[en] Liposomes are lipid-based nanovesicles widely explored as nanocarriers for the transport of biomolecules or drugs of interest to the place of action and for the development of new nanomedicines. This Thesis is devoted to the study of liposomal systems functionalized with targeting-ligands, with the final goal to be used as nanocarriers of therapeutically active enzymes. The new liposomal formulations have been specifically investigated and developed for the effective transportation of α-galactosidase A enzyme through cellular and blood brain membranes, and for the achievement of a new liposomal intravenous pharmaceutical product for the treatment of Fabry disease. Fabry disease is a rare disease which belongs to the group of lysosomal storage disorders, currently without a definitive cure. It characterizes by the deficiency in α-galactosidase (GLA) enzyme activity which results in the cellular accumulation of neutral glycosphingolipids (mainly Gb3) with multisystemic organ affectation, such as kidneys, heart, and nervous system. The current treatment is the enzyme replacement therapy, in which free GLA recombinant protein is administered intravenously to patients. This treatment shows several drawbacks including poor biodistribution, low stability, limited efficacy, high immunogenicity, and low capacity to cross biological barriers, such as cell membranes and the blood-brain barrier. An attractive strategy to overcome these problems is the use of nanocarriers for encapsulating enzymes. Nanoliposomes functionalized with RGD-peptide have already emerged as a good platform to protect and deliver GLA to endothelial cells. However, this initial GLA-nanoconjugate was still far from the preclinical testing. Several issues must be addressed for transforming this initial GLA-nanoformulation (or nanoGLA) into a pharmacological product. To achieve this transformation, a deep understanding and control of the nanoliposomal vehicle at the molecular and supramolecular level is unavoidable. In this Thesis, the relation between the physicochemical properties and biological behavior of targeted liposomes have been addressed, to get knowledge and gain control of liposomal systems for enzyme delivery, especially for the delivery of GLA enzyme for Fabry disease treatment. Small and uniform nanoGLA liposomes, functionalized with targeting-peptides, were successfully prepared by DELOS-susp, showing high GLA entrapment efficiency, enhanced enzymatic activity, and superior efficacy. NanoGLA formulation for the treatment of Fabry disease was successfully optimized with the required amount and quality to advance towards the preclinical evaluation in vivo. NanoGLA demonstrated superior efficacy compared to current treatment (Replagal®) and non-nanoformulated GLA in a Fabry KO mouse model in terms of higher reduction of Gb3 levels in all tested tissues, including brain. Further, the regulatory preclinical stage of development for this novel nanoGLA formulation was achieved for first time with GLP toxicity studies in rodent. Finally, alternative new ligand-targeted functionalized nanoliposomes prepared by the CO2-based DELOS-susp technology were explored for blood-brain barrier crossing applications. In summary, the results achieved in this Thesis support the strong potential of targeted liposomal systems for nanomedicine and drug delivery application. The successful development and optimization of the nanoGLA product for improving the current enzymatic replacement therapy in Fabry disease especially contributes as an example of translational and interdisciplinary research.

[es] Los liposomas son nanovesículas lipídicas ampliamente exploradas para ser utilizadas como transportadores de activos terapéuticos para el desarrollo de nuevas nanomedicinas. En la presente Tesis se ha estudiado el uso de estos sistemas liposomales funcionalizados con ligandos para ser utilizados como nanotransportadores de enzimas, específicamente, para el transporte eficaz de la enzima α-galactosidasa a través de membranas biológicas, como la membrana celular o la barrera hematoencefálica, para conseguir un nuevo producto farmacéutico para el tratamiento de la enfermedad de Fabry. La enfermedad de Fabry es una enfermedad minoritaria que pertenece a un grupo de trastornos englobados como enfermedades por depósito lisosómico, para las que actualmente no se ha encontrado una cura definitiva. Se caracteriza por la falta de actividad enzimática de la α-galactosidasa (GLA). Su deficiencia provoca la acumulación de diferentes sustancias en las células, como los glicoesfingolípidos (Gb3), y termina afectando de forma multisistémica a varios órganos como los riñones, el corazón o el sistema nervioso central. El tratamiento actual de esta enfermedad es mediante la terapia de reemplazo enzimático (ERT), que se basa en la administración intravenosa de la enzima deficiente, normalmente obtenida por biotecnología recombinante. Sin embargo, el éxito de este tipo de terapia suele quedar limitado por la inestabilidad y la baja eficacia de la enzima exógena que se administra, así como la incapacidad para cruzar barreras biológicas, como la barrera hematoencefálica. Una estrategia interesante para tratar de superar las limitaciones de los tratamientos de ERT es el diseño y desarrollo de nuevas nanoformulaciones a fin de aumentar la estabilidad y la eficacia de las enzimas terapéuticas, como la GLA. En los últimos años, en el marco del grupo Nanomol del ICMAB se ha estado investigando el desarrollo de un nuevo sistema liposomal que mejore el transporte intracelular de la GLA administrada exógenamente y otras propiedades farmacológicas de esta enzima. Los nanoliposomes resultantes se encuentran funcionalizados con el péptido RGD para aumentar la afinidad de estos nanoliposomas hacia las células endoteliales. A pesar de la obtención de resultados preliminares positivos con esta nanoformulación inicial de GLA (nanoGLA), había que superar diversas limitaciones para transformarla en un producto que cumpliese los requisitos para poderse testar en estudios preclínicos. Para ello, ha sido necesaria una alta comprensión y control del vehículo nanoliposomal a nivel molecular y supramolecular. En esta Tesis, se ha estudiado la relación entre las propiedades fisicoquímicas y el comportamiento biológico de los liposomas funcionalizados con péptidos, especialmente para el transporte de la enzima GLA para el tratamiento de la enfermedad de Fabry. Mediante el proceso DELOS-susp, se ha conseguido preparar exitosamente la formulación de nanoGLA con la cantidad y calidad necesarias para avanzar hacia la evaluación preclínica in vivo. La nanoGLA demostró una eficacia superior en comparación con el tratamiento actual (Replagal®) y la GLA no nanoformulada en un modelo de ratón Fabry, obteniendo una mayor reducción de los niveles de Gb3 en todos los tejidos analizados, incluido el cerebro. Además, se ha logrado por primera vez llegar a la etapa preclínica regulatoria en el desarrollo de esta nueva formulación de nanoGLA, con la realización de estudios toxicológicos GLP (Good Laboratory Practice) en roedores. Finalmente, también se ha explorado la preparación mediante DELOS-susp de nuevos nanoliposomas funcionalizados con ligandos alternativos al RGD para aplicaciones relacionadas con el cruce de la barrera hematoencefálica. En resumen, los resultados obtenidos en esta tesis avalan la estrategia de utilizar sistemas liposomales dirigidos a la administración de fármacos. El éxito en el desarrollo y la optimización del producto nanoGLA para mejorar la terapia actual de reemplazo enzimático en la enfermedad de Fabry es un claro ejemplo de investigación traslacional e interdisciplinaria.