[en] Fanconi anemia (FA) is a rare genomic instability disorder characterized by progressive bone marrow failure and predisposition to cancer. 19 FA-associated proteins are involved in the repair of DNA interstrand crosslinks (ICLs). Molecular diagnosis is a capital issue for FA patients and their families. The characterization of the mutations allows prenatal and preimplantacional diagnosis, permit to identify carriers in FA families and to rule out the disease in related donors' bone marrow transplantation (BMT). Mutations can be used as markers to monitor the success of BMT and their characterization is also required for the development of new therapies such as gene therapy or the latest techniques of "genome editing" to correct the defect in the mutated FA gene. Due to the genetic heterogeneity of FA the identification of the mutated gene in a given FA patient can require several months of highly specialized work. The use of the latest Next Generation Sequencing technologies such as whole exome sequencing (WES) could be a valid alternative to subtype and molecularly characterize all FA patients regardless of their complementation groups. In this study we present the results of the molecular characterization of 49 FA patients using WES. To simplify even more the molecular diagnosis process, we used a commercial kit for target enrichment of our samples and we characterized large deletions by coverage analysis. All mutations found were confirmed by Sanger sequencing or Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). We were able to completely characterize 42 out of 49 patients (85,7%) and 90 out of 97 mutated alleles (92,8%) thus demonstrating the potential of WES in FA molecular characterization. WES of unclassified FA individuals allowed us to discover biallelic germline mutations in ERCC4 (XPF) as a cause of FA: ERCC4 encodes for XPF a structure-specific nuclease- previously connected to nucleotide excision repair (NER) and to Xeroderma pigmentosum and XFE progeroid syndromes. Genetic reversion with wild-type ERCC4 cDNA of FA cell lines phenotype, provided genetic evidence that mutations in ERCC4 cause this FA subtype (FA-Q). Further biochemical and functional analysis demonstrated that the identified FA-causing ERCC4 mutations strongly disrupt the function of XPF in DNA ICL repair without severely compromising NER. Our data show that depending on the type of ERCC4 mutations and the resulting balance between both DNA repair activities, individuals present with one of three clinically distinct disorders, highlighting the multifunctional nature of the XPF endonuclease in genome stability and human disease. To investigate the possible role of ERCC4 in breast and ovarian cancer susceptibility, as occurs with other FA genes, we screened the 11coding exons and exon–intron boundaries of ERCC4 in1573 index cases from high-risk Spanish familial breast and ovarian cancer pedigrees that had been tested negative for BRCA1 and BRCA2 mutations and 854 controls. The frequency of ERCC4 mutation carriers does not differ between cases and controls, suggesting that ERCC4 is not a cancer susceptibility gene. Interestingly, the prevalence of ERCC4 mutation carriers (1/288) is similar to that reported for FANCA, whereas there are approximately100-fold more FA-A than FA-Q patients, indicating that most biallelic combinations of ERCC4 mutations are embryo lethal. Finally, we identified additional ERCC4 mutations specifically disrupting ICL repair.

[es] La anemia de Fanconi (AF) es un trastorno genético raro de inestabilidad genómica que se caracteriza por insuficiencia de la médula ósea y predisposición al cáncer. Las 19 proteínas AF conocidas hasta el día de hoy están implicadas en la reparación de los enlaces entrecruzados del ADN (ICL). El diagnóstico molecular es de capital importancia para los pacientes AF y sus familias. La caracterización de las mutaciones permite el diagnóstico prenatal y preimplantacional, de identificar portadores en las familias y de descartar la enfermedad en donantes emparentados para el trasplante de médula ósea (TMO). Las mutaciones pueden ser utilizadas como marcadores para monitorizar el éxito del TMO y también son importantes para el desarrollo de nuevas terapias como la terapia génica o las últimas técnicas de "edición de genoma" para corregir el gen mutado AF. Debido a la heterogeneidad genética de la AF la identificación del gen mutado puede requerir varios meses de trabajo altamente especializado. El uso de las tecnologías de nueva generación para la secuenciación del ADN como la secuenciación del exoma (whole exome sequencing; WES) pueden ser una válida alternativa para caracterizar molecularmente los pacientes AF independientemente del subtipo. En este estudio se presentan los resultados de la caracterización molecular de 49 pacientes deAF utilizando WES. Para simplificar el proceso de diagnóstico molecular, se utilizó un kit comercial para el enriquecimiento de las secuencias exómicas y caracterizamos las grandes deleciones por análisis de cobertura. Todas las mutaciones encontradas fueron confirmadas por secuenciación de Sanger o Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). Fuimos capaces de caracterizar por completo 42 de 49 pacientes (85,7%) y 91 de 99 alelos mutados (92,8%) demostrando así el potencial de la WES para la caracterización molecular de la AF. El análisis por WES de individuos AF no clasificados nos permitió descubrir como causa de AF mutaciones bialélicas en ERCC4, un gen que codifica para la nucleasa XPF previamente conectada con la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y con los síndromes Xeroderma Pigmentosum y progeria XFE. La complementación del fenotipo de las líneas celulares de AF con el cDNA wt de ERCC4, proporcionó la evidencia genética de que las mutaciones en ERCC4 causaban este subtipo de AF (FA-Q). Análisis bioquímicos y funcionales demostraron que las mutaciones en ERCC4 que causan AF- alteraban la función de XPF en la reparación de los ICL sin comprometer la NER. Nuestros datos demuestran que, dependiendo de las mutaciones en ERCC4 y el resultante equilibrio entre ambas actividades de reparación del ADN, los individuos pueden presentar tres trastornos distintos, Nuestros estudios destacan la naturaleza multifuncional de la endonucleasa XPF en la estabilidad del genoma y las enfermedades humanas. Para investigar el papel de ERCC4 en la susceptibilidad al cáncer de pecho y ovario, como ocurre con otros genes AF, examinamos los 11 exones y las regiones intrónicas proximales de ERCC4 in1573 casos de cáncer familiar de mama y ovario, que habían dado negativo para mutaciones en BRCA1 y BRCA2 y 854 controles. La prevalencia de los portadores de mutaciones en ERCC4 no difiere entre los casos y los controles, sugiriendo que ERCC4 no es un gen de susceptibilidad al cáncer de mama y ovario. Curiosamente, la prevalencia de portadores de mutaciones en ERCC4 (1/288 individuos) es similar a la reportada para FANCA, mientras que hay 100 veces más pacientes FA-A que FA-Q. Esto indica que la mayoría de las combinaciones de mutaciones bialélicas en ERCC4 son letales a nivel embrionario. Por último, se identificaron mutaciones adicionales en ERCC4 capaces de interrumpir específicamente la reparación de los ICLs.