[en] Nowadays there are evidences of the potentials health benefits that human milk oligosaccharides (HMOs) confer to the babies at local and systemic levels. Human milk is considered as a gold standard for the infant nutrition due to the concentration, quality, and complexity of their HMOs. Are known that these compounds play essential biological functions acting as a prebiotics, inmuno-modulators, pathogens inhibitors, such others. To date, more than 200 HMOs structures have been identified, being their obtention from natural resources impossible. Due to their structural complexity, the large-scale chemical synthesis of these carbohydrates remains a challenge. For this reason, formula milks only contain HMOs with simple structures such as 2'FL, DFL y 3'/6'-SL. Enzymatic synthesis is an alternative synthetic tool to synthetize HMOs, due to the stere- and regioselectivity action of enzymes. Lacto-N-tetraose (LNT) and their sialylated and fucosylated derivatives are the most abundant HMOs in human milk. Lacto-N-biosidase from B.bifidum is responsible for the hydrolysis of this compound in the metabolism of breast fed-babies. With the aim to synthesize LNT, in this thesis the enzyme lacto-N-biosidase from B.bifidum (LnbB) has been redesigned in order to generate an efficient biocatalyst able to synthetize the desired tetrasaccharide. For this, different strategies have been applied: i) rational redesign based on structural studies of the negative subsites of LnbB, ii) redesign of the positive subsites of LnbB using computational tools and iii) sequential synthesis of LNT. LnbB belongs to GH20 family and catalyses the hydrolysis of LNT compound giving the disaccharides lactose and lacto-N-biose. In this thesis the subsites of LnbB have been redesign using protein engineering methods, to test its synthesis by kinetically controlled transglycosylation using activated glycosyl donors. For the rational redesign of the negative subsites of LnbB, conservation and structural studies have been carried out, selecting and modifying the residues involved in the binding and stabilization of the donor molecule. By contrast, the redesign of the positive subsites of the enzyme has been done using the software BINDSCAND developed in the IQS Biochemistry Laboratory since LnbB doesn't present defined acceptor binding subsites, Also, in this thesis the sequential synthesis of LNT molecule has also been explored based on the glycosynthase strategy, combining the β-galactosidasa from Bacillus circullas (Bgac) E233G and LnbB (D320E_W394F) enzymes.

[es] Actualmente se tienen evidencias de los numerosos beneficios que los oligosacáridos de la leche materna (human milk oligosaccarides, HMOs) confieren a los recién nacidos, ya sea a nivel local o sistémico. La leche humana se considera única debido a la concentración, calidad y complejidad de sus HMOs. Es conocido que estas moléculas ejercen diversas funciones biológicas actuando como prebióticos, inmuno- moduladores, inhibidores de patógenos, entre otras. Hasta la fecha se han identificado más de 200 estructuras de HMOs diferentes, siendo imposible su obtención a partir de fuentes naturales. Debido a su elevada complejidad estructural la síntesis química a gran escala de estos carbohidratos sigue siendo un reto, requiriendo de numerosas etapas sintéticas. Por esto motivo, las leches de formula contienen principalmente HMOs de estructuras simples como 2'FL, DFL y 3'/6'-SL. La síntesis enzimática es una interesante alternativa sintética para la producción de estas moléculas, ya que, gracias a las enzimas, permite controlar la estero- y regioselectividad del oligosacárido formado. La leche humana presenta como HMO mayoritario el tetrasacárido lacto-N-tetraosa (LNT) y sus derivados fucosilados y/o sialilados. La enzima lacto-N-biosidasa de B.bifidum es la responsable de hidrolizar el tetrasacárido LNT en el metabolismo del recién nacido alimentado con leche materna. Con el objetivo de producir el compuesto LNT, en esta tesis se ha llevado a cabo el rediseño de la enzima lacto-N-biosidasa de B.bifidum (LnbB) con el fin de obtener un biocatalizador eficiente para la producción de este tetrasacárido. Para ello, se han aplicado diferentes estrategias: i) rediseño racional basado en el estudio estructural de los subsitios negativos de la enzima LnbB, ii) rediseño de los subsitios positivos de LnbB a partir de herramientas computacionales y iii) síntesis secuencial del compuesto LNT. La enzima LnbB pertenece a la familia GH20 y cataliza la hidrólisis de la molécula de LNT, dando lugar a los disacáridos lactosa y lacto-N-biosa. En esta tesis se han rediseñado los subsitios de la enzima LnbB empleando métodos de ingeniería de proteínas, para testar así su síntesis mediante la estrategia de transglicosidación por control cinético empleando dadores de glicosilo activados. Concretamente para el rediseño racional de los subsitios negativos de la enzima se han realizado estudios de conservación y estructurales, seleccionando y modificando aquellos aminoácidos involucrados en la unión y estabilización de la molécula dadora. Por otro lado, dado que la enzima no presenta subsitios definidos de unión al aceptor, para el rediseño de los subsitios positivos se ha empleado el software BINDSCAN desarrollado en el Laboratorio de Bioquímica de IQS. En esta tesis también se ha explorado la síntesis secuencial del compuesto LNT empleando la estrategia glicosintasa, combinando las enzimas β-galactosidasa Bacillus circullas (Bgac) E233G y LnbB (D320E_W394F).