[en] The results presented in this thesis are divided in two chapters depending on the enzymes studied: chitin deacetylases and glycosynthases. Chitin de-N-acetylases (CDAs) are a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of the acetamido groups of GlcNAc residues of chitin, chitosan, and chitin oligosaccharides (COS). CDAs belong to the family 4 of carbohydrate esterases (CE4), which also includes acetylxylan esterases and peptidoglycan deacetylases. Chitosans are a family of polysaccharides of N-acetyl-glucosamine and glucosamine. COS and their partially deacetylated derivatives (paCOS) have proven to be bioactive molecules in a broad variety of applications such as antimicrobials, immunostimulants, nanoformulations for drug and gene delivery, plant growth promoters, wound healing activity, etc. Most of the biological activities associated with paCOS seem to be largely dependent not only on the degree of polymerization (DP) and degree of acetylation (DA), but also on the specific acetylation pattern (PA). This structure-function relationship highlights the key role of the CDAS. The objectives of this thesis comprises the studies of structure-function relationships in the frame of the Subsite Capping Model. The presence of several loops surrounding the active site, which vary in size and structure depending on the CDA, define the accessible binding subsites of the catalytic cleft and seem to be responsible of defining the deacetylation pattern. In this thesis it is reported the validation of an analytical HPLC-MS methodology for CDA activity monitoring, the experimental demonstration of the Subsite Capping Model using the Vibrio cholerae chitin oligosaccharide deacetylase as reference and the results of the rational engineering of loops for the modulation of substrate specificity. Several generations of mutants were studied resulting in a greatly optimized enzyme. The other chapter is the work developed with glycosynthases, these enzymes have become efficient tools for the enzymatic synthesis of oligosaccharides, glycoconjugates and polysaccharides. They derive from retaining glycosidases in which the hydrolase activity has been abolished by mutation of the catalytic nucleophile but efficiently catalyse transglycosylation reactions when using activated glycosyl fluoride donors with the opposite anomeric configuration than the substrate in the parental hydrolase enzyme. Improving the performance of current (and new to come) glycosynthases and engineering specificity for non-natural substrates is being addressed by enzyme directed evolution. These approaches largely depend on efficient high throughput screening methods. In this work it is presented a general screening assay independent of the enzyme specificity for the screening of glycosynthase libraries based on a fluoride fluorescent chemosensor that transduces glycosynthase activity into fluorescence. This work describes the development and validation of the assay and its application to a nucleophile saturation mutant library of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase, In addition, a new and surprising mutant was found and furtherly characterized, the E134D mutant. This new glycosynthase provides mechanistic insights on the role of neighbouring residues in the glycosynthase catalytic reaction.

[es] Los resultados presentados en esta tesis están divididos en dos capítulos en función de los enzimas estudiados: quitina desacetilasas y glicosintasas. Las de-N-acetilasas de quitina (CDAs) son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de los grupos acetamido de los residuos GlcNAc de quitina, quitosano y oligosacáridos de quitina (COS). Las CDAs pertenecen a la familia 4 de las esterasas de carbohidratos (CE4), la cual también incluye esterasas de acetilxilano y desacetilasas de petidoglucano. Los quitosanos son polisacáridos de N-acetil-glucosamina y glucosamina. Los COS y derivados parcialmente desacetilados (paCOS) han demostrado ser moléculas bioactivas en un amplio rango de aplicaciones como pueden ser antimicrobianos, inmunoestimulantes, nano formulaciones para drug o gene delivery, promotores de crecimiento vegetal, promotores de la cicatrización de heridas, etc. La mayoría de las actividades biológicas asociadas a los paCOS parecen depender no solo del grado de polimerización (DP) y de acetilación (DA), sino también del patrón de acetilación (PA). Esta relación estructura función remarca el rol crucial de las CDAs. Los objetivos de esta tesis comprenden los estudios de la relación estructura-función dentro del marco del Subsite Capping Model. La presencia de varios loops rodeando el sitio activo, los cuales varían en tamaño y estructura en función de la CDA, definen los subsitios accesibles en el surco catalítico y, a su vez, también son responsables de definir el patrón de desacetilación. En esta tesis se reporta la validación de una metodología analítica HPLC-MS para la monitorización de la actividad de CDAs, la demostración experimental del Subsite Capping Model usando la desacetilasa de quitooligosacáridos de Vibrio cholerae y los resultados del diseño racional de los loops para la modulación de la especificidad de sustrato. Varias generaciones de mutantes fueron estudiadas obteniéndose como resultado un enzima altamente optimizado. El otro capítulo incluye el trabajo realizado en el campo de las glicosintasas. Estas enzimas se han convertido en unas eficientes herramientas para la síntesis de oligosacáridos, glicoconjugados y polisacáridos. Se derivan de glicosidasas con retención de conformación anomérica en las que la actividad hidrolítica ha sido abolida por la mutación del nucleófilo catalítico pero que catalizan eficientemente reacciones de transglicosilación cuando se les proporcionan donadores activados con fluoruro con la configuración anomérica opuesta a la del sustrato del enzima hidrolítico parental. Mejorar el rendimiento de las glicosintasas actuales (y futuras) y la ingeniería de la especificidad por sustratos artificiales están siendo afrontadas por metodologías de evolución dirigida. Estas aproximaciones dependen en gran medida de métodos de alta eficiencia de cribado. En este trabajo se presenta un método de cribado independiente de la especificidad del enzima para el cribado de bibliotecas de glicosintasas basado en un quimiosensor fluorescente de fluoruro capaz de transducir la actividad glicosintasa a fluorescencia. Se describe el desarrollo y validación del ensayo así como su aplicación a una biblioteca de saturación del residuo nucleófilo en la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis. Además, se encuentra un nuevo y sorprendente mutante que es posteriormente caracterizado, el mutante E134D. Esta nueva glicosintasa proporciona conocimiento mecanistico sobre el rol de los residuos adyacentes en la reacción catalítica de las glicosintasas.