[en] p24 proteins constitute a family of small (~ 24kDa) type-I transmembrane proteins which localize to the compartments of the early secretory pathway, including coated protein (COP) I- and COPII-coated vesicles, which mediate the bidirectional transport between the ER and the Golgi apparatus. Based on sequence homology, p24 proteins can be classified into four subfamilies: p24α, p24β, p24γ and p24δ. In contrast to animals and fungi, in plants there are only members of p24β and p24δ subfamilies. In particular, Arabidopsis contains 9 members of the p24δ subfamily which can be divided into two subclasses, δ-1 (p24δ3-p24δ6) and δ-2 (p24δ7-p24δ11), and 2 members of the p24β subfamily. Since p24 proteins cycle between the ER and the Golgi apparatus, they have been proposed to function as putative cargo receptors and to be involved in quality control during protein transport in the early secretory pathway, the organization of ER export sites or the biogenesis and maintenance of the Golgi apparatus. However, their functions in plants are essentially unknown. The main aim of this work has been the functional characterization of p24 proteins of the p24δ subfamily in Arabidopsis. To this end, two different approaches have been followed. On the one hand, quadruple knockout (KO) mutants of both p24δ-1 (p24δ3δ4δ5δ6 mutant) and p24δ-2 (p24δ7δ8δ9δ10 mutant) subclasses were obtained. The p24δ3δ4δ5δ6 and p24δ7δ8δ9δ10 mutant did not show phenotypic alterations when they were grown under standard growth conditions, suggesting that p24 proteins from the delta subfamily are not necessary for growth under these conditions in Arabidopsis. The analysis of the levels of p24 proteins in both quadruple mutants showed a decrease in the levels of other p24 proteins, which may be due to a decrease in protein stability and not to a decrease in mRNA levels, suggesting that these p24 proteins may function together in heteromeric complexes. In addition, a possible alteration in the compartments of the early secretory pathway was investigated. It was found that loss of p24δ-1 or p24δ-2 proteins produce alterations mainly in the Golgi apparatus. These data suggest that p24 proteins of the delta subfamily are involved in the maintenance of the structure and organization of the compartments of the early secretory pathway in Arabidopsis. Moreover, the effect of the loss of p24δ proteins in the transport of the K/HDEL receptor ERD2 and a K/HDEL ligand, the chaperone BiP, was also investigated. It was found that loss of p24δ proteins induced the accumulation of the K/HDEL receptor ERD2a-YFP at the Golgi apparatus. This effect was reversed by co-expression of either p24δ5 (δ-1 subclass) or p24δ9 (δ-2 subclass) or of a K/HDEL ligand. In addition, loss of p24δ proteins induced secretion of BiP, probably due to an inhibition of COPI-dependent retrograde Golgi-to-ER transport of ERD2 and, in consequence, in the retrieval of K/HDEL ligands. Finally, it was found that both p24 quadruple mutants show a constitutive activation of the UPR pathway, which may act as a compensatory mechanism that helps the plant to cope with the transport defects in the absence of p24 proteins. Indeed, an increase of the membrane association of several COPI and COPII subunits was observed in both quadruple mutants. In addition, loss of p24δ-1 and p24δ-2 proteins produced the up-regulation of SEC31A, a gene involved in the formation of COPII vesicles. On the other hand, it was investigated whether Arabidopsis p24 proteins from the delta-1 subclass are glycosylated and if this glycosylation may have functional implications, in particular with respect to their role in sorting ERD2 within COPI vesicles for retrieval of K/HDEL ligands from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum. It was found that a member of the p24δ-1 subclass, p24δ5, is N-glycosylated in its GOLD domain, in contrast to p24δ9, a member of the p24δ-2 subclass. The N-glycosylation of p24δ5 is not required for its steady-state localization at the endoplasmic reticulum, but it is important for its interaction with the K/HDEL receptor ERD2a and for retrograde transport of ERD2a and K/HDEL ligands from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum.

[es] Las proteínas p24 constituyen una familia de pequeñas (~24kDa) proteínas transmembrana de tipo-1 que localizan en los compartimentos de la vía secretora temprana, incluyendo las vesículas recubiertas de proteínas COP (Coat protein) I y COPII, implicadas en el transporte bidireccional entre el retículo endoplasmático ("endoplasmic reticulum", ER) y el aparato de Golgi. En función de la homología de sus secuencias, las proteínas p24 pueden ser clasificadas en cuatro subfamilias: p24α, p24β, p24γ y p24δ. A diferencia de animales y levaduras, en plantas solo hay miembros de las subfamilias p24β y p24δ. En particular, Arabidopsis contiene 9 miembros de la subfamilia p24δ, los cuales se pueden dividir en dos subclases, δ-1 (p24δ3-p24δ6) y δ-2 (p24δ7-p24δ11), y 2 miembros de la subfamilia p24β. A partir de su transporte bidireccional entre el ER y el aparato de Golgi, se ha propuesto que las proteínas p24 funcionan como posibles receptores de cargo y que están implicadas en el control de calidad durante el transporte de proteínas en la vía secretora temprana, la organización de los sitios de salida del ER ("ER export sites", ERES) y la biogénesis y mantenimiento del aparato de Golgi. El objetivo principal de la presente Tesis doctoral ha sido la caracterización funcional de las proteínas de la subfamilia p24δ en Arabidopsis. Para ello se han seguido dos aproximaciones diferentes. Por un lado se han obtenido los mutantes cuádruples nulos de ambas subclases, p24δ-1 (mutante p24δ3δ4δ5δ6) y p24δ-2 (mutante p24δ7δ8δ9δ10). Los mutantes p24δ3δ4δ5δ6 y p24δ7δ8δ9δ10 no mostraron alteraciones fenotípicas cuando fueron crecidos bajo condiciones estándar de crecimiento, lo que sugiere que las proteínas p24 de la subfamilia δ no son necesarias para el crecimiento bajo esas condiciones en Arabidopsis. El análisis de los niveles de proteínas en ambos cuádruples mutantes mostró una disminución en los niveles de otras proteínas p24, lo cual puede ser debido a una disminución de la estabilidad de dichas proteínas y no a una disminución de los niveles de mRNA, sugiriendo que esas proteínas p24 pueden funcionar formando complejos heteroméricos. Además, se investigó una posible alteración de los compartimentos de la vía secretora temprana. Se encontró que la pérdida de las proteínas p24δ-1 o p24δ-2 produce alteraciones principalmente en el aparato de Golgi. Esos datos sugieren que las proteínas p24 de la subfamilia δ están implicadas en el mantenimiento de la estructura y organización de los compartimentos de la vía secretora temprana en Arabidopsis. Además, se investigó el efecto de la pérdida de las proteínas p24δ en el transporte del receptor K/HDEL, ERD2, y de un ligando K/HDEL, la chaperona BiP. Se encontró que la pérdida de las proteínas p24 induce la acumulación del receptor ERD2a-YFP en el aparato de Golgi. Este efecto fue revertido mediante la co-expresión de p24δ5 (subclase δ-1) o de p24δ9 (subclase p24δ-2) o de un ligando K/HDEL. Además, la pérdida de proteínas p24δ induce la secreción de BiP, probablemente debido a una inhibición en el transporte retrógrado desde el aparto de Golgi hasta el ER de ERD2 mediado por vesículas COPI y, por tanto, en la recuperación de los ligandos K/HDEL. Finalmente se encontró que ambos mutantes cuádruples presentan una activación constitutiva de la respuesta a proteínas desplegadas ("unfolded protein response", UPR), la cual puede actuar como mecanismo de compensación que ayuda a la planta a hacer frente a los defectos en el transporte en ausencia de las proteínas p24. De hecho, se observó un aumento de la asociación a membrana de varias subunidades COPI y COPII en ambos cuádruples mutantes. Además, la pérdida de proteínas p24δ-1 o p24δ-2 produjo un incremento en la expresión de SEC31, un gen implicado en la formación de vesículas COPII. Por otro lado, se investigó si las proteínas p24 de la subclase δ-1 en Arabidopsis se encuentran glicosiladas y si está glicosilación puede tener implicaciones funcionales, en particular respecto a su papel en la inclusión de ERD2 dentro de vesículas COPI para la recuperación de ligandos K/HDEL desde el aparato de Golgi hasta el retículo endoplasmático. Se encontró que un miembro de la subclase p24δ-1, p24δ5, es N-glicosilado en su domino GOLD, a diferencia de p24δ9, un miembro de la subclase p24δ-2. La N-glicosilación de p24δ5 no es necesaria para su localización en el ER en el estado estacionario, pero es importante para su interacción con el receptor K/HDEL, ERD2a, y para el transporte retrógrado de ERD2a y ligandos K/HDEL desde el aparato de Golgi hasta el ER.