapy combinations.