[en] Alternative pre-mRNA splicing is a regulated step in eukaryotic gene expression in which introns are removed from the transcript and exons are joined together to form a mature mRNA. To study the effects of mutations on alternative splicing, we built a mutant library containing all combinations of 12 mutations that accumulated during the emergence of an alternatively-spliced human exon: FAS exon 6. This allowed us to study the effects of individual nucleotide substitutions in thousands of different closely-related genetic contexts. We show that the effect of the same mutation on exon inclusion depends non-monotonically on the inclusion levels of the exon before the mutation is made, with mutations having their strongest splice-altering effects in exons with intermediate levels of inclusion, and their smallest effects in exons that are always skipped or always included. After performing deep mutagenesis in two highly included (constitutive) exons, we find that, in agreement with our previous results, mutations have a very small effect on the inclusion of constitutive exons with the exception of mutations in exon-intron boundaries (splice sites). Since alternative splicing is frequently perturbed in human genetic diseases, we then put these results in a more practical context to address the question of the extent to which random mutations in the human genome are likely to have splice-altering effects. Since most human exons are highly included, we conclude that a random mutation is unlikely to have a splice altering effect, and that altered splicing should only be considered a likely proximal disease mechanism for mutations that affect alternatively spliced exons (included at intermediate levels) or disrupt splice sites.

[es] El empalme alternativo es un proceso de la expresión génica en eucariontes en el que los intrones del transcrito se eliminan, dejando únicamente exones para formar un RNAm maduro. Para estudiar los efectos de mutaciones en este proceso, diseñamos una librería de mutantes con las 12 mutaciones (y todas sus combinaciones) que surgieron a lo largo de la evolución enhumanos de un exón alternativo: el exón 6 de FAS. Esto nos permitió estudiar los efectos de cada mutación en miles de contextos genéticos distintos. Descubrimos que la misma mutación puede tener efectos muy diferentes en el empalme de un exón dependiendo de los niveles de inclusión del mismo. Los mayores efectos se observan en exones con niveles intermedios de inclusión, mientras que los menores efectos ocurren en exones con niveles de inclusión muy altos o muy bajos. Tras mutagenizar dos exones constitutivos, confirmamos que, con la excepción de mutaciones en los sitios de empalme, es poco probable que una mutación afecte la inclusión de dichos exones. Dado que el empalme alternativo es un proceso se encuentra alterado en muchas enfermedades genéticas humanas, pusimos nuestros resultados en un contexto más práctico al plantearnos qué probabilidad hay de que una mutación al azar sea capaz de alterar dicho proceso. Ya que la gran mayoría de exones humanos tienen altos niveles de inclusión, concluimos que es poco probable que una mutación escogida al azar sea capaz de alterar los niveles de inclusión de algún exón. De hecho, esto sólo es probable en el caso de mutaciones en los sitios de empalme o de aquellas que afecten la inclusión de un exón alternativo.