[en] The incidence of human fungal infections has greatly increased in the last twenty years. Candida albicans is the leading cause of human systemic as well as superficial mycoses. In healthy individuals, C. albicans acts as a commensal organism. However, in immunosuppressed patients it acts as an opportunistic pathogen. The commensal to pathogen shift of C. albicans depends on the loss of the balance between the immune system and the fungus. Approximately 80 percent of human infections are due to the formation of biofilms. Biofilms are microorganism communities that develop on biotic or non-biotic surfaces covered by a complex tridimensional structure of extracellular matrix. Biofilm formation is an outstanding clinical problem because their microorganisms are more resistant to both antimicrobial agents and the immune response. In this regard, most Candida infections are associated with biofilm formation. Amongst the different virulence factors of C. albicans (morphogenesis, phenotypical change, quorum sensing, hydrolytic enzyme secretion, adhesion, and hydrophobicity), biofilm formation and hydrophobicity have been, and are still currently, considered as outstanding factors. In this PhD thesis, both properties of C. albicans have been thoroughly analyzed in 448 clinical isolates of C. albicans from patients with systemic candidiasis. The hydrophobicity study of these 448 isolates showed that no significant differences were found among the 88 percent of the isolates or between the clinical isolates and the control strand C. albicans SC5314. Regarding the biofilm formation, 70 percent of the isolates had low or no biofilm formation ability. Moreover, there was no correlation between hydrophobicity and biofilm formation capacity. The biofilm matrix has a major role in its growth, it is involved in the adhesion interactions, is responsible for its mechanical stability, and controls cell dispersion. In addition, it acts as a digestive system providing nutrients for its constituent cells as well as a protective barrier against both antifungal agents and host defenses. Regarding these functional activities, among the cellular components of the biofilm, proteins deserve special attention due to both their potential enzymatic activity and as targets for other molecules. In the proteomic analysis of the ethanolic extracts from of the extracellular matrix of the biofilms of nine clinical isolates and the control strain, 905 proteins were identified. Most of that proteins (mean 708) were present in the isolates with higher biofilm formation capacity; 148 in those with moderate biofilm formation capacity, and 143 in the isolates with poor biofilm formation capacity. Fifty seven proteins were common to all nine studied isolates and the control strain. That proteins are multifunctional species, from different cellular locations, and involved in different pathways, some of which deserve special interest, such as the defense against chemical or biological injuries, as well as their involvement in protein binding, transport and metabolism. Most of these proteins (93%) have negative hydropathic indexes which is concomitant with the fact that biofilms are considered hydrogels. Moreover, only 10 out of the 57 proteins had a signal peptide, which may mean that most of them get the extracellular matrix by a non-classic secretion way. Glx3, one of the 57 common proteins, is also one of the major proteins. The study of mutants for the GLX3 gene showed that its absence produces a series of effects on the integrity of the cell wall and increases its sensitivity to agents that alter the assembly of the cell wall components, as well as to zymolyase and the oxidative stress, effects that are partially recovered by the reintegration of this gene. In addition, the null mutant for the GLX3 gene is avirulent in murine models. Due to these effects, further studies should investigate this GlX3 null mutant as a potential immunological tool.

[es] La incidencia de infecciones fúngicas ha aumentado notablemente en los últimos 20 años, siendo Candida albicans la principal especie causante de micosis en humanos, tanto sistémicas como superficiales. C. albicans, en individuos sanos se comporta como un comensal inocuo, pero en ciertas situaciones puede comportarse como patógeno oportunista. La conversión de comensal a patógeno depende de la rotura del equilibrio existente entre el sistema inmunitario del hospedador y el hongo. Se considera que aproximadamente el 80% de las infecciones producidas en humanos, son consecuencia de la formación de biopelículas. Las biopelículas son comunidades de microorganismos formadas sobre superficies bióticas o abióticas, que están recubiertas por una matriz extracelular (ME) formando una estructura tridimensional compleja. La formación de las biopelículas supone un importante problema clínico, debido a que los microorganismos que la forman son más resistentes tanto frente a los agentes antimicrobianos como frente a las defensas del hospedador. La mayoría de las candidiasis se consideran directamente relacionadas con la formación de biopelículas. De entre los distintos factores de virulencia descritos en C. albicans (morfogenesis, cambio fenotípico, Quorum Sensing, secreción de enzimas hidrolíticos, adhesión, hidrofobicidad, etc.), la hidrofobicidad y la formación de biopelículas han sido y son considerados en la actualidad como factores muy a destacar. En la presente Tesis Doctoral, estas dos propiedades son objeto de un exhaustivo estudio llevado a cabo en 448 aislados clínicos de C. albicans procedentes de pacientes con candidiasis sistémica. El estudio de la hidrofobicidad de los 448 aislados clínicos demostró que el 88% de los mismos presentaban hidrofobicidades muy semejantes entre ellos y con la cepa utilizada como control, C. albicans SC5314. El estudio de la capacidad de formación de biopelículas dio resultados más dispares, no existiendo una correlación entre la hidrofobicidad y la capacidad de formación de biopelículas. El 70% de los aislados analizados fueron poco o nada formadores. La matriz de la biopelícula presenta en muchos aspectos una importancia crítica asociada con el crecimiento de la misma, interviene en las interacciones de adhesión proporcionando estabilidad mecánica, controlando la dispersión de las células que la forman. De igual modo actúa como sistema digestivo proporcionando nutrientes para las células presentes en la misma. Y así mismo actúa como barrera protectora frente tanto a los agentes antifúngicos como a las defensas del hospedador. Con respecto a estas acciones dentro de los distintos componentes presentes en la matriz extracelular merecen especial interés las proteínas, debido entre otros motivos tanto a su posible acción enzimática como el actuar como dianas de reconocimiento para otras moléculas. En el análisis proteómico de los extractos etanólicos de la matriz extracelular de las biopelículas de 9 aislados clínicos y de la cepa control C. albicans SC5314, se identificaron un total de 905 proteínas. La mayoría se encuentran presentes en los aislados muy formadores, una media de 708, en los medianamente formadores encontramos 148 y en los poco formadores 143 de media. Comunes a los 9 aislados estudiados junto a la cepa control, encontramos un total de 57 proteínas, se trata de especies proteicas "multifunción", pudiéndolas encontrar en distintas ubicaciones celulares, así como actuando en diferentes procesos, mereciendo especial interés la defensa frente ataques químicos o biológicos, así como su implicación en el transporte, el metabolismo y la unión a proteínas. Estas proteínas presentan en su mayoría (93%) índices de hidropatía negativos, siendo este dato concomitante con el hecho de que las biopelículas son consideradas hidrogeles. Así mismo de las 57 proteínas comunes, solo10 presentaban péptido señal, indicando que la mayoría llegan a la ME por vías de secreción no clásicas. Una de las 57 proteínas comunes es la Glx3, siendo además una de las proteínas mayoritarias. El estudio de mutantes para el gen GLX3 demostró que la ausencia del mismo produce una serie de efectos sobre la integridad de la pared celular aumentando la sensibilidad a agentes que alteran el ensamblaje de los componentes de la misma, así como a la Zimoliasa y al estrés oxidativo, efectos que se recuperan en parte mediante la reintegración de dicho gen. Así mismo el mutante nulo para el gen GLX3, es avirulento en modelos murinos. Observando estos efectos, dicho mutante podría proponerse en estudios posteriores como una posible herramienta inmunológica.