[ca] En aquesta tesi doctoral es presenta el desenvolupament de noves eines per al diagnòstic precoç i el seguiment de malalties no transmissibles. Tot i que existeixen metodologies d'alt rendiment disponibles al mercat per aquest objectiu, l'alt cost i la baixa disponibilitat en entorns de baixos recursos dificulten la seva implementació en centres d'atenció primària dels països en desenvolupament. Per tant, el disseny de nous mètodes segueix sent essencial per reduir la incidència d'aquestes malalties. A més del desenvolupament de nous dispositius de diagnòstic més senzills i menys costosos, la cerca de nous biomarcadors en biòpsies líquides és molt rellevant. Entre els diferents tipus de biomarcadors, l'estudi de les vesícules secretades per les cèl·lules pot proporcionar informació rellevant sobre processos fisiològics i patològics dels teixits. Els exosomes són vesícules extracel·lulars de mida nanomètrica que s'estan estudiant intensament com a potencials biomarcadors de diagnòstic en moltes malalties, especialment, en biòpsies líquides per al càncer degut al seu alliberament augmentat per les cèl·lules canceroses amb la seva empremta molecular alterada. Aquest treball s'enfoca a l'estudi de les proves de diagnòstic ràpid (RDT, en anglès rapid diagnostic test) per a exosomes com a biomarcadors d'interès clínic. En concret, se centra en la millora dels paràmetres analítics, dissenys experimentals i tecnologies d'aquests RDTs. Tots els mètodes desenvolupats s'han provat i optimitzat amb exosomes derivats de sobrenedants de cultiu cel·lular de les línies cel·lulars MCF-7, MDA-MB-231 i SKBR3, com a model de cèl·lules de càncer de mama. En primer lloc, es va abordar la producció, aïllament i purificació d'aquests exosomes cultivats. Les nanovesícules canceroses obtingudes es van caracteritzar física i molecularment amb mètodes analítics estàndard, com ara l'anàlisi de seguiment de nanopartícules, la microscòpia electrònica de transmissió criogènica i la citometria de flux. Un dels principals reptes per analitzar els exosomes en un RDT és augmentar la sensibilitat i millorar els límits de detecció dels assajos. En aquesta direcció, es va explorar l'ús de tècniques de preconcentració magnètica i d'amplificació d'àcids nucleics, com la RT-PCR de doble marcatge, per al seu ús en aquest tipus de mostres. En aquesta tesi es desenvolupa un nova plataforma que combina la separació immunomagnètica i la detecció electroquímica d'amplicons doblement marcats per a la detecció quantitativa dels exosomes, basat en l'amplificació de les seqüències mRNA de gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH). El mètode desenvolupat es va provar amb mostres reals de sèrum humà i permet diferenciar pacients amb càncer de mama i individus sans, millorant notablement els límits de detecció. D'altra banda, es van explorar RDTs basats en paper. Amb aquestes plataformes s'aconsegueix la simplificació dels assajos i la millora de les característiques per a entorns amb recursos limitats. En aquesta tesi s'explora per primera vegada la potencialitat de l'assaig de flux vertical (VFA) per a la detecció visual d'exosomes. Aquest mètode es basa en l'ús de la fosfatasa alcalina com a marcador enzimàtic, produint un senyal colorimètric a la superfície de les membranes de paper. Els senyals visuals es van poder quantificar amb un programari d'anàlisi d'imatges, obtenint resultats prometedors per a la caracterització de marcadors de proteïnes en exosomes amb un dispositiu senzill i de baix cost. Per últim, es van explorar altres enfocaments no convencionals per a la detecció d'exosomes, centrats en la detecció de la seva activitat enzimàtica intrínseca. Es va estudiar l'activitat intrínseca de les aldehid deshidrogenases (ALDH), també com a biomarcador sobreexpressat en càncer. Es va desenvolupar un nou mètode basat en la nano-citometria de flux per a la detecció d'aquests enzims directament dins dels exosomes. Aquest estudi representa el primer pas cap al desenvolupament d'un nou RDT dirigit a l'activitat intrínseca de l'ALDH dels exosomes.

[es] En esta esta tesis doctoral se presenta el desarrollo de nuevas herramientas para el diagnóstico precoz y el seguimiento de enfermedades no transmisibles. Aunque existen metodologías de alto rendimiento disponibles en el mercado para conseguir este objetivo, el alto coste y la escasa disponibilidad en entornos de escasos recursos dificultan su implementación en centros de atención primaria de los países en vías de desarrollo. Por tanto, el diseño de nuevos métodos sigue siendo esencial para reducir la incidencia de estas enfermedades. Además del desarrollo de dispositivos de diagnóstico más sencillos y menos costosos, la búsqueda de nuevos biomarcadores en biopsias líquidas es muy relevante. Entre los distintos tipos de biomarcadores, el estudio de vesículas secretadas por las células puede proporcionar información relevante sobre procesos fisiológicos y patológicos de los tejidos. Los exosomas son vesículas extracelulares de tamaño nanométrico que se están estudiando intensamente como potenciales biomarcadores de diagnóstico en muchas enfermedades, especialmente, en biopsias líquidas para el cáncer, debido a su liberación aumentada por las células cancerosas con una impronta molecular alterada. Esta tesis doctoral se enfoca al estudio de las pruebas de diagnóstico rápido (RDT, del inglés rapid diagnostic test) para exosomas como biomarcadores de interés clínico. En concreto, se centra en la mejora de los parámetros analíticos, diseños experimentales y tecnologías de estos dispositivos. Todos los métodos desarrollados se han probado y optimizado con exosomas derivados de sobrenadantes de cultivo celular de las líneas celulares MCF-7, MDA-MB-231 y SKBR3, como modelo de células de cáncer de mama. En primer lugar, se abordó la producción, aislamiento y purificación de estos exosomas cultivados. Las nanovesículas cancerosas obtenidas se caracterizaron física y molecularmente con métodos analíticos estándar, como el análisis de seguimiento de nanopartículas, la microscopía electrónica de transmisión criogénica y la citometría de flujo. Uno de los principales retos para analizar los exosomas en un RDT es aumentar la sensibilidad y mejorar los límites de detección de los ensayos. En esta dirección, se exploró el uso de técnicas de preconcentración magnética y amplificación de ácidos nucleicos, como la RT-PCR de doble marcaje, para su uso en este tipo de muestras. En esta tesis se desarrolla una nueva plataforma que combina la separación inmunomagnética y la detección electroquímica de amplicones doblemente marcados para la detección cuantitativa de exosomas, basado en la amplificación de las secuencias mRNA de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). El método desarrollado se probó con muestras reales de suero humano y permite diferenciar a pacientes con cáncer de mama e individuos sanos, mejorando notablemente los límites de detección. Por otra parte, se exploraron RDT en papel. Con esta plataforma se consigue la simplificación analítica de los ensayos, y se mejoran sus características para entornos con recursos limitados. En esta tesis se explora por primera vez la potencialidad del ensayo de flujo vertical (VFA) para la detección visual de exosomas. Este método se basa en el uso de la fosfatasa alcalina como marcador enzimático, produciendo una señal colorimétrica en la membrana de papel. Las señales visuales pudieron cuantificarse con un software de análisis de imágenes, obteniendo resultados prometedores para la caracterización de marcadores de proteínas en exosomas con un dispositivo sencillo y de bajo coste. Por último, se exploraron otros enfoques no convencionales para la detección de exosomas, centrados en la detección de la actividad enzimática intrínseca. Se estudió la actividad de las aldehído deshidrogenasas (ALDH), considerado también como biomarcador sobreexpresado en cáncer. Se desarrolló un nuevo método basado en la nano-citometría de flujo para la detección de estas enzimas directamente en los exosomas. Este estudio supone el primer paso hacia el desarrollo de un nuevo RDT para la detección de exosomas.