[ca] El MNGIE és una malaltia mitocondrial d'herència autosòmica recessiva causada per mutacions en el gen TYMP, que codifica l'enzim timidina fosforilasa (TP). La TP catalitza la degradació de timidina (dThd) i desoxiuridina (dUrd), i la seva absència en pacients causa l'acumulació sistèmica d'aquests metabòlits, tòxica per la funció mitocondrial. A dia d'avui les úniques teràpies efectives són el transplantament de cèl·lules mare hematopoètiques i el transplantament de fetge. No obstant, els transplantaments estan limitats per la necessitat d'un donant compatible i tenen una taxa de mortalitat i morbiditat associada especialment elevada en pacients de MNGIE. Per a superar aquests inconvenients, fa temps vam proposar la teràpia gènica mitjançant vectors adenoassociats (rAAV) dirigits al fetge com a alternativa terapèutica, i vam demostrar la seva viabilitat en el model animal de MNGIE, el ratolí doble knockout (dKO) Tymp-/-Upp1-/-. Però aquest model només presenta fenotip bioquímic, de manera que només vam poder demostrar la correcció d'aquest fenotip. Al 2014 es va descriure que augmentant el desequilibri metabòlic mitjançant l'administració oral de dThd i dUrd al model dKO durant tota la seva vida provocava l'aparició d'alguns trets que reproduïen la simptomatologia clínica dels pacients. En aquesta tesi hem estudiat l'ús de la teràpia gènica en aquest model millorat, mitjançant el tractament amb tres rAAVs que expressaven la seqüència codificant de TYMP sota el control de 3 promotors hepàtics a diferents dosis. El tractament amb rAAV va incrementar l'activitat TP en fetge i va disminuir la concentració sistèmica de nucleòsids dels ratolins dKO, que sense tractament eren 30 vegades superiors als valors normals. A nivell fenotípic, en la majoria dels ratolins, el tractament també va prevenir l'increment del volum dels ventricles cerebrals i el deteriorament motor observats en els ratolins no tractats. Quan vam comparar els tres vectors utilitzats, el rAAV amb el promotor de l'alfa-1-antitripsina (AAT) va ser el més eficaç. Aquests resultats confirmen que la teràpia gènica mediada per rAAV dirigida al fetge restaura l'homeòstasi bioquímica i demostren la prevenció de l'aparició del fenotip clínic del model animal millorat de MNGIE. Un altre aspecte important per a la translació de la teràpia a la pràctica clínica és optimitzar el vector per tal de reduir-ne la dosi efectiva. En aquest sentit, hem testat dues aproximacions: la modificació de la seqüència codificant (ADNc) del gen segons la freqüència d'ús de codó per a incrementar la seva expressió, i l'eliminació dels dinucleòtids CpG de l'ADNc del gen per a reduir la immunogenicitat del vector. Vam dissenyar quatre seqüències optimitzades de l'ADNc de TYMP amb 4 algoritmes diferents. Vam generar vectors lentivirals per transduir 4 línies cel·lulars humanes i determinar l'eficiència d'expressió de cada seqüència comparada amb la seqüència salvatge, tenint en compte el grau d'activitat TP, el número de còpies del vector i els nivells relatius d'ARNm. De tots els experiments, només una seqüència optimitzada va millorar el grau d'expressió de TYMP respecte el de la seqüència salvatge en la línia cel·lular hepàtica Huh7. Pel que fa a la reducció de la immunogenicitat del vector, vam eliminar els dinucleòtids CpG de les seqüències dissenyades i vam analitzar el grau d'expressió de TYMP. Només la seqüència salvatge sense dinucleòtids CpG es va acostar a l'expressió de la seqüència natural. Tot i que s'hi observa una reducció d'expressió aproximada del 20%, es compensa per l'avantatge que aporta en termes de reducció de la resposta immunològica de cara a l'ús clínic del vector. En conclusió recomanem aquesta versió sota la regulació del promotor AAT per a ús eventual en la pràctica clínica.

[en] MNGIE (Mitochondrial NeuroGastroIntestinal Encephalomyopathy) is an autosomal recessive disease caused by mutations in TYMP, which encodes for the enzyme thymidine phosphorylase (TP). TP catalyses the first step of the catabolism of the nucleosides thymidine (dThd) and deoxyuridine (dUrd). The lack of TP activity causes systemic nucleoside accumulation which is toxic for mitochondrial function. Nowadays, the only available therapies for MNGIE are allogeneic hematopoetic stem cell transplantation or liver transplantation. However, these treatments are limited by the need of a compatible donor and are associated to high mortality and morbidity rates in MNGIE patients. To overcome these limitations, our laboratory proposed adenoassociated virus (rAAV) mediated gene therapy targeted to the liver for MNGIE and demonstrated its feasibility in the Tymp-/- Upp1-/- (dKO) mouse model of the disease. However, dKO mice show biochemical phenotype only, therefore we could only demonstrate the efficacy of our approach at the biochemical level. In 2014 it was reported that increasing the biochemical imbalances of the dKO model by chronic oral administration of dThd and dUrd to dKO mice over their entire life induced some features that recapitulate part of the clinical manifestations observed in patients. In this thesis we have studied the effect of gene therapy in this enhanced model, by treating the animals with three rAAVs expressing the human TYMP coding sequence under the control of three different liver-specific promoters. rAAV treatment increased liver TP activity and limited the systemic nucleoside concentration present in the dKO enhanced model, which was 30-fold higher as compared with non-exposed wild-type mice. AAV-treatment also prevented, in most animals, the enlarged brain ventricles and the motor impairment observed in the exposed dKO mice. When we compared the three promoters tested, the rAAV containing the AAT promoter showed the best efficacy. These results confirm that AAV-mediated gene therapy restores the biochemical homeostasis and demonstrate that this treatment prevents the clinical phenotype developed by the enhanced murine model of MNGIE. Another key point for the clinical translation of gene therapy is the optimization of the therapeutic gene expression to reduce the vector dose. For this reason, we tested two approaches: modification of the coding sequence of TYMP based on the codon use frequency to increase the expression of the gene, and CpG dinucleotide removal from the coding sequence to reduce immunogenicity of the vector. We designed four different codon-optimized sequences of the TYMP coding sequence, using four different algorithms. We cloned each optimized sequence in a lentiviral vector and transduced 4 different human cell lines. We analysed the degree of expression achieved with each sequence, as compared with the non-optimized wild-type TYMP sequence through evaluation of TP activity, vector copy number, and mRNA levels in the cell lines. Among all the sequences studied, only one optimized sequence resulted in higher TP activity when expressed per vector copy number in the hepatic cell line Huh7. To reduce the immunogenicity of the vector we removed the CpG dinucleotides from the wild-type coding TYMP sequence and two codon-optimized TYMP sequences. The wild-type sequence without CpG was the only one showing expression levels similar to those of the wild-type sequence. Even though the CpG free sequence shows a reduced expression of about 20% of that observed in the wild-type sequence, it is compensated by the advantages associated to the absence of CpG sites in terms of reduction of the immunological response when considering the vector for clinical use. In conclusion, among the different options tested, we recommend the rAAV vector containing the wild-type coding TYMP CpG-free sequence under the control of the AAT promoter for its use in the clinical practice.