[en] The aims of this dissertation have been the investigation of new candidate compounds targeting the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) in preclinical models of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and the discovery of new molecular biomarkers for myelodysplastic neoplasm (MDS) patients with micromegakaryocytes (mMK). DLBCL is the most frequent subtype of mature B-cell non-Hodgkin lymphoma. Despite the high rates of response to the immunochemotherapy regimen R-CHOP, new therapeutic strategies are still needed for refractory or relapsed patients. The recent discoveries on the impact of the tumor microenvironment, and specifically, the role of CXCR4, on tumor development, have pointed at the use of CXCR4-inhibitors (CXCR4-i) as a promising approach. In this work, 31 new CXCR4-i targeting compounds were screened on a representative DLBCL cell line, allowing the identification of the lead compound IQS-022. Subsequent studies demonstrated the antitumoral activity of this latter in a wider panel of DLBCL cell lines, as well as in an immunocompetent DLBCL xenograft model using the chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay. Among a panel of compounds derived from IQS-022 structure, IQS-036 was identified as presenting the best efficacy and safety profile, with the ability to elicit apoptosis in DLBCL cell lines. To investigate the specificity of IQS-036, subsequent studies were carried out using a CXCR4-wild type and a CXCR4-depleted cell line. These analyses, which included a flow cytometry-based occupancy assay, and in vitro and in vivo antitumor activity measurement, highlighted a partial specificity of the compound and potential, unforeseen off-target effects. MDS are a group of clonal hematopoietic stem cell diseases characterized by cytopenia and dysplasia in myeloid lineages. Among the multiple dysplastic features observed in MDS patients, mMK, defined as small megakaryocytes (MK) with a mono- or bi-lobated nucleus, have been associated with poor prognosis in MDS. However, the molecular alterations behind this occurrence are largely unknown. In this thesis, the patterns of cytogenetic alterations and somatic mutations were compared between MDS cases with different degrees of dysmegakaryopoiesis, leading to the observation that haploinsufficiency of EZH2 (EZH2h), caused by either mutation or loss of its locus in chromosome 7, in co-occurrence with RUNX1 mutation (RUNX1m), was significantly enriched in cases with high levels of mMK. This finding was confirmed in a smaller validation cohort, in which genetic alterations were examined by integrating various high-resolution and single-cell approaches. Subsequent transcriptomic studies of EZH2h+RUNX1m cases showed the downregulation of genes involved in TNF-α signaling via NF-κB, among others, some of which could be validated by single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) and quantitative PCR (RT-qPCR). Finally, functional validation assays using a cell line-based model of MK differentiation showed that EZH2 loss of function slightly reduced MK maturation and recapitulated some aspects of the previously identified gene expression profile. The results of this work highlight CXCR4 as a promising therapeutic target for DLBCL, with IQS-036 constituting a drug candidate with potent antitumor activity and a favorable safety profile in vitro and in vivo, despite an incomplete specificity. In addition, MDS cases with mMK are concomitantly enriched in two genetic hallmarks, i.e. the loss of function of both EZH2 and RUNX1 genes, which could potentially be considered a biomarker of a distinct MDS subtype with poor prognosis.

[es] Los objetivos de esta tesis doctoral han sido la investigación de nuevos compuestos candidatos dirigidos contra el receptor CXCR4 en modelos preclínicos de linfoma difuso de células B grandes (LDCBG) y el descubrimiento de nuevos biomarcadores moleculares para pacientes de neoplasias mielodisplásicas (SMD) con micromegacariocitos (mMK). El LDCBG es el subtipo de linfoma no Hodgkin de células B maduras más frecuente. A pesar de las altas tasas de respuesta al régimen de inmunoquimioterapia R-CHOP, sigue siendo necesario encontrar nuevas estrategias terapéuticas para pacientes refractarios o en recaída. Los recientes descubrimientos sobre el impacto del microambiente tumoral, y específicamente, de CXCR4, en el desarrollo tumoral, han apuntado hacia el uso de inhibidores de CXCR4 (CXCR4-i) como una aproximación terapéutica prometedora. En este trabajo se ha realizado un cribaje de 31 nuevos CXCR4-i con una línea celular representativa de LDCBG que ha permitido la identificación del compuesto candidato IQS-022. Se ha demostrado la actividad antitumoral de este último compuesto en un amplio panel de líneas celulares de LDCB, así como en un modelo inmunocompetente de xenoinjerto de LDCBG usando el ensayo de membrana corioalantoidea (CAM) de embrión de pollo. De entre un panel de compuestos derivados de la estructura de IQS-022, IQS-036 ha demostrado el mejor perfil de eficacia y seguridad, capaz de inducir la apoptosis en líneas celulares de LDCBG. Para investigar la especificidad de IQS-036, se ha utilizado una pareja de líneas celulares con y sin expresión de CXCR4. Estos análisis, que han incluido un ensayo de ocupación basado en citometría de flujo, y medidas de actividad antitumoral in vitro e in vivo, han demostrado una especificidad parcial del compuesto y la existencia de posibles efectos inespecíficos. Los SMD son un grupo de enfermedades clonales de células madre hematopoyéticas caracterizadas por citopenia y displasia en el linaje mieloide. De entre las diversas alteraciones displásicas observadas en pacientes de SMD, los mMK, definidos como megacariocitos (MK) pequeños con un núcleo mono- o bilobulado, se han asociado a un peor pronóstico en SMD. No obstante, no se conocen las alteraciones moleculares detrás de este fenómeno. En esta tesis se han comparado las alteraciones citogenéticas y mutaciones somáticas entre casos de SMD con diferentes grados de dismegacariopoyesis. Los pacientes con alto porcentaje de mMK han presentado una alta frecuencia de haploinsuficiencia del gen EZH2 (EZH2h), causada por su mutación o pérdida de su locus en el cromosoma 7, en coocurrencia con la mutación del gen RUNX1 (RUNX1m). Esta evidencia ha sido confirmada en una cohorte de validación, en la que las alteraciones genéticas se han estudiado integrando de varias técnicas de alta resolución y a nivel de célula única (single cell). Estudios transcriptómicos de casos EZH2h+RUNX1m han mostrado una regulación negativa de genes involucrados en la señalización de TNF-α a través de NF-κB, entre otros, algunos de los cuales se han validado mediante secuenciación de RNA de célula única y PCR cuantitativa. Finalmente, ensayos de validación usando un modelo de diferenciación de MK basado en una línea celular han mostrado que la pérdida de función de EZH2 puede reducir ligeramente la maduración de los MK y recapitular algunos aspectos del perfil de expresión génica previamente identificado. Los resultados de este trabajo sugieren que CXCR4 es una diana terapéutica prometedora en LDCBG, con IQS-036 siendo un candidato a fármaco con potente actividad antitumoral y perfil favorable de seguridad in vitro e in vivo, a pesar de una especificidad incompleta. Además, los casos de SMD con mMK están enriquecidos en la coocurrencia de dos eventos genéticos, la pérdida de función de los genes EZH2 y RUNX1, que podrían constituir un biomarcador de un subtipo específico de SMD con mal pronóstico.