[en] SUMMARY Tuberculosis disease (TB) caused 10.6 million new cases and 1.6 million deaths in 2021 according to the data from the World Health Organization (WHO). Its main causative agent is a single infectious microorganism called Mycobacterium tuberculosis. Although there is a preventive vaccine, BCG, and there are antibiotics available for the treatment of TB, the variable protection conferred by BCG against pulmonary TB and the emergence and spread of drug-resistant M. tuberculosis strains all around the world make TB nowadays the first cause of death due to bacterial infection. Antimicrobial resistance is one of the top 10 global public health threats declared by the WHO, and it especially worries in the case of TB. The inappropriate use of antibiotics available for decades has led to the rise of multi-drug resistant and extensively drug resistant strains of M. tuberculosis, in which the therapeutic options are dramatically reduced. To overcome TB problematic there are different strategies being developed globally: improve prevention of the disease with new vaccine candidates with better protective efficacies than BCG, and development of new drugs to treat TB infected patients. The discovery of new antibiotics active against sensitive and resistant forms of TB in the last decade has increased the clinical pipeline, and 17 new chemical classes of antibiotics are currently in Phase I and II clinical trials. However, there is still an urgent need of developing new antibiotics, but also new innovative strategies to fight TB, like host directed, phage or antivirulence based therapies. In this thesis we have developed a platform for screening and characterization of new drugs with inhibitory activity against the PhoPR system of M. tuberculosis. The PhoPR system is a two component system which regulates a variety of virulence phenotypes of M. tuberculosis, and consequently, inhibitors of this system could be a potential antivirulence strategy against TB. The screening platform has been established constructing a panel of different PhoPR M. tuberculosis reporter strains. PhoPR reporter strains contain an integrative plasmid in which the green fluorescent protein is under control of a well characterized promoter regulated by the PhoPR system. In order to have a wider view of PhoPR inhibition, we constructed a panel of PhoPR reporter strains using different PhoPR regulated promoters (mcr7 and pks2) that were introduced into different strains comprising the most widespread lineages of M. tuberculosis (L2 and L4). The secondary assays developed to characterize potential PhoPR inhibitors consist of a transcriptomic evaluation of the PhoPR regulon (mcr7, pks2, pks3, espA, espC and espD genes), and a proteomic evaluation of the secretion of different virulence effectors (ESAT-6, CFP-10, EspA and EspC). The reporter strains and the secondary assays have been validated using isogenic ¿phoPR mutants and a PhoPR inhibitory molecule already described in the literature, named ethoxzolamide (ETZ). We have also explored the possibility of using a non-pathogenic mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, as M. tuberculosis surrogate for the discovery of PhoPR inhibitors. To do so, we have engineered a M. smegmatis strain to replace its endogenous PhoPR system by the heterologous system from M. tuberculosis. We have also constructed a ¿phoPR mutant as control of inactive PhoPR system in M. smegmatis. Reporter strains constructed in the different M. smegmatis strains have demonstrated preliminary but promising results of the reporter plasmids in M. smegmatis strains carrying the PhoPR system from M. tuberculosis. Aside from M. tuberculosis, there are other non-tuberculous mycobacteria (NTM) in which antimicrobial resistance is worrying. Among them, Mycobacterium abscessus stands out because of its natural and easy development of acquired drug resistance. The growing use of Whole Genome Sequencing in the last years has allowed the identification of multiple potential single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring drug resistance phenotypes which need to be experimentally confirmed. In this Thesis we have also developed a targeted chromosomal barcoding strategy to establish direct genotype-phenotype associations between SNPs and antibiotic resistance phenotypes in M. abscessus. To do so, we have used the recombineering technology to confirm the genotype-phenotype relationship of an atpE D29A mutation and bedaquiline resistance. The recombineering technology allowed us to introduce the atpE D29A mutation into its specific loci in the M. abscessus chromosome with the use of a single strand allelic exchange substrate (ssAES) and to subsequently recover bedaquiline resistant clones. The use of ssAES with additional silent barcode mutations surrounding the atpE D29A mutation allowed to easily confirm the specific integration of the mutation of interest into the M. abscessus chromosome using PCR based techniques. This barcoding strategy has been successfully used in two different M. abscessus genetic backgrounds, the clinical isolate M. abscessus SL541 and the laboratory reference strain ATCC19977. Additionally, we have used the barcoding strategy to confirm the association of a second bedaquiline resistance mutation, the atpE A64P, demonstrating the broad applicability of this methodology.

[es] ¿ RESUMEN La tuberculosis (TB) causó 10,6 millones de nuevos casos y 1,6 millones de muertes en 2021 según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Su principal agente causal es un único microorganismo infeccioso denominado Mycobacterium tuberculosis. Si bien existe una vacuna preventiva, la BCG, y hay antibióticos disponibles para el tratamiento de la TB, la protección variable que confiere la BCG contra la TB pulmonar y la aparición y propagación de cepas resistentes a antibióticos de M. tuberculosis en todo el mundo hacen que la TB sea hoy en día la primera causa de muerte por una infección bacteriana. La resistencia a los antimicrobianos es una de las 10 principales amenazas mundiales para la salud pública declaradas por la OMS, y preocupa especialmente en el caso de la TB. El uso inapropiado de los antibióticos disponibles durante décadas ha llevado al surgimiento de cepas de M. tuberculosis multirresistentes (MDR) y extremadamente resistentes a los medicamentos (XDR), en las que las opciones terapéuticas se reducen drásticamente. Para afrontar la problemática de la TB, se están desarrollando diferentes estrategias a nivel mundial: mejorar la prevención de la enfermedad con nuevas vacunas candidatas con mejores eficacias protectoras que la BCG y el desarrollo de nuevos medicamentos para tratar a los pacientes infectados con TB. El descubrimiento de nuevos antibióticos activos contra las formas sensibles y resistentes de la TB en la última década ha aumentado la cartera clínica, y 17 nuevas clases químicas de antibióticos se encuentran actualmente en ensayos clínicos de Fase I y II. Sin embargo, todavía existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos antibióticos, pero también nuevas estrategias innovadoras para luchar contra la TB, como terapias dirigidas al huésped, basadas en fagos o en terapias antivirulencia. En esta tesis hemos desarrollado una plataforma de cribado y caracterización para el descubrimiento de nuevos fármacos con actividad inhibitoria contra el sistema PhoPR de M. tuberculosis. El sistema PhoPR es un sistema de dos componentes que regula una gran variedad de fenotipos de virulencia de M. tuberculosis y, en consecuencia, los inhibidores de este sistema podrían ser una estrategia antivirulencia con potencial contra la TB. La plataforma de cribado se ha establecido construyendo un panel de diferentes cepas indicadoras (reporteras) del sistema PhoPR M. tuberculosis. Estas cepas reporteras contienen un plásmido integrado en el que la proteína fluorescente verde está bajo el control de un promotor bien caracterizado regulado por el sistema PhoPR. Para poder tener una visión más amplia de la inhibición del sistema PhoPR, hemos construido un panel de cepas reporteras del sistema PhoPR utilizando diferentes promotores regulados por el sistema PhoPR (mcr7 y pks2) y que han sido introducidos en diferentes cepas de los linajes más extendidos de M. tuberculosis. Los ensayos secundarios desarrollados para caracterizar los posibles inhibidores del sistema PhoPR consisten en una evaluación transcriptómica de diferentes genes del regulón PhoPR (los genes mcr7, pks2, pks3, espA, espC y espD), y una evaluación proteómica de la secreción de diferentes efectores de virulencia (ESAT-6, CFP-10, EspA y EspC). Las cepas indicadoras y los ensayos secundarios se han validado utilizando mutantes isogénicos ¿phoPR y una molécula inhibidora del sistema PhoPR ya descrita en la literatura, llamada etoxzolamida (ETZ). También hemos explorado la posibilidad de utilizar una micobacteria no patógena, Mycobacterium smegmatis, como sustituta de M. tuberculosis para el descubrimiento de inhibidores del sistema PhoPR. Para hacerlo, hemos diseñado una cepa de M. smegmatis con su sistema PhoPR endógeno reemplazado por sistema heterólogo de M. tuberculosis. También hemos construido un mutante ¿phoPR como control del sistema PhoPR inactivo en M. smegmatis. Las cepas reporteras de M. smegmatis portadoras del sistema PhoPR de M. tuberculosis han mostrado resultados preliminares pero prometedores. Aparte de M. tuberculosis, existen otras micobacterias no tuberculosas (NTM) en las que preocupa la problemática de la resistencia antimicrobiana. Entre ellos, Mycobacterium abscessus destaca por su natural y fácil desarrollo de resistencia adquirida a antibióticos. La mayor accesibilidad en los últimos años a la secuenciación de genomas completos permite actualmente la identificación de múltiples polimorfismos de nucleótido único (SNP) potenciales que confieran fenotipos de resistencia a fármacos que deben confirmarse. En esta tesis, también hemos desarrollado una estrategia de ¿código de barras cromosómico¿ específica para establecer asociaciones directas de genotipo-fenotipo entre los SNP y los fenotipos de resistencia a los antibióticos en M. abscessus. Para ello, hemos utilizado la tecnología de recombinación para confirmar la relación genotipo-fenotipo de la mutación atpE D29A y la resistencia a bedaquilina. La tecnología de recombinación nos ha permitido introducir la mutación atpE D29A en la región específica del cromosoma de M. abscessus con el uso de un sustrato de intercambio alélico monocatenario (ssAES) y posteriormente recuperar clones resistentes a la bedaquilina. El uso de ssAES con mutaciones silenciosas adicionales como código de barras que rodea la mutación atpE D29A ha permitido confirmar fácilmente la integración específica de la mutación de interés en el cromosoma de M. abscessus mediate técnicas basadas en PCR. Esta estrategia de ¿código de barras¿ ha sido utilizada con éxito en dos fondos genéticos diferentes de M. abscessus, el aislado clínico M. abscessus SL541 y la cepa referencia de laboratorio ATCC19977. Además, hemos utilizado la estrategia de ¿código de barras¿ para confirmar la asociación de una segunda mutación de resistencia a bedaquilina, la mutación atpE A64P, demostrando la amplia aplicabilidad de esta metodología.