[ca] Els glicolípids són producte d'alt valor degut a les seves propietats amfipàtiques que els doten d'un ampli rang d'aplicacions en els sectors químic (ex., biosurfactants) o biomèdic (ex., adjuvant de vacunes). Depenent de la unitat lipídica que els forma aquests compostos poden ser classificats en diferents famílies. Si la unitat lpídica és una ceramida o diacilglicerol, el glicolípid resultant es coneixerà com a glicoesfingolípid o glicoglicerolípid (GGL) respectivament. Mentre que els glicoesfingolípids han demostrat jugar un paper clau en diversos processos biològics, els glicoglicerolípids són interessants degut al seu ús potencial per a ser usats com a adjuvants de vacunes o supressors tumorals. Tot i que l'interès per aquests compostos és alt, la seva aplicació es veu obstaculitzada per la seva baixa disponibilitat i alt cost de producció. La síntesi química requereix de complexes passos de protecció i desprotecció per tal d'aconseguir la desitjada regio- i estereoespecificitat de l'enllaç glicosídic que, conseqüentment, comporta una reducció del rendiment i eficiència del procés. Per això, vam considerar l'enginyeria metabòlica com a estratègia potencial per a la producció de glicolípids i ens vam centrar en l'obtenció d'una plataforma d'enginyeria metabòlica en E. coli per tal d'obtenir aquests complexes productes d'interès. En estudis previs, el nostre grup va reportar que la sintasa de glicolípids MG517 de Mycoplasma genitalium era funcional i que s'obtenien glicoglicerolípids a partir de UDP-glucosa (UDP-Glc) i diacilglicerol (DAG). Addicionalment, una primera generació de soques modificades va demostrar que la disponibilitat de DAG era limitant per a la producció de GGL (Mora-Buyé et al., 2012). En el present projecte, cinc estratègies diferents d'enginyeria metabòlica van ser proposades per tal d'augmentar la producció de GGL utilitzant E. coli. Les primeres quatre estratègies tenien com a objectiu incrementar el pool del precursor lipídic, DAG. Sent així, la primera estratègia es basà en augmentar la disponibilitat de DAG a través de l'eliminació de reaccions competitives. Per aconseguir-ho, es van knockejar diferents gens involucrats en la ß-oxidació i l'activació d'àcids grassos (∆tesA i ∆fadE) reportant un increment en la producció de casi el doble. La segona estratègia es va basar en incrementar la disponibilitat d'àcids grassos mitjançant la modulació de factors de transcripció (fabR i fadR). Aquesta estratègia no va reportar un increment de la producció però si un canvi en el perfil lipídic amb un increment d'àcids grassos insaturats. La tercera estratègia es basava en incrementar la conversió dels donadors d'acils a àcid fosfatídic, precursor del DAG, sobreexpressant les aciltransferases PlsC i PlsB. La quarta estratègia es centrà en augmentar la disponibilitat del diacilglicerol per la sobreexpressió de la proteïna de fusió PlsCxPgpB, capaç de redirigir el flux cap a DAG, o CDH promovent la hidròlisi de fosfolípids. D'entre les diferent soques modificades, ∆tesA co-expressant MG517 i la proteïna de fusió PlsCxPgpB va ser la soca més productora, amb un 350% d'increment en la producció de GGL comparant-la amb la soca parental expressant únicament MG517. Especialment interessant és que les soques coexpressant CDH van presentar un canvi en el perfil de GGL cap al lípid diglucosilat (representant al voltant d'un 80% del total de GGLs). Finalment, es va proposar una estratègia metabòlica per incrementar la disponibilitat de l'altre precursor, UDP-Glc. Aquesta cinquena estratègia es va basar en sobre expressar l'enzim GalU, responsable de la biosíntesi d'UDP-Glc, i eliminant l'enzim codificant per la UDP-sucre difosfatasa ushA. No obstant, cap d'aquestes modificacions va aconseguir millorar els nivells de GGLs. Per últim, tal i com va ser reportat pel nostre grup que la fosfatidiletanolamina era intercanviable en les membranes d'E. coli pels nous producte GGL, una llibreria de promotors i RBS va ser dissenyada per tal de disminuir la producció d'aquest fosfolípid, augmentant al mateix temps de la producció de glicolípids.

[es] Los glicolípidos son productos de alto valor debido a sus propiedades amfipáticas, que los dota en un amplio rango de aplicaciones en los sectores químicos (ej., biosurfactantes) o biomédicos (ej., adyuvante de vacunas). Dependiendo de la unidad lipídica que los forma, los glicolípidos son clasificados en diferentes familias. Si la unidad lipídica es una ceramida o diacilglicerol, los glicolípidos son conocidos como glicoesfingolípidos o glicoglicerolípidos (GGL) respectivamente. Mientras que los glicoesfingolípidos han demostrado jugar papeles clave en diversos procesos biológicos, los glicoglicerolípidos son compuestos interesantes debido a su potencial uso como adyuvantes de vacunas o supresores tumorales. Aunque el interés por estos compuestos es muy alto, su aplicación se ve obstaculizada por su baja disponibilidad y altos costes de producción. La síntesis química requiere de complejos pasos de protección y desprotección para conseguir la deseada regio- y estereoespecificidad del enlace glicosídico, que conlleva a una reducción del rendimiento y eficiencia del proceso. Por ello, consideramos la ingeniería metabólica como estrategia potencial para la producción de glicolípidos y nos centramos en construir una plataforma de ingeniería metabólica en E. coli para conseguir estas complejas estructuras de interés. En previos estudios, nuestro grupo reportó que la sintasa de glicolípidos MG517 de Mycoplasma genitalium era funcional y que glicoglicerolípidos podían ser obtenidos a partir de UDP-glucosa (UDP-Glc) y diacilglicerol (DAG). Adicionalmente, la primera generación de cepas modificadas demostró que la disponibilidad de DAG era limitante en la producción de GGL (Mora-Buyé et al., 2012). En el presente proyecto, cinco estrategias diferentes de ingeniería metabólica fueron propuestas para aumentar la producción de GGL en E. Coli. Las primeras cuatro estrategias se centraron en aumentar el pool del precursor lipídico, DAG. Para ello, la primera estrategia se basó en incrementar la disponibilidad de DAG a través de la eliminación de reacciones competitivas. Para lograrlo, se knockearon diferentes genes relacionados con la ß-oxidación y la activación de ácidos grasos (∆tesA y ∆fadE) reportando un incremento de casi el doble. La segunda estrategia se basó en incrementar la disponibilidad de ácidos grasos mediante la modulación de factores de transcripción (fabR y fadR). Aunque estrategia no reportó una mejora en el rendimiento de GGL, sí mostró un cambio en el perfil de los ácidos grasos con un incremento de los ácidos grasos insaturados. La tercera estrategia se basó en incrementar la conversión de los donadores de acilos a ácido fosfatídico, precursor del DAG, mediante la sobreexpresión de las aciltransferasas PlsC y PlsB. La cuarta estrategia se centró en aumentar la disponibilidad de diacilglicerol mediante la sobreexpresión de la proteína de fusión PlsCxPgpB capaz de redirigir el flujo de DAG, o CDH promoviendo la hidrólisis de fosfolípidos. Entre las diferentes cepas modificadas, la cepa ∆tesA coexpresando MG517 y la proteína de fusión PlsCxPgpB fue la mayor productora, con un incremento de los niveles de GGL del 350%, comparándola con la cepa parental expresando únicamente MG517. Interesantemente, las cepas coexpresando CDH mostraron un cambio en el perfil de GGL hacia el lípido diglucosilado (hasta el 80% del total del GGLs). Finalmente, una estrategia metabólica fue propuesta para aumentar la disponibilidad del otro precursor, UDP-Glc. La quinta estrategia se basó en la sobreexpresión de la enzima GalU, responsable de la biosíntesis de UDP-Glc, y la eliminación de la UDP-azúcar difosfatasa codificada por el gen ushA. Sin embargo, ninguna de estas modificaciones mejoró los niveles de GGL. Por último, tal y como reportó nuestro grupo que la fosfatidiletanolamina era intercambiable en las membranas de E. coli por los nuevos compuestos GGL, una librería de promotores y RBS fue diseñada para disminuir la producción de este fosfolípido intentando al mismo tiempo aumentar la producción de glicolípidos.