[en] During mitotic spindle assembly, γ-tubulin ring complexes (γTuRCs) nucleate microtubules at the centrosome, around mitotic chromatin and, by augmindependent recruitment, from pre-existing microtubules. The analysis of these distinct pathways in somatic cells is challenging due to the predominance of centrosomal nucleation. It is also unknown how microtubules derived from different nucleation pathways are organized into the bipolar spindle structure. Minus ends were shown to be present throughout the spindle with a higher concentration near the poles. However, the analysis of minus end dynamics has been prevented by lack of a suitable probe. I have identified the γ-tubulin ring complex (γTuRC) as a reliable marker for noncentrosomal microtubule minus ends in the spindle and have confirmed the accumulation of minus ends in the pole-proximal region. Using cells stably expressing γ-tubulin fused to photoactivatable GFP and mutants of γTuRC subunits, I have demonstrated that the γTuRC is recruited preferentially in the poledistal spindle region, where it associates with microtubule minus ends and then moves poleward along the mitotic spindle. Poleward transport of γTuRC at minus ends depends on the molecular motors dynein, KIFC1 and KIF11. I also discovered that some of the γTuRC that reaches the poles is stably incorporated at the centrosomes, complementing the microtubule-independent centrosome targeting previously described. Using laser ablation of centrosomes, I studied non-centrosomal spindle assembly. At mitotic entry, in the absence of centrosomes, these cells could nucleate microtubules from the nuclear area. These microtubules formed multipolar spindles but cells eventually divided into two daughter cells. However, cells derived from these abnormal mitoses were typically not viable. In summary, by revealing the dynamics of the minus ends of non-centrosomal microtubules, I have provided novel insight into assembly and architecture of the mitotic spindle. In addition, I have shown that centrosomes, even though not essential for somatic cell division, play an important role in the fidelity of spindle assembly and function.

[es] Durante la formación del huso mitótico, los complejos anulares de γ-tubulina (γTuRCs, del ingles γ-tubulin ring complexes) nuclean microtúbulos alrededor de la cromatina mitótica y, mediante la interacción con el complejo de la Augmina, a partir de otros microtúbulos ya existentes. El estudio de estos mecanismos en células somáticas es complejo, debido a la predominancia de la nucleación centrosomal de los microtúbulos en estas células. En la actualidad, aun no se sabe como microtúbulos procedentes de distintas vías de nucleación se organizan en la estructura bipolar del huso mitótico. Se ha observado que los extremos (-) están presentes a lo largo del huso, detectándose una mayor concentración cerca de los polos. A pesar de esto, no se conocen estudios detallados acerca de la dinámica del extremo (-) debido a la ausencia de marcadores adecuados. He observado que el complejo anular de γ-tubulina (γTuRC) es un marcador fiable de los extremos (-) en los microtúbulos acentrosomales presentes en el huso mitótico. Además, he confirmado la acumulación de estos extremos (-) en la región próxima a los polos del huso. Utilizando líneas celulares que expresan de forma estable γ-tubulina fusionada a un GFP foto-activable, y que además han sido transfectadas con isoformas mutantes de subunidades del γTuRC, he demostrado que el γTuRC se recluta preferentemente en regiones del huso alejadas de los polos. Allí el γTuRC se asocia con los extremos (-) de los microtúbulos, para ser transportado a lo largo del huso mitótico en dirección a los polos. El transporte del γTuRC presente en los extremos (-) en dirección a los polos lo realizan los motores moleculares Dineina, KIFC1 y KIF11. También he descubierto que una parte de las moléculas de γTuRC que alcanzan los polos del huso se integran de forma estable en los centrosomas, complementando la vía de incorporación al centrosoma independiente de microtúbulos que ha sido previamente descrita. Usando la técnica de ablación de centrosomas con laser, he estudiado la formación acentrosomal del huso. Cuando estas células entran en mitosis en ausencia de centrosomas, pueden nuclear microtúbulos desde el área nuclear. Estos microtúbulos forman husos multipolares, aunque las células finalmente se dividen en dos células hijas. Las células procedentes de estas mitosis anormales no suelen ser viables. En conclusión, mediante el revelado la dinámica de los extremos (-) de los microtúbulos no centrosomales, he proporcionado nueva información acerca del ensamblaje y arquitectura del huso mitótico. Además, he demostrado que los centrosomas, aunque no son esenciales para la división celular somática, juegan un papel importante en el correcto ensamblaje y función del huso mitótico.