[en] The hepatoencephalopathy due to mutations in GFM1, also known as combined oxidative phosphorylation deficiency type I (COXPD1) is a recessive mitochondrial disease caused by mutations in the nuclear gene encoding the mitochondrial translation elongation factor G1 (EFG1). Patients with COXPD1 usually develop a severe encephalopathy, sometimes combined with liver failure, with neonatal onset and rapid progression that normally leads to death during the first weeks or years of life. The study of COXPD1 has been so far performed mainly using in vitro models (cell lines and patient-derived biopsies). Although these experimental tools are useful, the lack of a suitable animal model has represented an important limitation to delve into the disease physiopathology and test potential therapeutic approaches. We have generated two mutant alleles for the Gfm1 murine gene: a knock-in allele (KI) harbouring the missense mutation p.R671C found in at least ten patients that survived more than one year, and a Gfm1 knock-out allele (KO). These alleles allowed us to obtain homozygous KI (Gfm1R671C/R671C) and compound heterozygous KI/KO (Gfm1R671C/-) mice. The homozygous KO mutation was embryonically lethal, whereas Gfm1R671C/R671C mice were viable and showed normal growth. The p.R671C mutation entailed a drastic reduction of EFG1 mitochondrial protein levels in every analysed tissue, causing a decrease of the mitochondrial translation rate and the respiratory chain (RC) complex IV (CIV) enzyme activity in liver of 6-week-old Gfm1R671C/R671C mice. At 50 weeks of age, the mitochondrial translation was similarly reduced but CIV deficiency was no longer observed. The Gfm1R671C/- mouse model, which showed normal survival at least until 80 weeks of age, experienced a more pronounced decrease of EFG1 protein levels in liver and brain mitochondria, as compared with the Gfm1R671C/R671C mice. Consequently, 8 and 30-week-old Gfm1R671C/R671C animals developed a significant reduction of the mitochondrial translation rate in both tissues which, in turn, caused a clear OXPHOS system dysfunction: reduced levels of the assembled complexes I and IV, together with the consequent decrease of their enzymatic activities. Nevertheless, no neuromuscular or hepatic alterations were detected in association with the molecular COXPD phenotype in Gfm1R671C/- mice. Moreover, the increase of mitoriboproteins and ARN-mt levels in liver and brain from this mouse model could be part of molecular response mechanisms promoted to compensate the EFG1 depletion. On the other hand, there is no currently available cure for COXPD1, and the nature of the disease (monogenic, autosomal and recessive) makes it a good candidate to be treated with gene therapy. In the second part of the thesis we initiated a preclinical gene therapy study using adeno-associated viral vectors (rAAV) to introduce the correct copy of the human GFM1 gene into Gfm1R671C/- mice. A single intravenous injection of an AAV9 carrying the GFM1 coding sequence under the control of the human alpha-1-antitripsin hepatic promoter (ssAAV9-ApoE-hAAT-GFM1) on 6-week-old Gfm1R671C/- mice (5E+12 vg/kg) partially recovered the mitochondrial EFG1 levels four weeks after treatment. Additionally, the treatment restored the levels of assembled complexes I and IV and their enzymatic activities in the target tissue, demonstrating the functionality of the EFG1 encoded by the therapeutic gene. Therefore, from the work performed in this thesis we obtained the Gfm1R671C/- mouse showing a clear dysfunctional molecular phenotype that makes it a suitable animal model for COXPD1. Moreover, the results of our gene therapy study show that using rAAV to provide the correct version of the GFM1 gene results in the restoration of the EFG1 function, pointing to gene therapy as a feasible and promising strategy for the treatment of COXPD1.

[es] La hepatoncefalopatía debida a mutaciones en GFM1, también conocida como deficiencia combinada de la fosforilación oxidativa de tipo I (COXPD1), es una enfermedad mitocondrial recesiva causada por mutaciones en el gen nuclear que codifica el factor de elongación de la traducción mitocondrial G1 (EFG1). Los pacientes suelen manifestar una encefalopatía grave, combinada a menudo con insuficiencia hepática, de aparición neonatal y progresión rápida, que normalmente desencadena la muerte durante las primeras semanas o años de vida. El estudio de la COXPD1 se ha llevado a cabo principalmente sobre modelos in vitro y la falta de un modelo animal apropiado ha representado hasta ahora una limitación importante para poder profundizar en la fisiopatología de la enfermedad y testar potenciales aproximaciones terapéuticas. En este trabajo se han generado dos alelos mutantes para el gen Gfm1 murino: un alelo knock-in (KI) con la mutación antisentido p.R671C, identificada al menos en 10 pacientes que han sobrevivido más de un año, y un alelo knock-out (KO). Estos han permitido obtener el modelo de ratón homocigoto KI (Gfm1R671C/R671C) y el heterocigoto compuesto KI/KO (Gfm1R671C/-). La mutación KO en homocigosis resultó letal durante el desarrollo embrionario, mientras que los ratones Gfm1R671C/R671C fueron viables y mostraron un crecimiento normal. La mutación p.R671C dio lugar a una reducción drástica de la proteína EFG1 mitocondrial en todos los tejidos estudiados, causando en los ratones Gfm1R671C/R671C una reducción de la traducción mitocondrial y de la actividad del complejo IV (CIV) de la cadena respiratoria (RC) en hígado a las 6 semanas de edad. La afectación de la traducción mitocondrial se mantuvo a las 50 semanas de edad, pero dejó de observar-se la afectación del CIV. El modelo Gfm1R671C/-, con supervivencia normal al menos hasta las 80 semanas de edad, manifestó una reducción de EFG1 más pronunciada en mitocondrias de hígado y cerebro en comparación con los ratones Gfm1R671C/R671C. En consecuencia, los animales Gfm1R671C/- de 8 y 30 semanas de edad experimentaron una disminución significativa de la traducción mitocondrial en los tejidos diana, que, a su vez, dio lugar a una disfunción clara del sistema OXPHOS: niveles inferiores de los complejos I y IV ensamblados, junto con la reducción consiguiente de sus actividades enzimáticas. A pesar de esto, en los ratones Gfm1R671C/- no se detectó ninguna alteración patológica a nivel hepático o neuromuscular asociada al fenotipo COXPD molecular. Por otra parte, actualmente no existe una cura para la COXPD1 y la terapia génica se sitúa como una posible estrategia apropiada para su tratamiento. Por ello, se inició un estudio preclínico de terapia génica utilizando vectores adenoasociados (rAAV) para introducir una copia correcta del gen GFM1 humano en los ratones Gfm1R671C/-. Una única inyección intravenosa de un AAV9 con la secuencia de GFM1 bajo el control del promotor de la alfa-1-antitripsina humana, de expresión hepática, (ssAAV9-hAAT-GFM1) en ratones Gfm1R671C/- de 6 semanas de edad (5E+12 gv/kg), dio lugar a una recuperación parcial de la cantidad de EFG1 mitocondrial en el hígado a las 4 semanas del tratamiento. Asimismo, se restituyeron los niveles de los complejos I y IV ensamblados y de sus actividades enzimáticas en el tejido diana, demostrando la funcionalidad de la proteína EFG1 codificada por el gen terapéutico. Así pues, a partir de este trabajo se ha obtenido el ratón Gfm1R671C/- con un claro fenotipo molecular disfuncional que lo sitúa como un buen modelo animal de la COXPD1. Además, se muestra como el uso de rAAV para proveer de la versión correcta del gen GFM1 consigue recuperar la función de EFG1 de forma eficaz, apuntando a la terapia génica como una estrategia factible y prometedora para el tratamiento de la COXPD1.