[en] The mechanism by which the nucleosome filament reaches different stages of compaction and finally forms the metaphase chromosome at the end of the cell cycle still remains one of the most challenging problems in the field of structural biology. The 30 nm fiber has been considered for many years the second level of compaction of chromatin, but most folding models based in fibres have been proposed from studies performed under very low ionic strength conditions. Our research group has conducted several studies about the internal structure of metaphase chromosome using microscopic techniques, which have allowed to observe a new folding element: the chromatin plate. The overall objective of this thesis is, first, to investigate the structure of chromatin during interphase under physiological ionic conditions and, second, to obtain high-resolution structural information of the chromatin plates observed in metaphase chromosomes. Chromatin structure from interphase nuclei under physiological conditions has been studied by transmission electron microscopy (TEM) and self-assembly capability of chromatin fragments from interphase nuclei has also been investigated. The internal structure of the metaphase chromosome has been studied using small angle synchrotron X-ray scattering (SAXS). Finally, ultrastructural information from metaphase chromatin has been obtained using cryo-electron tomography (cryo-ET). TEM results show that chromatin from interphase nuclei is formed by amorphous aggregates and plates. The analysis of chromatin structure from G1, S and G2 nuclei shows that plates are present along the entire interphase and its compaction increases along the cell cycle. In contrast to metaphase plates, interphase plates have smaller dimensions and lower stacking tendency. The lack of cohesion between interphase plates could be related to the increased accessibility of the DNA required for the transcription and replication processes. Experiments with interphase chromatin fragments show a clear self-assembly tendency to form laminar structures. By using fragments from G1, S and G2 phase nuclei, it was found that plates formed in early interphase are small and show lower compaction, whereas in the latter interphase plates have larger sizes and are more compact. The analysis of chromatin from metaphase chromosomes by cryo-ET allowed to see that in vitrified aqueous medium, in the absence of substrates and close to the metaphase ionic conditions, chromatin has a laminar structure. Analyzed chromatin plates have a thickness of about 10 nm, similar to the diameter of the nucleosome. Nucleosomes can be seen as individual units in unstructured plates, but in the compact ones only transverse lines corresponding to nucleosomal DNA are observed. The distance between these lines is about 5 nm; it is equivalent to the distance between the visible lines within individual nucleosomes in different orientations. These results suggest that the nucleosomes in the plates are irregularly arranged. It has often been observed that the plates can interact through their edges, forming cylindrical structures, or laterally, forming bilayers or multilayers. The thickness of two plates in contact is 16 nm, which is significantly lower than expected for two individual plates (20 nm). Consistent with previous observations, the results indicate that nucleosomes from both plates are interdigitated. In an interdigitated multilayered structure, nucleosomes may interact laterally. The distance between nucleosomes with lateral interaction is 6 nm. This is equivalent to the distance between stacked plates and is consistent with the dominant diffraction peak at 6 nm observed in SAXS experiments. These results reinforce the model of thin plates for the metaphase chromosome. The existence of plates in interphase suggests that, besides protecting the DNA, these laminar structures must participate in diverse functions of chromatin throughout the cell cycle.

[es] La forma en que el filamento de nucleosomas alcanza diversos estadios de compactación y acaba formando el cromosoma metafásico al final del ciclo celular sigue siendo uno de los problemas más difíciles de resolver en el campo de la biología estructural. La fibra de 30 nm ha sido considerada durante mucho tiempo el segundo nivel de plegamiento de la cromatina, pero la mayoría de los modelos de plegamiento basados en fibras han sido propuestos a partir de estudios realizados en condiciones de muy baja fuerza iónica. Nuestro grupo de investigación ha realizado diversos estudios acerca de la estructura interna del cromosoma metafásico empleando diversas técnicas microscópicas, que han permitido observar un nuevo elemento de plegamiento: la placa de cromatina. El objetivo general de esta tesis es, por un lado, investigar la estructura de la cromatina durante la interfase en condiciones iónicas fisiólogicas y, por otro lado, obtener información estructural de alta resolución de las placas de cromatina observadas en cromosomas metafásicos. En primer lugar, se ha realizado un estudio de la estructura de la cromatina procedente de núcleos bajo condiciones iónicas propias de la interfase mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y se ha evaluado la capacidad autoasociativa de fragmentos de cromatina procedentes de núcleos interfásicos. En segundo lugar, se ha estudiado la estructura interna del cromosoma metafásico mediante la técnica de dispersión de rayos X de sincrotrón a bajo ángulo (SAXS). Por último, se ha obtenido información ultraestructural de la cromatina metafásica empleando la técnica de crio-tomografía electrónica (crio-ET). Los resultados de TEM muestran que la cromatina emanada de núcleos interfásicos presenta agregados amorfos y placas. El análisis de la estructura en las fases G1, S y G2 indica que las placas están presentes a lo largo de toda la interfase y que su compactación aumenta a medida que el ciclo celular avanza. En comparación con las placas metafásicas, las interfásicas son de dimensiones más reducidas y presentan menor tendencia al apilamiento. La falta de cohesión entre placas podría estar relacionada con el aumento de accesibilidad del DNA que se requiere durante los procesos de transcripción y replicación. Los experimentos realizados con fragmentos de cromatina interfásica indican una clara tendencia a autoasociarse para formar estructuras laminares. Al utilizar fragmentos procedentes de núcleos en fase G1, S y G2 se observa que las placas formadas en la interfase temprana son pequeñas y laxas, mientras que las placas en la interfase tardía presentan tamaños mayores y son más compactas. El análisis mediante crio-TE de la cromatina procedente de cromosomas metafásicos ha permitido observar que, en medio acuoso vitrificado, en ausencia de sustratos y en condiciones iónicas próximas a la metafase, la cromatina presenta una estructura laminar. Las placas de cromatina analizadas presentan un grosor de unos 10 nm, similar al diámetro del nucleosoma. En las placas desestructuradas pueden visualizarse nucleosomas como entidades individuales, pero en las placas compactas únicamente se observan líneas transversales que corresponden al DNA nucleosomal. La distancia entre estas líneas es de unos 5 nm, y es equivalente a la distancia entre las líneas visibles en el interior de nucleosomas individuales con diversas orientaciones. Estos resultados sugieren que los nucleosomas en las placas se disponen irregularmente. Frecuentemente, se ha observado que las placas pueden interaccionar a través de sus bordes, formando estructuras cilíndricas, o lateralmente, formando bicapas o multicapas. El grosor de dos placas en contacto es de 16 nm, que es significativamente menor que el grosor esperado para dos placas individuales (20 nm). De acuerdo con observaciones anteriores, estos resultados indican que los nucleosomas de ambas placas se interdigitan. En una estructura multilaminar interdigitada, los nucleosomas pueden interaccionar lateralmente. La distancia entre nucleosomas con interacción lateral es de 6 nm; equivalente a la distancia entre placas apiladas y que coincide con la difracción dominante a 6 nm observada en los experimentos de SAXS en condiciones iónicas metafásicas. Los resultados obtenidos refuerzan el modelo de las placas finas de cromatina para el cromosoma metafásico. La existencia de placas en interfase sugiere que, además de proteger el DNA, estas estructuras laminares deben participar en las diversas funciones de la cromatina a lo largo del ciclo celular.