[en] This thesis is based on diagnosis of patients with 2 methyl 3 hydroxybutyryl CoA dehydrogenase (MHBD or HSD10) deficiency and the study of its pathophysiology and its involvement in Alzheimer's Disease (AD). The development of different methods for quantification of key metabolites in urine and for enzymatic analysis in cultured fibroblasts, as well as the molecular studies performed, has allowed us the diagnosis of 6 patients and 8 carriers, which represents 37% of the patients described in the literature. Expression studies of HSD17B10 demonstrated that this gen not escapes inactivation of the X chromosome, contrary to that published by other authors. The neurological symptoms of patients with deficiency HSD10 differs from other deficiencies in the isoleucine's metabolic pathway, maybe due to the alteration of other functions involved in both, brain and mitochondrial homeostasis. The expression "microarray" studies performed revealed significantly different expression in 31 genes, which could explain the clinical symptoms of the patients. The HSD10 protein appears to be involved in AD, due to their interaction with β amyloid peptide (Aβ). Studies in brain homogenates of AD patients showed decreased HSD10 activity from the early stages of the disease, which could explain the early mitochondrial dysfunction observed in AD. Furthermore, the Aβ incubation caused inhibition of HSD10 activity in control brain homogenates, which was rescued by incubating with high NAD+ concentrations. This observation was also corroborated in AD. This fact could be explained by a competitive interaction that occurs between NAD+ and Aβ. Therefore, the measurement of HSD10 activity could be used as a therapeutic target for AD. To this end, we obtained "in vitro" system to the evaluation of the HDSD10 isoform 1 recombinant protein, which is the mainly expressed in human brain, before and after incubation with Aβ, with and without addition of NAD+. The results were the same as when using human brain homogenates. Therefore, the system was validated for screening therapeutic molecules that could inhibit the Aβ HSD10 interaction and restore HSD10 activity. Among 117 compounds tested, only NAD+ was able to rescue HSD10 activity. Thus, we propose that the precursors of NAD+ could be considered an adjunctive therapy in AD. Recent studies support our results, since administration of NAD precursors mice model for AD, improve mitochondrial dysfunction and cognition.

[es] Esta tesis se basa en diagnóstico de pacientes con deficiencia de 2 metil 3 hidroxibutiril CoA deshidrogenasa (MHBD o HSD10) y en el estudio de la fisiopatología de esta enfermedad y de su implicación en la Enfermedad de Alzheimer (EA). El desarrollo de un método cuantitativo de metabolitos clave en orina y un método de análisis enzimático de la proteína HSD10 en fibroblastos cultivados, así como el análisis molecular, de los niveles de HSD10 y de los estudios patogenicidad de las mutaciones encontradas, nos ha permitido el diagnóstico de 6 pacientes y 8 portadoras, que representan el 37% de los pacientes descritos en la literatura. La herencia de esta enfermedad se halla ligada al cromosoma X. Se había descrito que el gen HSD17B10, que codifica para la proteína HSD10, se escapaba de la inactivación del cromosoma X. Sin embargo, el fenotipo bioquímico y clínico de nuestros pacientes no apoyaban este hallazgo. Mediante estudios de expresión de HSD17B10 por PCR cuantitativa se demostró que HSD17B10 no escapaba a la inactivación del cromosoma X. HSD10 es una proteína mitocondrial multifuncional que además de su papel en el metabolismo de la isoleucina y de los ácidos grasos, desempeña otras funciones en el metabolismo de hormonas esteroideas sexuales, esteroides neuroactivos, en la detoxificación de aldehídos citotóxicos y en la metabolización de cardiolipina peroxidada. La clínica neurológica de los pacientes con deficiencia de HSD10 difiere de otras deficiencias de la vía metabólica de la isoleucina. Por ello, realizamos estudios de microarrays de expresión. Obtuvimos una expresión significativamente diferente en 31 genes. Los resultados se confirmaron mediante PCR cuantitativa. La diferencia de expresión de estos genes podrían explicar los síntomas clínicos de los pacientes con deficiencia de HSD10. La proteína HSD10 parece estar implicada en la EA, debido a su interacción con el péptido β amiloide (pßA), habiéndose sugerido que dicha interacción es una de las causas de la disfunción mitocondrial en la EA. Para determinar la implicación de HSD10 en la EA se realizaron una serie de estudios en homogenados de cerebro de pacientes con EA y controles. Encontramos una disminución de la actividad de HSD10 en homogenados de cerebro de pacientes con EA y esta disminución no se debía a una disminución de los niveles de proteína, ya que el wester blot no reveló diferencias entre pacientes y controles. Se observó también que la actividad HSD10 disminuye con la progresión de la enfermedad. Por otro lado, comprobamos que la incubación de homogenados de cerebro control con pßA provocaba una inhibición de la actividad HSD10, que se rescataba al incubar con elevadas concentraciones de NAD +. Esta observación también fue corroborada en la EA. Este hecho se podía explicar por una interacción competitiva entre NAD+ y pßA, ya que ambos interaccionan con HSD10 en la misma posición aminoacídica. Por ello, al incubar con elevadas concentraciones NAD+ se inhibe la interacción pßA HSD10. Por tanto, la medición de la actividad HSD10 podría ser utilizada como diana terapéutica para la EA. Con esta finalidad, obtuvimos un sistema "in vitro" con la valoración de la proteína recombinante HDSD10 isoforma 1, que es la que expresa mayoritariamente en cerebro humano, antes y después de la incubación con pßA, con y sin adición de NAD+. Los resultados obtenidos fueron los mismos que al utilizar homogenados de cerebro humano. Por lo tanto, quedaba validado un sistema para cribar moléculas terapéuticas que pudieran inhibir la interacción pßA HSD10 y restablecer la actividad HSD10. Se probaron 117 compuestos de una librería peptídica, Coenzima Q10 y otros antioxidantes, pero no se consiguió rescatar la actividad HSD10. La actividad enzimática sólo se consiguió rescatar con NAD+ . Así, proponemos que los precursores de NAD+ podrían ser considerados una terapia coadyuvante en la EA. Estudios recientes apoyan nuestros resultados, ya que la administración de precursores de NAD+ a ratones modelo para la EA, mejoran la disfunción mitocondrial así como la cognición.