[en] Oxidative stress is defined as the disturbance in the balance between oxidants and antioxidants species in favor of the formers. While there are many types of oxidative damage, increasing evidence suggests an important role for protein oxidation in multiple diseases. Disulfides are formed in the cytosol during oxidative stress functioning as redox switches. The tri-peptide glutathione is a major thiol antioxidant that plays a key role in numerous cell functions. So far the glutathione redox status has been considered a reliable indicator of oxidative stress in cells because it reflects the balance between antioxidant status and pro-oxidant reactions. Nowadays, acute pancreatitis is a relatively common disease. However, the main questions that raise both doctors and researchers remain unanswered. How we could diagnose acute pancreatitis earlier? Which treatment we should give to a patient to attenuate the inflammatory process? What is the period of time that we can permit between the data of the patient is taken and the diagnosis of acute pancreatitis? In order to answer these questions, it is necessary to find out the molecular mechanisms that occur during the development of the pancreatic inflammatory response. For these reasons, one of the aims of this Thesis was to analyze the redox status of thiols and to identify mixed disulfides and targets of redox signaling in pancreas in experimental acute pancreatitis as a model of acute inflammation associated with glutathione depletion. There are different experimental models to induce and study acute pancreatitis in animals, all characterized and well established to induce mild and severe acute pancreatitis. For the development of this Thesis, it has been used a model of severe acute necrotic pancreatitis induced by retrograde infusion of sodium taurocholate in rats. This model has a high reproducibility and has been handled by our research group for several years. In addition, it was used in vitro cell line model of pancreatic acinar cells (266-6) that come from mice to investigate and further demonstrate the mechanisms involved. Therefore, for the study of acute pancreatitis it was used both in vitro and in vivo models. It is known that there is an association between acute inflammation and depletion of reduced glutathione (GSH). In addition, GSH depletion in pancreas is a hallmark of the early course of acute pancreatitis and contributes to the severity of the disease. One of the aims of this Thesis was to characterize the consequences of GSH depletion in acute pancreatitis at the molecular level. Glutathione depletion in pancreas in acute pancreatitis is not associated with any increase in oxidized glutathione levels or protein glutathionylation. Cystine and homocystine levels as well as protein cysteinylation and γ-glutamyl cysteinylation markedly rose in pancreas after induction of pancreatitis. Protein cysteinylation was undetectable in pancreas under basal conditions. The quantification of these low molecular weight thiols, its reduced and oxidized forms, as well as the mixed disulfide bridges (bound to proteins) was carried out after processing of the corresponding fresh samples from rat pancreatic tissue and subsequent analysis by mass spectrometry coupled to high resolution liquid chromatography (HPLC-MS/MS). To assess the formation of disulfide bridges during the course of acute pancreatitis, it was performed the "redox monobromobimane switch". The increase in fluorescence after pancreatitis onset showed that reversible thiol oxidation is formed in the course of the disease. After confirming disulfide formation during acute pancreatitis, it was investigated whether disulfides were formed with low molecular free thiols, such as GSH, cysteine, etc., or between proteins. The majority of protein disulfides seem to be ascribed to low molecular weight thiols since the diagonal electrophoresis performed after the redox switch revealed a marked increase in chemiluminescence along the diagonal at 6h after the induction of acute pancreatitis. When the formation of disulfide bridges in acute pancreatitis was studied, it was evaluated another oxidative modifications of proteins, S-nitrosylation and carbonylation. S-nitrosylation was assessed by "biotin switch" and carbonylation by bidimensional electrophoresis using an antibody against carbonylated residues. There were no significant changes in protein S-nitrosylation and carbonylation during the course of acute pancreatitis. We show in the present Thesis that acute pancreatitis is an inflammatory pathology associated with oxidative stress without carbonylation and S-nitrosylation protein oxidation but with a remarkable formation of disulfide bridges. Thiol-disulfide exchanges in proteins may cause profound effects on protein activity and cell signaling. In this Thesis it is described disulfide stress as a type of oxidative stress in acute inflammation in mammals associated with oxidation of the pair cysteine/cystine and protein cysteinylation, but without glutathione oxidation or changes in protein glutathionylation. The next step in this Thesis was to identify targets of disulfide stress that were oxidized in the course of acute pancreatitis. Targets of disulfide stress were identified by different techniques: Western blotting under reducing and non-reducing conditions, diagonal electrophoresis, proteomic methods and phosphatase activity in the presence and absence of N-acetylcysteine. All the potential targets of disulfide stress that were studied in the present Thesis were chosen by their importance and particular relevance because of their implication in redox stability, redox signaling and the inflammatory cascade that occurs in acute pancreatitis. The study of protein phosphatases in this Thesis enabled a further elucidation of the mechanisms involved in the inflammatory process during acute pancreatitis and allowed the identification of protein phospathases as targets of disulfide stress. All the identified targets of disulfide stress could be classified into two groups: Redox buffers and redox signaling thiols. Redox buffers would include ribonuclease inhibitor and albumin. Redox-signaling thiols are thioredoxin 1, APE1/REF1, KEAP1, tyrosine phosphatases and serine/threonine phosphatases, and protein disulfide isomerase. These targets of disulfide stress exhibit great relevance in biological processes involving enzyme activity, DNA repair, cell proliferation, apoptosis, endoplasmic reticulum stress, and the inflammatory response. Therefore, disulfide stress would be a specific type of oxidative stress involved in redox signaling in mammals. Because of its relationship with oxidative stress, redox homeostasis, and its action on MAPKs, PP2A could play a key role in early phases of acute pancreatitis, particularly in the severe form of the disease, participating critically in the inflammatory cascade control. Based on this hypothesis as well as on the oxidation observed in the catalytic subunit of PP2A and its loss of activity in acute pancreatitis, we decided to silence PP2Ac in pancreatic acinar 266-6 cells in order to study the role of PP2A inactivation in the activation of the MAPK cascade and in the up-regulation of inflammatory cytokines. What is more, non-silenced and PP2Ac-silenced pancreatic acinar 266-6 cells were incubated with 10 ng/mL of TNF-α for 1h. Additionally, in order to simulate in vitro the conditions of the in vivo experimental model induced by sodium taurocholate, non-silenced and PP2Ac-silenced 266-6 cells were treated with 0,5% sodium taurocholate for 2h. Then, the mRNA expression of the genes il-6, cxcl1 and tnf-α was assessed by real time PCR. PP2A silencing in pancreatic acinar cells, in vitro leads to activation of p38 and JNK MAPKs and up-regulation of cytokines CXCL-1, IL-6 and TNF-α. All these findings would help to better understand the molecular basis of the pancreatic disease and the main targets of oxidative stress that are affected during acute pancreatitis. Knowledge of the molecular biology of a disease is important because, ultimately, has its expression in a macromolecular level. The targets identified and the study of the antioxidant and inflammatory response also may contribute to improve the therapeutic treatment of acute pancreatitis. On the other hand, the new mechanism that is involved in acute inflammation in mammals would provide a new tool for the study of other diseases in which inflammation is present.

[es] El estrés oxidativo se define como la alteración en el equilibrio entre las especies oxidantes y antioxidantes, a favor de las primeras. Mientras que hay muchos tipos de daño oxidativo, cada vez más pruebas sugieren un papel importante en la oxidación de proteínas en múltiples enfermedades. Los puentes disulfuro se forman en el citosol durante el estrés oxidativo y funcionan como intercambiadores redox. El glutatión es un tripéptido y es uno de los principales antioxidantes, lo que le confiere un papel clave en numerosas funciones celulares. El estado redox del glutatión se considera el mejor indicador de estrés oxidativo en las células, ya que refleja el equilibrio entre el estado antioxidante y las reacciones pro-oxidantes. Hoy en día, la pancreatitis aguda es una enfermedad relativamente común. Sin embargo, las principales cuestiones que plantean tanto los médicos y los investigadores siguen sin respuesta. ¿Cómo podríamos diagnosticar la pancreatitis aguda antes? ¿Qué tratamiento hay que dar a un paciente para atenuar el proceso inflamatorio? ¿Cuál es el período de tiempo que nos podemos permitir entre que los datos del paciente son tomados y el diagnóstico de la pancreatitis aguda? Con el fin de responder a estas preguntas, es necesario conocer los mecanismos moleculares que ocurren durante el desarrollo de la respuesta inflamatoria del páncreas. Por estas razones, uno de los objetivos de esta Tesis ha sido analizar el estado redox de los tioles y los disulfuros mixtos y de identificar dianas de señalización redox en páncreas en la pancreatitis aguda experimental como modelo de inflamación aguda asociada con la depleción de glutatión. Existen diferentes modelos experimentales para inducir y estudiar la pancreatitis aguda en los animales, todos caracterizados y bien establecidos para inducir la pancreatitis aguda leve y grave. Para el desarrollo de esta Tesis, se ha utilizado un modelo de pancreatitis aguda necrótica inducida por la infusión retrógrada de taurocolato sódico en ratas. Este modelo tiene una alta reproducibilidad y ha sido utilizado por nuestro grupo de investigación durante varios años. Además, se ha utilizado un modelo in vitro a través de una línea celular de células acinares pancreáticas (266-6) procedentes de ratones para investigar en mayor profundidad los mecanismos implicados. Por lo tanto, para el estudio de la pancreatitis aguda se utilizaron tanto modelos in vitro como in vivo. Se sabe que existe una asociación entre la inflamación aguda y la depleción de glutatión reducido (GSH). Además, la depleción de GSH en el páncreas es una característica distintiva de las primeras fases de la pancreatitis aguda y contribuye a la severidad de la enfermedad. Uno de los objetivos de esta Tesis ha sido caracterizar las consecuencias de la depleción de GSH en la pancreatitis aguda a nivel molecular. La depleción de glutatión en el páncreas en la pancreatitis aguda no está asociada a ningún aumento en los niveles de glutatión oxidado o glutationilación de proteínas. Los niveles de cistina y homocisteína, así como la cisteinilación y γ-glutamilcisteinilación de proteínas aumentaron notablemente en el páncreas después de la inducción de la pancreatitis. La cisteinilación de proteínas fue indetectable en el páncreas en condiciones basales. La cuantificación de estos tioles de bajo peso molecular, sus formas reducidas y oxidadas, así como los puentes disulfuro mixtos (formas unidas a proteínas) se llevó a cabo en muestras de tejido pancreático fresco de rata y el posterior análisis por espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-MS/MS). Para evaluar la formación de puentes disulfuro durante el curso de la pancreatitis aguda, se llevó a cabo un intercambio redox con monobromobimano. El aumento de la fluorescencia después de la aparición de la pancreatitis mostró que la oxidación reversible de tioles se forma en el curso de la enfermedad. Tras confirmar la formación de puentes disulfuro durante la pancreatitis aguda, se investigó si los puentes disulfuros se formaban con tioles libres de bajo peso molecular, tales como GSH, cisteína, etc, o entre las proteínas. La mayoría de los disulfuros que sufren las proteínas parece ser debido a la unión de tioles de bajo peso molecular ya que la electroforesis diagonal llevada a cabo después del intercambio redox con biotina reveló un marcado aumento de quimioluminiscencia a lo largo de la diagonal a las 6h tras la inducción de la pancreatitis aguda. Después de estudiar la formación de puentes disulfuro en la pancreatitis aguda, se evaluaron otras modificaciones oxidativas de las proteínas: La S-nitrosilación y la carbonilación. La S-nitrosilación se evaluó mediante el intercambio con biotina y la carbonilación por electroforesis bidimensional utilizando un anticuerpo contra residuos carbonilados. No hubo cambios significativos en la S-nitrosilación y carbonilación de proteínas durante el curso de la pancreatitis aguda. Por tanto, en la presente Tesis mostramos que la pancreatitis aguda es una patología inflamatoria asociada con el estrés oxidativo, pero en la que no aparece carbonilación ni S-nitrosilación de proteínas y sin embargo, se acompaña de una considerable formación de puentes disulfuro. Los intercambios tiol-disulfuro en las proteínas pueden causar grandes efectos sobre la actividad de las mismas y sobre la señalización celular. En esta Tesis, se describe el estrés por disulfuro como un tipo de estrés oxidativo que ocurre en la inflamación aguda en mamíferos y que está asociado con la oxidación del par cisteína/cistina y la cisteinilación de proteínas, pero sin cambios en la oxidación del glutatión o en la glutationilación de proteínas. El siguiente paso en esta Tesis fue identificar dianas de estrés por disulfuro y que por tanto se oxidan en el curso de la pancreatitis aguda. Las dianas de estrés por disulfuro se identificaron mediante diferentes técnicas: Western blotting en condiciones reductoras y no reductoras, electroforesis diagonal, métodos proteómicos y el estudio de la actividad fosfatasa en presencia y ausencia de N-acetilcisteína. Todas las dianas potenciales de estrés por disulfuro que se estudiaron en la presente Tesis fueron escogidas por su importancia y relevancia particular en su implicación en la estabilidad redox, la señalización redox y la cascada inflamatoria que se produce en la pancreatitis aguda. El estudio de las proteín fosfatasas en esta Tesis permitió una elucidación adicional de los mecanismos implicados en el proceso inflamatorio durante la pancreatitis aguda así como la identificación de proteín fosfatasas como dianas de estrés por disulfuro. Todas las dianas identificadas de estrés por disulfuro se pueden clasificar en dos grupos: Los tampones redox y los tioles de señalización redox. Los tampones redox incluyen el inhibidor de la ribonucleasa y la albúmina. Los tioles de señalización redox son la tiorredoxina 1, APE1/REF1, KEAP1, las tirosín fosfatasas, las serín/treonín fosfatasas y la proteína disulfuro isomerasa. Estas dianas de estrés por disulfuro presentan gran relevancia en los procesos biológicos que implican actividad enzimática, la reparación del ADN, la proliferación celular, la apoptosis, el estrés del retículo endoplasmático y la respuesta inflamatoria. El estrés por disulfuro sería por tanto un tipo específico de estrés oxidativo implicado en la señalización redox en mamíferos. Debido a su relación con el estrés oxidativo, la homeostasis redox, y su acción sobre las MAPKs, la PP2A podría desempeñar un papel clave en las fases tempranas de la pancreatitis aguda, particularmente en la forma grave de la enfermedad, participando críticamente en el control en cascada inflamatoria. Sobre la base de esta hipótesis, así como en la oxidación observada en la subunidad catalítica de la PP2A y su pérdida de actividad en la pancreatitis aguda, decidimos silenciar la PP2Ac en células acinares pancreáticas 266-6 con el fin de estudiar el papel de la inactivación de la PP2A en la activación de la cascada de MAPK y en la regulación de las citoquinas inflamatorias. Además, las células acinares pancreáticas 266-6 silenciadas y no silenciadas la PP2Ac, se incubaron con 10 ng/mL de TNF-α durante 1 h. Y, con el fin de simular in vitro las condiciones del modelo experimental in vivo inducido por taurocolato sódico, las células acinares pancreáticas 266-6 silenciadas y no silenciadas la PP2Ac fueron tratadas con taurocolato sódico al 0,5% durante 2 h. A continuación, la expresión del ARNm de los genes il-6, cxcl1 y tnf-α se evaluó mediante PCR en tiempo real. El silenciamiento in vitro de la PP2Ac en células acinares pancreáticas conduce a la activación de las MAPKs p38 y JNK y a la regulación de las citoquinas CXCL-1, IL-6 y TNF-α. Todos estos hallazgos podrían ayudar a entender mejor la base molecular de la enfermedad pancreática y a las principales dianas de estrés oxidativo que se ven afectadas durante la pancreatitis aguda. El conocimiento de la biología molecular de una enfermedad es importante porque, en última instancia, tiene su expresión a nivel macromolecular. Las dianas identificadas y el estudio de la respuesta antioxidante e inflamatoria también pueden contribuir a mejorar el tratamiento terapéutico de la pancreatitis aguda. Por otra parte, el nuevo mecanismo que está implicado en la inflamación aguda en mamíferos proporcionaría una nueva herramienta para el estudio de otras enfermedades en las que la inflamación está presente.