[en] Recent advances in ribosome profiling, peptidomics and bioinformatics have revealed that many genomic regions previously misannotated as non-protein-coding actually code for evolutionarily conserved small proteins. These proteins, smaller that 100 amino acids in length, have been called microproteins, micropeptides or SEPs (small-ORF encoded polypeptides). To date, only few of them have been functionally characterised but they have been revealed as a new class of molecular regulators with crucial functions in many cellular processes, such as RNA splicing, DNA repair and mitochondrial metabolism. These surprising discoveries have opened a new field of study, with thousands of microproteins with clinical potential waiting to be characterised. Cellular plasticity is the ability of cells to change their original identity and transit between distinct cell states. It is known to be a fundamental property for embryonic development and tissue regeneration, but it has become clear that cellular plasticity is also crucial for cancer cells, which hijack this process to increase their adaptative capacity. In this doctoral thesis, we aimed to identify and characterise novel microproteins as regulators of cancer cell plasticity. Using a bioinformatic pipeline, we have identified MIDORI, a microprotein conserved across evolution encoded by ZEB2-AS1, a gene misannotated as a long non-coding RNA (lncRNA). ZEB2-AS1 is known to be upregulated by TGFβ signalling and it is required for the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Indeed, we have observed that MIDORI protein expression increases upon TGFβ as well as upon genotoxic and ER stress. Surprisingly, we demonstrate that MIDORI downregulates the mesenchymal transcriptional programme in many cell types and blocks the induction of EMT. Next, we analysed the role of MIDORI in several processes related with EMT. In breast cancer cells, MIDORI promotes the establishment of cell-to-cell junctions, impairs the secretion of proinflammatory cytokines and reduces cell migration and invasion in vitro. Moreover, MIDORI overexpression impairs metastatic colonization in vivo. Mechanistically, we have shown that MIDORI reduces the activation of the TGFβ effectors SMAD2, ERK1/2 and NF-kB. We have identified MYBBP1A, a NF-kB co-repressor, as a MIDORI interactor, suggesting that MIDORI could be blocking EMT by transcriptional regulation. In agreement with the role of MIDORI in cancer cells, our studies have also revealed that MIDORI enhances the reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem cells (iPSCs), a process known to require a mesenchymal-to-epithelial transition (MET). Of note, the conditioned medium of MIDORI-overexpressing MEFs is enough to promote cellular reprogramming, suggesting the MIDORI enhances reprogramming in a cell extrinsic manner. Importantly, we have found that endogenous MIDORI is transiently expressed at the early stages of reprogramming, when MET takes place, and MIDORI deficiency drastically decreases reprogramming efficiency. Interestingly, we have observed that MIDORI-deficient MEFs display a dysregulated transcriptional dynamics of EMT-related genes and upregulate p16INK4A and p19ARF tumour suppressor genes during the reprogramming process. Indeed, MIDORI-deficient MEFs are prone to enter cellular senescence and MIDORI overexpression decrease the onset of senescence during reprogramming, suggesting that MIDORI regulates in vitro reprogramming -at least in part- by regulating the onset of cellular senescence. Altogether, in this work we have identified MIDORI, a novel microprotein that is expressed upon stress and acts as an effector of a negative feedback loop that shuts down the mesenchymal programme to revert EMT. Consistently, MIDORI reduces metastasis of breast cancer cells and improves cellular reprogramming to iPSCs. Our data shed light in the regulation of the epithelial-mesenchymal plasticity and uncover a potential new target for regenerative medicine and cancer therapy.

[es] Avances recientes en las técnicas de perfilado de ribosomas, peptidómica y análisis bioinformático han desvelado que muchas regiones genómicas que fueron anotadas como no codificantes en realidad codifican proteínas pequeñas conservadas evolutivamente. Estas proteínas, de menos de 100 aminoácidos de longitud, se han denominado microproteínas, micropéptidos o SEP (de small-ORF encoded polypeptides). A día de hoy, solo unos pocos se han caracterizado funcionalmente, pero se han revelado como una nueva clase de reguladores moleculares con funciones cruciales en muchos procesos celulares, como el empalme del ARN, la reparación del ADN y el metabolismo mitocondrial. Estos sorprendentes descubrimientos han abierto un nuevo campo de estudio, con miles de microproteínas con potencial clínico a la espera de ser caracterizadas. La plasticidad celular es la capacidad de las células de cambiar su identidad y transitar entre distintos estados celulares. Se sabe que es una propiedad fundamental para el desarrollo embrionario y la regeneración de tejidos, pero ya ha quedado claro que la plasticidad celular también es crucial para las células tumorales, que se aprovechan de este proceso para aumentar su capacidad de adaptación. En esta tesis doctoral nos planteamos como objetivo principal identificar y caracterizar nuevas microproteínas reguladoras de la plasticidad en células tumorales. Usando un algoritmo bioinformático hemos identificado MIDORI, una microproteína conservada a lo largo de la evolución codificada por ZEB2-AS1, un gen mal anotado como un ARN largo no codificante (lncRNA). ZEB2-AS1 se transcribe por la señalización de TGFβ y es necesario para la transición epitelio-mesénquima (EMT). De hecho, hemos observado que la expresión de MIDORI aumenta con TGFβ, así como con estrés genotóxico y ER. Sorprendentemente, nuestros datos demuestran que MIDORI regula negativamente el programa de transcripción mesenquimal en muchos tipos celulares y bloquea la inducción de EMT. Hemos analizado el papel de MIDORI en varios procesos relacionados con la EMT. En células de cáncer de mama, MIDORI induce la formación de uniones adherentes, reduce la secreción de citoquinas pro-inflamatorias, y reduce la migración y la invasión celular in vitro. Mas aún, MIDORI es capaz de inhibir la colonización metastásica in vivo. A nivel de mecanismo, hemos observado que MIDORI reduce la activación de los efectores de la vía del TGFβ SMAD2, ERK1/2 y NF-kB, y que interactúa con MYBBP1A, un represor transcripcional de NF-kB, lo que sugiere que MIDORI podría estar bloqueando la EMT mediante la regulación de la transcripción. En línea con el papel de MIDORI en las células cancerosas, nuestros estudios también han revelado que MIDORI mejora la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) a células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), un proceso que requiere una transición mesénquima-epitelial (MET). El medio acondicionado de MEFs que sobreexpresan MIDORI promueve también la reprogramación celular, lo que sugiere que MIDORI mejora la reprogramación de una manera extrínseca. Además, hemos descubierto que MIDORI endógeno se expresa en las primeras etapas de la reprogramación, cuando se produce MET, y su deficiencia reduce drásticamente la eficiencia de la reprogramación. Mas aún, hemos observado que los MEFs deficientes en MIDORI muestran una dinámica transcripcional desregulada de genes relacionados con EMT y un aumento en la expresión de los genes supresores de tumores p16INK4A y p19ARF durante la reprogramación. De hecho, los MEFs deficientes en MIDORI son propensos a entrar en senescencia celular, lo que sugiere que MIDORI regula la reprogramación, al menos en parte, al regular la entrada en senescencia celular. En resumen, en este trabajo hemos identificado MIDORI, una nueva microproteína inducida por estrés que actúa como efector de un circuito de retroalimentación negativa que revierte la EMT. Nuestros datos arrojan luz sobre la regulación de la plasticidad epitelio-mesenquima y descubren una potencial diana terapeutica.