[en] The aim of this work is to evaluate the effects of freezing-thawing process on different structures of porcine spermatozoa, such as nuclear structure, mitochondrial function and spermatic subpopulational structure. In the first study we tested the effect of freezing-thawing on the nuclear structure of porcine spermatozoa. Freezing-thawing did not cause DNA fragmentation, although a clear destabilization of the protamine-1-DNA complexes was apparent. This destabilization started after cooling phase to 5 °C included in the freezing-thawing procedure. This indicates that this cooling phase is one of the most lethal phases during the freezing-thawing process of porcine spermatozoa. In the second study we evaluated the changes that the boar sperm motile subpopulational structure suffered during the freezing-thawing procedure taking into account the freezability of the ejaculates, as well as the mitochondrial activity and the mitochondrial formation of reactive oxygen species (ROS). We observed 4 motile subpopulations in all the treatments (fresh and frozen-thawed) and all the freezabilities (good, average and bad freezers) studied. The response of the majority of the motility parameters studied after the freezing-thawing was very different in the bad freezers semen compared with the good freezers. Furthermore, in the study of the mitochondrial activity we observed that the bad freezers samples presented the lowest mitochondrial activity. Finally, in the third work we studied the effect of the cryopreservation on the mitochondrial function of porcine spermatozoa. We evaluated the mitochondrial activity together with the rhythm of mitochondrial ROS formation, as well as the expression and localization of two important proteins on the mitochondrial function, mitofusin-2 (Mfn-2) and actin. We observed that mitochondrial activity as well as mitochondrial ROS formation decreased during the freezing with an initial drop in the cooling phase. Furthermore we also observed changes on the expression and localization of Mfn-2 and actin, which became apparent on the cooling phase. In conclusion, this study has demonstrated that the majority of the damage caused by the freezing-thawing process began during the cooling phase to 5 °C, being this step very important for sperm survival. The freezing-thawing process caused a nuclear destructuration, without causing nuclear fragmentation, as well as changes on the motile sperm subpopulational structure, being these changes more evident on ejaculates with the poorest freezing quality. Finally, freezing-thawing caused a decrease on the mitochondrial activity due to changes on the expression and localization of proteins which regulate mitochondrial function.

[es] El objetivo de este trabajo es el de evaluar los efectos que tiene el proceso de congelación-descongelación en diferentes estructuras del espermatozoide porcino, como la estructura nuclear, la función mitocondrial y la estructura subpoblacional espermática. En el primer estudio se comprobó el efecto de la congelación-descongelación sobre la estructura nuclear del espermatozoide porcino. El proceso de congelación-descongelación no causó fraccionamiento del ADN, pero sí que provocó una desestabilización de los complejos protamina-1-ADN. Esta desestabilización ya se empezó a hacer evidente en las muestras refrigeradas a 5 °C, demostrándose que es la fase de refrigeración hasta 5 °C una de las más letales durante la congelación de espermatozoides porcinos. En el segundo trabajo se evaluaron los cambios que sufre la estructura subpoblacional mótil del semen de cerdo durante el proceso de congelación-descongelación, teniendo en cuenta la congelabilidad de los eyaculados, además de la actividad mitocondrial y la formación de especies reactivas del oxigeno (ROS) de origen mitocondrial. Así, se observaron 4 subpoblaciones mótiles en todos los tratamientos (fresco y congelado-descongelado) y todas las congelabilidades (buenos, moderados y malos congeladores) estudiadas. La respuesta de la mayoría de los parámetros de motilidad estudiados después de la congelación-descongelación, fue muy diferente en el semen de los malos congeladores en comparación con los buenos congeladores. Además, en el estudio de la actividad mitocondrial se observó que las muestras de los malos congeladores eran las que presentaban una actividad mitocondrial más baja. Finalmente, en el tercer trabajo se estudió el efecto de la criopreservación sobre la función mitocondrial del espermatozoide porcino. Se evaluó la actividad mitocondrial juntamente con el ritmo de formación de ROS de origen mitocondrial, así como la expresión y la localización de dos proteínas importantes en la función mitocondrial, la mitofusina-2 (Mfn-2) y la actina. Se observó que tanto la actividad mitocondrial como la formación de ROS disminuían con la congelación con un descenso inicial en la refrigeración. Además también se observaron cambios en la expresión y localización tanto de la Mfn-2 como de la actina, que ya se hicieron aparentes en la fase de refrigeración. En conclusión, estos estudios han demostrado que la mayoría de los daños provocados por el proceso de congelación-descongelación se inician durante la refrigeración a 5 °C, siendo este paso muy importante para la supervivencia espermática. El proceso de congelación-descongelación provoca desestructuración nuclear, sin llegar a provocar el fraccionamiento nuclear, así como cambios en la estructura de subpoblaciones espermáticas mótiles, siendo estos cambios más evidentes en eyaculados con baja calidad en la congelación. Finalmente, la congelación-descongelación provoca una disminución de la actividad mitocondrial debida a cambios en la expresión y localización de proteínas que regulan la función mitocondrial.