[en] The differentiation capacity of mesenchvmal stem cells (MSCs) towards chondrocytes, in a process called chondrogenesis, provides them a great therapeutic potential for the repalr of cartJlage defects in rheumatic diseases such as osteoarthritis (OA). However, the molecular mechanisms underlving the chondrogenesis process are still in part unknown. Proteomic tools enable us to globallv analvze cellular activitv, obtaining proteomic profiles that provide us information about the present connections between proteins and ceJlular pathwavs. In this work, we have emploved different proteomic strategies in order to elucidate the molecular mechanisms involved in the chondrogenesis process of bone marrow MSCs, with the purpose of identify new chondrogenic markers useful for molecular monitorization in cell therapv-based approaches for cartllage repair. Firstly, we standardized SILAC labeling in bone marrow MSCs in order to carry out quantitatlve proteomic experiments. Once the SILAC method was optimized, its application aJlowed us to describe the modulations of intraceJlular proteins during the chondrogenic differentiation of MSCs. 65 proteins exhibited a significant modulation of their levels between the two different stages of chondrogenic differentiation (daV 2 vs. dav 14). Most of these proteins were involved in cellular metabolism and glvcolvsis. Next, we emploved a double-SILAC strategy, followed bV nanoLC-ESI·MS analysis, to Identify and quantify the extraceJlular proteins of M5Cs at davs 2 and 14 of chondrogenesis. Using this methodology, we found alterations in the abundance of 34 proteins between the two time points evaluated. Most of the proteins increased at day 14 were cartilage-specific ECM proteins. Proteoglvcan 4 (PRG4) and TIMP1 were validated bV immunoassavs so both have a valuable potential use as biomarkers of chondrogenic differentiation. Flnallv, we confirmed the utilltV of mass spectrometry imaging (MSI) for the characterization of the lipids involved in chondrogenesis. In this studv, we confirmed that M5Cs mobilize the sphingomvelin during their differentiation toward chondrocytes and the phosphocholine-related lipids could be markers of the undifferentiated stage.

[gl] A capacidad e de diferenciación das células nai mesenquimais (MSCs) cara os condrocitos, nun proceso coñecido como condroxénese, outorga a estas célulasFinalmente, se comprobó la utilidad de las técnicas de imagen mediante espectrometría de masas (MS Imaging) para la caracterización de lipldos involucrados en el proceso de diferenciación. En este último estudio demostramos que las MSCs metabolizan la esfingomielina durante la diferenciación condrogénica, V que la fosfocolina V sus derivados son posibles marcadores de indiferenciación de MSCs. un gran potencial terapéutico para a reparación dos defectos da cartilaxe característicos de enfermidades reumáticas como a artrose. Non obstante, os mecanismos moleculares que participan neste proceso de diferenciación non son de todo coñecidos. As técnicas proteómicas posibilitan analizar globalmente a actividade celular, xa que permiten obter perfís proteicos que proporcionan información sobre as conexións existentes entre as prote(nas e as rutas ou ,procesos celulares nos que participan. Neste traballo empregáronse diferentes metodoloxías proteómicas para estudar os mecanismos moleculares que participan na diferenciación condroxénica das MSCs obtidas da medula ósea, ca fin de identificar novos marcadores condroxénicos que poidan empregarse na monitorización de terapias celulares encamiñadas á reparación da cartilaxe . Inicialmente estandarizouse a marcaxe metabólica SILAC nas MSCs iIIadas de medula ósea para levar a cabo os estudos proteómicos cuantitativos. Unha vez optimizado este método, a súa aplicación permitiunos describir as proteínas intracelulares cuxa abundancia altérase durante o proceso de diferenciación das MSCs. Os niveis de expresión de 65 proteínas moduláronse significativamente entre os dous estadios celulares analizados (indiferenciado (dia 2) e diferenciado (día 14)). A maior parte destas proteínas estaban implicadas no metabolismo celular e na glucólise. En base a este traballo, decidimos realizar outro estudo no que aplicamos a doble marcaxe SILAC seguido da análise nanoLC-ESI-MS para identificar e cuantificar as proteínas secretas palas MSCs ós días 2 e 14 do proceso de condroxénese. Mediante esta estratexia, detectáronse cambios significativos na abundancia de 34 proteínas entre os dous tempos analizados. A maior parte das proteínas aumentadas a día 14 son proteínas relacionadas coa matriz extracelular da cartilaxe, e entre elas validamos mediante inmunoensaios o incremento do proteoglicano 4 (PRG4) e TIMPl como potenciais biomarcadores da diferenciación condroxénica. Finalmente, comprobouse a utilidade das técnicas de imaxen mediante espectrometrla de masas (MS Imaging) para a caracterización de ¡¡pidos involucrados no proceso de diferenciación. Neste último estudo demostramos que as MSCs metabolizan a esfingomielina durante a diferenciación condroxénica, e que a fosfocoJina e os seus derivados son posibles marcadores de indiferenciación das MSCs.