[en] The main purpose of this Doctoral Thesis is the molecular characterization and the functional study of the PHB1 and PHB2 proteins of T. cruzi. First, in order to obtain antibodies, cloning and expression of the PHBs from T. cruzi in E. coli have been carried out. These antibodies have been employed to determine the subcellular localization of the PHBs through fluorescence and electronic microscopy, observing a differential localization among the different forms of the parasite. Likewise, it has been compared the expression of these proteins in the different forms of T. cruzi, observing a major expression in the epimastigote stage. It has also been determined in vitro that PHBs from T. cruzi, as well as L. major, possess the ability to bind Fe3+ and protect the DNA from the action of H2O2, inhibiting the Fenton reaction, which reactive oxygen species (ROS) are generated. To determine the role of PHBs in the parasite's biology, these proteins have been successfully overexpressed and attempted to make knockout lines for the phb1 and phb2 genes. For the first line, a decrease in the expression of the PHB1 has been observed and for the second one, a knockout line, the lack of phb2 was demonstrated to be lethal to the parasite. In the stage of epimastigotes, the lines overexpressing the PHBs did not affect the parasite's growth, but these lines were more capable to resist oxidative stress. In this study, it was also determined that the PHBs do not favor the infection, but once the trypomastigotes penetrated the host cells, those cells overexpressing PHBs favored the intracellular multiplication of the amastigotes forms. Finally, antigenicity of PHB2 has been demonstrated since the recombinant PHB2 protein is recognized by the sera of chagasic patients.

[es] El principal propósito de esta Tesis Doctoral es la caracterización molecular y el estudio de la funcionalidad de las proteínas PHB1 y PHB2 de T. cruzi. Para ello, se ha realizado la clonación y expresión de las PHBs de T. cruzi en E. coli, a fin de obtener anticuerpos a partir de las proteínas recombinantes. Dichos anticuerpos se han utilizado para la determinación de la localización subcelular de las PHBs en diferentes estadios del parásito a través de microscopia de fluorescencia y electrónica, observándose una localización diferencial entre las distintas formas. Asimismo se ha analizado la expresión de las proteínas de interés en diferentes formas de T. cruzi, observándose una mayor expresión en el estadio de epimastigotes. También se ha determinado que al igual que las PHBs de L. major, las de T. cruzi poseen la capacidad de unión al Fe3+ y en ensayos in vitro, pueden proteger al ADN de la acción del H2O2 inhibiendo la reacción de Fenton, en la cual se forman especies reactivas de oxígeno (ROS). Para determinar el papel de las PHBs en la biología del parásito se han sobreexpresado las PHBs de T. cruzi de forma exitosa y mediante el sistema CRISPR/Cas9 se ha intentado realizar líneas knockout para los genes phb1 y phb2, de las cuales se ha conseguido una línea disminuida para la PHB1 y otra línea knockout para la PHB2, demostrando que la falta del gen phb2 es letal para el parásito. Asimismo, con las líneas que sobreexpresaron a las PHBs se ha determinado el posible papel de dichas proteínas en los diferentes estadios de T. cruzi, observándose que en el estadio de epimastigotes la sobreexpresión de las PHBs no afectó al crecimiento del protozoo. Además se determinó que tanto la PHB1 como la PHB2 están implicadas en la protección al parásito frente a condiciones de estrés oxidativo. En este estudio también se ha determinado que las PHBs no favorecen la infección, pero una vez los tripomastigotes penetraron en las células, si se observó que la sobreexpresión de las PHBs en el estadio de amastigotes favoreció la capacidad de multiplicación intracelular del parásito. Finalmente, la antigenicidad de la PHB2 ha quedado demostrada dado que la proteína recombinante PHB2 es reconocida antigénicamente por los sueros de pacientes chagásicos.