[en] In the past decades, multiphoton microscopy has become a very useful tool for the visualization of biological tissues. In particular, second harmonic generation (SHG) microscopy has an important advantage over conventional microscopy methods, due to its ability to observe tissues formed by type I collagen, such as the sclera and the cornea, without stanning and/or fixation procedures. These ocular structures are of interest for this PhD Thesis. For this purpose, we present a prototype of a compact multiphoton microscope adapted for the examination of the external segment of the living human eye. This new system requires a calibration of the acquisition parameters, aiming at a compromise between image quality and safety for the biological tissues under study, to record optimal images using reduced exposure times. The evaluation of the quality of images, recorded with different acquisition parameters, has confirmed that it is possible to achieve an optimal recording with exposure times below 1 s. Once the optimal recording conditions have been evaluated, it is necessary to know if the experimental system is suitable for in vivo imaging, taking into account the laser source parameters, the exposure time and the visual angle, following the ANSI Z136.1 standards. Therefore, a detailed analysis of the Maximum Permissible Exposure (MPE) calculation for the experimental system developed is included herein. This analysis concludes that the multiphoton microscope developed in this work is safe for the proposed experimental conditions. After the safety analysis, we proceeded to record images in live conditions of healthy volunteer patients, keeping the experimental conditions well below the calculated MPE. As a result, images of the cornea, sclera and sclero-corneal limbus were recorded with sufficient resolution to detect individual fibers and cells, comparable to ex-vivo samples, with high repeatability. In some cases, involuntary eye movements can cause image degradation, hence the need to reduce the exposure time, and, as in all biological samples, when images are obtained deeper in the eye, phenomena such as scattering occur, which also reduce the quality of the images. Due to this, different methods of image improvement are proposed. We have reported a marginal blind deconvolution method. This allows restoring images when little information is available from the experimental system, and unsupervised. This procedure has demonstrated to increase the quality of the deconvoluted images, as well as in their resolution, compared to the original images. An alternative enhancement method has been the use of radially polarized light, by means of an S-waveplate. The images acquired with radially polarized light have been compared with images recorded, quasi-simultaneously, with circularly polarized light. The increase in quality of images acquired with radial light is remarkable, especially noticeable with depth, where images are more degraded due to aberrations and scattering. Finally, we have compared images recorded with a sub-10fs laser, with reduced dimensions and greater flexibility for the implementation of a prototype multiphoton microscope in the clinic, and a typical Ti:Sapphire laser of more than 120 fs, of large dimensions and high cost. The results show that the sub-10fs laser is highly affected due to the action of chromatic dispersion, being necessary to increase the laser output power to obtain images of similar qualities to those acquired with the Ti:Sapphire laser. The enhancement methods applied in this Thesis allowed enhanced multiphoton images that provide information on the structures of the cornea and sclera, while not compromising the integrity of the tissues, since they remain several orders of magnitude below the maximum exposure levels allowed for the human eye.

[es] Durante las últimas décadas la microscopía multifotónica se ha convertido en una herramienta de gran utilidad para visualizar tejidos biológicos. En particular, la microscopía de generación de segundo armónico (SHG, del inglés Second Harmonic Generation) tiene una ventaja importante respecto a métodos de microscopía convencionales, debido a su capacidad para observar tejidos formados por colágeno tipo I, como la esclera y la córnea, sin necesidad de operaciones de teñido y fijado. Dichas estructuras oculares son las que vamos a estudiar en esta Tesis Doctoral. Para ello, presentamos un prototipo de microscopio multifotónico compacto que nos servirá para examinar el segmento externo del ojo humano en vivo. Este nuevo sistema requiere una calibración de los parámetros de adquisición de imágenes óptimas en tiempos de exposición reducidos, buscando un compromiso entre la calidad de imagen y la seguridad de los tejidos bajo estudio. La evaluación de la calidad de imágenes, registradas con diferentes parámetros, ha permitido confirmar que se pueden obtener imágenes óptimas, con alta resolución, en tiempos de exposición menores de 1 s. Una vez evaluadas las condiciones de registro óptimo, fue necesario saber si el sistema es apto para su uso en vivo, teniendo en cuenta parámetros de la fuente láser, el tiempo de exposición y el ángulo visual, siguiendo la norma ANSI Z136.1. Los cálculos de la exposición máxima permitida (Maximum Permissible Exposure, MPE) para el microscopio multifotónico indican que es seguro para las condiciones experimentales propuestas. Tras el análisis de seguridad, se procedió al registro de imágenes en condiciones en vivo en ojos de voluntarios sanos, registrando imágenes de la córnea, la esclera y el limbo esclerocorneal, con suficiente resolución como para detectar fibras y células individuales, comparables a condiciones ex vivo, con alta repetibilidad. En algunos casos, movimientos involuntarios del ojo, pueden dar lugar a una degradación de la imagen. Además, como en todas las muestras biológicas, en el ojo también se producen fenómenos tipo scattering, reduciendo la calidad de las imágenes. Por esta razón se ha propuesto la mejora de imágenes multifotónicas mediante diferentes técnicas. Se ha analizado la utilidad de un procedimiento de deconvolución ciega marginal. Este método permite restaurar imágenes cuando se cuenta con poca información del sistema experimental, sin necesidad de supervisar el proceso. Con su aplicación se mejora la calidad de las imágenes deconvolucionadas, así como su resolución, en comparación a las imágenes originales. Otro método para mejorar las imágenes registradas ha sido el uso de luz polarizada radialmente, mediante una lámina "S-waveplate". Las imágenes adquiridas con la luz radial se han comparado con imágenes registradas, cuasi simultáneamente, con luz polarizada circularmente. El aumento en la calidad de imágenes adquiridas con luz radial es destacable, especialmente con la profundidad, donde las imágenes se degradan más debido a las aberraciones y el scattering. Finalmente, se han comparado imágenes registradas con un láser de pulsos de menos de 10 fs, con dimensiones reducidas y mayor flexibilidad para la implementación de un prototipo de microscopio multifotónico clínico, y con un láser de Ti:Zafiro de más de 120 fs, de grandes dimensiones y alto coste. Los resultados muestran que el primero se ve más afectado por la acción de la dispersión cromática, por lo que es necesario aumentar la potencia de salida del láser para obtener imágenes de cualidades similares a las adquiridas con el láser de Ti:Zafiro. Los métodos de mejora aplicados, con mayor o menor éxito, permiten obtener imágenes multifotónicas óptimas que aportan información sobre las estructuras de la córnea y la esclera, sin poner en riesgo la integridad de los tejidos, ya que se mantienen varios órdenes de magnitud por debajo de los niveles de exposición máximos permitidos para el ojo humano.