[en] The bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) is an aquatic mammal widely known for its social behavior and global distribution in the seas and oceans. However, its natural habitat faces serious threats, primarily due to human activity, such as water pollution, overexploitation of resources, and illegal fishing. Additionally, global warming is leading to a reduction in the fish that make up the daily diet of these dolphins, requiring greater physiological resources to obtain food. In addition to their presence in their natural habitat, bottlenose dolphins are commonly housed in zoos and aquariums worldwide. This poses the challenge of maintaining genetic variability in these captive populations to avoid inbreeding. In 2017, the International Union for Conservation of Nature (IUCN) classified the bottlenose dolphin as vulnerable, limiting its movement between countries. This has highlighted the need to exchange semen samples between conservation centers for this species. Therefore, assisted reproduction techniques (ARTs) have become of great interest in the conservation of this species and other cetaceans. The overall objective of this doctoral thesis has been to analyze the seminal characteristics and sperm functionality of the bottlenose dolphin through the study of its conservation, morphometry, and protein composition. To achieve this purpose, three male bottlenose dolphins were used, all sexually mature, residing at the Oceanogràfic of Valencia, Spain. Previously, keepers and veterinarians had trained these animals to collaborate in obtaining seminal samples in a non-invasive way, based on the voluntary willingness of the dolphins. In Article 1, experiments were conducted to develop a sperm cooling method that allows the viability of sperm to be maintained for several days, thus facilitating the exchange of samples between centers for artificial insemination programs. The results indicated that bottlenose dolphin semen can be refrigerated for at least 7 days, maintaining sperm functionality, especially at a temperature of 5°C and a concentration of 100x106 spermatozoa/ml, while preserving the microbiological quality of semen samples. In Article 2, the morphometric characteristics of bottlenose dolphin sperm were analyzed. Principal component analysis (PCA) revealed that four principal components (PCs) represented more than 91% of the accumulated variance determined by the 13 morphometric parameters of the analyzed sperm, with PC1 providing the highest explained variance (47.21%), followed by PC2 (25.65%), PC3 (11.17%), and PC4 (7.72%). Mainly, two sperm subpopulations with differences between individuals were identified, and correlations were established between sperm morphometry and blood testosterone levels. Furthermore, it was observed that the main morphometry differences were due to storage time and not storage temperature. In Article 3, an inventory of proteins in semen was provided for the first time in a cetacean. A total of 722 different proteins were identified, with 419 of them belonging to sperm and 303 to seminal plasma, of which 111 proteins were common to both sperm and seminal plasma. These protein profiles were compared to those of other species (human, bovine, canine), revealing common proteins among them. In conclusion, this study has provided valuable information about the conservation and sperm characteristics of the bottlenose dolphin, including morphometric and protein aspects. These findings are not only essential for the conservation of this species but also have implications for improving ARTs in aquatic mammals in general.

[es] El delfín mular (Tursiops truncatus) es un mamífero acuático ampliamente conocido por su comportamiento social y su distribución global en los mares y océanos. Sin embargo, su hábitat natural se enfrenta a graves amenazas, principalmente debido a la actividad humana, como la contaminación de las aguas, la sobreexplotación de los recursos y la pesca ilegal. Así mismo, el calentamiento global está llevando a una reducción de los peces que conforman la dieta diaria de estos delfines, lo que requiere un mayor gasto de recursos fisiológicos para obtener alimento. Además de su presencia en su hábitat natural, el delfín mular es comúnmente alojado en zoológicos y acuarios en todo el mundo. Esto plantea el desafío de mantener la variabilidad genética en estas poblaciones en cautiverio para evitar la consanguineidad. En 2017, la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) clasificó al delfín mular como vulnerable, lo que ha limitado su movimiento entre países. Esto ha destacado la necesidad de intercambiar muestras seminales entre centros para la conservación de esta especie. Por lo tanto, las técnicas de reproducción asistida (TRAs) se han tornado de gran interés en la conservación de esta especie y otros cetáceos. El objetivo general de la presente tesis doctoral ha sido analizar las características seminales y la funcionalidad espermática del delfín mular a través del estudio de su conservación, morfometría y composición proteica. Para alcanzar este propósito, se emplearon tres delfines mulares machos, todos maduros sexualmente, que residían en el Oceanogràfic de Valencia en España. Previamente, el personal de cuidadores y veterinarios especializados había entrenado a estos animales para colaborar en la obtención de muestras seminales de manera no invasiva, basándose en la disposición voluntaria de los propios delfines. En el Artículo 1, se llevaron a cabo experimentos para desarrollar un método de refrigeración espermática que permita mantener la viabilidad de los espermatozoides durante varios días, facilitando así el intercambio de muestras entre centros para programas de inseminación artificial. Los resultados indicaron que el semen de delfín mular puede refrigerarse durante al menos 7 días, manteniendo la funcionalidad de los espermatozoides, especialmente a una temperatura de 5°C y una concentración de 100x106 espermatozoides/ml, manteniendo la calidad microbiológica de las muestras seminales. En el Artículo 2, se analizaron las características morfométricas de los espermatozoides de delfín mular. El análisis de componentes principales (PCA) reveló que cuatro componentes principales (PC) representaron más del 91% de la varianza acumulada determinados por los 13 parámetros morfométricos de los espermatozoides analizados, siendo PC1 el que proporcionó la mayor varianza explicada (47.21%), seguido por PC2 (25.65%), PC3 (11.17%) y PC4 (7.72%). Se identificaron principalmente dos subpoblaciones espermáticas con diferencias entre individuos, y se establecieron correlaciones, tanto positivas como negativas, entre la morfometría de los espermatozoides y los niveles de testosterona en sangre. Además, se observó que las principales diferencias morfométricas se debieron al tiempo de almacenamiento y no a la temperatura de almacenamiento. En el Artículo 3, se proporcionó un inventario de proteínas en el semen por primera vez en un cetáceo. Se identificaron un total de 722 proteínas diferentes perteneciendo 419 de ellas a los espermatozoides y 303 al plasma seminal, de las cuales 111 proteínas fueron comunes a ambos, espermatozoides y plasma seminal. Se compararon estos perfiles proteicos con el de otras especies (humano, bovino, canino), revelando proteínas comunes entre ellas. En conclusión, este estudio ha proporcionado una valiosa información sobre la conservación y características espermáticas del delfín mular, incluyendo aspectos morfométricos y proteicos. Estos hallazgos no solo son fundamentales para la conservación de esta especie, sino que también tienen implicaciones para mejorar las TRAs en mamíferos acuáticos en general.