[en] Tissue engineering is a multidisciplinary field which involves several areas such as cell biology, material science, engineering, or medicine. It appears as a necessity to solve the lack of organ donors or another efficient substitute for the tissue required. In the case of skin, tissue-engineered skin substitutes (TESSs) have been developed since more than forty years ago, however, due to the advances in technology, they have emerged as a promising therapeutic strategy in the last fifteen years. The main purpose in dermatology of these advanced therapies is to resemble as much as possible the native human skin and be an alternative to the gold standard treatment with autografts. In the last years, many different TESSs have been developed, based on different characteristics such as cellular composition or biomaterials used as scaffold. Among the first, keratinocytes and fibroblasts have been the main cell types used, allowing the manufacture of cultured epithelial or dermal substitutes (monolayer), respectively, and composite skin substitutes (bilayer) where epidermis and dermis are resembled. However, trying to develop more complex skin substitutes, in the last years, more cell types have been incorporated and studied, such as melanocytes, adipocytes or mesenchymal stem cells. This fact has allowed to produce trilayer substitutes that are under research trying to improve the clinical TESSs already used. Regarding the biomaterial composition, collagen, hyaluronic acid or human plasma/fibrin are the most studied, alone or combined with others, however, in some cases, no biomaterial-based TESSs have been also developed. These can be constituted of an acellular dermal matrix where fibroblasts and keratinocytes are cultured or, even, the cultured fibroblasts, under specific conditions, are able to produce and secrete their own extracellular matrix that serves as scaffold. In this context, the Unidad de Producción Celular e Ingeniería Tisular (UPCIT), the laboratory where this Doctoral Thesis has been developed, is able to produce a clinical human plasma-based skin substitute (HPSS) constituted of human plasma and agarose as secondary biomaterial and human primary keratinocytes and fibroblasts as cellular composition. However, agarose it is not naturally found in skin or human body and moreover, it is difficult to handle under Good Manufacturing Practices (GMP) conditions (all advanced therapy medicinal products must comply with this regulation to be used in patients). Moreover, the HPSS manufactured in the UPCIT it is a bilayer substitute constituted of keratinocytes and fibroblasts, however, the development of more complex or different HPSSs is an interesting approach for the treatment of different types of skin injuries or wounds. Therefore, the objectives of this Doctoral Thesis are, I) to evaluate the skin cell isolation protocol used for the extraction of the human primary keratinocytes and fibroblasts used during the UPCIT's manufacturing process, II) to analyze several biological properties and culture methodologies of different versions of the HPSS model manufactured at UPCIT, combining, individually, six secondary biomaterials (serine, fibronectin, collagen, laminin-1, laminin-2 and hyaluronic acid) with human plasma as scaffold (a seventh type without secondary biomaterial was also manufactured) and studying four cellular combinations [Trilayer (mesenchymal stem cells, fibroblasts and keratinocytes), Bilayer (fibroblasts and keratinocytes), Monolayer (keratinocytes) and Control (without cells) HPSSs], III) to determine the advantages and disadvantages of the HPSS model, by its comparison with another clinical TESS model where no biomaterials are used (self-assembled skin substitute – SASS) and IV) to determine the in vivo wound healing potential of a bilayer HPSS combined with hyaluronic acid as secondary biomaterial and compare the results with the gold standard treatment and secondary wound healing approaches. Firstly, to evaluate the skin cell isolation protocol, the UPCIT's protocol, which is based on a one-step digestion strategy where the dermis and epidermis are firstly mechanically separated and subsequently digested, was compared with the two-step digestion protocol developed at LOEX laboratory (Canada) for the manufacture of the SASS clinical model. In this protocol, the dermis and epidermis are enzymatically separated by the effect of the enzyme thermolysin at the dermalepidermal junction level and then, each tissue is individually digested. The results of this study revealed that the epithelial cell viability was higher using the LOEX-Protocol compared to the UPCITProtocol (93% vs. 85%) and the number of epithelial cells extracted per cm2 of skin was also 3.4 times higher. However, when the dermal cells were isolated, no significant differences were reported. Moreover, once the keratinocytes and fibroblasts were cultured for several passages, no differences in terms of population doubling time, time of culture or percentage of expression of an epithelial stem cell marker (Keratin 19), were observed. These results proved the effectiveness of the UPCIT's protocol for its application into a clinical environment. On the second study, several conditions of the HPSS model regarding the secondary biomaterial used, the skin cell tissue source or the cellular composition were evaluated by in vitro asssays such as cell viability, cell metabolic activity, protein secretion profile and histology. The results revealed that the in vitro properties of the HPSS model were dependent on the human plasma used more than the secondary biomaterial added and moreover, similar results were observed regardless of abdominal skin or foreskin cells were used. In addition, two culture methodologies were also compared, submerged (SUB) and air/liquid interface (ALI), demonstrating that better histological structure and higher secretion of useful wound healing proteins such as bFGF and, mainly, VEGF-A were reported when ALI was applied, although it was more time-consuming. Regarding cell composition, better results were reported when Trilayer and Bilayer HPSSs were developed, compared to Monolayer substitutes. Once the in vitro biological properties of the several variations of the HPSS model manufactured at UPCIT were determined, the purpose was to compare them and also its mechanical properties, with another clinical TESS model developed without the use of biomaterials (SASS). This is a bilayer model cultured under ALI methodology, and for this reason, bilayer HPSSs composed of human plasma and the most usually investigated secondary biomaterials (collagen and hyaluronic acid) were compared using the same skin cell populations for the manufacture of both models. A bilayer HPSS without secondary biomaterial was also included in this study. The results demonstrated that slight biological differences were observed between both models and between the HPSS subtypes, however, SASSs were more resistant to tensile forces (p-value<0.01), but HPSS manufacturing time was shorter (46- 55 days for SASSs and 32-39 days for HPSSs), something to consider when a faster treatment is required. Therefore, the previous studies demonstrated that the role of the secondary biomaterial used for the development of the HPSS model manufactured at UPCIT is not as important in vitro, however, their individual in vivo properties could determine better outcomes. To that purpose, a bilayer (because it is the type of cellular TESS most used in a clinical environment) HPSS constituted of hyaluronic acid as secondary biomaterial (for its in vivo properties, previously demonstrated in other studies) was manufactured and its wound healing potential was evaluated in a surgical excision skin wound model in mice for 8 weeks. The results reported by this HPSS were compared with the use of autografts, another bilayer HPSS constituted of agarose as secondary biomaterial (the oldest HPSS manufactured at UPCIT) and secondary, commercial or under research, wound healing approaches. Homeostasis analysis indicated similar values of transepidermal water loss and elasticity between the bilayer HPSS combined with hyaluronic acid (6.42±0.75 g/h/m2, 0.42±0.08 AU), autografts (6.91±1.28 g/h/m2, 0.40±0.08 AU) and healthy mouse skin (6.40±0.43 g/h/m2, 0.35±0.03 AU). Moreover, histological results showed that bilayer HPSSs and autografts presented better skin structuration and higher expression of keratins. On balance, the results of this Doctoral Thesis demonstrate that the design, development and manufacture of different subtypes of a HPSS model are a promising and useful strategy as advanced therapy. The possibility of using several secondary biomaterials and skin cell tissue sources without reporting significant differences in terms of their biological properties, the versatility of applying two culture methodologies depending on the needs (time vs. higher secretion of wound healing factors) and the ease of manufacturing different cellular compositions, together with the homogeneity of their in vitro results reported when compared with another clinical TESS model, determine that the HPSS model is robust and successful. This is particularly observed when hyaluronic acid was in vivo studied as secondary biomaterial, demonstrating a wound healing potential and a recovery of homeostasis parameters similar to those of autografts. Therefore, this research validates the translation of the HPSS model into a clinical environment and recommends its use as an alternative to autografts for the treatment of several skin injuries and wounds.

[es] La ingeniería de tejidos es un campo multidisciplinar que involucra diversas áreas como la biología celular, la ciencia de materiales, la ingeniería o la medicina. Surge como necesidad para resolver los problemas relacionados con la falta de donantes de órganos o de la existencia de alternativas eficientes para el remplazo del tejido de interés. En el caso de la piel, los sustitutos de piel creados por ingeniería de tejidos (TESSs por sus siglas en inglés) surgieron hacen más de cuarenta años, sin embargo, debido al avance de las tecnologías, ha sido en los últimos quince años cuando se han erigido como una estrategia terapéutica prometedora. El principal objetivo de estas terapias avanzadas es tratar de asemejarse lo máximo posible a la piel humana nativa y ser una alternativa al tratamiento de referencia con autoinjertos. En los últimos años, numerosos TESSs se han desarrollado, basados en distintos aspectos como la composición celular o los biomateriales utilizados como soporte. Entre los primeros, los queratinocitos y los fibroblastos han sido los principales tipos celulares utilizados, permitiendo la fabricación de sustitutos epiteliales o dérmicos (monocapa), respectivamente, y sustitutos bilaminares o bicapa, cuando se combinan ambos tipos celulares para imitar la epidermis y la dermis. Sin embargo, en los últimos años, en un intento por desarrollar sustitutos de piel más complejos, otros tipos celulares como melanocitos, adipocitos o células madre mesenquimales se han estudiado, dando lugar a sustitutos trilaminares con el objetivo de mejorar los modelos clínicos ya existentes. Atendiendo a los biomateriales, el colágeno, el ácido hialurónico o el plasma humano/fibrina son los más estudiados, tanto en solitario como en combinación con otros, sin embargo, en algunos casos se han desarrollado TESSs sin biomateriales donde una matriz dérmica acelular sirve como superficie de cultivo para fibroblastos y queratinocitos, o incluso, se ha promovido que los propios fibroblastos en cultivo sean capaces de producir y secretar, bajo condiciones específicas, su matriz extracelular que sirve como soporte. En este contexto, la Unidad de Producción Celular e Ingeniería Tisular (UPCIT), el laboratorio donde se ha desarrollado esta Tesis Doctoral, es capaz de producir un sustituto de piel clínico basado en el plasma humano (HPSS por sus siglas en inglés), combinado con agarosa como biomaterial secundario y constituido por queratinocitos y fibroblastos primarios humanos. Sin embargo, la agarosa no se encuentra de manera natural en la piel o el cuerpo humano y es difícil de manipular bajo condiciones de Good Manufacturing Practices (GMP), unas normas que todo medicamento de terapias avanzadas debe cumplir cuando el objetivo es el tratamiento de pacientes. Además, el modelo piel fabricado en la UPCIT es bilaminar (queratinocitos y fibroblastos), por lo que el desarrollo y estudio de HPSSs diferentes y más complejos sería de interés para el tratamiento de diferentes tipos de lesiones y heridas cutáneas. Por tanto, los objetivos de esta Tesis Doctoral son, I) evaluar el protocolo de aislamiento celular utilizado en la UPCIT para la obtención de queratinocitos y fibroblastos humanos primarios utilizados en el ámbito clínico, II) analizar varias propiedades biológicas y metodologías de cultivo de diferentes versiones del modelo de HPSS fabricado en la UPCIT, combinando el plasma humano con seis biomateriales secundarios (serina, fibronectina, colágeno, laminina-1, laminina-2 y ácido hialurónico) y sin combinar con ningún biomaterial secundario, y estudiando cuatro combinaciones celulares diferentes [HPSS Trilaminares (células madre mesenquimales, fibroblastos y queratinocitos), HPSS Bilaminares (fibroblastos y queratinocitos), HPSS Monocapa (queratinocitos) y Controles (sin células)], III) determinar las ventajas y los inconvenientes del modelo HPSS, mediante su comparación con otro modelo clínico en el que no se utilizan biomateriales (SASS por sus siglas en inglés) y IV) determinar in vivo el potencial para curar heridas de un HPSS bilaminar combinado con ácido hialurónico como biomaterial secundario y comparar los resultados con el tratamiento estándar y estrategias secundarias de curación de heridas. En primer lugar, para evaluar el protocolo de aislamiento celular de la UPCIT, que se basa en una única digestión enzimática donde la dermis y la epidermis se separan mecánicamente para posteriormente ser digeridas, se comparó con el protocolo de aislamiento basado en dos digestiones que se aplica en el laboratorio LOEX (Canadá) durante el proceso de fabricación del modelo clínico SASS. En este, la dermis y la epidermis se separan por el efecto de la enzima termolisina que actúa a nivel de la unión dermoepidérmica y después cada tejido es digerido por separado. Los resultados de este estudio determinaron que la viabilidad de las células epiteliales aisladas fue mayor aplicando el protocolo LOEX que el de la UPCIT (93% vs. 85%), y además el número de células epiteliales extradías por superficie de piel fue también 3,4 veces mayor. Sin embargo, no se observaron diferencias en el aislamiento de las células dérmicas. Además, cuando los queratinocitos y los fibroblastos fueron cultivados durante varios pases, tampoco se observaron diferencias en aspectos como el tiempo de duplicación, el tiempo de cultivo o el porcentaje de expresión de marcadores de células madre epiteliales (Queratina 19). Estos resultados demostraron la eficacia del protocolo de aislamiento celular de la UPCIT para su aplicación en el ámbito clínico. En el segundo estudio, varias condiciones del modelo HPSS, atendiendo al biomaterial secundario utilizado, la región anatómica de donde las células de la piel fueron extraídas o la composición celular fueron evaluadas in vitro, a través de ensayos de viabilidad celular, actividad metabólica celular, secreción de proteínas e histología. Los resultados demostraron que las propiedades biológicas de los HPSSs dependen del plasma humano utilizado durante el proceso de fabricación más que del biomaterial secundario incorporado y, además, se obtuvieron resultados similares independientemente del origen celular utilizado (piel abdominal o de prepucio). Aparte, también se compararon dos metodologías de cultivo, sumergido (SUB) y en interfase air/líquido (ALI por sus siglas en inglés), demostrando que esta segunda técnica permitió la obtención de sustitutos de piel con mejor estructura y que secretaban una mayor cantidad de proteínas de interés para el proceso de curación de heridas, como bFGF y, principalmente, VEGF-A, sin embargo, requería mucho más tiempo de producción. En relación con la composición celular, en general se obtuvieron mejores resultados para los sustitutos Trilaminares y Bilaminares, en comparación con los Monocapa. Una vez que las propiedades biológicas de varios subtipos del modelo HPSS fabricado en la UPCIT fueron determinadas in vitro, el objetivo fue compararlos, así como sus propiedades mecánicas, con otro modelo clínico de sustituto de piel creado por ingeniería de tejidos en el cual no se utilizan biomateriales durante el proceso de fabricación (SASS). Este es un modelo bilaminar cultivado mediante la técnica ALI, y por esa razón, se comparó con varios HPSSs bilaminares constituidos por plasma humano y los biomateriales secundarios más investigados (colágeno y ácido hialurónico). Ambos modelos de piel fueron fabricados utilizando las mismas poblaciones celulares y, en el caso del modelo HPSS también se fabricaron sustitutos de piel sin incluir un biomaterial secundario. Los resultados demostraron que existían mínimas diferencias biológicas entre ambos modelos y entre los distintos subtipos de HPSS estudiados, sin embargo, los SASSs eran más resistentes a las fuerzas tensoras (p-valor<0,01), aunque el tiempo de producción fue menor en el caso del modelo HPSSs (32-39 días frente a los 46-55 días del modelo SASS), algo a tener en cuenta cuando se necesita un rápido tratamiento. Por tanto, los estudios previos demostraron que el rol del biomaterial secundario en el modelo HPSS producido en la UPCIT no es tan importante in vitro, sin embargo, sus propiedades individuales in vivo podrían ser determinantes a la hora de obtener mejores resultados. Por ello, un HPSS bilaminar (puesto que es el tipo de TESS celular más utilizados en clínica) combinado con ácido hialurónico como biomaterial secundario (por las propiedades previamente demostradas in vivo en otros estudios) fue fabricado y su potencial en la curación de heridas fue estudiado en un modelo de herida por escisión quirúrgica en ratones durante 8 semanas. Los resultados de este HPSS se compararon con los del uso de autoinjertos, los de otro HPSS bilaminar fabricado con agarosa como biomaterial secundario (el HPSS más antiguo fabricado en la UPCIT) y estrategias secundarias de curación de heridas, comerciales o en investigación. El análisis de homeostasis determinó que los valores de pérdida transepidérmica de agua y elasticidad eran similares entre los HPSS bilaminares constituidosde ácido hialurónico (6,42±0,75 g/h/m2, 0,42±0,08 UA), los autoinjertos (6,91±1,28 g/h/m2, 0,40±0,08 UA) y la piel sana de los ratones (6,40±0,43 g/h/m2, 0,35±0,03 UA). Además, a nivel histológico los grupos tratados con los HPSSs bilaminares y los autoinjertos presentaron una mejor estructura y mayor expresión de queratinas. En definitiva, los resultados de esta Tesis Doctoral demuestran que el diseño, desarrollo y fabricación de diferentes subtipos de un modelo HPSS son una estrategia prometedora y útil como terapia avanzada. La posibilidad de usar varios biomateriales secundarios y células de diferentes tejidos de origen sin albergar diferencias significativas en sus propiedades biológicas, la versatilidad de usar dos metodologías de cultivo diferentes dependiendo de las necesidades (tiempo vs. mayor secreción de factores útiles para el proceso de curación de heridas) y la facilidad para fabricar diversas composiciones celulares, junto con la homogeneidad de los resultados obtenidos in vitro cuando se comparó con otro modelo clínico de sustituto de piel creado por ingeniería de tejidos, determinan que el modelo HPSS es robusto y exitoso. Esto se observa especialmente cuando el ácido hialurónico se utiliza como biomaterial secundario in vivo, demostrando un potencial de curación de heridas y una recuperación de los parámetros de homeostasis similar al uso de autoinjertos. Por tanto, esta investigación valida la traslación del modelo HPSS al ámbito clínico y sugiere que su uso puede ser una alternativa al tratamiento con autoinjertos para diferentes tipos de lesiones y heridas cutáneas.