[ca] La importància de les noves tecnologies de producció de vacunes s'ha convertit recentment en un assumpte de gran rellevància a causa de l'aparició de la pandèmia COVID-19. No obstant això, el desenvolupament de les tecnologies de producció de vacunes com a mesura per a combatre les malalties infeccioses mai ha cessat. La recerca en el camp de les tecnologies de producció de vacunes està altament relacionada amb la recerca en enginyeria de bioprocessos. Aquesta tesi doctoral se centra en l'estudi del bioprocés per a produir partícules semblants a virus (VLPs) del virus de la immunodeficiència humana (VIH) basades en la poliproteïna Gag del mateix virus, usant cèl·lules HEK293 i transfecció transitòria com a plataforma productora. Aquestes VLPs són nanoestructures no infeccioses envoltades de membrana cel·lular la conformació de la qual s'assembla a la del virus natiu del VIH, però sense el seu material genètic. Posteriorment, la membrana que les envolta es pot modificar, afegint antígens d'altres malalties per a estimular el sistema immune i usar-les com a potencials vacunes. Per a poder optimitzar la producció de VLPs, és necessari l'estudi de múltiples factors, que van des de rutes metabòliques a nivell cel·lular fins al disseny de les condicions i paràmetres d'operació a escala de bioreactor. En el treball que es presenta en aquesta tesi doctoral, aquest repte pot dividir-se en tres parts principals. La primera part, presentada en els Capítols ú i dos, se centra en l'optimització del procés de producció de VLPs a nivell cel·lular, mitjançant proteòmica i enginyeria metabòlica. Aquí, els efectes de la transfecció transitòria i la producció de VLPs ha estat estudiada a nivell molecular usant proteòmica quantitativa per a identificar colls d'ampolla en el metabolisme influenciant la producció de VLPs. Una vegada identificats, s'han aplicat estratègies d'enginyeria metabòlica usant disseny d'experiments (DoE) per a optimitzar la transfecció i el procés de generació de partícules. La segona part, presentada en el Capítol tres, se centra en la intensificació i optimització de la producció de VLPs a nivell de bioreactor, establint un procés en perfusió. Per a això s'ha estudiat el medi de cultiu, els agents per a formar els complexos de DNA i les condicions de cultiu en el bioreactor. A més, usant estratègies com el DoE s'han optimitzat paràmetres operacionals com el recanvi específic de medi per cèl·lula (CSPR), la quantitat de DNA usada per a transfectar i els temps de retransfecció. Així mateix, s'han provat diferents equips de retenció cel·lular per a arribar a implementar un sistema de perfusió en continu. La tercera i última part, que comprèn els Capítols quatre, cinc i sis, se centra en la caracterització del producte, dirigida a dissenyar un procés de purificació eficient. Per a establir un mètode analític que determini l'estequiometria de la proteïna Gag en les VLPs produïdes en diferents tipus cel·lulars, s'ha usat la tècnica parallel reaction monitoring (PRM), contribuint a la millora de futurs mètodes de control de qualitat i analítics (PAT) per a un futur bioprocés a gran escala. A més, la vesícules extracelul·lars (EVs) que es coprodueixen amb les VLPs han estat estudiades mitjançant proteòmica quantitativa per a entendre la seva naturalesa ja que són les principals impureses de les preparacions de VLPs. D'igual forma s'ha caracteritzat el perfil de glicosilacions de les VLPs i les EVs per a ampliar el coneixement que i permetre dissenyar un procés de purificació específic per a VLPs. Els resultats que aquí es presenten contribueixen al desenvolupament d'una prometedora plataforma per a la producció de vacunes basades en VLPs de Gag i aplanen el camí per a l'avanç i l'evolució del camp de la producció de vacunes.

[en] The importance of vaccine technology has recently become a matter of high interest due to the outbreak of the COVID-19 pandemic. However, the development of vaccine technology against infectious diseases throughout history has never stopped. It has influenced the way the population interacts and the establishment of social rules. The research in the field of vaccine technology is deeply tied to the research in bioprocess engineering, as in a globalized world, an effective vaccine is the one that can be produced at large scale, reaching as many people as possible through efficient vaccination policies. This PhD thesis is focused on the study of the bioprocess for the production of human immunodeficiency virus (HIV-1) virus- like particles (VLPs) based on the HIV-1 polyprotein Gag using HEK293 cells and transient transfection. These VLPs are non-infectious membrane-bound nanostructures whose conformation resembles the native HIV-1 virus albeit lacking the viral genetic material. In order to use these particles as potential vaccines, they can be later modified presenting exogenous antigens in their membrane to elicit an immune response against different diseases. In order to optimize VLP production, multiple aspects of the bioprocess must be studied, from molecular factors like cellular pathways to the modulation of operational parameters at bioreactor scale. In this work, this undertaken challenge can be divided in three main parts. The first part, comprising chapters one and two, focused on the optimization of the VLP production process at cellular level through proteomics and metabolic engineering. Here, the effects of transient transfection and production of VLPs was studied at molecular level using multiplexed quantitative proteomics to identify metabolic bottlenecks influencing VLP production. Once these pathways were identified, metabolic engineering and design of experiments (DoE) approaches were applied to optimize transfection, cell budding efficiency and VLP production. The second part, comprising chapter three, focused on the intensification and optimization of VLP production at bioreactor level, implementing a perfusion-based bioprocess. The culture media used, the DNA complexation agent and culture conditions in the bioreactor were studied. Also, operational parameters like the cell specific perfusion rate (CSPR), the amount of DNA used for transfection and the time of retransfection were also optimized using a DoE approach. Moreover, different cell retention devices were tested to work towards the implementation of a continuous harvest mode of operation. The third and last part, comprising chapters four, five and six, focused on the characterization of the product aiming to design an efficient downstream process. Parallel reaction monitoring (PRM) was used to establish a method of determining Gag stoichiometry in the VLPs for different production platforms, paving the way for improvements in quality control and process analytics technologies (PAT) in a future large scale bioprocess. Moreover, the coproduced extracellular vesicles (EVs) were studied through multiplexed quantitative proteomics to better understand the nature of the main source of impurities in a VLP preparation. Additionally, EV and VLP glycosylations were analyzed, to characterize the two nanostructures glycosylation signature and help gain some insight towards the design of a specific separation method for VLP purification. The results hereby presented contribute to the development of a promising vaccine platform based on Gag VLPs and pave the way towards the advance and evolution of vaccine manufacturing.