[ca] Els nanofàrmacs poden superar les limitacions dels fàrmacs convencionals, oferint millors beneficis clínics i sòcio-econòmics. Poden ser de dos tipus: i) aquells en què les mateixes molècules terapèutiques actuen com a fàrmac; ii) aquells en què les molècules terapèutiques estan directament acoblades a una nanoestructura. Utilitzar nanoestructures com a sistemes d' alliberament de fàrmacs ofereix un seguit d'avantatges gràcies a la seva mida i ajustabilitat, ja que es poden dissenyar per modificar la semivida dels actius, millorar la seva biodistribució i controlar el seu perfil d'alliberament, traduint-se en un benefici global pel pacient. Tanmateix, la translació dels nanofàrmacs cap a etapes avançades de desenvolupament farmacèutic enfronta grans reptes, com l'alta qualitat requerida d'aquests per ser avaluats en proves preclíniques (i clíniques posteriorment) tenint en compte la seva complexa naturalesa multicomponent. En aquest treball s'ha realitzat una caracterització avançada per controlar i garantir la qualitat d'una nova formulació nanoliposomal, en desenvolupament, pel tractament de la malaltia de Fabry. Fabry és una malaltia minoritària pertanyent al grup de trastorns d'emmagatzematge lisosomal on la manca/deficiència de l'enzim [Alfa]-galactosidasa (GLA) provoca l'acumulació lisosomal de glicoesfingolípids, ocasionant una patologia multisistèmica i la mort prematura. La teràpia de reemplaçament enzimàtic (TRE) mitjançant l'administració intravenosa de l'enzim és la principal opció de tractament per als malalts de Fabry. No obstant, la TRE mostra una sèrie de limitacions: mala biodistribució, baixa capacitat per creuar membranes biològiques, alta immunogenicitat i eficàcia limitada. Actualment s'està explorant l'ús de nanotransportadors capaços d'encapsular proteïnes com a estratègia alternativa per superar aquestes limitacions. Nanoliposomes funcionalitzats amb el pèptid RGD, carregats amb GLA i preparats mitjançant la metodologia verda i escalable DELOS-susp han donat lloc a un producte patentat més eficaç a nivell preclínic que les TRE tradicionals comercialitzades. Aquest benefici ha estat reconegut per l'EMA mitjançant la designació de medicament orfe. Tot i així, per convertir aquesta nanoformulació en un potencial candidat a producte farmacèutic, es necessita una major comprensió i control sobre la interacció molecular i supramolecular del liposoma (nanoestructura) i la GLA (biomolècula). En aquesta tesi s'han explorat quatre versions d'enzims GLA recombinants, els quals difereixen en l'expressió d'etiquetes de purificació i en els sistemes d'expressió emprats per la seva producció (cèl·lules de mamífers de ronyó embrionari humà (HEK) o d'ovari de hàmster xinès (CHO)), per tal d'investigar quines propietats de l'enzim són les més favorables per generar nanoconjugats GLA-nanoliposoma estables, eficients i robusts com a teràpia de Fabry. L'enzim GLA expressat en cèl·lules CHO i sense etiquetes de purificació va demostrar ser el candidat més prometedor per obtenir nanoconjugats GLA-nanoliposoma amb major eficiència d'encapsulació i activitat enzimàtica. D'altra banda, la complexitat d'aquesta nanoformulació comporta que petits canvis en la seva composició, medi, concentració o forma farmacèutica puguin afectar severament al seu rendiment, seguretat i eficiència in vivo. Per això, és crucial aconseguir un control adequat dels atributs crítics de qualitat (ACQ) per poder garantir la qualitat desitjada del producte abans d'arribar a la fase clínica. Per adreçar aquest objectiu, en aquesta tesi s'han desenvolupat, optimitzat i/o validat diverses metodologies per caracteritzar i controlar els següents ACQ, tenint sempre en compte el requeriments de les agències reguladores: i) la composició química de la membrana liposomal, ii) la qualitat microbiològica i el contingut d'endotoxines, iii) el perfil cinètic d'alliberament de l'enzim GLA, així com la pèrdua de GLA encapsulada en els nanoliposomes al llarg del temps, durant l'emmagatzematge, iv) els possibles productes de degradació dels components nanoliposomals, i v) la presència del pèptid RGD en la membrana nanoliposomal. En resum, els resultats assolits en aquesta tesi suposen una contribució important per avançar en el desenvolupament preclínic d'aquesta nanoformulació pel tractament de Fabry.

[en] Nanopharmaceuticals can overcome the limitations of conventional drugs, offering enhanced clinical and socio-economic benefits. Nanopharmaceuticals can be of two types: i) those where the therapeutic molecules are themselves the drug; ii) those where the therapeutic molecules are directly coupled to a nanocarrier. Nanocarriers as drug delivery systems offer many advantages thanks to their size and tuneability; these can be designed to modify the half-life of compounds, alter their biodistribution and control the drug release profile, eventually providing an overall clinical benefit to patients. However, the translation of nanopharmaceuticals from lab bench to an advanced stage of pharmaceutical development faces significant challenges. Among others, the high-quality that these novel nanoformulations must meet for the preclinical (and further clinical) testing is a major challenge due to their complex multicomponent nature. Herein, an advanced characterization effort was carried out to guarantee and control the quality of a novel, under development, nanoliposomal formulation for Fabry disease treatment. Fabry disease is an X-linked rare disease belonging to the lysosomal storage disorders group in which the lack/deficiency of [Alfa]-galactosidase (GLA) enzyme causes the lysosomal accumulation of neutral glycosphingolipids, resulting in a multisystemic pathology and the premature death. Enzyme replacement therapy (ERT) through the intravenous administration of the missing enzyme is the main treatment option for Fabry patients. However, ERT shows potential limitations such as poor biodistribution, poor capacity to cross biological membranes, high immunogenicity, and limited efficacy. The use of nanocarriers capable to encapsulate proteins is currently being explored and exploited as an alternative strategy to overcome the handicaps of the traditional ERTs. RGD-targeted nanoliposomes entrapping the GLA enzyme and prepared by the green-scalable DELOS-susp methodology yielded a patented product more effective at preclinical level than traditional marketed ERTs. This significant benefit was recognized by the EMA by means of the Orphan Drug Designation. In order to support the development of this nanoformulation to become a potential intravenous drug product candidate, further understanding and control of the molecular and supramolecular interaction between the liposomal nanocarrier and the GLA enzyme is required. Four recombinant GLA enzymes differing in purification tags and expression systems were explored in this thesis, using human embryonic kidney (HEK) or Chinese hamster ovary (CHO) mammalian expression systems, in order to investigate which GLA properties are the most favorable to generate stable, efficient and robust liposome-based nanoconjugates for Fabry therapy. The use of GLA protein without purification tags and expressed in CHO cells demonstrated to be the most promising drug substance candidate to obtain GLA-loaded liposomes with higher protein entrapment efficiency and increased enzymatic activity. Moreover, due to the complexity of these nanoliposomes, small changes in their composition, media, concentration or pharmaceutical form can severely impact on their in vivo performance, safety and efficiency profile. A suitable characterization and control of the critical quality attributes (CQAs) to ensure the desired product quality is crucial prior the cGMP production batch to entry the clinical phase. To address this issue, in this thesis advanced methodologies were developed, optimized and/or validated to characterize and/or control the following CQAs, taking into account the regulatory compliance requirements: i) the chemical membrane composition of the nanoliposomal formulations; ii) the microbiological contamination and bacteria endotoxin content; iii) the GLA release kinetics profile and the GLA leakage rate from the nanoliposomes throughout shelf-life; iv) the potential degradation products from nanoliposomal components; and v) the targeting ligand integration in the nanoliposomal membrane. In summary, the results achieved in this thesis are an important contribution to advance in the CMC development of the GLA-loaded nanoliposomal formulation for Fabry disease treatment.