[en] Transient gene expression (TGE) has gained interest for the manufacturing of biologics in recent years. The increasing demand in gene therapy vectors and the raise in tailored medicine require continuous improvements to cope with these growing needs. Nevertheless, the industrial implementation of TGE is vastly hindered due to the cell density effect (CDE). This cellular phenomenon poses serious limitations on the optimal cell density for an efficient TGE, thereby reducing the volumetric productivity of the bioprocess. Thus, the commercial exploitation of many TGE-based biopharmaceuticals is severely restricted, if not unfeasible. This PhD thesis explores the cell biology mechanisms underlying the CDE upon the production of human immunodeficiency virus (HIV-1) virus-like particles (VLPs) in HEK293 cells using polyethyleneimine (PEI)-based transfection. These VLPs are viral-derived nanostructures devoid of any genetic material that may initiate an infectious cycle. In the first chapter, the relationship between extracellular vesicles (EVs) and the CDE was studied. Initial observations proved the disruption of DNA/PEI polyplexes in EV-saturated cell culture media. Also, polyplexes remained trapped in intracellular endosomes at high cell densities (HCD), preventing successful transfection. Transfection efficiency could be restored when EVs were depleted from the exhausted media. Finally, overexpression of the UDP-glucose ceramide glucosyltransferase (UGCG) alleviated intracellular polyplex sequestration and enhanced transfection efficiency. The second chapter of this thesis was focused on the study of the cellular mechanics that disrupted DNA/PEI polyplex stability at HCD. Moreover, an investigation upon polyplex uptake pathways was undertaken, resulting in a characterization of the PEI-based transfection mechanism. Elemental analysis of polyplexes incubated in exhausted media revealed a substantial increase in their ionic strength. Additionally, sulfur was adsorbed in these conditions, suggesting the accumulation of sulfur-containing molecules in the extracellular media. The elevated ionic strength resulted in polyplex aggregation, hindering efficient cell transfection. Elucidation of the transfection mechanisms was achieved through the inhibition and labeling of specific cell-surface proteoglycans (PGs). Polyplex uptake seemed to be initiated by a coalescence phenomenon of heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) like Glypican – 4 (GPC-4) around the entry points. In the third chapter, a transcriptomic study upon HEK293 cell cultures was conducted. The experimental set-up allowed a comparison between conditions under diverse media replacement (MRs) regimes, at two distinct cell densities. The transfection restorative effects exhibited by the EV-depleted media were most likely attributed to changes in the physicochemical nature of the media. Likewise, nucleocytoplasmic transport was shut down and histone production was enhanced under EV-depleted regime. Subsequent proteomic identification of the EV-depleted media revealed that cells underwent an infection-like state that stimulated virion release pathways. Finally, extracellular matrix accumulation was hypothesized to be a key factor in the CDE. The last chapter was focused on product characterization, aiming to stablish a routinary assessment of critical quality attributes (CQAs). VLPs derived from batch transfection and extended gene expression (EGE) productions were isolated and subjected to a series of characterization techniques. Moreover, the impact of specific productivity upon CQAs was also studied by gene silencing strategies. Differences in the biophysical properties of produced nanoparticles were envisioned with the employed pipeline.

[es] La expresión génica transitoria (TGE) ha ganado interés para la fabricación de productos biológicos en los últimos años. La creciente demanda de vectores de terapia génica y el aumento de la medicina personalizada requieren mejoras continuas en este tipo de procesos para hacer frente a estas necesidades crecientes. Sin embargo, la implementación industrial de la TGE se ve obstaculizada por el cell density effect (CDE). Este fenómeno celular plantea serias limitaciones en la densidad celular óptima para una TGE eficiente, reduciendo así la productividad volumétrica del bioproceso. Por lo tanto, la comercialización de muchos productos biofarmacéuticos basados en TGE está restringida, siendo inviable en muchos casos. Esta tesis doctoral explora los mecanismos celulares subyacentes al CDE durante la producción de partículas similares a virus (VLPs) del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1) en células HEK293 utilizando transfección basada en polietilenimina (PEI). Estas VLPs son nanoestructuras derivadas de virus que carecen de cualquier material genético que pueda iniciar un ciclo infeccioso. En el primer capítulo, se estudió la relación entre las vesículas extracelulares (EVs) y el CDE. Se demostró la disrupción de los complejos DNA/PEI en medios de cultivo celulares saturados de EVs. Además, los complejos permanecieron atrapados en endosomas intracelulares a altas densidades celulares (HCD), impidiendo una transfección exitosa. La eficiencia de transfección pudo restaurarse cuando se eliminaban las EVs del medio gastado. Finalmente, la sobreexpresión de la UDP-glucosa ceramida glucosil-transferasa (UGCG) alivió el secuestro intracelular de los complejos y mejoró la eficiencia de transfección. El segundo capítulo de esta tesis se centró en el estudio de la mecánica celular que interrumpía la estabilidad de los complejos DNA/PEI en HCD. Se llevó a cabo una investigación sobre las vías de absorción de los complejos, resultando en una caracterización del mecanismo de transfección basado en PEI. El análisis elemental de los complejos incubados en medio gastado reveló un aumento sustancial en su fuerza iónica. Además, se adsorbió azufre en estas condiciones, lo que sugiere la acumulación de moléculas que contienen azufre en el medio extracelular. La elevada fuerza iónica resultó en la agregación de los complejos. La elucidación de los mecanismos de transfección se logró mediante la inhibición y el marcaje de proteoglicanos (PGs) específicos de la superficie celular. La absorción de los complejos parecía iniciarse por un fenómeno de coalescencia de proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPGs) como Glypican – 4 (GPC-4), alrededor de los puntos de entrada. En el tercer capítulo, se realizó un estudio transcriptómico en cultivos de células HEK293. El diseño experimental permitió una comparación entre condiciones de recambio de medio (MRs), a dos densidades celulares distintas. Los efectos restaurativos de la transfección exhibidos por el medio deplecionado de EVs probablemente se atribuían a cambios en la naturaleza fisicoquímica del propio medio. El transporte núcleo-citoplásmico se detuvo y la producción de histonas se incrementó cuando se usaba el medio deplecionado de EVs. La posterior identificación proteómica del medio deplecionado de EVs reveló que las células experimentaban un estado similar a una infección que estimulaba las vías de liberación de viriones. Finalmente, se hipotetizó que la acumulación de la matriz extracelular era un factor clave en el CDE. El último capítulo se centró en la caracterización del producto, con el objetivo de establecer una evaluación rutinaria de los atributos críticos de calidad (CQAs). Las VLPs derivadas de la transfección por lotes y las producciones de expresión génica extendida (EGE) se sometieron a una serie de técnicas de caracterización. El impacto de la productividad específica en los CQAs también se estudió mediante estrategias de silenciamiento génico. Se vislumbraron diferencias en las propiedades biofísicas de las nanopartículas con la metodología empleada.