[en] Gene editing consists of the modification of the genomic sequence. The development of programmable endonucleases supposed an important advance in the efficiency of gene editing. The use of this technology is widely developed and has different applications such as basic science, improving agricultural production, or biomedicine applications. The pig (Sus scrofa domesticus) is one of the most important animals in the meat industry worldwide. The in vitro embryo production in this species is still inefficient due to the high incidence of polyspermic and suboptimal embryo development, being this an important limitation. For this reason, one of the main objectives of this Thesis was to optimize the conditions for the generation of knock-out (KO) pig embryos by different methodologies to achieve the higher efficiency of the system, in terms of blastocyst formation and mutation rates. On the other hand, the production of gene-edited embryos has an important limitation, the incidence of mosaicism, thus being another central objective of this study to produce embryos with the lowest mosaicism incidence to later obtain pigs with the desired mutation and maximum efficiency. All the studies shown in this Doctoral Thesis were based on the use of a conventional system of in vitro embryo production (IVP) involving the use of immature cumulus-oocyte complexes (COCs) and the in vitro fertilization (IVF), followed by an embryo culture procedure. In this experimental work, frozen-thawed boar semen is routinely used for IVF after being selected by a swim-up procedure that had been previously optimized too. Mutation detection was performed using the ﬂuorescent PCR-capillary gel electrophoresis technique. Samples were considered wild type when the peak obtained by capillary electrophoresis was the same size as control peak. Other peaks were considered to be KO, and when more than two peaks were detected, this sample was evaluated as a mosaic. In chapter 2 the time of microinjection and the use of Cas9 as RNA or ribonucleoprotein (RNP) were evaluated. When Cas9 was delivered as mRNA, mutation rate was similar in all groups, being around 30-42%, whereas the mosaicism rate was between 0-21%. On the other hand, when RNP was delivered, mutation rates did not differ between groups but were higher compared with those microinjected with Cas9-mRNA. Mosaicism rate was lower in the group microinjected before insemination (15%) compared with those injected afterwards (33-57%). Therefore, in vitro-produced embryos microinjected with RNP before insemination followed by embryo transfer allowed the production of two females and one male with frame shift mutations in both alleles of the TPC2 gene. In chapter 3, after the optimization of electroporation conditions and changes to the ratio of sgRNA:Cas9, the efﬁciency of electroporation was tested in comparison to microinjection to analyse different strategies to generate CAPN3 KO pig embryo that could be models of LGMDR1 human disease. Regarding mutation parameters and blastocyst rate, no differences were found between either the methods (electroporation vs. microinjection) or the combination of guides. In the last chapter, the objective was to evaluate whether the application of aphidicolin makes it possible to improve the gene-editing system by reducing the mosaicism without affecting the quality and quantity of genetically modiﬁed embryos obtained. For this, sgRNAs against TPCN1 were used. As a result, a positive effect in avoiding the mosaicism and a negative effect of aphidicolin were observed in blastocyst development was observed. Therefore, under the tested conditions in these experiments, the use of aphidicolin did not show any advantage. In conclusion, after the studies carried out in the different chapters of this Thesis, an efficient and optimized system has been established to generate gene-edited embryos and pigs that could be used for human disease models.

[es] La edición génica consiste en la modificación de la secuencia de ADN. El desarrollo de endonucleasas programables ha supuesto un importante avance en la eficiencia de la edición génica. El uso de esta tecnología se encuentra ampliamente desarrollada, presentando diversas aplicaciones como: ciencia básica, mejora en la producción ganadera y aplicaciones biomédicas. El cerdo (Sus scrofa domesticus) es uno de los animales más importantes en la industria cárnica a nivel mundial. La producción de embriones in vitro en esta especie es aún ineficiente debido a la alta poliespermia y un desarrollo embrionario subóptimo. Por esto, uno de los principales objetivos fue optimizar las condiciones para la generación de embriones de cerdo knock-out (KO) mediante diferentes metodologías para maximizar la eficiencia del sistema, en términos de desarrollo embrionario y mutación. Por otro lado, la producción de embriones editados genéticamente tiene una importante limitación, el mosaicismo, siendo así otro objetivo central de este estudio producir embriones con la menor incidencia de mosaicismo para posteriormente obtener cerdos con la mutación deseada. Todos los estudios mostrados en esta Tesis Doctoral se basaron en el uso de un sistema convencional de producción de embriones in vitro (PIV) que implica la maduración de complejos cúmulo-ovocito (COC) y la fecundación in vitro (FIV), seguida de cultivo embrionario. En este trabajo experimental, semen de verraco congelado-descongelado se usa para la FIV después de ser seleccionado mediante swim-up, que también se había optimizado previamente. La detección de mutaciones se realizó mediante PCR con cebadores fluorescentes seguida de una electroforesis capilar. Las muestras se consideraron nativas cuando el pico obtenido por electroforesis capilar fue del mismo tamaño que el pico de control. Otros picos se consideraron KO, y cuando se detectaron más de dos picos, se evaluó como mosaico. En el capítulo 2 se evaluó el tiempo de microinyección y el uso de Cas9 como ARN o ribonucleoproteína (RNP). Cuando Cas9 se administró como ARNm, la tasa de mutación fue similar en todos los grupos (30-42%), mientras que la tasa de mosaicismo fue de 0-21%. Por otro lado, con RNP, las tasas de mutación no difirieron entre los grupos, pero fueron más altas en comparación con Cas9-mARN. La tasa de mosaicismo fue menor en el grupo microinyectado antes de la inseminación (15%) en comparación con los inyectados después (33-57%). Por lo tanto, los embriones microinyectados con RNP antes de la inseminación seguida de la transferencia de embriones permitieron la producción de dos hembras y un macho con mutaciones en ambos alelos del gen TPC2. En el capítulo 3, después de la optimización de las condiciones de electroporación y en la proporción de sgRNA:Cas9, se probó la eficiencia de la electroporación frente a la microinyección para analizar diferentes estrategias para generar embriones CAPN3-KO que podrían ser modelos de LGMDR1. En cuanto a los parámetros de mutación y tasa de blastocistos, no se encontraron diferencias entre los métodos (electroporación vs. microinyección) ni la combinación de guías. En el último capítulo, el objetivo fue evaluar si la aplicación de afidicolina permite mejorar el sistema de edición de genes reduciendo el mosaicismo sin afectar la calidad-cantidad de embriones genéticamente modificados obtenidos. Para ello se utilizaron sgRNAs contra TPCN1. Como resultado, se observó un efecto positivo al evitar el mosaicismo y un efecto negativo en el desarrollo embrionario. Por lo tanto, bajo las condiciones probadas en estos experimentos, el uso de afidicolina no mostró ninguna ventaja. En conclusión, tras los estudios realizados en los diferentes capítulos de esta Tesis, se ha establecido un sistema eficiente y optimizado para generar embriones y cerdos editados genéticamente que podrían utilizarse para modelos de enfermedades humanas.