[en] OSTEOINDUCTION BY GENE THERAPY. ALTERNATIVE TO CONVENTIONAL BONE GRAFTING. Gene therapy is a new therapeutic mode that emerges in the 1980s and it can be defined as the transfer of nucleic acids (DNA or RNA) for therapeutic purposes. The use of viral and non-viral vectors in gene therapy is a very useful tool to deliver the desired protein gene to the target cell and thus the gene is expressed producing de desired protein. This experimental work aims to use gene therapy for tissue regeneration and its application to complex bone defects. The main objective of this work is to create autologous bone using the ostoinductive capacity offered by gene therapy. The clinical application of gene therapy for the reconstruction of complex bone defects will advance with the development of more effective and safe vectors in the future. Non-vascularized autologous bone grafts are the conventional method for reconstruction of bone defects. For larger and more complex bone defects, vascularized bone grafting is used. These vascularized bone grafts have the problem of donor site morbidity. Hypothesis for the experimental work. The hypothesis is that it is possible to obtain autologous bone using gene therapy techniques and the use of newly formed bone for the consolidation of bone defects. Methodology: Experience 1: Infection of target cells (fibroblasts obtained from Lewis rat muscle) with AXCAOBMP2 adenovirus (carrying of the BMP2 protein gene). In vitro study: verification of the production of the BMP-2 protein by target cells. Experience 2: In vivo infection of Lewis rat quadriceps muscle cells. Histological and radiological verification of bone formation. Experience 3: In vitro infection of Lewis rat bone marrow mesenchymal cells with AxCAOBMP2 adenovirus and subsequent in vivo transfer. Histological and radiological verification of bone formation. Experience 4: Creation of a femoral diaphyseal defect in an animal model (Lewis rat). Infection of the area of the bone defect with the AxCAOBMP2 adenovirus. Radiological verification of consolidation in the bone defect. Results: Experience 1: In vitro verification that fibroblast cell cultures are infected by the AXCAOBMP2 adenovirus. The infected cells produce the BMP2 protein and there is also a differentiation towards alkaline phosphatase positive cells. Experience 2: Radiological and histological evidence of bone formation in the rat quadriceps. Experience 3: Radiological and histological verification of bone formation at the point of injection of cells previously infected in vitro. Experience 4: Radiological verification that the femurs treated with the AxCAOBMP2 adenoviruses have consolidation of the bone defect while the untreated animals do not have consolidation. Discussion. Gene therapy will be used in the coming years for tissue regeneration through the transfection of genes that induce the production of specific proteins that stimulate pluripotencial cells to differentiate into a certain cell type. Clinical application will depend on the use of more effective and safer vectors (viral and non-viral) in the future. Conclusion. Our final conclusion responds positively to the working hypothesis: it is possible to create autologous bone from gene therapy applied to osteoinduction and the autologous bone obtained can be used for the reconstruction of bone defects.

[es] Resumen de la TESIS. La terapia génica es una nueva modalidad terapéutica surgida a finales de los años 80, y que puede definirse como la transferencia de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) con fines terapéuticos. La utilización de vectores (vectores virales y vectores no-virales) en terapia génica son herramientas muy útiles para la administración del gen de la proteína deseada a las células diana y así el gen es expresado y produce la proteína deseada. Las principales aplicaciones clínicas de la terapia génica se han centrado en 3 campos. 1. La terapia génica en enfermedades metabólicas hereditarias. 2. La terapia génica en el tratamiento del cáncer . 3. Inmunización frente a enfermedades infecciosas mediante transferencia génica. El presente trabajo pretende utilizar la terapia génica para la regeneración tisular en concreto para la osteoinducción ósea y su aplicación a defectos óseos complejos. El objeto central del presente trabajo experimental es crear hueso autólogo a partir de la capacidad osteoinductiva que nos ofrece la terapia génica, en concreto la manipulación génica de células endógenas para generar proteínas específicas con capacidad osteoinductiva.(BMPs). En segundo lugar conseguir que el hueso autólogo obtenido mediante la utilización de la terapia génica pueda ser usado en la reconstrucción de un defecto óseo. La aplicación clínica de la terapia génica orientada la reconstrucción de defectos óseos complejos irá ligada al desarrollo de vectores de terapia génica más efectivos y seguros (vectores no –virales) en el futuro. Antecedentes Los injertos óseos autólogos no vascularizados constituyen el método convencional para la reconstrucción de defectos óseos. Para defectos óseos mayores y allí donde el lecho receptor tiene una pobre vascularización la elección es el injerto óseo Los aloinjertos (injertos óseos de cadáver) tienen capacidad osteconductiva pero no poseen propiedades osteoinductivas. Además presentan el inconveniente de su importante grado de reabsorción y la posibilidad de transmisión de enfermedad. Los implantes de material sintético no son una buena solución biológica y tienen una longevidad limitada. El injerto óseo autólogo vascularizado es el de primera elección en la reconstrucción de defectos óseos extensos. Como inconvenientes de estos injertos óseos vascularizados están por un lado la morbilidad que ocasiona en las zonas donantes, y por otro el reducido número de las mismas. Esto conlleva unas restricciones anatómicas en cuanto a las dimensiones y morfología de las posibles transferencias óseas vascularizadas. Valgan todas estas consideraciones como "JUSTIFICACIÓN" del siguiente trabajo experimental que pretende conseguir crear hueso autólogo a partir de la capacidad osteoinductiva que nos ofrece la terapia génica, en concreto la manipulación génica de células endógenas para producir proteínas específicas con capacidad osteoinductiva (BMP/proteínas morfogenéticas productoras de hueso) y que se produzcan en cantidad suficiente y tiempo mantenido para que induzcan a la diferenciación celular hacia osteoblastos y a la formación de tejido óseo. Hipótesis de trabajo: En nuestro trabajo experimental se pretende conseguir crear hueso autólogo a partir de la capacidad osteoinductiva que nos ofrece la terapia génica, en concreto la manipulación génica de células endógenas para generar proteínas específicas con capacidad osteoinductiva. En segundo lugar conseguir que el hueso autólogo obtenido mediante la utilización de la terapia génica pueda ser usado en la reconstrucción de un defecto óseo. Por tanto la HIPOTESIS de nuestro trabajo es conseguir un hueso autólogo utilizando técnicas de terapia génica y utilización del hueso neoformado para la consolidación de defectos óseos. Objetivos concretos: 1 OBJETIVO EXPERIENCIA I 1. Infectar in vitro fibroblastos obtenidos de rata Lewis (células diana) con el adenovirus AXCAOBMP-2, que es un adenovirus de replicación deficiente y con expresión del gen de la BMP-2. 2. Detectar expresión de BMP-2 por las células infectadas con el vector viral mediante la técnica Western-blot. 3. Comprobar la conversión de las células diana hacia osteoblastos mediante la detección de fosfatasa alcalina como marcador de diferenciación celular. 2 OBJETIVO EXPERIENCIA II 1. Infectar in vivo células musculares de la rata Lewis (células diana) mediante inyección intramuscular de los adenovirus AXCAOBMP-2. 2. Comprobar mediante estudio radiológico e histológico la formación de hueso osteoinducido. 3 OBJETIVO EXPERIENCIA III 1. Infección in vitro de células pluripotenciales de médula ósea obtenidas de la rata Lewis (células diana), con el adenovirus AXCAOBMP-2. 2. Transferir in vivo, mediante inyección de las células infectas in vitro en el cuádriceps del animal experimental (rata Lewis). 3. Comprobar mediante estudio radiológico e histológico la formación de hueso osteoinducido. 4 OBJETIVO EXPERIENCIA IV 1. Crear un defecto diafisario femoral en la rata Lewis. 2. Infección in vivo del foco de fractura mediante la inyección intramuscular de los adenovirus AXCAOBMP-2. 3. Comprobar radiológicamente la consolidación ósea en el defecto óseo. Metodología: EXPERIENCIA I: Infección de células diana (fibroblastos obtenidos de músculo rata Lewis) con adenovirus portadores del gen de la BMP-2 ( AxCAOBMP-2). Estudio in vitro: test de infección por los adenovirus , comprobación de la producción de BMP-2 por las células diana . EXPERIENCIA II: Infección in vivo de células musculares correspondiente al cuádriceps del animal. Modelo animal rata LEWIS. Comprobaremos histológicamente y radiológicamente la formación ósea. EXPERIENCIA III: Infección in vitro con el adenovirus AxCAOBMP-2 de cels mesenquimales de médula ósea de rata Lewis para su posterior transferencia in vivo. Modelo animal en rata LEWIS. Comprobación radiológicamente y radiológicamente de la formación de hueso. EXPERIENCIA IV: Creación de un defecto diafisario femoral en modelo animal (rata Lewis). Infección de la zona del defecto óseo creado con el adenovirus AxCaoBMP-2. Comprobación radiológica de la consolidación en el defecto óseo tratado. Resultados: EXPERIENCIA I: Comprobación in vitro que los cultivos celulares con fibroblastos son infectados por los adenovirus portadores del gen BMP-2 y que dichas células producen BMP-2 y además se produce su diferenciación hacia células fosfatasa alcalinas positivas. EXPERIENCIA II: Infección in vivo de células musculares en el cuádriceps de la rata. Comprobación radiológica e histológica de formación de hueso. EXPERIENCIA III. : Infección in vitro de células mesenquimales de médula ósea con los adenovirus portadores del gen de la BMP-2. Posterior transferencia de las células infectadas al modelo animal (rata Lewis). Comprobación radiológica e histológica de formación de hueso en el punto de inyección de las células infectadas in vitro previamente. EXPERIENCIA IV. Aplicación a un defecto óseo diafisario en el fémur de la rata Lewis. Comprobamos radiológicamente que los fémures tratado con los adenovirus portadores de la BMP-2 tenían consolidación en el defecto femoral creado mientras que los animales de grupo controlo no tenían consolidación. Discusión. La terapia génica tendrá su utilización en los próximos años en la REGENERACIÓN TISULAR mediante la estimulación a través de la transfección de aquellos genes que estimulen la producción de las proteínas precisas que induzcan a las células pluripotenciales a diferenciarse hacia un determinado tipo celular. En nuestro trabajo hemos buscado la diferenciación hacia tejido óseo (OSTEOINDUCCION) para su utilización en reconstrucciones óseas complejas. La aplicación clínica irá ligada a la utilización de vectores para terapia génica más eficaces y seguros en el futuro. CONCLUSION FINAL Nuestra conclusión final responde de forma positiva a nuestra hipótesis de trabajo: "es posible crear hueso autólogo a partir de la terapia génica aplicada a la osteoinducción y que el hueso autólogo obtenido se puede utilizar para la reconstrucción de defectos óseos en cirugía plástica