[en] For most of human history, pathogens have been a leading cause of death and illness. Although we have attained the ability to treat them easily, thanks to the discovery of antibiotics, the widespread overuse and misuse of antimicrobial drugs have accelerated the appearance of antimicrobial resistances (AMRs). Because AMRs have rendered most antimicrobial drugs ineffective, the development of alternative approaches is more necessary than ever before. Host defense peptides (HDPs) have been proposed as blueprints for the generation of new antimicrobials to fight AMR infections. Despite this, most HDPs are produced by chemical synthesis, which is expensive, unsustainable, and difficult to scale-up. Alternatively, their recombinant production is very appealing but still challenging. HDPs are highly susceptible to degradation and are generally toxic to the recombinant host. However, inclusion bodies (IBs), which are protein aggregates that usually happen during recombinant production, can be used to allow HDP formation inside the host without being harmful. Also, the construction of chimeric proteins could be a strategy for successful recombinant expression of small peptides. In this context, this dissertation explores several new strategies for the recombinant production of HDPs. We tried leucine zippers as potential domains to drive the recombinant production of HDPs to the insoluble fraction and improve IBs protein quality. After that, we developed several antimicrobial multidomain proteins based on the fusion of different peptides and proteins from innate immunity. Because we also used leucine zippers with these constructs, they could be produced effectively - without toxicity to the microbial cell factory. Moreover, when needed, we were able to recover soluble antimicrobials from IBs using a mild, non-denaturing protocol. Overall, we demonstrated that these constructs have a broad-spectrum antimicrobial action against multi-drug resistant (MDR) bacteria, in both the soluble and IB format, and that they could trigger the release of IL-8 within a range of potential immunomodulatory properties. These outcomes invited us to use our constructs in the biofunctionalization of self-assembled monolayers to avoid biofilm formation. We observed that the chimeric proteins could be anchored to these materials and avoid biofilm growth. In sum, these results reinforce multidomain antimicrobial proteins as potential antimicrobial alternatives with immunomodulatory properties and open up the possibility for many applications of this new generation of antimicrobial protein nanoparticles as well as their soluble analogs.

[es] Durante la mayor parte de la historia humana, los patógenos han sido una de las principales causas de muertes y enfermedades. Gracias al descubrimiento de los antibióticos hemos conseguido tratar estas enfermedades con facilidad, pero su mal uso ha acelerado la aparición de resistencias a los antimicrobianos (AMRs). Dado que las AMRs han provocado que la mayoría de fármacos antimicrobianos sean ineficaces, el desarrollo de tratamientos alternativos es más necesario que nunca. Los péptidos de la defensa del huésped (HDPs) han sido propuestos como modelos para la generación de nuevos antimicrobianos para luchar contra las infecciones AMR. Sin embargo, la mayoría de HDPs se producen mediante la síntesis química, un proceso que es caro, insostenible y difícil de escalar. Alternativamente, la producción recombinante de HDPs es muy atractiva pero complicada, ya que son péptidos altamente susceptibles de ser degradados y son tóxicos para el huésped recombinante. Sin embargo, los cuerpos de inclusión (IBs), que son agregados de proteína formados durante los procesos de producción recombinante, se pueden utilizar como formato alternativo al de la proteína soluble para permitir la producción de HDPs dentro del huésped sin efectos tóxicos. Por otra parte, la construcción de proteínas quiméricas podría ser una estrategia para expresar péptidos pequeños con éxito. En este contexto, esta tesis explora diversas estrategias para la producción recombinante de HDPs. Por un lado, hemos explorado el uso de las cremalleras de leucina como dominios potenciales para fomentar la producción recombinante de HDPs en la fracción insoluble y para aumentar la calidad de la proteína recombinante en los IBs. Además, hemos desarrollado varias proteínas antimicrobianas multidominio basadas en la fusión de diferentes péptidos HDP y proteínas de la inmunidad innata. Como también hemos utilizado cremalleras de leucina en estos constructos, se pueden expresar de manera efectiva - sin toxicidad para la célula productora. Además, en caso de necesidad, podemos recuperar antimicrobianos solubles a partir de los IBs gracias a un protocolo de solubilización suave y no desnaturalizando. En conjunto, hemos demostrado que estos constructos tienen un amplio espectro de acción antimicrobiana contra bacterias multi resistentes (MDR), tanto en el formato soluble como en el formato de IBs. Es más, los constructos también son capaces de estimular la liberación de IL-8 dentro de un potencial rango de propiedades inmunomoduladoras. Estos resultados nos han invitado a utilizar nuestras proteínas en la biofuncionalizacón de monocapas autoensamblantes para evitar la formación de biofilms, y hemos observado que estas proteínas pueden anclarse a estos materiales y evitar el crecimiento de biofilms. En resumen, estos resultados refuerzan las proteínas antimicrobianas multidominio como potenciales alternativas antimicrobianas con propiedades inmunomoduladoras.