[en] Ex situ reproduction is one of the measures recognized by the scientific and conservationist community for the conservation of threatened species and their reintroduction into the natural environment. However, captive breeding of endangered bird species often fails due to the absence of environmental stimuli associated with life in captivity. This circumstance prevents the development of physiological reproductive cycles in natural conditions and, therefore, the obtention of progeny from valuable individuals from the point of view of the genetic and ecological diversity. In general, and in summary, environmental stimuli, through a set of physiological events in the central nervous system, trigger the hypothalamic release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH), which will induce the synthesis and release of gonadotropins (FSH) and LH) in gonadotropic cells of the adenohypophysis. Both FSH and LH will induce at the gonadal level the physiological changes for the maturation of gametes. The possibility of pharmacologically inducing reproductive cycles in birds could resolve to a large extent the difficulties of captive breeding in species or individuals of high ecological value. On the other hand, the contribution of knowledge on the reproductive physiology of birds, and, specifically, to the hormonal mechanisms that control these processes, would be relevant for the better understanding both of the reproductive cycles in nature and the application of said knowledge to the production of birds and eggs for human consumption. The work of this thesis included the expression of a recombinant quail FSH in a heterologous mammalian cell expression system (CHO) and the purification of LH from turkey adenohypophysis. Therefore, the development of specific antibodies for recombinant quail FSH and pituitary FSH and LH, was considered an essential tool for monitoring these hormones in laboratory processes: expression in the culture medium or cell lysates, purification, concentration and dialysis. The production of specific antibodies against the beta subunits of FSH and LH allowed the identification of recombinant quail FSH (ccrFSH) expressed in Chinese hamster ovary cells (CHO) and the identification and purification of turkey LH. At the in vitro biological tests performed, ccrFSH significantly induced progesterone secretion in granulosa cells of F5 follicles. However, it did not induced progesterone secretion in granulosa cells of F1 follicles. These results demonstrated the specificity of action of this hormone. At the in vivo experiments, the exclusive administration of ccrFSH for fifteen days in prepubertal quail consistently induced the development of follicles with a diameter ≥ 1 mm. However, this treatment did not induce complete follicular development. The combined administration of ccrFSH and LH or eCG did induce complete follicular development, ovulation and egg formation in quail. These experiments demonstrated the in vivo biological activity of ccrFSH and the need for the joint activity of FSH and LH in the induction of the cycle in this species. Recombinant quail FSH was also effective, administered together with eCG, in the induction of ovarian follicular development and maturation. The administration of turkey adenohypophysis glycoprotein extract in individuals with mature ovarian follicles induced ovulation and egg laying. The artificial insemination in these individuals and the incubation of the laid eggs resulted in embryonic development and hatching. The control of the induced cycle was performed by ultrasound exploration of the coelomic cavity and allowed the follow-up of the follicular development until ovulation. Ultrasound showed an effective method for monitoring the induced ovarian cycle. These results demonstrate the efficacy of ccFSH in the induction of the ovarian cycle in birds and the possibility of using this technology in assisted reproduction processes in endangered species to obtain progeny and their reintroduction into the wild.

[es] La reproducción ex situ es una de las medidas reconocidas por la comunidad científica y conservacionista para la conservación de especies amenazadas y su reintroducción en el medio natural. Sin embargo, la reproducción en cautividad de especies de aves amenazadas fracasa con frecuencia debido a la ausencia de estímulos ambientales asociada a la vida en cautividad. Esta circunstancia impide el desarrollo de los ciclos reproductivos fisiológicos en condiciones naturales y, por tanto, la obtención de progenie a partir de individuos valiosos desde el punto de vista de la diversidad genética y ecológica. De modo general y, en resumen, los estímulos ambientales, a través de un conjunto de eventos fisiológicos en el sistema nervioso central, desencadenan la liberación hipotalámica de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), que inducirá la síntesis y liberación de gonadotropinas (FSH y LH) en las células gonadotropas de la adenohipófisis. Tanto la FSH como la LH inducirán a nivel gonadal los cambios fisiológicos necesarios para la maduración de los gametos. La posibilidad de inducir farmacológicamente los ciclos reproductivos en aves podría resolver en gran medida las dificultades de la reproducción en cautividad en especies o individuos de alto valor ecológico. Por otra parte, la aportación de conocimiento a la fisiología reproductiva de las aves, y, concretamente, a los mecanismos hormonales que controlan estos procesos, sería relevante para la mejor comprensión tanto de los ciclos reproductivos en la naturaleza como para la aplicación de dicho conocimiento a la producción de aves y huevos para consumo humano. Los trabajos de esta tesis incluyeron la obtención de una FSH recombinante de codorniz en un sistema de expresión heterólogo de células de mamífero (CHO) y la purificación de LH a partir de adenohipófisis de pavo. Por tanto, el desarrollo de anticuerpos específicos para FSH recombinante de codorniz y FSH y LH hipofisarias de pavo, fue considerado una herramienta imprescindible para el seguimiento de estas hormonas en los procesos de laboratorio: expresión en el medio de cultivo o lisados celulares, purificación, concentración y diálisis. La producción de anticuerpos específicos contra las subunidades beta de FSH y LH permitió la identificación de la FSH recombinante de codorniz (ccrFSH) expresada en células de ovario de hámster chino (CHO) y la identificación y purificación de LH de pavo. En los ensayos biológicos in vitro realizados, ccrFSH indujo significativamente la secreción de progesterona en células de la granulosa de folículos F5. Sin embargo, no indujo la secreción de progesterona en células de la granulosa de folículos F1. Estos resultados demostraron la especificidad de acción de esta hormona. En los experimentos in vivo, la administración exclusiva de ccrFSH durante quince días en codornices prepúberes indujo de manera consistente el desarrollo de folículos de diámetro ≥ 1 mm. Sin embargo, este tratamiento no indujo el desarrollo folicular completo. La administración combinada de ccrFSH y LH o eCG sí indujo desarrollo folicular completo, la ovulación y la formación de huevos en codorniz. En estos experimentos se demostró la actividad biológica in vivo de ccrFSH y la necesidad de la actividad conjunta de FSH y LH en la inducción del ciclo en esta especie. La FSH recombinante de codorniz también fue eficaz, administrada junto a eCG, en la inducción del desarrollo y maduración folicular ovárica. La administración de extracto glicoproteico de adenohipófisis de pavo en los individuos con folículos ováricos maduros indujo la ovulación y la puesta de huevos. La inseminación artificial en estos individuos y la incubación de los huevos puestos resultaron en desarrollo embrionario y eclosión.El control del ciclo inducido se realizó mediante exploración ecográfica de la cavidad celómica y permitió el seguimiento del desarrollo folicular hasta la ovulación. La ecografía se mostró un método eficaz para el seguimiento del ciclo ovárico inducido. Estos resultados demuestran la eficacia de ccFSH en la inducción del ciclo ovárico en aves y la posibilidad de utilizar esta tecnología en los procesos de reproducción asistida en especies amenazadas para la obtención de progenie y su reintroducción en el medio natural.