[ca] Els mitocondris necessiten mantenir un contingut en dNTPs adequat per a garantir els processos de replicació i reparació del mtDNA. Per tal d'assegurar la disponibilitat d'aquests dNTPs, les cèl·lules eucariotes disposen de dues vies anabòliques diferenciades: la síntesi de novo i la ruta de salvament. Les mutacions en gens nuclears que comporten una pertorbació de l'homeòstasi de dNTPs s'associen a defectes en el manteniment del mtDNA, donant lloc a alteracions en la seva quantitat i qualitat. Tradicionalment s'ha adoptat la idea que totes les espècies de dNTPs es troben en proporcions similars i principalment solubilitzades de forma lliure en la matriu mitocondrial, on són disponibles per a les polimerases i altres enzims que participen en els processos de replicació i reparació del mtDNA. No obstant això, nosaltres hem observat que el dGTP està significativament sobrerepresentat en comparació amb la resta de dNTPs en els mitocondris de cèl·lules humanes i de teixits de ratolí. A més, el dGTP hi apareix majoritàriament associat a proteïna, concretament al complex I de la cadena respiratòria, a través de la seva subunitat NDUFA10. NDUFA10 és una subunitat accessòria de complex I per a la qual no s'hi ha descrit una funció específica, però que resulta essencial per al correcte acoblament de l'holoenzim. No obstant això, la NDUFA10 comparteix el domini funcional dNK (domini dNK, PFAM PF01712) amb diverses les desoxirribonucleòsid quinases que participen a la ruta de salvament per a la síntesi de dNTPs, com ara la TK2, dCK o dGK, amb les quals també comparteix una alta identitat de seqüència. Tots aquests enzims catalitzen la fosforilació dels desoxirribonucleòsids utilitzant ATP com a donador de fosfat. Tanmateix, no s'ha descrit cap activitat quinasa associada a la NDUFA10 o al complex I. A partir dels resultats anteriors, vam generar diferents models experimentals per confirmar la unió del dGTP al complex I i aprofundir en l'estudi d'aquesta interacció. Mitjançant la introducció de mutacions dirigides a la NDUFA10 de línies cel·lulars humanes hem localitzat el lloc d'unió del dGTP dins el domini dNK de la proteïna. A més, hem determinat que aquesta unió és altament específica i estable i es dóna en una proporció estequiomètrica 1: 1. D'altra banda, hem generat un model murí amb les mateixes mutacions en el domini dNK de NDUFA10 que havíem introduït en cèl·lules humanes (Ndufa10E160A; R161A / E160A; R161A o NDUFA10KI). A diferència del que passa amb la proteïna humana, les mutacions introduïdes afecten l'estabilitat de la proteïna NDUFA10 murina, i en conseqüència a l'acoblament i funció del complex I. Els animals NDUFA10KI desenvolupen una cardiomiopatia hipertròfica que causa la seva mort entre les setmanes 25-30 de vida, probablement per una alteració greu de la funció oxidativa mitocondrial deguda a la desestabilització de NDUFA10 al cor. Curiosament, aquestes mutacions semblen tenir conseqüències diferents per a l'estabilitat de la proteïna i el complex I en funció de el teixit analitzat, afectant de forma més lleu al cervell. En qualsevol cas, la disrupció de la interacció NDUFA10-dGTP en els animals NDUFA10KI es tradueix en una dràstica reducció en el contingut mitocondrial de dGTP a tots els teixits estudiats, mentre que no s'observen efectes sobre la resta de dNTPs, el que ens permet confirmar in vivo que la interacció amb el dGTP es produeix a nivell del domini dNK de la NDUFA10. Com que afecta una proporció molt important del dGTP mitocondrial, la interacció descrita amb el complex I a través de la seva subunitat NDUFA10 podria suposar un nou mecanisme de control de la disponibilitat de dNTPs, la qual cosa suposa la primera relació directa descrita entre metabolisme oxidatiu i la síntesi de DNA.

[en] For the mitochondria it is essential to maintain a dNTP pool that is in an adequate quantity and proportion to guarantee mitochondrial DNA (mtDNA) replication and repair processes. In order to ensure the availability of these dNTPs, eukaryotic cells have two differentiated anabolic pathways: the de novo synthesis and the salvage pathway, both of which are tightly regulated. Mutations in nuclear genes that result in a disturbance of dNTPs homeostasis are associated with defects in mtDNA maintenance, leading to alterations in its quantity and quality, in what are known as mtDNA depletion and deletions syndromes. Traditionally, dNTPs are thought to be present in similar proportions, and mainly free-solubilized in the mitochondrial matrix, where they are available for polymerases and other enzymes that participate in mtDNA replication and repair processes. However, we have observed that dGTP is significantly overrepresented against the rest of dNTPs in mitochondria of human cells and mouse tissues. Furthermore, dGTP appears mostly associated with protein, specifically with complex I of the respiratory chain, through its subunit NDUFA10. NDUFA10 is an accessory subunit of complex I essential for the correct assembly of the holoenzyme with no other function so far described. However, NDUFA10 shares the functional dNK domain (pfam PF01712) with several of the deoxyribonucleoside kinases involved in the salvage pathway for the synthesis of dNTPs, such as TK2, dCK or dGK, with which it also shares a high sequence identity. All these enzymes catalyse the phosphorylation of deoxyribonucleosides using ATP as phosphate donor. However, no kinase activity has been found associated with NDUFA10 or complex I. Following the above results, we generated different experimental models in order to confirm the binding of dGTP to complex I and to further study this interaction. By introducing targeted mutations in NDUFA10 of human cell lines we have localized the dGTP binding site within the dNK domain of the protein. Furthermore, we have determined that this binding is highly specific and stable, and occurs at a stoichiometric ratio of 1:1. In addition, we have obtained a murine model with the same mutations in the dNK domain of NDUFA10 that we had introduced in human cells (Ndufa10E160A;R161A/E160A;R161A or NDUFA10KI). In contrast to what occurs with the human protein, the introduced mutations affect the stability of the murine NDUFA10 protein, and thereby the assembly and function of complex I. NDUFA10KI animals develop a fatal hypertrophic cardiomyopathy and die between 25-30 weeks of life, probably due to severe impairment of mitochondrial oxidative function as a consequence of NDUFA10 destabilization in the heart. Interestingly, these mutations appear to have different consequences for the stability of the protein and complex I depending on the analysed tissue, with the brain, for example, being less affected. In any case, disruption of the NDUFA10-dGTP interaction in NDUFA10KI animals results in a drastic reduction in the mitochondrial dGTP content in all studied tissues, whereas no effect on the other dNTPs is observed. These observations confirm that the interaction with dGTP occurs at the level of the dNK domain of NDUFA10 in vivo. Because it affects to such a large proportion of mitochondrial dGTP, the described interaction with complex I through its NDUFA10 subunit could represent a novel mechanism regulating dNTP availability and linking oxidative metabolism with DNA synthesis.