[en] Although it is well established that apoptotic mechanisms play a central role in neuronal death after different types of CNS damage, little is known about the activation of apoptotic pathways in glial cells which have been postulated to be important for the termination of the glial response. It is remarkable that the classically defined main executioner of programmed cell death, caspase-3, has recently been attributed a non-apoptotic role, participating in cellular events including cell proliferation, cell cycle regulation, or cellular differentiation. Accordingly, the general aim of this thesis was to analyze the putative role of the classic apoptotic and anti-apoptotic pathways after acute excitotoxic damage to the immature rat brain. For this purpose, a well-characterized in vivo model of excitotoxicity was used, where damage was induced by the intracortical injection of N-methyl-D-asparate (NMDA) in postnatal day 9 rats. Cell death, apoptotic and anti-apoptotic proteins were analyzed at different survival times after the lesion by enzymatic assays and double immunofluorescence for confocal microscope analysis. The first set of results demonstrated that although cleaved caspase-3 was found in some damaged neurons showing TUNEL+ nuclei, cleaved caspase-3 was mainly observed in the nucleus of activated astrocytes in the lesioned hemisphere as early as 4 h post-lesion, persisted until the glial scar was formed at 7-14 days, and was marginally associated with TUNEL labeling. Caspase-3 enzymatic activity was significant during the first hours post-lesion and co-localized with the presence of caspase-cleaved fragments of glial fibrillary acidic protein (CCP-GFAP) in astrocytes. However, at longer survival times, when astroglial hypertrophy was observed, astroglial caspase-3 did not generally correlate with GFAP cleavage but instead was associated with de novo expression of vimentin. Moreover, astroglial caspase-3 cleavage was not associated with cell proliferation. These first results provided evidence for a non-traditional role of caspases in astroglial function, suggesting that caspase activation may be important for astroglial cytoskeleton remodeling following injury. Secondly, in order to evaluate upstream pathways activating caspase-3 in neurons and glial cells, the spatio-temporal activation of the intrinsic and extrinsic apoptosis pathways were analyzed. In damaged neuronal cells of the ipsilateral cortex and hippocampus an important contribution of the intrinsic mitochondrial pathway through caspase-9 activation was shown to account for most of neuronal caspase-3 activation and apoptotic nuclei. However, neuronal caspase-8 showed a diminished correlation with caspase-3 and characteristically showed cortical layer specificity. In glial cells, activation of caspase-9, caspase-8, and also p53, another putative caspase-3 activating molecule, was only significant in cortical layer VI and the corpus callosum, suggesting that astroglial caspase-3 does not generally correlate with classical upstream activating pathways. In the third part of this thesis, inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) and heat shock proteins (HSPs), known inhibitors of cleaved caspase-3 in other cell types, were analyzed. Whereas neuronal cells showed noticeable expression of HSC70/HSP70 and cIAP-2, these poorly correlated with caspase-3 in this cell type. In astrocytes, survivin and the small HSP25/27 showed a strong correlation with caspase-3 in several regions and throughout different survival times, pointing to these proteins as relevant candidates for the blockade of caspase-3 enzymatic activity, which could account for the absence of astroglial cell death. In conclusion, this thesis has discerned new non-apoptotic roles of caspase-3 in astroglial cells and suggests mechanisms for caspase-3 blockade in these glial cells, improving the understanding of the mechanisms employed by astrocytes to cope with damage in the immature brain.

[es] Los mecanismos apoptóticos han sido estudiados en profundidad, constituyendo un papel substancial en la muerte neuronal tras diferentes tipos de daño en el SNC. No obstante, muy poco se sabe acerca de la activación de los mecanismos apoptóticos en las células gliales y su relevancia en la terminación de la respuesta glial. La caspasa-3 ha sido definida clásicamente como al principal ejecutora de la muerte celular programada, le han sido recientemente atribuidos otros papeles no-apoptóticos, participando en acontecimientos celulares, incluyendo proliferación celular, regulación del ciclo celular, y vías celulares apoptóticas y antiapoptóticas después de un daño excitotóxico en el cerebro inmaduro de rata. Para este propósito, se ha utilizado un modelo de excitotoxicidad bien caracterizado, que consiste en la inducción de un daño cerebral mediante una inyección intracortical de N-methyl-D-asparate (NMDA) en ratas postnatales en el día 9 de vida (P9). La muerte celular, las proteínas apoptóticas y antiapoptóticas fueron analizadas a distintos tiempos de supervivencia después de la lesión por ensayos enzimáticos y análisis de doble fluorescencia con microscopía confocal. Los primeros resultados como la caspasa-3 clivada se presentaba en neuronas dañadas con los núcleos TUNEL+, aunque fue observada mayoritariamente en el núcleo de astrocitos activados en el hemisferio lesionado sin asociación con fragmentación del ADN, desde tiempos tempranos las 4 horas post-lesión (hpl) hasta la formación de la cicatriz glial a los 7-14 días, sin encontrarse asociación con marcaje con TUNEL. La actividad enzimática de la caspasa-3 fue detectada a las primeras horas post-lesión y coincidiendo con los fragmentos clivados por caspasas de la proteína acídica fibrilar (CCP-GFAP) en astrocitos. Sin embargo, a largos tiempos de supervivencia, cuando surge la hipertrofia astroglial, la caspasa-3 astroglial generalmente no correlacionó con el clivage de CCP-GFAP, pero en cambio se relacionó con la expresión de novo de vimentina. Por otra parte, la caspasa-3 clivada no se ha vinculado a proliferación celular. Estes resultados iniciales mostraron la evidencia de un no-tradicional papel de las caspasas en la función astroglial, sugeriendo que su activación puede ser importante para la reestructuración del citoesqueleto después de un daño. Secundariamente, al evaluar las vías de activación de la caspasa-3 en neuronas y células gliales, la activación espacio-temporal de las vías apoptóticas intrínseca y extrínseca fueron analizadas. Se expresó principalmente en las neuronas dañadas corticales e hipocampales, una importante contribución de la vía intrínseca através de la gran proporción de caspasa-9 activa con la activación neuronal de la caspase-3 y muerte celular. Por otra banda, la caspasa-8 presentó una reducida correlación con la caspasa-3, y característicamente presentó con especificidad en las capas corticales. En las células gliales, la activación de la caspasa-9, caspasa-8, y también p53, otra molécula que activa la caspasa-3 indirectamente, fue solamente significante en la capa cortical VI y en el corpus callosum, sugeriendo que la caspasa-3 astroglial no se correlaciona generalmente con las clásicas vías de activación. La tercera parte de esta tesis se focalizó en el estudio de las moléculas antiapoptóticas, como varios inhibitores de apoptosis (IAPs) y las heat shock proteins (HSPs), conocidas como inhibidoras de la caspasa-3 clivada en otros tipos celulares. Las neuronas presentaron una apreciable expresión de HSC70/HSP70 y cIAP-2, aunque estas pobremente se correlacionan con caspasa-3 en este tipo celular. En astrocitos , la survivina y la chaperona HSP25/27 mostraron una fuerte correlación con caspasa-3 en varias regiones cerebrales y a varios tiempos de supervivencia, siendo estas proteínas destacadas candidatas para el bloqueo de la actividad enzimática de la caspasa-3, la cual podría acumularse en ausencia de muerte astroglial. En conclusión esta tesis ha destapado nuevos roles no apoptóticos de la caspasa-3 en células astrogliales, sugeriendo mecanismos de bloqueo de la caspasa-3, ayudando a la mejor comprensión de los mecanismos empleados por los astrocitos para enfrentarse al daño en el cerebro inmaduro.