[en] Livestock production contributes to greenhouse gas emissions, particularly in ruminants, in the form of enteric methane (CH4), produced through microbial fermentation of carbohydrates in the rumen. One of the strategies that showed most potential to reduce enteric CH4 production involves the use of feed additives. Among feed additives with potential to reduce CH4 emissions in ruminants, the red macroalgae Asparagopsis taxiformis has proven effective due to its high content in halogenated CH4 analogues, primarily bromoform (CHBr3). However, most strategies based on methanogenesis inhibitors, including A. taxiformis, generate an excess of dihydrogen (H2) in the rumen, which is expelled and, consequently, not redirected or retained in metabolites that can be used by the ruminant. Therefore, these mitigation strategies do not result in an improvement in rumen fermentation efficiency that could benefit animal productivity. To overcome this inefficiency in CH4 inhibition, phenolic compounds have been suggested as potential H2 acceptors, which could incorporate some of the excess H2 in their degradation process by specific rumen microorganisms. The main objective of this Doctoral Thesis was to develop nutritional strategies to reduce CH4 production in ruminants while improving rumen fermentation efficiency. A series of in vitro experiments (Study 1) were conducted to assess the dose-response effect of A. taxiformis (Experiment 1.1) and a wide range of phenolic compounds (phenol, catechol, resorcinol, hydroquinone, phloroglucinol, pyrogallol, gallic acid) and formic acid (Experiment 1.2) on CH4 production and rumen fermentation. Asparagopsis taxiformis at 2% of the dry matter (DM) of the substrate was optimal for inhibiting CH4 production (-99%) and increasing H2 accumulation (+37.5 times) without compromising overall rumen fermentation. Phenolic compounds at concentrations below or equal to 6 mM did not negatively affect ruminal fermentation. Subsequently, each phenolic compound was evaluated in the presence of A. taxiformis within an adapted microbial population (Experiment 1.3), with phloroglucinol proving most effective in capturing the excess H2 resulting from methanogenesis inhibition. Then, increasing doses of phloroglucinol in combination with A. taxiformis were evaluated to optimise its potential as H2 acceptor (Experiment 1.4). Phloroglucinol at a maximum concentration of 36 mM reduced H2 production per mol of reduced CH4 (-45.5%), increased volatile fatty acid (VFA) concentration (+49.8%), and promoted greater acetate synthesis compared to A. taxiformis alone, without affecting the abundance of total bacteria in the rumen. Following the in vitro study, individual and combined supplementation with A. taxiformis at 0.5% DM and floroglucinol at 2% DM (equivalent to a ruminal concentration of 40 mM) was evaluated in adult goats (Study 2). The supplementation of A. taxiformis alone reduced CH4 production (-31%) and increased H2 emissions (+38 times) and propionate synthesis, while the combination with floroglucinol reduced H2 emissions (-68%) and increased acetate concentration (+18.9%). The level of reduction in H2 emission, mostly occurred in postprandial situations, suggests that a higher efficiency of H2 redirection towards acetate synthesis is possible. The study design did not allow determining if the shift in the fermentation profile led to improved animal productivity. Concurrently, an in vitro experiment was conducted to examine the degradation pattern of CHBr3 from A. taxiformis in the rumen and its impact on rumen fermentation according to the type of diet (Study 3), as this compound can potentially be toxic to the animal or the consumer if it is transferred to milk or meat. Rapid degradation of CHBr3 was observed (70% degraded in 30 minutes, 90% in 3 hours, and 100% in 12 hours), followed by dibromomethane formation until 6 hours, and then gradually decreased. The forage:concentrate ratio in the diet did not have an effect on bromoform degradation. Finally, pure cultures of seven methanogen strains were used to determine their sensitivity to increasing doses of CHBr3 (Study 4). The results showed that the lowest CHBr3 concentration (0.4 μM) was sufficient to inhibit methanogens' growth, with different reduction levels between species. The findings of this Doctoral Thesis have contributed to the study of combined supplementation of A. taxiformis and floroglucinol under in vitro and in vivo conditions, representing a potential nutritional strategy to mitigate CH4 production and redirect H2 accumulation towards acetate production, thereby improving rumen fermentation efficiency. The results also provide a better understanding of the mode of action and degradation of CHBr3, essential aspects for the approval of using A. taxiformis in the food production chain by the competent health authorities.

[es] La producción ganadera, como cualquier otro sector económico, contribuye a las emisiones de gases de efecto invernadero, especialmente en los rumiantes en forma de metano entérico (CH4), que se produce como resultado de la fermentación microbiana de carbohidratos en el rumen. Una de las estrategias que ha mostrado mayor potencial para reducir la emisión de CH4 en rumiantes es el uso de aditivos nutricionales. Entre los aditivos de la dieta con mayor potencial, la macroalga roja Asparagopsis taxiformis se ha mostrado efectiva gracias a su elevado contenido en análogos halogenados del CH4, principalmente bromoformo (CHBr3). Sin embargo, la mayoría de las estrategias basadas en el uso de inhibidores de la metanogénesis, incluyendo A. taxiformis, generan un exceso de dihidrógeno (H2) en el rumen que se emite y, por consiguiente, no se redirige ni se retiene en metabolitos que puedan ser utilizados por el rumiante. Por tanto, la reducción de la producción de CH4 mediante el uso de aditivos no conlleva una mejora en la eficiencia de la fermentación ruminal que pueda beneficiar la productividad animal. Para superar dicha ineficiencia en la inhibición del CH4, se han considerado los compuestos fenólicos como potenciales aceptores de H2, con la posibilidad de que recuperen parte del exceso de H2 en su proceso de degradación por microorganismos ruminales específicos. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral fue desarrollar estrategias nutricionales que reduzcan la producción de CH4 en rumiantes y que al mismo tiempo mejoren la eficiencia de la fermentación ruminal. Para ello, se llevó a cabo una serie de experimentos in vitro (Estudio 1) para evaluar el efecto dosis-respuesta de A. taxiformis (Experimento 1.1) y un amplio rango de compuestos fenólicos (fenol, catecol, resorcinol, hidroquinona, floroglucinol, pirogalol, ácido gálico) y ácido fórmico (Experimento 1.2) sobre la producción de CH4 y la fermentación ruminal. Asparagopsis taxiformis al 2% de la materia seca (MS) del sustrato fue óptimo para inhibir la producción de CH4 (-99%) y aumentar la acumulación de H2 (+37,5 veces) sin comprometer la fermentación ruminal. Los compuestos fenólicos a concentraciones inferiores o iguales a 6 mM no afectaron negativamente la fermentación ruminal. Posteriormente, se evaluó cada compuesto fenólico en presencia de A. taxiformis sobre una población microbiana ya adaptada a la presencia de los compuestos fenólicos (Experimento 1.3), siendo el floroglucinol el más eficaz en captar el exceso de H2 resultante de la inhibición de la metanogénesis. A continuación, se evaluaron dosis crecientes de floroglucinol en combinación con A. taxiformis para optimizar su potencial como aceptor de H2 (Experimento 1.4). Floroglucinol a una concentración máxima de 36 mM redujo la producción de H2 por mol de CH4 reducido (-45.5%), aumentó la concentración de AGV (+49,8%) y promovió un incremento de la síntesis de acetato en comparación con A. taxiformis sola, sin efectos negativos en la abundancia del total de bacterias en el rumen. Tras el estudio in vitro, se evaluó in vivo la suplementación con A. taxiformis al 0,5% MS y floroglucinol al 2% MS (equivalente a una concentración ruminal de 40 mM) en la dieta en cabras adultas (Estudio 2). La suplementación de A. taxiformis redujo la producción de CH4 (-31%) y aumentó las emisiones de H2 (+38 veces) y la síntesis de propionato, mientras que la combinación con floroglucinol redujo las emisiones de H2 (-68%) y aumentó la concentración de acetato (+18,9%). El nivel de reducción de las emisiones de H2 y que fuera un efecto mayoritariamente postprandial sugiere que una mayor eficiencia de redirección del H2 hacia la síntesis de acetato es posible. El diseño del estudio no permitió determinar si el cambio en el perfil de fermentación supuso una mejora en productividad animal, lo que requeriría futuros estudios. Además de optimizar la combinación del alga y compuestos fenólicos, se realizó un experimento in vitro para examinar el patrón de degradación del CHBr3 de A. taxiformis en el rumen y su impacto en la fermentación ruminal según el tipo de dieta (Estudio 3), puesto que es un compuesto con potencial efecto tóxico en el animal o en el consumidor si se transfiere a la leche o carne. Se observó una rápida degradación del CHBr3 (70% degradado en 30 minutos, 90% en 3 horas y 100% en 12 horas), seguida de la formación d dibromometano hasta las 6 horas, que luego disminuyó de forma gradual pero más lentamente que el CHBr3. La relación de forraje y concentrado en la dieta no influyó en la degradación del bromoformo. Finalmente, se emplearon cultivos puros de siete cepas de metanógenos con el fin de determinar la diferente sensibilidad de estos microorganismos a dosis crecientes de CHBr3 (Estudio 4). Los resultados mostraron que la concentración más baja de CHBr3 (0,4 μM) fue suficiente para inhibir el crecimiento de los metanógenos, con diferentes niveles de reducción según la especie. Los hallazgos de esta Tesis Doctoral han contribuido al estudio de la suplementación combinada de A. taxiformis y floroglucinol en condiciones in vitro e in vivo, representando una potencial estrategia nutricional para mitigar la producción de CH4 y redirigir la acumulación de H2 hacia la producción de acetato, por tanto, mejorando la eficiencia de la fermentación ruminal. Los resultados obtenidos también permiten una mejor comprensión del modo de acción y degradación del CHBr3, aspectos fundamentales para la aprobación del uso de A. taxiformis en la cadena de producción de alimentos por las autoridades sanitarias competentes.