[en] Late-onset Pompe disease (LOPD) is a rare genetic disorder produced by mutations in the GAA gene and is characterized by progressive muscle weakness. LOPD muscle biopsies show a progressive accumulation of glycogen and autophagic vacuoles eventually leading to the atrophy of muscle fibers. This doctoral thesis focuses on two main investigations. A first set of experiments was performed with the aim to identify miRNAs in the serum of LOPD patients that could be biomarkers of the disease progression. A second group of experiments was performed to study the different pathophysiological mechanisms of the disease leading to muscle atrophy. In the first study, we identified 14 miRNAs that showed different expression levels in serum samples of LOPD patients compared to controls. We validated these results in a larger cohort of patients and we found increased levels of 3 miRNAs, the so-called dystromiRs: miR-1-3p, miR-133a-3p and miR-206. These miRNAs are involved in muscle regeneration and the expression was increased in muscle biopsies from patients. Significant correlations between miRNA levels and muscle function tests were found. In conclusion, serum expression levels of dystromiRs may represent potential biomarkers for the follow-up of LOPD patients. In the second study, the expression of molecules related to muscle fiber atrophy in muscle biopsies of LOPD patients was analyzed using immunostaining techniques and RT-PCR. BNIP3, a well-known atrogene, was identified as a potential mediator of muscle fiber atrophy in LOPD muscle biopsies. We observed that vacuolated fibers in LOPD patients' muscle biopsies were smaller than non-vacuolated fibers and expressed BNIP3. Our data suggested that BNIP3 expression is regulated by inhibition of the AKT-mTOR pathway, leading to phosphorylation of ULK1 at Ser317 by AMPK. We studied myoblasts and myotubes obtained from LOPD patients and controls to confirm these results using different molecular techniques. Myotubes derived from LOPD patients were likewise smaller and expressed BNIP3. Conclusively, transfection of BNIP3 into control myotubes leads to myotube atrophy. In conclusion, all these findings suggest a cascade which starts with the inhibition of the AKT-mTOR pathway and activation of BNIP3 expression leading to progressive muscle fiber atrophy. Our results open the door to potential new treatments targeting BNIP3 to reduce its deleterious effects on muscle fiber atrophy in Pompe disease.

[es] La enfermedad de Pompe de inicio tardío (EPIT) es un trastorno genético raro producido por mutaciones en el gen GAA y se caracteriza por una debilidad muscular progresiva. Las biopsias musculares de pacientes con EPIT muestran una acumulación de glucógeno que se asocia a la presencia de vacuolas autofágicas induciendo en fases avanzadas una atrofia de las fibras musculares. Esta tesis doctoral se centra en dos investigaciones principales. Por un lado, se realizó un estudio sobre los niveles de miRNAs en suero de pacientes con EPIT con el fin de encontrar posibles biomarcadores de la progresión de la enfermedad. Por otro lado, se estudiaron diferentes mecanismos fisiopatológicos en los pacientes con EPIT, centrándose en el proceso de atrofia muscular. En el primer estudio, identificamos 14 miRNAs que mostraron diferentes niveles de expresión en muestras de suero de pacientes con EPIT en comparación con los controles. Validamos estos resultados en una cohorte más grande de pacientes y encontramos niveles elevados de 3 miRNAs, los llamados dystromiRs: miR-1-3p, miR-133a-3p y miR-206. Estos miRNAs están involucrados en la regeneración muscular y la expresión de éstos se encontró incrementada en biopsias musculares de pacientes con EPIT. Se encontraron correlaciones significativas entre los niveles de miRNAs y la prueba de función muscular. En conclusión, los niveles de expresión sérica de dystromiRs pueden representar biomarcadores potenciales para el seguimiento de pacientes con EPIT. En el segundo estudio, se realizó el análisis de la expresión de moléculas relacionadas con la atrofia de fibras musculares en biopsias de pacientes con EPIT mediante técnicas de inmunotinción y RT-PCR. BNIP3, un atrogén bien conocido, se identificó como un mediador potencial de la atrofia en pacientes con EPIT. Observamos que las fibras vacuoladas en biopsias musculares de pacientes con EPIT eran más pequeñas que las fibras no vacuoladas y que, además, expresaban BNIP3. Nuestros datos sugieren que la expresión de BNIP3 está regulada por la inhibición de la vía AKT-mTOR, lo que lleva a la fosforilación de ULK1 en Ser317 por AMPK. Estudiamos mioblastos y miotubos obtenidos de pacientes con EPIT y controles para confirmar estos resultados utilizando diferentes técnicas moleculares. Los miotubos derivados de pacientes con EPIT también eran más pequeños y expresaban BNIP3. Adicionalmente, la transfección de BNIP3 en miotubos de control condujo a la atrofia de los miotubos. En conclusión, todos estos hallazgos sugieren una cascada que comienza con la inhibición de la vía AKT-mTOR y la activación de la expresión de BNIP3 que, a su vez, conduce a la atrofia de las fibras musculares. Nuestros resultados abren la puerta a nuevos tratamientos potenciales dirigidos a BNIP3 para reducir sus efectos nocivos sobre la atrofia de las fibras musculares en la enfermedad de Pompe.