[en] Ochratoxin A (OTA) is a toxic secondary metabolite produced by moulds belonging essentially to the Aspergillus and Penicillium genera, under diverse conditions. Its presence in the human body is due to the ingestion of small quantities present in a wide range of food commodities, both of vegetable and animal origin. Next to cereals, wine in the European diet is the second major source of OTA. OTA is a potent toxin affecting mainly the kidneys, in which it can cause both acute and chronic lesions. Besides nephrotoxicity, toxicological studies on animals have demonstrated that it has mainly, genotoxicity, carcinogenicity and immunosuppressive properties. Furthermore, it is suspected to be a possible cause of the fatal human disease known as Balkan endemic nephropathy observed in South Eastern Europe, and of the urinary tract tumours in humans. Briefly, the objectives of the present project are: (i) to assess the level of OTA contamination in Spanish grape-based beverages and to study the possible influence of several variables in the OTA content of wines and derivatives; (ii) to survey the mycoflora of several Spanish vineyards during four-year consecutive field samplings, in order to clarify where, when and to what extent OTA occurs in this country; (iii) to identify and study the effect of various ecophysiological factors and their interactions on potential ochratoxigenic fungi isolated from wine grapes, in order to find out the conditions that might minimize or prevent their growth and OTA formation. Additional studies to investigate, first the impact of application of fungicides to grapes in vitro, and later the effect of different fungicide treatments on grapes in the field, were carried out. Visualization of Aspergillus carbonarius grape colonization and early infection was also achieved with epi-, stereo- and confocal fluorescence microscopy, after the transformation of this fungus with the reporter green fluorescent protein gene (gfp). It has been shown that nearly 20 % of the Spanish wines tested contained OTA, most of them at concentrations below the EU limits, and that black aspergilli are responsible for the production of this toxin in this country, mainly A. carbonarius. Despite A. niger aggregate species were dominant in grapes, because of their modest ability and low amounts produced, their contribution to the OTA problem is rather small. Uniseriate species were discarded as a source of OTA in the surveyed regions, as no toxin was detected in any of the isolates. Black aspergilli were present on grapes from setting to harvest in most of the vineyards. However, their occurrence increased with grape maturity in the field, related to the fact that high temperature and humidity favoured black aspergilli development and OTA production. It was shown the growing ability of A. carbonarius in the range 10-45 °C and 0.88-0.995 of water activity (aw), with an optimum around 30 °C and at the highest aw. Temperature conditions for OTA production were more restrictive, with optimum detected at 20 °C and at the highest water availability. Other ecophysiological factors such as the country of origin of the strains, photoperiod conditions, alternation of temperatures, etc. were also studied, as understanding the factors leading to OTA synthesis will enable strategies to limit its formation. Several effective ways for prevention and control of black aspergilli and their dangerous mycotoxin have been suggested in the final part of this thesis. As OTA production by black aspergilli has been shown to occur optimally very early after inoculation, minimizing the harvesting and transport time to wine cellars might be crucial to reduce the toxin levels. Attention should also be paid in minimizing damages on grape skin, as it was shown that openings trigger the entrance of the fungi colonizing the berry surface, probably enabling production of maximum amounts of OTA. The implementation of other preventive measures such as controlling pathogenic fungi and insects during grape growing -some fungicides have been tested in vitro and in vivo-, and other good agricultural practices, may help in the reduction of OTA contamination in grapes. As a general conclusion, several factors were found to help in the prevention of ochratoxigenic fungi development, but it may be necessary to apply a multiple barrier approach to control the growth and subsequent OTA production of these microorganisms. Prevention measures are always preferable to corrective actions, and together with a proper control of OTA in grape-derivatives, should ensure the adequate protection of the consumer.

[es] La ocratoxina A (OTA) es un metabolito secundario tóxico producido esencialmente por hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium, bajo diversas condiciones. Su presencia en el cuerpo humano es debida a la ingestión de pequeñas cantidades provenidas de un amplio abanico de alimentos, tanto de origen vegetal como animal. Después de los cereales, el vino es el elemento en la dieta europea que más contribuye a la ingesta diaria de OTA. La OTA es una potente toxina que afecta principalmente los riñones, dónde puede provocar tanto lesiones agudas como crónicas. A parte de la nefrotoxicidad, estudios toxicológicos en animales han demostrado que también tiene propiedades genotóxicas, carcinogénicas e inmunosupresivas. Además, se sospecha que es la causa de una enfermedad mortal para los humanos observada en la Europa del Este y conocida como la 'Nefropatía Endémica de los Balcanes', así como de la formación de tumores en el tracto urinario de humanos. Brevemente, los objetivos del presente trabajo son: (i) valorar el nivel de contaminación por OTA en bebidas españolas derivadas de la uva y estudiar la posible influencia de varias variables en el contenido de OTA de vinos y productos derivados; (ii) estudiar la micoflora de distintos viñedos españoles durante cuatro años consecutivos mediante muestreos de campo, para esclarecer dónde, cuándo y hasta que punto existe OTA en este país; (iii) identificar y estudiar el efecto de varios factores ecofisiológicos y de sus interacciones en hongos potencialmente productores de OTA aislados de uva de vinificación, para encontrar las condiciones que puedan minimizar o prevenir su crecimiento y la formación de OTA. Se llevaron a cabo estudios adicionales para investigar en primer lugar los efectos in vitro de la aplicación de fungicidas en uva, seguido del efecto de diferentes tratamientos fungicidas en uva en el campo. También se ha conseguido visualizar la colonización y los primeros estadios de infección de Aspergillus carbonarius en uva, gracias a la microscopia de fluorescencia láser confocal, epi- y estereomicroscopia, después de transformar este hongo con el gen de la proteína de fluorescencia verde (gfp). Se vio que aproximadamente un 20 % de los vinos españoles analizados contenían OTA, la mayoría a concentraciones por debajo de los límites establecidos por la UE, y que los Aspergillus negros son los responsables de la producción de esta toxina en este país, sobretodo Aspergillus carbonarius. Pese al dominio de las especies del agregado A. niger en la uva, y debido a su modesta capacidad de producir la toxina y a las bajas cantidades producidas, su contribución al problema de la OTA es ínfima. Las especies uniseriadas fueron descartadas en este aspecto, ya que no se detectó toxina en ninguna de les cepas aisladas. Se detectaron Aspergillus negros en la uva desde el cuajado hasta la cosecha, en la mayoría de viñedos. No obstante, su incidencia aumentó con la maduración de la uva, pues las altas temperaturas y humedad favorecieron el desarrollo y producción de OTA por estos hongos. Se demostró la capacidad de A. carbonarius de crecer en el intervalo 10-45 °C y 0,88-0,995 de actividad de agua (aw), con el óptimo alrededor de 30 °C y a las más altas aw. Las condiciones de temperatura favorables para la producción de OTA fueron más restringidas, siendo 20 °C y las altas aw las condiciones óptimas. También se estudiaron otros factores ecofisiológicos como el país de origen de las cepas, las condiciones de fotoperiodo, la alternancia de temperaturas, etc., pues el conocimiento de los factores que dan lugar a la producción de OTA pueden ayudar a diseñar estrategias para limitar su formación. En la parte final de esta tesis se han sugerido varias maneras de prevenir y controlar los Aspergillus negros y su micotoxina. Como que se ha visto que la producción de OTA por los Aspergillus negros es óptima poco tiempo después de su inoculación, la reducción del tiempo de cosecha y transporte a la bodega será decisivo para reducir los niveles de esta toxina. También se ha de procurar minimizar los daños en la piel de la uva, pues se ha visto que las aperturas fomentan la entrada del hongo que se encuentra colonizando la superficie, probablemente permitiendo la máxima producción de OTA. La implementación de otras medidas preventivas como el control de hongos patógenos y de insectos durante el crecimiento de la uva -se ensayaron varios fungicidas in vitro e in vivo-, y de otras buenas prácticas agronómicas, pueden ayudar a reducir la contaminación por OTA de la uva. Como conclusión general, se ha visto que varios factores poden ayudar a prevenir el desarrollo de los hongos ocratoxigénicos, pero es necesario aplicar un sistema de métodos combinados para controlar el crecimiento y subsiguiente producción de OTA por estos microorganismos. Las medidas preventivas son siempre preferibles a las acciones correctoras, y junto con un debido control de la OTA en los derivados de la uva, aseguraran una adecuada protección del consumidor.