[en] Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonosis caused by Leishmania infantum. The dog is considered the main peridomestic reservoir of the parasite. CVL is endemic in the Mediterranean basin, Middle East, and South America and the prevalence of Leishmania infection can reach 67% in these areas. Moreover, leishmaniasis is emerging within non endemic areas such as North America and the United Kingdom. Leishmaniasis is thus increasingly becoming an important concern both from human public health and animal welfare perspectives. The aim of the present study is to insight into the molecular mechanisms of the resistance and susceptibility to CVL. Analyzing the polymorphism in 12 candidate genes and for the MHC class II region and by evaluating the immunological profile during the establishment of the infection and the progress of the disease. We have characterized 22 new SNPs in the Slc11a1 gene, which is involved in the first step of defense against the parasites and it is known for its multiple pleiotropic effects influencing the immune response. A total of 24 polymorphisms of the Slc11a1 gene have been typed in 164 dogs from 19 different breeds and we have discovered significant associations with CVL for 3 SNPs: A4549G in intron 6, C4859T in exon 8 and C8542T in intron 13, corroborating the role of this gene in CVL. In collaboration with the Centre for Integrated Genomic Medical Research (CIGMR) (University of Manchester) we have genotyped the MHC class II region and a panel of 97 SNPs from 11 candidate genes related with the immune response: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 and VDR (Vitamin D Receptor). Polymorphism at these genes has been analyzed in a breed-matched case-control study of 36 dogs of 4 different breeds known to be predisposed to CVL. We have identified two susceptibility alleles for CVL, the allele DQB1*02301 and allele DRB1*01502, corroborating for this allele the association previously described. These two alleles were found in the same haplotype in the boxer breed. Moreover, we have identified an allele (DRB1*01301) only in the control animals of this breed. Data analyses for the 11 candidate genes have revealed that 3 SNPs were significantly associated to CVL: 1 SNP identified in the 3' flanking region of IL-6 (20R191) and 2 SNPs identified in intron 7 of VDR gene (13M453 and 15S439), suggesting the role of these candidate genes on CVL. All these candidate genes have been genotyped in a cohort of Ibizan Hounds as a resistant breed. Data analysis confirms a specific genetic background for this breed that probably contributes to the resistance to CVL. New alleles for the MHC class II (DRB1*06901 and DQB1*04801) and specific haplotypes for the Slc11a1 gen have been identified. To evaluate the immunological profile associated to Leishmania infantum infection we have performed a cytokine gene expression study (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-&#947;, TNF-&#945; and TGF-&#946;) monthly during one year follow-up in six experimentally infected beagle dogs that presented different progression of the illness. Our results contribute to the knowledge of the pathogenesis of canine visceral leishmaniasis, which is marked by a balance production of Th1 and Th2 cytokines. In the first stage of infection a predominant Th2 response with an early IL-4 and IL-13 expression could favours parasite survival and the spread of the infection. A higher late IFN-&#947; expression is associated with the increase of parasite load and clinical status. Moreover, the high variability of expression during the pre-infection stage difficult the establishment of reference basal levels for these cytokines. The results of this study corroborate the role of the genes Slc11a1 and DRB1 in canine visceral leishmaniasis and provide new candidate genes related with the disease, further confirming the importance of host genetics in resistance/susceptibility to infectious disease. Moreover, they provide information of the cytokine profile in Leishmania infantum infection.

[es] La leishmaniosis canina es una zoonosis causada por el protozoo Leishmania infantum y el perro es considerado el principal reservorio del parasito. Es una enfermedad endémica de la cuenca Mediterránea, Oriente medio y Sudamérica y la prevalencia en estas zonas llega al 67%. Además es una enfermedad en expansión ya que recientemente se han descrito casos en Estados Unidos y en Reino Unido. El objetivo de esta tesis es el estudio de la base molecular de la resistencia y la susceptibilidad a la leishmaniasis visceral canina (CVL) a partir de dos aproximaciones distintas, el estudio del polimorfismo en 12 genes candidatos y el MHC de clase II y el perfil inmunológico en el establecimiento de la infección y en la posterior evolución de la enfermedad. Se han caracterizado 22 nuevos SNPs para el gen Slc11a1, que está involucrado en la primera barrera de defensa contra los parásitos. Un estudio caso-control formado por 164 perros de 19 razas, donde se han analizado 24 polimorfismos para este gen, nos ha permitido identificar 3 SNPs significativos: A4549G localizado en el intrón 6, C4859T localizado en el exón 8 y C8542T localizado en el intrón 13, corroborando la implicación de este gen en la CVL. Gracias a un trabajo en colaboración con el Centre for Integrated Genomic Medical Research (Universidad de Manchester) se ha caracterizado la región del MHC de clase II y se han genotipado 97 SNPs en 11 genes candidatos relacionados con la respuesta inmune: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 y VDR (Vitamin D Receptor). El polimorfismo de estos genes se ha analizado en una población de 36 perros pertenecientes a razas que presentan una elevada prevalencia para la enfermedad. Se han identificado dos alelos asociados a susceptibilidad a la CVL, el alelo DQB1*02301 y el alelo DRB1*01502, corroborándose para este último la asociación descrita previamente. Estos dos alelos forman parte del mismo haplotipo en la raza boxer, raza en la que también se ha identificado un alelo que solo se encuentra en los animales controles, DRB1*01301. A partir del análisis de los 11 genes candidatos hemos identificado 3 SNPs significativamente asociados a CVL: 1 SNP localizado en la región 3' flanqueante de la IL-6 (20R191) y 2 SNPs localizados en el intrón 7 del gen VDR (13M453 y 15S439) sugiriendo un papel relevante de estos genes en la CVL. Todos estos genes candidatos han sido genotipados en una población de podencos ibicencos, raza considerada resistente a la leishmaniosis. Los resultados obtenidos confirman que esta raza tiene una base genética propia que probablemente configura su particular resistencia a la enfermedad. Se han identificado nuevos alelos para el MHC-II (DRB1*06901 y DQB1*04801) y haplotipos específicos para el gen Slc11a1. Para el análisis del perfil inmunológico en la infección por Leishmania infantum se ha llevado a cabo un estudio de expresión de citoquinas (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-&#947;, TNF-&#945; y TGF-&#946;), analizadas mensualmente durante un año, en beagles de infección experimental que presentaron diferencias en la progresión de la enfermedad. Hemos observado que en la fase inicial de la infección una predominante respuesta Th2 con una elevada expresión de IL-4 y IL-13 puede favorecer la replicación del parásito y la diseminación de la infección. La elevada expresión de IFN-&#947; durante la fase patente de la infección está asociada con el aumento de la carga parasitaria y a los síntomas clínicos. Además, es importante remarcar la elevada variabilidad de la expresión génica durante la pre-infección, dificultando el establecimiento de niveles de referencia de la expresión basal de estas citoquinas. Los resultados de esta tesis corroboran el papel de los genes Slc11a1 y DRB1 en la leishmaniosis visceral canina y ponen en evidencia nuevos genes candidatos relacionados con la enfermedad, reafirmando la base genética de la resistencia/susceptibilidad en el huésped; además, aportan información del perfil de diferentes citoquinas en la infección por Leishmania infantum.