[en] The bases of tuberculosis (TB) control programs consist of a diagnosis and correct treatment of patients with active TB. An essential factor for controlling the spread of this disease is the ability to diagnose infected individuals in their early stages before they become infectious to others through the progression to active TB. The tuberculin skin test (TST) has been until now the only tool available for the diagnosis of latent tuberculosis infection (LTBI). Unfortunately, this test has some disadvantages because of its poor specificity that lead to false positive results by the BCG vaccine strain and nontuberculous mycobacteria (NTM) cross-reaction. Moreover, TST has a low sensibility in groups with impaired cellular immunity giving false negative results. CD4 T cells represent the major players in the protection against TB. Of greatest relevance are the T helper (Th) 1 cells, that produce IFN-g. The IFN-g cytokine activates macrophages for the development of a protective immunity against Mycobacterium tuberculosis. Therefore, an immunodiagnostic assay based on the in vitro quantification of this cellular immune response could be an alternative to the TST for the diagnosis of LTBI. In the last years, two specific M. tuberculosis antigens have been described. These antigens are early secretory antigenic target 6 (ESAT-6) and culture filtrate protein 10 (CFP-10), absent in BCG strain and in the majority of NTM. A new third M. tuberculosis antigen called TB7.7 has been also studied. In vitro assays for the diagnosis of LTBI, based on the detection of IFN-g secreted by effector T cells stimulated with these specific antigens, have been developed. There are two commercially available IFN-g T-cell based assays: QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFN-G-IT) and T-SPOT.TB, both approved by the U.S. Food and Drug Administration. QFN-G-IT test stimulates whole-blood with ESAT-6, CFP- 10 and TB7.7 in the same tube, and measures the concentration of IFN-g in supernatants with an ELISA assay. On the other hand, T-SPOT.TB assay stimulates isolated peripheral blood mononuclear cells with ESAT-6 and CFP-10 separately, and detects number of IFN-g producing T cells by means of an ELISPOT. In this sense, the main objectives of this Thesis are the standardization and clinical evaluation of these new immunological assays for the diagnosis of LTBI and active TB, their application in clinical practice in adult and pediatric immunocompetent and immunosuppressed population, and the evaluation of NTM effect in the LTBI diagnosis. Finally, we study and evaluate new antigens and potential biomarkers for the diagnosis of active TB and LTBI. In summary, IFN-g tests are more specific than TST because they are less affected by BCG vaccination and NTM sensitization. So, the utilization of these assays can help to reduce unnecessary LTBI treatment among adult and pediatric population. Therefore, detection of IFN-g produced by T cells after M. tuberculosis specific antigen stimulation is an alternative diagnostic tool for LTBI in immunocompetent and immunosuppressed patients. In addition, IFN-g assays could help in the immunodiagnosis of active TB. On the other hand, the study of new specific antigens and biomarkers is a potential tool for studying host immune response during anti-TB therapy and finding novel diagnostic markers for active TB and M. tuberculosis infection.

[es] La razón de ser del programa de control de tuberculosis es diagnosticar precozmente y tratar a los individuos enfermos de forma apropiada. Por otro lado, el estudio de las personas infectadas permite aplicar, medidas de prevención y evitar que estas personas desarrollen la enfermedad. La prueba de la tuberculina (PT) ha sido utilizada durante los últimos 100 años como herramienta para el diagnóstico de la infección tuberculosa. Su principal inconveniente radica en que la mayoría de proteínas presentes en el PPD no son específicas de Mycobacterium tuberculosis. Esto provoca una disminución en la especificidad de la prueba, ya que individuos sensibilizados por exposición previa a micobacterias no tuberculosas (MNT) o vacunados con la BCG también responden inmunológicamente al PPD. Además, la PT presenta una baja sensibilidad en pacientes con alteraciones en la inmunidad celular. 70 La citoquina efectora clave en el control de la infección micobacteriana para la activación de los macrófagos y el desarrollo de la inmunidad protectora contra M. tuberculosis es el IFN-g. Por lo tanto, un método de inmunodiagnóstico basado en la cuantificación in vitro de la respuesta inmune celular puede ser una alternativa a la PT. En los últimos años, se han descrito dos antígenos específicos de M. tuberculosis: Early Secretory Antigen Target-6 (ESAT-6) y Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10). Estos antígenos están ausentes en la cepa vacunal de la BCG y en la mayoría de MNT. También se ha estudiado un tercer antígeno llamado TB7.7. En este sentido han sido desarrollados diferentes métodos de cuantificación de la respuesta inmune celular utilizando estos antígenos específicos micobacterianos para la estimulación de las células T sensibilizadas y para la detección in vitro de IFN-g. En base a esta tecnología se han estandarizado dos técnicas comerciales: Quantiferon Gold In tube (QFN-G-IT) y T-SPOT.TB. QFN-G-IT estimula los linfocitos presentes en muestras de sangre total con los antígenos ESAT-6, CFP-10 y TB7.7 en un mismo tubo, y determina la producción de IFN-g mediante técnica de ELISA. Por otro lado, TSPOT. TB requiere una separación de células mononucleares para estimularlas con los antígenos ESAT-6 y CFP-10 por separado, y el IFN-g se detecta mediante ELISPOT. De esta forma, la Tesis se ha centrado en la estandarización y evaluación clínica de estas técnicas inmunológicas para el diagnóstico de la infección tuberculosa y TB activa, así como su aplicabilidad en la práctica clínica en pacientes adultos y pediátricos (inmunocompetentes e inmunodeprimidos), y el estudio del efecto de las MNT sobre la positividad de la PT. Finalmente, la Tesis se completa con la evaluación de nuevos marcadores y antígenos alternativos en el diagnóstico in vitro de la TB. En resumen, las técnicas basadas in vitro son más específicas que la PT, ya que están menos influenciadas por la vacuna de la BCG y la sensibilización a MNT. Por lo tanto, el uso de estas técnicas puede ayudar a reducir el número de quimioprofilaxis innecesarias en población adulta y pediátrica. La detección de IFN-g liberado por las células T sensibilizadas tras estimular con antígenos específicos de M. tuberculosis es una herramienta diagnóstica alternativa en el diagnóstico de la infección tuberculosa en población inmunocompetente e inmunodeprimida. Además, estas técnicas in vitro pueden ayudar en el inmunodiagnóstico de la TB activa. Por otro lado, el estudio de nuevos antígenos específicos y biomarcadores es una herramienta potencial para el estudio de la respuesta del huésped contra M. tuberculosis durante el tratamiento y la búsqueda de nuevos marcadores para el diagnóstico de la infección tuberculosa y TB activa.