[en] Microalgae are photosynthetic microorganisms with a great ability of adapting to adverse conditions, developing regulation mechanisms to maintain optimal carbon/nitrogen ratios in the cell for survival. When these microorganisms are submitted to environmental stress conditions, the carbon initially devoted to the synthesis of structures is deviated towards the production of storage compounds. This doctoral thesis is framed within the response of the microalga Chlamydomonas reinhardtii to the absence of nitrogen in the culture medium. Under this nutrient deficiency, the assimilated carbon is relocated to the synthesis of the main reserve compounds: triacylglycerols (TAG) and starch. These compounds are of high interest due to their potential as precursors in the production of energetic compounds, such as biofuels or chemical building blocks in the industry. Other bioactive compounds that are synthetized by microalgae are carotenoids, widely used in pharmacological and pigment industry for their antioxidant properties. Therefore, scale-up processes where microalgae biomass is used for the production of several compounds for commercialization, in a sustainable and integrated way, imply to identify and enhance the key bottlenecks and difficulties in the production stage. To obtain starch and TAG, induction must be made under stress conditions, which limits cell growth because of the production of storage compounds at the expense of natural cell cycle and division. In this thesis, a first molecular approach is made for the enhancement of neutral lipids in Chlamydomonas reinhardtii, overexpressing a gene responsible for the increase of carbon flux upstream the specific neutral lipid pathway (Chapter 1). On the other hand, a second genetic engineering approach is followed, overexpressing a gene directly involved in TAG assembly (Chapter 2). In addition, the hypothesis whether the simultaneous overexpression of these genes, can synergistically improve the levels previously reached by carbon flux enhancement, is assessed (Chapter 3). Finally, the utilization of the microalgal biomass for the simultaneous production of carotenoids and starch under nitrogen starvation, and the use of starch for the production of chemical precursors is studied (Chapter 4). In Chapter 1, the effect of the overexpression of the endogenous gene, encoding the chloroplastic acetyl- CoA synthetase (ACS2), from Chlamydomonas reinhardtii, is presented. This enzyme is responsible for the direct assimilation of acetate into acetyl-CoA, which, among other metabolic pathways, feeds the route involved in fatty acid synthesis. The results show an increase in starch production under replete conditions, and a rise in acyl-CoA intermediates, which are further incorporated to TAG biosynthesis. Transfer of cultures to nitrogen depletion causes TAG production in the transformant in a greater proportion than the parental line, and higher transcript levels of the ACS2 gene as a consequence of its overexpression. In Chapter 2, the heterologous expression of the gene encoding a type-1 diacylglycerol acyltransferase, from the boraginaceae Echium pitardii (DGAT1) in Chlamydomonas reinhardtii, is studied. This enzyme catalyzes the last step of assembly of an acyl chain in a diacylglycerol backbone to yield a molecule of TAG. The transformant shows a higher amount of total fatty acids, and a significant rise of the neutral lipid fraction under nitrogen depletion conditions. A higher uptake of acetate from the medium, the presence of intracellular glycerol and a slower degradation of the photosynthetic apparatus compared to the parental line, are also observed. In Chapter 3, the generation of acs transformants, and the generation of double acs/dgat transformants from the single acs clones, is achieved with the aim of establishing a comparison between them. Results show a synergistic enhancement in the neutral lipid content in the double transformant, which simultaneously expresses both genes. In addition, the single acs and the double acs/dgat transformants present a higher amount of carotenoids under replete conditions, a higher content of starch in replete and N-depleted conditions, and a better evolution of photosynthetic efficiency throughout nutrient deficiency. Finally, in Chapter 4, the ability of Chlamydomonas reinhardtii to accumulate starch under nitrogen starvation is utilized for the production of the chemical precursors 5'-hydroxymethylfurfural (5'-HMF) and levulinic acid (LA). These intermediates are used in the industry for the synthesis of biofuels, additives, polymers or molecular imaging probes. The application of a Central Composite Design and Response Surface Methodology allowed to determine the influence of the operational conditions involved in the acidic hydrolysis of starch, firstly to glucose, and in a further step, to 5'-HMF and LA. The best temperature, acid percent, DMSO percent and reaction time conditions were selected for each of the three precursors. Moreover, the extraction of carotenoids, prior to hydrolysis, allows to set the basis for an integrated biorefinery process, aiming to produce several compounds of interest from a sole biomass.

[es] Las microalgas son microorganismos fotosintéticos con una gran capacidad de adaptación a condiciones adversas, desencadenando mecanismos de regulación con los que se mantienen ratios adecuadas de carbono y nitrógeno en la célula para su supervivencia. Cuando estos microorganismos son sometidos a condiciones de estrés ambiental, el carbono inicialmente dirigido a la formación de estructuras es redirigido a la síntesis de compuestos de reserva. Esta tesis doctoral se enmarca en la respuesta de la microalga Chlamydomonas reinhardtii ante la ausencia de nitrógeno en el medio de cultivo. Ante esta carencia nutricional, el carbono asimilado pasa a ser convertido a los dos compuestos principales de reserva: almidón y triacilgliceroles (TAG). Estos compuestos son de alto interés debido a su potencial como precursores en la producción de compuestos energéticos, tales como biocombustibles o intermediarios químicos en la industria. Otras biomoléculas de alto valor añadido generadas por las microalgas son los carotenoides, ampliamente utilizados en la industria farmacológica y de pigmentos por su carácter antioxidante. Así pues, el escalado a procesos sostenibles e integrados donde una única biomasa de microalgas pueda ser empleada para la obtención de varios productos susceptibles de comercialización, pasa por identificar y mejorar los principales cuellos de botella en el proceso de producción. En el caso de la obtención de almidón y TAG, su inducción en condiciones de estrés tiene como inconveniente la limitación en el crecimiento de los cultivos, ya que los recursos disponibles son dedicados a la acumulación de estos compuestos en lugar de la evolución y división natural de la célula. En el presente trabajo, se lleva a cabo por un lado, la mejora para la obtención de lípidos neutros mediante manipulación genética, sobreexpresando en Chlamydomonas reinhardtii un gen responsable del aumento del flujo de carbono aguas arriba de la ruta metabólica específica de síntesis de lípidos neutros (Capítulo 1), y por otro lado, sobreexpresando un gen directamente implicado en el ensamblaje de los triacilgliceroles (Capítulo 2). Además, se aborda la hipótesis de que la expresión simultánea de ambos genes puede llevar a una mejora superior a la que tendría sólo mejorar el aumento del flujo de carbono hacia la ruta (Capítulo 3). Por último, se estudia el aprovechamiento de la biomasa microalgal para la producción simultánea de carotenoides y almidón en carencia de nitrógeno y su utilización en la obtención de precursores químicos de interés industrial (Capítulo 4). En el Capítulo 1, se estudia el efecto de la sobreexpresión del gen endógeno que codifica la acetil-CoA sintetasa (ACS2) cloroplástica en Chlamydomonas, responsable de la producción, en un solo paso, de acetil-CoA desde acetato. El acetil-CoA, entre otros destinos metabólicos, alimenta la ruta de síntesis de ácidos grasos. Los resultados muestran un aumento en la síntesis de almidón en condiciones de cultivo repletas, además de un aumento de los intermediarios acil-CoA, los cuales son posteriormente incorporados a la ruta de síntesis de novo de triacilgliceroles. El paso de los cultivos a condiciones de carencia de nitrógeno provoca la síntesis de TAG en mayor proporción que la especie parental, además de detectarse mayores niveles de transcrito del gen ACS2 como consecuencia de su sobreexpresión. En el Capítulo 2, se aborda la expresión heteróloga en Chlamydomonas reinhardtii de un gen que codifica una diacilglicerol aciltransferasa de tipo 1 (DGAT1), procedente de la especie boraginácea Echium pitardii, que es responsable del último paso de ensamblaje de un acilo al esqueleto de diacilglicerol para formar una molécula de TAG. Se comprobó que el transformante posee mayor cantidad de ácidos grasos totales y un aumento significativo de la fracción de ácidos grasos neutros en condiciones de carencia de nitrógeno, además de un mayor consumo de acetato y presencia de glicerol intracelular con respecto a la especie parental. También se observa una degradación más lenta del aparato fotosintético. En el Capítulo 3, se realiza la obtención de transformantes acs, y a partir de éstos, la obtención de transformantes acs/dgat, con el fin de establecer una comparativa entre el transformante simple y el doble, que sobreexpresa simultáneamente ambos genes. Los resultados muestran un aumento sinérgico en lípidos neutros en el transformante doble seleccionado, mejorando tanto a la especie parental inicial como al transformante simple acs del que procede. Las dos especies transformadas presentan además una mayor cantidad de carotenoides y una mayor síntesis de almidón en medio repleto y carente de nitrógeno, y de nuevo, una mejor evolución de la eficiencia fotosintética en el transcurso de la carencia nutricional. Finalmente, en el Capítulo 4, se utiliza la capacidad de acumulación de almidón de Chlamydomonas reinhardtii bajo deficiencia de nitrógeno para la producción de los precursores químicos 5'-hidroximetilfurfural (5'-HMF) y ácido levulínico (LA). Estos intermediarios son ampliamente utilizados en industria para la síntesis de biocombustibles, aditivos, polímeros o sondas de diagnóstico por imagen. La aplicación de un diseño experimental y la metodología de Superficie de Respuesta, permitió determinar la influencia de los parámetros experimentales implicados en la hidrólisis ácida de almidón, en un primer paso a glucosa y posteriormente, a 5'-HMF y LA. Se seleccionaron las condiciones de temperatura, porcentaje de ácido, porcentaje de DMSO y tiempo de reacción para favorecer la síntesis de cada uno de los tres precursores. Además, la extracción de carotenoides previa a la hidrólisis, permite implementar las bases para un proceso de biorefinería integrada para la producción de varios compuestos a partir de una misma biomasa.