[ca] La malaltia de von Willebrand (VWD) és la patologia hemorràgica hereditària més freqüent a la població i està causada per dèficits quantitatius o qualitatius del factor von Willebrand (VWF). Segons el defecte, es distingeixen tres grans categories: la VWD de tipus 1 caracteritzada per una reducció parcial del VWF, la VWD de tipus 3 per una absència total de factor i la VWD de tipus 2 per defectes funcionals en aquesta proteïna. Actualment el diagnòstic d'aquesta patologia es basa en manifestacions clíniques de sagnat, una història familiar positiva i la realització d'un conjunt extens de proves de coagulació. Per altra banda, el diagnòstic genètic de la VWD s'ha considerat un test de segona línia degut a l'elevat cost que suposa realitzar l'anàlisi molecular del gen del VWF (VWF) mitjançant la tecnologia de Sanger. Els avenços realitzats en els últims anys en les eines de seqüenciació massiva (NGS) han promogut un interès creixent per la seva aplicació al diagnòstic clínic de malalties causades per gens de gran mida i altament polimòrfics com és el cas de la VWD. L'objectiu general d'aquesta tesi doctoral consisteix en aprofitar la tecnologia de NGS pel desenvolupament i optimització d'un protocol versàtil i econòmic per abordar l'estudi molecular de la VWD. Es pretén aplicar el nou protocol a grans cohorts de pacients per aprofundir en la investigació dels mecanismes genètics de la VWD i determinar la implicació de les variants identificades al VWF en diferents aspectes del fenotip amb rellevància en el curs clínic de la malaltia. En aquest sentit, s'ha dissenyat i optimitzat un protocol eficaç i econòmic que permet amplificar el VWF en 48 pacients simultàniament i seqüenciar-los posteriorment per NGS. El desenvolupament d'aquesta estratègia ha tingut especial rellevància dins del projecte "Perfil Clínic i Molecular de la malaltia de von Willebrand: Registre Espanyol" (PCM-EVW-ES), l'objectiu del qual és el d'establir un registre nacional per a la VWD i en el qual han participat la majoria dels grans hospitals del país reclutant 556 individus. L'aplicació del procediment en aquest registre ha permès identificar un elevat número de mutacions diferents al VWF i ha estat essencial per a la confirmació i la classificació de la VWD en 480 pacients dels 556 inicialment inclosos, establint-se una correlació genotip-fenotip en el 94,6% dels casos. Tanmateix, l'aplicació del protocol en l'estudi retrospectiu d'una cohort portuguesa de 92 pacients amb VWD, ha demostrat la seva potència, eficàcia, rapidesa i reducció de costos, en comparació amb la tecnologia de Sanger, pel diagnòstic molecular d'aquesta patologia. A continuació, derivat de l'estudi genètic d'aquestes cohorts s'han seleccionat varies mutacions potencials d'splicing (PSSM) per a investigar el seu efecte patogènic mitjançant estudis transcripcionals in vivo. Els resultats obtinguts han permès caracteritzar l'efecte patogènic en el processament de l'mRNA del VWF de 8 PSSM i posen de manifest que mutacions de tipus missense i sinònimes també poden actuar alternat l'splicing. Per últim, s'ha investigat la participació dels polimorfismes en la modulació de la gravetat i les manifestacions clíniques de la VWD. D'aquesta manera s'ha estimat que quatre polimorfismes poden arribar a explicar de l'1,5% al 2,6% de la variància fenotípica de diferents mesures del VWF (VWF:Ag, VWF:RCo i/o VWF:CB). En resum, l'anàlisi genètica del VWF mitjançant la tecnologia NGS ha demostrat la seva vàlua en el diagnòstic de la VWD i ha aportat dades per a comprendre i esclarir la base molecular d'aquesta patologia.

[en] Von Willebrand's disease (VWD) is the most common inherited bleeding disorder and is caused by a deficiency or dysfunction of von Willebrand factor (VWF). There are three major categories: type 1 resulting from a partial reduction of the VWF, VWD type 3 resulting from a complete or near complete absence of this factor and VWD type 2 characterized by qualitative deficiency. Currently, the diagnosis of this pathology is based on clinical and phenotypic information. The molecular diagnosis of VWD has been considered as a second line test due to the high cost to perform the molecular analysis of the VWF gene (VWF) by Sanger. Recently, the advances in high throughput sequencing methologies (NGS) have promoted a growing interest in its application to the clinical diagnosis of monogenic diseases. The main objective of this doctoral thesis is to develop and optimize a versatile and economic protocol based on NGS to address the molecular study of the VWD. It is intended to apply the new protocol to large patient cohorts to study in depth the molecular mechanisms of the VWD and determine the implication of VWF variants in the VWD phenotype. In this sense, an effective and economical protocol has been designed and optimized that allows the amplification of the VWF in 48 patients simultaneously and sequencing by NGS. The development of this strategy has been of particular relevance in the "Clinical and Molecular Profile of von Willebrand's Disease: Spanish Registry" (PCM-EVW-ES), whose purpose is to establish a national registry of the VWD. The majority of Spanish hospitals participated in this project and recruited a total of 556 individuals. The application of the developed procedure in this registry has prompted the identification of a high number of VWF mutations and has been essential for confirmation and classification of the VWD in 480 patients of the 556 initially included, establishing a genotype-phenotype correlation in 94.6% of cases. Additionally, the application of this protocol in the retrospective study of a Portuguese cohort of 92 VWD patients has demonstrated its power, efficiency, and cost reduction, compared to Sanger's technology, in molecular diagnosis of VWD. Derived from the genetic study of these cohorts, several potential splice site mutations (PSSM) have been selected to investigate their pathogenic effect through transcriptional studies in vivo. The results obtained demonstrate the pathogenic effect of 8 VWF PSSM in the mRNA processing and prove that missense and synonymous mutations could also affect splicing. Finally, it has been investigated the participation of VWF polymorphisms in the modulation of the severity and the clinical manifestations of the VWD. In this way, it has been estimated that four polymorphisms can account from 1.5% to 2.6% of the phenotypic variance of different VWF measurements (VWF: Ag, VWF: RCo and / or VWF: CB). In summary, genetic analysis of the VWF by means of NGS technology has proven its worth in the diagnosis of the VWD and has provided data to understand and elucidate the molecular basis of this pathology.