[en] Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is defined as a chronic fibrosing interstitial pneumonia of unknown, progressive and fatal cause that mainly affects adults over 60 years of age, limited to the lungs and associated with the histopathological pattern of usual interstitial pneumonia (UIP). The absence of specific manifestations of IPF is an obstacle to its early detection. It is a disease of late and challenging diagnosis, with a therapeutic approach of reduced efficacy. These characteristics raise the need to find new biomarkers associated with fibrosis and new therapeutic targets for an early diagnosis and increase patients' quality and life expectancy. The pathogenesis of the disease involves a loss of alveolar epithelial cells, a proliferation of fibroblasts and their transformation to myofibroblasts in an environment of remodeling of the extracellular matrix produced by an imbalance of secretory and soluble factors. This fibrotic microenvironment favors cellular senescence, the acquisition of the mesenchymal phenotype and/or associated with the myofibroblast, as well as changes in cellular metabolism. The myofibroblast phenotype, considered an effector of the fibrotic process, plays a role of enormous importance due to its capacity for proliferation, migration, contraction and synthesis of collagen and other proteins of the extracellular matrix. Previous results from our group identify the metabolic enzyme NNMT as a director of epithelial-mesenchymal transformation (EMT) in models of non-small cell lung cancer tumor epithelial cells resistant to therapy. Other studies describe its importance in similar processes associated with gastric cancer, prostate cancer, ovarian cancer and glioblastomas. NNMT catalyzes the methylation of nicotinamide (NAM) and similar compounds using S-adenosylmethionine (SAM) as a methyl donor to produce S-adenosylhomocysteine (SAH) and methyl nicotinamide (1-MNA), modifying metabolism and cellular methylation capacity. With this background, we hypothesized that NNMT could play a relevant role in the fibrotic processes associated with fibroblast-myofibroblast transformation (FMT) that could be reflected in the clinical development of patients with IPF. Therefore, our objective has been to study the involvement of NNMT in FMT, senescence and metabolism of primary fibroblasts isolated from patients with IPF compared to control fibroblasts. Using clinical histology samples, we also considered whether NNMT could be a biomarker for the disease. Primary fibroblast cultures were isolated and cultured from lung biopsies of IPF patients (N = 15) and compared with fibroblast populations obtained from pneumothorax patients as a control group (N = 30). Using TGF-β1 as a profibrotic factor and IL-1β as an antifibrotic and pro-inflammatory factor, these populations were characterized by analyzing parameters associated with the FMT, EMT and senescence process. Next, using lentivirus gene transduction techniques, NNMT was inhibited and overexpressed to evaluate its role in these processes and its impact on cell metabolism. Finally, the presence of NNMT was analyzed in histological sections from patients, comparing it with other fibrotic markers. The results show us that IPF fibroblasts exhibit overexpression of fibrotic markers such as α-SMA, COL1A1 and COL1A2, and senescence markers (p16, p21 and β-galactosidase activity) compared to control fibroblasts. Induction with TGF-β1 produced an increase in the expression of fibrotic markers such as α-SMA, FN1, COL1A1 and COL1A2 and mesenchymal markers such as n-cadherin and SNAI1, both in fibrotic fibroblasts and controls. In contrast, IL-1β caused a decrease in these markers in fibrotic fibroblasts but not in control fibroblasts. The enzymatic activity of NNMT was shown to be increased in IPF fibroblasts compared to controls. This result was corroborated by observing a significant increase in the protein and gene expression of this protein in fibrotic fibroblasts. The inhibition of NNMT in IPF fibroblasts caused a decrease in the expression of fibrotic markers (α-SMA), mesenchymal (SNAI1 and vimentin) and senescence (p16, p21 and β-galactosidase activity) in shNNMT fibroblasts compared to the control ones (shNT). In contrast, the overexpression of NNMT in IPF fibroblasts (NNMT) produced a significant increase in fibrotic, mesenchymal and senescence markers compared to control fibroblasts (Flag). Regarding the wound closure capacity of fibroblast cultures, the repression and overexpression of NNMT produced an increase and a decrease in the area closed by migration and/or proliferation, respectively, compared to control fibroblasts. Immunofluorescence studies in these fibroblasts with fluorescent specific antibodies for NNMT and α-SMA showed that both markers co-express, which could indicate that they would have a direct relationship in the acquisition of the myofibroblast phenotype and the development of fibrosis. Modulation of NNMT levels represented a metabolic change in fibrotic fibroblasts. Fibroblast populations with high levels of NNMT showed a decrease in 1-MNA and NAM and an increase in metabolites of the polyamine pathway (spermine and spermidine). However, the levels of NAD + did not show changes between the different groups. Finally, the immunohistochemical results obtained from paraffin tissue sections from patients with IPF showed us that NNMT, like α-SMA, is expressed in reactive fibrosis areas and not in healthy tissue. In conclusion, our results indicate that NNMT is expressed in clinical samples from patients with IPF and in fibroblasts obtained from them. Furthermore, control and fibrotic fibroblasts overexpress NNMT in profibrotic environments (TGF-β1), and this expression is decreased in antifibrotic environments (IL-1β). NNMT gene overexpression increases the fibrotic and senescent phenotype associated with fibroblasts, and its repression decreases it. All of this points to the fact that NNMT plays an essential role in the fibrotic, senescence and metabolic processes associated with fibrotic fibroblasts and IPF and presents us with this enzyme as a promising fibrosis marker that could constitute a therapeutic target for the treatment of this pathology.

[es] La Fibrosis Pulmonar idiopática (FPI) está definida como una neumonía intersticial fibrosante crónica de causa desconocida, progresiva y fatal que afecta fundamentalmente a adultos mayores de 60 años, limitada a los pulmones y asociada con el patrón histopatológico de neumonía intersticial usual (NIU). La ausencia de manifestaciones específicas de la FPI supone un obstáculo para su detección temprana. Es una enfermedad de diagnóstico difícil y tardío, con un abordaje terapéutico de eficacia reducida. Estas características suscitan la necesidad de encontrar nuevos biomarcadores asociados a la fibrosis y nuevas dianas terapéuticas para un diagnóstico temprano e incrementar la calidad y esperanza de vida de los pacientes. La patogenia de la enfermedad conlleva una pérdida de células epiteliales alveolares, una proliferación de fibroblastos y su transformación a miofibroblastos, en un ambiente de remodelación de la matriz extracelular producida por un desequilibro de factores de secreción y solubles. Este microambiente fibrótico favorece la senescencia celular, la adquisición de fenotipo mesenquimal y/o asociado al miofibroblasto, así como cambios en el metabolismo celular. El fenotipo miofibroblasto, considerado efector del proceso fibrótico, juega un papel de enorme importancia debido a su capacidad de proliferación, migración, contracción y síntesis de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular. Resultados previos de nuestro grupo identifican la enzima metabólica NNMT como directora de la transformación epitelio-mesenquimal (EMT) en modelos de células epiteliales tumorales de cáncer de pulmón no microcítico resistentes a la terapia. Otros estudios describen su importancia en procesos similares asociados al cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer de ovario y glioblastomas. La NNMT cataliza la metilación de la nicotinamida (NAM) y compuestos similares usando la S-adenosilmetionina (SAM) como dador de metilos para producir S-adenosilhomocisteína (SAH) y metilnicotinamida (1-MNA), modificando el metabolismo y la capacidad de metilación celular. Con estos antecedentes, nuestra hipótesis fue que la NNMT podría jugar un papel de relevancia en los procesos fibróticos asociados a la transformación fibroblasto-miofibroblasto (FMT) que se pudiese reflejar en el desarrollo clínico de los pacientes con FPI. Por tanto, nuestro objetivo ha sido estudiar la implicación de la NNMT en la FMT, la senescencia y el metabolismo de poblaciones de fibroblastos aislados de pacientes con FPI respecto a los fibroblastos control. Utilizando muestras clínicas de histología, también nos planteamos determinar si NNMT podría ser un biomarcador de la enfermedad. Se aislaron y cultivaron poblaciones de fibroblastos primarios procedentes de biopsias pulmonares de pacientes con FPI (N=15) y se compararon con poblaciones de fibroblastos obtenidos de pacientes con neumotórax como grupo control (N=30). Utilizando TGF-β1 como factor profibrótico e IL1β como factor antifibrótico y proinflamatorio, se caracterizaron estas poblaciones analizando parámetros asociados al proceso FMT, EMT y de senescencia. A continuación, mediante técnicas de transducción génica con lentivirus, se inhibió y se sobreexpresó la NNMT con objeto de evaluar su rol en estos procesos y su repercusión en el metabolismo celular. Finalmente, se analizó la presencia de NNMT en cortes histológicos procedentes de pacientes comparándola con otros marcadores fibróticos. Los resultados nos muestran que los fibroblastos de FPI presentan una sobreexpresión de marcadores fibróticos como el α-SMA, COL1A1 y COL1A2, así como de marcadores de senescencia (p16, p21 y actividad β-galactosidasa) respecto a los fibroblastos control. La inducción con TGF-β1 produjo un aumento en la expresión de marcadores fibróticos como el α-SMA, FN1, COL1A1 y COL1A2 y marcadores mesenquimales como la n-cadherina y SNAI1, tanto en fibroblastos fibróticos como control. En cambio, la IL1β provocó una disminución de estos marcadores en los fibroblastos fibróticos, pero no en los fibroblastos control. La actividad enzimática de la NNMT se mostró incrementada en fibroblastos de FPI respecto a los controles. Este resultado se corroboró al observar un aumento significativo de la expresión proteica y génica de dicha proteína en los fibroblastos fibróticos. La inhibición de NNMT en fibroblastos de FPI provocó una disminución en la expresión de marcadores fibróticos (α-SMA), mesenquimales (SNAI1 y vimentina) y de senescencia (p16, p21 y actividad β-galactosidasa) en estas poblaciones shNNMT respecto a las poblaciones control (shNT). En contraste, la sobreexpresión de NNMT en fibroblastos de FPI (NNMT) produjo un aumento significativo de los marcadores fibróticos, mesenquimales y de senescencia respecto a las poblaciones control (Flag). Respecto a la capacidad de cierre de la herida de los cultivos de fibroblastos, la represión y la sobreexpresión de NNMT produjo un incremento y una disminución del área cerrada por migración y/o proliferación respectivamente, comparado con fibroblastos control. Estudios de inmunofluorescencia en estas poblaciones con anticuerpos fluorescentes específicos para NNMT y α-SMA mostraron que ambos marcadores co-expresan, lo que podría indicar que tendrían una relación directa en la adquisición del fenotipo miofibroblastos y el desarrollo de la fibrosis. La modulación de los niveles de NNMT representaron un cambio metabólico en los fibroblastos fibróticos. Las poblaciones de fibroblastos con niveles elevados de NNMT mostraron una disminución de 1-MNA y NAM y un aumento de los metabolitos de la ruta de las poliaminas (espermina y espermidina). Sin embargo, los niveles de NAD+ no mostraron cambios entre los distintos grupos. Finalmente, los resultados de inmunohistoquímica obtenidos de cortes de tejido parafinado procedentes de pacientes con FPI nos mostraron que NNMT, al igual que α-SMA, se expresa en las zonas de fibrosis reactiva y no en tejido sano. En conclusión, nuestros resultados indican que la NNMT se expresa en muestras clínicas de pacientes con FPI y en fibroblastos obtenidos de los mismos. Además, los fibroblastos control y fibróticos sobreexpresan NNMT en ambientes profibróticos (TGF-β1) y esta expresión disminuye en ambientes antifibróticos (IL-1β). La sobreexpresión génica de NNMT aumenta el fenotipo fibrótico y senescente asociado a los fibroblastos y su represión lo disminuye. Todo ello apunta a que la NNMT juega un papel de relevancia en los procesos fibróticos, de senescencia y metabólicos asociados a los fibroblastos fibróticos y a la FPI y nos presenta a esta enzima como un marcador prometedor de fibrosis que podría constituir una diana terapéutica para el tratamiento de esta patología.