[ca] La determinació de fluxos metabòlics constitueix una eina fonamental per a l'anàlisi quantitativa de la fisiologia cel·lular, ja que ens proporciona una mesura del grau d'implicació de les diverses vies en els processos metabòlics així com una visió general del comportament cel·lular. La quantificació exacta de la magnitud dels fluxos de cadascuna de les diferents vies "in vivo" és, per tant, un objectiu important de la fisiologia cel·lular i l'enginyeria metabòlica, especialment en el context de la biotecnologia industrial, l'objectiu principal de la qual és maximitzar la producció del compost d'interès, com ara la producció de compostos químics, biopolímers o d'altres compostos bioactius com ara les proteïnes. Aquest projecte de recerca s'ha dirigit a contribuir a una millor comprensió de la fisiologia del llevat metilotròfic Pichia pastoris sota l'estrès ocasionat per la producció de proteïnes recombinants. Concretament, aquesta tesi s'ha centrat en l'anàlisi sistemàtica del metabolisme cel·lular a nivell fluxomic i metabolòmic, i com aquests conjunts de dades de diferents nivells poden integrar-se i contribuir a la comprensió dels efectes de la càrrega metabòlica potencialment imposada per la secreció d'una proteïna recombinant i l'efecte del tipus de font de carboni utilitzat. En el Capítol 2, s'obtingué una descripció consistent de la composició principal de la biomassa de P. pastoris per a cada condició de cultiu realitzada en aquest estudi. Els resultats obtinguts han estat utilitzats en els capítols següents per realitzar l'anàlisi de fluxos metabòlics. En el Capítol 3, es realitzaren experiments amb marcatge 13C fraccional biosintèticament dirigit (BDF). Els experiments es realitzaren en cultius operats en continu de P. pastoris creixent amb barreges de glucosa/metanol com a font de carboni, per tal d'obtenir informació sobre les relacions entre fluxos de les principals vies metabòliques del metabolisme central d'aquest llevat. Es desenvoluparen noves equacions pel cas de la mescla de font de carboni mixta glucosa/metanol utilitzada. Seguidament, aquestes relacions foren utilitzades per dur a terme l'anàlisi de fluxos metabòlics de les diferents soques de P. pastoris secretores d'una lipasa recombinant (les quals tenien 1 i 2 còpies del gen que codifica la lipasa). La principal característica obtinguda, reflectida en els diferents quocients de fluxos metabòlics i les dades macroscòpiques dels cultius, fou la similitud en les estimacions finals de fluxos entre les dues soques productores de lipasa. No obstant, s'observaren diferències estadísticament significatives al comparar ambdues soques amb la soca control de referència (no productora). Durant el Capítol 4, seguint la mateixa metodologia comentada en el capítol anterior, s'estudià l'efecte de la taxa de dilució i diferents relacions de barreges glicerina/metanol com a font de carboni en cultius en continu de P. pastoris amb una única còpia del gen de la lipasa . Concretament, es realitzaren cultius a dues velocitats de dilució per tal d'avaluar l'impacte combinat de la composició de les diferents mescles de fonts de carboni i velocitat de creixement sobre la distribució de fluxos intracel·lulars. Les dades experimentals obtingudes en aquest estudi es combinaren amb dades de marcatge 13C obtingudes en experiments previs sota les mateixes condicions. No obstant, com a conseqüència de la utilització de glicerina en lloc de glucosa, no fou possible la utilització de les equacions de flux formulades en el capítol anterior. Per tant, com a solució alternativa, s'implementà una metodologia basada en l'avaluació global de la xarxa metabòlica per tal de calcular la distribució de fluxos. Curiosament, no s'observaren diferències estadísticament significatives en la distribució de fluxos quan es compararen els diferents cultius amb diferent relació de glicerina/metanol realitzats sota la mateixa taxa de dilució. D'altra banda, si que s'observaren clares diferències en el moment de comparar els patrons de flux corresponents a diferents taxes de dilució. Les diferents anàlisis metabolòmiques es descriuen en els Capítols 4 i 5. En el Capítol 5, s'aplicà una anàlisi metabolòmica juntament amb una distribució de fluxos en condicions isotopomèriques no estables (condicions de marcatge 13C en dinàmic) per a caracteritzar el metabolisme central de carboni de la soca de referència (control) de P. pastoris creixement amb glucosa/metanol com a font de carboni mixta. Una nova metodologia basada en les dades de marcatge obtingudes mitjançant GC-MS i LC-MS ens va permetre una quantificació més precisa dels diferents fluxos metabòlics per a les vies de les pentoses fosfat, la glucòlisi i la via d'assimilació del metanol. Posant com a referència els resultats obtinguts en el capítol 3, aquesta nova metodologia permeté determinar una distribució de fluxos més amplia i acurada. Així mateix, es realitzà una anàlisi termodinàmica de les dades de metabolòmica , la qual ens va permetre validar les concentracions de metabòlits mesurades i les direccions dels fluxos calculades. Finalment, en el Capítol 6, es realitzà una comparació fluxòmica i metabolòmica entre les diferents soques utilitzades en aquesta tesi, a més a més d'una altra soca amb més de 2 còpies del gen de la lipasa disponible en el Grup de recerca. Els resultats obtinguts no mostraren diferències estadísticament significatives entre les diferents soques productores en termes de distribució global dels fluxos. Ara bé, s'observaren diferències locals estadísticament significatives en alguns punts de la xarxa metabòlica. A més, l'anàlisi metabolòmica, revelà diferències clares entre la soca control i la productora, com ara la concentració de trehalosa, metabòlit estretament lligat a respostes d'estrès. En general, durant aquesta tesi s'ha portat a terme amb èxit la implementació de noves metodologies per a l'anàlisi dels fluxos metabòlics de P. pastoris. Aquestes metodologies han estat comparades i posteriorment validades. A més a més, utilitzant les diferents dades metabolòmiques obtingudes, ens ha permès expandir la xarxa metabòlica proposada durant els primer capítols d'aquesta tesi, ampliant així el coneixement sobre l'impacte de producció d'una proteïna recombinant sobre el metabolisme central del carboni de P. pastoris creixent sobre fonts de carboni mixtes.

[en] Determination of metabolic fluxes constitutes a fundamental tool for quantitative analysis of cell physiology, as they provide a measure of the degree of engagement of various pathways in metabolic processes and overall cellular function. Accurate quantification of the magnitude of pathway fluxes in vivo is, therefore, an important goal of cell physiology and metabolic engineering, especially in the context of industrial biotechnology, where the aim is to convert as much substrate as possible into useful products such as chemicals, chemical building blocks, biopolymers or bioactive compounds such as proteins. This research project was aimed to contribute to the better understanding of the Pichia pastoris physiology under recombinant protein production stress. Specifically, this thesis was focused on the systematic analysis of cell metabolism at the fluxome and metabolome omics levels, and how datasets from these different levels can be integrated and contribute to the understanding of the impact of the potential burden imposed by the secretion of a recombinant protein and the type of mixed carbon source used. In Chapter 2, a consistent description of the biomass principal component of P. pastoris was obtained for each condition tested in this study, obtaining the best estimation of the biomass composition. The obtained results were afterwards used in the following chapters to perform the metabolic flux analysis. In Chapter 3, biosynthetically directed fractional 13C-labelling (BDF) experiments were performed in chemostat cultures of P. pastoris growing on a glucose/methanol mix, obtaining information about the principals metabolic flux ratios of the central carbon metabolism of this yeast. New equations were developed for the case of "glucose/methanol" as a mixed carbon source. Afterwards, these values were used to perform the metabolic flux analysis of two P. pastoris strains secreting different amounts of a recombinant lipase (corresponding to strains harbouring 1 and 2 copies of the lipase encoding gene). The most prominent feature obtained, already indicated by the metabolic flux ratios and the macroscopic data, was the similarity in flux estimations between the two lipase producing strains. Nevertheless, statistical differences were observed when comparing the control (non-producing) strain to the production strains. In Chapter 4, using the same experimental approach as in chapter 3, chemostat cultures of the P. pastoris strain harbouring one copy of the lipase gene growing on 3 different "glycerol/methanol" and 2 dilution rates were performed to evaluate the impact of carbon mix compositions and growth rate on the flux distribution. Experimental data was combined with existing 13C-labelling datasets obtained from previous BDF experiments performed on replica experiments. However, due to the use of glycerol instead of glucose, it was not possible to use the equations formulated in the previous chapter. Hence, an alternative approach based on the global evaluation of the metabolic network was done in order to calculate the final flux distribution. Interestingly, no statistical differences were observed when the experiments were done under a given dilution rate varying the glycerol-methanol concentrations. Nevertheless, clear differences were observed when comparing flux patterns corresponding to different dilutions rates. The metabolome analyses were performed in Chapters 4 and 5. In Chapter 5, metabolomic and instationary 13C flux analysis was applied to characterize the central carbon metabolism under "glucose/methanol" co-assimilating conditions, using the same reference control strain from Chapter 3. A new methodology based on GC-MS and LC-MS derived data allowed for an accurate mapping of metabolic fluxes for the glycolytic, pentose phosphate and methanol assimilation pathways. Compared with the results obtained in Chapter 3, more fluxes could be determined. Furthermore, using thermodynamic metabolic network analysis of metabolome data allowed validating metabolite measurements and metabolic flux directions. Finally in Chapter 6, a fluxome and metabolome comparison between the strains used in this thesis plus another strain harbouring five copies of the lipase gene was performed. The results showed no statistical differences between the tested strains in terms of global flux distribution, however we observe statistical differences in some fluxes of the metabolic network. Nevertheless, metabolome analysis, revealed some clear differences for example in the trehalose pool, as a result of the impact of protein secretion in the metabolite concentration pools. Overall, during this thesis we have succeeded in establishing new methodologies for the analysis of Pichia pastoris flows. These methodologies have been compared and validated. Moreover using the metabolomics data obtained has allowed us to expand the metabolic network proposed in the early chapters increasing the knowledge about the impact of a recombinant protein production using different carbon sources as a mixed substrates.