[en] The phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling pathway plays a central role in promoting neuronal survival and differentiation. PDK1 is a crucial master kinase that, in response to PI 3-kinase activation, switches on a number of AGC-kinase family members including PKB/Akt. Activation of Akt by PDK1 relies on the interaction of the PH domains present on both kinases with PtdIns(3,4,5)P3, the PI 3-kinase product. Crystal structure high-resolution of the PDK1 PH-domain allowed the design of a specific point mutation, Lys 465 to Glu, impairing the interaction of the PH-domain with PtdIns(3,4,5)P3. The PDK1K465E/K456E mice were shown to be viable but smaller, with a modest reduction in Akt activity compared with the wild type mice. By contrast, other PDK1 target such as RSK, S6K or SGK isoforms remained unaffected. Our former studies have indicated that neuronal survival was not compromised in the PDK1K465E/K465E mice, although activation of Akt was obviously reduced. Even after treated with the Akti-1/2 inhibitor, cortical neurons were still surprisingly capable to survive. Regarding this, I proposed that Akt3 plays key role in regulating neuronal survival. The results of my study indicate that the PKB/Akt activation in cortex was less reduced than in insulin responsive tissues in the PDK1K465E/K465E mice. I further analyze the activity of different Akt isoforms, and I found that PKBγ/Akt3 activity was preserved compared with PKBα/Akt1 or PKBβ/Akt2 in the PDKK465E/K465E mice, and also that the proportion of Akt3 phosphorylation at the PDK1 site is much higher in neurons than in other tissues in the PDK1K465E/k465E mice. The PKBβ/Akt2 only accounted for a small fraction of the total PKB/Akt activity in cortical neurons, which implies unimportant role in regulating the neuronal survival. Furthermore, The data from Akt shRNA interference and Hoechst assays demonstrate that the percentage of apoptotic cells was increased by Akt1 and Akt3 shRNAs infection in cortical neurons In the PDK1K465E/K465E mice, whereas Akt2 down-regulation had no significant effects on neuronal apoptosis. Here I proposed a model that the neuronal survival was regulated by PKB/Akt isoforms in a quantitative manner. Because of the high proportion of Akt phosphorylation at Thr 8/9 sites, Akt1 and Akt3 might play more important roles than Akt2 in neuronal survival. Besides this, I also uncovered a novel mechanism in the activation of PKB/Akt in the PDK1K465E/K465E mice, In which PDK1 can take advantage of the docking site mechanism to activate Akt, in spite of the absence of PtdIns(3,4,5)P3 binding.

[es] La vía de la fosfoinositol 3 quinasa (PI3K) desempeña un papel crucial en el control de la supervivencia y diferenciación neuronales. PDK1 es una quinasa master esencial que, en respuesta a la activación de PI3K, activa un elevado número que quinasas de la família Agc, incluidas las isoformas de PKB/Akt. La activación de Akt por PDK1 depende de la interacción de los dominios PH presentes en ambas quinasas con PtdIns(3,4,5)P3, el producto de la PI3K. La resolución de la estructura cristalográifca del dominio PH de PDK1 permitió el diseño de una mutación puntual dirigida, Lys 465 a Glu, que impide la interacción del dominio PH de PDK1 con PtdIns(3,4,5)P3. Los ratones PDK1K465E/K456E eran viables aunque pequeños y presentaban una modesta reducción de la activación de Akt comparados con los ratones control. Por el contrario, el resto de quinasas reguladas por PDK1, como RSK, S6K o SGK de activaban con normalidad. Nuestros estudios previos demostraron que la supervivencia neuronal no estaba afectada en el ratón PDK1K465E/K465E, a pesar de que la activación de Akt estaba claramente reducida. Incluso tras el tratamiento con el compuesto inhibidor de Akt1 y Akt2 Akti-1/2, las neuronas corticales eran sorprendentemente capaces de sobrevivir. Es por ello que se propusoq eu Akt3 podria tener un papel central en el control de la supervivencia neuronal. Los resultados de este estudio demuestran que la activación de PKB/Akt en el córtex estaba menos comprometida que en tejidos de respuesta a insulina en el ratón PDK1K465E/K465E. se analizó la actividad de las tres isoformas de Akt, y se demostró que la actividad de PKBγ/Akt3 estaba preservada en comparación con PKBα/Akt1 or PKBβ/Akt2 el ratón PDKK465E/K465E, y que la proporción de actividad Akt3 es más elevada en neuronas que en otros tipos celulares, en el ratón PDK1K465E/k465E. PKBβ/Akt2 representa tan solo una pequeña fracción de la actividad PKB/Akt total en neuronas corticales lo que no hace pensar que tenga un papel esencial en el control de la supervivencia neuronal. Además, experimentos de interferencia de RNA demuestran que la inhibición de Akt1 y Akt3 compromete la supervivencia neuronal en el ratón PDK1K465E/K465E, mientras que la inhibición de Akt2 no tiene consecuencias. Se propone así un modelo cuantitativo de regulación de la supervivencia neuronal por Akt por el que Akt1 y Akt3 juegan un papel más importante en supervivencia porque representan un elevado porcentaje de la actividad Akt total. Además, se demuestra en esta tesis un nuevo mecanismo de activación de PKB/Akt en el ratón PDK1K465E/K465E por el que en ausencia de unión a PtdIns(3,4,5)P3 PDK1 puede aún interaccionar directamente con Akt y activarla.