[en] Colorectal cancer (CRC) has become the third most common cancer worldwide, presenting a relapse rate of approximately 30-40% after surgery. The study of circulating tumor DNA (ctDNA) in liquid biopsies has emerged as a crucial tool in cancer research, both for characterizing intratumoral heterogeneity (ITH) and studying minimal residual disease (MRD). Post-surgery ctDNA assessment in stage II-III CRC is crucial for guiding adjuvant treatment (ACT) decisions, where a significant portion of patients fail to clear ctDNA post-ACT, leading to recurrence. However, while existing assays detect ctDNA and help identifying high-risk patients for recurrence, the very low tumor fraction of alterations in plasma limits their sensitivity, posing challenges in deciding on ACT. Particularly, in next generation sequencing (NGS) ctDNA analysis, the need for bioinformatics tools that ensure robust analysis of tumor samples from liquid biopsy is highlighted, ensuring high sensitivity and specificity. In this context, the general objective of this thesis is to enhance the characterization of CRC patients and the study of the molecular mechanisms involved in relapse using NGS in liquid biopsy samples through the implementation, optimization, and validation of bioinformatics pipelines. Firstly, a paired tumor-normal analysis strategy with a gene panel was proposed in a cohort of 148 localized CRC patients, resulting in the detection of at least one somatic mutation in 100% of the patients at diagnosis. This enabled all patients to be monitored in post-surgery plasma for MRD detection, which was shown to be independent of the monitoring of somatic or pathogenic mutations, exhibiting higher accuracy values when a greater number of mutations were followed. Plasma sequencing at diagnosis revealed mutations not detected in tissue, reflecting ITH. Subsequently, whole exome sequencing (WES) of ctDNA at different time points in relapsed CRC patients in two independent cohorts was performed to enhance the comprehension of tumor progression mechanisms. A plasma WES-based tumor-agnostic assay demonstrated higher sensitivity in MRD detection compared to current assays. Immune evasion appears to be the primary driver of progression in the localized CRC setting, indicating the potential efficacy of immunotherapy for microsatellite stability in CRC patients. Organoid modeling further supports the promising potential of targeted therapy in eradicating MRD, surpassing conventional treatments. The findings in this thesis, which arise from the development of bioinformatics pipelines for liquid biopsy analysis in CRC patients, reflect a more comprehensive study of the tumor molecular profile, overcoming the barrier of ITH posed by the study of tumor tissue biopsies, the plasma capability of detecting MRD with high sensitivity and specificity, as well as the identification of tumor progression mechanisms and potentially actionable targets.

[es] El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más común a nivel mundial, con una tasa de recaída del 30-40% tras la cirugía. El estudio del ADN tumoral circulante (ctDNA) mediante biopsia líquida se ha convertido en una herramienta clave para caracterizar la heterogeneidad intratumoral (ITH) y estudiar la enfermedad residual mínima (MRD). Evaluar el ctDNA tras la cirugía en pacientes con CCR en estadio II-III es esencial para guiar decisiones sobre el tratamiento adyuvante (ACT), ya que muchos pacientes no eliminan el ctDNA tras el ACT, lo que conduce a recaídas. La baja fracción tumoral en el plasma limita la sensibilidad de los ensayos actuales en la detección de ctDNA, dificultando la toma de decisiones sobre el ACT. Por ello, en el análisis de ctDNA mediante secuenciación masiva (NGS), es necesario el uso de herramientas bioinformáticas que garanticen un análisis robusto del tumor, asegurando alta sensibilidad y especificidad. En este contexto, el objetivo de esta tesis es mejorar la caracterización de pacientes con CCR y estudiar los mecanismos moleculares implicados en la recaída mediante NGS en biopsia líquida, mediante la validación e implementación de pipelines bioinformáticos. Inicialmente, se propuso una estrategia de análisis pareado tumor-normal con un panel de genes en una cohorte de 148 pacientes con CCR localizado, detectándose al menos una mutación somática en el 100% de los pacientes al diagnóstico. Esto permitió monitorizar a los pacientes en el plasma postoperatorio para la detección de MRD, lo cual se mostró independiente de la selección de mutaciones somáticas o patogénicas, con mayor precisión cuando se seguía un mayor número de alteraciones. La secuenciación de plasma en el diagnóstico reveló mutaciones no detectadas en el tejido, reflejando la ITH. Posteriormente, se realizó la secuenciación del exoma completo (WES) del ctDNA en distintos momentos en pacientes con CCR recaído en dos cohortes independientes, para mejorar la comprensión de los mecanismos de progresión tumoral. Un ensayo basado en WES de plasma, agnóstico al tumor, demostró una mayor sensibilidad en la detección de MRD en comparación con los ensayos actuales. La evasión inmune se identificó como uno de los principales impulsores de la progresión en CCR localizado, lo que sugiere la potencial eficacia de la inmunoterapia en pacientes con estabilidad de microsatélites. Además, el uso de un modelo de organoides respaldó el potencial de la terapia dirigida para erradicar MRD. Los hallazgos de esta tesis, que surgen del desarrollo de pipelines bioinformáticos para el análisis de biopsias líquidas en pacientes con CCR, reflejan un estudio más completo del perfil molecular tumoral, superando las limitaciones de la ITH asociadas a biopsias de tejido. También resaltan la capacidad del plasma para detectar MRD con alta sensibilidad y especificidad, e identificar mecanismos de progresión tumoral y potenciales dianas terapéuticas.