[en] Understanding the intricate inner structure of nanoparticles (NPs) as well as their interaction within biological systems is essential for advancing drug delivery technologies. However, visualizing NP dynamics remains a formidable challenge due to current limitations in imaging techniques. This thesis addresses this gap by developing and refining advanced microscopy methods to gain unprecedented insights into NP behaviour, thereby expanding the frontiers of NP research for therapeutic applications. To establish a basis for these studies, we focused on characterizing our biodegradable and biocompatible Oligo Modified poly(β-amino ester) (OM-pBAE NPs. By systematically modifying the terminal oligopeptide groups, we investigated how these alterations impacted their physicochemical and mechanical properties, as well as their interactions within cellular environments. Using diverse characterization techniques, we assessed the effects of each modification on NP stability, cellular uptake, and transfection efficiency, identifying substantial differences in intracellular trafficking among OM-pßAE NPs. These initial analyses underscored a significant limitation: conventional imaging techniques were insufficient to fully decipher the intracellular pathways and ultimate fate of these NPs. To overcome this, we developed novel methodologies, including Polyplex Expansion Microscopy (PExM) and Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM), which offered high and super-resolution insights into NP trafficking and localization. These tools revealed how subtle structural variations among the NPs influence their intracellular pathways, particularly highlighting the role of histidine in facilitating endosomal escape. This critical step for efficient delivery involves histidine-induced destabilization of endosomal membranes, enabling NPs to reach their targets within cells. Building on these findings, we investigated OM-pßAE NP behaviour within 3D cellular models, moving beyond traditional 2D cultures to better simulate in vivo conditions. Using multiphoton microscopy, we visualized OM-pBAE NP penetration and distribution in spheroids, gaining valuable insights into how these carriers navigate complex biological structures. The results demonstrated that histidine-containing NPs showed enhanced penetration and intracellular delivery aligning with the results obtained with 2D cell cultures studies. Collectively, this thesis not only underscores the need for an in-depth understanding of nanosystems behaviour in specific systems to improve clinical efficacy but also contributes powerful new tools for the nanomedicine research community. These advancements enable more accurate studies of drug delivery systems (DDS) and pave the way for optimized design and application of nanoparticle-based therapies.

[es] Comprender el comportamiento de las nanopartículas (NPs) dentro de los sistemas biológicos es esencial para avanzar en los diferentes campos que abarca la nanomedicina. Sin embargo, la visualización de la dinámica de las NPs sigue siendo un reto considerable debido a las limitaciones actuales en las técnicas de imagen. Esta tesis aborda esta brecha desarrollando y perfeccionando métodos avanzados de microscopía para entender el comportamiento de las NPs, ampliando así las fronteras de la investigación de nanoformulaciones para aplicaciones biomédicas. Para establecer una base para estos estudios, nos centramos en la caracterización de nuestras nanopartículas, basadas en los OM-pBAE (Oligo Modified poly(β-amino ester)), unos polímeros biodegradables y biocompatibles. Mediante la modificación de los grupos oligopeptídicos terminales, investigamos cómo estas alteraciones impactaban sus propiedades fisicoquímicas y mecánicas, así como sus interacciones dentro de los entornos celulares. Utilizando diversas técnicas de caracterización, evaluamos los efectos de cada modificación en la estabilidad de las NPs, su captación celular y eficiencia de transfección, identificando diferencias sustanciales en el tráfico intracelular entre las NPs OM-pßAE. Estos análisis iniciales subrayaron una limitación importante: las técnicas de imagen convencionales resultaron insuficientes para descifrar completamente las rutas intracelulares y el destino de estas nanopartículas. Para superar este reto, metodologías novedosas, como Polyplex Expansion Microscopy (PExM) i Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) han sido desarrolladas. Éstas técnicas ofrecen super-resolución para poder estudiar el tráfico y la localización de las NPs. Además, revelan cómo variaciones estructurales sutiles entre las nanopartículas influyen en sus rutas intracelulares, destacando particularmente el papel de la histidina en facilitar la el escape del Endosoma. Este paso implica la desestabilización de las membranas endosomales, inducido por la histidina, lo que permite que las NPs alcancen sus objetivos dentro de las células. A partir de estos hallazgos, investigamos el comportamiento de las NPs de OM-pßAE en modelos celulares 3D, avanzando más allá de los cultivos tradicionales en 2D para simular mejor las condiciones in vivo. Utilizando Multiphoton Microscopy (MPM), visualizamos la penetración y distribución de las NPs de OM-pBAE en esferoides, obteniendo información sobre cómo estas NPs navegan por estructuras biológicas complejas. Los resultados demostraron que las NPs que contienen histidina mostraban una mayor penetración y distribución intracelular, en línea con los resultados obtenidos en estudios de cultivos celulares en 2D. En conjunto, esta tesis no solo subraya la necesidad de una comprensión profunda del comportamiento de los nanosistemas en sistemas específicos para mejorar la eficacia clínica, sino que también contribuye con herramientas nuevas y potentes para la comunidad científica. Estos avances permiten estudios más precisos de los sistemas de administración de fármacos (DDS) y allanan el camino para el diseño y la aplicación optimizada de la nanomedicina.