[ca] La contínua propagació de la pesta porcina africana (PPA) a l'Europa continental després de la seva introducció a Georgia l'any 2007, així com l'expansió a Àsia a partir del 2018, posa en evidència la gran amenaça que aquesta malaltia representa per la indústria porcina arreu del món. La PPA és una malaltia hemorràgica porcina de declaració obligatòria a l'Organització Mundial de Sanitat Animal (OIE) que provoca enormes pèrdues econòmiques. L'agent causant, el virus de la pesta porcina africana (VPPA), és un virus embolcallat i amb simetria icosaèdrica, amb un genoma d'ADN de doble cadena d'unes 180 kpb. Actualment no es disposa de vacuna contra el VPPA. El sistema de control recomanat per la OIE es basa en un diagnòstic eficient, seguit pel sacrifici dels animals infectats o potencialment en contacte amb el virus, mesures poc assequibles en regions menys afavorides. El desenvolupament de vacunes contra la PPA es veu dificultat per la manca de coneixement sobre aspectes crítics de la infecció i la immunitat contra el VPPA. En aquest sentit, tot i que s'ha demostrat que els limfòcits T CD8+ juguen un paper clau en la resposta protectora contra el VPPA, els antígens del virus capaços d'induir respostes T CD8+ segueixen majoritàriament sense haver estat descrits. La identificació d'aquests antígens podria facilitar el disseny racional de vacunes, així com l'enteniment dels mecanismes subjacents a la immunitat contra el VPPA. Així doncs, l'objectiu principal de la present tesi era la caracterització de proteïnes del VPPA que continguessin epítops T CD8+ amb potencial protector contra la soca Georgia2007/1 del VPPA, actualment circulant per Europa i Àsia. S'han explorat diferents metodologies i estratègies amb l'objectiu d'identificar tant epítops T CD8+ com proteïnes enteres del VPPA codificant epítops T CD8+ promíscuament reconeguts i amb potencial protector. Per identificar epítops T CD8+ específics contra el VPPA, es va utilitzar una estratègia doble: i) una anàlisi bioinformàtica multiparamètrica emprant el proteoma de la soca Georgia2007/1 com a patró; i ii) un estudi immunopeptidòmic basat en l'anàlisi de pèptids units a les molècules de SLA I en macròfags alveolars porcins infectats in vitro amb VPPA. Els resultats obtinguts a partir d'assajos in vitro realitzats amb PBMCs de porcs recuperats de la infecció amb VPPA han permès definir els estudis immunopeptidòmics com a una estratègia més fiable que les prediccions in silico per a la identificació d'epítops T CD8+ del VPPA. Tal com s'esperava, els pèptids no van ser promíscuament reconeguts per PBMCs de tots els animals, confirmant la seva marcada restricció per al·lels específics de SLA I. Anàlisis posteriors utilitzant proteïnes completes van permetre la caracterització d'una sèrie d'antígens del VPPA capaços de ser reconeguts promíscuament. Així, mitjançant fibroblasts autòlegs transitòriament transfectats amb plasmidis codificant ORFs completes del VPPA fusionades a ubiquitina, per millorar la presentació antigènica per classe I, va permetre la identificació d'antígens del VPPA immunodominants i promíscuament reconeguts per cèl·lules T CD8+ específiques del VPPA. Finalment, experiments d'immunització amb ADN van permetre demostrar el potencial protector dels antígens identificats contra la infecció experimental amb una dosi letal de la soca Georgia2007/1 del VPPA. La protecció total contra el VPPA molt probablement requereixi un ampli repertori d'especificitats de cèl·lules B i T, i per tant caldrà seguir aprofundint en l'estudi d'antígens del VPPA amb potencial protector. Serà també necessari explorar plataformes d'expressió alternatives que permetin obtenir respostes immunitàries més robustes que les conferides per les vacunes d'ADN, una eina ideal per a la investigació bàsica però que resta lluny de ser òptima com a formulació vacunal final d'ús veterinari.

[en] The continuous spread of African swine fever (ASF) through Continental Europe after its introduction in Georgia in 2007, and its subsequent expansion in Asia from 2018, evidence this disease as a major threat to swine industry worldwide. ASF is a pig hemorrhagic disease of obligatory declaration to the World Organization for Animal Health (OIE) and causes enormous economic losses to the affected countries. The causative agent, African swine fever virus (ASFV), is a large, enveloped, icosahedral virus with a dsDNA genome of about 180 kbp in length. There is currently no commercial vaccine against ASFV. Early and efficient diagnosis followed by slaughtering of infected and in contact animals are the only control methods today recommended by the OIE, measures unfortunately not affordable by less favored regions. ASF vaccine development is largely hindered by lack of knowledge about critical aspects of ASFV infection and protective immunity. In this regard, CD8+ T lymphocytes have been widely shown to play a critical role in protective response against ASFV. However, the identity of the ASFV antigens capable of inducing protective CD8+ T-cell responses remains largely unknown. Identification of such protective antigens could lead to rationale vaccine design as well as better understanding the mechanisms underlying ASFV immunity. Therefore, the present thesis aimed to determine ASFV proteins containing CD8+ T-cell epitopes with potential to elicit protective responses against the Georgia2007/1 ASFV, the isolate currently circulating in Continental Europe and Asia. Different methodologies and strategies have been explored aiming to identify both ASFV-specific CD8+ T-cell epitopes and full-length proteins encoding promiscuously recognized CD8+ T-cell epitopes with protective potential. In order to identify ASFV-specific CD8+ T-cell epitopes, a double strategy was employed: i) a multiparametric bioinformatics analysis using the Georgia2007/1 proteome as template; and ii) an immunopeptidomic approach based on the analysis of SLA I-bound peptides found in porcine alveolar macrophages in vitro infected with ASFV. The results observed when evaluating the in vitro recognition of the peptides by ASFV-specific PBMCs obtained from ASF-recovered pigs, suggested immunopeptidomics analysis as a more reliable strategy than in silico predictions for the identification of ASFV CD8+ T-cell epitopes. As expected, peptides were not promiscuously recognized by PBMCs from all animals, confirming their marked restriction for specific SLA I alleles. Further analysis using full-length proteins allowed determining few ASFV antigens promiscuously recognized by ASFV-specific PBMCs. Thus, stimulation of ASFV-specific PBMCs with autologous fibroblasts transiently transfected with plasmids encoding full-length ASFV ORFs fused to ubiquitin to improve SLA I antigen presentation, led to the identification of four ASFV proteins as immunodominant and promiscuously recognized antigens by ASFV-specific CD8+ T cells. Finally, DNA immunization experiments allowed demonstrating the protective potential of the ASFV antigens here identified against the Georgia2007/1 ASFV challenge. Sterilizing protection against ASFV most likely will require a broad repertoire of B and T-cell specificities and thus, further investigations will be needed to determine other ASFV antigens eliciting protective responses. Likewise, it will most likely be indispensable the use of alternative expression platforms to encode the potential vaccine antigens, aiming to induce more solid immune response than that afforded by DNA vaccines, an ideal tool for antigen discovery but far from optimal for final veterinary vaccine formulations.