[en] It is of great importance to control viral diseases affecting aquaculture in an efficient and cost-effective manner. Vaccination represents the primary preventive measure against highly infectious viral diseases that affect farmed fish. This study presents an innovative recombinant modular platform of subunit vaccines for oral administration, nanostructured as inclusion bodies (IBs). The modular platforms include the recombinant antigenic virus protein bound to a His-tag at the C-terminal part. Furthermore, at the N-terminal end, we have attached the recombinant viral antigen with a spacer peptide to a recombinant gamma interferon as an adjuvant in order to assess whether the IFN domain induces an increase in the immune response. Similarly, we have attached the viral antigen with IFN to a ligand sequence in order to assess whether the selected ligand has the potential to target the vaccine to immunologically relevant cells or organs, and to stimulate a local and/or systemic immune response. The study selected two viral pathogens affecting fish: spring viraemia virus affecting carp (SVCV) and infectious pancreatic necrosis virus affecting salmonids (IPNV). These two pathogens collectively account for approximately 86% of the total production of farmed fish worldwide. For the first time, we designed and produced nanostructured recombinant proteins of SVCV G3 glycoprotein (SVCV), SVCV G3 bound to IFN[Gamma] (SVCV-IFN), IPNV VP2 protein bound to IFN[Gamma] (IPNV-IFN) and IPNV VP2 bound to IFN[Gamma] and a CCR5 ligand (IPNV-IFN[Gamma]-CCR5). Morphological characterisation of the modular platforms was performed by scanning electron microscopy (FESEM), which demonstrated that the nanostructures are internalised by zebrafish liver cells (ZFL), by primary cultures of rainbow trout anterior kidney macrophages (RT-HKM) and by trout intestine cells (RTgutGC). This was achieved by flow cytometry and confocal microscopy. In vitro, the nanostructured modules induced the expression of innate immunity-associated genes in ZFL, RTgutGC and RT-HKM cells. In vivo experiments with zebrafish (D. rerio) larvae demonstrated that fluorescent SVCV and SVCV-IFN nanopellets are taken up in the intestine and pancreas. Furthermore, we demonstrate that adult zebrafish vaccinated with SVCV-IFN and challenged with SVC virus exhibit an excellent level of protection, indicating the adjuvant potential of the IFN[Gamma] module. In in vivo assays with rainbow trout (O. mykiss) administered by oral intubation, we demonstrate that fluorescent IPNV and IPNV-IFN nanopellets are absorbed in the intestinal tract, biodistributed to the anterior kidney and endocytosed by kidney macrophages. In vivo experiments were conducted on juvenile trout, which were orally intubated with IPNV-IFN and IPNV-IFN-CCR5. The expression of immune response gene markers was observed in hindgut, spleen and anterior kidney macrophages at days 1, 3, 15 and 21 post-intubation. Furthermore, sera obtained 21 days post-intubation with the ligand module (IPNV-IFN-CCR5) demonstrated a significant induction of IPN virus-specific antibodies in comparison to IPNV-IFN and control groups. This suggests that the CCR5 ligand may be promoting cell migration and consequently the induction of IPN virus-specific antibodies. In conclusion, the results demonstrate that oral subunit vaccines comprising gamma interferon and/or ligand modules can elicit an innate-adaptive immune response and protect fish against SVC and IPN virus.

[es] Las enfermedades virales que impactan la acuicultura necesitan ser controladas de forma barata y eficientemente. La vacunación es la principal herramienta preventiva para combatir enfermedades virales altamente infecciosas que afectan a los peces de cultivo. En este estudio, presentamos una innovadora plataforma modular recombinante de vacunas de subunidad para administración oral, nanoestructuradas como cuerpos de inclusión (IBs, Inclusion bodies). Las plataformas modulares incluyen la proteína antigénica recombinante del virus unida a un His-tag en la parte C-terminal. Además, por el extremo N-terminal unimos el antígeno viral recombinante con un péptido espaciador a un Interferón gamma recombinante como adyuvante para evaluar si el dominio IFN induce un aumento de la respuesta inmune. De la misma forma, unimos el antígeno viral con IFN a una secuencia ligando, para evaluar si el ligando seleccionado tiene el potencial de dirigir la vacuna a células u órganos de relevancia inmunológica, y estimular una respuesta inmune local y/o sistémica. Para el estudio, seleccionamos el virus de la viremia primaveral que afecta a la carpa (SVCV) y el virus de la necrosis pancreática infecciosa que afecta a salmónidos (IPNV), especies que en conjunto representan cerca del 86% de la producción total de peces cultivados a nivel mundial. Por primera vez, diseñamos y producimos proteínas recombinantes nanoestructuradas de la glicoproteína G3 de SVCV, G3 de SVCV unido a IFN[Gamma] (SVCV-IFN), proteína VP2 de IPNV unido a IFN[Gamma] (IPNV-IFN) y VP2 de IPNV unido a IFN[Gamma] y un ligando CCR5 (IPNV-IFN-CCR5). Realizamos la caracterización morfológica de las plataformas modulares por microscopia electrónica de barrido (FESEM) y demostramos que las nanoestructuras son internalizadas por células hepáticas de pez cebra (ZFL), por cultivos primarios de macrófagos de riñón anterior de trucha arcoíris (RT-HKM) y por células de intestino de trucha (RTgutGC), mediante citometría de flujo y microscopia confocal. A nivel in vitro, los módulos nanoestructurados indujeron la expresión de genes asociados a la inmunidad innata en células de ZFL, RTgutGC y RT-HKM. En experimentos in vivo con larvas de pez cebra (D. rerio) demostramos que los nanopellets SVCV y SVCV-IFN fluorescentes son absorbidos a nivel intestinal y en páncreas. Además, demostramos que los peces cebra adultos vacunados con SVCV-IFN y desafiados con el virus SVC, presentan un excelente nivel de protección, indicando el potencial adyuvante del módulo IFN[Gamma]. En ensayos in vivo con trucha arcoíris (O. mykiss) administrados por intubación oral, demostramos que los nanopellets IPNV e IPNV-IFN fluorescentes son absorbidos en el tracto intestinal, biodistribuidos al riñón anterior y endocitados por macrófagos del riñón. En experimentos in vivo, truchas juveniles fueron intubadas de forma oral con IPNV-IFN e IPNV-IFN-CCR5 y observamos la expresión de marcadores de genes de respuesta inmune en intestino posterior, bazo y macrófagos del riñón anterior el día 1, 3, 15 y 21 después de la intubación. Además, sueros obtenidos 21 días post intubación con el módulo ligando (IPNV-IFN-CCR5) mostraron una inducción significativa de anticuerpos específicos del virus IPN en comparación a IPNV-IFN y los grupos control, lo que podría indicar que el ligando CCR5 puede estar promoviendo la migración celular y consecuentemente la inducción de anticuerpos específicos del virus de IPN. Los resultados en conjunto muestran, que las vacunas orales de subunidad que incluyen los módulos interferón gamma y/o ligando pueden estimular la respuesta inmune innata-adaptativa y proteger a los peces contra el virus de SVC e IPN.