[en] Summary The primary objective of this thesis is to develop metal-free contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI) based on organic radicals, addressing the well-known toxicity associated with the commonly used Gd(III)-based contrast agents (GBCAs) in clinical diagnostics. In particular, based on "radical dendrimers" i.e. dendrimers fully functionalized by organic radicals since dendrimers, which are monodisperse polymers with a precisely defined molecular structure, serve as an ideal platform for anchoring organic radicals. This strategy not only enhances relaxivity but also provides a shielding effect, protecting the radicals from reduction. This thesis explores the synthesis, characterization, and application of novel radical dendrimers, with a focus on i) improving previous synthetic methods, ii) investigating amphiphilic radical dendrimers capable of self-assembly into supramolecular structures, and iii) incorporating additional properties to develop bimodal imaging probes. All of them designed to enhance water-solubility, imaging capabilities, improve safety, and provide multifunctional (or multimodal) diagnostic features. Previous synthetic procedures of water-soluble radical dendrimers were complex and time-consuming. For this reason, the first aim of this thesis has been the development of a more efficient synthesis process involving fewer reaction and purification steps than those obtained in the group previously. It has been designed, synthesized and characterized a series of water-soluble radical dendrimers (G0 to G5 generations) using a simplified synthetic approach based on a cyclotriphosphazene core and lysine-derived branching units, functionalized with nitroxyl radicals. It has resulted in a highly versatile process that allows for on-demand modulation of water solubility and it has permitted to reduce substantially the reaction time. Electron paramagnetic resonance (EPR) and molecular dynamics (MD) studies reveal key factors influencing water accessibility and relaxivity. Higher-generation dendrimers, especially G5, with 192 radical units exhibit significantly enhanced relaxivity (24 mM-1s-1) due to increased radical density. In vitro and in vivo tests confirm their biocompatibility and accumulation in glioblastoma tumors. Additionally, folic acid has been successfully conjugated to these dendrimers for future tumor-targeted applications. It has been explored the use of amphiphilic radical dendrons based on a polyethylene glycol (PEG) chain and bis-MPA dendrons fully functionalized with nitroxyl radicals. Interestingly, while the dendritic precursors self-assemble forming fibres, upon the binding of radicals to them they organize forming nanovesicles (dendrimersomes) in the three generations studied (G2, G3, and G4). EPR, cryo-TEM, and MD simulations have made possible to track their self-assembly and structure. These dendrimersomes demonstrate relaxivity comparable to GBCAs and offer improved safety. In vivo biodistribution experiments in mice revealed that the highest generation provided extended imaging times exceeding one hour, along with good biocompatibility and enhanced tissue contrast. It accumulated in the bladder and was efficiently excreted through urine. These novel nanovesicles obtained, in addition to being promising contrast agents, could also be used as nanocarriers for drugs, anticancer compounds or genetic material, among others. Finally, with the aim of incorporating new properties to radical dendrimers, it has been developed a bimodal imaging agent, designed to exhibit not only magnetic but also fluorescent properties. It is based on a polyamide dendrimer incorporating a naphthalimide (Naft) core, functionalized with nitroxyl radicals. Although the fluorescence is partially quenched by the radicals, the final compound present both fluorescent and magnetic imaging capabilities, making it suitable for both MRI and live cell fluorescence imaging. In addition, we have been able to explain the fluorescence quenching process by means of DFT calculations. This study highlights the potential of such agents for dual-modality imaging in cancer diagnosis and therapy monitoring. In conclusion, this work demonstrates that multifunctional radical dendrimers are promising alternatives to GBCAs as MRI contrast agents.

[es] Resumen El objetivo principal de esta tesis es desarrollar agentes de contraste (CA) libres de metales para imagen de resonancia magnética (MRI) basados en radicales orgánicos, como solución al problema conocido de toxicidad asociado con los CA basados en Gd(III) (GBCA) ampliamente utilizados en diagnósticos clínicos. En particular, en agentes basados en "dendrímeros radicales", es decir, dendrímeros completamente funcionalizados por radicales orgánicos. En esta tesis se explora la síntesis, caracterización y aplicación de nuevos dendrímeros radicales, centrándonos en i) mejorar los métodos sintéticos anteriores, ii) investigar dendrímeros radicales anfifílicos capaces de autoensamblarse en estructuras supramoleculares, e iii) incorporar propiedades adicionales para desarrollar sondas de imágenes bimodales. Todos ellos diseñados para mejorar la solubilidad en agua, la capacidad de dar contraste, mejorar la toxicidad y proporcionar características diagnósticas multifuncionales. Los procedimientos sintéticos previos de dendrímeros radicales solubles en agua eran complejos y consumían mucho tiempo. Por este motivo, el primer objetivo de esta tesis ha sido el desarrollo de un proceso de síntesis más eficiente que implique menos pasos de reacción y purificación que los obtenidos anteriormente. Se ha diseñado, sintetizado y caracterizado una serie de dendrímeros radicales solubles en agua (G0 a G5) utilizando una estrategia sintética simplificada basada en un núcleo de ciclotrifosfaceno y unidades de ramificación derivadas de lisina. Ha resultado ser un método muy versátil que permite modular la solubilidad en agua de los compuestos bajo demanda y ha permitido reducir sustancialmente el tiempo de reacción. Los estudios de resonancia paramagnética electrónica (EPR) y dinámica molecular (MD) revelan factores clave que influyen en la accesibilidad y relajatividad del agua. La generación G5, con 192 unidades de radical, muestra una relajatividad muy alta (24 mM-1s-1) debido a su gran densidad de radicales. Las pruebas in vitro e in vivo confirman su biocompatibilidad y acumulación en tumores de glioblastoma. Además, el ácido fólico se ha conjugado con éxito a estos dendrímeros para futuras aplicaciones dirigidas a tumores. Se ha explorado el uso de dendrones radicales anfifílicos basados en una cadena de polietilenglicol (PEG) y dendrones bis-MPA completamente funcionalizados con radicales nitroxilo. Es muy interesante el hecho que los precursores dendríticos se autoensamblan formando fibras, mientras que cuando éstos incorporan los radicales se organizan formando nanovesículas (dendrimersomas) en las tres generaciones estudiadas (G2, G3 y G4). Las simulaciones de EPR, cryo-TEM y MD han permitido estudiar su autoensamblaje y estructura. Estos dendrímersomas demuestran una relajatividad comparable a los GBCA y no muestran citotoxicidad. Estudios de biodistribución in vivo en ratones revelaron que la generación más alta proporcionaba tiempos de obtención de imágenes más largos, superiores a una hora, junto con una buena biocompatibilidad y un buen contraste en tejido. Se excretaba de forma eficiente a través de la orina. Estas nuevas nanovesículas obtenidas, además de ser agentes de contraste prometedores, también podrían utilizarse como nanotransportadores de fármacos, compuestos anticancerígenos o material genético, entre otros. Finalmente, con el objetivo de incorporar nuevas propiedades a los dendrímeros radicales, se ha desarrollado un agente de obtención de imágenes bimodal, diseñado para presentar no solo propiedades magnéticas sino también fluorescentes. Se basa en un dendrímero de poliamida que incorpora un núcleo de naftalimida (Naft), funcionalizado con radicales nitroxilo. Aunque los radicales disminuye parcialmente la fluorescencia, el compuesto final presenta tanto capacidades de imagen fluorescente como magnética, lo que lo hace adecuado para la resonancia magnética (MRI) y la imagen fluorescente en células vivas. Además, hemos logrado explicar el proceso de disminución de la fluorescencia mediante cálculos de DFT. Este estudio destaca el potencial de estos agentes para la imagen de doble modalidad en el diagnóstico del cáncer y el seguimiento de la terapia.