[ca] Els glicolípids són una gran família de molècules amfifíliques amb una part polar formada per una o més unitats de sucre i una part apolar lipídica. Aquests compostos estructurals mostren un gran interès industrial i farmacològic gràcies a les seves propietats tant físiques com biològiques. Existeixen diverses aplicacions com per exemple en la farmacèutica, cosmètica, o com a biosurfactants i adjuvants de fàrmacs, entre d'altres. Tot i existir un gran interès en aquests compostos, la seva utilització en la indústria biotecnològica es veu limitada per la seva producció i obtenció. La síntesis química presenta moltes dificultats i etapes de protecció i desprotecció degut la necessitat d'obtenir la regioespecificitat d'aquestes molècules. Una altra alternativa possible és l'obtenció mitjançant síntesis enzimàtica, però l'alt cost d'alguns dels substrats lipídics o sucres activats fan incrementar el cost total del procés. Així que una tercera estratègia que apareix com a prometedora és l'enginyeria metabòlica de plataformes cel·lulars que, un cop transformades amb els enzims necessaris per la síntesis d'aquests compostos, proporcionin les eines moleculars i els metabòlits necessaris per sintetitzar i obtenir el producte desitjat. Com a organisme hoste per incorporar els enzims per efectuar aquestes enginyeries metabòliques és proposa la microalga verda unicel·lular Chlamydomonas reinhardtii. Aquesta microalga presenta una àmplia bateria d'eines moleculars, el seu genoma seqüenciat i metodologies de transformació tant del genoma nuclear com del genoma del cloroplast. Apart, es presenta com una microalga segura (GRAS) i per tant amb un gran potencial biotecnològic. Al consistir en un organisme fotosintètic pot transformar el diòxid de carboni en el nostre compost d'interès, gràcies a la llum solar, obtenint així el nostre compost d'una forma més sostenible amb una petjada de carboni menor. És per tot això que les microalgues ja s'utilitzen actualment per produir proteïnes recombinants d'interès, en la indústria de la alimentació, creació de biopolímers o bioplàstics, font de biocombustibles i fins i tot bioremediació. En aquest projecte de tesis s'hi van realitzar dues estratègies per tal de produir dos glicolípids amb valor afegit, com són els glicoglicerolípids i els ramnolípids, i explorar, alhora, dues estratègies d'enginyeria: transformació del genoma nuclear i transformació del genoma del cloroplast de Chlamydomonas reinhardtii. En la primera estratègia es pretén expressar de forma heteròloga la glicosiltransferasa de Mycoplasma genitalium MG517 que catalitza l'enllaç glicosídic d'una glucosa o galactosa a una unitat lipídica de diacilglicerol. L'expressió de la MG517 pretenia obtenir un nou reservori de glicoglicerolípids (presents de forma endògena en els tilacoides del cloroplast de C.reinhardtii) en el compartiment del citosol/reticle endoplasmàtic. A més a més aquesta nova glicosiltransferasa a l'hoste C.reinhardtii aportaria biodiversitat als glicoglicerolípids, ja que aquesta microalga tant sols presenta galactosildiacilglicerols amb unes cadenes lipídiques concretes (provinents de la ruta procariota del cloroplast) i al incorporar la MG517 es vol crear també glicosildiacilglicerols amb diferents cadenes lipídiques, presents en el reticle endoplasmàtic. S'explora, doncs, la transformació nuclear del genoma de Chlamydomonas reinhardtii mitjançant electroporació i agitació amb "glass beads" i es realitzen estudis moleculars per cercar la proteïna recombinant i estudis del perfil lipídic de la microalga per tal d'analitzar-ne el producte. També es proven diferents soques recipients de l'enginyeria, s'introdueixen introns interespaiats a la seqüència codificant del gen, i es cerca una metodologia de rastreig massiu per tal de trobar línies candidates òptimes.Tot i els esforços bolcats en aquest apartat, es va aconseguir detectar la proteïna recombinant de l'enzim MG517 però la seva inestable expressió al llarg de les generacions impossibilitava l'estudi de la seva activitat, i aquesta problemàtica no va semblar desaparèixer amb el canvi de sistemes d'expressió ni amb la inserció d'introns al casset d'expressió. El sistemes de cribratge es van posar apunt però no van aconseguir detectar candidates per l'expressió de la proteïna de fusió mVenus+MG517. Pel que fa la segona estratègia, es vol introduir, no tant sols un gen, sinó la ruta de síntesis de ramnolípids de Pseudomonas aeruginosa per així obtenir una plataforma cel·lular verda per la producció d'aquests biosurfactants amb alt interès comercial. Es van introduir els gens rhlA (cadena A de ramnosiltransferasa) que dona l'enzim RhlA, que catalitza la formació d'HAA (àcid 3-(3-hidroxialcanoiloxi)alcanoat), i el gen rhlB (cadena B de ramnosiltransferasa) que produeix mono-ramnolípids per la unió de ramnosa en el compost lipídic d'HAA. Per aquest objectiu es selecciona el cloroplast com a diana, degut a la presencia del substrat de l'enzim RhlA, 3-hidroxiacil-ACP, en el cicle de síntesis dels àcids grassos i per explorar un alternativa a l'expressió de proteïnes per la via nuclear. Es pretén, en un inici, expressar tant sols el primer enzim, RhlA i analitzar la seva expressió i activitat mitjançant la detecció del seu producte lipídic HAA. Posteriorment es volen introduir els següents gens de la síntesi dels ramnolípids com és el cas de la ramnosiltransferasa RhlB i analitzar també la seva presència i la seva activitat detectant el producte de mono-ramnolípid. Es va arribar a detectar l'expressió de l'enzim RhlA i el seu producte HAA presentant diversitat de congèneres, essent el HAA (C10-C10) i HAA(C10-C8) els més abundants. Per el que fa l'expressió de RhlB no es va poder arribar a detectar la proteïna tot i que si que estudis preliminars detecten el producte de síntesis de l'enzim RhlB, el mono-ramnolípid. Totes dues estratègies obren portes de noves metodologies al laboratori i creen noves proves de concepte sobre aquesta microalga verda, que es planteja com una possible plataforma cel·lular per la producció de glicolípids amb valor afegit.

[es] Los glicolípidos son una gran familia de moléculas anfifílicas con una parte polar formada por una o más unidades de azúcar y una parte apolar lipídica. Estos compuestos estructurales muestran un gran interés industrial y farmacológico gracias a sus propiedades tanto físicas como biológicas. Existen diversas aplicaciones como por ejemplo en la farmacéutica, cosmética, o como biosurfactantes y adyuvantes de fármacos, entre otros. Aunque existe un gran interés en estos compuestos, su utilización en la industria biotecnológica se ve limitada por su producción y obtención. La síntesis química presenta muchas dificultades y etapas de protección y desprotección debido a la necesidad de obtener la regioespecificidad. Otra alternativa posible es la obtención mediante síntesis enzimática, pero el alto coste de algunos de los sustratos lipídicos o azúcares activados incrementan el coste total del proceso. Así que una tercera estrategia que aparece como prometedora es la ingeniería metabólica de plataformas celulares que, una vez transformadas con las enzimas necesarias por la síntesis de estos compuestos, proporcionen las herramientas moleculares y los metabolitos necesarios para sintetizar y obtener el producto deseado. Como organismo huésped para incorporar las enzimas para efectuar estas ingenierías metabólicas se propone la microalga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii. Esta microalga presenta una batería de herramientas moleculares, un genoma secuenciado y metodologías de transformación tanto del genoma nuclear como del genoma del cloroplasto. Aparte, se presenta como una microalga segura (GRAS) y por tanto con un gran potencial biotecnológico. Al consistir en un organismo fotosintético puede transformar el dióxido de carbono atmosférico, gracias a la luz solar, en nuestro compuesto de interés, obteniendo así nuestro compuesto con una huella de carbono menor. Por todo ello, las microalgas ya se utilizan actualmente para producir proteínas recombinantes de interés, en la industria de la alimentación, creación de biopolímeros o bioplásticos, fuente de biocombustibles e incluso biorremediación. En este proyecto de tesis se realizaron dos estrategias para producir dos glicolípidos con valor añadido, como son los glicoglicerolípidos y los ramnolípidos, y explorar, al mismo tiempo, dos estrategias de ingeniería: transformación del genoma nuclear y transformación del genoma del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii. En la primera estrategia se pretende expresar de forma heteróloga la glicosiltransferasa de Mycoplasma genitalium MG517 que cataliza el enlace glicosídico de una glucosa o galactosa a una unidad lipídica de diacilglicerol. La expresión de la MG517 pretendía obtener un nuevo reservorio de glicoglicerolípidos (presentes de forma endógena en los tilacoides del cloroplasto de C.reinhardtii) en el compartimiento del citosol/retículo endoplasmático. Además esta nueva glicosiltransferasa al huésped de C.reinhardtii aportaría biodiversidad a los glicoglicerolípidos, ya que esta microalga sólo presenta galactosildiacilgliceroles con unas cadenas lipídicas concretas (provenientes de la ruta procariota del cloroplasto) y al incorporar la MG51 también glicosildiacilgliceroles con diferentes cadenas lipídicas, presentes en el retículo endoplasmático. Se explora, pues, la transformación nuclear del genoma de Chlamydomonas reinhardtii mediante electroporación y agitación con "glass beads" y se realizan estudios moleculares para buscar la proteína recombinante y estudios del perfil lipídico de la microalga para analizar su producto. También se prueban diferentes cepas recipientes de la ingeniería, se introducen intrones interespaciados en la secuencia codificante del gen, y se busca una metodología de rastreo masivo para encontrar líneas candidatas óptimas. A pesar de los esfuerzos volcados en este apartado, se logró detectar la proteína recombinante de la enzima MG517 pero su inestable expresión a lo largo de las generaciones imposibilitaba el estudio de su actividad, y esta problemática no pareció desaparecer con el cambio de sistemas de expresión ni con la inserción de intrones en el casete de expresión. Los sistemas de cribado se optimizaron, pero no lograron detectar candidatas por la expresión de la proteína de fusión mVenus+MG517. En cuanto a la segunda estrategia, se quiere introducir, no sólo un gen, sino la ruta de síntesis de ramnolípidos de Pseudomonas aeruginosa para así obtener una plataforma celular verde para la producción de estos biosurfactantes con alto interés comercial. Se introdujeron los genes rhlA (cadena A de ramnosiltransferasa) que da enzima RhlA que cataliza la formación de HAA(ácido 3-(3-hidroxialcanoiloxi)alcanoato), y el gen rhlB (cadena B de ramnosiltransferasa) que produce mono- por la unión de ramnosa en el compuesto lipídico de HAA. Para este objetivo se selecciona el cloroplasto como diana, debido a la presencia del sustrato de la enzima RhlA, 3-hidroxiacilo-ACP, en el ciclo de síntesis de los ácidos grasos y para explorar una alternativa a la expresión de proteínas por la vía nuclear. Se pretende, en un inicio, expresar tan sólo la primera enzima, RhlA y analizar su expresión y actividad mediante la detección de su producto lipídico HAA. Posteriormente se quieren introducir los siguientes genes de la síntesis de los ramnolípidos como es el caso de la ramnosiltransferasa RhlB y analizar también su presencia y su actividad detectando el producto de mono-ramnolípido. Se llegó a detectar la expresión de la enzima RhlA y su producto HAA presentando diversidad de congéneres, siendo el HAA (C10-C10) y HAA(C10-C8) los más abundantes. En cuanto a la expresión de RhlB no se pudo llegar a detectar la proteína, aunque estudios preliminares detectan el producto de síntesis de la enzima RhlB, el mono-ramnolípido. Ambas estrategias abren puertas de nuevas metodologías en el laboratorio y crean nuevas pruebas de concepto sobre esta microalga verde, que se plantea como una posible plataforma celular para la producción de glicolípidos con valor añadido.