[en] The potential impact of noble metal nanoparticles (NPs) in diverse fields, particularly medicine, is tremendous. However, before NPs can be routinely used in clinical practices, it is fundamental to comprehensively study their interaction with cells. This study is non-trivial because such interaction is an extremely complex process that depends on multiple factors. In order to use plasmonic NPs as biosensing probes or to investigate their interaction with biological specimens, it is necessary to detect them. The most frequently used methods are electron microscopy (SEM/TEM), two-photon luminescence (TPL) and dark-field (DF) microscopy. While the first one outperforms in terms of resolution, it requires intensive sample preparation and is highly invasive. Although TPL is capable of identifying NPs with good accuracy and contrast, measurements can be affected by high peak powers of pulsed illumination. Moreover, they require specialized equipment, and are limited by insufficient temporal resolution to follow the NP-cell interaction dynamics or track cells in flow. In this context, DF stands out as a great option. However, since the cell's scattering can be very high, DF alone is not reliable for detecting metal NPs immersed in cells. In this thesis we present two alternative methods for imaging of plasmonic NPs embedded in cells, both based on DF microscopy. Scattering is very attractive for several reasons: acquisition time is not fundamentally limited; it is harmless for the cells or plasmonic NPs; it does not suffer from blinking or bleaching; and its implementation is simple and does not require specialized elements. The key idea is removing the cell's contribution to the total scattering by using the distinct optical properties of cells and plasmonic NPs, thus overcoming the reliability issue of standard DF. Polarization difference dark-field (PDDF) microscopy exploits the different responses of cells and gold nanorods (GNRs) to light's polarization orientation. While scattering intensity of GNRs is highly dependent on it, cell's is not. Therefore, by subtracting two images, one for each polarization direction, cells' scattering is eliminated. We validated the concept using a phantom sample, and proved PDDF's ability to discriminate GNRs-loaded cells from bare ones is higher than DFs. However, its applicability is limited by two factors: it is only useful for asymmetric NPs, and it is not possible to carry out quantitative measurements. Two-color dark-field (TCDF) microscopy uses the distinct optical properties of cells and plasmonic NPs on illumination wavelength. While NP's scattering strongly changes with wavelength, cell's does not. Hence, the subtraction of two images, one for each color, will cancel out cell's scattering. Using phantom samples we first proved standard DF is not suitable for plasmonic NPs detection in environments with non-negligible scattering, whereas TCDF is capable of doing so. We carried out experiments on mammalian cells that show TCDF performs better than standard DF in terms of both specificity and sensitivity. Finally we demonstrated the potential of TCDF for long-term tracking of NPs in cells and cell screening in mixed populations under both static and flowing conditions. Thanks to its robustness, fewer limitations and better performance, the use of TCDF is more convenient than PDDFs. We demonstrated TCDF is efficient and versatile: It works for adherent and suspension cells, under static and flowing conditions, and for diverse applications. Importantly, TCDF's performance could be further improved by optimizing the optical setup and using more sophisticated calibration methods. TCDF is presented as a complement to existing methods (TPL and SEM/TEM), since it is more suitable for live-cell studies and performs better in terms of speed, although it is not as sensitive. TCDF could be applied to other resonant NPs and systems, as long as their scattering properties significantly differ.

[es] El impacto potencial de las nanopartículas (NPs) de metales nobles en diversos campos, en particular medicina,es inmenso. Sin embargo, antes de que puedan ser usadas rutinariamente en procedimientos clínicos es fundamental estudiar concienzudamente su interacción con las células, estudio que no es trivial porque es un proceso extremadamente complicado que depende de muchos factores. A fin de usar las NPs plasmónicas como sonda para biosensado o investigar su interacci ón con especímenes biológicos es necesario detectarlas. Los métodos más usados son la microscopia de electrones (SEM/TEM), luminiscencia de dos fotones (TPL) y campo oscuro (DF). Aunque la resoluci ón de la primera sobresale, requiere preparaci ón de muestras compleja y es altamente invasiva. Si bien TPL es capaz de identificar NPs con buena precisi ón y contraste, las mediciones pueden ser afectadas por las altas potencias pico de la iluminaci ón pulsada. Más aún, estas requieren equipos especializados y su resolución temporal es insuficiente para seguir la dinámica de la interacción entre las NPs y las células o rastrear células en flujo. En este contexto, DF sobresale como una excelente opci ón, sin embargo, dado que el esparcimiento de la célula misma puede ser bastante alto, no es confiable. En esta tesis presentamos dos métodos basados en microscopia DF para detectar NPs plasmónicas embebidas en células. El esparcimiento es bastante atractivo por varias razones: el tiempo de adquisici ón no está fundamentalmente limitado; no es dañino para las células o NPs; no sufre de parpadeo o fotoblanqueado; y su implementaci ón es simple y no requiere elementos especializados. La idea clave es remover la contribuci ón de la célula al esparcimiento total, y con ello superar el problema de confiabilidad del DF convencional. La microscopia de campo oscuro de diferencia de polarizaci ón (PDDF) explota el hecho que mientras que la intensidad del esparcimiento producido por nanocilindros de oro (GNRs) depende de la orientaci ón de la polarización de la luz, la de las células no lo hace. De esta manera, al substraer dos imágenes, una por cada dirección, el esparcimiento de la célula es eliminado. Validamos el concepto usando una muestra substituta y probamos que la habilidad de PDDF para discriminar células con GNRs de células sin ellos es mayor que la de DF. Sin embargo, dos factores limitan su aplicabilidad: solo es útil para NPs asimétricas y no es posible realizar medidas cuantitativas.La microscopia de campo oscuro de dos colores (TCDF) toma ventaja de que el esparcimiento producido por las NPs cambia drásticamente con la longitud de onda, mientras que el de las células no lo hace. Así, la substracción de dos imágenes, una por cada color, cancelará el esparcimiento de las células. Usando una muestra substituta probamos que el DF convencional no es fiable para detectar NPs plasmónicas en medios con esparcimiento no despreciable, mientras que TCDF sí lo es. Realizamos experimentos en células que demostraron que TCDF se desempeña mejor que DF en términos especificidad y sensibilidad. Mostramos tambi én el potencial de TCDF para el rastreo a largo plazo de NPs en células y la identificación de células en poblaciones mixtas en condiciones estáticas y en flujo. El uso de TCDF es más conveniente que el de PDDF gracias a su robustez, menos limitaciones y mejor desempe ño. TCDF es eficiente y vers átil: funciona para células adherentes y en suspensi ón, diversas aplicaciones, y en condiciones estáticas y de flujo. Además, su desempeño podría ser mejorado optimizando el montaje óptico y usando métodos de calibración más sofisticados. TCDF se presenta como un complemento a técnicas ya existentes (TPL and SEM/TEM), dado que es más adecuado para estudios con células vivas y se desempeña mejor en términos de velocidad, aunque no sea tan sensible. TCDF podría ser aplicado a otros sistemas y otras NPs con resonancia, siempre que sus propiedades de esparcimiento difieran lo suficiente.