[en] Transthyretin (TTR) misfolding and amyloid aggregation is associated with a group of fatal disorders known as TTR amyloidosis (ATTR). Most of these diseases are hereditary, being caused by mutations that destabilize TTR's native state. Noteworthy, wild-type protein deposition also occurs and is considered a common cause of heart failure in the elderly. Small molecules that bind TTR can act as kinetic stabilizers, preventing tetramer dissociation and thus aggregation. In this context, our group repurposed tolcapone, an FDA-approved molecule for Parkinson¿s Disease, as a potent TTR aggregation inhibitor. Importantly, tolcapone¿s unique ability to cross the blood-brain barrier suggests that it could be an option for leptomeningeal amyloidosis, a rare type of ATTR that cannot be addressed with any of the current therapies. In the present thesis, we demonstrated that tolcapone binds to and inhibits the aggregation of TR variants associated with leptomeningeal amyloidosis, suggesting that it can become the first broad-spectrum drug to treat all manifestations of the disease. Despite the excellent performance of tolcapone, the structures of TTR:tolcapone complexes revealed that it could be redesigned to establish more contacts with the protein, which could improve its potency. By combining rational design and molecular dynamics simulations we discovered M-23, a molecule that presents one of the highest affinities for TTR reported thus far. The crystal structure confirmed that, as intended, M-23 forms new and strong contacts with the protein, leading to a higher tetramer stabilization both in vitro and in serum relative to tolcapone. These results encouraged us to further develop M-23 into a drug for ATTR, yet its poor pharmacokinetic profile could compromise its therapeutic use. In this context, we developed PITB, a M-23 derivative that keeps the interactions it establishes with TTR while improving its pharmacokinetics. The structural and biophysical characterization of PITB interaction with TTR revealed that it binds with high affinity to both the wild-type protein and the two most clinically significant TTR variants, stabilizes them, and inhibits their aggregation. Most importantly, PITB exerted a higher tetramer stabilizing effect in plasma from patients than tolcapone, which together with its remarkable pharmacokinetics make of PITB a very promising candidate to treat ATTR and at an affordable cost for all patients. While much insight has been gained in these studies through three-dimensional structures, they do not shed light into the dynamics of the conformational alterations involved in the amyloidogenicity of disease-related TTR variants or assess the effect of molecular binders. To address this gap, in this thesis we exploited the potential of two mass spectrometry-based footprinting methods, hydrogen deuterium exchange (HDX) and fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). The data obtained provided valuable insights into the effect of pathogenic mutations and kinetic stabilizers on TTR structure, opening a new avenue for the personalized screening of TTR kinetic stabilizers targeting specific variants. All in all, the results obtained in this thesis provide significant understanding of the structural-determinants of TTR kinetic stabilization, and support the development of the molecules presented here as drugs to treat ATTR.

[es] El mal plegamiento y la agregación amiloide de la transtiretina (TTR) se asocian a un grupo de trastornos de pronóstico fatal conocidos como amiloidosis por TTR (ATTR). Estas enfermedades son mayoritariamente hereditarias y están causadas por mutaciones que desestabilizan el estado nativo de la TTR. Hay que indicar que la deposición de la variante natural de la proteína parece ser una causa frecuente de insuficiencia cardíaca en las personas mayores. Ciertas moléculas pequeñas que se unen a la TTR pueden actuar como estabilizadores cinéticos, impidiendo la disociación del tetrámero y, por tanto, la agregación. En este contexto, nuestro grupo reposicionó tolcapone, una molécula aprobada por la FDA para la enfermedad de Parkinson, como un potente inhibidor de la agregación de TTR. Además, al ser capaz de atravesar la barrera hematoencefálica podría suponer una opción para la amiloidosis leptomeníngea, intratable a fecha de hoy. En la presente tesis, demostramos que tolcapone se une e inhibe la agregación de las variantes de TTR asociadas con la amiloidosis leptomeníngea, lo que sugiere que puede convertirse en el primer fármaco de amplio espectro para tratar todas las manifestaciones de la enfermedad. Las estructuras de los complejos cristalográficos (TTR:tolcapone) revelaron la posibilidad de mejorar su potencia estableciendo contactos adicionales con la proteína. Combinando el diseño racional y las simulaciones de dinámica molecular diseñamos M-23, una molécula que presenta una de las mayores afinidades por la TTR descritas hasta la fecha. La estructura cristalina confirmó que, como se pretendía, M-23 forma nuevos y fuertes contactos con la TTR, lo que conduce a una mayor estabilización del tetrámero tanto in vitro como en suero en relación con tolcapone. Estos resultados nos animaron a seguir avanzando M-23 como fármaco para la ATTR, aunque su deficiente perfil farmacocinético podría comprometer su uso terapéutico. En este contexto, desarrollamos PITB, un derivado de M-23 que mantiene las interacciones que establece con TTR al tiempo que mejora su farmacocinética. La caracterización estructural y biofísica de la interacción de PITB con TTR reveló que se une con alta afinidad tanto a la proteína de tipo salvaje como a las dos variantes de TTR más significativas clínicamente, las estabiliza e inhibe su agregación. Y lo que es más importante, el PITB ejerce un mayor efecto estabilizador del tetrámero en plasma de pacientes que tolcapone, lo que unido a su destacable farmacocinética hacen de PITB un candidato muy prometedor para tratar la ATTR y a un coste asequible para todos los pacientes. Aunque se han obtenido muchos conocimientos en estos estudios a través de estructuras tridimensionales, estos no arrojan luz sobre la dinámica de las alteraciones conformacionales implicadas en la amiloidogenicidad de las variantes de TTR ni para evaluar el efecto de ligandos estabilizantes. Con el objetivo de cubrir esta necesidad, en el presente trabajo explotamos el potencial de dos técnicas analíticas de huella peptídica basadas en la espectrometría de masas como son el intercambio de deuterio por hidrógeno (HDX) y la oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP). Los datos obtenidos nos han proporcionado información relevante tanto sobre el efecto de las mutaciones patogénicas de la TTR como de los agentes estabilizantes analizados. Por todo ello, estas técnicas nos permiten establecer una alternativa muy prometedora y que no ha sido explorada previamente para el cribado personalizado de estabilizadores cinéticos de TTR dirigidos a variantes específicas. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis proporcionan una comprensión significativa de los determinantes estructurales de la estabilización cinética de TTR, y apoyan el desarrollo de los estabilizadores cinéticos como fármacos prometedores para el tratamiento de la ATTR.