[en] HYPERTENSION AND INFLAMATION: GENETIC POLYMORPHISMS ANALYSIS AND CLINICAL AND BIOLOGICAL CORRELATION 1. INTRODUCTION Human hypertension is an example of a complex, multifactorial, polygenic disease influenced by the genetic background although the underlying genetics components remain unknown. Polymorphisms in several genes have been associated with blood pressure levels. An accumulating body of evidence indicates that inflammation plays a pivotal role in the patho?genesis of cardiovascular disease and hypertension. An inflammatory expression pattern of endothelium is the main substrate underlying atherosclerotic lesions of vascular walls. Endothelial dysfunction along with unfavorable blood flow and hypercholesterolemia leads to the impairment of the vascular tone. Hypertension is associated with an increase in vascular inflammatory responses, which contributes to vascular dysfunction. The idea that hypertension and inflammation are linked emerges from cross sectional and prospective studies showing that circulating inflammatory molecules are increased in hypertensive patients, and their levels predict the onset of hypertension. Some cross-sectional studies showed that, compared to normotensives, the plasma levels of inflammatory markers, cytokines, chemokines, and adhesion molecules, are increased in patients with essential hypertension and no evidence of cardiovascular disease. This association has been also observed in patients with pre-hypertension. In fact, these subjects exhibit higher plasma levels of inflammatory markers compared to controls. It has been shown that hypertensive patients also have increased plasma soluble CD40L level and elevated CD40/CD40L expression on platelets. Furthermore in a prospective study was observed that among healthy men without hypertension those with high plasma levels of fibrinogen, ?1-antitrypsin, haptoglobin, ceruloplasmin and orosomucoid were at higher risk of becoming hypertensive. In particular, the risk of future hypertension was higher among subjects with a concomitant increase of more than three proteins, underlining the importance of the level of inflammation, more than the effect attributable to a single molecule. In the same way it has been shown, in a cohort of 20525 patients, that the levels of high-sensitive C reactive protein (CRP) predicted the development of hypertension, during a follow-up of 7.8 years. This association was independent of the baseline levels of systolic blood pressure and diastolic blood pressure and was also observed among those with very low initial blood pressure. This data has been confirmed, during a follow-up of 11 years, middle-aged men with CRP levels >3.0 mg/l are at increased risk of developing hypertension as compared to those with CRP <1.0 mg/l. Interestingly, they also observed that the association between the low-grade inflammatory condition and the risk of becoming hypertensive, remained statistically significant even after adjustment for features of the metabolic syndrome. However in the best of our knowledge there are only a few studies analyzing the association of polymorphisms in genes that encode inflammation molecules and hypertension. And there is no study analyzing this association with resistant hypertension. We therefore hypothesized that variations in polymorphisms in genes that encode inflammation molecules may modulate the susceptibility to hypertension and refractory hypertension. In the present study, we have analyzed IL10 -627 C>A, IL12B -1188 A>C, TNFA -238 G>A, TNFA -308G>A and CD40 -1 C>T polymorphisms in three different study groups (controls, hypertensive patients and refractory hypertension patients) involving a total of 440 subjects. 2. METHODS Design An observational case-control study was performed. Study Population After sample size calculation, we included in this study 50 resistant hypertension patients, 284 hypertensive patients and 160 sex and aged matched healthy controls. Hypertension was defined as resistant to treatment, or refractory, when a therapeutic plan that had included attention to lifestyle measures and the prescription of at least three drugs including a diuretic in adequate doses failed to achieve goal blood pressure (BP) (<140/90 mmHg or < 130/80 in diabetics). Hypertension population was defined as having a systolic/diastolic BP of >140/90 mm Hg or >130/80 mmHg in diabetics on 3 separate occasions but controlled after treatment during the follow-up. Normotensive subjects had a BP < 140/90 mm Hg or <130/80 mmHg in diabetics. All the hypertensive patients were controlled every month, and 24-hour ambulatory blood pressure monitoring was performed in the refractory group at least twice. We considered a patient as refractory to treatment if a blood pressure <140/90 mmHg or <130/80 mmHg in diabetics were never achieved. Target organ damage was determined by an echocardiogram, and a funduscopy. Treatment adherence was confirmed in all the patients with analytic control and adherence tests. All the patients were treated according to the recommendations of the Joint National Committee VII and European Society of Cardiology guidelines with full doses. Informed consent was obtained from all subjects before participation. The study was approved by the Ethical Committee of University of Salamanca and was in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. Measurements Blood pressure was measured in the resting state in duplicates or triplicates using a Hawksley random zero mercury sphygmomanometer with an appropriate cuff size and verified three times with a Omron Automatic Blood Pressure Monitor, Model #HEM-773AC. 24 h ambulatory blood pressure monitoring was measured using a MAPA SPACE-LABS modelo 90207, Spacelabs Inc, US. Measurements were performed early in the morning before drawing of blood samples and with the participant in a supine position with slightly elevated head. Laboratory methods DNA was extracted from whole blood using a QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). The presence of the studied alleles was determined by polymerase chain reaction ?restriction fragment length polymorphism analysis. For each analysis we used the previously reported primers. Digested samples were separated on a 3% ethidium bromide?stained agarose gels and visualized by UV transillumination. Statistical Analysis All genotype groups obeyed the Hardy?Weinberg equilibrium. Normally distributed parametric data are expressed as mean ? standard deviation, and compared with Student?s t-test. Chi Square or if appropriated Fisher exact test were applied to examine differences in allele frequencies between subjects. p < 0.05 was regarded as significant. Odds ratio and 95% confidence limits (OR 95% CI) were also calculated. All analyses were performed using Statistical Package for Social Science (SPSS) version 18.0. 3. RESULTS IL10 -627 C>A There were differences in the distribution of genotypes and alleles of the IL10 -627 C>A polymorphism between controls and hypertensive patients (p 0.005 OR 1.78 (1.19-2.64)). There were no differences between controlled hypertensive patients and resistant hypertension patients. No significant association was observed when we studied the distribution of IL10 -627 C>A genotypes and the mean value of inflammatory markers or target organ damage. IL12B -1188 A>C No significant association was observed when we studied the distribution of genotypes and alleles of the IL12B -1188 A>C polymorphism between resistant hypertensive and controlled hypertensive groups, and between controls and hypertensive patients. No significant association was observed when we studied the distribution IL12B -1188 A>C genotypes and the mean value of inflammatory markers or target organ damage. TNFA -238G>A No significant association was observed when we studied the distribution of genotypes and alleles of the TNFA -238G>A polymorphism between resistant hypertensive and controlled hypertensive groups, and between controls and hypertensive patients. No significant association was observed when we studied the distribution TNFA -238G>A genotypes and the mean value of inflammatory markers or target organ damage. TNFA-308 G>A No significant association was observed when we studied the distribution of genotypes and alleles of the TNFA-308 G>A polymorphism between controls and hypertensive patients. However there were differences in the distribution of genotypes and alleles of the TNFA-308 G>A polymorphism between controlled hypertensive patients and resistant hypertensive patients (p 0.02). No significant association was observed when we studied the distribution of TNFA-308 G>A genotypes and the mean value of inflammatory markers or target organ damage. CD40 -1C>T No significant association was observed when we studied the distribution of genotypes and alleles of the CD40 -1C>T polymorphism between resistant hypertensive and controlled hypertensive groups, and between controls and hypertensive patients. No significant association was observed when we studied the distribution CD40 -1C>T genotypes and the mean value of inflammatory markers or target organ damage. 4. CONCLUSIONS Main Objectives The population included in this study presents similar demographic features and cardiovascular risk factors profile to other populations described in Spain. The prevalence of left ventricular hypertrophy and retinopathy, as well as the number of antihypertensive drugs used and the pharmacological class of these drugs, are as expected for the type of population studied. There are differences in genotype distribution of polymorphisms of genes that encode inflammation molecules between hypertensive and non-hypertensive patients. There are differences in genotype distribution of polymorphisms of genes that encode inflammation molecules between hypertensive and resistant hypertensive patients. Secondary objectives Variations in IL10 -627C>A polymorphisms are associated with high blood pressure and variations in TNFA -308 G>A polymorphisms are associated to resistant hypertension. However, variations in IL12B -1188 A>C, TNFA -238G>A and CD40 -1C>T polymorphisms are associated neither to high blood pressure nor to resistant hypertension. There are no differences between controlled hypertensive patients and resistant hypertensive patients in the mean value of several inflammatory markers. In the same way there are no differences in the mean value of several inflammatory markers when patients are grouped by variations in IL10 -627 C>A, IL12B -1188 A>C, TNFA -238 G>A, TNFA -308G>A and CD40 -1 C>T polymorphisms. Mean values of inflammatory markers are not related to target organ damage. Variations in IL10 -627 C>A, IL12B -1188 A>C, TNFA -238 G>A, TNFA -308G>A and CD40 -1 C>T polymorphisms are not related to target organ damage.

[es] 1 . INTRODUCCI?N Hipertensi?n humana es un ejemplo de una enfermedad compleja y multifactorial , polig?nica influenciado por el fondo gen?tico aunque siguen siendo desconocidos los componentes gen?tica subyacente . Los polimorfismos en varios genes han sido asociados con niveles de presi?n arterial . Un cuerpo que acumulaba la evidencia indica que la inflamaci?n juega un papel fundamental en la g?nesis ? pato de la enfermedad cardiovascular y la hipertensi?n. Un patr?n de expresi?n inflamatoria del endotelio es el sustrato principal lesiones ateroscler?ticas subyacentes de las paredes vasculares . La disfunci?n endotelial junto con el flujo de sangre desfavorable y la hipercolesterolemia conduce a la alteraci?n del tono vascular . La hipertensi?n se asocia con un aumento en las respuestas inflamatorias vasculares , lo que contribuye a la disfunci?n vascular . La idea de que la hipertensi?n y la inflamaci?n est?n vinculados surge de estudios transversales y prospectivos transversales que muestran que circulan mol?culas inflamatorias aumentan en pacientes hipertensos , y sus niveles predicen la aparici?n de la hipertensi?n. Algunos estudios transversales mostraron que , en comparaci?n con los normotensos , los niveles plasm?ticos de los marcadores inflamatorios , citocinas , quimiocinas y mol?culas de adhesi?n , est?n aumentados en pacientes con hipertensi?n esencial y sin evidencia de enfermedad cardiovascular . Esta asociaci?n tambi?n se ha observado en pacientes con pre - hipertensi?n. De hecho , estos sujetos exhiben niveles plasm?ticos elevados de marcadores inflamatorios en comparaci?n con los controles. Se ha demostrado que los pacientes hipertensos tambi?n han aumentado de plasma nivel de CD40L soluble y expresi?n CD40/CD40L elevado en plaquetas . Adem?s, en un estudio prospectivo se observ? que entre los hombres sanos sin hipertensi?n aquellos con niveles plasm?ticos elevados de fibrin?geno, ?1 - antitripsina , la haptoglobina , ceruloplasmina y orosomucoide estaban en mayor riesgo de convertirse en hipertensos . En particular , el riesgo de hipertensi?n futuro fue mayor entre los sujetos con un aumento concomitante de m?s de tres prote?nas , lo que subraya la importancia del nivel de la inflamaci?n , m?s que el efecto atribuible a una ?nica mol?cula . De la misma manera se ha demostrado , en una cohorte de 20.525 pacientes , que los niveles de prote?na C reactiva de alta sensibilidad - (PCR ) predijeron el desarrollo de la hipertensi?n , durante un seguimiento de 7,8 a?os . Esta asociaci?n fue independiente de los niveles de referencia de la presi?n arterial sist?lica y la presi?n arterial diast?lica y tambi?n se observ? entre las personas con presi?n arterial inicial muy baja. Estos datos han sido confirmados , durante un seguimiento de 11 a?os, los hombres de mediana edad con niveles de PCR > 3,0 mg / l tienen un mayor riesgo de desarrollar hipertensi?n en comparaci?n con aquellos con PCR < 1,0 mg / l. Curiosamente, tambi?n observaron que la asociaci?n entre el estado inflamatorio de bajo grado y el riesgo de convertirse en hipertensos, se mantuvo estad?sticamente significativa incluso despu?s de ajustar por las caracter?sticas del s?ndrome metab?lico. Sin embargo, en lo mejor de nuestro conocimiento s?lo hay unos pocos estudios que analicen la asociaci?n de polimorfismos en los genes que codifican las mol?culas de la inflamaci?n y la hipertensi?n. Y no hay ning?n estudio que analiza esta asociaci?n con la hipertensi?n resistente . Por lo tanto, la hip?tesis de que las variaciones en los polimorfismos en los genes que codifican las mol?culas inflamatorias pueden modular la susceptibilidad a la hipertensi?n arterial y la hipertensi?n refractaria. En el presente estudio , hemos analizado IL10 -627 C> A, IL12B -1188 A> C , TNFA -238 G> A, TNFA - 308G > A y CD40 -1 C > T polimorfismos en tres grupos de estudio diferentes (controles , pacientes hipertensos y pacientes con hipertensi?n refractaria ) con un total de 440 sujetos. 2 . M?TODOS dise?o Se realiz? un estudio observacional de casos y controles . Poblaci?n de estudio Tras el c?lculo del tama?o de la muestra , se incluyeron en este estudio 50 pacientes resistentes a la hipertensi?n, 284 pacientes hipertensos y 160 del sexo y los controles sanos de edad avanzada. La hipertensi?n se define como resistente al tratamiento , o refractario , cuando un plan terap?utico que hab?a incluido atenci?n a las medidas de estilo de vida y la prescripci?n de al menos tres f?rmacos, incluyendo un diur?tico en dosis adecuadas no logr? alcanzar la presi?n arterial objetivo ( BP ) ( < 140/90 mmHg y < 130/80 en diab?ticos ) . Poblaci?n La hipertensi?n se define como tener una presi?n sist?lica / diast?lica de > 140 /90 mm Hg o > 130/80 mmHg en diab?ticos en 3 ocasiones distintas , pero controlada despu?s del tratamiento durante el seguimiento. Sujetos normotensos ten?an una presi?n arterial <140 /90 mm Hg o <130/80 mmHg en diab?ticos. Todos los pacientes hipertensos fueron controlados cada mes, y el monitoreo de la presi?n arterial ambulatoria de 24 horas se llev? a cabo en el grupo refractario al menos dos veces . Se consider? que un paciente como refractario al tratamiento si no se logra una presi?n arterial <140/90 mmHg o <130/80 mmHg en diab?ticos. Da?o a ?rganos diana se determin? mediante un ecocardiograma y un fondo de ojo . La adherencia al tratamiento fue confirmado en todos los pacientes con un control anal?tico y pruebas de adherencia. Todos los pacientes fueron tratados de acuerdo con las recomendaciones del Comit? Nacional Conjunto VII y la Sociedad Europea de Cardiolog?a con dosis completas . El consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos antes de la participaci?n. El estudio fue aprobado por el Comit? ?tico de la Universidad de Salamanca y estaba de acuerdo con los principios de la Declaraci?n de Helsinki. mediciones Se midi? la presi?n arterial en el estado de reposo por duplicado o triplicado utilizando un esfigmoman?metro de mercurio al azar Hawksley cero con un manguito de tama?o apropiado y verificada tres veces con un monitor de presi?n arterial Omron autom?tica , modelo # HEM- 773AC . 24 h monitorizaci?n ambulatoria de presi?n arterial se midi? utilizando un MAPA DE ESPACIO -LABS Modelo 90207 , Spacelabs Inc, EE.UU. . Las mediciones se realizaron por la ma?ana temprano antes de extraer las muestras de sangre y con el participante en posici?n supina, con la cabeza ligeramente elevada . m?todos de laboratorio Se extrajo ADN de sangre entera usando un kit QIAamp DNA Blood Mini ( Qiagen ) . La presencia de los alelos estudiados se determin? mediante la reacci?n en cadena de la polimerasa ? los fragmentos de restricci?n polimorfismo de longitud de an?lisis . Para cada an?lisis se utilizaron los cebadores se inform? anteriormente . Las muestras digeridas se separaron en un bromuro de etidio 3 % ? geles de agarosa te?idos y visualizados por transiluminaci?n UV. An?lisis estad?stico Todos los grupos de genotipos obedecieron el equilibrio de Hardy ? Weinberg. Datos param?tricos distribuci?n normal se expresan como media ? desviaci?n est?ndar , y se compararon con la prueba t de Student ?s . Chi Square o si se aplicara consign? prueba exacta de Fisher para examinar las diferencias en las frecuencias al?licas entre los sujetos . p < 0,05 fue considerado como significativo. Tambi?n se calcularon los odds ratio y el 95 % l?mites de confianza (OR IC del 95 % ) . Todos los an?lisis se realizaron utilizando el paquete estad?stico para Ciencias Sociales (SPSS ) versi?n 18.0 . 3 . RESULTADOS IL10 -627 C> A Hubo diferencias en la distribuci?n de los genotipos y alelos de la IL10 -627 C> Un polimorfismo entre los controles y los pacientes hipertensos (p 0,005 OR 1,78 ( 1,19-2,64 ) ) . No hubo diferencias entre los pacientes hipertensos controlados y pacientes con hipertensi?n resistentes . No se observ? una asociaci?n significativa cuando se estudi? la distribuci?n de IL10 -627 C > genotipos A y el valor medio de los marcadores de inflamaci?n o da?o a ?rganos diana . IL12B -1188 A> C No se observ? una asociaci?n significativa cuando se estudi? la distribuci?n de genotipos y alelos del polimorfismo de IL12B -1188 A> C entre hipertensos resistentes y grupos de hipertensos controlados , y entre los controles y los pacientes hipertensos. No se observ? una asociaci?n significativa cuando se estudi? la distribuci?n IL12B -1188 A > genotipos C y el valor medio de los marcadores de inflamaci?n o da?o a ?rganos diana . TNFA - 238g > A No se observ? una asociaci?n significativa cuando se estudi? la distribuci?n de genotipos y alelos del TNFA - 238g > Un polimorfismo entre hipertensos resistentes y grupos de hipertensos controlados , y entre los controles y los pacientes hipertensos. No se observ? una asociaci?n significativa cuando se estudi? la distribuci?n TNFA - 238g > genotipos A y el valor medio de los marcadores de inflamaci?n o da?o a ?rganos diana . TNFA -308 G> A No se observ? una asociaci?n significativa cuando se estudi? la distribuci?n de genotipos y alelos del TNFA -308 G> A polimorfismo entre los controles y los pacientes hipertensos. Sin embargo, hubo diferencias en la distribuci?n de los genotipos y alelos del TNFA -308 G> A polimorfismo entre los pacientes hipertensos controlados y en pacientes hipertensos resistentes (p 0.02 ) . No se observ? una asociaci?n significativa cuando se estudi? la distribuci?n de TNFA -308 G> genotipos A y el valor medio de los marcadores de inflamaci?n o da?o a ?rganos diana . CD40 - 1C > T No se observ? una asociaci?n significativa cuando se estudi? la distribuci?n de genotipos y alelos del CD40- 1c> T polimorfismo entre hipertensos resistentes y grupos de hipertensos controlados , y entre los controles y los pacientes hipertensos. No se observ? una asociaci?n significativa cuando se estudi? la distribuci?n de CD40 -1C > T genotipos y el valor medio de los marcadores de inflamaci?n o da?o a ?rganos diana . 4 . CONCLUSIONES Objetivos Principales La poblaci?n incluida en este estudio presenta las caracter?sticas demogr?ficas similares y los factores de riesgo cardiovascular perfil a otras poblaciones que se describen en Espa?a . La prevalencia de la hipertrofia ventricular izquierda y la retinopat?a , as? como el n?mero de f?rmacos antihipertensivos utilizados y la clase farmacol?gica de estos f?rmacos , son como se esperaba para el tipo de poblaci?n estudiada . Existen diferencias en la distribuci?n de los genotipos de los polimorfismos de los genes que codifican las mol?culas de inflamaci?n entre hipertensos y no hipertensos . Existen diferencias en la distribuci?n del genotipo de los polimorfismos de genes que codifican mol?culas de la inflamaci?n entre los pacientes hipertensos hipertensos y resistentes . Los objetivos secundarios Las variaciones en la IL10 - 627C > A polimorfismos est?n asociados con la presi?n y variaciones arterial en TNFA -308 polimorfismos G> A se asocian a la hipertensi?n resistente . Sin embargo , las variaciones en IL12B -1188 A> C , TNFA - 238g > A y CD40 -1C > T polimorfismos est?n asociados ni a la presi?n arterial alta ni hipertensi?n resistente . No hay diferencias entre los pacientes hipertensos controlados y los pacientes hipertensos resistentes en el valor medio de varios marcadores de inflamaci?n . De la misma manera que no hay diferencias en el valor medio de varios marcadores de inflamaci?n cuando los pacientes se agrupan por las variaciones en IL10 -627 C > A, IL12B -1188 A> C , TNFA -238 G> A , TNFA - 308G > A y polimorfismos CD40 -1 C> T. Los valores medios de los marcadores de inflamaci?n no est?n relacionados con lesi?n de ?rgano diana . Las variaciones en la IL10 -627 C> A, IL12B -1188 A> C , TNFA -238 G> A, TNFA - 308G > A y CD40 -1 C > T polimorfismos no est?n relacionados con lesi?n de ?rgano diana .