[ca] S'hipotetitza que les proteases regulen gairebé totes les funcions biològiques, ja que representen un percentatge considerable del genoma humà. No obstant, poc se sap sobre les funcions biològiques de moltes. Això és especialment cert en el cas de les carboxipeptidases citosòliques, de les quals s'han suggerit funcions i implicacions, però sovint se'n desconeixen les veritables activitats biològiques i la implicació en processos cel·lulars complexos. Aquest treball de tesi doctoral tracta sobre la caracterització funcional de les carboxipeptidases citosòliques 1 i 6, dos enzims desglutamiladors membres de la subfamília M14D de metal·locarboxipeptidases que s'han relacionat amb processos cel·lulars rellevants com ara neurodegeneració i ciliopaties. Així doncs, la nostra recerca s'ha centrat específicament a determinar el paper funcional de les CCPs sota un punt de vista biomèdic, tractant de sorgir nous coneixements sobre la seva implicació en la salut i la malaltia. Amb aquest objectiu s'han realitzat estudis de biologia cel·lular, generació de knock out mitjançant CRISPR/Cas9, obtenció d'imatges d'alta resolució i avaluació de l'activitat enzimàtica. A més, s'ha desenvolupat i aplicat una tècnica proteòmica per a l'estudi del paisatge interactòmic d'aquestes carboxipeptidases. Aquest treball de tesi es compon de tres capítols interconnectats en què es caracteritzen funcionalment les carboxipeptidases citosòliques 1 i 6. En el primer capítol ens hem proposat la caracterització general de la CCP1 humana, el membre més gran de la família CCP, sent el que té el nombre més gran de dominis predits. L'elucidació dels papers funcionals específics a cada orgànul ha estat durant molt de temps un factor que ha contribuït significativament a l'estudi de les CCP. Per això, En aquest capítol ens hem centrat en com les cèl·lules es veuen afectades per la pèrdua d'activitat de CCP1. S'han determinat les consideracions generals de CCP1 quant al paper funcional utilitzant el knock out del gen, centrant-nos en les seves implicacions en els processos generals de desglutaminació, descrivint-ne la localització subcel·lular i el paper funcional nuclear específic. El segon capítol està destinat a la identificació dels paisatges interactòmics de CCP1 i CCP6 en humans sota un punt de vista biomèdic. Desvelar les interaccions proteïna-proteïna pot revelar com estan implicades en diferents processos, proporcionant pistes o ajudant a determinar la seva implicació en malalties. En aquest capítol s'han generat els paisatges interactòmics de CCP1 i CCP6 a partir de cèl·lules humanes in vitro, identificant nous interactors i substrats potencials que ens han permès conèixer el seu paper funcional. El treball proteòmic realitzat en aquest capítol es va dur a terme al Grup Bioscope (Universidade Nova de Lisboa, Portugal) dirigit pel professor José Luis Capelo sota la vigilància del Dr. Hugo Santos. En el darrer capítol ens vam proposar caracteritzar el 'domini N' conservat de les carboxipeptidases citosòliques, centrant-nos en CCP6 com a unitat mínima d'expressió de CCP. Aquest domini característic es conserva al llarg de la línia evolutiva, estant present a totes les CCPs identificades, però no en altres metal·locarboxipeptidases. Encara que s'ha realitzat un extens treball per descriure el domini catalític conservat, se sap poc sobre el 'domini N' i la seva implicació en l'activitat de les CCPs. Actualment, l'única informació relativa al 'domini N' s'ha obtingut de Caenorhabditis elegans. En aquest capítol, hem avaluat els efectes d'una mutació puntual en aquest domini sobre l'activitat enzimàtica de la CCP6 humana, alhora que avaluem les seves implicacions en l'estabilitat de la proteïna, la localització subcel·lular i l'especificitat de substrat. El treball experimental d'aquest capítol es va fer en col·laboració amb la Paula Alfonso.

[en] Proteases are presumed to regulate nearly every biological function, as they represent a considerable percentage of the genome; nevertheless, little is known about the in vivo biological roles for many proteases. This is especially true for cytosolic carboxypeptidases, which have suggested functions and implications but are often unknown in terms of their true biological activities and implication in complex cellular processes. The present thesis work reports on the general functional characterisation of CCP1 and CCP6, two deglutamylating enzymes members of the M14D subfamily of metallocarboxypeptidases which have been related with relevant cellular processes. Thus, our research has specifically focused on determining the functional role of CCPs under a biomedical point of view, trying to arise new insights into their implication in health and disease. Cell biology studies, CRISPR/Cas9 knock out generation, high-resolution imaging, and enzymatic activity assessing were all carried out with this goal in mind. Furthermore, a proteomic technique was developed and applied for the study of the carboxypeptidase interactomic landscape. This thesis work is composed by three interconnected chapters were the cytosolic carboxypeptidases 1 and 6 are functionally characterized. In the first chapter we aimed for the general characterisation of human CCP1, first focusing on how cells are affected by its loss of activity. CCP1 is the largest member of the CCP family, being the one with the largest number of predicted domains. The elucidation organelle-specific functional roles have long been a factor that has contributed significatively to the study of CCPs. In this chapter have determined general considerations of CCP1 regarding its functional role using the knocking out of the gene in specific cell lines, focusing on its implications in general deglutamylation processes, describing its subcellular localisation, and its specific nuclear functional role. The second chapter was aimed for the identification of the human CCP1 and CCP6 interactomic landscapes under a biomedical point of view. Unveiling the protein-protein interactions can reveal how they are involved in different processes, providing hints or aid in determining their implication in disease. In this chapter the interactomic landscapes of CCP1 and CCP6 were generated from in vitro human cells, identifying new potential interactors and substrates which have allowed us to gain insight into their functional role. The proteomic work performed in this chapter was performed at the Bioscope Group (Universidade Nova de Lisboa, Portugal) headed by Professor Jose Luis Capelo under Dr. Hugo Santos surveillance. In last chapter we aimed for the characterisation of the conserved N-domain of cytosolic carboxypeptidases, focusing on CCP6 as the minimal CCP expression unit. This characteristic domain is conserved along the evolutionary line, being present in all identified CCPs, but not in other metallocarboxypeptidases. Although an extensive work has been conducted to describe the conserved catalytic domain, little is known about the N-domain and its implication in CCP activity. At present, the only information regarding the N-domain has been obtained from Caenorhabditis elegans. In this chapter, we evaluated the effects of this point mutation on the enzymatic activity of human CCP6 while assessing their implications in protein stability, subcellular localisation, and substrate specificity. The experimental work of this chapter was performed in collaboration with Paula Alfonso.