[en] The diversity of the T cell receptor repertoire is generated by random recombination of genomic segments and so some cells bear autoreactive receptors. The T cell repertoire tolerance against self-molecules is accomplished first by thymic selection. The promiscuous expression consists in the intrathymic expression of peripheric autoantigens that are characteristics of other tissues. Thymic medullar cells are the main cell type that can express these autoantigens. AIRE gene is a transcription factor that is expressed mainly in the medullar epithelial cells and that is the most important regulator of this promiscuous expression of the thymus. This gene codes for a zinc finger protein that exerts its function modulating the level of transcription of the promiscuously expressed genes, although the mechanism of action is not precisely described. Another level of gene expression regulation is the post-transcription level where the lability of the transcripts plays an important role in the control. The AU motifs are elements of transcript lability localised in the 3'UTR of the genes and they are sign of high turnover and short half live of the messenger RNA. Genes containing AREs are of potential biological and pharmacological interest, as they often code for inflammatory mediators, cytokines, proto-oncoproteins, and transcription factors. The objectives of the thesis are: The design of a method to identify genes with AU motifs in the thymus with differential expression in activation. To characterise a gene identified by the method described in the objective number 1, ZNF304, sequence and initial analysis in lymphocyte activation. To analyse the promiscuous expression of the insulin gene in the human thymus and the role of the VNTR polymorphisms of the promoter region as susceptibility locus established. To analyse the AIRE gene expression and to relate it to the insulin gene expression as an example of autoantigen that is modulated by AIRE and to investigate the influence of AIRE and the insulin polymorphism in the final amount of message. We designed a method that we called AU-DD useful to identify AU containing genes and to assay the differential expression of them under different stimulations. We cloned and sequenced the ZNF304 gene, a zinc finger containing gene and KRAB box. The KRAB box is involved in the repression of the transcription. The gene is expressed mainly in lymphoid tissues and the initial characterisation in the expression in peripheral blood mononuclear cells activation results in biphasic activation and a rapid response at 30 minutes post-induction and another peak at the 6 hours that was coincident with the peak of the cytokines studied. We detect insulin mRNA in all the thymic samples analysed. We typed the samples for the VNTR polymorphism that is in linkage desequilibrium with the PstI polymorphism that is easy to analyse by RFLP analysis of the 3' UTR of the insulin gene. Class III VNTR alleles that confer a dominant protection, produces more insulin that class I predisposing allele. Insulin levels in the thymus show interindividual variable expression that correlate with the level expression of AIRE gene in the samples analysed.

[es] Las especificidades del repertorio T se generan mediante la recombinación de segmentos génicos al azar por lo que un porcentaje de células son autoreactivas. La tolerancia del repertorio T hacia las moléculas propias se consigue en primera instancia mediante la selección tímica. El fenómeno de la expresión promiscua consiste en la expresión intratímica de autoantígenos periféricos propios de otros tejidos. Las células medulares tímicas, principalmente, serían las células encargadas de expresar estos autoantígenos. El gen AIRE es un factor de transcripción que se expresa principalmente en las celulas epiteliales medulares y que es responsable de regular la expresión promiscua en el timo. Este gen codifica para una proteina con dedos de zinc que ejerce su función regulando el nivel de transcripcion de los genes expresados promiscuamente, aunque todavía no está bien establecido el modelo de actuación. Otro nivel de regulación de la expresión génica se daría a nivel post-transcripcional donde la labilidad del tránscrito jugaría un papel importante de control. Los motivos AU son elementos de inestabilidad del tránscrito localizados en la zona 3' no traducida del gen y son signo de alto recambio y vida media corta del mensajero. Los genes que contienen motivos AU son de gran interés biológico ya que frecuentemente se encuentran en factores de transcripción, citocinas y oncogenes. Los objetivos de la tesis son: Diseñar un método para identificar genes con motivos AU en el timo con expresión diferencial en activación. Caracterizar un gen identificado mediante el objetivo anterior, ZNF304, a nivel de secuencia y análisis inicial en activación linfocitaria. Comprobar la expresión promiscua del gen de la insulina en el timo humano y el papel de los polimorfismos VNTR de su región promotora como locus de susceptibilidad establecido. Analizar la expresión del gen AIRE relacionándolo con la expresión del gen de la insulina como ejemplo de autoantígeno regulado por él y relacionar la influencia de AIRE y de los polimorfismos de insulina en la cantidad de mensajero final. Diseñamos un método llamado AU-DD válido para identificar genes con motivos AU y de ensayar la expresión diferencial de los mismos bajo diferentes estímulos. Secuenciamos el gen ZNF304, un gen con motivos dedos de zinc y caja KRAB. La caja KRAB está relacionada con represión transcripcional. El gen se expresaba principalmente en tejidos linfoides y la caracterización inicial a nivel de expresión en activación en mononucleares de sangre periférica daba como resultado una activación de modulación bifásica, con rápida respuesta a los 30 minutos de inducción y otro pico a las 6 horas que coincidía con el pico de activación de las citocinas. Detectamos mensajero de insulina en todas las muestras de timo total analizadas. Tipamos las muestras en función al polimorfismo VNTR que está en desequilibrio de unión con el polimorfismo PstI, fácilmente analizable mediante restricción de la zona no traducida del gen de la insulina. El alelo VNTR clase III, protector dominante de la diabetes tipo 1, producía mayor cantidad de insulina que el alelo que predispone, el de clase I. El nivel de insulina en el timo era variable de forma interindividual y ello correlacionaba con el nivel de expresión del gen AIRE dentro de la misma muestra analizada.