[en] Bacterial infections are pathologies of common occurrence, in most cases treated using antibiotics. However, even though treatments are available, they still account for the top five global mortality cases. The reason for that is the misuse and overuse of antibiotics, resulting in a number of antibiotic resistant bacterial strains able to overcome conventional treatments. Various methods can be employed to prevent bacterial resistance, with a new generation of fast antibiotic susceptibility testing (AST) being one of them. However, nearly all methods require sample extraction and enrichment, resulting in long incubation times (2-7 days form test to result) that severally limit the decision-making process, i.e. definition of the treatment. Therefore, there is a need for tests able to generate resistance profiles within 2-4 hours. This thesis tackles this issue by the development of a new rapid diagnostic tool, built around a novel bioassay and integrating advanced microfluidic and optical elements. After the evaluation of four different strategies based on the use of iron-based metabolic indicators, the final bioassay was based on a newly developed cyanotype-based reaction. The reaction mechanism combines the traditional cyanotype reaction, where iron citrate complex is photo-dissociated to produce free iron (II) (resulting from iron (III) reduction) and CO2 from the photo-oxidation of citrate. In the new version of the reaction, UV light traditionally used to photo-activate iron citrate is substituted by less energetic visible light, which cannot directly reduce iron ions, but requires metabolic activation by living bacteria. In presence of living bacteria and visible light, a photo-catalytic reaction is started, which produced Prussian blue molecules, observable with the bare eye. The best results, after optimization of the reaction conditions, allowed the detection of 1 CFU/mL within 4 hours of incubation. The assay was further demonstrated as proof of concept as direct viability test in serum and blood. Regarding to the optical components, four light routing strategies were developed and tested aiming to minimize the number of light sources and detectors necessary for multiple optical channels detection: (i) a microfluidically-controlled optical router, requiring external pumps to redirect the light into the optical detection channels; (ii) electrodepositable alginate hydrogels, acting as waveguides, to guide the light to the detection area; (iii) electrically controlled optical shutters, based on the use of nickel oxide that change from transparent to deep black to allow/avoid the light to cross; and (iv) frequency-modulation system, where each monochromatic light source is pulsed at a specific frequency and can be identified subsequently even when using a single photo-detector. Although all of them presented advantages and disadvantages, the frequency-modulation system was selected as the best option for being simple, cheap and fast, and no requiring external instrumentation. Microfluidics were implemented in the system to manage the small sample and reagent volumes required. Custom-made geometric valves were produced by exploiting the logical AND-valve concept, where two separate liquids met at the valve and could only propagate past if both were present. By matching the breaching of the valve and controlling the pressures inside the system, a 1-1 dilution of both liquids would occur after the valve. Sequential valves provided a 2-fold dilution of one of the inlet solutions. Finally, the three components were integrated into a single prototype composed of two parts: a reusable and a disposable part. The device enables read-out of a single resistance profile within 4 hours, without any external equipment.

[es] Las infecciones bacterianas son patologías comunes que se tratan con antibióticos. No obstante, todavía representan una de las cinco causas más comunes de mortalidad mundial debido al uso excesivo e incorrecto de antibióticos, que ha derivado en un incremento en el número de cepas bacterianas resistentes a antibióticos. De entre las estrategias propuestas para paliar este problema, el desarrollo de métodos rápidos para la determinación de susceptibilidad a antibióticos es una de las más exploradas. Casi todos los métodos actuales requieren enriquecimiento bacteriano, lo que prolonga el ensayo entre 2 y 7 días, retrasando la selección del tratamiento. Por lo tanto, se requieren tests rápidos capaces de generar perfiles de resistencia entre 2-4 horas. Esta tesis aborda este problema desarrollando un nuevo test de diagnóstico rápido basado en un bioensayo innovador y nuevos elementos ópticos y fluídicos. Después de evaluar cuatro estrategias de detección basadas en indicadores metabólicos, se seleccionó un bioensayo derivado de la cianotipia. En la cianotipia, el citrato de hierro es fotodisociado en iones hierro (II) y CO2, producido por la fotooxidación del citrato, y el hierro (II) reacciona con el ferricianuro para producir Azul de Prusia. En la nueva versión, la luz UV se sustituye por luz visible, menos energética, que es incapaz de reducir el complejo de hierro directamente. La reducción solo se produce en presencia de bacterias y luz visible, lo que inicia una reacción fotocatalítica que acaba produciendo Azul de Prusia. Los mejores resultados, después de optimizar las condiciones de reacción, permitían la detección de 1 bacteria/mL en 4 horas de reacción. El bioensayo se demostró, como prueba de concepto, en la detección directa de bacterias en muestras de suero y sangre completa. Se desarrollaron y testaron cuatro estrategias de componentes ópticos para el direccionamiento de la luz con el objetivo de reducir el número de fuentes de luz y detectores necesarios para interrogar múltiples caminos ópticos: (i) un router óptico controlado microfluídicamente mediante bombas externas capaz de direccionar el haz de luz a cada canal ópticos de detección; (ii) routers basados en hidrogeles de alginato electrodepositables, en los cuales el gel actuaba como una guía de luz dirigiendo la luz selectivamente al canal de detección; (iii) obturadores ópticos controlados eléctricamente, con óxido de níquel, un material que cambia de transparente a negro permitiendo o evitando así el paso de luz; y (iv) moduladores de pulsos de frecuencia, en los que cada fuente luz monocromática se modula con un patrón de frecuencia que permite identificarla. Aunque cada una presentaba ventajas e inconvenientes, esta última se implementó en el dispositivo final por su simplicidad, bajo coste y rapidez, además de no requerir instrumentación externa. Los componentes microfluídicos permiten gestionar los pequeños volúmenes de muestra y reactivos empleados en el ensayo. Se desarrollaron válvulas geométricas diseñadas como válvulas lógicas, en las que el líquido solo podía fluir si los dos líquidos de entrada entraban en contacto. Controlando las presiones y la fuerza de ruptura de la válvula en el sistema fue posible obtener una dilución de la muestra de 1:1 en el flujo de salida. La incorporación de varias válvulas secuenciales permitía realizar una dilución 1:2 de la muestra inicialmente inoculada. Finalmente, los tres componentes se integraron en un único prototipo formado por una parte reutilizable y una de un solo uso. El dispositivo permitía la determinación de la susceptibilidad a antibióticos en fluidos biológicos en 4 horas, de forma autónoma y sin requerir ningún instrumento externo adicional.