[ca] La gran quantitat de beneficis que ofereix la crioconservació d'oòcits bovins ha incrementat dràsticament la demanda d'oòcits bovins. En aquest context, la crioconservació exitosa d'oòcits bovins madurats in vitro resulta de vital importància per garantir l'abastiment d'oòcits bovins. No obstant això, encara no s'ha aconseguit un protocol de vitrificació d'oòcits bovins eficient i eficaç. L'objectiu d'aquesta tesis és, per tant, investigar la utilització d'elevades concentracions de NaCl o sucrosa abans de la vitrificació i escalfament, l'enriquiment de l'oolema amb colesterol abans de la vitrificació i l'addició d'un biopolímer sintetitzat per un bacteri de l' Antàrctica durant la vitrificació i escalfament, com a estratègies per millorar els protocols de vitrificació d'oòcits. S'ha descrit que l'exposició dels oòcits a concentracions elevades de clorur sòdic, sucrosa i trehalosa abans de la manipulació millora la criotolerància a la vitrificació i la capacitat de desenvolupament en l'espècie porcina. En el capítol IV d'aquesta tesis vam observar que el tractament amb solucions de 375 mOsmol de NaCl o sucrosa durant una hora abans de la vitrificació, no tenia efectes perjudicials per l'estat del fus meiòtic dels oòcits bovins madurats in vitro. Concretament, el pretractament amb sucrosa abans de la vitrificació no va ser capaç de millorar el desenvolupament embrionari com s'havia observat en altres espècies. L'enriquiment de la membrana amb colesterol podria incrementar la fluïdesa i la permeabilitat de la membrana i augmentar la criotolerància dels oòcits a la crioconservació. En el capítol V d'aquesta tesis vam utilitzar bodipy-colesterol per visualitzar el transport del colesterol per microscòpia confocal en oòcits bovins madurats in vitro. Aquest mètode ens va permetre determinar el temps d'incubació necessari per una incorporació òptima del colesterol a la membrana i evitar la no desitjada penetració al citoplasma, utilitzant diferents concentracions de metil-β-cyclodextrines carregades amb colesterol. Tot i que no es va aconseguir millorar la criotolerància en termes de supervivència i capacitat de desenvolupament, l'addició de colesterol alterava l'expressió de gens relacionats amb el metabolisme lipídic, (CYP51), apoptosis (BAX) i metilació del DNA (DNMT3A) en mòrules bovines, sobretot quan els oòcits eren vitrificats a estadi de vesícula germinal. Pseudomonas sp. ID1, un bacteri aïllat del sediment marí de l'Antàrtica, produeix un polisacàrid com a mecanisme de tolerància al refredament (M1 EPS). Aquest exopolisacàrid també confereix crioprotecció per altres cèl·lules bacterianes, suggerint que pot ser utilitzat com a agent per la crioconservació cel·lular. En el capítol VI es va afegir M1 EPS a les solucions de vitrificació i escalfament com a agent bloquejant de la formació de gel, per limitar el dany dels oòcits bovins madurats in vitro i incrementar posteriorment la capacitat de desenvolupament. Es van analitzar els efectes de la suplementació amb diferents concentracions de M1 EPS en l'organització dels fusos meiòtics, la capacitat de desenvolupament en termes de percentatges de blastocists i l'expressió gènica en blastocists de dia 8. La suplementació amb M1 EPS durant la vitrificació i escalfament dels oòcits de vedella prepúber madurats in vitro protegia el fus meiòtic contra la descondensació de cromosomes i microtúbuls causada per la vitrificació. Tot i que després del suplement amb M1 EPS no es va observar millora en els percentatges de blastocists, es van registrar diferents canvis en l'expressió d'alguns gens relacionats amb epigenètica (DNMT3A i KAT2A) i qualitat embrionària (BAX, BCL2) entre blastocists obtinguts a partir d'oòcits vitrificats amb diferents concentracions de M1 EPS. En resum, basant-nos en els resultats d'aquesta tesis, podem concloure que la criotolerància dels oòcits bovins madurats in vitro no només depèn del dany que pateixin en l'organització del fus meiòtic. Sinó que també en els canvis en l'expressió gènica que condicionen el posterior desenvolupament embrionari.

[es] La gran cantidad de beneficios que ofrece la crioconservación de ovocitos bovinos ha incrementado drásticamente la demanda de ovocitos. En este contexto, la crioconservación exitosa de ovocitos madurados in vitro resulta de vital importancia para garantizar el abastecimiento de ovocitos bovinos. Sin embargo, aún no se ha logrado un protocolo de vitrificación de ovocitos bovinos eficiente y eficaz. El objetivo de esta tesis es, por tanto, investigar la utilización de elevadas concentraciones de NaCl o sacarosa antes de la vitrificación y calentamiento, el enriquecimiento del oolema con colesterol antes de la vitrificación y la adición de un biopolímero sintetizado por una bacteria de la Antárctica durante la vitrificación y el calentamiento, como estrategias para mejorar los protocolos de vitrificación de ovocitos. Se ha descrito que la exposición de los ovocitos a concentraciones elevadas de cloruro sódico, sacarosa y trehalosa antes de la manipulación mejora la criotolerància a la vitrificación y la capacidad de desarrollo en la especie porcina. En el capítulo IV de esta tesis observamos que el tratamiento con soluciones de 375 mOsmol de NaCl o sucrosa durante una hora antes de la vitrificación, no tenía efectos perjudiciales para el huso meiótico de los ovocitos bovinos madurados in vitro. Concretamente, el pretratamiento con sacarosa antes de la vitrificación no fue capaz de mejorar el desarrollo embrionario como se había observado en otras especies. El enriquecimiento de la membrana con colesterol podría incrementar la fluidez y la permeabilidad de la membrana y aumentar la criotolerància de los ovocitos a la crioconservación. En el capítulo V de esta tesis utilizamos bodipy-colesterol para visualizar el transporte del colesterol por microscopía confocal en ovocitos bovinos madurados in vitro. Este método nos permitió determinar el tiempo de incubación necesario para una incorporación óptima del colesterol en la membrana y evitar la no deseada penetración en el citoplasma, utilizando diferentes concentraciones de metil-β-cyclodextrinas cargadas con colesterol. Aunque no se mejoró la criotoleráncia en términos de supervivencia y capacidad de desarrollo, la addición de colesterol alterava la expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico, (CYP51), apoptosis (BAX) y metilación del DNA (DNMT3A) en mórula bovinas, sobre todo en ovocitos vitrificados en estadio de vesícula germinal. Pseudomonas sp. ID1, una bacteria aislada del sedimento marino de la Antártica, produce un polisacárido como mecanismo de tolerancia al enfriamiento (M1 EPS). Este exopolisacárido también confiere crioprotección a otras células bacterianas, sugiriendo que puede ser utilizado como agente para la crioconservación celular. En el capítulo VI de esta tesis, se añadió M1 EPS a las soluciones de vitrificación y calentamiento como agente bloqueante de la formación de hielo, para limitar el daño de los ovocitos bovinos madurados in vitro e incrementar posteriormente la capacidad de desarrollo. La suplementación con M1 EPS durante la vitrificación y el calentamiento de los ovocitos de ternera prepúber madurados in vitro protegía el huso meiótico contra la descondensación de cromosomas y microtúbulos causada por la vitrificación. Aunque después del suplemento con M1 EPS no se observó mejora en los porcentajes de blastocistos, se registraron diferentes cambios en la expresión de algunos genes relacionados con epigenética (DNMT3A y KAT2) y calidad embrionaria (BAX, Bcl2) entre blastocistos obtenidos a partir de ovocitos vitrificados con diferentes concentraciones de M1 EPS. En resumen, basándonos en los resultados de esta tesis, podemos concluir que la criotoleráncia los ovocitos bovinos madurados in vitro no sólo depende del daño que sufran en la organización del huso meiótico. Sino que también en los cambios en la expresión génica que condicionan el posterior desarrollo embrionario.