[en] Tuberculosis (TB) is a highly infectious airborne disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb). An estimated 9.9 million people fell ill with TB in 2020 although only 5.8 million cases were diagnosed and reported. In addition, it is estimated that 1.5 million people died from TB in the same year. TB is treatable and curable. The standard treatment for active drug-susceptible TB (DS-TB) includes the use of four anti-TB drugs for six months. This regimen has a success rate of 85%. However, the inappropriate use of drugs for decades led to the emergence of bacterial strains resistant to one or more of these anti-TB drugs. The treatment of drug resistant forms of TB (MDR-TB) is more complex and with limited options. It includes the use of second-line anti-TB drugs, which are associated with severe side effects and longer times (treatment can be extended up to two years). Moreover, patients might not have alternative treatment options if TB is caused by bacteria that do not respond to the most effective second-line TB drugs; this is known as extensively drug resistant (XDR-TB). The increase of drug resistant strains together with the limited protective efficacy of the available BCG vaccine against pulmonary TB, make Mtb one of the most infectious killers in the world. Therefore, shorter, safer, and simpler regimens to combat drug susceptible and drug resistant TB are urgently needed. Over the last decade, the discovery of new anti-TB drugs has increased the clinical pipeline. As of December 2021, there were 23 drugs and various combination regimens in clinical trials. Such as the study that aims to reduce the standard treatment for DS-TB to four months using rifapentine and moxifloxacin instead rifampicin and ethambutol. Or, for instance, the combination of bedaquiline-pretomanid-linezolid administered for six months that was recently approved for operational research against XDR-TB. Despite these advances, there is a lack of understanding on how to properly combine new compounds into optimal TB regimens. An initial step to this aim is in vitro combination assays. However, such combination studies for old and new drugs against Mtb is a nascent field. It is thus key to develop new methodologies to provide high quality data able to feed the rational design of future anti-TB regimens. This Thesis is divided into three chapters, which contain their own introduction with specific concepts, as well as a final discussion of the results generated in them. Chapter 1 deals with methodology development. 1. We first performed an in-depth study of currently available in vitro methodologies to evaluate drug combinations against Mtb. We includedstandard techniques as well as the recently published DiaMOND method. The main limitations were: (i) their basis on growth inhibition, which very often does not correlate with killing ability; (ii) their single-point measurements, which leads to a loss of valuable information as the different combinations show their maximum effect at different times, or (iii) their low throughput, which significantly limits the capability of exploring new drug interactions. 2. In the second part of this chapter, we developed a new in vitro methodology applied to the study of drug combinations against Mtb. This methodology, named OPTIKA (Optimized Time Kill Assays), overcomes current limitations of standard techniques such as the need of primary checkerboard assays based on growth inhibition to select favourable pair-wise combinations and the confirmation by technically cumbersome and low-throughput CFU-based time kill assays. In addition to the enhanced throughput of OPTIKA comparing with standard methods, its main advantage is that it allows to interrogate hundreds of combinations of n drugs and select favourable interactions based on killing activity in a unique assay. In Chapter 2, we applied OPTIKA to study ß-lactam containing drug combinations against Mtb. We focused our study on these drugs because it is a large family of antibiotics with exceptional records of clinical safety in humans and there has been a recently growing interest on them in the TB field. We chose two sub-families of ß-lactams (i.e. carbapenems and cephalosporins) to perform our in vitro combination screenings based on bacterial killing. We screened ß-lactams: (i) in combination with a panel of commercially available drugs creating combinations up to three drugs, and (ii) in combinations of up to five drugs from a set of drugs recently recommended by the World Health Organization (WHO) treat drug-resistant forms of TB. After these screenings, we robustly identified a clear favourable contribution of the ß-lactams at initial times of the experiments. In addition, we found some favourable and non-favourable partners in high-order drug combinations containing ß-lactams. In Chapter 3, the study of ß-lactam contribution to favourable drug combinations was done from a mechanistic perspective. There, we focused our work on pair-wise drug combinations containing rifampicin and cell wall inhibitors, such as ß-lactams and the first-line anti-TB drug ethambutol. Through transcriptomics, we found that bacteria treated with multiple drugs were not able to mount the adaptative and protective responses that were observed when they were exposed to single drugs.

[es] La tuberculosis es una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis. Es una enfermedad de transmisión aérea y altamente contagiosa. Se estima que 9.9 millones de personas enfermaron de tuberculosis en 2020 aunque solamente 5.8 millones de casos fueron diagnosticados y notificados. Además, se calcula que 1.5 millones de personas murieron de tuberculosis en ese mismo año. Hoy en día, la tuberculosis es una enfermedad tratable y curable. El tratamiento estándar para las formas de tuberculosis activa sensibles a fármacos consiste en el uso de cuatro antibióticos durante seis meses. La tasa de éxito de este tratamiento es de un 85%. Sin embargo, el uso incorrecto de estos fármacos a lo largo de los años condujo a la generación de resistencias y, por tanto, a la existencia de cepas bacterianas resistentes a uno o más de estos fármacos antituberculosos. El tratamiento de las formas de tuberculosis resistentes a fármacos es más complejo y con opciones limitadas. En estos casos, hay que recurrir al uso de fármacos antituberculosos de segunda línea, los cuales se asocian a efectos secundarios graves y necesitan ser administrados durante periodos de tiempo más largos (el tratamiento puede prolongarse hasta dos años). Además, los pacientes pueden no tener opciones de tratamiento alternativas si la tuberculosis está causada por bacterias que no responden a los fármacos antituberculosos de segunda línea más eficaces; es lo que se conoce como tuberculosis extremadamente resistente. El aumento de cepas resistentes a fármacos, junto con la limitada eficacia protectora de BCG, la vacuna disponible contra la tuberculosis pulmonar, hacen de M. tuberculosis uno de los agentes infecciosos más mortales a nivel mundial. Por lo tanto, se necesitan urgentemente tratamientos más cortos, más seguros, más simples y más eficaces frente a formas sensibles y resistentes de tuberculosis. Durante la última década, el descubrimiento de nuevos compuestos con actividad antituberculosa ha aumentado significativamente la lista de posibles fármacos en desarrollo clínico. A fecha de diciembre de 2021, se estaban evaluando 23 compuestos y varios regímenes de combinaciones en ensayos clínicos, con el objetivo de optimizar el uso de los fármacos recientemente descubiertos. Por ejemplo, el estudio que pretende reducir el tratamiento estándar de formas de tuberculosis sensibles a fármacos a cuatro meses mediante el uso de rifapentina y moxifloxacina en lugar de rifampicina y etambutol. O la combinación de bedaquilina, pretomanid y linezolid administrada durante seis meses que ha sido aprobada recientemente para ser utilizada en el marco de actividades de investigación operativa contra formas de tuberculosis extremadamente resistentes a fármacos. A pesar de estos avances, no se sabe cómo combinar adecuadamente los nuevos compuestos en regímenes óptimos contra la tuberculosis. Un primer paso para ello son los ensayos de combinación in vitro. Sin embargo, este tipo de estudios de combinación de fármacos antiguos y nuevos contra la tuberculosis es un campo incipiente. Por lo tanto, es fundamental desarrollar nuevas metodologías que proporcionen datos de alta calidad capaces de alimentar el diseño racional de futuros regímenes antituberculosos. Esta tesis se divide en tres capítulos principales. Cada uno de los cuales contiene su propia introducción con conceptos específicos así como una discusión final de los resultados presentados en ellos. El Capítulo 1 trata del desarrollo de metodología. 1. Primero realizamos un estudio en profundidad de las metodologías in vitro actualmente disponibles para evaluar combinaciones de fármacos contra M. tuberculosis. Incluimos tanto técnicas tradicionales como el método DiaMOND, recientemente publicado. Como principales limitaciones hemos encontrado: (i) su base en la inhibición del crecimiento, que muy a menudo no se correlaciona con la capacidad de matar, (ii) sus mediciones en un solo punto, lo que conlleva una pérdida de información muy valiosa ya que las distintas combinaciones presentan su máximo efecto a distintos tiempos, o (iii) su baja capacidad, que limita significativamente la capacidad de explorar nuevas interacciones farmacológicas. 2. En la segunda parte de este capítulo, desarrollamos una nueva metodología aplicada al estudio in vitro de combinaciones de fármacos frente a tuberculosis. Esta metodología, denominada OPTIKA, supera las limitaciones de las técnicas actuales, como la necesidad de realizar ensayos primarios basados en inhibición de crecimiento para seleccionar las combinaciones favorables y la posterior confirmación de estas interacciones mediante las tradicionales curvas de muerte basadas en contaje de colonias viables, experimentos técnicamente engorrosos y de baja capacidad. Además de la mayor capacidad de OPTIKA en comparación con los métodos tradicionales, su principal ventaja es que permite ensayar cientos de combinaciones de n fármacos y seleccionar las interacciones favorables basándose en muerte celular y en un único ensayo En el Capítulo 2, aplicamos OPTIKA para llevar a cabo un estudio de las interacciones farmacológicas de combinaciones que contienen β-lactámicos frente a M. tuberculosis. Centramos nuestro estudio en los β-lactámicos porque se trata de una gran familia de antibióticos con registros excepcionales de seguridad clínica en humanos. Además, recientemente ha habido un creciente interés en esta familia de fármacos en el campo de la tuberculosis. Elegimos dos subfamilias de β-lactámicos (carbapenems y cefalosporinas) para llevar a cabo nuestros cribados in vitro de combinación basados en muerte celular. Hemos examinado los β-lactámicos: (i) en combinación con un panel de fármacos disponibles en el mercado creando combinaciones de hasta tres fármacos, y (ii) en combinaciones de hasta cinco fármacos de un conjunto de fármacos recientemente recomendados por la organización mundial de la salud para tratar las formas de tuberculosis resistentes. Tras estos cribados, identificamos de forma robusta una clara contribución favorable de los β-lactámicos en los momentos iniciales de los experimentos. Además, encontramos contribuciones favorables y no favorables de determinados fármacos en combinaciones de más de tres compuestos que contienen β- lactámicos. En el Capítulo 3, el estudio de la contribución de los β-lactámicos a las combinaciones favorables de fármacos se realiza desde una perspectiva mecanicista. En él, centramos nuestro trabajo en combinaciones de parejas de compuestos que contienen rifampicina e inhibidores de la pared celular como los β-lactámicos y el fármaco antituberculoso de primera línea etambutol. A través de la transcriptómica, descubrimos que las bacterias tratadas con múltiples fármacos no eran capaces de generar la respuesta adaptativa y protectora que se observa cuando se exponen a fármacos únicos.