[en] Baculoviruses are a large group of pathogenic insect viruses that are characterized by their high specificity. The main application is their use as a bioinsecticidal against different crop pests, although some of their characteristics have allowed the development of technologies to use the baculoviruses as vectors for the heterologous protein expression, as well as in gene therapy. The expression system based on baculoviruses, known as BEVS (Baculovirus Expression Vector System), was developed in the 80's and since then it has allowed the expression of a great diversity of recombinant proteins in insect cell cultures, in a faster and more economical way than using other expression systems. However, this production system has some limitations affecting mostly to the large-scale productions. These limitations are usually related with low yields of expression, decreasing the production efficiency. Moreover, the continuous multiplication of the baculoviruses in cell cultures results in the emergence of defective viruses which are characterized by the loss of parts of the genome, affecting to the recombinant proteins production due to the loss of the corresponding recombinant gene. Therefore, for the BEVS to remain competitive as a production system, it is necessary the introduction of improvements to increase the production levels with respect to the conventional system. Taking advantage of the knowledge of previous studies about the interaction of the baculoviruses with their host, in this thesis has been addressed the introduction of improvements in the BEVS from different perspectives and developing different strategies, which are reflected in each of the following chapters. In the first chapter, a sequence derived from the baculovirus genome of S. exigua (SeMNPV) with promoter activity is described. This sequence is derived from a viral gene highly expressed in insects infected with SeMNPV, and has been named as pSeL. This new promoter shows an expression levels of the GFP protein about twice higher compared to those obtained using the promoter of the polyhedrin gene (polh) in different insect cell lines. Moreover, the combination of both promoters pSeL and polh shows an additive effect in comparison with the expression obtained with both promoters used separately.In the second chapter, the transcriptional study of the infective process of the baculoviruses AcMNPV and SeMNPV both in cell culture and S. exigua larvae has revealed a gene, lef5, highly overexpressed in larvae (with respect to its expression in cell culture). This, gives us the opportunity to hypothesize about the possible role of this protein in the genomic stability of the baculoviruses during their replication in cell culture. The study of the overexpression of the lef5 gene from SeMNPV (Se-lef5) in recombinant baculoviruses, that also express GFP, confirms the influence of this gene in the viral stability. Through several successive infective passages, it is observed that the stability of the gfp transgene and the ability to express GFP, is higher in those viruses expressing Se-lef5 compared with the control viruses. The third chapter focuses on the search of non-viral regulatory or enhancer sequences (coming from the host), which can influence in the expression of viral genes and increase the production of recombinant proteins of interest. For that, it was generated a viral library containing genes expressed in the gut of S. exigua larvae, and it was selected by flow cytometry, using a cell sorter, for those viruses showing high expression levels of GFP. The subsequent selection and characterization of those individual baculoviruses showing the best expression levels of GFP, allowed us to identify some of the transgenes present in those baculoviruses. Among the identified sequences we found, multiple times, genes similarly to P450 cytochrome, heat-shock proteins and REPAT proteins. The isolated viruses that carry these sequences show expression levels of GFP between 3-4 times higher to the expression levels before the library selection. However, the generation of equivalent recombinant baculoviruses expressing these sequences, show expression levels of GFP similar to the control baculovirus. This suggests that the increased GFP expression observed can be due to other factors, as the emergence of point mutations, and not only to the presence of the transgene in the selected baculoviruses. The results presented in this thesis represent new improvements in the production of recombinant proteins in cell culture, through the use of promoters other than conventional and the increase of the genomic stability of the recombinant baculoviruses. The introduction of regulatory or enhancer sequences of the expression has also been explored to improve the production levels. Although in this case it could not be validated that the observed increase of expression was associated to the presence of these sequences (it exists the possibility that this improvement was due to mutations on the viral genome), our results validate the methodology employed for the selection of viruses with higher expression levels of recombinant protein. Thus, the strategies developed in this work are able to increase the expression levels of a recombinant protein. Therefore, they show a great potential to be used in the vectors usually employed in the baculovirus expression system, increasing its profitability in the large-scale production of recombinant proteins.

[es] Los baculovirus forman un amplio grupo de virus patógenos de insectos que se caracterizan por su elevada especificidad. Su principal aplicación es su uso como agente bioinsecticida frente a diferentes plagas agrícolas, aunque algunas de sus características han permitido el desarrollo de tecnologías que permiten usar los baculovirus como vectores para la expresión heteróloga de proteínas, así como vectores para su uso en terapia génica. El sistema de expresión basado en baculovirus, conocido como BEVS (Baculovirus Expression Vector System), fue desarrollado en los años 80 y desde entonces ha permitido la expresión de gran diversidad de proteínas recombinantes en cultivos celulares de insectos, de una manera más rápida y económica que empleando otros sistemas de expresión. Sin embargo, este sistema de producción presenta una serie de limitaciones que afectan sobre todo cuando se quiere una producción a gran escala. Estas limitaciones suelen estar relacionadas con bajos rendimientos de expresión, disminuyendo así la eficiencia de producción. Además, la multiplicación continuada de los baculovirus en cultivos celulares da lugar a la aparición de virus defectivos que se caracterizan por la pérdida de partes de su genoma, pudiendo afectar a la producción de proteínas recombinantes por pérdida del gen recombinante correspondiente. Por ello, para que el sistema BEVS siga siendo un sistema de producción competitivo, es necesaria la introducción de mejoras que permitan aumentar los niveles de producción con respecto al sistema convencional. Aprovechando los conocimientos de estudios previos sobre la interacción de los baculovirus con su huésped, en esta tesis se ha abordado la introducción de mejoras en el sistema de expresión BEVS desde distintas perspectivas y desarrollando diferentes estrategias, que aparecen reflejadas en cada uno de los capítulos. En el primer capítulo se describe una secuencia derivada del genoma del baculovirus de S. exigua (SeMNPV) con actividad promotora, a partir de un gen viral altamente expresado en insectos infectados con dicho virus, a la que se ha denominado pSeL. Este nuevo promotor muestra unos niveles de expresión de la proteína GFP alrededor de 2 veces mayores con respecto a los obtenidos empleando el promotor del gen de la poliedrina (polh) en diferentes líneas celulares de insectos. Además, la combinación de los promotores pSeL y polh muestra un efecto aditivo frente a la expresión de ambos promotores empleados individualmente. En el segundo capítulo, el estudio transcripcional del proceso infectivo de los baculovirus AcMNPV y SeMNPV tanto en cultivos celulares como en larvas de S. exigua ha revelado un gen, el gen lef5, altamente sobreexpresado en larvas (respecto a su expresión en cultivo celular). Esto, nos dio pie a hipotetizar sobre su posible papel en la estabilidad genómica de los baculovirus durante su replicación en cultivo celular. El estudio de la sobreexpresión del gen lef5 de SeMNPV (Se-lef5) en baculovirus recombinantes, que además expresan GFP, confirma la influencia de este gen en la estabilidad viral. A lo largo de varios pases de infección sucesivos se observa que la estabilidad del transgén gfp y la capacidad para expresar la proteína GFP, es mayor en los virus que expresan Se-lef5 en comparación a los virus control. El tercer capítulo se centra en la búsqueda de secuencias reguladoras o intensificadoras no virales (procedentes del huésped), que puedan influir en la expresión de los genes virales y así aumentar la producción de proteínas recombinantes de interés. Para ello se construyó una genoteca viral que contiene genes expresados en el intestino de larvas de S. exigua, y se seleccionó para aquellos virus que presentaban altos niveles de expresión de GFP, mediante citometría de flujo empleando un separador celular. La posterior selección y caracterización de aquellos baculovirus individuales que mostraron los mejores niveles de expresión de GFP, nos permitió identificar algunos de los transgenes presentes en dichos baculovirus. Entre las secuencias identificadas encontramos, en más de una ocasión, genes con similitud al citocromo P450, proteínas de choque térmico y proteínas REPAT. Los virus aislados que portan estas secuencias muestran niveles de expresión de GFP entre 3 y 4 veces superiores a los niveles de expresión previos a la selección de la genoteca. Sin embargo, la generación de nuevos baculovirus recombinantes que expresan estas secuencias, muestran unos niveles similares de GFP al baculovirus control. Esto nos hace pensar que el aumento de expresión de GFP observado puede deberse a otros factores, como la aparición de mutaciones puntuales, y no únicamente a la presencia del transgén en los baculovirus seleccionados. Los resultados presentados en esta tesis suponen nuevas mejoras en la producción de proteínas recombinantes en cultivos celulares, a través del uso de promotores distintos a los convencionales y del aumento de la estabilidad genómica de los baculovirus recombinantes. También se ha explorado la introducción de secuencias reguladoras o intensificadoras de la expresión para mejorar los niveles de producción. Aunque en este caso no se pudo validar que el aumento de expresión observado estuviera asociado a la presencia de dichas secuencias (existe la posibilidad que se esa mejora fuera debida a mutaciones en el genoma de los virus), nuestros resultados validan la metodología empleada para la selección de virus con mayores niveles de expresión de proteína recombinante. Así, las estrategias empleadas en este trabajo son capaces de aumentar los niveles de expresión de una proteína recombinante. Por tanto, presentan un gran potencial para ser incorporadas en los vectores que se emplean de manera habitual en el sistema de expresión de baculovirus, aumentando su rentabilidad en la producción a gran escala de proteínas recombinantes.