[en] While super-resolution microscopy has brought a significant improvement in nano-scale imaging of molecular assemblies in biological media, its extension to imaging molecular orientation using fluorescence anisotropy has not yet been fully explored. Providing orientational order information at the nano-scale would be of considerable interest for the understanding of biological functions since they are intrinsically related to structural fundamental processes such as in protein clustering in cell membranes, supra-molecular polymerization or aggregation. In this thesis, we propose a super-resolution polarization-resolved microscopy technique able to image molecular orientation behaviors in static and dynamic environments, in order to report structural information at the single molecule level and at nanometric spatial scale. Using direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) in combination with polarized detection, fluorescence anisotropy images are reconstructed at a spatial resolution of a few tens of nanometers. We analyze numerically the principle of the method in combination with models for orientational order mechanisms, and provide conditions for which this information can be retrieved with high precision in biological samples based on fibrillar structures. Finally, we propose an alternative technique based on stochastic fluctuations of single molecules: polarized super-resolution optical fluctuation imaging (polar-SOFI), and compare this approach with the previous one in terms of information gained and spatial resolution. We illustrate both techniques on molecular order imaging in actin stress fibers and tubulin fibers in fixed cells, DNA fibers and insulin amyloid fibrils.

[es] La microscopía de súper resolución ha aportado una mejora significativa en la imagen, a escala nanométrica, de ensambles moleculares en medios biológicos. Sin embargo, su extensión, mediante la utilización de la anisotropía de fluorescencia para la obtención de imágenes de orientación molecular, aún no ha sido explorada a fondo. El proporcionar información sobre la orientación molecular a escala nanométrica es de gran interés para la comprensión de las funciones biológicas. Esta información está intrínsecamente relacionada con la estructura de los ensamblajes de proteínas en las membranas celulares, la polimerización y la agregación supra molecular, entre otros. En esta tesis, proponemos una técnica de microscopía de luz polarizada de súper resolución, la cual permite visualizar el comportamiento de la orientación molecular en ambientes dinámicos y estáticos. El objetivo final es el de poder reportar información estructural a nivel de molécula única y escala espacial nanométrica. Utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica (dSTORM) en combinación con detección polarizada, las imágenes de anisotropía de fluorescencia son reconstruidas con una resolución espacial de varias decenas de nanómetros. Además, el principio del método ha sido validado numéricamente en combinación con modelos de mecanismos de orientación molecular y delimitando las condiciones en que esta información se puede obtener con una precisión alta en muestras biológicas, principalmente en estructuras fibrilares. Así también, se propone una técnica alternativa basada en la emisión de fluctuaciones estocásticas de moléculas individuales: imagen de polarización con súper resolución de fluctuaciones (polar-SOFI). Además comparamos esta técnica con la anterior, en términos de la información obtenida y la resolución espacial. Finalmente, ilustramos ambas técnicas para la obtención de imágenes del orden molecular de fibras de estrés de actina y tubulina en células fijas, fibras de ADN y fibrillas de insulina amiloide.