[en] Retinoic acid (RA), the biologically active form of vitamin A, is an important molecular signal for the early embryonic development and the differentiation of many cell types. RA induces the differentiation of neuroblastoma cells when added in vitro, and a therapeutic effect for RA has been demonstrated in a multicenter clinical assay with high-risk neuroblastoma patients. RA signaling is mediated by the retinoic acid receptor (RAR), belonging to the nuclear hormone receptor superfamily. In addition to its classical transcriptional actions, RAR also mediates rapid transcription-independent (nongenomic) actions, consisting in the activation of signal transduction pathways, as the phosphatidyl-inositol-3-kinase or the ERK MAPK-signaling pathways. RA-induced rapid transcription-independent actions play a role in different physiological contexts, being our main goal to elucidate how these rapid actions converge with the transcriptional actions and integrate together to achieve a physiological response to RA. First, several experiments using phospho-specific antibodies and signaling pathways inhibitors showed that activation of PI3K/Akt pathway downstream targets, like mammalian target of rapamycin (mTOR) and p70S6 kinases, was rapidly induced by RA treatment. On the other hand, mitogen- and stress-activated protein kinase 1 (MSK1) was shown to be an ERK target induced by RA addition. Secondly, we identified nuclear proteins whose phosphorylation state was rapidly modified by RA treatment in neuroblastoma cells, by comparing nuclear phosphoproteins from control and RA-treated cells using two proteomic approaches: 2DE-gels stained with Coomassie and quantitative LC-MS/MS assay based on the iTRAQ (isolated tags for relative and absolute quantification) methodology. Our results showed that RA addition led to changes in the phosphorylation patterns in two families of proteins: 1) those related to chromatin dynamics in relation to transcriptional activation, and 2) those related to mRNA processing and, in particular, mRNA splicing. Finally, functional assays showed that RA treatment in neuroblastoma cells led to the alteration of pre-mRNA alternative splicing and mRNA translation patterns, through a molecular mechanism involving SFRS (splicing factor, serine/arginine-rich) proteins. Therefore, we conclude that RA activation of signaling pathways converge at multiple levels with RAR-dependent transcriptional regulation to generate the cellular response to RA orchestrated by RAR receptor.

[es] La vitamina A, a partir de una serie de transformaciones metabólicas, se convierte en el ácido retinoico (RA), su metabolito activo más potente biológicamente. La vitamina A y sus derivados juegan un importante papel como reguladores fisiológicos de un gran número de procesos biológicos. Concretamente, el RA posee un papel relevante en el desarrollo embrionario temprano y en la generación de varios órganos y sistemas, como es el caso del Sistema Nervioso. El RA es capaz de inducir la parada proliferativa y la diferenciación in vitro de líneas celulares de muy diferente origen, incluyendo muchos tipos celulares tumorales como el neuroblastoma. Estudios previos realizados en la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y han mostrado que, además de las acciones clásicas sobre la transcripción de genes específicos, el receptor nuclear de RA (RAR), perteneciente a la superfamilia de los receptores nucleares de hormonas, media cambios rápidos en el estado de activación de rutas de señalización, como la ruta de PI3K/Akt y la vía de la MAP kinasa ERK. Este tipo de acciones rápidas independientes de transcripción, también llamadas no genómicas, constituyen el tema de interés principal de esta Tesis Doctoral, siendo nuestro objetivo general tratar de comprender cómo contribuyen este tipo de acciones en los procesos celulares y cómo se integran con las acciones genómicas transcripcionales para conseguir una única respuesta al RA. Un primer estudio de los intermediarios de estas rutas, mediante el empleo de fosfoanticuerpos específicos de residuo e inhibidores de las vías de señalización, demostró que la activación de PI3K/Akt y ERK por un tratamiento a tiempos cortos con RA se traduce en la fosforilación de sustratos corriente abajo (downstream), como mTOR y p70S6 en el caso de Akt, y MSK1 para ERK. Además, se estableció que ERK es activada independientemente de PI3K, aunque existe cierta relación entre ambas, pues la inhibición de PI3K con LY294002 modificaba el grado de inducción de ERK. Mediante un abordaje proteómico, se trató de identificar a aquellas proteínas nucleares que sufrían un cambio en su estado de fosforilación como consecuencia de las acciones atípicas del RA. Primeramente, se realizó una comparación de geles bidimensionales teñidos con Coomassie de fosfoproteínas nucleares de las células control y tratadas con RA. Este estudio fue ampliado con un ensayo LC-MS/MS cuantitativo empleando la metodología iTRAQ. Los resultados mostraron que el RA modifica el patrón de fosforilación de dos grandes grupos de proteínas: 1) aquellas que participan en transcripción y en la remodelación de la cromatina, y 2) las relacionadas con el procesamiento del mRNA, y dentro de ellas, sobre todo las implicadas en splicing. Además, estos resultados pudieron ser validados para algunas de estas proteínas mediante el empleo de otras metodologías. Los estudios funcionales mostraron que efectivamente el RA participa en la regulación del splicing alternativo, a través de la activación de la vía de PI3K/Akt. El mecanismo molecular podría implicar alteraciones en la unión al mRNA de algunos factores de splicing ricos en Ser y Arg (proteínas SFRS) y la promoción de la interacción entre las proteínas de splicing SF2 y U1- 70K. Por otro lado, el RA también desempeña un papel en la regulación del inicio de la traducción, que requiere de la inducción de la vía de PI3K/Akt/mTOR, responsable de fosforilar a 4E-BP1, y de la MAP kinasa ERK. Como conclusión, la activación de vías de señalización por las acciones no genómicas del RA en células de neuroblastoma puede regular el procesado del mRNA como parte de la respuesta orquestada por el receptor nuclear RAR.