[en] Food and feed contamination by non-legislated mycotoxins beauvericin (BEA) and enniatin B (ENB) is a worldwide health concern in the present. The principal objective of this work is to assess some of the existing protocols to discover the single nucleotide variants (SNVs) in transcriptomic data obtained by RNA-seq from Jurkat cells samples individually exposed to BEA and ENB at three concentration levels (1.5, 3 and 5 µM). Moreover, previous transcriptomic results are compared with new findings obtained using a different RNA-seq protocol. SNV-protocol 1 complementary pipeline did not find any SNV. Instead, SNV-protocol 2 found rs201003509 in BEA exposed cells and rs36045790 in ENB in the differentially expressed genes in all doses compared to controls. Concerning gene expression, discrepant results were found for 1.5 µM BEA exposed cells compared with previous findings. However, 354 overlapped differentially expressed genes (DEGs) were identified in the three ENB concentrations used, with 147 matches with respect to the 245 DEGs found in the previous results. In conclusion, the two discovery SNVs protocols based on variant calling from RNA-seq used in this work displayed very different results and there were SNVs found manually not identified by any pipeline. Additionally, the new gene expression analysis reported comparable but non identical DEGs to the previous transcriptomic results obtained from these RNA-seq data. In the proteomic analysis of mitochondria enriched extracts from Jurkat cells exposed for 24 h to three concentrations of BEA:ENB (0.01–0.1–0.5 μM), a number of 1821 proteins (202 mitochondrial) were identified and relatively quantified. 340 proteins (59 mitochondrial) were statistically significant altered in our samples (Anova p-value ≤ 0.05 and fold change (FC) ≥1.5). The protein mitochondrial translational release factor 1 like (MTRF1L) was the most abundant protein in the three mycotoxin exposures studied. The mycotoxins mixture exposure induced concentration dependent changes at mitochondrial proteins levels that mainly involve inner and outer membrane complexes, Electron Transport Chain (ETC) and ribosomes. These results showed alteration of proteins levels related to oxidative phosphorylation, metabolic and neurodegenerative diseases related pathways. Some micotoxins such as BEA, ochratoxin A (OTA), and zearalenone (ZEA) can penetrate de Blood Brain Barrier (BBB). Therefore, the anti-inflammatory action of a pumpkin carotenoid extract from the pulp of C. maxima (var. Delica) against these mycotoxins and their combinations (OTA+ZEA and OTA+ZEA+BEA) was tested on a blood brain barrier model with co-cultured ECV304 and C6 cells using an untargeted metabolomic approach. Cells were added with mycotoxins at a concentration of 100 nmol/L per mycotoxin and pumpkin carotenoid extract at 500 nmol/L. As control we used only vehicle solvent (cell control) or vehicle solvent with pumpkin extract (extract control). After two hours of exposure, samples were analysed with HPLC-ESI-QTOF-MS. Metabolites were identified against the Metlin database. The proinflammatory arachidonic acid metabolite eoxin (14,15-LTE4) showed lower abundance in ZEA and BEA+OTA+ZEA-treated cultures that also received the pumpkin extract than in cultures that were not treated with the extract. Another marker of inflammation, prostaglandin D2-glycerol ester, was only found in cultures treated with OTA+ZEA and BEA+OTA+ZEA but not in the ones that were also treated with the pumpkin extract. Furthermore, the concentration of the pumpkin extract metabolite dihydromorelloflavone significantly decreased in the presence of mycotoxins. In conclusion, the pumpkin extract showed protective activity against cellular inflammation triggered by mycotoxins thanks to the properties pertinent to flavonoids contained in the pulp. Following with the studies of pumpkin extract on mycotoxins toxicity at molecular level, a transcriptional approach using ECV304 cells was set. The chosen mycotoxins were aflatoxins and enniatins are common mycotoxins present in food and feed with an extended toxicity profile in humans and animals. Both types of substances reach a wide range of tissues and organs and have the capability to penetrate the BBB. Since carotenoids and mycotoxins have been reported to modify diverse mitochondrial processes individually, transcriptional in vitro studies on human epithelial cells ECV304 were conducted to analyze the relative expression of 13 mitochondria related genes. ECV304 cells were differentiated for 9 days and treated for 2 h with: a) pumpkin (500 nM); b) aflatoxins (100 nM); c) enniatins (100 nM); d) aflatoxins (100 nM) and pumpkin (500 nM); e) enniatins (100 nM) and pumpkin (500 nM). Even at low concentrations, dietary carotenoids activity on mitochondrial genes expression reported a beneficial effect and, for most of the genes studied across the ETC, developed a protective effect when mixed with aflatoxins or enniatins. In order to expand the analysis of the effect of pumpkin extract and other mycotoxins in the BBB, ECV304 cells were subcultured for 7 days and exposed to BEA, ENs, OTA, ZEA (100 nM each) and pumpkin extract (500 nM), individually and combined. Reactive oxygen species (ROS) were measured by fluorescence using the dichlorofluorescein diacetate probe at 0 h, 2 h and 4 h. Intracellular ROS generation reported was condition dependent. RNA extraction was performed and gene expression was analyzed by qPCR after 2 h exposure. The selected genes were related to the ETC and mitochondrial activity. Gene expression reported upregulation for exposures including mycotoxins plus pumpkin extract versus individual mycotoxins. Beauvericin and Beauvericin-Enniatins exposure significantly downregulated Complex I and pumpkin addition reverted the effect upregulating Complex I. Complex IV was the most downregulated structure of the ETC. Thioredoxin Interacting Protein (TXNIP) was the most upregulated gene. These data confirm that mitochondrial processes in the BBB could be compromised by mycotoxin exposure and damage could be modulated by dietary antioxidants like carotenoids.

[es] Beauvericina (BEA) y eniatina B (ENB) son micotoxinas no legisladas de Fusarium que se encuentran habitualmente en los cereales y productos a base de cereales de todo el mundo. El objetivo principal de este trabajo es evaluar algunos de los protocolos existentes para descubrir las variantes de un solo nucleótido (SNVs) en los datos transcriptómicos obtenidos por secuenciación de ARN (RNA-seq) de células Jurkat expuestas individualmente a BEA y ENB a tres niveles de concentración (1,5, 3 y 5 µM). También se comparan los resultados del análisis transcriptómico realizado en trabajos anteriores con los nuevos obtenidos mediante un protocolo diferente. El SNV-protocol 1 no mostró ningún SNV. El SNV-protocol 2, identificó los SNVs rs201003509 en las células expuestas a BEA y el rs36045790 en ENB en los genes expresados diferencialmente para todas las dosis en comparación con los controles. Con respecto a la expresión génica, se encontraron resultados discrepantes en las células expuestas a 1,5 µM de BEA en comparación con el análisis transcriptómico anterior. Sin embargo, se identificaron 354 genes expresados diferencialmente (DEGs) superpuestos en las tres concentraciones de ENB utilizadas, con 147 coincidencias respecto a los 245 DEGs encontrados en los resultados anteriores. En conclusión, los dos protocolos de descubrimiento de SNVs mostraron resultados muy diferentes y hubo SNVs encontrados manualmente no identificados automáticamente. El nuevo análisis de expresión génica reportó DEGs comparables pero no idénticos a los resultados transcriptómicos anteriores obtenidos a partir de los datos de secuenciación de ARN. En el análisis proteómico de extractos de mitocondrias enriquecidos provenientes de células Jurkat expuestas durante 24 h a tres concentraciones de BEA:EN B (0,01-0,1-0,5 μM), se identificaron y cuantificaron relativamente 1821 proteínas (202 mitocondriales). 340 proteínas (59 mitocondriales) se encontraron alteradas de forma estadísticamente significativa en comparación con el control (valor p de Anova ≤ 0,05 y cambio de pliegue (FC) ≥1,5). La proteína de liberación traslacional mitocondrial factor 1 (MTRF1L) fue la proteína más abundante en las tres exposiciones a micotoxinas estudiadas. La exposición a la mezcla de micotoxinas indujo cambios dependientes de la concentración en los niveles de proteínas mitocondriales que implican principalmente a los complejos de la membrana interna y externa, la cadena de transporte de electrones (CTE) y los ribosomas. Estos resultados mostraron la alteración de los niveles de proteínas relacionadas con la fosforilación oxidativa, el metabolismo y las vías relacionadas con las enfermedades neurodegenerativas. Algunas micotoxinas como BEA, ocratoxina A (OTA) y zearalenona (ZEA) pueden atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). La acción antiinflamatoria de un extracto de calabaza procedente de la pulpa de C. maxima (var. Delica) fue analizada frente a estas micotoxinas y sus combinaciones (OTA+ZEA y OTA+ZEA+BEA) en un modelo de barrera hematoencefálica con células ECV304 y C6 co-cultivadas mediante un enfoque metabolómico no dirigido. La exposición se realizó con micotoxinas a una concentración de 100 nmol/L por micotoxina y extracto de carotenoides de calabaza a 500 nmol/L. Para el control se utilizó sólo el vehículo disolvente (control de las células) o el vehículo disolvente con el extracto de calabaza (control del extracto). Tras dos horas de exposición, las muestras se analizaron con HPLC-ESI-QTOF-MS. Los metabolitos se identificaron con la base de datos Metlin. El metabolito proinflamatorio eoxina (14,15-LTE4) de la vía del ácido araquidónico mostró una menor abundancia en los cultivos tratados con ZEA y BEA+OTA+ZEA y extracto de calabaza que en las exposiciones a micotoxinas sin extracto de calabaza. Otro marcador de inflamación, el éster de prostaglandina D2-glicerol, sólo se encontró en los cultivos tratados con OTA+ZEA y BEA+OTA+ZEA, pero no en los que también fueron tratados con el extracto de calabaza. Además, la concentración del metabolito del extracto de calabaza dihidromorflavona disminuyó significativamente en presencia de micotoxinas. En conclusión, el extracto de calabaza mostró una actividad protectora contra la inflamación celular desencadenada por las micotoxinas gracias a las propiedades pertinentes a los flavonoides contenidos en la pulpa. Siguiendo con los estudios del extracto de calabaza sobre la toxicidad de las micotoxinas a nivel molecular, se estableció un enfoque transcripcional utilizando células ECV304. Las micotoxinas elegidas fueron las aflatoxinas (AFs) y las eniatinas (ENs), comúnmente presentes en los alimentos y los piensos con un amplio perfil de toxicidad en humanos y animales. Ambos tipos de sustancias alcanzan una amplia gama de tejidos y órganos y tienen la capacidad de penetrar la BHE. Dado que se ha informado de que los carotenoides y las micotoxinas modifican individualmente diversos procesos mitocondriales, se realizaron estudios transcripcionales in vitro en células epiteliales humanas ECV304 para analizar la expresión relativa de 13 genes relacionados con la mitocondria. Las células ECV304 fueron diferenciadas durante 9 días y tratadas durante 2 h con: a) calabaza (500 nM); b) aflatoxinas (100 nM); c) enniatinas (100 nM); d) aflatoxinas (100 nM) y calabaza (500 nM); e) enniatinas (100 nM) y calabaza (500 nM). Incluso a bajas concentraciones, la actividad de los carotenoides dietéticos sobre la expresión de los genes mitocondriales reportó un efecto beneficioso y, para la mayoría de los genes estudiados a través de la CTE, desarrolló un efecto protector cuando se mezcló con AFs o ENs. Después de los resultados obtenidos en el estudio anterior, se amplió el estudio transcripcional de exposición en células ECV304 a otras micotoxinas y extracto de calabaza. También se midió la generación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS). El modelo de BHE fue cultivado in vitro durante 7 días y expuesto a BEA, ENs, OTA, ZEA (100 nM cada una) y extracto de calabaza (500 nM), individualmente y en combinación. Las especies reactivas de oxígeno se midieron por fluorescencia a las 0 h, 2 h y 4 h utilizando la sonda de diacetato de diclorofluoresceína. La generación intracelular de ROS reportada fue dependiente de la condición. Se realizó la extracción de ARN y se analizó la expresión génica mediante RT-qPCR tras 2 h de exposición. Los genes seleccionados estaban relacionados con la CTE y la actividad mitocondrial. Los genes se encontraron sobreexpresados en las exposiciones que incluían micotoxinas más extracto de calabaza frente a las de micotoxinas individuales. La exposición a beauvericina y a beauvericina-enniatinas redujo significativamente el Complejo I y la adición de calabaza revirtió el efecto aumentando el Complejo I. El Complejo IV fue la estructura más regulada de la CTE. La proteína que interactúa con la tiorredoxina (TXNIP) fue el gen más alterado. Estos datos confirman que los procesos mitocondriales en la BHE podrían verse comprometidos por la exposición a micotoxinas y el daño podría ser modulado por antioxidantes dietéticos como los carotenoides.