[en] Alzheimer disease (AD) is an important neurodegenerative disorder which affects to elderly people and only acetylcholinesterase inhibitors have shown some efficacy in its treatment. This work evaluates some pharmacological characteristics of two new tacrine-huperzine A hybrids, (±)-huprine Y (huprine Y) and (±)-huprine Z (huprine Z). Bovine and human acetylcholinesterase (AChE) and human butyrylcholinesterase (BChE) inhibition were assayed by Ellman's method. The two huprines were more active than both tacrine and huperzine A as inhibitors of both human and bovine AChE, and they acted as mixed-type AChE inhibitors. Moreover, huprine Y exhibited a tight-binding character seen in the experiments of reversibility of bovine AChE inhibitory activity. In addition, both compounds were more active toward AChE than toward BChE. Also, the selectivity for the human AChE was greater than for the bovine enzyme. In ex vivo studies performed in mice, both drugs showed a clear inhibitory activity of brain AChE, 20 min after i.p. injection, huprine Y being more potent than huprine Z [ID50 = 1.09 (0.39-2.98) vs 5.77 (3.29-10.30) mmol/kg]. The time-course study of the inhibitory effect displayed a t1/2 of 1 hour for the two compounds. A single dose (10 mmol/kg) of different anticholinesterasic drugs was administered to another group of mice and in all cases the effect was lower than the effect displayed by huprines at the same dose. Another interesting point was that the huprines at doses as high as 30 and 40 mmol/kg, respectively, only showed slight increases of salivation and some tremors, while tacrine and huperzine A produced higher undesirable effects, and even the death of some animals. The previous ID50 calculated for the huprines were administered to some mice and the inhibitory activity was determined using plasma. Both drugs inhibited the peripheral enzyme with a lower potency than the central ChE. Lastly, the effect on muscarinic receptors was studied. Displacements of [3H]-pirenzepine and [3H]-QNB, this one in presence of pirenzepine 10 mM were performed in membranes of rat hippocampus. Non-linear regression analysis of the curves showed that both drugs had a higher affinity for the M1 receptor (Ki = 2.55 ± 0.89.10-7 huprine Y; 3.89 ± 0.28.10-7 huprine Z) than for the M2 receptor (Ki = 6.91 ± 1.39.10-6 huprine Y; >10-5 huprine Z). Studies of the huprines production of [3H]-inositol phosphates were done in order to know wheter these drugs act as agonist or antagonist of M1 receptors. Carbachol, a well-known muscarinic agonist, showed a EC50 of 8.40 ± 0.42 .10-5 M (effect reverted in almost 100% by muscarinic antagonist atropine and pirenzepine), while EC50 were 4.72 ± 1.40 .10-4M and 3.80 ± 0.20 .10-4 M for the huprine Y and the huprine Z, respectively. The increases of inositol phosphates production induced by the drugs were antagonized in a 50% in both cases by the muscarinic antagonist. On the other hand, prazosine, an a1-adrenoceptor antagonist, reverted 30% of the effect, which proves that huprines are muscarinic M1 agonists, but there are other mechanisms involved in the production of inositol phosphates. In summary, these results show that huprine Y and huprine Z are two potent anticholinesterasic drugs, which act at CNS and which are of potential interest in the treatment of the AD.

[es] La enfermedad de Alzheimer (AD) es uno de los trastornos neurodegenerativos más importantes que afectan a las personas de edad avanzada, y tan sólo los fármacos anticolinesterásicos han probado tener cierta utilidad en la terapéutica de esta enfermedad. En el presente trabajo de tesis doctoral se han evaluado diversas características farmacológicas de dos nuevos anticolinesterásicos híbridos tacrina-huperzina A, (±)-huprina Y (huprina Y) y (±)-huprina Z (huprina Z). Mediante el método de Ellman se determinó la inhibición de los enzimas acetilcolinesterasa (AChE) bovina y humana y butirilcolinesterasa (BChE) humana. Ambas huprinas resultaron más activas que la tacrina y la huperzina A como inhibidores de la AChE bovina y humana, el mecanismo de inhibición fue de tipo mixto. Además, en los experimentos de reversibilidad de la actividad sobre la AChE bovina, la huprina Y mostró inhibir la enzima con carácter tight-binding. Por otro lado, tanto la huprina Y como la huprina Z actuaron de forma más potente sobre la AChE que sobre la BChE, y de forma más selectiva sobre la AChE humana que sobre la AChE bovina. En los estudios ex vivo realizados en ratón, ambos compuestos mostraron una clara actividad inhibitoria sobre la AChE cerebral, 20 min post-inyección, siendo la huprina Y más potente que la huprina Z [DI50 = 1.09 (0.39-2.98) vs 5.77 (3.29-10.30) mmol/kg]. El tiempo de semivida biológica del efecto fue igual a 1 hora en ambos casos. Se inyectó una única dosis de 10 mmol/kg de diferentes anticolinesterásicos a otro grupo de ratones y se comprobó que la inhibición de la enzima era muy inferior a la mostrada a la misma dosis por las huprinas. Otro aspecto interesante fue observar que las máximas dosis utilizadas de los compuestos (30 mmol/kg huprina Y y 40 mmol/kg huprina Z) sólo producían un ligero aumento de salivación y un leve temblor, mientras que a dosis inferiores de tacrina y huperzina A los efectos indeseables eran muy superiores, llegando en algunos casos a producirse la muerte del animal. A las DI50 calculadas, las huprinas inhibieron la ChE periférica (plasma) con una potencia muy inferior a la mostrada para la AChE central. Por último, se estudió el efecto de estos anticolinesterásicos sobre los receptores muscarínicos. En primer lugar se determinó el desplazamiento de [3H]-pirenzepina y [3H]-QNB, éste último junto a pirenzepina 10 mM, en membranas de hipocampo de rata. Mediante análisis de regresión no lineal se mostró que ambas huprinas tenían una alta afinidad por los receptores muscarínicos M1 (Ki = 2.55 ± 0.89.10-7 huprina Y; 3.89 ± 0.28.10-7 huprina Z), y que esta afinidad era significativamente superior a la que mostraban por los receptores M2 (Ki = 6.91 ± 1.39.10-6 huprina Y; >10-5 huprina Z). A continuación se realizaron estudios de producción de fosfatos de [3H]-inositol inducida por las huprinas con el objeto de discernir si estos compuestos actúan como agonistas o como antagonistas muscarínicos. El carbacol, reconocido agonista muscarínico, mostró una CE50 igual a 8.40 ± 0.42 .10-5 M (efecto revertido en casi su totalidad por los antagonistas atropina y pirenzepina), mientras que el valor para la huprina Y fue de 4.72 ± 1.40 .10-4M y para la huprina Z de 3.80 ± 0.20 .10-4 M. Los aumentos en la producción de fosfatos de [3H]-inositol inducidos por las huprinas fueron revertidos en un 50% por los antagonistas muscarínicos, mientras que el antagonista de los adrenoceptores a1 prazosina revirtió un 30% el efecto, lo cual demuestra que estos fármacos son agonistas muscarínicos M1, pero que además existen otros mecanismos implicados. En resumen, los resultados expuestos en esta tesis doctoral prueban que tanto la huprina Y como la huprina Z son dos potentes anticolinesterásicos, que actúan a nivel del SNC y que presentan un potencial interés para el tratamiento de la EA.