[ca] La MNGIE és una malaltia metabòlica rara causada per mutacions recessives en el gen TYMP, el qual codifica per l'enzim TP. Això causa una acumulació sistèmica de nucleòsids que provoca toxicitat mitocondrial, i normalment acaba sent letal durant les primeres dècades de vida. L'objectiu d'aquest treball era aconseguir una integració eficaç de l'ADNc humà de TYMP dins d'un intró dels gens Tymp i Alb en hepatòcits per l'acció coordinada de dos elements: la CRISPR/Cas9 i els templates amb l'ADNc de TYMP. Aquests templates van ser dissenyats per a ser integrats en una regió subseqüent a un promotor genòmic, de manera que l'expressió de l'ADNc de TYMP estaria sota el seu control. En el cas del locus Alb, l'edició gènica correcta produiria una proteïna híbrida Alb-hTP que tindria capacitat secretora. Amb aquesta aproximació, els hepatòcits serien editats permanentment i l'ADNc de TYMP seria expressat a llarg termini, de manera que es resoldria el problema de pèrdua d'expressió del transgèn sovint detectada en teràpies gèniques convencionals. Es van provar dues estratègies diferents. En la primera, els ARNs de la CRISPR/Cas9 varen ser introduïts per nanopartícules (NPs). Això va permetre una expressió elevada però transitòria. Es van provar dues NPs diferents: les NPs polimèriques (PNPs) de GEMAT-IQS, i les NPs lipídiques (NPLs) d'Acuitas Therapeutics®. En la segona estratègia, el sistema CRISPR/Cas9 va ser lliurat com a ADN dins de vectors AAV. Els resultats in vitro i in vivo van corroborar que l'ADNc de TYMP podia ser inserit amb èxit en els dos loci. També vam corroborar la presència d'ARNm de TYMP i de proteïna TP funcional dins les cèl·lules editades. L'experimentació in vivo es va fer amb el model de ratolí de MNGIE. Els nivells plasmàtics de Thd i dUrd dels animals tractats van ser monitorats per valorar l'eficiència de les diferents estratègies d'edició gènica. Els millors resultats es van obtenir en els animals tractats amb les NPLs que portaven els ARNs de la CRISPR/Cas9 i els vectors rAAV2/8 que portaven els templates d'ADN. Aquests ratolins van presentar una correcció bioquímica estable i consistent que es va correlacionar amb la presència d'ARNm TYMP i d'enzim TP funcional en les cèl·lules del fetge. A més, els ratolins editats en el locus Alb van presentar una activitat TP significativa en plasma, el qual confirma que l'enzim híbrid pot ser secretat amb èxit tot mantenint la seva activitat en plasma. Tanmateix, la reducció de nivells plasmàtics de nucleòsids no va ser suficient per assolir els nivells detectats en els ratolins WT, de manera que hi ha espai per a l'optimització. Sorprenentment, en alguns casos l'edició gènica es va produir en absència de la CRISPR/Cas9, el qual suggereix que els templates d'ADN sols podrien provocar la inserció correcta a través de recombinació homòloga. Tots aquests resultats confirmen que la nostra estratègia d'edició gènica és viable, tot i que necessitem augmentar l'eficiència global del procediment per aconseguir una correcció bioquímica total en el model de MNGIE.

[en] MNGIE is a rare metabolic disease caused by recessive mutations in the TYMP gene, which encodes the enzyme TP. This causes a systemic accumulation of nucleosides which results in mitochondrial toxicity that is usually lethal during the first decades of life. The goal of the present work was to achieve an efficient integration of the human TYMP cDNA on introns of the Tymp and Alb genes of murine hepatocytes by the coordinated action of two elements: CRISPR/Cas9 system and TYMP cDNA templates. These templates were designed to be integrated in a region downstream a genomic promoter, so that the TYMP cDNA expression will be under its control. In the case of the Alb locus the successful gene editing produced a hybrid Alb-hTP protein with a secretory ability. With this approach, hepatocytes would be permanently edited and the TYMP cDNA would be expressed long-term, thus overcoming the problem of loss of transgene expression often detected in conventional gene therapies. Two distinct strategies were tested. In the first one, CRISPR/Cas9 RNAs were delivered by nanoparticles (NPs). This allowed a high but transient expression. We tested NPs of two different sources: polymeric NPs (PNPs) of GEMAT-IQS, and lipid NPs (LNPs) of Acuitas Therapeutics®. In the second approach, CRISPR/Cas9 was delivered as DNA inside AAV vectors. Both in vitro and in vivo results corroborated that the TYMP cDNA could be successfully inserted in both loci. We also assessed the presence of TYMP mRNA and functional TP protein in the edited cells. In vivo experimentation was performed with the mice model of MNGIE. The Thd and dUrd plasma levels of treated animals were monitored to assess the effectivity of the different genome editing approaches. The best results were obtained in animals treated with LNPs carrying the CRISPR/Cas9 RNAs and rAAV2/8 vectors carrying the DNA templates. These mice showed a consistent and stable biochemical correction that correlated with the presence of TYMP mRNA and functional TP enzyme in liver cells. Moreover, mice of the Alb locus gene editing group presented significant TP activity in plasma, which confirms that the hybrid enzyme can be successfully secreted and maintains its activity in plasma. However, the reduction of plasma nucleoside levels was not enough to reach the levels observed in WT mice, so there is room for optimization. Unexpectedly, in some cases genome edition was observed in the absence of CRISPR/Cas9, which suggests that the DNA templates alone could trigger the correct insertion through homologous recombination. All these results confirm that our genome editing approach is viable, although we need to increase the overall efficiency of the procedure to achieve a full biochemical correction in the murine model of MNGIE.