[en] Several genome-wide association studies (GWAS) have contributed to the characterization of the genetic component of multiple sclerosis (MS). These studies examine hundreds of thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) distributed throughout the whole genome. However, the causal genetic variants of the disease and the pathogenic mechanisms by which they are associated with the risk of developing MS remain unknown. In addition, GWAS are focused on common variants (minority allele frequency (MAF) ≥1%) and do not take into account the contribution of the rare genetic variants. In this context, the objective of this thesis was to identify genetic variants associated with MS susceptibility and to study their functional implications. DNA resequencing of the coding and regulatory regions of 14 genes linked to MS risk in a discovery cohort of 524 MS patients and 546 healthy controls comprised the first phase of the study. The analysis of the data was structured in three blocks: a) the identification of common variants associated with the risk of MS; b) the detection of genes that tend to accumulate rare variants in MS patients; and c) the finding of structural variants associated with the susceptibility to develop MS. Regarding the first block, 32 common SNPs differentially distributed between MS patients and healthy controls were identified, from which a selection was performed for their validation in an independent cohort of 3450 patients and 1688 controls by means of genotyping. Among the validated polymorphisms, two were chosen for additional studies: i) rs10892307 (CXCR5), for which a SNP was identified in high linkage disequilibrium (LD), rs11602393, whose MS risk allele was associated with a decreased CXCR5 promoter activity by a dual-luciferase reporter assay and with a reduced proportion of circulating regulatory T cells expressing CXCR5 on their surface by flow cytometry; and ii) rs2762943 (CYP24A1), for which it was found that MS patients carrying the risk allele showed diminished serum calcitriol levels and a trend for increased levels of CYP24A1 gene expression, which codes for an enzyme responsible for vitamin D degradation, after its in vitro stimulation with calcitriol in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). In reference to the second block, rare variant enrichments were detected more frequently in MS patients within specific regions of the FCRL1, RGS1, TRAF3 and CYP24A1 genes, of which the one reported in the whole sequence of RGS1 was associated with a decreased RGS1 gene expression in PBMCs, with a lower percentage of circulating B cells expressing RGS1 on their membrane, and with a lack of response to in vitro stimulation of PBMCs with interferon-β, all in MS patients. The third block uncovered a deletion of exons 4-10 in the FCRL1 gene in a patient with MS but, despite its experimental validation, no additional carrier individuals could be identified to tightly associate it with MS. Overall, the complete set of results led to conclude that i) the variant rs11602393 is associated with a decrease in circulating regulatory T cells with CXCR5-mediated migratory capacity towards CXCL13 chemokine enriched germinal centers; ii) the risk allele of the rs2762943 polymorphism could be related to a decrease in serum calcitriol levels influenced by a higher CYP24A1 enzyme activity; iii) that the presence of rare variants associated with the RGS1 gene can alter both the migratory capacity of B cells by reducing the proportion of them expressing RGS1 and the response to in vitro exposure of PBMCs to interferon-β treatment; and iv) that the FCRL1 deletion still cannot be associated with the risk of MS.

[es] Varios estudios de asociación del genoma completo (GWAS) han contribuido a la caracterización del componente genético de la esclerosis múltiple (EM). Estos estudios examinan cientos de miles o millones de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) distribuidos por todo el genoma. Sin embargo, las variantes genéticas causales de la enfermedad y los mecanismos patogénicos por los cuales se asocian con el riesgo de EM se desconocen. Además, los GWAS analizan los SNPs comunes (frecuencia del alelo minoritario (MAF) ≥1%) y no consideran la contribución de las variantes raras. En este contexto, el objetivo de la presente tesis fue identificar variantes genéticas asociadas con la susceptibilidad de EM y estudiar sus implicaciones funcionales. La primera fase del estudio consistió en una resecuenciación de las regiones codificantes y reguladoras de 14 genes vinculados con el riesgo de EM en una cohorte de 524 pacientes y 546 controles sanos. El análisis de los datos se estructuró en tres bloques: a) la identificación de variantes comunes asociadas con el riesgo de EM; b) la detección de genes que tienden a acumular variantes raras en pacientes con EM; y c) el hallazgo de variantes estructurales asociadas con la susceptibilidad de desarrollar EM. Respecto al primer bloque, se identificaron 32 SNPs comunes diferencialmente distribuidos entre pacientes con EM y controles sanos, de las que se hizo una selección para su validación mediante genotipado en una cohorte independiente de 3.450 pacientes y 1.688 controles. Entre los validados, se escogieron dos para estudios adicionales: i) rs10892307 (CXCR5), para el que se identificó un SNP en alto desequilibrio de ligamiento (LD), rs11602393, cuyo alelo de riesgo se asoció con una disminución de la actividad del promotor de CXCR5 mediante un ensayo reportero dual-luciferasa y con una reducción del porcentaje de células T reguladoras circulantes que expresaban CXCR5 en su superficie mediante citometría de flujo; y ii) rs2762943 (CYP24A1), para el cual se encontró que los pacientes con EM portadores del alelo de riesgo mostraban niveles de calcitriol en suero disminuidos y tendían a niveles aumentados de la expresión génica de CYP24A1, codificante de una enzima que degrada la vitamina D, tras su estimulación in vitro con calcitriol en células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Referente al segundo bloque, se detectaron enriquecimientos de variantes raras más frecuentemente en pacientes con EM en regiones concretas de los genes FCRL1, RGS1, TRAF3 y CYP24A1, de los que el reportado en toda la secuencia de RGS1 se asoció con una expresión génica de RGS1 disminuida en CMSP, con un menor porcentaje de células B circulantes que expresan RGS1 en su membrana, y con una falta de respuesta a la estimulación de CMSP in vitro con interferón- β, todo en pacientes con EM. El tercer bloque reveló una deleción de los exones 4-10 del gen FCRL1 en un paciente con EM pero, a pesar de validarla experimentalmente, no se identificaron más individuos portadores para asociarla sólidamente con la enfermedad. Los resultados obtenidos permiten concluir que la variante rs11602393 se asocia con una disminución de las células T reguladoras circulantes con capacidad migratoria hacia los centros germinales mediante la quimioatracción CXCR5-CXCL13; que el alelo de riesgo del polimorfismo rs2762943 podría relacionarse con niveles disminuidos en suero de calcitriol por una mayor actividad de la enzima CYP24A1; que la presencia de variantes raras asociadas al gen RGS1 puede influenciar la capacidad migratoria de las células B al reducir la proporción de las mismas que lo expresan y alterar la respuesta de las CMSP al tratamiento con interferón-β, y que la deleción del gen FCRL1 todavía no puede asociarse con el riesgo de EM.