[en] ABSTRACT: Antibiotic resistance has become a pressing public health concern. The main mechanism for the dissemination of resistance genes is the horizontal transfer during conjugation. Hence, the search for conjugation inhibitors (COINs) is paramount in the fight against the spread of resistances. In this pursuit, only unsaturated fatty acids had been described as COINs. Here, we define 2-bromopalmitic acid (2-BP) as a specific COIN. 2-BP is a palmitate analog without any unsaturation in its aliphatic chain which acts as inhibitor of many membrane-associated enzymes. The carboxylic group of COINs is essential for its effectivity. However, inhibition is not due to the presence of double or triple bonds in these compounds but, indirectly, by the conformation COINs can acquire upon binding to their molecular target. We identify the VirB11 homolog in the conjugative plasmid R388, the traffic ATPase TrwD, as their molecular target. VirB11 form hexameric rings in which each monomer has a C-terminal catalytic region (CTD) and a N-terminal region that interacts with the cytoplasmic site of the membrane (NTD) connected both of them by a flexible linker. Biochemical and structural characterizations define a non-competitive inhibition where COINs bind to a pocket comprised by NTD and linker, preventing the pivoting movement of NTD over CTD which, in turn, result in a reduction of TrwD ATPase activity. Interestingly, COINs are liberally incorporated into bacterial membranes, replacing palmitic acid as the major component. We determine that TrwD binds palmitic acid, thus facilitating its interaction with the membrane. Altogether, our data suggest that COINs bind TrwD at a site that is otherwise occupied by palmitic acid, albeit they differ in the contacts involved in the interaction. As a result, COINs affect the interaction of TrwD with the membrane. For a further understand of the conjugative process, we visualized the process in real time using fluorescent protein fusions to the main players in the conjugative system. Localization of the proteins suffers dramatic changes in the presence or absence of the rest of the component of the Type IV secretion system (T4SS). Moreover, by using fluorescent constructs of SeqA, a probe that binds hemimethylated DNA, we have found, surprisingly, that more than one event of conjugation takes place at a particular time. Additionally, we identify the formation of a weak complex between TrwD and the relaxase TrwC. TrwD presents structural homology to chaperones of the ClpB/Hsp 104 family, hence TrwD could play a chaperone activity during the transport of the pilot protein TrwC. In short, our results do not only contribute to a better understanding of VirB11 proteins and the conjugative process but also may open a new avenue for the rational design of more potent and effective drugs to control dissemination of antibiotic resistance genes.

[es] RESUMEN: La resistencia a los antibióticos se ha convertido en un problema apremiante de salud pública. El mecanismo principal para la diseminación de genes de resistencia es la transferencia horizontal durante la conjugación. Por lo tanto, la búsqueda de inhibidores de la conjugación (COINs) es primordial en la lucha contra la propagación de resistencias. En esta búsqueda, sólo los ácidos grasos insaturados habían sido descritos como COINs. Aquí, definimos el ácido 2-bromopalmítico (2-BP) como COIN específico. 2-BP es un análogo del palmitato sin ninguna insaturación en su cadena alifática que actúa como inhibidor de muchas enzimas asociadas a la membrana. El grupo carboxílico de los COINs es esencial para su efectividad. Sin embargo, la inhibición no se debe a la presencia de enlaces dobles o triples en estos compuestos sino, indirectamente, a la conformación que pueden adquirir al unirse a su diana molecular. Identificamos el homólogo de VirB11 en el plásmido conjugativo R388, la ATPasa TrwD, como su diana molecular. VirB11 forma anillos hexaméricos en los que cada monómero tiene una región catalítica C-terminal (CTD) y una región N-terminal que interactúa con el lado citoplasmático de la membrana (NTD) ambas regiones están conectadas a través de una región flexible denominada linker. Caracterizaciones bioquímicas y estructurales definen una inhibición no competitiva, donde los COINs se unen a un bolsillo situado entre el NTD y el linker, previniendo el movimiento pivotante del NTD sobre el CTD, lo que resulta en una reducción de la actividad ATPasa de TrwD. Curiosamente, los COINs son incorporados a las membranas bacterianas, reemplazando al ácido palmítico como principal componente. Hemos determinado que TrwD se une al ácido palmítico, lo que facilita su interacción con la membrana. En conjunto, nuestros datos sugieren que los COINs se unen a TrwD en un sitio que de otra manera estaría ocupado por el ácido palmítico, aunque difieren en los contactos involucrados durante la interacción. Como resultado, los COINs afectan a la interacción de TrwD con la membrana. Para una mayor comprensión del proceso conjugativo, visualizamos el proceso a tiempo real utilizando proteínas de fusión fluorescentes para los principales componentes del sistema. La localización de las proteínas sufre drásticos cambios en presencia o ausencia del resto del componente del sistema de secreción tipo IV (T4SS). Además, usando construcciones fluorescentes de SeqA, una sonda que se une al ADN hemimetilado, hemos encontrado, sorprendentemente, que pueden producirse simultáneamente más de un evento conjugativo. También identificamos la formación de un complejo débil entre TrwD y la relaxasa TrwC. TrwD presenta homología estructural con los chaperones de la familia ClpB / Hsp 104, por lo que podría desempeñar una actividad de chaperona durante el transporte de la proteína piloto TrwC. En resumen, nuestros resultados no sólo contribuyen a una mejor comprensión de las proteínas VirB11 y el proceso conjugativo, sino que también pueden abrir una nueva vía para el diseño racional de fármacos más potentes y eficaces para controlar la diseminación de genes de resistencia a antibióticos.