[ca] Comprendre el comportament complex de les nanopartícules (NPs) dins dels sistemes biològics és essencial per avançar en el camp de la nanomedicina. Tanmateix, la visualització de la dinàmica de les NPs continua sent un repte considerable a causa de les limitacions actuals en les tècniques d'imatge. Aquesta tesi aborda aquesta bretxa desenvolupant i perfeccionant mètodes avançats de microscòpia per obtenir una profunda comprensió del comportament de les NPs, ampliant així les fronteres de la investigació de nanoformulacions per a aplicacions biomèdiques. Per establir una base per a aquests estudis, ens vam centrar en la caracterització de les nostres nanopartícules de OM-pBAE (Oligo Modified poly(β-amino ester)), polímers biodegradables i biocompatibles. Mitjançant la modificació sistemàtica dels grups oligopeptídics terminals, vam investigar com aquestes alteracions impactaven les propietats fisicoquímiques i mecàniques, així com les seves interaccions dins dels entorns cel·lulars. Amb diverses tècniques de caracterització, vam avaluar els efectes de cada modificació en l'estabilitat de les NPs, la internal·lització cel·lular i l'eficiència de transfecció, identificant diferències substancials en el trànsit intracel·lular segons les diferents NPs utilitzades. Aquests estudis van posar de manifest una limitació important: les tècniques d'imatge convencionals eren insuficients per desxifrar completament les rutes intracel·lulars i el destí d'aquestes nanopartícules. Per superar aquest repte, metodologies innovadores han estat desenvolupades, com la Polyplex Expansion Microscopy (PExM) i Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM), que ofereixen una super -resolució per a poder estudiar el trànsit i la localització de les NPs. Aquests mètodes van revelar com variacions estructurals subtils entre les nanopartícules influeixen en les seves rutes intracel·lulars, destacant especialment el paper de la histidina en la facilitació de l'alliberament endosomal. Aquest pas crític per a una distribució eficient implica la desestabilització de les membranes endosomals induïda per la histidina, permetent que les NPs arribin a alliberar el seu principi actiu dins de les cèl·lules. A partir d'aquests resultats, vam investigar el comportament de les NPs de OM-pßAE en models cel·lulars 3D, avançant més enllà dels cultius tradicionals en 2D per simular millor les condicions in vivo. Utilitzant la Multiphoton Microscopy (MPM), vam visualitzar la penetració i distribució de les NPs de OM-pBAE en esferoides, obtenint informació valuosa sobre com aquestes NPs naveguen per estructures biològiques complexes. Els resultats van demostrar que les NPs que contenien histidina presentaven una major penetració i distribució intracel·lular, en línia amb els resultats obtinguts en estudis amb cultius cel·lulars en 2D. Col·lectivament, aquesta tesi no només subratlla la necessitat de comprendre en profunditat el comportament dels nanosistemes en entorns específics per millorar l'eficàcia clínica, sinó que també contribueix amb eines noves i potents per a la comunitat de recerca en nanomedicina. Aquests avenços permeten estudis més precisos dels sistemes de distribució de fàrmacs (DDS) i obren el camí per al disseny i aplicació optimitzats de teràpies basades en nanopartícules.

[en] Understanding the intricate inner structure of nanoparticles (NPs) as well as their interaction within biological systems is essential for advancing drug delivery technologies. However, visualizing NP dynamics remains a formidable challenge due to current limitations in imaging techniques. This thesis addresses this gap by developing and refining advanced microscopy methods to gain unprecedented insights into NP behaviour, thereby expanding the frontiers of NP research for therapeutic applications. To establish a basis for these studies, we focused on characterizing our biodegradable and biocompatible Oligo Modified poly(β-amino ester) (OM-pBAE NPs. By systematically modifying the terminal oligopeptide groups, we investigated how these alterations impacted their physicochemical and mechanical properties, as well as their interactions within cellular environments. Using diverse characterization techniques, we assessed the effects of each modification on NP stability, cellular uptake, and transfection efficiency, identifying substantial differences in intracellular trafficking among OM-pßAE NPs. These initial analyses underscored a significant limitation: conventional imaging techniques were insufficient to fully decipher the intracellular pathways and ultimate fate of these NPs. To overcome this, we developed novel methodologies, including Polyplex Expansion Microscopy (PExM) and Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM), which offered high and super-resolution insights into NP trafficking and localization. These tools revealed how subtle structural variations among the NPs influence their intracellular pathways, particularly highlighting the role of histidine in facilitating endosomal escape. This critical step for efficient delivery involves histidine-induced destabilization of endosomal membranes, enabling NPs to reach their targets within cells. Building on these findings, we investigated OM-pßAE NP behaviour within 3D cellular models, moving beyond traditional 2D cultures to better simulate in vivo conditions. Using multiphoton microscopy, we visualized OM-pBAE NP penetration and distribution in spheroids, gaining valuable insights into how these carriers navigate complex biological structures. The results demonstrated that histidine-containing NPs showed enhanced penetration and intracellular delivery aligning with the results obtained with 2D cell cultures studies. Collectively, this thesis not only underscores the need for an in-depth understanding of nanosystems behaviour in specific systems to improve clinical efficacy but also contributes powerful new tools for the nanomedicine research community. These advancements enable more accurate studies of drug delivery systems (DDS) and pave the way for optimized design and application of nanoparticle-based therapies.