[ca] La resistència a antibiòtics està considerada una de les principals amenaces a la salut pública del segle XXI per la OMS. A causa del seu consum excessiu i incorrecte, els bacteris han desenvolupat mecanismes per fer-les front y així, ser capaços de sobreviure a la seva presència. Quan un bacteri desenvolupa el gen que li dota de resistència, disposa de diversos mecanismes amb el que pot cedir aquesta resistència a bacteris veïns. Aquest procés és conegut com transferència horitzontal de gens, i és la principal causa de la propagació dels gens de resistència a antibiòtics. Podem distingir entre 3 subtipus, sent la conjugació la més comú. La conjugació és la transferència de material genètic des d'un bacteri donant a un altra receptor i requereix contacte directe entre cèl·lules. La seva característica principal és la presència d'un plasmidi conjugatiu. En aquest treball, s'ha estudiat el plasmidi conjugatiu pLS20, del bacteri Gram positiu Bacillus subtilis. És una elecció d'estudi interessant donant que B. subitlis pertany al filo Firmicutes, sent aquest el filo predominant al intestí humà. El intestí humà funciona com un reservori genètic de resistència a antibiòtics. A més, pLS20 té interès biotecnològic degut a la seva existència en B. sutiblis natto, el quin és important en producció alimentària. Entendre com es regula la conjugació i reunir informació sobre les proteïnes que participen al procés conjugatiu és molt important per poder acabar amb la propagació de la resistència a antibiòtics. Per tant, aquesta tesi està centrada en l'estudi estructural i molecular de diverses proteïnes de pLS20. En primer lloc, el circuit regulador que controla la expressió de gens del principal operon conjugatiu ha estat estudiat, en la quina participen Rco, Rap i Phr*. Hem caracteritzat estructuralment el domini de tetramerització de Rco i hem vist que comparteix similitud amb la família de proteïnes p53. A més, hem determinat que Rco té diferents estats de oligomerizació en funció del pH, probablement a causa de la interfície de tetramerització composta per residus carregats. Així mateix, la unió entre Rap i Rco a diferents estequiometries i l'efecte de Phr* en la formació del complex han sigut analitzats per cromatografia de exclusió molecular. Respecte a Rap, s'ha avaluat la possibilitat de regulació creuada amb altres sistemes de Rap per assajos de unió. En segon lloc, hem treballat amb Reg576, una proteïna reguladora que participa en la regulació de gens involucrats en el establiment del plasmidi una vegada transferit a la cèl·lula receptora. Hem identificat al seu lloc d'unió al ADN y hem mutat un residu conservat per concloure que la unió no es veu afectada. D'altra banda, hem obtingut diferents disposicions y grups espacials de la proteïna a més de la que ja està depositada, revelant que Reg576 cristal·litza amb relativa facilitat. Finalment, hem investigat P34, proteïna involucrada en adhesió cel·lular que té un paper igualment important que la regulació del procés conjugatiu. Hem determinat que és una proteïna TIE (tioèster, Isopeptídic, èster) ja que hem caracteritzat estructuralment el seu domini tioèster, denominat TED. Mitjançant la introducció de la mutació de la cisteïna que participa en el enllaç tioèster, no hem observat cap canvi significatiu en l'estructura de la proteïna, però hem mesurat canvis dràstics en la funcionalitat. En definitiva, aquests resultats suposan un important avanç en la comprensió sobre la regulació de la conjugació i el contacte entre cèl·lules per començar la transferència de gens del plasmidi pLS20. Donada la importància de las proteïnes estudiades, no descartem l'opció de utilitzar aquestes proteïnes com futures dianes de fàrmacs per detenir la propagació de la resistència a antibiòtics.

[en] Antibiotic Resistance is considered one of the most important public health threats of the 21st century by the WHO. Due to human overuse and misuse of antibiotics, bacteria develop new mechanisms to survive in the presence of antibiotics. Once one bacterium has evolved the gene that endows resistance to it, there are several ways by which this trait can pass to neighbouring bacteria. This process is known as horizontal gene transfer and it is the main reason for the spread of antibiotic resistance genes. We can distinguish between three subtypes, conjugation being the most common one. Conjugation is the active transfer of genetic material from a donor bacterium to a recipient bacterium, involving direct cell-to-cell contact. It is characterized by the presence of a conjugative plasmid. In this work, we have studied the pLS20 conjugative plasmid, from Gram positive bacteria Bacillus subtilis. It is an interesting choice of research as Bacillus subtilis belongs to the phylum Firmicutes, which is the predominant pylum in human gut. The human gut has favourable conditions for conjugative gene exchange and therefore is a pool of antibiotic resistance genes. Also, pLS20 has biotechnological interest because of its occurrence in B. subtilis natto, which is important in food production. Understanding how conjugation is regulated and gathering information of the specific proteins that take part in the conjugative process is of extreme importance in order to stop antibiotic resistance spread. Consequently, this work is focused on the structural and molecular study of various pLS20 proteins. Firstly, the regulatory circuit that controls the expression of the genes of the main conjugation operon has been studied, in which Rco, Rap and Phr* take part. We have structurally characterized the tetramerization domain of Rco and realized it shares high structural resemblance with p53 family proteins. Also, we have determined that Rco has different oligomerization states under distinct pHs, probably due to the charged tetramerization interface. Furthermore, binding between Rapp and Rco at different stoichiometries and the effect of Phr* in the complex formation has been analyzed by size exclusion chromatography. With regard to Rap, the possibility of cross-regulation with other Rap systems has been considered and evaluated by binding assays. Secondly, we have studied Reg576, which is also a transcriptional regulator that controls the transctiption of the genes involved in the establishment of the plasmid once it has been transferred to the recipient cell. We have identified its binding region in DNA and mutated a conserved residue of the protein and determined that binding is not affected. Moreover, we have obtained diverse crystal packings and space groups of the proteins, revealing that Reg576 is a protein that tends to crystallize with relative ease. Finally, we have investigated P34, a protein involved in cell adhesion, which plays an equally important part in the overall success of plasmid transfer as does gene regulation. We have determined it is a TIE (thioester, isopeptide, esther) type of protein as we have structurally characterized its TED domain. Also, from the structure of a mutant where the thioester bond-forming cysteine was mutated to a serine, we conclude that there are no significant structural changes. However, we have observed drastic functionality changes: conjugation is inhibited for the mutant. Together, these results bring new important insights into how conjugation in the pLS20 plasmid is regulated and how cells contact each other to start the transfer of the genes. Given the importance of the proteins characterized, we do not discard the option of using these proteins as future drug targets to stop antibiotic resistance spread.