[en] Almond and pistachio nuts can be occasionally colonized with the fungal species Aspergillus flavus and A. parasiticus and, concomitantly, contaminated with aflatoxins, potent carcinogenic mycotoxins for humans. As reviewed in chapter I, the most effective pre-harvest management strategy for limiting aflatoxin contamination is the massive release of native atoxigenic strains of A. flavus for the competitive displacement (or competitive exclusion) of wild toxigenic isolates from the agroecosystem. Many farmers from the U.S.A., Africa, and Italy and diverse crop industries benefit from using this technology. Thereafter, in temperate and tropical regions, where the biocontrol strategy is still not implemented, the search for native atoxigenic A. flavus strains is a necessity. In California, for example, the US Environmental Protection Agency granted registration of the atoxigenic strain AF36 of A. flavus for use in pistachio and almond in 2012 and 2017, respectively. This strain is applied using sorghum grains as the AF36 spores carrier with the commercial name AF36 Prevail®. The use of AF36 Prevail® is a clear competitive advantage for U.S. farmers since commercial biocontrol agents to reduce aflatoxin contamination are not available in other nut-growing regions such as Australia, Spain, or Turkey. Although AF36 Prevail® was primarily developed for applying to row crops (e.g. maize, cotton), it has also been effective in limiting aflatoxin contamination in nut trees in California. Even so, AF36 Prevail® often fails in nut orchards because of differential characteristics between row and tree crops. Then, we evaluated (chapter II) the sporulation of the biocontrol strain AF36 in pistachio orchards and advised farmers to spread the AF36 Prevail® product in the moist soil area but avoid the site where the irrigation drops fall. Our study about the dynamics of A. flavus' spores suggested that AF36 Prevail® could be applied every two rows obtaining an overlapping effect on the non-treated row whether the distance between tree rows is ≤ 10 m. Furthermore, we detected that tree debris in the canopy act as an inoculum source for Aspergillus species included in section Nigri, ochratoxins producers, and biocontrol strategies may act parallelly to protect against both mycotoxins. It is essential to monitor how the atoxigenic AF36 strain survives and competes with aflatoxin-producing species populations in the target agroecosystem to understand how it can displace wild isolates of Aspergillus spp. Traditionally, biocontrol strains of A. flavus have been monitored through vegetative compatibility assays (VCA), but these are tedious and time-consuming. Thus, we tackled this concern by developing and validating a mismatch-qPCR assay to quantify the proportion of AF36 vs. toxigenic genotypes of A. flavus and A. parasiticus from diverse soil and plant samples. Our mismatch-qPCR efficiently quantifies AF36 proportions in the Aspergillus population. To overcome the disadvantages (loss of grains, poor sporulation, etcetera) of applying the strain AF36 using sorghum grains as carriers, we studied (chapter II) the pistachio male inflorescences as an inoculum source of atoxigenic strains. Male inflorescences are an abundant and free substrate, regularly distributed in the orchard. In our trials, the density of AF36 spores on the pistachio canopy of the inflorescence-treated trees was similar (P > 0.05) to this of Prevail®-treated trees. Furthermore, our results indicated that in pistachio orchards, where biocontrol practices are not conducted, eliminating this critical source of toxigenic Aspergillus inoculum is recommended. In chapter III, we characterized the resistance of various almond cultivars against A. flavus and A. parasiticus colonization and aflatoxin contamination. Remarkably, we found high variability in response to aflatoxin contamination of almond cultivars caused by both Aspergillus species. In addition, the shells were an insurmountable barrier to the pathogen, regardless of their type of shell (hard, semihard, or paper shell). However, natural-opening shells often occur in paper shell almond cultivars in the field. Our results also pointed out the importance of peach for introgressing resistance to the pathogen in almond breeding programs. Finally, we presented the possibility of combining both cultivar resistance and biocontrol, which offers a particularly promising aflatoxin control strategy. In a final chapter IV, we surveyed two leading Spanish almond- and pistachio-producing regions, Andalusia and Castilla La Mancha. In these surveys, we isolated 78 strains of Aspergillus section Flavi. Remarkably, four A. flavus were identified as atoxigenic (i.e., no-aflatoxin and no-cyclopiazonic acid producers) and, to our knowledge, this is the first report of atoxigenic strains of A. flavus native to Spain. Besides, six A. tamarii strains resulted, for the first time, described as slightly aflatoxigenic. With the work advocated in this Ph. D Thesis, we have contributed definitely to the optimized use of this biological control strain in Californian tree nut crops. In addition, we are closer to offering a safe product option to be used infield shortly by the Spanish almond and pistachio producers.

[es] Las almendras y los pistachos son colonizados ocasionalmente por las especies fúngicas Aspergillus flavus y A. parasiticus y, por consiguiente, pueden contaminarse con aflatoxinas, potentes micotoxinas cancerígenas para los humanos. En el capítulo I de la presente Tesis Doctoral, revisamos una de las estrategias de control más efectiva para limitar la contaminación por aflatoxinas en campo: la liberación masiva de cepas atoxigénicas (no productoras de micotoxinas) nativas de A. flavus para el desplazamiento competitivo (o exclusión competitiva) de los aislados toxigénicos del agroecosistema. Muchos agricultores de EE. UU., África e Italia tienen acceso comercial a este tipo de agentes de biocontrol. En cambio, en las regiones templadas y tropicales donde aún no se implementa esta estrategia de biocontrol es necesaria la búsqueda de cepas atoxigénicas de A. flavus. En California, la Agencia de Protección Ambiental (EPA) de EE. UU. otorgó el registro de la cepa atoxigénica AF36 de A. flavus para uso en pistachero y almendro en 2012 y 2017, respectivamente. La cepa AF36 se aplica en campo utilizando granos de sorgo recubiertos de esporas con el nombre comercial AF36 Prevail®. El uso de AF36 Prevail® supone una ventaja competitiva para los agricultores estadounidenses ya que, en otras regiones productoras de frutos secos, como Australia, España o Turquía, no hay agentes de control biológico comerciales disponibles. El producto AF36 Prevail® se desarrolló para su uso en cultivos extensivos (ej. maíz y algodón), aunque también se ha mostrado eficaz disminuyendo la contaminación por aflatoxinas en frutos secos. Aun así, el control biológico de aflatoxinas en frutos secos mediante el uso de AF36 Prevail® fracasa con frecuencia debido a características agronomicas propias de este tipo de cultivos arbóreos. En el capítulo II, por lo tanto, evaluamos la esporulación y dispersión del producto AF36 Prevail® en campos de pistachero y recomendamos a los agricultores aplicar el producto en el área de suelo irrigada por los microaspersores aunque, evitando la zona donde impactan las gotas del agua de riego ya que afecta negativamente a su esporulación. Según nuestro estudio sobre la dispersión de las esporas de A. flavus, las esporas de AF36 fácilmente alcanzan la copa de los pistacheros próximos al punto de aplicación aunque disminuye marcadamente con la distancia a la fuente de inóculo y la altura, ajustándose a distintas ecuaciones de difusión. Nuestros datos apuntan a que AF36 Prevail® podría aplicarse en filas alternas de pistacheros obteniéndose un efecto de protección (densidad de esporas por árbol) similar en el conjunto de los árboles si la distancia entre filas es ≤ 10 m. Además, detectamos que los restos de tejido que quedan en la copa de los pistacheros actúan como fuente de inóculo para las especies de Aspergillus de la sección Nigri, productores de ocratoxinas, por lo tanto, la estrategia de biocontrol puede actuar de forma paralela contra ambas micotoxinas. Para comprender cómo la cepa atoxigénica AF36 sobrevive, compite y desplaza a las cepas silvestres de Aspergillus spp. productoras de aflatoxinas, es esencial la monitorización en los campos donde ha sido liberada. Tradicionalmente, las cepas de A. flavus se han monitoreado mediante ensayos de compatibilidad vegetativa (VCA), pero son tediosos y requieren varias semanas para su ejecución. Por lo tanto, desarrollamos y validamos (capítulo II) un protocolo de qPCR basado en un Mismatch para cuantificar la proporción de AF36 frente a los genotipos toxigénicos de A. flavus y la población general de A. parasiticus. Nuestra qPCR-Mismatch cuantifica de manera eficiente las proporciones de AF36 respecto a la población de Aspergillus en el suelo y la planta. Debido a los problemas derivados de aplicar la cepa AF36 en granos de sorgo (pérdida de granos, mala esporulación, etcétera), estudiamos (capítulo II) la posibilidad de utilizar las inflorescencias masculinas de pistachero como fuente de inóculo para las cepas atoxigénicas. Las inflorescencias masculinas constituyen un sustrato abundante, gratuito, y que se distribuye regularmente en la plantación. En nuestros ensayos, la densidad de esporas de AF36 en la copa de los pistacheros con inflorescencias del suelo inoculadas con AF36 fue similar (P > 0.05) a la de los árboles tratados con AF36 Prevail®. Estos resultados apuntan indirectamente a que, en los campos de pistacheros donde no se llevan a cabo prácticas de biocontrol, es recomendable eliminar las inflorescencias masculinas en el suelo al constituir una importante fuente de inóculo. En el capítulo III, caracterizamos la resistencia de cultivares y selecciones avanzadas de almendro a la colonización por A. flavus y A. parasiticus y, la subsiguiente, contaminación por aflatoxinas. Sorprendentemente, encontramos una alta variabilidad en la resistencia/susceptibilidad de los genotipos de almendro a la colonización por ambas especies. Además, la cáscara (endocarpo) intacta resultó ser una barrera infranqueable para el patógeno, independientemente del tipo (dura, semidura o de papel). Sin embargo, las aperturas de la cáscara, que naturalmente pueden aparecer en cultivares de almendro de cáscara de papel, constituyen un punto de entrada para las esporas del patógeno. En este capítulo, además, destacamos la importancia del melocotonero para la introgresión de genes de resistencia al patógeno en los programas de mejora del almendro. Finalmente, presentamos la posibilidad de combinar tanto la resistencia del cultivar como el biocontrol, lo que ofrece una estrategia de control de aflatoxina particularmente prometedora. En un capítulo final (IV), caracterizamos la población de Aspergillus spp. en dos de las principales regiones españolas productoras de almendras y pistachos, Andalucía y Castilla La Mancha. Durante las prospecciones realizadas, aislamos 78 cepas de Aspergillus sección Flavi y seis cepas de A. tamarii que sorprendentemente fueron caracterizadas como ligeramente aflatoxigénicas. Cabe destacar, que identificamos cuatro cepas de A. flavus como atoxigénicas (es decir, no productoras de aflatoxinas ni ácido ciclopiazónico) lo que constituye la primera descripción de cepas atoxigénicas de A. flavus españolas. En la presente Tesis Doctoral, hemos contribuido notablemente a la optimización del control biológico de aflatoxinas en los cultivos de frutos secos de California. Además, estamos más cerca de ofrecer agentes de control biológicos para reducir la contaminación por aflatoxinas que puedan emplear los productores españoles.