[en] Rare neurodegenerative diseases represent an intricate and challenging area of study, with significant implications in medicine and genetics. Movement disorders, NBIA (neurodegeneration with brain iron accumulation) conditions, cerebellar ataxia and spastic paraplegia are some of the diseases included in this group. The present PhD dissertation comprises three distinct chapters, each of which contributes to our understanding of the genetics and mechanisms of disease involved in these conditions. Chapter I: Genetic findings in a clinical series of movement disorders The exploration of the genetic landscape of movement disorders begins with an in-depth look at data management and interpretation of whole exome sequencing (WES) results obtained from a cohort of patients affected by these group of disorders. It also involves segregation analysis and functional studies designed to investigate the pathogenicity of candidate mutations. Rare neurodegenerative diseases are characterised by their genetic and phenotypic heterogeneity. The diversity of these disorders necessitates advanced techniques for pinpointing the responsible mutations. The choice of WES as a diagnostic tool reflects an approach that is not only cost-efficient but also highly effective, as evidenced by a diagnostic success rate of 41.5% in this study. This success rate aligns with existing evidence, demonstrating the viability of WES for identifying causal mutations in patients with neurodegenerative conditions. One of the most significant findings from this chapter is the identification of five novel genetic variants. These discoveries not only broaden our knowledge of the phenotypic variations associated with previously recognized genes, but also unveil new disease-causing mutations. Such novel genetic insights have the potential to expand the spectrum of diagnostic approaches for these challenging conditions. Chapter II: A signature of microRNAs as candidate biomarkers for PKAN Pantothenate kinase-associated neurodegeneration (PKAN), a subtype of NBIA caused by mutations in the PANK2 gene, occupies the central stage in the second chapter. PANK2 encodes an enzyme panthotenate kinase that takes part in the first step of the coenzyme A synthesis. This section of the dissertation explores microRNAs (miRNAs) as potential biomarkers for PKAN. These small, non-coding RNA molecules have gained attention for their regulatory roles in gene expression, and their differential expression patterns can provide insights into the pathophysiology of neurodegenerative diseases. The objectives of this chapter are twofold. First, to validate the differential expression of a set of selected miRNAs in two independent cohorts of plasma samples from PKAN patients and controls, using quantitative real-time PCR. Secondly, miRNAs differential expression is assessed in PKAN and control fibroblasts. However, the results obtained reveal that the miRNAs studied are not sufficient to discriminate between PKAN patients and healthy individuals. The intriguing exception could be hsa-miR-375-3p, suggesting an association with the presence of the p.T528M PANK2 allele in homozygosis. This chapter introduces a significant breakthrough in the form of the application of a direct reprogramming protocol to transform fibroblasts into neuron-like cells, providing a platform for studying the differential expression of miRNAs in a neuron-specific context. Direct reprogramming using the transcription factor Ascl1 has successfully transformed human PKAN-fibroblasts into neural cells, and a preliminary establishment of this cellular model has been achieved in this work. This is a significant advancement, offering the potential for uncovering critical insights into the underlying mechanisms of PKAN in future experiments. Beyond miRNA analysis, this chapter explores the cellular sensitivity of PKAN-fibroblasts to cell death and lipid peroxidation. PKAN-fibroblasts exhibit a higher susceptibility to these processes compared to control cells. This observation emphasizes the importance of lipid homeostasis and peroxidation processes in PKAN pathogenesis, shedding light on potential therapeutic targets. Chapter III: Human induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cerebellar precursor cells model in the study of PLAN pathophysiology The third chapter ventures into the realm of cellular modelling by employing human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to create a platform for studying PLA2G6-associated neurodegeneration (PLAN) in vitro. PLAN is caused by mutations in the gene PLA2G6, a calciumindependent phospholipase that hydrolyses glycerophospholipids to produce lysophospholipids and free fatty acids. This approach seeks to generate cerebellar precursor cells from hiPSCs derived from both PLAN patients and healthy donors. The primary objective is to characterise these precursor cells under basal conditions and in response to iron excess supplementation, providing a deeper understanding of the pathophysiological mechanisms at play. The examination of cerebellar neurons generated in this work unveils several noteworthy observations. These neurons exhibit altered transcript levels of genes associated with iron homeostasis and ferroptosis, indicating the importance of iron regulation in PLAN pathophysiology. Additionally, the results suggest that the neurons display elevated lipid peroxidation, reduced mitochondrial membrane potential, increased levels of reactive oxygen species, and impaired autophagic flux under basal conditions, compared to control cells. The addition of ferric ammonium citrate leads to notable changes in the expression of genes investigated in basal conditions and to the accumulation of autophagy markers. Iron supplementation does not significantly affect the production of peroxidised lipids, suggesting a complex interplay of iron-related processes in the disease. Taken together, these results broaden the existing knowledge in PLAN pathogenesis.

[es] Las enfermedades neurodegenerativas raras representan un área de estudio compleja y desafiante, con importantes implicaciones en los campos de la medicina y la genética. En este grupo se incluyen los trastornos del movimiento, las enfermedades neurodegenerativas con acumulación de hierro en cerebro (ENACH; NBIA, neurodegeneration with brain iron accumulation), la ataxia cerebelosa y paraplejía espástica, entre otras. La presente tesis doctoral consta de tres capítulos, cada uno de los cuales contribuye a nuestra comprensión de la genética y los mecanismos moleculares involucrados en estas enfermedades. Capítulo I: Hallazgos genéticos en una serie clínica de trastornos del movimiento La exploración del escenario genético en trastornos del movimiento comienza con el abordaje de la gestión de datos y la interpretación de los resultados de la secuenciación del exoma completo obtenidos en una cohorte de pacientes afectados por este grupo de trastornos. También implica el análisis de segregación y estudios funcionales diseñados para investigar la patogenicidad de mutaciones candidatas. Las enfermedades neurodegenerativas raras se caracterizan por su heterogeneidad genética y fenotípica. La diversidad de estos trastornos a menudo requiere técnicas avanzadas para identificar las mutaciones responsables. La secuenciación de exoma completo como herramienta de diagnóstico no sólo es rentable sino también altamente efectiva, como lo demuestra una tasa de éxito diagnóstico del 41,5% en este estudio. Esta tasa de éxito se alinea con la evidencia existente, lo que demuestra la adecuación de la técnica para identificar mutaciones causales en pacientes que cursan con una clínica neurodegenerativa. Uno de los hallazgos más importantes de este capítulo es la identificación de cinco nuevas variantes genéticas. Estos descubrimientos no sólo amplían nuestro conocimiento sobre el espectro fenotípico de genes previamente conocidos, sino que también revelan nuevas mutaciones patológicas. Estos conocimientos permiten avanzar en la mejora de los enfoques de diagnóstico para estas enfermedades. Capítulo II: Un perfil de expresión de microARNs como biomarcadores candidatos para PKAN La neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa (PKAN), un subtipo de ENACH/NBIA causada por mutaciones en el gen PANK2, ocupa el segundo capítulo. PANK2 codifica una enzima pantotenato quinasa que participa en el primer paso de la síntesis de la coenzima A. Esta sección de la tesis explora los microARNs (miARNs) como posibles biomarcadores de esta enfermedad. Estas pequeñas moléculas de ARN no codificantes regulan la expresión genética, y sus patrones de expresión diferencial pueden proporcionar información sobre la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas. Los objetivos de este capítulo son dos. Primero, validar la expresión diferencial de un conjunto de miARNs seleccionados en dos cohortes independientes de muestras de plasma de pacientes PKAN y controles, mediante PCR cuantitativa en tiempo real. En segundo lugar, evaluar la expresión diferencial de estos miARNs en fibroblastos de individuos PKAN y sanos. Sin embargo, los resultados obtenidos revelan que esta firma de miARNs no es suficiente para discriminar entre pacientes con PKAN y controles. La excepción podría ser hsa-miR-375-3p, para el que los datos obtenidos sugieren una asociación con la presencia del alelo p.T528M PANK2 en homocigosis. Este capítulo presenta un avance significativo mediante la aplicación de un protocolo de reprogramación directa, permitiendo la conversión de fibroblastos en células neurales, generando así una plataforma que permita estudiar la expresión de miARNs en un contexto neurona-específico. La utilización del factor de transcripción Ascl1 ha podido transformar con éxito los fibroblastos PKAN en células neuronales, y se ha logrado un establecimiento preliminar de este modelo celular. Se trata de un avance significativo que ofrece la posibilidad de profundizar en los mecanismos subyacentes de PKAN mediante experimentos futuros. Además del análisis de miARNs, este capítulo explora la sensibilidad de los fibroblastos PKAN a la muerte celular por la peroxidación lipídica. Los fibroblastos PKAN muestran una mayor susceptibilidad a estos procesos en comparación con las células control. Esta observación enfatiza la importancia de la homeostasis de los lípidos y los procesos de peroxidación en la patogénesis de PKAN, arrojando luz sobre posibles objetivos terapéuticos. Capítulo III: Modelo de células precursoras de cerebelo derivadas de hiPSC en el estudio de la fisiopatología de PLAN El tercer capítulo tiene como objetivo de estudiar la neurodegeneración asociada a mutaciones en el gen PLA2G6 (PLAN). PLAN es causada por mutaciones en el gen PLA2G6, una fosfolipasa independiente de calcio que hidroliza los glicerofosfolípidos para producir lisofosfolípidos y ácidos grasos libres. Se han generado células precursoras de cerebelo a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas tanto de pacientes con PLAN como de donantes sanos. La caracterización de estos precursores muestra varias observaciones notables. Estas neuronas exhiben niveles alterados de transcripción de genes asociados con la homeostasis del hierro y la ferroptosis, lo que indica la importancia de la regulación del hierro en la fisiopatología de PLAN. Además, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que las neuronas muestran una peroxidación lipídica elevada, un potencial de membrana mitocondrial reducido, niveles elevados de especies reactivas de oxígeno y un flujo autofágico deteriorado en condiciones basales, en comparación con las células control. La adición de citrato férrico de amonio conduce a cambios notables en la expresión de los genes investigados en condiciones basales y también a la acumulación de marcadores de autofagia. La suplementación con hierro no afecta significativamente la producción de lípidos peroxidados, lo que sugiere una interacción compleja de procesos relacionados con el hierro en la enfermedad. En conjunto, estos resultados amplían el conocimiento existente sobre la patogénesis de PLAN.