[ca] L'ús de proteïnes com a anticossos i de les citocines com a teràpia ha anat augmentant de manera constant en les últimes tres dècades. Malgrat l'èxit de les bioteràpies en el tractament de diverses malalties, aquests sovint s'associen amb efectes secundaris que en limiten la dosi. Per tant, hi ha una creixent tendència a controlar la seva activitat terapèutica mitjançant senyals interns o estímuls externs. L' activació selectiva de les teràpias permet millorar tant la seguretat com l'eficàcia del tractament i, fins i tot, pot permetre la incorporació d'antígens que d'altra manera es consideren no farmacològics. Aquesta tesi pretenia desenvolupar noves estratègies per a generar proteïnes condicionalment actives per a aplicacions terapèutiques. La tesi es divideix en dues parts, la primera es centra en el desenvolupament d'un fragment d'anticòs variable de cadena senzilla (scFv) sensible a diferents estímuls, mentre que la segona explora l'aplicació d'eines de disseny de proteïnes de novo per a dissenyar fragments que emmascaren diferents proteïnes terapèutiques. L'objectiu principal de la primera part d'aquesta tesi va ser desenvolupar un scFv sensible a estímuls i dirigit contra CD133 per a administrar càrregues terapèutiques a les cèl·lules mare del glioma. Per a això, en primer lloc, es va desenvolupar un protocol per a produir i caracteritzar aquest scFv i, seguidament, es van investigar dos enfocaments d'emmascarament diferents. Com que l'emmascarament amb un fragment d'antigen no va funcionar com s'esperava, vam imaginarne un de nou per a impedir estèricament les interaccions scFv-antigen mitjançant la conjugació específica de lloc amb un polímer flexible. Després de seleccionar vuit llocs de conjugació diferents, vam identificar una posició que maximitzava l'eficiència de l'emmascarament sense afectar l'afinitat del scFv desenmascarat pel seu objectiu. Amb aquest mutant, es va avaluar la capacitat d'emmascarament de polímers amb diferents mides i naturaleses. Finalment, es va implementar la capacitat de resposta a dos estímuls diferents i es va confirmar la recuperació de l'afinitat d'unió després del tractament amb l'estímul adequat. L'enfocament d'emmascarament ideat a la primera part d'aquesta tesi té el potencial d'aplicar-se a qualsevol format d'anticòs, amb qualsevol especificitat d'antigen i qualsevol estímul d'activació. D'altra banda, l'objectiu principal de la segona part d'aquesta tesi va ser avaluar la idoneïtat de les eines de disseny de proteïnes de novo per a la generació de bioteràpies sensibles a proteases. Per a aquest estudi es van utilitzar com a proteïnes model un minibinder hiperestable dissenyat de novo contra EGFR i imitadors de dos citocines, IL-2 i IL-21. Es van aplicar una varietat de mètodes computacionals desenvolupats recentment per a dissenyar màscares que interaccionen específicament amb la proteïna d'interès i eviten la seva unió al receptor. Vam confirmar que les màscares per al minibinder anti-EGFR i l'imitador IL-21 van permetre reduir la unió de l'antigen en diversos graus. A més, es va observar la recuperació de la capacitat d'unió després de la escissió proteolítica de la màscara. Els nostres experiments confirmen que els mètodes de disseny de proteïnes de novo són eines valuoses que poden ajudar a la generació de bioteràpies condicionalment actives. En general, hem desenvolupat noves estratègies per a fer que diferents proteïnes siguin sensible a estímuls i que es puguin utilitzar per crear teràpies potencialment més segures i eficients.

[es] El uso de proteínas, incluyendo anticuerpos y citoquinas, como terapia ha ido en constante aumento en las últimas tres décadas. A pesar del éxito de los bioterapéuticos en el tratamiento de distintas enfermedades, a menudo se asocian con efectos secundarios que limitan la dosis. Por ese motivo, hay una tendencia creciente vuelta a controlar la actividad bioterapéutica con estímulos internos o externos. La activación selectiva de la terapia permite mejorar tanto la seguridad como la eficacia del tratamiento, hasta llegar a incorporar antígenos que de otro modo se considerarían intratables. Esta tesis tuvo como objetivo desarrollar nuevas estrategias para generar proteínas condicionalmente activas con aplicaciones terapéuticas. La tesis se divide en dos partes, la primera se centra en el desarrollo de un fragmento de anticuerpo variable de cadena sencilla (scFv) que responde a diferentes estímulos, mientras que la segunda explora la aplicación de herramientas de diseño de proteínas de novo para diseñar mascaras para proteínas terapéuticas. El principal objetivo de la primera parte de esta tesis fue desarrollar una versión sensible a estímulos de un scFv dirigido contra CD133, para administrar cargas terapéuticas a las células madre de glioma. Con este fin, primeramente se desarrolló un procedimiento para producir y caracterizar el scFv objetivo. A continuación, se investigaron dos propuestas de enmascaramiento diferentes. Dado que el enmascaramiento con un fragmento de antígeno no funcionó como se esperaba, diseñamos una nueva estrategia para impedir estéricamente las interacciones scFvantígeno mediante la conjugación sitio-específica de un polímero. Después de seleccionar ocho sitios de conjugación, identificamos una posición que maximizaba la eficiencia de. A seguir, se evaluó la capacidad de enmascaramiento de polímeros de diferentes tamaños y naturalezas. Finalmente, se implementó la capacidad de respuesta a dos estímulos diferentes y se confirmó el rescate de la afinidad de unión tras el tratamiento con el estímulo apropiado. El enfoque de enmascaramiento ideado tiene el potencial de aplicarse a cualquier formato de anticuerpo, con cualquier especificidad de antígeno y cualquier estímulo de activación. En la segunda parte de esta tesis, el objetivo principal fue evaluar la idoneidad de herramientas de diseño de proteínas de novo para la generación de bioterapéuticos sensibles a proteasas. Para este estudio se utilizaron como proteínas modelo un binder hiperestable diseñado de novo contra EGFR y imitadores de dos citoquinas, IL-2 e IL-21. Se aplicaron diversos métodos computacionales desarrollados recientemente para diseñar máscaras que interactúen específicamente con la proteína de interés y eviten su unión al receptor. Confirmamos que las máscaras para el minibinder anti-EGFR y el imitador de IL-21 permiten reducir la unión del antígeno en varios órdenes de magnitud. Además, se observó el rescate de la capacidad de unión después de la escisión proteolítica de la máscara. Nuestros experimentos confirman que los métodos de diseño de proteínas de novo son herramientas valiosas que pueden ayudar en la generación de bioterapéuticos condicionalmente activos. En conjunto, hemos desarrollado varias nuevas estrategias para conseguir que diferentes proteínas sean condicionalmente activas, las cuales podrán emplearse para crear terapias potencialmente más seguras y eficientes.