[en] This doctoral dissertation aims to contribute to the development of new tools for the early diagnosis and monitoring of non-communicable diseases. To achieve this goal, high throughput methodologies are available in the market, but the high cost and low accessibility difficult their implementation in primary healthcare centers in low- and middle-income countries. Thereby, the development and improvement of novel methods for low resource settings remains essential to reduce the burden of those diseases. In addition to the development of new, simpler, and less expensive instruments for diagnosis, the research of novel biomarkers in liquid biopsies is also very relevant. Among the different types of biomarkers, the study of exosomes as cell secreted vesicles, widely available in all biofluids, could provide direct information about physiological and pathological processes in the tissues. Exosomes are nano-sized extracellular vesicles which are currently under intensive study as potential diagnostic biomarkers for many health disorders. Particularly, they are emerging as a new biomarker in liquid biopsies for cancer, since it is known that they are profusely released by cancer cells containing their altered molecular fingerprint. The work thus addresses the study of rapid diagnostic tests (RDTs) for the analysis of exosomes as biomarkers of clinical interest. Specifically, it is focused on the improvement of the analytical parameters, experimental designs, and technologies of those RDTs. All the approaches were tested and optimized with exosomes derived from cell culture supernatants from MCF-7, MDA-MB-231 and SKBR3 cell lines, as a model of breast cancer cells. The production, isolation and purification of those cultured exosomes were firstly addressed. Then, the obtained cancer-derived exosomes were physically and molecularly characterized with standard analytical methods, such as nanoparticle tracking analysis, cryogenic transmission electron microscopy and flow cytometry. One of the main challenges dealing with exosomes in RDTs is to increase the sensitivity and improve the limits of detection of the assays. In this direction, the use of magnetic preconcentration and nucleic acid amplification techniques, as double-tagging RT-PCR, were explored for its use in this kind of samples. In this dissertation, a novel electrochemical magneto-actuated platform combining immunomagnetic separation and genosensing of double-tagged amplicons for the quantitative detection of exosomes, is reported. The approach is based on the amplification of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) transcripts . The proposed RDT was tested with human serum XII samples, enabling to discriminate breast cancer patients and healthy individuals and enhancing the limits of detection. On the other hand, paper-based detection techniques, as Lateral and Vertical Flow assays, were explored to improve the simplification of the assays, able to deal with resource-limited settings. In this dissertation, the potentiality of Vertical Flow Assay (VFA) for the visual detection of exosomes is explored for the first time. This approach relies on the use of alkaline phosphatase as enzymatic reporter, producing a colorimetric signal on the surface of the paper membranes. The visual signals were quantified with an image analysis software, obtaining promising results for the characterization of protein markers on exosomes with a simple and cost-effective device. Finally, other non-conventional approaches were explored for the detection of exosomes, focused on the detection of their intrinsic enzymatic activity. The intrinsic enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH) was also studied as an overexpressed biomarker in cancer disease. A novel method based on nano-flow cytometry was developed for the detection of those enzymes directly inside the exosomes. This study represents the first step towards the development of a new RDT targeting ALDH intrinsic activity of exosomes for cancer diagnostics.

[es] En esta esta tesis doctoral se presenta el desarrollo de nuevas herramientas para el diagnóstico precoz y el seguimiento de enfermedades no transmisibles. Aunque existen metodologías de alto rendimiento disponibles en el mercado para conseguir este objetivo, el alto coste y la escasa disponibilidad en entornos de escasos recursos dificultan su implementación en centros de atención primaria de los países en vías de desarrollo. Por tanto, el diseño de nuevos métodos sigue siendo esencial para reducir la incidencia de estas enfermedades. Además del desarrollo de dispositivos de diagnóstico más sencillos y menos costosos, la búsqueda de nuevos biomarcadores en biopsias líquidas es muy relevante. Entre los distintos tipos de biomarcadores, el estudio de vesículas secretadas por las células puede proporcionar información relevante sobre procesos fisiológicos y patológicos de los tejidos. Los exosomas son vesículas extracelulares de tamaño nanométrico que se están estudiando intensamente como potenciales biomarcadores de diagnóstico en muchas enfermedades, especialmente, en biopsias líquidas para el cáncer, debido a su liberación aumentada por las células cancerosas con una impronta molecular alterada. Esta tesis doctoral se enfoca al estudio de las pruebas de diagnóstico rápido (RDT, del inglés rapid diagnostic test) para exosomas como biomarcadores de interés clínico. En concreto, se centra en la mejora de los parámetros analíticos, diseños experimentales y tecnologías de estos dispositivos. Todos los métodos desarrollados se han probado y optimizado con exosomas derivados de sobrenadantes de cultivo celular de las líneas celulares MCF-7, MDA-MB-231 y SKBR3, como modelo de células de cáncer de mama. En primer lugar, se abordó la producción, aislamiento y purificación de estos exosomas cultivados. Las nanovesículas cancerosas obtenidas se caracterizaron física y molecularmente con métodos analíticos estándar, como el análisis de seguimiento de nanopartículas, la microscopía electrónica de transmisión criogénica y la citometría de flujo. Uno de los principales retos para analizar los exosomas en un RDT es aumentar la sensibilidad y mejorar los límites de detección de los ensayos. En esta dirección, se exploró el uso de técnicas de preconcentración magnética y amplificación de ácidos nucleicos, como la RT-PCR de doble marcaje, para su uso en este tipo de muestras. En esta tesis se desarrolla una nueva plataforma que combina la separación inmunomagnética y la detección electroquímica de amplicones doblemente marcados para la detección cuantitativa de exosomas, basado en la amplificación de las secuencias mRNA de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). El método desarrollado se probó con muestras reales de suero humano y permite diferenciar a pacientes con cáncer de mama e individuos sanos, mejorando notablemente los límites de detección. Por otra parte, se exploraron RDT en papel. Con esta plataforma se consigue la simplificación analítica de los ensayos, y se mejoran sus características para entornos con recursos limitados. En esta tesis se explora por primera vez la potencialidad del ensayo de flujo vertical (VFA) para la detección visual de exosomas. Este método se basa en el uso de la fosfatasa alcalina como marcador enzimático, produciendo una señal colorimétrica en la membrana de papel. Las señales visuales pudieron cuantificarse con un software de análisis de imágenes, obteniendo resultados prometedores para la caracterización de marcadores de proteínas en exosomas con un dispositivo sencillo y de bajo coste. Por último, se exploraron otros enfoques no convencionales para la detección de exosomas, centrados en la detección de la actividad enzimática intrínseca. Se estudió la actividad de las aldehído deshidrogenasas (ALDH), considerado también como biomarcador sobreexpresado en cáncer. Se desarrolló un nuevo método basado en la nano-citometría de flujo para la detección de estas enzimas directamente en los exosomas. Este estudio supone el primer paso hacia el desarrollo de un nuevo RDT para la detección de exosomas.