[en] For the mitochondria it is essential to maintain a dNTP pool that is in an adequate quantity and proportion to guarantee mitochondrial DNA (mtDNA) replication and repair processes. In order to ensure the availability of these dNTPs, eukaryotic cells have two differentiated anabolic pathways: the de novo synthesis and the salvage pathway, both of which are tightly regulated. Mutations in nuclear genes that result in a disturbance of dNTPs homeostasis are associated with defects in mtDNA maintenance, leading to alterations in its quantity and quality, in what are known as mtDNA depletion and deletions syndromes. Traditionally, dNTPs are thought to be present in similar proportions, and mainly free-solubilized in the mitochondrial matrix, where they are available for polymerases and other enzymes that participate in mtDNA replication and repair processes. However, we have observed that dGTP is significantly overrepresented against the rest of dNTPs in mitochondria of human cells and mouse tissues. Furthermore, dGTP appears mostly associated with protein, specifically with complex I of the respiratory chain, through its subunit NDUFA10. NDUFA10 is an accessory subunit of complex I essential for the correct assembly of the holoenzyme with no other function so far described. However, NDUFA10 shares the functional dNK domain (pfam PF01712) with several of the deoxyribonucleoside kinases involved in the salvage pathway for the synthesis of dNTPs, such as TK2, dCK or dGK, with which it also shares a high sequence identity. All these enzymes catalyse the phosphorylation of deoxyribonucleosides using ATP as phosphate donor. However, no kinase activity has been found associated with NDUFA10 or complex I. Following the above results, we generated different experimental models in order to confirm the binding of dGTP to complex I and to further study this interaction. By introducing targeted mutations in NDUFA10 of human cell lines we have localized the dGTP binding site within the dNK domain of the protein. Furthermore, we have determined that this binding is highly specific and stable, and occurs at a stoichiometric ratio of 1:1. In addition, we have obtained a murine model with the same mutations in the dNK domain of NDUFA10 that we had introduced in human cells (Ndufa10E160A;R161A/E160A;R161A or NDUFA10KI). In contrast to what occurs with the human protein, the introduced mutations affect the stability of the murine NDUFA10 protein, and thereby the assembly and function of complex I. NDUFA10KI animals develop a fatal hypertrophic cardiomyopathy and die between 25-30 weeks of life, probably due to severe impairment of mitochondrial oxidative function as a consequence of NDUFA10 destabilization in the heart. Interestingly, these mutations appear to have different consequences for the stability of the protein and complex I depending on the analysed tissue, with the brain, for example, being less affected. In any case, disruption of the NDUFA10-dGTP interaction in NDUFA10KI animals results in a drastic reduction in the mitochondrial dGTP content in all studied tissues, whereas no effect on the other dNTPs is observed. These observations confirm that the interaction with dGTP occurs at the level of the dNK domain of NDUFA10 in vivo. Because it affects to such a large proportion of mitochondrial dGTP, the described interaction with complex I through its NDUFA10 subunit could represent a novel mechanism regulating dNTP availability and linking oxidative metabolism with DNA synthesis.

[es] Las mitocondrias necesitan mantener un contenido en dNTPs adecuado para garantizar los procesos de replicación y reparación del DNA mitocondrial (mtDNA). Para asegurar la disponibilidad de estos dNTPs, las células eucariotas disponen de dos vías anabólicas diferenciadas: la síntesis de novo y la ruta de salvamento de dNTPs. Las mutaciones en genes nucleares que se traducen en una perturbación de la homeostasis de dNTPs se asocian a defectos en el mantenimiento del mtDNA, dando lugar a alteraciones en su cantidad y calidad. Tradicionalmente se ha adoptado la idea de que los dNTPs se encuentran en proporciones similares, y principalmente solubilizados de forma libre en la matriz mitocondrial, disponibles para polimerasas y otras enzimas que participan en los procesos de replicación y reparación del mtDNA. Sin embargo, encontramos que el dGTP está significativamente sobrerrepresentado frente al resto de dNTPs en mitocondrias de células humanas y tejidos de ratón. Además, el dGTP aparece mayoritariamente asociado a proteína, concretamente al complejo I de la cadena respiratoria, a través de su subunidad NDUFA10. La NDUFA10 es una subunidad accesoria del complejo I para la que no se ha descrito una función específica dentro del mismo, pero que resulta esencial para el correcto ensamblaje de la holoenzima. Sin embargo, la NDUFA10 comparte el dominio funcional dNK (dominio dNK, pfam PF01712) con varias de las desoxirribonucleósido quinasas que participan en la ruta de salvamento para la síntesis de dNTPs, como son la TK2, dCK o dGK, con las que también comparte una alta identidad de secuencia. Todas estas enzimas catalizan la fosforilación de los desoxirribonucleósidos usando ATP como donador de fosfato. Sin embargo, no se ha descrito ninguna actividad quinasa asociada a NDUFA10 o al complejo I. A raíz de estos resultados, generamos distintos modelos experimentales con la finalidad de confirmar la unión del dGTP al complejo I y profundizar en el estudio de dicha interacción. Mediante la introducción de mutaciones dirigidas en la NDUFA10 de líneas celulares humanas hemos localizado el sitio de unión del dGTP dentro del dominio dNK de la proteína. Además hemos determinado que esta unión es altamente específica y estable, y se da en una proporción estequiométrica de 1:1. Asimismo, hemos obtenido un modelo murino con las mismas mutaciones en el dominio dNK de NDUFA10 que habíamos introducido en células humanas (Ndufa10E160A;R161A/E160A;R161A o NDUFA10KI). A diferencia de lo que ocurre con la proteína humana, las mutaciones introducidas afectan a la estabilidad de la proteína NDUFA10 murina, y con ello al ensamblaje y función del complejo I. Los animales NDUFA10KI desarrollan una cardiomiopatía hipertrófica que causa su muerte entre las semanas 25-30 de vida, probablemente a causa de una alteración grave de la función oxidativa mitocondrial a consecuencia de la desestabilización de NDUFA10 en el corazón. Curiosamente, estas mutaciones parecen tener consecuencias distintas para la estabilidad de la proteína y el complejo I en función del tejido analizado, afectando de forma más leve al cerebro, por ejemplo. En cualquier caso, la disrupción de la interacción NDUFA10-dGTP en los animales NDUFA10KI se traduce en una drástica reducción en el contenido mitocondrial de dGTP en todos los tejidos estudiados, mientras que no se observa ningún efecto sobre el resto de dNTPs, lo que nos permite confirmar in vivo que la interacción con el dGTP se produce a nivel del dominio dNK de la NDUFA10. Al afectar a una proporción tan importante del dGTP mitocondrial, la interacción descrita con el complejo I a través de su subunidad NDUFA10 podría suponer un nuevo mecanismo de control de la disponibilidad de dNTPs, tratándose de la primera relación directa descrita entre metabolismo oxidativo y la síntesis de DNA.