[ca] La Mucopolisacaridosi tipus IIIB (MPSIIIB) és una malaltia minoritària d'acumulació lisosòmica, d'herència autosòmica recessiva, causada per la deficiència de l'enzim α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU), implicat en la via de degradació del glicosaminoglicà (GAG) Heparan Sulfat (HS). Aquesta pèrdua d'activitat comporta una acumulació progressiva de HS intralisosòmic que finalment dóna lloc a la disfunció i mort cel·lular. La MPSIIIB és principalment una malaltia neurodegenerativa amb una lleu afectació somàtica, en comparació amb d'altres malalties d'acumulació lisosòmica. Després d'un primer període asimptomàtic durant els primers mesos de vida, la malaltia es caracteritza per una fase inicial entre el primer i quart any de vida amb alentiment del desenvolupament mental. Aquesta fase és seguida per l'aparició de problemes de comportament severs conjuntament amb un deteriorament intel·lectual que s'inicia al voltant del tercer o quart any de vida. Finalment, amb l'aparició de demència severa, els problemes de comportament comencen a desaparèixer i les funcions motores inicien un alentiment progressiu, que finalment resulta en una pèrdua total de locomoció, disfàgia i lesions en el sistema piramidal. La mort se sol produir entre la segona i tercera dècada de vida, tot i que formes més lleus de la malaltia presenten una evolució més lenta amb esperances de vida més llargues. Actualment no hi ha cap tractament específic ni efectiu per la MPSIIIB. Totes les teràpies i tractaments actuals estan basats en el control simptomàtic i en la millora de la qualitat de vida dels pacients i de l'entorn familiar. Per aquesta raó, i degut a l'absència de teràpies eficaces, es fa necessari el desenvolupament de noves estratègies terapèutiques per al tractament de la malaltia. La teràpia gènica in vivo basada en l'administració de vectors virals derivats dels virus adenoassociats (AAV) ofereix una alternativa atractiva per al tractament de malalties minoritàries d'origen genètic com la MPSIIIB. D'una banda, les estratègies de teràpia gènica basades en vectors virals AAV han mostrat resultats prometedors com a eina per a la transferència gènica in vivo. D'altra banda, aquestes estratègies també han mostrat expressió a llarg termini en models animals de malalties així com també en pacients afectats de malalties genètiques després d'una única administració del vector. Per tant, i degut a la seva baixa immunogenicitat, a la seva expressió a llarg termini i al fet que poden transduir cèl·lules quiescents, els vectors virals AAV es presenten com a bons candidats per al tractament de malalties genètiques amb afectació del Sistema Nerviós Central (SNC). Entre tots els vectors AAV identificats i caracteritzats, aquells derivats del serotip 9 (AAV9) es caracteritzen per presentar un ampli tropisme. L'administració d'aquest serotip directament al Líquid Cefaloraquidi (LCR) ha demostrat ser eficaç en transduir diferents tipus cel·lulars del SNC juntament amb una àmplia distribució. A més, part del vector administrat al LCR pot passar a circulació sanguínia i transduir el fetge, entre d'altres teixits, donant lloc a l'expressió del transgèn no només al SNC, sinó que també a nivell somàtic. Per tant, en la present tesi doctoral s'ha desenvolupat una estratègia de teràpia gènica centrada en l'administració al LCR d'un AAV9 codificant per la proteïna NAGLU murina (AAV9-mNAGLU), amb la finalitat de tractar la patologia neurològica i somàtica característiques de la MPSIIIB. Una única administració del vector viral AAV9-mNAGLU a la cisterna magna de ratolins models de la MPSIIIB, va donar lloc a una àmplia transducció del SNC i del fetge, que alhora es va traduir en un augment en els nivells d'activitat NAGLU en aquest òrgans i en la correcció de la patologia neuronal i somàtica. A nivell del SNC, l'augment d'activitat enzimàtica NAGLU en els ratolins MPSIIIB tractats va donar lloc a la normalització del contingut de GAGs del cervell. També es van corregir els signes de neuroinflamació característics d'aquest model animal, amb la desaparició de l'astrocitosi i la microgliosi al cervell dels ratolins MPSIIIB tractats. També es va dur a terme un estudi d'expressió gènica del cervell, el qual va permetre observar una desregulació en l'expressió gènica de gens implicats en la immunitat innata, l'estrès oxidatiu i la funció lisosòmica, entre d'altres, al cervell dels ratolins MPSIIIB no tractats. El tractament amb AAV9-mNAGLU va donar lloc a la normalització de l'expressió de la majoria dels gens diferencialment expressats, fent similars els perfils d'expressió gènica entre ratolins MPSIIIB tractats i ratolins control sans (ratolins WT). Aquests resultats van proporcionar una prova més de l'eficàcia terapèutica d'aquesta aproximació de teràpia gènica. A nivell somàtic, l'enzim NAGLU produït al fetge de ratolins MPSIIIB tractats va donar lloc a un augment de l'activitat NAGLU circulant, fent accessible l'enzim a la resta d'òrgans i teixits somàtics. Alhora, aquest augment d'activitat NAGLU circulant va permetre la normalització del contingut en GAGs de la majoria d'òrgans i teixits analitzats. A banda d'aquest efecte, el tractament amb el vector viral AAV9-mNAGLU també va comportar una normalització de les alteracions de comportament característiques de la malaltia així com també un augment significatiu de la supervivència dels ratolins MPSIIIB tractats d'ambdós sexes. Demostrada l'eficàcia del tractament en ratolins MPSIIIB, es va avaluar la translacionabilitat de l'aproximació terapèutica en models animals més grans. Gossos Beagle adults van ser utilitzats per a aquesta finalitat, ja que la mida del cervell d'aquests és molt similar a la mida dels pacients humans en edat pediàtrica a qui aniria destinada una possible teràpia. Es va administrar el vector viral AAV9 codificant per la proteïna NAGLU canina (AAV9-cNAGLU) al LCR de 4 gossos sans, de tal manera que es va poder observar una producció i secreció elevada i estable de l'enzim NAGLU actiu al LCR, sense signes de toxicitat associada. Un percentatge elevat de la població humana és seropositiva per anticossos neutralitzants (NAbs) contra la càpsida proteica dels vectors virals AAV9. La presència de NAbs circulants podria suposar l'eliminació del vector viral de la circulació sanguínia abans de transduir cap tipus cel·lular, limitant així l'eficàcia terapèutica del tractament proposat. Degut a aquest fet, també es va utilitzar el model caní per tal d'avaluar l'efecte de la immunitat preexistent sobre els nivells d'activitat NAGLU mesurats al LCR. Els resultats van mostrar com després de l'administració intracisterna del vector AAV9-cNAGLU, els nivells d'activitat en LCR es mantenien elevats i constants a llarg termini independentment de la presència d'elevats títols circulants de NAbs. Conjuntament, els resultats van mostrar l'eficàcia terapèutica de l'administració al LCR de vectors AAV9 codificants per la proteïna NAGLU i la translacionabilitat d'aquesta aproximació cap a models animals de major mida, així com també la persistència d'activitat al LCR independentment de la presència de NAbs circulants contra la càpsida del vector viral. Per tant, l'aproximació de teràpia gènica descrita en aquest treball pot esdevenir un possible tractament, no només per a la MPSIIIB, sinó que també per a altres malalties d'acumulació lisosòmica amb afectació del SNC.

[en] Mucopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) is a rare Lysosomal Storage Disease (LSD) caused by the lack of the α-N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity, an enzyme involved in the stepwise degradation of the Glycosaminoglycan (GAG) Heparan Sulfate (HS). This leads to a pathological accumulation of HS in the lysosomes of cells that ultimately results in cell dysfunction and/or death. MPSIIIB is mainly a neurodegenerative disease, and has a mild somatic involvement compared with other LSDs. After an initial asymptomatic period during the first few months of life, the disease manifests between the first and fourth year with slowing of mental development. This is followed by severe behavioral problems along with intellectual impairment during the second phase, which starts around the third or fourth year of life. Finally, with the onset of severe dementia, behavioral alterations begin to disappear and a progressive impairment of motor functions starts, which ultimately results in a total loss of locomotion, dysphagia and pyramidal system lesions. Death usually occurs between the second and third decades of life, although milder forms of the disease with slower progression and longer life expectancies have been described. There is currently no effective treatment for MPSIIIB. All available therapies and treatments are symptomatic and aimed at improving the quality of life of patients and their families. For this reason, it is necessary to develop new therapeutic strategies for this disease. In this regard, in vivo gene therapy based on the administration of adeno-associated viral vectors (AAV) offers an attractive alternative for the treatment of rare genetic diseases such as MPSIIIB. On the one hand, strategies based on AAV gene therapy have shown promising results as a tool for gene transfer in vivo. On the other hand, these strategies have showed long term expression in animal models as well as in patients affected of genetic diseases after a single vector administration. In addition, and due to their low immunogenicity, their long-term expression and their ability to transduce different cell types in the brain, AAV vectors are good candidates for the treatment of genetic diseases with CNS involvement. Among all the AAV serotypes described and characterized so far, those derived from serotype 9 (AAV9) show a broad tropism. Administration of AAV9 directly to the cerebrospinal fluid (CSF) results in transduction of different cell types in the CNS with a widespread distribution. Moreover, after its passage through the CNS, part of the vector reaches the bloodstream, resulting in transduction of the liver and other somatic tissues, allowing transgene expression not only in the CNS but also in the periphery. Therefore, the aim of the present Doctoral Thesis was to develop a therapeutic strategy based on the intra-CSF delivery of an AAV9 vector coding for murine NAGLU (mNAGLU) to treat both CNS and somatic MPSIIIB pathology. A single intra-CSF administration of AAV9-mNAGLU viral vector to MPSIIIB male and female mice resulted in a broad transduction of CNS and liver which led to an increase of NAGLU activity above normal levels in those organs and correction of neurologic and somatic pathology. At a CNS level, the restoration of NAGLU activity in MPSIIIB-treated mice lead to normalization of the content of GAGs in the brain. AAV9-mNAGLU administration also completely corrected all signs of neuroinflamation characteristic of this animal model, with disappearance of astrocytosis and microgliosis in MPSIIIB-treated mice. Moreover, the AAV9 treatment also normalized brain lisosomal homeostasis as reflected by the normalization of the activities of other lisosomal enzymes. Gene expression analysis were performed on whole brain and revealed a dysregulation of gene expression of genes related to innate immunity, lisosomal functions and oxidative stress in untreated MPSIIIB. Interestingly, a representative group of up-regulated genes (~50%) were related to microglia, indicating the critical role of this cellular type in the development of the disease. Treatment with AAV9-mNAGLU normalized gene expression of the majority of these deregulated genes, so that the expression profile of AAV9-treated MPSIIIB mice resembled that of healthy WT littermates, providing further evidence of the therapeutic efficacy of the approach. At a somatic level, the NAGLU enzyme produced by the liver led to increased NAGLU circulating activity, making the enzyme available for all the affected organs and tissues. This led to the normalization of GAG content in most of the somatic organs and tissues analyzed. Intra-CSF AAV9-mNAGLU administration also normalized typical behavioral deficits observed in MPSIIIB untreated mice and increased survival both in males and females. Once the efficacy of the AAV9 treatment was demonstrated in the mouse model, we evaluated the feasibility of the approach in a larger animal model. Healthy adult Beagle dogs were used for this purpose, since the brain of dogs is closer in size to that of the human pediatric patients who are the target of this therapy. A high and stable production and secretion of active NAGLU was documented in the CSF of dogs that received an intracisternal administration of AAV9 vectors coding for the canine NAGLU, in the absence of any signs of toxicity. In addition, due to the fact that a high percentage of the human population is seropositive for neutralizing antibodies (NAbs) against the AAV9 capsid proteins, which could potentially limit the efficacy of the treatment by clearing the vector from the circulation before it enters any cell, we also evaluated the effect of pre-existing immunity on the levels of NAGLU activity measured in the CSF. The results showed that the levels of enzymatic activity achieved in the CSF were the same regardless of the presence of high NAbs titers in serum prior to the treatment. Together, these results demonstrate the efficacy of intra-CSF AAV9-mNAGLU delivery in correcting MPSIIIB disease and the scalability of the approach to larger animal models, as well as the lack of effect of pre-exiting immunity on CNS efficacy when the vector is delivered directly to the CSF. Thus, the therapeutic approach described herein may become a possible treatment not only for MPSIIIB, but also for other LSDs with CNS involvement.