[en] SUMMARY Mycotoxins are toxic metabolites produced by certain fungal species, which can contaminate a wide range of food and raw materials under specific environmental conditions. Among mycotoxins, aflatoxin B1 (AFB1) and ochratoxin A (OTA) are some of the most toxic and studied. In order to contextualize the knowledge generated in recent years on AFB1 and OTA toxicity in cell and animal models, a literature review was performed focusing on techniques such as immunofluorescence and flow cytometry. It was revealed that flow cytometry was mainly used in the evaluation of apoptosis and oxidative stress while immunofluorescence in the detection of genetic, epigenetic and metabolic alterations. The most commonly used cell line for in vitro assays was HepG2, followed by HEK-293T and PK-15. As for in vivo studies, laboratory animals with the highest number of assays were chickens and rats, while the main target organs analyzed were thymus, bursa of Fabricius and spleen. The main focus of the research was on immune toxicity, nephrotoxicity, and hepatotoxicity. Several bioactive compounds contained in pumpkin (P) and fermented milk whey (FW) have shown a potential application in the mitigation of mycotoxin-induced toxicity due to their antioxidant and anti-inflammatory properties. To gain insight into the possible neuroprotective and immune protective role of P and FW, several molecular and omics assays were carried out to investigate the possible effects of these functional ingredients against AFB1 and OTA in human neuronal cells and T lymphocytes. The analysis of neuronal differentiation in vitro showed that OTA treatment was the most detrimental not only by repressing neuronal biomarkers expression but also by arresting the cell cycle at G0/G1 phase. It has been also observed less marked results after exposure to AFB1 and the mixture of mycotoxins, suggesting their possible antagonistic effect. However, the addition of P and FW restored biomarker levels similar to the control and modulated both cell cycle alterations and mycotoxin-promoted gene expression changes. The results of RNA sequencing performed on a human T lymphocyte cell line revealed that AFB1 mainly altered the ataxia telangiectasia mutated signaling pathway, indicating possible DNA damage and alterations in its repair mechanisms. Conversely, OTA exposure activated glycolysis pathway, suggesting a possible reprogramming of energy metabolism toward anaerobiosis. In combination, AFB1 and OTA activated ferroptosis, a type of programmed necrosis with lipid peroxidation and repression of glutathione peroxidase 4 antioxidant enzyme activity. Transcriptomic analysis in Jurkat immune cells exposed to a digested bread extract prepared with mycotoxins and P-FW mixture showed that AFB1 and OTA promoted a clear proinflammatory response in vitro by activating eicosanoid and interferon gamma signaling pathways. Nevertheless, the presence of functional ingredients not only attenuated the overexpression of proinflammatory genes but also the induction of factors and metabolic pathways, strictly related to inflammation. To assess the effects of FW against AFB1 and OTA hepatotoxicity and nephrotoxicity in vivo using Wistar rats, the gene expression of biological biomarkers such as carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1) and kidney injury molecule 1 (KIM-1) was analyzed by quantitative real-time PCR and droplet digital PCR. The results of CPS1 relative and absolute quantification showed that in the liver of male rats, AFB1 was the most toxic exposure by repressing CPS1 gene expression, which was totally reversed upon FW administration. In females, mycotoxin-induced damage as well as the hepatoprotective effect of FW were less evident. In the kidney of male and female rats, OTA exposure was the most damaging by increasing KIM-1 gene expression to a greater extent than other conditions. However, the absolute KIM-1 quantification showed that FW alleviated gene expression changes and kidney damage in both sexes. Further research is needed to investigate AFB1 and OTA mechanisms of action, as well as the potential beneficial effects of functional ingredients, which represent an efficient dietary strategy in protecting human health from global food contaminants such as mycotoxins.

[es] RESUMEN Las micotoxinas son metabolitos secundarios tóxicos producidos por ciertas especies de hongos que pueden contaminar una amplia gama de alimentos y materias primas en condiciones ambientales específicas. La aflatoxina B1 (AFB1) y la ocratoxina A (OTA) figuran entre las micotoxinas más tóxicas y estudiadas. Con el fin de contextualizar los avances en los últimos años sobre los efectos tóxicos de AFB1 y OTA en modelos celulares y animales, se realizó una revisión bibliográfica centrada en técnicas como la inmunofluorescencia y la citometría de flujo. Se puso de manifiesto que la citometría de flujo se empleó principalmente en la evaluación de la apoptosis y el estrés oxidativo mientras que la inmunofluorescencia en la detección de alteraciones genéticas, epigenéticas y metabólicas. En los estudios in vitro la línea celular más utilizada fue HepG2, seguida por HEK-293T y PK-15. En cuanto a los estudios in vivo, los animales de laboratorio con mayor número de estudios fueron los pollos y ratas mientras que los principales órganos diana analizados fueron el timo, la bolsa de Fabricio y el bazo. Los objetivos principales de las investigaciones se centraron en la inmunotoxicidad, nefrotoxicidad, y hepatotoxicidad. Varios compuestos funcionales contenidos en la calabaza (CL) y en el suero de leche fermentado (FW) han demostrado su potencial aplicación en la mitigación de toxicidad inducida por micotoxinas debido a sus propiedades antioxidantes y antinflamatorias. Para conocer el posible papel neuroprotector e inmunoprotector de CL y FW, se llevaron a cabo varios ensayos moleculares y ómicos con el fin de investigar los posibles efectos de estos ingredientes funcionales frente a AFB1 y OTA en células neuronales y linfocitos T humanos. El estudio sobre la diferenciación neuronal in vitro evidenció que el tratamiento con OTA fue el más perjudicial no sólo por reprimir la expresión de biomarcadores neuronales, sino también por detener el ciclo celular en la fase G0/G1. Resultados menos pronunciados se observaron tras la exposición a AFB1 y a la mezcla de micotoxinas, sugiriendo un posible efecto antagónico. Sin embargo, la adición de CL y FW restableció los niveles de los biomarcadores de forma similar al control y moduló tanto las alteraciones del ciclo celular como los cambios de expresión génica promovidos por las micotoxinas. Los resultados de la secuenciación del ARN realizada en una línea celular de linfocitos T humanos revelaron que AFB1 alteró principalmente la vía de señalización de la ataxia telangiectasia mutada, indicando posibles daños en el ADN y alteraciones en sus mecanismos de reparación. La exposición a OTA activó principalmente la ruta de la glucólisis, sugiriendo la posible reprogramación del metabolismo energético hacia la anaerobiosis. En combinación, AFB1 y OTA activaron la ferroptosis, una forma de necrosis programada con peroxidación lipídica y represión de la enzima antioxidante glutatión peroxidasa 4. El análisis transcriptómico en células inmunitarias Jurkat expuestas a un digerido gastrointestinal de pan preparado con micotoxinas y la mezcla de CL y FW puso de manifesto la promoción tras la exposición a AFB1 y OTA de una clara respuesta proinflamatoria mediante la activación de la vía de señalización de los eicosanoides y del interferón gamma. No obstante, la presencia de los ingredientes funcionales no solo atenuó la sobreexpresión de genes proinflamatorios sino también la inducción de factores y rutas metabólicas estrictamente inflamatorias. Para estudiar los efectos del FW frente la hepatotoxicidad y nefrotoxicidad de AFB1 y OTA in vivo en ratas Wistar, se analizó la expresión génica de biomarcadores biológicos como la carbamoil fosfato sintetasa 1 (CPS1) y la molécula de lesión renal 1 (KIM-1) mediante PCR cuantitativa en tiempo real y PCR digital en gotas (ddPCR). Los resultados de la cuantificación relativa y absoluta de CPS1 demostraron que en el hígado de ratas macho, la exposición a AFB1 fue la más tóxica al reprimir la expresión génica de CPS1, lo que se revirtió totalmente en presencia del FW. En las hembras, el daño inducido por las micotoxinas así como el efecto hepatoprotector del FW fueron menos pronunciados. En el riñón de ratas macho y hembra, la exposición a OTA fue la más dañina aumentando en mayor medida la expresión génica de KIM-1. Sin embargo, el análisis por ddPCR demostró que el FW aliviaba los cambios de expresión génica y el daño renal en ambos sexos. Es necesario seguir investigando los mecanismos de acción de AFB1 y OTA, así como los posibles efectos beneficiosos de los compuestos funcionales, que representan una eficiente estrategia alimentaria en la protección de la salud humana frente a contaminantes alimentarios de carácter global como las micotoxinas.