[en] Introduction. Personalized medicine promises diagnosis and treatment of disease at the individual level and relies heavily on clinical specimen and diagnostic assay quality. As more targeted treatment options become available, testing for multiple tumor markers is required and optimization of sample use is needed to allow for a complete diagnostic workflow. In addition, characterization of the immune status of patients becomes increasingly important to immuno-oncology. The required extraction of information and biological insights from tissue slides remains challenging using traditional tissue-based methods. Recent research data have shown that iterative cycles of staining and destaining can be performed in a single tissue slide without losing antigenicity. However, the methodology proposed was manual, labor-intensive and time-consuming, thus limiting its applicability outside a research environment. Hypothesis. We have developed an innovative, simple, robust and automatized methodology, Next Generation Immunohistochemistry (NGI), to sequentially determine the expression of multiple individual biomarkers in a single tissue section. NGI may fill the actual limitations of the current approaches and become one of the multiplexed imaging technologies that could be used in different pathology and research laboratories to improve biomarker analyses in precision oncology. NGI may allow for a comprehensive characterization of biological tissue samples at cellular level while maintaining important spatial distribution/interaction between tumor and its microenvironment, information necessary to understand tumor biology and complexity. Objectives. We plan to develop and validate specific NGI panels composed of different biomarkers designed to address the a) quantification of KI67 biomarker in tumor cells in a reproducible and automated way; b) characterization of the tumor microenvironment; and c) characterization of breast cancer tumor cell phenotypes, heterogeneity and spatial interactions with cytotoxic t-cells. Results. In the first study, an NGI panel composed of KI67 for proliferation information and PanCK for tumor cell recognition was designed, which allowed us together with image analysis, to quantify KI67 in the tumor cells automatically and solve the reproducibility issues that KI67 index has. In the second study a panel composed of different biomarkers to explore the t-cells was designed: CD3 (t-cells), Foxp3 (regulatory t-cells), CD4 (helper t-cells), CD8 (cytotoxic t-cells), KI67 (proliferation marker), PanCK (tumor recognition) that allowed us the quantification of the different t-cell subtypes in the sample, their spatial distribution and their proliferation analyses. In the third study a panel composed of KI67, estrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR), HER2 (human epidermal growth factor receptor-2) and PanCK provided information on the expression of each biomarker at a single-cell level, allowing analysis of their co-expression in the same cell, their distribution, their spatial interaction (tumor cell-tumor cell, tumor cell-immune cells) and their changes during anti-Her2 treatment. Conclusions. NGI has been developed, validated and used in different studies. It can be used in any pathology or research laboratory that is equipped for digital pathology, in a relatively simple and inexpensive way. It only uses a single slide for each of the panels saving material for further analyses. NGI provides reproducible results that are comparable to standard IHCs. NGI quantifies different biomarkers at a single cell level, providing co-expression and spatial analyses, information that helps deeper understand the tumor biology and complexity; information that could be used for response prediction and for identifying better or new biomarkers to predict response to treatment and supporting better patient stratification towards different immunotherapies or therapy combinations.

[es] Introducción. La medicina personalizada promete el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades a nivel individual y depende en gran medida de la calidad de las muestras clínicas y los ensayos de diagnóstico. A medida que se dispone de opciones de tratamiento más específicas, se requieren pruebas para múltiples marcadores tumorales y se necesita optimizar el uso de muestras para permitir un flujo de trabajo de diagnóstico completo. Además, la caracterización del estado inmunitario de los pacientes se vuelve cada vez más importante para la inmunooncología. La extracción de información y los conocimientos biológicos requeridos a partir de portaobjetos de tejido sigue siendo un desafío con los métodos tradicionales basados ​​en tejidos. Los datos de investigaciones recientes han demostrado que los ciclos iterativos de tinción y decoloración se pueden realizar en un solo portaobjetos de tejido sin perder antigenicidad. Sin embargo, la metodología propuesta era manual, laboriosa y lenta, lo que limitaba su aplicabilidad fuera de un entorno de investigación. Objetivos. Planeamos desarrollar y validar paneles de NGI específicos compuestos por diferentes biomarcadores diseñados para abordar a) la cuantificación del biomarcador KI67 en células tumorales de forma reproducible y automatizada; b) la caracterización del microambiente tumoral; y c) la caracterización de los fenotipos de las células tumorales de cáncer de mama, heterogeneidad e interacciones espaciales con células T citotóxicas. Resultados. En el primer estudio se diseñó un panel NGI compuesto por KI67 para la información de proliferación y PanCK para reconocimiento de células tumorales; lo que nos permitió, junto con el análisis de imágenes, cuantificar el KI67 en las células tumorales de forma automática y solucionar los problemas de reproducibilidad que tiene la cuantificación del KI67. En el segundo estudio se diseñó un panel compuesto por diferentes biomarcadores para explorar las células T: CD3 (células T), Foxp3 (células T reguladoras), CD4 (células T auxiliares), CD8 (células T citotóxicas), KI67 (marcador de proliferación), PanCK (reconocimiento de células tumorales) que nos permitió cuantificar los diferentes subtipos de células T en la muestra, su distribución espacial y su análisis de proliferación. En el tercer estudio, un panel compuesto por KI67, receptor de estrógeno (ER), receptor de progesterona (PR), HER2 (receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano) y PanCK proporcionó información sobre la expresión de cada biomarcador a nivel celular; lo que permitió el análisis de coexpresión en la misma célula, su distribución, su interacción espacial (célula tumoral-célula tumoral, célula tumoral-células inmunes) y sus cambios durante el tratamiento anti-Her2. Conclusiones. NGI ha sido desarrollado, validado y utilizado en diferentes estudios. Puede ser utilizado en cualquier laboratorio de patología o investigación que esté equipado para patología digital, de una forma relativamente sencilla y económica. Utiliza un único portaobjetos para cada uno de los paneles, ahorrando material para análisis posteriores. NGI proporciona resultados reproducibles que son comparables a los IHC estándar. NGI cuantifica diferentes biomarcadores a nivel de una sola célula, proporcionando análisis de coexpresión y espaciales; información que ayuda a comprender mejor la biología y la complejidad del tumor. Esta información podría usarse para la predicción de la respuesta a tratamientos y para identificar nuevos o mejores biomarcadores para predecir la respuesta al tratamiento y respaldar una mejor estratificación de los pacientes hacia diferentes inmunoterapias o combinaciones de terapias.