[en] Intravesical instillations of Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) is the preferred treatment in patients with non-muscle-invasive bladder cancer (NMIBC) after tumour resection. M. bovis BCG has demonstrated efficacy in reducing the recurrence and tumor progression due to the activation of the patient immune system, which enhances the survival rate of individuals with NMIBC. However, intravesical treatment with this immunotherapeutic agent is associated with adverse events in more than 50% of treated patients, being able to develop serious complications in 5% of cases, including lung or disseminated M. bovis BCG infections. Furthermore, up to 30-40% of patients do not respond to M. bovis BCG therapy and, consequently, they have to finish the treatment. One of the alternatives proposed to replace the M. bovis BCG treatment is the use of Mycobacterium brumae, an environmental non-pathogenic mycobacterium with an antitumor and immunomodulatory effect demonstrated in vitro, ex vivo and in vivo in a murine model of bladder cancer. With the aim of developing new therapeutic alternatives that are effective for all patients, the objective of this thesis is to decipher into the phenotypic characteristics and genotypes of different strains of M. brumae and compare them with M. bovis BCG; to evaluate their interaction with different tumour cells; to study the immunemodulatory effect of both mycobacteria in the specific context of older people; and to characterize its potential ability to induce trained immunity. Initially, the genome of the reference strain and three environmental isolates of M. brumae were sequenced and analysed. The comparison with the genome of M. bovis BCG and M. tuberculosis demonstrated the non-pathogenicity of M. brumae, as well as the presence of genes involved in the activation of the host immune system demonstrating its immunogenicity. No differences were observed at the phenotypic level of the different strains of M. brumae and very few at the genotypic level. However, it was observed that the CR-103 strain could inhibit some tumour cell proliferation more efficiently. Besides, the CR-142 strain induced an increase in cytokine production in infected macrophages, compared with the rest of the strains. The ability of M. brumae to inhibit the tumour proliferation was demonstrated in tumour cell lines from locations other than the bladder, such as colon, liver, or pancreas. On the other hand, the ability of M. brumae and M. bovis BCG to activate the immune system from young and old healthy populations, as well as from patients with bladder neoplasia was evaluated. Using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) a significant difference between the evaluated populations in terms of triggering the production of proinflammatory cytokines and the antitumor capacity of the activated PBMCs. Finally, the capacity of M. brumae to induce trained immunity, compared to M. bovis BCG, was evaluated in different in vitro and ex vivo cultures using an in vitro model with THP-1 human monocytes and PBMC-derived monocytes, respectively. The results indicated that the initial stimulation of monocytes with M. brumae followed by a secondary non-specific stimulus induce an elevated production of IL-1[Beta], IL-6, and TNF-[Alfa], and an enhanced lactate production. This indicates a change in the metabolic profile of the cells and shows the potential of M. brumae to induce trained immunity.

[es] La instilación por vía intravesical de Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) es el tratamiento de elección en pacientes con cáncer de vejiga no músculo-invasivo (CVNMI) tras la resección del tumor. M. bovis BCG presenta una eficacia demostrada disminuyendo la recurrencia y la progresión tumoral gracias a la activación del sistema inmune del paciente, lo cual mejora la tasa de supervivencia de los individuos con CVNMI. Sin embargo, el tratamiento intravesical con este agente inmunoterapéutico se asocia a efectos adversos en más del 50% de los pacientes tratados, pudiendo desarrollar complicaciones graves en un 5% de casos, incluyendo infecciones pulmonares o diseminadas. Además, hasta un 30-40% de los pacientes no responden favorablemente a la terapia con M. bovis BCG, por lo que se ven obligados a interrumpir el tratamiento. Una de las alternativas propuestas para sustituir el tratamiento con M. bovis BCG es el uso de Mycobacterium brumae, una micobacteria ambiental no patógena con un efecto antitumoral e inmunomodulador demostrado tanto in vitro, como ex vivo e in vivo en modelo murino de cáncer vesical. Con el objetivo de desarrollar nuevas alternativas terapéuticas que sean eficaces para todos los pacientes, el objetivo de esta tesis es profundizar en las características fenotípicas y genotípicas de diferentes cepas de M. brumae y compararlas con M. bovis BCG; evaluar su interacción con diversos tipos de células tumorales; estudiar el efecto inmunomodulador de ambas micobacterias en el contexto específico de personas mayores; y caracterizar su potencial capacidad de inducir inmunidad entrenada. Inicialmente se secuenció y analizó el genoma de la cepa de referencia de M. brumae y de tres aislados ambientales de M. brumae. La comparación con el genoma de M. bovis y M. tuberculosis demostró la no patogenicidad de M. brumae, así como la presencia de genes involucrados en la activación del sistema inmune del huésped demostrando su inmunogenicidad. No se observaron diferencias a nivel fenotípico de las diferentes cepas de M. brumae y muy pocas a nivel genotípico. Sin embargo, se observó que la cepa CR-103 era capaz de inhibir la proliferación tumoral de una forma más eficaz en algunas líneas tumorales y que la cepa CR-142 inducía una mayor producción de citocinas en macrófagos infectados, comparando con el resto de las cepas de M. brumae. Se demostró la capacidad de inhibir la proliferación tumoral de M. brumae en líneas tumorales de localizaciones diferentes a vejiga, como colon, hígado o páncreas. Por otro lado, se estudió la capacidad de activar el sistema inmune por parte de M. brumae y M. bovis BCG en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos sanos jóvenes y mayores, así como de pacientes con neoplasia vesical, obteniendo una diferencia significativa entre las poblaciones evaluadas en cuando a la inducción de la producción de citocinas proinflamatorias y la capacidad antitumoral de las PBMC estimuladas. Finalmente, se evaluó si M. brumae era capaz de inducir inmunidad entrenada como M. bovis BCG en diferentes cultivos in vitro y ex vivo, utilizando un modelo in vitro con monocitos humanos THP-1 y monocitos derivados de PBMC, respectivamente. Los resultados indicaron que la estimulación inicial de monocitos con M. brumae era capaz de inducir un incremento en la producción de IL-6, TNF-[Alfa] e IL-1[Beta], así como un incremento en la producción de lactato tras un estímulo secundario inespecífico, indicando un cambio en el perfil metabólico y revelando el potencial de M. brumae para inducir inmunidad entrenada.