[en] Motoneuron diseases are a large group of sporadic and hereditary neurological disorders with the differential trait of being induced by the degeneration of motoneurons (MNs). These disorders can be divided into those caused by traumatic injuries, such as a peripheral nerve or spinal root injuries, or by physiopathological diseases like amyotrophic lateral sclerosis (ALS) or spinal muscular atrophies (SMA). Under stressful situations motoneurons activate endogenous mechanisms for neuroprotection, however, when a severe injury occurs, producing disconnection between the target organ and the motoneuron, the death of those motoneurons is promoted. By elucidating the mechanisms through which motoneurons die after an axotomy or when their axons degenerate, it will be possible to find new compounds and therapies to promote their survival. The main objective of this thesis is to investigate the potential neuroprotective effects through the modulation of voltage-dependent anion channels (VDACs) in different motoneuron disease models. Therefore, the first objective was to set up and characterize the brachial plexus injury (BPI), and analyze the changes in protein levels from the complex of the mitochondrial-associated membrane (MAM). This revealed that VDAC1 was highly expressed after the BPI in mice, and presented high multimeric forms. Different cell death mechanisms were studied, and it was concluded that ferroptosis contributed to the loss of MNs, characterized by the accumulation of lipid peroxidation products and low glutathione peroxidase 4 (GPX4) enzymatic activity. The second objective was to induce ferroptotic cell death in the NSC-34 cell line to test an inhibitor of the oligomerization of the three isoforms of VDAC, named 4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid (DIDS). DIDS targets thiol residues, decreasing the channel conductance in the multimeric forms of the three VDACs isoforms placed in the outer mitochondrial membrane (OMM). This objective aimed to mimic the cell death mechanisms induced after the neurotmesis of the brachial plexus to assess the neuroprotective effect of DIDS. Unfortunately, the tested concentrations of DIDS were not able to enhance cell viability after ferroptosis induction. Regarding the results of the second objective and considering the neuroprotective effect described previously in other neuronal cell lines, DIDS was administered in vivo after BPI and promoted neuroprotective effects by preserving the number of MNs and reducing the immunoreactivity of microglia and astrocytes. Then, we demonstrated that DIDS not only reduced the multimeric forms of VDAC1 but also decreased PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1). Contrary to what was hypothesized, DIDS did not play a role in the modulation of GPX4. Sig1R and VDAC1 both belong to the MAMs protein complex. Sig1R promotes the release of Ca2+ from the endoplasmic reticulum (ER) by inositol-1,4,5-triphosphate receptor type 3 (IP3R3), and VDAC1 allows the entrance of Ca2+ into the mitochondria. The Sig1R KO mice presented high protein levels of VDAC1. Our findings revealed that DIDS after the BPI in the Sig1R KO model tended to protect the survival of MNs. Next, we tested an inhibitor specific to VDAC1 named vBIT-12. This enzyme, given at 10mg/kg, did not promote preservation of the MNs, although it reduced the astrocyte immunoreactivity. Considering the neuroprotective effects of VDACs modulation after BPI, we assessed the neuroprotective effect of DIDS in the SOD1G93A transgenic mice, as ALS model. ALS is characterized by degeneration of MNs in the motor cortex and spinal cord, which leads to paralysis, muscle weakness, and death. Our findings revealed that intraperitoneal administration of DIDS did not enhance neuromuscular function neither reduced spinal MN death. In summary, we observed ferroptosis cell death hallmarks after BPI in the spinal cord and used VDACs oligomerization inhibitors that exerted neuroprotective actions on axotomized MNs. However, VDACs modulations seem not to be a suitable target for ALS.

[es] Las enfermedades de motoneuronas (MNs) es un grupo amplio de enfermedades neurológicas tanto esporádicas como hereditarias con el rasgo distintivo de ser inducidas por degeneración de MNs. Estas enfermedades pueden ser divididas en lesiones traumáticas como lesión de nervio o de raíz espinal, o enfermedades fisiopatológicas como esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o atrofia muscular espinal (AME). Bajo situaciones de estrés, las motoneuronas activan mecanismos endógenos de neuroprotección, de todos modos, cuando ocurre una lesión grave, se produce una desconexión entre el órgano diana y la motoneurona. Estudiando los mecanismos mediante los cuales las MNs mueren después de una axotomía o cuando sus axones degeneran, permite el estudio de nuevos compuestos y terapias para promover la supervivencia de estas. El principal objetivo de estas tesis ha sido el de investigar el potencial neuroprotector de la familia de canales aniónico dependiente de voltaje (VDACs) a partir su modulación, en diferentes modelos de muerte de motoneuronas. Con este objetivo, hemos caracterizado la lesión del plexo braquial (BPI), y hemos analizado los cambios a nivel de proteína en el complejo mitocondria asociada a membrana del retículo endoplasmático (MAM). En este objetivo hemos observado un aumento significativo de VDAC1 después de la lesión BPI junto con sus formas multiméricas. Distintos tipos de muerte celular han sido estudiados, y se ha llegado a la conclusión que la ferroptosis contribuye a la pérdida de MNs, caracterizado por la acumulación de peroxidación lipídica y bajos niveles de actividad enzimática de glutatión peroxidasa 4 (GPX4). El segundo objetivo fue el de inducir muerte ferroptótica al modelo celular NSC-34 para testar un inhibidor de las tres isoformas de VDAC llamado 4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid (DIDS). Este objetivo tenía como finalidad mimetizar el tipo de muerte celular después de una axotomía del plexo braquial para estudiar los efectos neuroprotectores de DIDS. Desgraciadamente, las concentraciones testadas de DIDS no fueron suficientes para promover la viabilidad celular después de la inducción de ferroptosis. Pese a los resultados del segundo objetivo y teniendo en cuentas los efectos neuroprotectores descritos en otras líneas celulares. DIDS fue administrado in vivo después de la lesión BPI, promovió la supervivencia de MNs y redujo la immunoreactividad de microglia y astrocitos. A continuación, demostramos que DIDS no solo reduce las formas multiméricas de VDAC1 sino que también reduce PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1). Contrario a lo que se había hipotetizado, DIDS no participo en la modulación de GPX4. Sigma1R (Sig1R) y VDAC1 pertenecen al complejo proteico MAM. Sig1R promueve la liberación de Ca2+ del retículo endoplasmático mediante inositol-1,4,5-trifosfato receptor tipo 3 (IP3R3), y permite la entrada de Ca2+ mediante VDAC1 en la mitocondria. En el modelo knockout de Sig1R (Sig1R KO) de ratón hemos observado elevados niveles de VDAC1. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con DIDS después de la lesión de BPI en el modelo Sig1R KO presenta una tendencia a la protección de MNs. Se ha utilizado un compuesto que tiene como diana VDAC1, llamado vBIT12. Esta enzima fue administrada a 10mg/kg y no preservo el número de MNs, aunque redujo la immunoreactividad de los astrocitos. Considerando los efectos neuroprotectores de DIDS después de la lesión BPI, se analizó el efecto neuroprotector en el modelo de ratón transgénico de ELA SOD1G93A. Nuestros resultados revelaron que la administración intraperitoneal de DIDS no mejoró la función neuromuscular ni redujo la muerte de MNs espinales. En resumen, observamos características distintivas de muerte celular por ferroptosis después de BPI en la medula espinal y utilizamos inhibidores de la oligomerización de VDACs que promovieron acciones neuroprotectoras en MN axotomizadas. Sin embargo, las modulaciones de VDAC no parecen ser un objetivo adecuado para la ELA.