[en] This PhD thesis was focused on the studying of the variability of mitochondrial DNA (DNAmt) by massive parallel sequencing (NGS) and the impact of such variability on the glioma. Due to the significant role of mitochondria in cellular energy production, it has been postulated that mtDNA alterations might contribute to the carcinogenesis process, particularly in those tissues that require more energy, such as the brain. Thus, the study of glioma becomes very interesting in terms of mitochondrial analysis. The advances on mtDNA sequencing with NGS allow studies based on mitochondrial variability to be carried out more precisely and thoroughly, particularly those focused on mitochondrial heteroplasmy detection and establishment. However, heteroplasmy detection at low frequencies is not a straightforward process due to the great difficulty in discriminating the presence of false positives and false negatives correctly, and so far, there is not specific criteria that determines the best methodology to establish a reliable detection limit. Considering these aspects, two main goals were proposed in this PhD thesis: 1) To evaluate the detection and reproducibility capacity of Next Generation Sequencing (NGS), using the Nextera XT® methodology and the MiSeq platform (Illumina), in detecting reliably mitochondrial genome variability in both homoplasmy and heteroplasmy; 2) To assess the involvement of mitochondrial genome in the development of gliomas with different malignancy degrees. Both the methodology and the results and discussion were organised in 4 chapters. In the first chapter, the material and the methodology used in this work were detailed. In the second chapter, the results and discussion regarding the analysis of the quality of the data generated from the sequencing of the mtDNA samples were reported. In the third chapter, the results and discussion of the reliability and reproducibility of the results obtained in mtDNA analysis by generating independent NGS libraries were reported. Moreover, a new strategy was established to define heteroplasmy detection limits using NGS. Finally, in the fourth chapter the results and discussion of the analysis of mitochondrial variability in individuals affected by glioma were described. This work has allowed us to expand the knowledge regarding mitochondrial heteroplasmy detection using NGS and the role of mtDNA in glioma. Concerning mitochondrial heteroplasmy detection, a new strategy was presented to establish its detection limits, in an attempt to reduce misinterpretations of results. Regarding the study of glioma, the present work was the first to establish an association between mitochondrial haplogroups J and T and glioma, and it inferred the likelihood of tumours to progress to higher levels of malignancy according to the haplogroup. Likewise, the low amount of both mutations overrepresented in the study and mutations in stable positions that might have some impact at the pathogenic level, and the low mutational load detected in individuals affected by glioma, suggested that glioma tends to not accumulate mtDNA mutations to avoid generating a large amount of ROS in the environment and to progress to stages of higher levels of malignancy.

[es] La presente tesis doctoral se ha centrado en el estudio de la variabilidad del DNA mitocondrial (DNAmt) por secuenciación masiva (NGS) y el impacto de dicha variabilidad en el glioma cerebral. Debido al papel que desempeña la mitocondria en la producción de energía celular, se ha postulado que alteraciones en el DNAmt pueden contribuir al proceso carcinogénico, sobre todo en aquellos tejidos que requieren más energía, como el cerebral. Así pues, el estudio del glioma deviene muy interesante en términos de análisis mitocondrial. Asimismo, los avances en la secuenciación del DNAmt mediante NGS permiten realizar estudios sobre la variabilidad mitocondrial de forma más precisa y exhaustiva, particularmente en aquellos centrados en la detección y la determinación de la heteroplasmia mitocondrial. Sin embargo, la detección de la heteroplasmia a bajas frecuencias no es un proceso sencillo debido a la gran dificultad para discriminar correctamente la presencia de falsos positivos y falsos negativos, sin que de momento exista un criterio único que determine cuál es la mejor metodología para establecer un límite de detección fiable. Considerando estos aspectos, en la presente tesis doctoral se han planteado 2 objetivos principales: 1) Evaluar la capacidad de detección y reproducibilidad de la Next Generation Sequencing (NGS), utilizando la metodología de Nextera XT® y la plataforma MiSeq (Illumina), en la detección fiable de la variabilidad del genoma mitocondrial tanto en homoplasmia como en heteroplasmia; y 2) Valorar la implicación del genoma mitocondrial en el desarrollo de gliomas cerebrales de diferentes grados de malignidad. Tanto la metodología como los resultados y discusión se han organizado en 4 capítulos. En el primer capítulo se han descrito todos los aspectos relacionados con el material y la metodología empleada en el presente trabajo. En el segundo capítulo se han presentado los resultados y la discusión en relación al análisis de la calidad de los datos generados a partir de la secuenciación de las muestras de DNAmt. En el tercer capítulo se han descrito los resultados y la discusión en relación a la determinación de la fiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos en el análisis del DNAmt, a partir de la generación de librerías de NGS independientes. Además, se ha establecido una nueva estrategia para determinar los límites de detección de la heteroplasmia mitocondrial mediante NGS. Por último, en el cuarto capítulo se han presentado los resultados y la discusión basados en el análisis de la variabilidad mitocondrial de individuos afectos de glioma. El presente trabajo ha permitido ampliar los conocimientos respecto a la detección de la heteroplasmia mitocondrial mediante la tecnología de NGS y el papel del DNAmt en el glioma cerebral. A nivel de la detección de la heteroplasmia, se ha presentado una nueva estrategia para establecer sus límites de detección, intentando reducir errores en la interpretación de los resultados obtenidos. Respecto al estudio del glioma, este trabajo ha sido el primero en establecer una asociación de los haplogrupos mitocondriales J y T y el glioma cerebral y ha inferido en la probabilidad de que los tumores puedan progresar a grados de mayor malignidad según el haplogrupo. Asimismo, los resultados obtenidos respecto la baja cantidad tanto de mutaciones sobrerrepresentadas en el estudio como de mutaciones en posiciones estables que pueden tener cierto impacto a nivel patogénico, y la baja carga mutacional detectada en los individuos afectos de glioma, han sugerido una preferencia por parte del glioma de no acumular mutaciones en el DNAmt, con el fin de no generar una gran cantidad de ROS en el ambiente y poder progresar a estadios de mayor malignidad tumoral.