[en] By the end of the 20th century, but especially in the early 21st century, the improvement of biotechnology allowed to enlarge the therapeutic armamentarium of biologic medicines. Due to their biological and protein nature, they own innate physicochemical heterogeneity. Both the quality control and the comparability exercise of pre- and post-manufacturing versions of a given biological require analytical techniques that allow concluding reliably on their level of similarity. Omalizumab (Xolair®) is a monoclonal antibody developed as antiasthmatic. Its outstanding therapeutic performance has driven sales increase, but also the off-label uses in many indications. Development of techniques capable of comparing versions of omalizumab, both for biosimilar candidate development and for other purposes would be of substantial value. There are no biosimilars of Xolair® in the market yet, although some companies do have candidates in their development pipeline. Its undoubted therapeutic and commercial interest led us to propose the creation of a preliminary program that would allow us to anticipate the degree of similarity of a biosimilar candidate for omalizumab with the reference product. Moreover, a tool with those characteristics would cover other needs such as allowing for comparability of post-manufacturing versions or quality control. The following hypothesis was therefore proposed: "The creation of a battery of analytical ad hoc assays allow to accurately anticipate with high reliability the level of comparability among versions of omalizumab, and contribute to different objectives as the selection of biosimilar candidates". We set the objective of developing specific and sensitive analytical assays to compare critical molecular and functional attributes of omalizumab. To achieve such objective 3 sub-projects were proposed: - The best way to determine the performance of an analytical assay is by performing head-to-head analyses of highly similar molecules in order to establish its discriminating power. For that reason, in the first sub-project, we proposed to develop analogues of omalizumab with different levels of analogy. These test compounds were used to tune up key comparability techniques. Three critical physicochemical attributes were characterised: aminoacid sequence, glycosylation pattern and protein folding. - In the second sub-project, some methods were developed to functionally compare versions of omalizumab. A Surface Plasmon Resonance (SPR) technique was optimized and proved to be the most suitable for the determination and comparison of the binding capacity to IgE. Biological activity was studied in vitro and in vivo. - In order to demonstrate biosimilarity it is mandatory to use highly sensitive assays that reveal slight dissimilarities. In the third sub-project, we proposed to set up an alternative approach possibly capable of detecting functional differences that could have remained undetected by means of the above studies. With this purpose, the functional impact of the omalizumab's versions and variants was evaluated in a co-administration approach with another novel MC inhibitor (EP2 agonists). We have conceived a so-called Biosimilarity Predictive Program (PPB) for biosimilar candidates of Xolair®. The PPB includes the assessment of the primary structure, a stringent methodology to characterize the glycosylation pattern, and two functional assays (SPR and an in vitro assay using LAD2 cells). The PPB was designed to provide a preliminary diagnosis of the level of analytical equivalence between the biosimilar candidate and the reference product. The results allowed us to conclude that the set of assays may serve to anticipate the level of analytical similarity and therefore to anticipate a potential therapeutic equivalence between anti-IgE molecules. Such set of techniques may be applied, not only as a PPB, but also it could be even implemented for other applications: batches comparison and determination of the impact of manufacturing or composition changes, among others.

[es] El perfeccionamiento de las técnicas biotecnológicas permitió a finales del pasado siglo, pero sobre todo a principios del siglo XXI, ampliar notablemente el arsenal terapéutico de medicamentos biológicos. Una particularidad de los productos biológicos, en razón de su origen y de su naturaleza proteica, es su heterogeneidad fisicoquímica. El control de calidad lote a lote y la comparación de un determinado producto antes y después de cambios, requieren de técnicas analíticas que permitan concluir con fiabilidad sobre su grado de igualdad. Dichas técnicas son de particular utilidad en el desarrollo de biosimilares. Omalizumab (Xolair®) es un anticuerpo monoclonal desarrollado como antiasmático cuyo elevado rendimiento terapéutico y sus expectativas comerciales lo convierten en un producto interesante para la puesta a punto de técnicas para la comparación de versiones de Xolair®. En la actualidad aún no existen biosimilares de Xolair® comercializados. Su indudable interés terapéutico y comercial nos llevó a pensar en la conveniencia de crear un programa preliminar que permitiera anticipar el grado de semejanza de un candidato a biosimilar para omalizumab con el producto de referencia. Se estableció la hipótesis de que: "La creación de una batería de pruebas analíticas ad hoc permite anticipar con elevada fiabilidad la comparabilidad entre versiones de omalizumab, y contribuir a objetivos tales como seleccionar candidatos a biosimilar". Con el propósito de verificar dicha hipótesis se planteó el objetivo de desarrollar pruebas analíticas específicas para omalizumab. Mediante las técnicas incluidas se comparan atributos críticos tanto fisicoquímicos como funcionales que se espera que, en gran medida, anticipen el grado de equivalencia terapéutica entre versiones. Para cumplir este objetivo se propusieron 3 sub-proyectos: - La mejor forma de evaluar una técnica analítica es analizar moléculas altamente similares y ver si esta es capaz de discernir entre ellas. Por este motivo, en el primer sub-proyecto se planteó obtener moléculas análogas a omalizumab. Se produjeron 2 moléculas análogas. Una vez disponibles, se usaron para poner a punto técnicas clave en comparabilidad para atributos fisicoquímicos: secuencia primaria, glicosilación y estructura tridimensional. - En el segundo sub-proyecto se desarrollaron métodos para comparar funcionalmente moléculas análogas de omalizumab. Se optimizó una técnica de Surface Plasmon Resonance (SPR) que demostró ser idónea en la determinación y comparación de la capacidad de unión a IgE. La actividad biológica se estudió in vitro e in vivo. - En un ejercicio de comparabilidad se requiere de técnicas altamente sensibles para desvelar divergencias estructuro-funcionales menores. En el tercer sub-proyecto se propuso crear un escenario alternativo en el que diferencias funcionales no reveladas previamente pudieran detectarse. Para ello se evaluó el impacto funcional de versiones/variantes de omalizumab en un marco de co-administración con otros inhibidores mastocitarios (agonistas EP2). La ejecución de los sub-proyectos ha permitido proponer un Programa Predictivo de Biosimilaridad (PPB) específico para candidatos a biosimilar de Xolair®. Este incluye la evaluación de la estructura primaria, una metodología exhaustiva de caracterización de la glicosilación, y dos técnicas para la evaluación de sus características de unión a IgE (SPR y un ensayo in vitro en células LAD2). El PPB está diseñado para ofrecer un diagnóstico preliminar del grado de equivalencia analítica entre el candidato a biosimilar y el producto de referencia. Los resultados obtenidos en esta tesis permiten concluir que la batería de pruebas desarrolladas anticipan el grado de igualdad entre moléculas con actividad anti-IgE y que, si bien pueden conformar un PPB para la selección de clones productores de candidatos a biosimilar, es implementable además en la comparación entre lotes de un mismo producto, la determinación del impacto de cambios en proceso y otras aplicaciones.