[es] Los tumores neuroendocrinos (NETs) son un grupo heterogéneo de neoplasias poco comunes, caracterizadas por un lento crecimiento y que se originan a partir de las células enterocromafines. Su incidencia anual viene aumentando progresivamente, aunque se desconoce si éste incremento es real, el reflejo de mayor uso de (mejores) técnicas diagnósticas o una combinación de ambas. A pesar de que frecuentemente los NETs tienen metástasis al diagnóstico, la supervivencia en estos pacientes ha aumentado, lo cual puede relacionarse con mejoras en las opciones diagnósticas y terapéuticas disponibles. Los NETs requieren métodos diagnósticos estandarizados para asegurar un diagnóstico precoz, así como para monitorizar la progresión de la enfermedad y orientar un tratamiento óptimo. Adicionalmente, el número y la calidad de las opciones terapéuticas se ha incrementado en los últimos años. En este sentido, esta tesis evalúa algunas nuevas opciones diagnósticas y terapéuticas para pacientes con NETs. El capítulo 1 ofrece una visión general sobre los NETs, y se centra en la utilidad/ limitaciones de los biomarcadores actualmente disponibles, así como en la descripción de algunos nuevos (posibles) marcadores en NETs. Además, resume opciones terapéuticas para tumores neuroendocrinos funcionantes y no funcionantes, tanto aquellas nuevas como las actualmente disponibles. Este capítulo representa la introducción al contenido fundamental de esta tesis: nuevos marcadores diagnósticos y opciones terapéuticas en NETs. El capítulo 1 termina con una visión general de los objetivos generales de esta tesis. El capítulo 2 evalúa detalladamente la expresión de algunos componentes de los sistemas somatostatina/cortistatina y ghrelina en una seria amplia, bien caracterizada, de carcinoides pulmonares típicos y atípicos. Hasta donde sabemos, este estudio representa la primera caracterización sistemática de los componentes de estos sistemas reguladores en muestras de carcinoides pulmonares (LCs), tejido adyacente no tumoral y pulmón sano. En este estudio, la expresión de somatostatina, de algunos de sus receptores (SSTs) y del receptor de ghrelina se incrementó gradualmente en el tejido no tumoral adyacente y en el tejido tumoral en comparación a pulmón normal. Además, la presencia de isoformas truncadas SST5TMD4, In1-ghrelin y el receptor de ghrelina GHSR1b fue reportada por primera vez en LCs. Asimismo, una expresión aumentada de la enzima ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT) se observó en tumores con necrosis, los cuales (a su vez) fueron aquellos con mayor tamaño, mayor capacidad de invasión y de producir metástasis a distancia. Estos datos sugieren que una desregulación del sistema ghrelina puede estar involucrada en el desarrollo/progresión de estos tumores. El capítulo 3 discute específicamente la expresión de componentes de los sistemas somatostatina/ cortistatina en tumorres gastroenteropancreáticos (GEP-NETs). La sobre-expresión observada de SST5 en el tejido tumoral comparado con el tejido adyacente no tumoral y el control sano, así como su relación clínica con la invasión vascular y nerviosa del tumor, sugieren un probable rol de SST5 como diana terapéutica en GEP-NETs agresivos, además, enfatiza la importancia de evaluar el perfil de SSTs en GEP-NETs, el cual aportaría información adicional para la toma de decisiones terapéuticas, incluida la utilización de análogos de somatostatina (SSAs) de segunda generación. El hallazgo más novedoso y relevante del capítulo 4 es la marcada sobre-expresión de la enzima GOAT en muestras de GEP-NETs. Específicamente, cuando la expresión de esta enzima es prácticamente ausente en tejido normal, su expresión se observó en tejido adyacente no tumoral y se sobre-expresó en tejido tumoral, una sobre-expresión que fue confirmada utilizando inmunohistoquímica. Asimismo, esta enzima se asoció con tumores de mayor tamaño, especialmente en NETs gastrointestinales. Estos hallazgos, combinados con publicaciones previas, sugieren el posible papel de la enzima GOAT como un biomarcador en NETs. El capítulo 5 describe los efectos de ketoconazol en la proliferación, ciclo celular, apoptosis, secreción de adrenocorticotropina (ACTH) o serotonina y cromogranina en una línea celular de NET bronquial productora de ACTH y una línea celular de NET pancreático no productora de ACTH. Específicamente, ketoconazol mostró características predominantemente pro-apoptóticas o citotóxicas dependiendo de la línea celular; estos efectos se mantuvieron a pesar de la combinación con SSAs. Además, ketoconazol fue capaz de inducir cambios en el ciclo celular, específicamente el aumento de las fases G0/G1 en ambas líneas celulares y una disminución de las fases G2/M en la línea celular pancreática. Incluso se observó un efecto inhibitorio en la secreción de serotonina del análogo de somatostatina pasireotide en la línea celular pancreática, el cual no había sido previamente descrito y que probablemente se debe a la expresión de SST5 en esta línea celular. En el capítulo 6 se caracteriza de forma detallada un modelo de líneas celulares pancreáticas utilizando sistemas de cultivo en dos- (2D; monolayer) y tres- dimensiones (3D; esferoides) en diferentes condiciones de nutrientes. Al analizar los resultados, se observa que los cultivos en 3D con esferoides representan un método valioso para evaluar la secreción y proliferación celular en líneas celulares de NETs, incluso en condiciones con deprivación de suero. Se observó una expresión dinámica de los SSTs y receptor de dopamina (D2R) en los sistemas de cultivo en 2D y 3D, lo cual no se había descrito previamente. En este capítulo, los efectos del análogo de somatostatina octreotide y el agonista de dopamina cabergolina, así como de los nuevos fármacos quimera SSTs-D2R (BIM-065, BIM-23A760) se evaluaron en ambos modelos de cultivo. El tratamiento con cabergolina y ambas quimeras inhibió la secreción de cromogranina A y serotonina, pero no la proliferación celular. Esto sugiere que el efecto de las quimeras en la secreción parece estar mediado por el D2R, sugiriendo un posible papel de los agonistas de cabergolina para el tratamiento de NETs funcionantes, incluido el síndrome carcinoide siempre y cuando expresen D2R. El capítulo 7 muestra los efectos in vitro de telotristat etiprate, un nuevo inhibidor de la enzima hidroxilasa de triptófano en líneas celulares pancreáticas. Este fármaco mostró un potente efecto en la inhibición de la secreción de serotonina, el cual fue dependiente de dosis en un modelo de células pancreáticas de NETs. Su combinación con pasireotide, pero no con octreotide, tuvo un efecto aditivo en el control de la secreción de serotonina. En el modelo 3D de NET pancreático, la secreción de serotonina fue totalmente inhibida por telotristat, sin embargo, este bloqueo no produjo cambios en el crecimiento celular. Estos datos sugieren que la serotonina no ejerce un efecto autocrino/paracrino en la proliferación celular en este modelo 3D de NET pancreático. En el capítulo 8 se observó una expresión disminuida de SSTs en pacientes con diabetes tipo 2 y GEP-NETs comparado con pacientes con GEP-NETs pero sin diabetes. Esta expresión disminuida no se observó cuando los pacientes diabéticos fueron tratados con metformina. Los estudios in vitro demostraron el efecto anti-proliferativo de las biguanidas y estatinas en líneas celulares de NETs, con el consiguiebnte incremento de la apoptosis y disminución de la migración celular. Puesto que la metformina y las estatinas son fármacos comercialmente disponibles, económicos y con una amplia experiencia en su uso, nuestros resultados sugieren que estos fármacos podrían representar una opción terapéutica factible como terapia adyuvante en NETs. Finalmente, en el capítulo 9 se discuten los resultados y conclusiones de los estudios presentados en esta tesis, especialmente en relación a las modalidades diagnósticas y opciones terapéuticas, tanto actuales como futuras, para los pacientes con NETs.

[nl] Neuroendocriene tumoren (NET) vormen een heterogene groep van zeldzaam voorkomende, langzaam groeiende tumoren. NET ontstaan vanuit enterochromaffine cellen. De jaarlijkse incidentie van NET is progressief toegenomen in de afgelopen jaren. Het is echter niet duidelijk of deze toename in incidentie een werkelijke toename is, veroorzaakt wordt door verbeterde diagnostische procedures, of door een combinatie van beiden. Hoewel NET vaak al gemetastaseerd blijken te zijn bij de diagnose, is de gemiddelde overleving van patiënten met NET toegenomen. Dit is waarschijnlijk toe te schrijven aan verbeterde diagnostiek en toegenomen therapeutische mogelijkheden. Er zijn goede en gestandaardiseerde diagnostische procedures nodig om patiënten met een NET in een zo vroeg mogelijk stadium te diagnosticeren, om het beloop van de ziekte nauwlettend te vervolgen en om deze patiënten een optimale behandeling te kunnen geven. In de afgelopen jaren is het aantal medicamenteuze behandelingsmogelijkheden voor patiënten met een NET sterk toegenomen. In dit proefschrift worden een aantal studies beschreven die betrekking hebben op diagnostische en therapeutische mogelijkheden voor NET patiënten. Hoofdstuk 1 betreft een algemene inleiding over NET en benadrukt de toepassing en beperkingen van de huidige diagnostische procedures voor patiënten met NET. Er wordt een overzicht gegeven van een aantal mogelijk nieuwe diagnostische (bio)merkers. In dit hoofdstuk worden tevens huidige en nieuwe behandelingsmogelijkheden voor functionele en niet-functionele NET besproken. Dit hoofdstuk vormt de inleiding voor het onderwerp van dit proefschrift, n.l. nieuwe diagnostische en therapeutische mogelijkheden voor patiënten met NET. Hoofdstuk 1 wordt afgesloten met een overzicht van de doelstellingen van het onderzoek van het proefschrift. In het onderzoek beschreven in hoofdstuk 2 is de expressie van verschillende componenten van het somatostatine/cortistatine en het ghrelin systeem onderzocht in een grote serie van goed gekarakteriseerde typische en atypische long carcinoiden (LC). Voor zover bekend is dit de eerste studie waarin beide systemen tegelijkertijd worden onderzocht in LC weefsels. Het onderzoek toont aan dat de expressie van somatostatine, van enkele somatostatine receptor subtypen (SSTs), en van de ghrelin receptor GHSR, gradueel toeneemt van normaal naar niet tumor-aangrenzend weefsel en tumor weefsel. Bovendien werd voor de eerste keer in LC expressie aangetoond van de korte iso-vormen SST5TMD4, In1-ghrelin en de ghrelin receptor GHSR1b. Hogere expressie van ghrelin-O-acetyltrasferase (GOAT) werd gevonden in tumoren met necrose, grotere tumoren met meer peritumorale invasie en metastasen op afstand. Deze bevindingen suggereren dat een ontregelde regulatie van het ghrelin systeem betrokken zou kunnen zijn bij de ontwikkeling/progressie van de tumoren. In hoofdstuk 3 wordt onderzoek naar de expressie van componenten van het somatostatine/ cortistatine systeem in gastroenteropancreatische- (GEP-) NET beschreven. De gevonden hogere expressie van SST5 in tumor weefsel in vergelijking met tumor-aangrenzend en met normaal weefsel, en de klinische relatie van SST5 expressie met vasculaire- en zenuw invasie, suggereert dat SST5 een mogelijk doelwit is om agressieve GEP-NET te behandelen. Bovendien kan de evaluatie van het SSTs profiel in GEP-NET aanvullende informatie opleveren die mogelijk gebruikt kan worden bij klinische besluitvorming, waaronder het gebruik van een tweede generatie somatostatine analogen (SSA). De meest nieuwe en relevante bevinding van het onderzoek beschreven in hoofdstuk 4 is de duidelijke overexpressie van GOAT in GEP-NET weefsel. Terwijl de expressie van dit enzym vrijwel afwezig is in bijbehorend normaal weefsel, wordt expressie gevonden in aangrenzend niet-tumor weefsel en is expressie van GOAT met name aanwezig in tumor weefsel. De hogere expressie van GOAT in GEP-NET weefsel werd tevens aangetoond met behulp van immunohistochemie. Hoge expressie van dit enzym was geassocieerd met grotere tumoren en voornamelijk in gastro-intestinale NET. Deze bevindingen, tezamen met eerdere publicaties, suggereren dat GOAT een mogelijke diagnostische biomerker is in GEP-NET. Hoofdstuk 5 beschrijft onderzoek naar de effecten van het geneesmiddel ketoconazol op de groei, cel cyclus, apoptose en afgifte van ACTH of serotonine en chromogranine in respectievelijk een ACTH-producerende long NET cellijn en een niet-ACTH producerende pancreas NET cellijn. Ketoconazol heeft een voornamelijk pro-apoptotisch of cytotoxisch effect, afhankelijk van het type cellijn. Bovendien zorgt behandeling met ketoconazol voor veranderingen in celcyclus, namelijk een toename in G0/G1 fase in beide cellijnen en een afname in G2/M fase in de pancreas NET cellijn. Bovendien tonen de resultaten in hoofdstuk 5 een niet eerder gerapporteerd remmend effect aan van het SSA pasireotide op serotonine afgifte van de pancreas NET cellijn. Dit effect wordt waarschijnlijk gemedieerd via de hoge SST5 expressie in deze cellijn. Het onderzoek in hoofdstuk 6 beschrijft een uitgebreide karakterisering van twee páncreas NET modellen in tweedimensionale (monolayer) en driedimensionale (sferoïden) kweeksystemen, in verschillende kweekmedium condities. Op basis van de resultaten van dit onderzoek wordt geconcludeerd dat een driedimensionaal (sferoïde) kweeksysteem een veelbelovend systeem is om groei en hormoon secretie van NET cellijnen te bestuderen, zelfs onder serum arme kweekcondities. In dit onderzoek wordt tevens aangetoond dat de expressie van SSTs en de dopamine D2 receptor (D2R) verandert tijdens de groei van cellen, zowel in twee- als driedimensionale kweken. De effecten van het somatostatine analoog octreotide, de dopamine agonist cabergoline en van twee nieuwe SSTs-D2R bindende geneesmiddelen (BIM-065 en BIM-23A760) werden onderzocht in de twee kweeksystemen. Cabergoline en de twee SSTs-D2R multi-receptor bindende geneesmiddelen, en niet octreotide, hadden een remmend effect op de afgifte van chromogranine en serotonine, maar niet op de celgroei. De bevindingen suggereren dat het effect van de twee SSTs-D2R bindende geneesmiddelen op de afgifte van hormonen in dit pancreas NET model verloopt via de D2R, en een mogelijke rol voor dopamine agonisten bij de behandeling van D2R-bevattende functionele NET, waaronder het carcinoid syndroom. Hoofdstuk 7 beschrijft onderzoek naar de in vitro effecten van de nieuwe tryptofaan hydroxylase remmer telotristat op pancreas NET cellen. Telotristat remt krachtig en dosisafhankelijk de serotonine afgifte, bij klinisch relevante concentraties. De combinatie met pasireotide, maar niet met octreotide, had een aanvullend remmend effect op de serotonine afgifte. In driedimensionaal gekweekte pancreas NET cellen kon de serotonine afgifte volledig worden geremd door telotristat, maar was er geen effect op de celgroei. Deze resultaten tonen aan dat serotonine in dit pancreas NET model geen autocrien/paracrien effect heeft op de celgroei. Het onderzoek in hoofdstuk 8 toont dat de SSTs expressie in GEP-NET weefsel van patiënten met type 2 diabetes verlaagd is ten opzichte van GEP-NET weefsel van patiënten zonder diabetes. In type 2 diabetes patiënten die behandeld werden met metformine werd deze verlaging in SSTs expressie niet gevonden. In vitro experimenten toonden groei remmende effecten van biguanides en statines aan op NET cellijnen, met een toegenomen apoptose en afgenomen migratie van de cellen. Aangezien metformine en statines commercieel verkrijgbare en relatief goedkope geneesmiddelen zijn en er een langdurige ervaring is in het gebruik ervan, kunnen deze geneesmiddelen mogelijk van aanvullende waarde zijn bij de adjuvante behandeling van patiënten met NET. In hoofdstuk 9 worden de resultaten en conclusies van de studies uit dit proefschrift bediscussieerd in relatie tot huidige en mogelijk nieuwe toekomstige diagnostische en therapeutische mogelijkheden voor patiënten met een NET.