[en] During development the lymphocytes have many choices by taking in order to define their identity. The first choice is about T (LT) or B (LB) lineage. Then the lymphocytes select their TCR αβ or γδ. Later they define their identity with CD4 vs CD8 co-receptors. Finally, in periphery they define among Th1, Th2, Th17, or regulatory T cells (Treg) lineages. Some stages of T cells differentiation are complex to identify such as Treg or Recent Thymic Emigrants (RTEs). The T cell differentiation and development are control by activation and repression a lot of specific genes. The Epigenetica and specifically the DNA methylation has a pivotal role in genome dynamics. In the human genome DNA methylation plays an important role in establishing and maintaining chromatin structures and in regulating gene transcription during development and differentiation. DNA methylation predominantly occurs at cytosine guanine dinucleotide (CpG). However, some areas are CpG rich and they are not always methylated. These regions are calling CpG islands (CGIs) and are present in many promoter genes or intragenic places. This mechanism has an important role in T-cell and lineage commitment and differentiation. The CD4 and CD8 co-receptor is coded by the CD4, and CD8A, and CD8B genes, and is the main lineage differentiation protein for T cells. CD4 gene has a CGIs upstream on the promoter and CD8A gene has three well-defined CGIs amenable to perform quantitative DNA methylation analysis. The aim of the present work is to analyze the methylation pattern of CD4 and CD8A genes and assess its possible use for staging the maturation state of CD4 and CD8 T lymphocytes. We studied three CpG islands located within promoter region of CD8A gene. The methylation analysis was performed in purified T cell populations from human thymus, cord blood and adult peripheral blood. T lymphocytes were sorted by FACS and included: i) single positive CD4 and CD8 T cells from thymus and ii) recent thymic emigrants (RTEs), naïve and memory T cells from cord blood and from adult blood. Genomic DNA from each population was treated with bisulfite and amplified by Nested-PCR with specific primers for each CpG island. The PCR products were cloned and sequenced for quantitative methylation analysis. Initial results showed that CpG Island 2 is not methylated in any of the T cell populations studied, while the CpG islands 1 and 3 have a variable degree of methylation. We identified a specific region of CD8A CpG island 1 that is differentially methylated in T cell populations. This region is clearly more methylated in CD4 T cells than in CD8 T cells. Moreover, within CD8 T cell populations there were differences between naïve and memory cells. It was also feasible to design a protocol for the rapid detection of methylation in this region. This protocol is based on the ability of FRET probes to discriminate nucleotide changes in a melting step by qPCR. Using it we were able to analyze 4 CpG positions and we determined the exact number of methylated positions (0-4) in each sample. In conclusion, we have identified a specific region in CD8A gene that is differentially methylated in T cell populations, which could be an epigenetic marker for T cell differentiation between CD4 and CD8 lymphocytes. The methylation patterns of this region are probably part of the maturation mechanisms that occur in the transition from naïve to memory cells among CD8 T lymphocytes.

[es] Durante su desarrollo los linfocitos tienen una serie de elecciones secuenciales para definir su identidad. Primero, la selección entre el linaje T (LT) o B (LB), luego la definición de su TCR como αβ o γδ posteriormente definir su identidad con los correceptores CD4 vs CD8 y, en periferia después de la activación del LT naive definir los linajes Th1, Th2, células T reguladores (Treg) o Th17. Algunos estadios de diferenciación en las células T son complejos de identificar y cuantificar. Especialmente, en sangre periférica, un ejemplo claro son las Treg o las células emigrantes tímicas recientes (RTEs). El control de la diferenciación y desarrollo de los LT se inician sin cambios en la secuencia del DNA pero con una constante activación y represión de transcritos de muchos genes. La regulación epigenética tiene un papel clave en la dinámica del genoma de los LT. Los cambios epigenéticos mantienen la estructura de la cromatina y regulan la transcripción de genes durante su desarrollo y diferenciación, principalmente por la metilación del DNA. La metilación se da en dinucleótidos CG. Sin embargo, hay unas regiones ricas en estos dinucleótidos conocidas como islas CpG (CGI), que no se metilan comúnmente y que se ubican en regiones promotoras, intergénicas o intragénicas. La metilación diferencial de estas regiones en muchos genes establecer perfiles de metilación de cada estadio de diferenciación celular y podrían ser marcadores de estadios celulares. Nuestra hipótesis es que la metilación del DNA, juega un papel clave en la diferenciación e identidad celular en humanos y que los perfiles de metilación del DNA de algunos genes, expresados diferencialmente en los estadios de maduración de los LT, como los genes que codifican para CD4 y CD8 pueden ser un marcador celular especialmente para el estadio de RTEs. Los objetivos fueron: i) analizar los patrones de metilación de los genes CD4, CD8A y CD8B durante el desarrollo de LT tímicos y periféricos; ii) diseñar una prueba molecular sensible y específica para identificar gradientes de metilación en poblaciones de LT y asociarlas con su grado de diferenciación. Estudiamos una CGI en el gen CD4 y tres CGIs en el gen CD8A en diferentes poblaciones de LT separadas por FACS sorting, de timo, sangre de cordón y sangre periférica de adultos sanos. Extrajimos el DNA, el cual se trato con bisulfito de sodio y luego se secuenció cada CGI. Nuestros resultados muestran que las CGI del gen CD4 no se metila diferencialmente en LT. La CGI-2 del gen CD8A no se metila en ningún caso, la CGI-3 presenta el mayor grado de metilación, pero sin diferencias entre linajes ni poblaciones y en la CGI-1 del gen CD8A identificamos una región diferencialmente metilada (DMR). Sobre esta región diseñamos por primera vez una prueba de PCR cuantitativa con sondas FRET, que permiten discriminar cambios en las temperaturas de melt cuando las CpG están o no metiladas en cada población de LT. Usando esta prueba pudimos analizar la DMR y pudimos discriminar claramente entre LT CD4 y CD8. Además, permite identificar en sangre periférica de adultos entre RTE CD8 y LT CD8 naive. También observamos que los LT CD4 incrementan la metilación de esta región a medida que van madurando En conclusión encontramos una región en el gen CD8A, ubicada en el extremo 5' de la CGI-1 que puede ser un marcador epigenético para diferenciar LT CD4 y CD8 y algunos estadios de desarrollo celular. Esta región puede estar involucrada en mecanismos de regulación de la expresión del gen CD8 y con la identidad celular.