[en] Background: Glioblastoma (GB) is the most frequent malignant glioma. Methyl Guanine Methyl Transferase (MGMT) promoter methylation is a known prognostic and predictive factor of response to temozolomide in these tumors. However, repeating MGMT analysis is not always feasible. Brain rebiopsies involve risk to the patient. Moreover, tissue biopsies could not always represent the tumor heterogeneity. Advances in the use of biomarkers in liquid biopsy are positioning it as a solution to these disadvantages. MGMT methylation status analysis can be carried out through several techniques, being the methylation-specific PCR (MSP) the most used. Pyrosequencing is a simple method that has proved useful for this analysis. In this project, we have determined the MGMT promoter methylation status, in tissue samples and in ctDNA from blood samples of GB patients, by MSP and pyrosequencing. Methodology: MGMT methylation was analyzed in tissue and blood from patients diagnosed with GB. We used MSP (CpG 74-78 and 84-87) in 81 tissue samples and 83 blood samples, and pyrosequencing (CpG 74-78) in 78 tissue, 56 serum and 55 plasma samples. For pyrosequencing, two cut-off points with clinical relevance were considered: one that divided the cohort into two groups according to the maximum difference in overall survival, called "best cut-off point", and the minimum percentage from which the methylation had already a clinical impact, called the "minimum cut-off point". Both were statistical significant. Results: The "best cut-off point" in tissue was 11.4%, while the "minimum cut-off point" was 5%. The 48.6% of cases were positive for methylation in tissue, by MSP, and 55.7% by pyrosequencing. Eight unmethylated cases by MSP resulted methylated by pyrosequencing, whereas in 3 samples the results were reversed. Similarly, 4 samples that were not assessed by MSP had a result by pyrosequencing. For plasma samples, the "best cut-off" for pyrosequencing was 3.4%. 14.9% were methylated by MSP, while 28.6% were methylated by pyrosequencing. The "best cut-off" in serum was 1.6%, a value below the commercial unmethylated DNA, and it had no significant correlation with overall survival. For this reason, the serum was discarded for further analysis. Conclusions: MSP and pyrosequencing, once the cut-off point is defined, are two valid methods for the MGMT methylation status assay, in tissue of GB patients. Even thought the agreement between them is not perfect, both results correlate with survival and response to treatment with alkylating agents. Therefore, both techniques are useful. Although our project has shown the presence of ctDNA in blood and plasma of GB patients, the sensitivity to determine MGMT methylation, by either method, is low. The serum does not represent a good source to assess MGMT methytation in ctDNA.

[es] Antecedentes: El glioblastoma (GB) es el glioma maligno más frecuente. Mediante el tratamiento multidisciplinar con cirugía, radio y quimioterapia se consigue una supervivencia mediana de 15 meses. La metilación del promotor del gen O-6-Metilguanina-DNA-metiltransferasa (MGMT) es un conocido factor pronóstico y predictivo de respuesta a temozolomida en estos tumores, pero su análisis de manera repetida es complejo. Las rebiopsias cerebrales comportan un riesgo para el paciente, además, las muestras de tejido obtenidas pueden no representar la heterogeneidad tumoral. Los avances en el uso de biomarcadores en biopsia líquida la están posicionando como una solución a estos inconvenientes. La determinación de la metilación de MGMT se puede llevar a cabo con diversas técnicas, siendo la PCR específica de metilación (MSP) la más utilizada, tanto en ensayos clínicos como en la práctica diaria. La pirosecuenciación es una técnica sencilla y con resultados objetivos que se ha demostrado útil para el análisis de esta alteración epigenética. En este proyecto, hemos determinado el estado de metilación del promotor de MGMT, en muestras de tejido y en ctDNA de muestras sanguíneas, utilizando las técnicas de MSP y pirosecuenciación. Metodología: Se analizó la metilación de MGMT en tejido y sangre de pacientes con GB. 81 muestras de tejido y 83 de sangre, fueron valoradas mediante MSP (CpG 74-78 y 84-87), mientras que 78 de tejido, 56 de suero y 55 de plasma, lo fueron mediante pirosecuenciación (CpG 74-78). Para la pirosecuenciación, se consideraron dos puntos de corte con relevancia clínica: aquel que dividía la cohorte en dos grupos según la máxima diferencia en supervivencia global, llamado "mejor punto de corte", y el porcentaje mínimo a partir del cual la metilación ya tenía un impacto clínico, llamado "punto de corte mínimo". Ambos puntos de corte tenían significación estadística. Resultados: El "mejor punto de corte" en tejido fue de 11,4%, mientras que el "punto de corte mínimo" fue de 5%. El 48,6% de casos fueron positivos para la metilación en tejido, mediante MSP y el 55,7% lo fue por pirosecuenciación. Ocho casos no metilados por MSP, se detectaron metilados por pirosecuenciación, mientras que en 3 muestras pasó a la inversa. Asimismo, 4 muestras no valorables por MSP tuvieron resultado por pirosecuenciación. En plasma, el "mejor punto de corte" para la pirosecuenciación fue 3,4%. 14,9% casos fueron metilados por MSP, mientras que el 28,6% lo fue por pirosecuenciación. El "mejor punto de corte" en suero fue de 1,6%, un valor inferior a las muestras de DNA no metilado comercial y sin correlación significativa con la supervivencia global. Por este motivo, el suero se descartó para análisis adicionales. Conclusiones: La MSP y la pirosecuenciación, una vez definido el punto de corte, son dos métodos válidos para la determinación de la metilación del promotor del gen de MGMT, en tejido de pacientes con GB. Aunque la concordancia entre ellos no es perfecta, ambos ofrecen resultados que se correlacionan con la supervivencia y la respuesta al tratamiento con agentes alquilantes. Por lo tanto, ambas técnicas son útiles para detectar pacientes que podrían beneficiarse de dichos tratamiento. Pese a que, en nuestro proyecto, se ha demostrado la presencia de ctDNA en sangre y plasma de pacientes con GB, la sensibilidad para la detección de la metilación de MGMT, con los dos métodos, es baja. El suero no es una buena fuente para la determinación de metilación de MGMT en ctDNA.