[ca] Els vaccins són l'invent més rendible de la història de la humanitat quant a vides salvades i la seva rellevància en la societat s'ha fet evident durant la recent pandèmia de COVID-19. En aquest sentit, les Virus-Like Particles (VLPs) constitueixen una prometedora aproximació per al desenvolupament de nous candidats vacunals. Aquest treball es centra en la producció de VLPs mitjançant l'expressió recombinant de la poliproteïna Gag del VIH-1 i la seva modificació amb l'objectiu de presentar epítops de patògens d'interès. El treball es pot dividir en tres apartats principals. El primer, format pels capítols u i dos, estudia la funcionalització de les VLPs de Gag amb la proteïna Spike (S) del SARS-CoV-2. El segon, format pels capítols tres, quatre, cinc i sis, es focalitza en la generació, caracterització i millora de la producció de diferents línies cel·lulars d'expressió gènica estable (SGE) per a la producció de VLPs de Gag. El tercer, format pel capítol set, fusiona els coneixements adquirits en els apartats anteriors per produir VLPs funcionalitzades amb la proteïna S a escala de bioreactor. En el primer capítol, es presenta una metodologia que permet la generació de VLPs de Gag funcionalitzades amb la proteïna S (S-VLPs) mitjançant la co-expressió de les proteïnes S i Gag. S'assoleix la funcionalització de les VLPs, la seva producció és optimitzada mitjançant disseny d'experiments i es realitza un cultiu en bioreactor seguit d'un procés de purificació amb potencial per a ésser traslladat a escala industrial. Al capítol dos, es proposen diverses variants de S-VLPs que presenten diferents mutacions de proteïna S. La influència de les mutacions en l'expressió i la qualitat de les VLPs és estudiada. Posteriorment, es realitzen assajos per a avaluar el reconeixement de les VLPs per part de sèrum de persones recuperant-se de la COVID-19 per a seleccionar la millor variant en funció del seu potencial immunogènic. Al capítol tres, es genera una línia cel·lular estable per a la producció de VLPs de Gag, mitjançant integració aleatòria. La selecció del clon 10H9 és basada en els seus paràmetres de creixement, la producció de VLPs i l'estabilitat de l'expressió. Al capítol quatre, es genera una línia cel·lular estable que expressa VLPs de Gag de manera constitutiva, mitjançant la integració dirigida al genomic safe harbor AAVS1 mitjançant CRISPR/Cas9. El clon seleccionat, anomenat 13++, millora significativament els nivells de producció de la línia cel·lular 10H9. A més, l'èxit obtingut emprant aquesta tècnica, la postula com una metodologia interessant per a la producció de noves línies cel·lulars. Al capítol cinc, es genera mitjançant transducció lentiviral una línia cel·lular competent per intercanvi de cassets mediat per recombinasa (RMCE) que expressa de forma estable VLPs de Gag. Els clons s'examinen en termes de cinètica de creixement, producció de VLPs, estabilitat i capacitat de dur a terme intercanvi de cassets per RMCE. El clon seleccionat, anomenat SH5, pot ser emprat per a generar fàcilment línies cel·lulars estables d'alta producció per a l'expressió de pràcticament qualsevol gen d'interès. En el capítol sis, es comparen els nivells de producció i la qualitat de les VLPs de les línies cel·lulars 10H9, 13++ i SH5, tot comparant-les amb una producció per expressió gènica transitòria (TGE), mentre que s'estudien els medis de cultiu utilitzats i la durada del bioprocés. El cultiu de la línia cel·lular 13++ en medi HyCell durant 10 dies millora en 2,7 vegades els nivells de producció de VLPs de la TGE. Finalment, al capítol set, s'estudia la producció de S-VLPs mitjançant la transfecció transitòria de la línia cel·lular 13++ en bioreactor d'un litre. Els resultats s'avaluen i es discuteixen per definir els passos a seguir en futurs processos per a la generació de VLPs pseudotipades.

[en] Vaccines are the most cost-effective life-saving invention of the human history and their relevance in society had become evident during the recent COVID-19 pandemic. Virus-like particles (VLPs) are a promising approach for the development of new vaccine candidates. This work is focused on the production of VLPs by the recombinant expression of the HIV-1 Gag polyprotein, and their modification to present epitopes from pathogens of interest. The work can be divided in three main sections. The first one, comprising chapters one and two, studies the functionalization of Gag VLPs with the SARS-CoV-2 Spike (S) protein. The second one, comprising chapters three, four, five and six, focuses on the generation, characterization and production enhancement of different stable gene expression (SGE) cell lines for the production of Gag-VLPs. Finally, the third one, comprising chapter seven, merges the knowledge acquired in the previous sections to produce S-functionalized VLPs at bioreactor scale. In chapter one, the methodology for the generation of Gag-VLPs incorporating the S protein (S-VLPs) by the transient co-expression of S and Gag proteins is presented. The functionalization of the VLPs is achieved, their production is enhanced using design of experiments (DoE), and a bioprocess consisting of a bioreactor followed by a scalable downstream purification process is performed. In chapter two, several S-VLP variants harboring different S protein mutations are proposed. The influence of the mutations is studied in terms of VLP expression and quality. After that, COVID-19 convalescent human sera recognition assays are performed to select the best proposed variant based on its immunogenic potential. In chapter three, a stable cell line for the production of Gag-VLPs is generated by means of illegitimate random integration. The selection of the 10H9 clone is based on growth kinetics, VLP production and expression stability. In chapter four, a SGE cell line constitutively expressing Gag-VLPs is generated by locus-specific integration at the AAVS1 genomic safe harbor using CRISPR/Cas9. The selected clone, named 13++, greatly improves the production levels of the 10H9 cell line. Moreover the success of the used integration approach postulates it as an interesting methodology for the production of new cell lines. In chapter five, a Recombinase-Mediated Cassette Exchange (RMCE)-competent cell line stably expressing Gag-VLPs is generated by lentiviral transduction. The clones are screened in terms of growth kinetics, VLP production, stability, and ability to perform RMCE targeting. The selected clone, named SH5, can be used to easily generate high producer stable cell lines for the expression of virtually any gene of interest. In chapter six, the VLP production and quality of the 10H9, 13++ and SH5 cell lines are compared with transient gene expression (TGE), while the culture media used and the length of the bioprocess is studied. 13++ cell line cultured in HyCell media and harvested at day 10 improves by 2.7-fold the VLP production levels of TGE. Finally, in chapter seven, the production of S-VLPs by 13++ cell line transfection at 1 liter bioreactor is studied. The results are evaluated and discussed to define the steps to be followed in future processes for the generation of pseudotyped VLPs.