[ca] La producció de proteïnes recombinants en plantes representa una oportunitat per a la seva obtenció i utilització comercial. L'objectiu principal d'aquesta tesi industrial ha estat el desenvolupament de sistemes vegetals de producció de proteïnes, eficients i competitius econòmicament, amb possibilitats de portar-les al mercat. Per fer-ho hem explorat dos sistemes: els cultius cel·lulars de Daucus carota i les fulles de Nicotiana benthamiana, cadascun d'ells amb els seus avantatges i limitacions. Com a prova de concepte, ambdós sistemes van ser utilitzats per a la producció d'"insulin-like growth factor 1" (IGF1), un pèptid d'alt valor afegit per a les indústries cosmètica i farmacèutica. S'assajaren vàries estratègies innovadores per a millorar els rendiments de producció augmentant l'expressió gènica i reduir costos de purificació del producte. A més, l'activitat biològica de l'IGF1 i els seus derivats produïts en planta va ser avaluada en comparació amb pèptids sintètics. Com a primera estratègia s'assajaren supressors del silenciament de l'ARN d'origen viral per tal d'incrementar l'expressió gènica. En assajos d'expressió transitòria amb la proteïna verda fluorescent com a marcadora, seleccionàrem la proteïna P1b del ipomovirus Cucumber vein yellowing virus (CVYV). Els nostres resultats amb línies cel·lulars de pastanaga sobreexpressores de l'IGF1 o el seu pèptid derivat CPP-IGF1 (variant dissenyada per a millorar la seva penetració en cèl·lules humanes) mostraren que en combinació amb P1b s'arribava a rendiments de producció 4 vegades majors que les línies sense el supressor del silenciament. A més, els pèptids foren dirigits al medi de cultiu per facilitar el seu aïllament mitjançant una simple clarificació. En assajos d'activitat, les fraccions obtingudes confirmaren ser capaces d'incrementar la divisió de fibroblasts humans. En relació amb l'estabilitat de la producció, s'observà una reducció propera al 33% després de vint-i-un cicles de propagació successius, per la qual cosa s'implementà la criopreservació de les línies transgèniques per mantenir els rendiments de producció originals, i així establir bancs cel·lulars per usos futurs. Alhora, es desenvolupà un sistema de producció transitòria de l'IGF1 i el CPP-IGF1 en fulles de N. benthamiana utilitzant un vector derivat del virus del mosaic del tabac, Tobacco mosaic virus (TMV). Aquest sistema va permetre reduir el temps d'obtenció del pèptid actiu, encara que en comparació amb la producció a les línies cel·lulars l'obtenció del producte no fou tan senzilla. Per tal de facilitar la purificació de l'IGF1 a partir de les matrius vegetals, aplicàrem una estratègia innovadora basada en fusions a oleosina per dirigir la producció a cossos lipídics. Aquesta tecnologia ja havia estat utilitzada en llavors, però no en cultius cel·lulars i escassament en fulles. Les nostres observacions mostraren la presència d'abundants cossos lipídics en nombrosos cultius cel·lulars incloent-hi els de D. carota amb l'excepció de les dues espècies model analitzades, Nicotiana tabacum i Arabidopsis thaliana. Desafortunadament, l'expressió estable de fusions a l'oleosina sembla que va afectar greument al creixement dels calls cel·lulars, pel que s'exploraren alternatives de la seva aplicació a la producció en fulles. Per tal d'augmentar la quantitat de cossos lipídics, la producció de les fusions a l'oleosina es realitzà simultàniament amb la d'inductors de l'acumulació de triacilglicerols utilitzant elements clau de la seva ruta biosintètica en A. thaliana: l'enzim DGAT1 i el factor de transcripció WRI1. Quan ambdós inductors foren co-expressats en combinació amb fusions a oleosina i l'IGF1 en plantes de N. benthamiana, es va obtenir fins 1 μg/g d'IGF1 unit als cossos lipídics, fàcilment aïllable i actiu. El nostre treball proporciona evidències que la utilització de supressors del silenciament de l'ARN, els vectors virals i la tecnologia de les oleosines contribueixen al potencial de les matrius vegetals per a la producció de proteïnes d'interès.

[es] La producción de proteínas recombinantes en plantas representa una oportunidad para su obtención y uso comercial. El objetivo principal de esta tesis industrial ha sido el desarrollo de sistemas vegetales de producción de proteínas, eficientes y competitivos a nivel económico, con posibilidades de llevarlas al mercado. Para ello hemos explorado dos sistemas: los cultivos celulares de Daucus carota y las hojas de Nicotiana benthamiana, cada uno con sus ventajas y limitaciones. Como prueba de concepto, ambos sistemas fueron utilizados para la producción de "'insulin-like growth factor 1" (IGF1), un péptido de alto valor añadido para las industrias cosmética y farmacéutica. Se ensayaron varias estrategias innovadoras para mejorar los rendimientos de producción aumentando la expresión génica y para reducir costes de purificación del producto. Además, la actividad biológica de IGF1 y sus derivados producidos en plantas se evaluó en comparación con péptidos sintéticos. Como primera estrategia se ensayaron supresores del silenciamiento de ARN de origen viral para incrementar la expresión génica. En ensayos de expresión transitoria con la proteína verde fluorescente como marcadora, seleccionamos la proteína P1b del ipomovirus Cucumber vein yellowing virus (CVYV). Nuestros resultados con líneas celulares de zanahoria sobreexpresoras de IGF1 o su péptido derivado CPP-IGF1 (variante diseñada para mejorar su penetración en células humanas) mostraron que en combinación con P1b alcanzaban rendimientos de producción 4 veces mayores que las líneas sin el supresor del silencing. Además, los péptidos fueron dirigidos al medio de cultivo para facilitar su aislamiento por simple clarificación. En ensayos de actividad, las fracciones obtenidas confirmaron ser capaces de incrementar la división de fibroblastos humanos. En relación a la estabilidad de la producción, se observó una reducción cercana al 33% después de veintiún ciclos de propagación sucesivos, por lo que se implementó la criopreservación de las líneas transgénicas para mantener los rendimientos de producción originales, y así establecer bancos de líneas celulares para usos futuros. También se desarrolló un sistema de producción transitoria de IGF1 y CPP-IGF1 en hojas de N. benthamiana utilizando un vector derivado del virus del mosaico del tabaco, Tobacco mosaic virus (TMV). Este sistema permitió reducir el tiempo de obtención del péptido activo, aunque en comparación con la producción en líneas celulares la obtención del producto no fue tan sencilla. Con el fin de facilitar la purificación de IGF1 desde matrices vegetales, aplicamos una estrategia innovadora basada en fusiones a oleosina para dirigir la producción a cuerpos lipídicos. Esta tecnología ya había sido utilizada en semillas, pero no en cultivos celulares, y escasamente en hojas. Nuestras observaciones mostraron la presencia de abundantes cuerpos lipídicos en numerosos cultivos celulares, incluyendo los de D. carota, con la excepción de las dos especies modelo analizadas, Nicotiana tabacum y Arabidopsis thaliana. Desafortunadamente, la expresión estable de fusiones a oleosina pareció afectar gravemente el crecimiento de los callos celulares, por lo que se exploró la alternativa de su aplicación a la producción en hojas. Para aumentar la cantidad de cuerpos lipídicos, la producción de las fusiones a oleosina se realizó simultáneamente con inductores de la acumulación de triacilgliceroles, usando elementos clave de su ruta biosintética en A. thaliana: la enzima DGAT1 y el factor de transcripción WRI1. Cuando ambos inductores fueron co-expresados en combinación con fusiones de oleosina e IGF1 en plantas de N. benthamiana, se obtuvo hasta 1 μg/g de IGF1 unida a los cuerpos lipídicos, fácilmente aislable y activo. Nuestro trabajo proporciona evidencias de que la utilización de supresores del silenciamiento de ARN, los vectores virales y la tecnología de oleosinas contribuyen al potencial de las matrices vegetales para la producción de proteínas de interés.