[en] Finding new fluorescent organic nanoparticles (FONs) with the potential to overcome the limits of common fluorescent probes as molecular fluorophores, fluorescent proteins and inorganic nanoparticles is a subject of strong interest for materials scientists developing new probes for fluorescence microscopy and theranostics. In the recent years, innovative non-liposomal nanovesicles, based on the self-assembly of quaternary ammonium surfactants and sterols, named Quatsomes (QSs), have been developed as promising candidates for applications as multifunctional drug carriers. Within this scenario, the main objective of this Thesis (conducted in the framework of the Marie Skłodowska-Curie ITN "Nano2Fun") is to explore the possibility of using Quatsomes as a vehicle for nanostructuring in aqueous media several dye molecules, irrespective of their physicochemical and optical properties, in order to obtain new fluorescent organic nanoparticles (FONs) with superior colloidal stability and enhanced fluorescent features, especially with high brightness, in relation to single molecule flurofores and other type of FONS. The self-assembly of molecular organic fluorophores, sterols and quaternary ammonium surfactants into fluorescent Quatsomes was achieved by the DELOS-SUSP method, a compressed CO2 –based process which guarantees a highly homogeneous membrane composition and supramolecular arrangement, which have impact on the optical properties of the obtained FONs. Different strategies have been explored to nanostructurate in aqueous media, by mean of QSs, molecular dyes with different physicochemical properties, including those water- and non-water soluble, analyzing the impact of their nanostructuration on the optical properties of the obtained FONs. Thus, anionic water-soluble dyes, such as fluorescein, were nanostructured over QSs surface, taking advantage of anionic/cationic interaction among dye and vesicles surface. On the other hand, lipophilic and non-water soluble dyes modified with long alkyl chains can be stably incorporated into QSs membrane, as shown in the case of several dyes families, including cyanine, diketopyroolopyrrole (DPPs) and fluorene derivatives. The fluorescent QSs showed superior colloidal and optical stability (up to several months), a high degree of structural homogeneity and high fluorescence performances, overcoming those of other nanostructures of the same dyes. Furthermore, aiming to obtain multicolor nanoparticles, Quatsomes allowed the simultaneous loading within their membrane of different dyes, which showed a highly efficient fluorescence resonance energy transfer (FRET) mechanism, an interesting tool for monitoring the carrier integrity during the drug delivery and for multiplexed imaging applications. Finally, fluorescent Quatsomes were tested as nanoprobes for in vitro cells imaging. It has been demonstrated that fluorene-based Quatsomes (named LysoQS) constitute a strongly specific lysosomal probe ideal for long-term imaging. Furthermore, cyanines-loaded Quatsomes were used as probes for super-resolution microscopy technique (STORM) which allowed visualizing and resolving single Quatsomes structures upon internalization in cells. The results of this Thesis showed that fluorescent Quatsomes, thanks to the advantages offered in comparison with other commonly employed fluorescent labels, constitute a promising fluorescent nanoprobes with possible future applications in bioimaging, theranostics and, generally, nanomedicine.

[es] El estudio de nuevas nanopartículas orgánicas fluorescentes (FONs) que puedan superar los límites de las comunes sondas fluorescentes como fluoróforos moleculares, proteínas fluorescentes y nanopartículas inorgánicas es un tema de gran interés para los científicos de materiales que desarrollan nuevas sondas para microscopía de fluorescencia y teranóstica. En los últimos años, se han desarrollado nuevas nanovesículas no liposómicas, basadas en el autoensamblaje de tensioactivos y esteroles, denominados Quatsomes (QSs), que constituyen unos prometedores vehículos de fármacos multifuncionales. Dentro de este escenario, el objetivo principal de esta Tesis (realizada en el marco del proyecto Marie Skłodowska-Curie ITN "Nano2Fun") es explorar la posibilidad de utilizar los Quatsomes como vehículos para la nano-estructuración en medios acuosos de varias moléculas fluorescentes, independientemente de sus propiedades físico-químicas y ópticas, con el fin de obtener nuevas nanopartículas orgánicas fluorescentes (FONs) con elevada estabilidad coloidal y características fluorescentes optimales, especialmente en relación al brillo. El auto-ensamblaje de fluoróforos orgánicos moleculares, esteroles y tensioactivos de amonio cuaternario en Quatsomes fluorescentes se logró mediante el método DELOS-SUSP, un proceso a base de CO2 comprimido, que garantiza una composición de membrana y una disposición supramolecular altamente homogéneas y, como consecuencia, nanovesículas con elevadas propiedades ópticas. Se han explorado diferentes estrategias para la nano-estructuración en medios acuosos, por medio de QSs, de moléculas fluorescentes con diferentes propiedades fisicoquímicas, incluyendo aquellas solubles y no solubles en agua, analizando el impacto de la nano-estructuración sobre las propiedades ópticas de las FONs obtenidas. De esta manera, los fluoroforos aniónicos solubles en agua, como la fluoresceína, fueron nano-estructurados encima de los QSs. Por otra parte, los fluoróforos lipófilos y no solubles en agua, modificados con largas cadenas alquílicas pueden incorporarse de forma estable en la membrana de los QSs, como se muestra en el caso de varias familias de colorantes, por ejemplo, las cianinas, los diketopirrolopirroles (DPP) y los derivados del fluorene. Los QSs fluorescentes mostraron una estabilidad óptica coloidal excepcional (hasta varios meses), un alto grado de homogeneidad estructural y altas eficiencias de fluorescencia, mostrando mejores prestaciones en comparación con otras nanoestructuras de los mismos fluoroforos. Además, con el objetivo de obtener nanopartículas multicolores, los Quatsomes permitieron cargar simultáneamente diferentes fluoroforos dentro de sus membranas, mostrando un mecanismo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) altamente eficiente, una interesante herramienta para monitorear la integridad del carrier durante la administración del fármaco y para la adquisición de imágenes multicolores. En conclusión, los Quatsomes fluorescentes se probaron como nano-sondas para la obtención de imágenes de células in vitro. Se ha demostrado que los Quatsomes que incorporan derivados del fluorene (denominados LysoQS) constituyen una sonda lisosómica altamente específica, ideal para la adquisición de imágenes en tiempos largos. Además, los Quatsomes cargados de cianinas se utilizaron como sondas para técnicas de microscopía superresolución (STORM), que permitió la visualización y resolución de Quatsomes individuales tras la internalización en las células. Los resultados de esta tesis muestran que los Quatsomes fluorescentes, gracias a las ventajas ofrecidas en comparación con otros marcadores fluorescentes comúnmente empleados, son unas nanosondas altamente prometedoras, con posibles aplicaciones futuras en bioimagen, teragnostica y, en general, nanomedicina.