[ca] S'han estudiat en profunditat els mecanismes apoptòtics, constituint un factor substancial en la mort neuronal després de diferents tipus de danys en el SNC. No obstant això, molt poc es sap sobre l'activació dels mecanismes apoptòtics en les cèl·lules glials i la seva rellevància en la terminació de la resposta glial. La caspasa-3 ha estat definida clàssicament com la principal executora de la mort cel·lular programada i li han estat atribuïts recentment altres papers no apoptòtics de participació en esdeveniments cel·lulars, incloent-hi la proliferació cel·lular, la regulació del cicle cel·lular, i la participació en vies cel·lulars apoptòtiques i antiapoptòtiques després d'un dany excito-tòxic en el cervell immadur de rata. Per aquest propòsit, s'ha utilitzat un model de excitotoxicitat ben caracteritzat, que ha consistit en la inducció d'un dany cerebral mitjançant una injecció intracortical de N-methyl-D-asparate (NMDA) en rates postnatals en el 9è dia de vida (P9). La mort cel·lular, les proteïnes apoptòtiques i antiapoptòtiques van ser analitzades a diferents terminis de supervivència després de la lesió per assaigs enzimàtics i anàlisis de doble fluorescència amb microscopia confocal. Els primers resultats com la caspase-3 clivada es presentava en neurones danyades amb els nuclis TUNEL+, encara que va ser observada majoritàriament en el nucli d'astròcits activats en l'hemisferi lesionat sense associació amb fragmentació del ADN, des de les 4 hores post-lesió (hpl) fins a la formació de la cicatriu glial als 7-14 dies, sense trobar-se associació amb marcatge amb TUNEL. L'activitat enzimàtica de la caspasa-3 va ser detectada a les primeres hores post-lesió i coincidint amb els fragments clivados per caspasas de la proteïna acídica fibrilar (CCP-GFAP) en astrocitos. No obstant això, sobre llargs terminis de supervivència, quan sorgia la hipertròfia astroglial, la caspasa-3 astroglial generalment no es va correlacionar amb el clivage de CCP-GFAP, però en canvi es va relacionar amb l'expressió de novo de vimentina. Per altra banda, la caspasa-3 clivada no s'ha vinculat a proliferació cel·lular. Aquests resultats inicials van mostrar l'evidència d'un paper gens tradicional de les caspases en la funció astroglial, suggerint que la seva activació pot ser important per a la reestructuració del citoesquelet després d'un dany. Secundàriament, al avaluar les vies d'activació de la caspasa-3 en neurones i cèl·lules glials, l'activació espai-temporal de les vies apoptòtiques intrínseca i extrínseca va ser analitzada. Es va expressar principalment en les neurones danyades corticals i hipocampals, una important contribució de la via intrínseca a través de la gran proporció de caspasa-9 activa amb l'activació neuronal de la caspase-3 i mort cel·lular. Per altra banda, la caspasa-8 va presentar una reduïda correlació amb la caspasa-3, i característicament es va presentar amb especificitat en les capes corticals. En les cèl·lules glials, l'activació de la caspasa-9, caspasa-8, i també p53, altra molècula que activa la caspasa-3 indirectament, va ser significant tant sols en la capa cortical VI i en el corpus callosum, suggerint que la caspasa-3 astroglial no es correlaciona generalment amb les clàssiques vies d'activació. La tercera part d'aquesta tesi es va focalitzar en l'estudi de les molècules antiapoptòtiques, com diversos inhibidors de l'apoptosis (IAPs) i les proteïnes heat shock (HSPs), conegudes com inhibidors de la caspasa-3 clivada en altres tipus cel·lulars. Les neurones van presentar una apreciable expressió de HSC70/HSP70 i cIAP-2, encara que aquestes es correlacionaven pobrament amb caspasa-3 en aquest tipus cel·lular. En astròcits , la survivina i la chaperona HSP25/27 van mostrar una forta correlació amb caspasa-3 en diverses regions cerebrals i a diversos terminis de supervivència, sent aquestes proteïnes destacades candidates per al bloqueig de l'activitat enzimàtica de la caspasa-3, la qual podria acumular-se en absència de mort astroglial. En conclusió, aquesta tesi ha descobert nous rols no apoptòtics de la caspasa-3 en cèl·lules astroglials i suggereix mecanismes de bloqueig de la caspasa-3, ajudant al coneixement dels mecanismes emprats pels astròcits per enfrontar-se al dany en el cervell immadur.

[en] Although it is well established that apoptotic mechanisms play a central role in neuronal death after different types of CNS damage, little is known about the activation of apoptotic pathways in glial cells which have been postulated to be important for the termination of the glial response. It is remarkable that the classically defined main executioner of programmed cell death, caspase-3, has recently been attributed a non-apoptotic role, participating in cellular events including cell proliferation, cell cycle regulation, or cellular differentiation. Accordingly, the general aim of this thesis was to analyze the putative role of the classic apoptotic and anti-apoptotic pathways after acute excitotoxic damage to the immature rat brain. For this purpose, a well-characterized in vivo model of excitotoxicity was used, where damage was induced by the intracortical injection of N-methyl-D-asparate (NMDA) in postnatal day 9 rats. Cell death, apoptotic and anti-apoptotic proteins were analyzed at different survival times after the lesion by enzymatic assays and double immunofluorescence for confocal microscope analysis. The first set of results demonstrated that although cleaved caspase-3 was found in some damaged neurons showing TUNEL+ nuclei, cleaved caspase-3 was mainly observed in the nucleus of activated astrocytes in the lesioned hemisphere as early as 4 h post-lesion, persisted until the glial scar was formed at 7-14 days, and was marginally associated with TUNEL labeling. Caspase-3 enzymatic activity was significant during the first hours post-lesion and co-localized with the presence of caspase-cleaved fragments of glial fibrillary acidic protein (CCP-GFAP) in astrocytes. However, at longer survival times, when astroglial hypertrophy was observed, astroglial caspase-3 did not generally correlate with GFAP cleavage but instead was associated with de novo expression of vimentin. Moreover, astroglial caspase-3 cleavage was not associated with cell proliferation. These first results provided evidence for a non-traditional role of caspases in astroglial function, suggesting that caspase activation may be important for astroglial cytoskeleton remodeling following injury. Secondly, in order to evaluate upstream pathways activating caspase-3 in neurons and glial cells, the spatio-temporal activation of the intrinsic and extrinsic apoptosis pathways were analyzed. In damaged neuronal cells of the ipsilateral cortex and hippocampus an important contribution of the intrinsic mitochondrial pathway through caspase-9 activation was shown to account for most of neuronal caspase-3 activation and apoptotic nuclei. However, neuronal caspase-8 showed a diminished correlation with caspase-3 and characteristically showed cortical layer specificity. In glial cells, activation of caspase-9, caspase-8, and also p53, another putative caspase-3 activating molecule, was only significant in cortical layer VI and the corpus callosum, suggesting that astroglial caspase-3 does not generally correlate with classical upstream activating pathways. In the third part of this thesis, inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) and heat shock proteins (HSPs), known inhibitors of cleaved caspase-3 in other cell types, were analyzed. Whereas neuronal cells showed noticeable expression of HSC70/HSP70 and cIAP-2, these poorly correlated with caspase-3 in this cell type. In astrocytes, survivin and the small HSP25/27 showed a strong correlation with caspase-3 in several regions and throughout different survival times, pointing to these proteins as relevant candidates for the blockade of caspase-3 enzymatic activity, which could account for the absence of astroglial cell death. In conclusion, this thesis has discerned new non-apoptotic roles of caspase-3 in astroglial cells and suggests mechanisms for caspase-3 blockade in these glial cells, improving the understanding of the mechanisms employed by astrocytes to cope with damage in the immature brain.