[en] The glycosynthase technology has become a powerful enzymatic tool for the synthesis of oligosaccharides, polysaccharides and glycoconjugates. Glycosynthases are mutated glycosidases devoid of hydrolase activity but able to efficiently catalyze the formation of glycosidic bonds in high yields when using an activated glycosyl donor. In addition, the activated donor and its transglycosylation product, can both act as acceptors leading to the autocondensation of the donor or to the elongation of the transglycosylation product leading to polysaccharides. The present work aims to synthesize novel artificial functionalized polysaccharides with defined structures by the use of the glycosynthase technology. On the one hand, an increase in the molecular weight of the polysaccharides is attempted by the use of a carbohydrate binding module (CBM). This module might improve the solubility of the new polymers that are synthesized during the polymerization reaction. The effect on the polymerization degree has been studied for both the glycosynthase mutant in the presence of CBM and for the fusion protein glycosynthase-CBM. On the other hand, functionalized artificial polysaccharides have been synthesized from activated disaccharidyl donors where the desired functionalization has been introduced at position C-6'. These functionalized donors act as a substrate for the glycosynthase mutant that will catalyze the autocondensation reaction. The azido group was chosen as a suitable functional group given its versatility and its size, small enough to be accepted by the enzyme. Donors 6-azidolaminaribiosyl fluoride and 6-azidocellobiosyl fluoride have been synthesized and evaluated as substrates for the glycosynthase reactions by the E134S 1,3-1,4-β-glucanase from Bacillus licheniformis mutant and the E197A cellulase mutant from Humicola insolens, respectively. Artificial 6-azido- and 6-amino-6-deoxicelluloses with an alternating functionalization pattern have been produced. As opposed to chemically modified celluloses where the substitution pattern is intrinsically random, the glycosynthase-catalyzed polymerization of properly modified glycosyl donors gives access to novel functionalized celluloses with defined and regular substitution patterns.

[es] La tecnología glicosintasa se ha convertido en una herramienta importante para la síntesis de oligosacáridos, polisacáridos y glicoconjugados. Las glicosintasas son glicosidasas mutadas desprovistas de actividad hidroítica pero capaces de catalizar eficientemente la formación de enlaces glicosídicos con rendimientos elevados utilizando un dador glicosídico activado. Además, el dador activo y su producto de transglicosidación pueden actuar como aceptores dando lugar a la autocondensación del dador o a la elongación del producto de transglicosidación, produciendo polisacáridos. En el presente trabajo se pretenden sintetizar nuevos polisacáridos artificiales funcionalizados con estructuras definidas mediante el uso de la tecnología glicosintasa. Por un lado, se ha intentado aumentar la masa molecular de los polisacáridos utilizando un módulo de unión de carbohidratos (CBM). Este módulo podría mejorar la solubilidad de los nuevos polímeros a medida que se van sintetizando durante la reacción de polimerización. El efecto en el grado de polimerización ha sido estudiado tanto para el mutante glicosintasa en presencia de CBM como para la proteína de fusión glicosintasa-CBM. Por otro lado, se han sintetizado polisacáridos artificiales funcionalizados a partir de dadores disacarídicos activados donde la funcionalización deseada ha sido introducida previamente en la posición C-6'. Estos dadores funcionalizados actúan como sustrato para el mutante glicosintasa que catalizará la reacción de autocondensación. El grupo azido fue escogido por ser un grupo funcional adecuado dada su versatilidad y tamaño, suficientemente pequeño como para ser aceptado por el enzima. Los dadores fluoruro de 6-azidolaminaribiosa y fluoruro de 6-azidocelobiosa han sido sintetizados y evaluados como sustratos para las reacciones glicosintasa con el mutante E134S de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis y el mutante E197A de la celulasa de Humicola insolens, respectivamente. Se han sintetizado 6-azido y 6-amino-6-deoxicelulosas artificiales con una secuencia de funcionalización alternada. De forma opuesta a la modificación química de celulosas donde la secuencia de sustitución es intrínsicamente aleatoria, la polimerización catalizada por glicosintasas de dadores glicosídicos modificados apropiadamente, permite acceder a nuevas celulosas funcionalizadas con secuencias de sustitución definidas y regulares.