[en] Human ribonucleases are a heterogeneous group of proteins belonging to the superfamily of RNase A. These proteins are characterized by their ability to hydrolyse ribonucleic acids and the presence of antimicrobial activity against various pathogens including bacteria, fungi, parasites and viruses. The first objective of this doctoral study is focused on the antimicrobial characterization of native Ribonuclease 3 forms purified from eosinophils. Native forms present posttranslational modifications giving different glycosylation grades that modulate their activity during inflammatory processes. This study aims to establish the antimicrobial properties of native forms purified from eosinophils and their activity in a membrane model system. Results indicate that post-translational modifications contribute to the the protein biological activities, suggesting a related physiological role. As a second objective, we evaluated for the first time the antifungal activity of the antimicrobial RNase 3 and RNase 7 against Candida albicans, an eukaryotic pathogen selected as a simple model to test the antimicrobial mechanism of action. Both human ribonucleases displayed a high antifungal activity. Results highlighted a dual mechanism of action, where cell lysis takes place at high protein concentration, while depolarization, cell internalization and cellular RNA degradation is achieved at sublethal doses. Finally, the last objective is focused on the characterization of ribonuclease 8, also called the placental RNase, the most recent human ribonuclease described. RNase 8 has gained and lost one cysteine residue in non-conserved positions in a mechanism called "disulphide shuffling". The protein tendency to aggregate required the design of an alternative purification protocol. We analysed its antimicrobial abilities, suggesting a possible role in innate defence. The results of this study confirmed the high antimicrobial activity of several human ribonucleases from the RNase A superfamily suggesting an ancestral role in the host immune defence response. The study contributed to the understanding of their mechanism of action and set the basis for applied drug design.

[es] Las ribonucleases humanas son un grupo heterogéneo de proteínas pertenecientes a la superfamilia de la Ribonucleasa A. Estas proteínas se caracterizan por su capacidad de hidrolizar ácidos ribonucleicos y por la presencia de actividad antimicrobiana frente diversos organismos patógenos como bacterias, hongos, parásitos y virus. El primer objetivo del presente estudio doctoral se centra en la caracterización de la actividad antimicrobiana y en modelos de membrana de las formas nativas de la ribonucleasa 3 purificadas a partir de eosinófilos. Las distintas formas nativas presentan modificaciones postraduccionales dadas por diversos grados de glicosilación que se correlacionan con la activación de los eosinófilos durante los procesos inflamatorios. El estudio establece la capacidad antimicrobiana de las formas nativas y su actividad en modelos de membrana. Los resultados indican que las modificaciones postrasduccionales modulan la actividad biológica de la RNasa 3, sugiriendo una contribución in vivo en su función fisiológica. Como segundo objetivo de esta tesis, se evaluó por primera vez en nuestro grupo de investigación la actividad antimicótica de las ribonucleasas 3 y 7 frente al hongo Candida albicans, el cual fue elegido como modelo patógeno eucariota. Se determinó y caracterizó la presencia de actividad frente a Candida por parte de ambas ribonucleasas humanas. Por último, el tercer objetivo de esta tesis se centra en la purificación y caracterización de la ribonucleasa 8, la más reciente ribonucleasa humana descrita, identificada inicialmente en placenta. La RNasa 8 presenta un patrón inusual de enlaces disulfuro respecto a sus proteínas homólogas. Este cambio estructural modifica la estabilidad de la proteína y expone regiones que facilitan el proceso de agregación proteica. Fue necesaria la previa optimización de un protocolo alternativo de purificación. Se analizaron sus propiedades antimicrobianas, sugiriendo su posible participación en la respuesta inmunitaria innata. Los resultados del presente estudio corroboran las propiedades antimicrobianas de diversas ribonucleasas humanas miembros de la familia de la RNasa A, sugiriendo una función ancestral en el sistema de defensa innato. El estudio contribuye a la comprensión de su mecanismo de acción y plantea su potencial uso como herramientas terapéuticas.