[en] Dent's disease type 1 is a rare inherited disorder characterized by low molecular weight proteinuria (LMWP), hypercalciuria and nephrocalcinosis that progresses to end-stage renal disease. This disease is caused by mutations in the CLCN5 gene, that codifies for CLC-5, a Cl- channel which is mainly expressed in the proximal tubule of renal cells. At present, there are no specific treatments nor active clinical trials for this disease, thus, the current approach is supportive care. CLCN5 mutations cause impaired trafficking of apical receptors and transporters that leads to compromised endocytosis. Although the primary effect of these mutations is known, their impact on other cellular functions within the proximal tubule remains unclear and might have a relevant consequence on renal function. Therefore, in this work, we proposed that the discovery of altered gene networks and cellular processes associated with the CLCN5 mutations should provide relevant information on the pathophysiology of Dent's disease at the tubular level. In order to identify the impact of CLCN5 on the renal proximal tubule, we generated cell lines derived from human proximal tubule (RPTEC/TERT y HK-2) carrying CLCN5 silencing or p.I524K, p.E527D y p.V523del mutations. Once the cellular models were established, we evaluated the expression of endogenous and exogenous CLCN5 at mRNA level, as well as protein level expression, subcellular localization, glycosylation state and half-life of CLC-5 WT and the different mutants. Moreover, we also analyzed the endocytic capacity of each one of them. Once the cellular models were validated, we evaluated the impact of CLCN5 silencing and mutations at the gene expression level through microarray analysis in the RPTEC cell line. The results obtained indicated that CLCN5 silencing alters molecular functions related to protein binding, anion binding, binding to signaling receptors, and biological processes such as cellular differentiation and regulation of cellular communication. It resulted interesting to notice that the reintroduction of the CLCN5 gene (in pre-silenced cells) recovered the expression of 381 genes. By comparing the expression pattern among the CLCN5 WT form and the different mutations, we identified that the p.V523del mutation exhibited a more forceful impact on gene expression in the RPTEC/TERT cellular model. The changes in gene expression induced by this mutation were related to biological processes such as cell cycle, morphogenesis and the development of renal tubule. In this work, we have also identified new protein interactions associated with CLC-5 WT and the different mutations. The identification of these novel interactions of CLC-5 could shed light on the exact role of CLC-5 in the proximal tubule. The results of this thesis have provided important insights into the underlying mechanisms of Dent's disease and are useful for the discovery of new therapeutic targets to prevent disease progression and end-stage renal failure. Eventually, our results could be also applied to other renal diseases related to Fanconi syndrome.

[es] La enfermedad de Dent de tipo 1 es un trastorno hereditario poco frecuente caracterizado por proteinuria de bajo peso molecular (PBPM), hipercalciuria y nefrocalcinosis que progresa a enfermedad renal terminal. Es una enfermedad provocada por mutaciones en el gen CLCN5 que codifica para el canal de cloro ClC-5, el cual está expresado principalmente en el túbulo proximal. En la actualidad, no existen tratamientos específicos ni ensayos clínicos activos y el cuidado es de soporte para esta enfermedad. Mutaciones en el gen CLCN5 provocan un defecto en el tráfico en los receptores y transportadores apicales y como consecuencia, se compromete el proceso de endocitosis. A pesar de que se conoce el efecto primario de estas mutaciones, se desconoce el efecto de las mismas sobre otras funciones propias de las células del túbulo proximal que, de forma secundaria, podrían tener un impacto sobre la función tubular y, en consecuencia, en la función renal. Postulamos que el descubrimiento de redes génicas y procesos celulares que puedan alterarse como consecuencia de mutaciones en el gen CLCN5 deberían proveer información relevante sobre la fisiopatologia de la enfermedad de Dent a nivel tubular. Con el fin de identificar el impacto del silenciamiento y de determinadas mutaciones en el gen CLCN5 sobre procesos, todavía por identificar, en las células del túbulo proximal renal, generamos líneas celulares derivadas del túbulo proximal humano (RPTEC/TERT y HK-2) con el gen CLCN5 silenciado o portadoras de las mutaciones p.I524K, p.E527D y p.V523del en CLCN5. En los modelos celulares obtenidos tras el silenciamiento y re-expresión de las formas WT y mutadas de CLCN5, evaluamos los niveles de expresión del gen CLCN5 endógeno y exógeno a nivel de mRNA, y los niveles de expresión, localización sub-celular, estado de glicosilación y vida media de la proteína CLC-5 WT y de las diferentes formas mutadas, así como la capacidad endocítica de cada una de las líneas. Una vez validados los modelos celulares, se estudió el impacto producido por el silenciamiento de CLCN5 y de las distintas mutaciones en el perfil de expresión génica de las células RPTEC mediante ensayos de microarrays. Los resultados obtenidos indican que el silenciamiento de CLCN5 altera funciones moleculares relacionadas con la unión a proteínas, la unión a aniones, la unión a receptores de señalización, y procesos biológicos tales como la diferenciación celular y la regulación de la comunicación celular. Fue muy interesante observar que la reintroducción del gen CLC-5 WT en las células previamente silenciadas revertía con signo distinto la expresión de 381 genes previamente modificados por el silenciamiento de CLCN5. La comparación del patrón de expresión de las distintas mutaciones entre ellas y con la forma WT reveló el gran impacto producido por la mutación p.V523del en el modelo celular RPTEC/TERT. Los cambios en la expresión génica inducidos por este mutante se relacionan con procesos biológicos tales como el ciclo celular, la morfogénesis y el desarrollo del túbulo renal. En este trabajo hemos identificado nuevas interacciones proteicas asociadas a la forma WT o a las distintas mutaciones de CLCN5. La identificación de nuevas interacciones de CLC-5 con proteínas cuya función es conocida puede ayudar a esclarecer en gran medida el papel exacto de CLC-5 en las células del túbulo proximal. Los resultados de esta tesis han aportado nueva información sobre los mecanismos que subyacen a la enfermedad de Dent y deberían ser de utilidad para el descubrimiento de dianas y soluciones terapéuticas capaces de prevenir la progresión de la enfermedad y el fallo renal terminal para esta enfermedad y, eventualmente, para otras enfermedades relacionadas con el síndrome de Fanconi.