[ca] La leucèmia limfocítica crònica (LLC) és una malaltia incurable causada per l'expansió de cèl·lules B madures CD5+ en sang perifèrica (SP), ganglis limfàtics (GL) i medul·la òssia. És la leucèmia d'adults més freqüent als països occidentals i és genèticament i clínicament molt heterogènia. Malgrat la intensiva investigació realitzada, els mecanismes moleculars causants del desenvolupament i evolució de la LLC no estan clarament identificats. És més, el rol dels factors de transcripció en la patogènesi de la LLC roman molt poc entès. En aquest context, LEF1 és un factor de transcripció expressat de novo en totes les fases de la malaltia, des de condiciones premalignes a variants més agressives, i el seu motiu d'unió és present als elements reguladors que s'activen en la LLC. LEF1 s'expressa en les cèl·lules de pacient, però es perd en línies cel·lulars o models de ratolí de LLC. Per això, l'objectiu principal d'aquesta tesi doctoral era desenvolupar models que permetin realitzar estudis funcionals in vitro amb cèl·lules primàries de LLC, i aplicar aquesta metodologia per elucidar el rol oncogènic de LEF1 en la patogènesi de la LLC. A l'Estudi 1, vaig caracteritzar els efectes d'un nou sistema de cultiu in vitro, basat en cèl·lules estromals d'origen murí que expressen CD40L humà i secreten BAFF i IL-21 humans, en cèl·lules de LLC de pacients. Amb aquest sistema, les cèl·lules de LLC van adquirir un fenotip i transcriptoma d'activació i proliferació, semblant al de les cèl·lules de LLC obtingudes del GL. A més a més, aquest sistema va mantenir les cèl·lules primàries de LLC amb bona viabilitat durant més temps en cultiu. Això va permetre el desenvolupament de tècniques de biologia molecular, com el mètode d'edició gènica CRISPR-Cas9 per electroporació, per reduir l'expressió de gens diana en cèl·lules de pacients de LLC i també del limfoma de cèl·lules del mantell, una malaltia semblant a la LLC. A l'Estudi 2, vaig aplicar aquests avenços per desxifrar el rol de LEF1 a l'inici i evolució de la LLC. A partir d'anàlisis funcionals integrals en mostres de LLC de pacients, vaig descobrir que LEF1 pot induir quiescència i proliferació a les cèl·lules de LLC, segons el context de la malaltia. La funció de LEF1 es controla per un mecanisme dual: abundància de la proteïna i splicing alternatiu. Nivells baixos de la proteïna contribueixen a una fase estable de la malaltia, regulant l'expressió de gens relacionats amb supervivència cel·lular, adhesió/migració i activació dels limfòcits. Quan la proteïna de LEF1 augmenta, afegeix un impuls proliferatiu a les cèl·lules de LLC ja que regula, addicionalment, l'expressió de gens involucrats en la progressió del cicle cel·lular i proliferació. Interessantment, vaig trobar que els nivells de proteïna de LEF1 són més elevats en les mostres de U-CLL, el subtipus més agressiu de la malaltia, per un mecanisme de més estabilitat de la proteïna. En paral·lel, en resposta a estímuls proliferatius del microambient tumoral en el GL, les cèl·lules de LLC canvien l'expressió de les isoformes de LEF1, promovent l'exclusió de l'exó 6. Vaig identificar que la inclusió de l'exó 6 té lloc a SP i promou un perfil transcripcional quiescent, mentre que l'exclusió de l'exó 6 en les isoformes de LEF1 predomina en les cèl·lules que estan activament proliferant i indueix la progressió del cicle cel·lular. En definitiva, aquesta tesi doctoral aporta detalls importants sobre el rol de LEF1 en la patogènesi de LLC. Donat que LEF1 regula la supervivencia i proliferación de les cèl·lules de LLC, podria representar una diana terapèutica atraciva per tot l'espectre de LLC.

[es] La leucemia linfocítica crónica (LLC) es una enfermedad incurable causada por la expansión de células B maduras CD5+ en sangre periférica (SP), ganglios linfáticos (GL) y medula ósea. La LLC es la leucemia de adultos más frecuente en los países occidentales y es genéticamente y clínicamente muy heterogénea. A pesar de una intensiva investigación, los mecanismos moleculares causantes del desarrollo y evolución de la LLC no están claramente identificados. Además, el rol de los factores de transcripción en la patogénesis de la LLC está muy poco entendido. En este contexto, LEF1 es un factor de transcripción expresado de novo en todas las fases de la enfermedad, desde condiciones premalignas a variantes más agresivas, y su motivo de unión está presente en elementos reguladores que se activan en la LLC. LEF1 se expresa en las células de pacientes, mientras que se pierde en líneas celulares o modelos murinos de LLC. Por ello, el objetivo principal de esta tesis doctoral era desarrollar modelos que permitieran realizar estudios funcionales in vitro con células primarias de LLC, y aplicar esta metodología para elucidar el rol oncogénico de LEF1 en la patogénesis de la LLC. En el Estudio 1, caractericé los efectos de un nuevo sistema de cultivo in vitro, basado en células estromales de origen murino, que expresan CD40L humano y secretan BAFF y IL-21 humanos, en células de LLC de pacientes. Con este sistema, las células de LLC adquirieron un fenotipo y transcriptoma de activación y proliferación, similares a las células de LLC obtenidas de GL. Además, este sistema mantuvo las células primarias de LLC con buena viabilidad durante más tiempo en cultivo. Esto permitió el desarrollo de técnicas de biología molecular, como el método de edición génica CRISPR-Cas9 por electroporación, que fue optimizado para reducir la expresión de genes diana en células derivadas de paciente de LLC y también de linfoma de células del manto, una enfermedad parecida a la LLC. En el Estudio 2, apliqué todos estos avances funcionales para descifrar el rol de LEF1 en el inicio y desarrollo de la LLC. A través de análisis funcionales integrales en muestras de LLC de pacientes, descubrí que LEF1 puede inducir quiescencia y proliferación en LLC, según el contexto de la enfermedad. La función de LEF1 se controla por un mecanismo dual: abundancia de proteína y splicing alternativo. Bajos niveles de proteína contribuyen a una fase estable de la enfermedad, regulando la expresión de genes relacionados con supervivencia celular, adhesión/migración y activación de linfocitos. Cuando la proteína de LEF1 aumenta, añade un empuje proliferativo a las células de LLC ya que regula, además, la expresión de genes involucrados en la progresión del ciclo celular y proliferación. Interesantemente, encontré que los niveles de proteína LEF1 son más elevados en las muestras de U-CLL, el subtipo más agresivo de la enfermedad, por un mecanismo de mayor estabilidad de la proteína. En paralelo, en respuesta a estímulos proliferativos del microambiente tumoral en el GL, las células de LLC cambian la expresión de las isoformas de LEF1, promoviendo la exclusión del exón 6. Identifiqué que la inclusión del exón 6 ocurre, principalmente, en las células de SP y promueve un perfil transcripcional quiescente, mientras que la exclusión del exón 6 en las isoformas de LEF1 predomina en células que están activamente proliferando e induce progresión del ciclo celular. En definitiva, esta tesis doctoral aporta detalles importantes sobre el rol de LEF1 en la patogénesis de la LLC. Puesto que LEF1 regula la supervivencia y proliferación de las células de LLC, podría representar una diana terapéutica atractiva para todo el espectro de LLC.