[en] The increasing interest in using virus-like particles (VLPs) as vaccine candidates, vectors for gene and cancer therapy, and nanocarriers for drug delivery has led to a higher demand for efficient and scalable biomanufacturing platforms. Their structural similarity to viruses, without containing the infectious viral components, makes them excellent candidates for these applications. However, their manufacturing involves complex processes, including production by cell culture, purification, and formulation to meet clinical standards. This thesis addresses the critical challenges in VLP bioprocessing through four chapters, focusing on purification, formulation and functionalization of HIV-1 Gag VLPs. Purification of VLPs is a crucial phase in the bioprocess of these nanoparticles, which ensures the removal of contaminants such as extracellular vesicles, host cell proteins, and DNA. Chapter One delves into the comparison of various downstream processing technologies to optimize the purification of HIV-1 Gag VLPs. The purification process proposed encompasses four key steps: clarification through depth filtration and standard filtration, concentration and intermediate purification via tangential flow filtration or multimodal chromatography, capture using ion exchange, hydrophobic interaction and heparin affinity chromatography, and polishing with size exclusion chromatography. The study evaluates each step based on yield, purity, and contaminant removal efficiency. A comprehensive purification process has been defined based on the best results obtained in each step. This process yielded an overall recovery of 38% and purity of 64% after the polishing step. The levels of DNA and protein contaminants met regulatory standards. Chapter Two focuses on the optimization of lyophilization formulations for HIV-1 Gag VLPs using a Design of Experiments approach. Various excipients, including cryo-lyo protectants, bulking agents, buffers, tonicity modifiers, and surfactants, are evaluated for their impact on VLP size, concentration, and quality. The optimized formulation composed by sucrose, arginine, TrisHCl, sodium chloride and polysorbate 80 successfully preserves the integrity of the VLPs. The thermostability studies show that structural integrity characteristics is maintained at 4°C for 4 weeks, in both lyophilized and reconstituted form. In Chapter Three, the advances in purification and formulation are applied to develop a complete bioprocess for HIV-1 Gag VLPs. This includes a perfusion-based upstream production followed by a three-step downstream purification process. The perfusion-based approach yields a 2.4-fold improvement in VLP volumetric productivity compared to previous results. The subsequent downstream processes, including secondary clarification and anion exchange chromatography show around a 60% purity of VLPs. The final lyophilization step maintained VLP integrity. The functionalization of VLPs for targeted drug delivery represents a significant alternative in cancer therapy. In Chapter Four the use of HIV-1 Gag VLPs functionalized with the T22 peptide, a known antagonist of the CXCR4 receptor associated to various cancers. VLPs produced in HEK293 cells and purified through the DSP proposed in chapter one have been functionalized via click chemistry. In vitro studies have demonstrated that the T22-functionalized VLPs specifically target and penetrate CXCR4-positive cells, with a notable increase in intracellular fluorescence compared to non-functionalized VLPs. This specificity highlights the potential of VLPs as nanocarriers for selective drug delivery. Overall, this thesis provides a comprehensive exploration of the purification, formulation, and functionalization of HIV-1 Gag VLPs, addressing key challenges and paving the way for their clinical application as vaccines and targeted cancer therapies.

[es] El creciente interés en el uso de partículas similares a virus (VLP) como candidatos vacunales, vectores para terapias génicas y oncológicas y nanoportadores para la administración de fármacos ha generado una mayor demanda de plataformas de biofabricación eficientes y escalables. Su similitud estructural con los virus los convierte en excelentes candidatos. Sin embargo, su fabricación implica procesos complejos, incluida la producción mediante cultivo celular, purificación y formulación para cumplir con los estándares clínicos. Esta tesis aborda los desafíos críticos en el bioprocesamiento de las VLPs a través de cuatro capítulos, centrándose en la purificación, formulación y funcionalización de las VLPs basadas en la poliproteína Gag del VIH-1. La purificación de las VLPs es una fase crucial en el bioproceso de estas nanopartículas. El Capítulo Uno profundiza en la comparación de tecnologías para optimizar la purificación de las Gag VLPs. El proceso de purificación propuesto abarca cuatro pasos: clarificación mediante filtración profunda y filtración estándar, concentración y purificación intermedia mediante filtración de flujo tangencial o cromatografía multimodal, captura mediante cromatografía de intercambio iónico, interacción hidrofóbica y afinidad por heparina, y pulido con cromatografía de exclusión por tamaño. Se evalúa cada paso según el rendimiento, la pureza y la eliminación de contaminantes. Se ha definido un proceso de purificación integral en base a los mejores resultados obtenidos en cada paso. Este proceso produjo una recuperación general del 38 % y una pureza del 64 %. Los niveles de ADN y proteínas contaminantes cumplieron con los estándares regulatorios. El Capítulo Dos se centra en la optimización de formulaciones de liofilización para las Gag VLPs mediante un enfoque de Diseño de Experimentos. Se evalúan varios excipientes, incluidos crio-lio protectores, agentes de carga, tampones, modificadores de tonicidad y tensioactivos, para determinar su impacto en el tamaño, la concentración y la calidad de las VLPs. La formulación optimizada compuesta por sacarosa, arginina, TrisHCl, cloruro de sodio y polisorbato 80 preserva con éxito la integridad de las VLPs. Los estudios de termoestabilidad muestran que las características de integridad estructural se mantienen a 4°C durante 4 semanas, tanto en forma liofilizada como reconstituida. En el Capítulo Tres se aplican los avances en purificación y formulación para desarrollar un bioproceso completo. Esto incluye una producción previa basada en perfusión seguida de un proceso de purificación. El enfoque basado en perfusión produce una mejora 2.4 veces en la productividad volumétrica de las VLPs en comparación con resultados anteriores. El proceso de purificación que incluyó la clarificación secundaria y la cromatografía de intercambio aniónico, muestran valores aproximados de pureza del 60%. El paso final de liofilización mantuvo la integridad de las VLPs. La funcionalización de las VLPs para la administración dirigida de fármacos representa una alternativa importante en la terapia del cáncer. En el Capítulo Cuatro se analiza el uso de las Gag VLPs funcionalizadas con el péptido T22, conocido antagonista del receptor CXCR4 el cual está asociado a varios cánceres. Las VLPs producidas en células HEK293 y purificadas mediante el proceso propuesto en el capítulo uno se han funcionalizado mediante reacciones químicas. Los estudios in vitro han demostrado que las VLPs funcionalizadas se dirigen específicamente y penetran en las células CXCR4 positivas, con un aumento notable de la fluorescencia intracelular en comparación con las VLPs no funcionalizadas. Esta especificidad resalta el potencial de las VLPs como nanoportadores para la administración selectiva de fármacos. En general, esta tesis proporciona una exploración integral de la purificación, formulación y funcionalización de las Gag VLP del VIH-1, abordando desafíos claves y allanando el camino para su aplicación clínica como vacunas y terapias dirigidas contra el cáncer.