[en] Plant diseases caused by pathogenic fungi are responsible of important crop losses endangering food security and safety. Antimicrobial peptides (AMPs), exhibiting potent and durable lytic activity specifically against microorganisms, have a great potential as novel natural fungicides for the control of pathogenic fungi. However, viable exploitation of AMPs requires fast, cost-efficient, and safe production systems. The main goal of this work was to develop a sustainable platform for the production of bioactive AMPs, and to characterize them in the control of fungal infections in plants to advance in their application in agriculture. Antifungal proteins (AFPs) secreted by filamentous fungi are a group of highly stable cysteine-rich AMPs that specifically target fungal cells. In this study, we demonstrate that Nicotiana benthamiana plants are an excellent biofactory for producing AFPs through transient expression using a new vector derived from the tobacco mosaic virus. Using this plant-based production system we efficiently produced two different bioactive AFPs, the Penicillium expansum AfpA and Penicillium digitatum AfpB. We found that the subcellular compartment where AFPs are accumulated has an important impact on protein yield, probably avoiding toxicity towards plant cells. The highest yields were achieved when targeting AFPs to vacuoles, reaching up to 0.170 mg/g of fresh leaves of the highly active AfpA and eight times more of AfpB (1.2 mg/g of leaf). We also show that plant crude extracts containing AFPs are fully active against plant pathogens without requiring further protein purification, thus reducing significantly downstream processing. Therefore, the developed system is efficient for the production of AFPs, and also it is economic and safe since it is based on plants. We also developed an alternative system for the production of the linear PAF102 antifungal peptide that was recalcitrant to be produced in biological systems. This system is based on targeting the peptide to lipid droplets (LDs) through the fusion to a plant oleosin protein. Using this oleosin fusion technology, we produced PAF102 in rice seed LDs, reaching moderate yields of about 20 mg of peptide per gram of grain. Production on rice seeds is long process in order to speed the process, we successfully transferred the plant oleosin fusion technology to the Pichia pastoris system. We produced commercially relevant yields of PAF102 in these yeast LDs, reaching values of 180 mg/l of culture in only 4 days. The accumulation of PAF102 in the LDs of rice seeds and yeast facilitated its downstream extraction and recovery by simple flotation on dense solutions, with the recovered PAF102 being biologically active against pathogenic fungi. Finally, we demonstrate that in planta produced AfpA and AfpB, either purified protein or protein extracts enriched with these two proteins, are efficient in controlling important fungal diseases on economically relevant crops, including Botrytis gray mold disease in tomato leaves and fruits, blast disease in rice plants and Fusarium proliferatum infection in rice seeds. Our results provide a sustainable production system of AFPs, and evidence their efficacy on protecting plants from fungal infection, strongly supporting the use of AFPs as environmental friendly and effective "green fungicides" in crop and postharvest protection.

[es] Los hongos patógenos de plantas causan importantes pérdidas en las cosechas, poniendo en peligro la seguridad y calidad alimentaria. Los péptidos antimicrobianos (AMPs) muestran una actividad lítica potente y duradera específicamente frente a microorganismos, por lo que tienen un gran potencial como nuevos fungicidas naturales para el control de los hongos patógenos. Su explotación requiere de sistemas de producción rápidos, eficaces, económicos y seguros. El principal objetivo de este trabajo era desarrollar sistemas de producción sostenibles de AMPs, y su caracterización en el control de infecciones fúngicas para avanzar en su aplicación en la agricultura. Las proteínas antifúngicas (AFPs) secretadas por hongos filamentosos son un grupo de AMPs ricos en cisteínas, muy estables, activos específicamente frente a hongos. En este estudio demostramos que las plantas de Nicotiana bentamiana son una excelente biofactoría de AFPs mediante expresión transitoria usando un nuevo vector derivado del virus de mosaico del tabaco. Utilizando este sistema de producción en plantas, hemos producido eficientemente dos AFPs muy activas frente a hongos fitopatógenos, la AfpA de Penicillium expansum y la AfpB de Penicillium digitatum. Hemos descubierto que el compartimento subcelular donde se acumulan las AFPs tiene un impacto importante en la producción obtenida, probablemente porque su compartimentalización evita la toxicidad hacia las células vegetales. Los valores más altos se obtuvieron cuando las proteínas se acumularon en las vacuolas, alcanzando hasta 0,170 mg/g de hoja en el caso de la proteína más activa AfpA y hasta ocho veces más para la AfpB (1,2 mg/g de hoja). También demostramos que los extractos crudos de plantas que contienen AFP son activos frente a hongos, sin necesidad de purificar las proteínas reduciendo considerablemente el procesamiento del material vegetal y los costes de producción. Por lo tanto, el sistema desarrollado es eficiente para la producción de AFPs, y también es económico y seguro ya que se basa en plantas. Además, hemos desarrollado un sistema alternativo para la producción del péptido antifúngico PAF102 que previament no había podido producirse biotecnológicamente. Este sistema se basa en acumular el péptido en las gotas lipídicas (LDs) mediante la fusión a una proteína oleosina de plantas. Mediante esta estrategia, hemos producido PAF102 en semillas de arroz en cantidades de 20 mg por gramo de semilla. Sin embargo, la producción en semillas es lenta y para acelerar el proceso hemos transferido la tecnología de la fusión a oleosinas de plantas al sistema de Pichia pastoris. Usando este nuevo sistema hemos obtenido rendimientos comercialmente relevantes con producciones de 180 mg/l de cultivo en sólo 4 días. La acumulación de PAF102 en las LDs de las semillas de arroz y de la levadura facilita enormemente su extracción por simple flotación en soluciones densas, permitiendo la recuperación de péptido activo frente a hongos patógenos. Finalmente, hemos demostrado que tanto AfpA y AfpB producidas en plantas, como los extractos de plantas enriquecidos estas proteinas, son eficaces en la prevención de infecciones fúngicas en cultivos económicamente relevantes, tales como la podredumbre gris causada por Botrytis cinerea en hojas y frutos de tomate, el quemado del arroz causado por Magnaporthe oryzae, o las infecciones de las semillas de arroz por Fusarium proliferatum. Nuestros resultados proporcionan un sistema de producción sostenible de AFPs y demuestran su eficacia en la protección de las plantas contra las infecciones fúngicas, apoyando firmemente su uso como "fungicidas verdes" eficaces y respetuosos con el medio ambiente en la protección de cultivos y postcosecha.