[en] Glycolipids are products of high-added value due to their amphipathic properties, which endow them with a broad range of applications in the chemical (i.e., biosurfactants) and biomedical sectors (i.e., vaccine adjuvants). Depending on their lipidic moiety, glycolipids are classified in different families. If the lipid moiety is a ceramide or diacylglycerol, the glycolipids are known as glycosphingolipids or glycoglycerolipids respectively. While glycosphingolipids have shown to play essential roles in many biological processes, glycoglycerolipids (GGL) are interesting compounds due to their potential use as vaccine adjuvants or tumor suppressors. Although the interest of these compounds is very high, their applications are hampered by their low availability and high productions costs. Chemical synthesis requires complex protection and deprotection steps to achieve the desired regio- and stereospecificity of the glycosidic linkage, which consequently lower the yield and efficiency of the process. Therefore, we considered metabolic engineering as a potential strategy for the production of glycolipids and we aimed at building up a metabolic engineering platform in E. coli to achieve these complex structures of interest. In previous studies, our group reported that the glycolipid synthase MG517 from Mycoplasma genitalium was functional and glycoglycerolipids were obtained from UDP-glucose (UDP-Glc) and diacylglycerol (DAG). In addition, the first generation of engineered strains demonstrated that the availability of the DAG was the key bottleneck in GGL production (Mora-Buyé et al., 2012). In the present project, five different metabolic strategies were proposed to increase the production of GGL using E. coli. The first four strategies were aimed at increasing the available pool of the lipidic precursor, DAG. Thus, the first strategy was based on increasing DAG availability by removing competing reactions. To achieve so, different genes involved in the ß-oxidation and activation of fatty acids were knocked out (ΔtesA y ΔfadE) reporting an almost 2-fold production increase. The second strategy was based on increasing fatty acids availability by modulating different transcriptional factors (fabR y fadR). Although this strategy did not report an improvement of GGL yield, showed a change in the fatty acid profile with an increase of unsaturated fatty acids. The third strategy was based on increasing the conversion of acyl donors to phosphatidic acid, precursor of DAG, by overexpressing PlsC and PlsB acyltransferases. The fourth strategy was based on increasing diacylglycerol availability by overexpressing the fusion PlsCxPgpB protein that could redirect the flux to DAG or CDH promoting the hydrolysis of phospholipids. Among the different engineered strains, the ∆tesA strain co-expressing MG517 and a fusion PlsCxPgpB protein was the best producer, with a 350% increase of GGL titer compared to the parental strain expressing MG517 alone. Interestingly, the strains co-expressing CDH showed a shift in the GGL profile towards the diglucosylated lipid (up to 80% of total GGLs). Finally, a metabolic strategy was proposed to increase the availability of the other precursor, UDP-Glc. This fifth strategy was based on overexpressing GalU enzyme, which is responsible for the biosynthesis of UDP-Glc, and by removing the UDP-sugar diphosphatase encoding gene ushA. However, none of these modifications further improved the GGL titers. Finally, as it was also reported by our group that phosphatidylethanolamine was exchangeable in the membranes of E. coli by the new GGL compounds, a library of promoters and RBS was designed to decrease the production of this phospholipid trying at the same time to increase the production of glycolipids.

[es] Los glicolípidos son productos de alto valor debido a sus propiedades amfipáticas, que los dota en un amplio rango de aplicaciones en los sectores químicos (ej., biosurfactantes) o biomédicos (ej., adyuvante de vacunas). Dependiendo de la unidad lipídica que los forma, los glicolípidos son clasificados en diferentes familias. Si la unidad lipídica es una ceramida o diacilglicerol, los glicolípidos son conocidos como glicoesfingolípidos o glicoglicerolípidos (GGL) respectivamente. Mientras que los glicoesfingolípidos han demostrado jugar papeles clave en diversos procesos biológicos, los glicoglicerolípidos son compuestos interesantes debido a su potencial uso como adyuvantes de vacunas o supresores tumorales. Aunque el interés por estos compuestos es muy alto, su aplicación se ve obstaculizada por su baja disponibilidad y altos costes de producción. La síntesis química requiere de complejos pasos de protección y desprotección para conseguir la deseada regio- y estereoespecificidad del enlace glicosídico, que conlleva a una reducción del rendimiento y eficiencia del proceso. Por ello, consideramos la ingeniería metabólica como estrategia potencial para la producción de glicolípidos y nos centramos en construir una plataforma de ingeniería metabólica en E. coli para conseguir estas complejas estructuras de interés. En previos estudios, nuestro grupo reportó que la sintasa de glicolípidos MG517 de Mycoplasma genitalium era funcional y que glicoglicerolípidos podían ser obtenidos a partir de UDP-glucosa (UDP-Glc) y diacilglicerol (DAG). Adicionalmente, la primera generación de cepas modificadas demostró que la disponibilidad de DAG era limitante en la producción de GGL (Mora-Buyé et al., 2012). En el presente proyecto, cinco estrategias diferentes de ingeniería metabólica fueron propuestas para aumentar la producción de GGL en E. Coli. Las primeras cuatro estrategias se centraron en aumentar el pool del precursor lipídico, DAG. Para ello, la primera estrategia se basó en incrementar la disponibilidad de DAG a través de la eliminación de reacciones competitivas. Para lograrlo, se knockearon diferentes genes relacionados con la ß-oxidación y la activación de ácidos grasos (∆tesA y ∆fadE) reportando un incremento de casi el doble. La segunda estrategia se basó en incrementar la disponibilidad de ácidos grasos mediante la modulación de factores de transcripción (fabR y fadR). Aunque estrategia no reportó una mejora en el rendimiento de GGL, sí mostró un cambio en el perfil de los ácidos grasos con un incremento de los ácidos grasos insaturados. La tercera estrategia se basó en incrementar la conversión de los donadores de acilos a ácido fosfatídico, precursor del DAG, mediante la sobreexpresión de las aciltransferasas PlsC y PlsB. La cuarta estrategia se centró en aumentar la disponibilidad de diacilglicerol mediante la sobreexpresión de la proteína de fusión PlsCxPgpB capaz de redirigir el flujo de DAG, o CDH promoviendo la hidrólisis de fosfolípidos. Entre las diferentes cepas modificadas, la cepa ∆tesA coexpresando MG517 y la proteína de fusión PlsCxPgpB fue la mayor productora, con un incremento de los niveles de GGL del 350%, comparándola con la cepa parental expresando únicamente MG517. Interesantemente, las cepas coexpresando CDH mostraron un cambio en el perfil de GGL hacia el lípido diglucosilado (hasta el 80% del total del GGLs). Finalmente, una estrategia metabólica fue propuesta para aumentar la disponibilidad del otro precursor, UDP-Glc. La quinta estrategia se basó en la sobreexpresión de la enzima GalU, responsable de la biosíntesis de UDP-Glc, y la eliminación de la UDP-azúcar difosfatasa codificada por el gen ushA. Sin embargo, ninguna de estas modificaciones mejoró los niveles de GGL. Por último, tal y como reportó nuestro grupo que la fosfatidiletanolamina era intercambiable en las membranas de E. coli por los nuevos compuestos GGL, una librería de promotores y RBS fue diseñada para disminuir la producción de este fosfolípido intentando al mismo tiempo aumentar la producción de glicolípidos.