[ca] La investigació desenvolupada en la present Tesi està enfocada a l'estudi de l'heteroplàsmia mitocondrial humana. Els treballs d'heteroplàsmia mitocondrial que s'han publicat fins al moment d'inici de la Tesi s'han centrat en la regió no codificant del DNA mitocondrial (DNAmt) i no hi ha cap estudi on s'utilitzin seqüències completes de DNAmt. Per detectar correctament l'heteroplàsmia mitocondrial, cal tenir en compte la presència dels anomenats NUMTs (insercions nuclears d'origen mitocondrial). A causa de l'elevada similitud entre NUMTs i DNAmt, una co-amplificació entre ells podria comprometre la veracitat dels resultats. Actualment, no existeix en la bibliografia cap treball on s'utilitzin primers que evitin la co-amplificació amb NUMTs. D'altra banda, les bases de dades de NUMTs descrites fins el moment presenten una gran discrepància en el nombre total de NUMTs i han estat realitzades amb una versió antiga de l'esborrany del genoma humà. Els objectius de la Tesi són els següents: 1) establir una metodologia adequada per a la correcta amplificació i seqüenciació del genoma mitocondrial humà que eviti la co-amplificació amb NUMTs; 2) realitzar una exhaustiva compilació de les insercions nuclears d'origen mitocondrial basada en la darrera versió de l'esborrany del genoma humà (GRCh37); 3) avaluar l'impacte de la contaminació per NUMTs en estudis de càncer com un exemple d'aplicació de la base de dades descrita; 4) determinar la freqüència i el patró de l'heteroplàsmia en la totalitat del genoma mitocondrial; i 5) comparar el patró mutacional de l'heteroplàsmia mitocondrial amb l'observat a nivell poblacional. La metodologia així com la presentació dels resultats i la discussió s'han organitzat en 3 capítols dirigits a respondre els diversos objectius. En el primer capítol s'ha dut a terme el disseny i la validació d'un conjunt de primers que permet l'amplificació i seqüenciació completa de genoma mitocondrial. A més, aquests primers estan dissenyats de manera que eviten la co-amplificació amb DNA nuclear (DNAn). Finalment, i com a conseqüència de l'actualització de l'esborrany del genoma humà, s'han re-avaluat aquests primers, havent-se de redissenyar una de les parelles. En el segon capítol es presenta la compilació de les 755 insercions nuclears d'origen mitocondrial realitzada tenint en compte el darrer esborrany del genoma humà GRCh37. En aquesta base de dades, es presenten per primera vegada les posicions no idèntiques entre el DNAmt i el DNAn. Aquestes posicions han estat la base per l'aplicació de l'exemple que s'ha realitzat en estudis de càncer, avaluant així l'impacte de la contaminació per NUMTs. En el tercer i darrer capítol es presenta l'estudi exhaustiu sobre la freqüència i patró de l'heteroplàsmia mitocondrial humana mitjançant la seqüenciació completa del genoma mitocondrial de 101 individus. Alhora aquesta informació s'ha utilitzat per realitzar una comparativa amb l'espectre mutacional a nivell poblacional. Aquest és el primer treball on es descriuen per primera vegada un conjunt d'eines essencials pel correcte estudi de l'heteroplàsmia mitocondrial humana: es presenta un conjunt de primers que permeten amplificar i seqüenciar selectivament la totalitat del genoma mitocondrial i s'ha generat una base de dades d'insercions nuclears d'origen mitocondrial basada en el nou esborrany del genoma humà GRCh37, reportant alhora les posicions no-idèntiques entre el DNAmt i els NUMTs. És la primera vegada on s'analitza la freqüència i el patró de l'heteroplàsmia mitocondrial humana en individus sans. El 62.37% de la població presenta heteroplàsmia mitocondrial (de longitud i/o puntual) i un 24.75% d'individus presenta heteroplàsmia puntual, posant de manifest l'elevada freqüència d'heteroplàsmia mitocondrial a nivell poblacional. La distribució de l'heteroplàsmia mitocondrial comprèn tot el genoma mitocondrial, localitzant-se tant en posicions definides com a hotspot com en posicions altament estables i conservades. Comparant el patró mutacional de l'heteroplàsmia amb el descrit a nivell poblacional, sembla haver-hi un excés d'heteroplàsmia puntual localitzada en posicions que presenten zero hits en la filogènia. L'excés de transicions detectat en l'espectre mutacional de l'heteroplàsmia, en comparació amb el descrit a nivell poblacional, implica que determinades forces evolutives com la deriva o la selecció han hagut d'actuar perquè finalment siguin eliminades. En aquest context, les heteroplàsmies puntuals localitzades en posicions estables podrien tenir un gran impacte en la supervivència de la pròpia mitocòndria, suggerint que la selecció purificadora hauria d'estar actuant per prevenir la seva fixació en els individus. Aquest és el primer treball on s'analitza la freqüència i el patró de l'heteroplàsmia mitocondrial humana en individus sans. Tenint en compte l'elevada quantitat de dades que es presenta unit a la poca informació prèvia disponible, aquest treball proporciona una nova perspectiva per a l'estudi de les malalties associades al DNAmt així com en treballs a nivell poblacional, evolutiu i forense.

[en] The investigation developed in this thesis is focused on the study of human mitochondrial heteroplasmy. Until the beginning of the present thesis, the heteroplasmy works published have been focused on the analysis of non-coding region, and no studies on determining the levels of heteroplasmy using complete mitochondrial DNA (mtDNA) sequences has been published. To properly detect the mitochondrial heteroplasmy, the presence of NUMTs (nuclear insertions of mitochondrial origin) has to be taken into account. Due to similarity between NUMTs and mtDNA, a co-amplification between them could compromise the veracity of the sequence results. Currently, the published primers to amplify the whole mtDNA do not prevent the co-amplification with NUMTs. Moreover, the NUMT databases described until now show discrepancies in the total number of NUMTs and all of them have been carried out with an older version of the Human Genome Reference Sequence. The main goals of the thesis are: 1) to establish an appropriate methodology for the correct amplification and sequencing of the human mitochondrial genome that avoid the co-amplification with NUMTs; 2) to perform an exhaustive compilation of nuclear insertions of mitochondrial origin based on latest version of the Human Genome Reference Sequence (GRCh37); 3) to evaluate the impact of NUMTs contamination on cancer studies as an application example of the described database; 4) to determine the frequency and pattern of heteroplasmy in the whole mitochondrial genome; and 5) to compare the heteroplasmic mutational spectrum with the observed at population level in the whole mtDNA. The methodology used, the presentation of results and the discussion are organized into 3 chapters directed to answer the objectives. In the first chapter, the design and validation of the set of primers that allows a selective amplification and sequencing of complete mitochondrial genome has been performed. Moreover, these primers have been designed to avoid co-amplification with nuclear DNA (DNAn). Finally, and as a result of the updated Human Genome Reference Sequence, primer pairs have been re-evaluated and one of them had to be redesigned. The second chapter presents the compilation of the 755 nuclear insertions of mitochondrial origin performed with the last Human Genome Reference Sequence GRCh37. In this database, we present for the first time the non-identical positions between DNAmt and DNAn. These positions have been the basis for the evaluation of the impact of NUMTs contamination on cancer studies in the application example. In the third and final chapter is presented an exhaustive study of the frequency and pattern of the human mitochondrial heteroplasmy using the complete sequencing of the mitochondrial genome of 101 individuals. Moreover, this information has been used to perform a comparison with the mutational spectrum at the population level. This is the first study that describes essential tools for the correct study of the human mitochondrial heteroplasmy: a set of primes that can selectively amplify and sequence the entire mitochondrial genome and a database of nuclear insertions of mitochondrial origin based on the last Human Genome Reference Sequence GRCh37, reporting the non-identical positions between mtDNA and NUMTs. For the first time the analysis of the frequency and pattern of the human mitochondrial heteroplasmy in healthy individuals is reported. The results show that the 62.37% of the individuals are heteroplasmic (length and/or point) and 24.75% of individuals presented point heteroplasmy, highlighting the high frequency of mitochondrial heteroplasmy at population level. The distribution of mitochondrial heteroplasmy covers the whole mitochondrial genome, finding them in hotpots as well as in highly stable and conserved positions. Comparing the presented results with the mutational spectrum at population level, it seems that there is an excess of point heteroplasmy located in positions that have zero hits in the mitochondrial phylogeny. The excess of transitions detected in the heteroplasmic mutational spectrum, in comparison with the described at the population level, implies that some evolutionary forces may be acting to finally remove them. In fact, highly stable heteroplasmic positions could have a greater impact in the viability of mitochondrial survival, suggesting that purifying selection must be operating to prevent their fixation within individuals. This is the first study that analyses the frequency of heteroplasmy in healthy population, carrying out an evolutionary evaluation of the detected changes. This work provides a new perspective which would be important for medical, evolutionary, and forensic proposes