[ca] En el primer estudi confirmem que el tractament amb enoxaparina es capaç de disminuir la pressió portal en rates amb cirrosi establerta i hipertensió portal. A més, la millora en la pressió portal es va produir sense efectes en el flux sanguini portal, suggerint una disminució en la resistència vascular intrahepàtica. La falta d'efectes de l'administració aguda d'enoxaparina en la pressió portal, en els paràmetres hemodinàmics sistèmics, i en el contingut de superòxid o GMPc, suggereix que l'enoxaparina no té un efecte directe sobre el component dinàmic de la resistència vascular intrahepàtica. Per acabar de confirmar aquests resultats, es va examinar la resposta dependent d'endoteli al vasodilatador acetilcolina i no es van observar diferències entre les rates tractades amb enoxaparina i les rates tractades amb vehicle en cap dels dos models de cirrosi.. A més a més, tot i que en els tractaments de més llarga durada amb enoxaparina es van observar sobretot millores en les alteracions arquitecturals, es van observar també canvis en el to vascular. Es van disminuir els nivells d'estrès oxidatiu, de proteïnes nitrotirosinades i es va augmentar en el contingut de GMPc. A més a més, es va observar una disminució de la ratio p-Moesina/Moesina en les rates tractades amb enoxaparina, suggerint que el tractament amb enoxaparina pot modular el to vascular mitjançant la relaxació de les CHE, almenys a llarg termini. Tot i això, s'ha de tenir en compte que aquest canvis en el to vascular poden ser deguts a la millora de l'alteració estructural observada. És cert que el tractament amb enoxaparina ja es va descriure com a un bon tractament per a millorar la fibrosi hepàtica en models de dany hepàtic lleu. El nostre estudi amplia aquestes observacions a models amb cirrosi establerta. El tractament amb enoxaparina va ser iniciat en el moment on es va aturar l'administració del tòxic (tant CCl4 com TAA) com a model de regressió de malaltia avançada, o es va administrar alhora amb el tòxic, com a model de prevenció de la progressió de la cirrosi, en el model de TAA. Això ens va permetre analitzar els efectes del tractament amb enoxaparina en dos escenaris diferents. En el model de regressió amb CCl4, les rates que van rebre durant 3 setmanes el tractament van tenir més temps de regressió espontània de la fibrosi que les rates que van rebre només una setmana de tractament. Tot i això, tant les d'una setmana de tractament com les de 3 setmanes de tractament van tenir una disminució del 25% del contingut de col·lagen analitzat per tinció de Sirius Red. Això també es va observar en el model de cirrosi de TAA tant en regressió com en prevenció. Tot els resultats van cap a la mateixa direcció i suggereixen el paper de l'enoxaparina en disminució de la fibrosi hepàtica. A més, es va observar una disminució dels nivells d'activació de les CHE en les rates tractades amb enoxaparina, tant a nivell de teixit com en cèl·lula aïllada de rata tractada. A part de l'efecte de l'enoxaparina en la fibrosi hepàtica, es va observar la influència de del tractament en la prevenció d'esdeveniments trombòtics en la microcirculació hepàtica. De fet, s'ha suggerit que aquests podrien jugar un paper important en la progressió de la fibrosi hepàtica. Per explorar aquest efecte hem avaluat el contingut de fibrina en el parènquima hepàtic com a marcador de la formació de microtrombes. Els fetges de rates tractades amb enoxaparina van tenir una menor deposició de fibrina. Aquest fet ja es va observar en les rates tractades durant una setmana, però l'efecte va ser més gran i significatiu en les rates tractades durant 3 setmanes. Aquestes troballes confirmen la connexió que hi ha entre trombosi i fibrosi hepàtica i consolida el concepte de l'ús dels anticoagulants per a la prevenció/dissolució dels microtrombes per a millorar la fibrosi hepàtica. Per contra, no es van observar canvis a nivell d'inflamació. Per tant, encara que no podem descartar completament el potencial efecte del tractament amb enoxaparina en la reducció de la inflamació, no sembla que aquests sigui el principal mecanisme responsable de la millora les alteracions arquitecturals en la cirrosi hepàtica. És important remarcar que els efectes beneficiosos del tractament amb enoxaparina en la reducció de la pressió portal, resistència vascular intrahepàtica i fibrosi hepàtica no es van associar a efectes deleteris en els animals. No es van observar diferencies en els enzims hepàtics, ni es va observar sagnats durant el tractament o durant l'estudi hemodinàmic. En el segon estudi es va avaluar l'efecte de l'anticoagulant oral, Rivaroxaban, en la cirrosi hepàtica. Com ja es va veure en el primer estudi, la teràpia anticoagulant pot ser una bona estratègia terapèutica per al tractament de la hipertensió portal en la cirrosi. Tot i això, les heparines de baix pes molecular són dependents dels nivells sanguinis d'antitrombina, que de fet poden estar disminuïts en els pacients cirròtics. Es per això que vam estudiar els efectes de Rivaroxaban, que és un inhibidor directe del factor Xa (tant el Factor Xa lliure com el que es troba unit al complex de protrombinasa) i és independent dels nivells d'antitrombina. A més a més, Rivaroxaban té l'avantatge de ser biodisponible via oral i té una acció ràpida. Tot això, fa de rivaroxaban un anticoagulant més previsible i potencialment més eficient comparat amb altres heparines. En aquest estudi hem confirmat els efectes beneficiosos de l'ús d'anticoagulants per a millora la hipertensió portal en la cirrosi. Hem demostrat que l'administració oral de rivaroxaban disminueix els nivells d'estrès oxidatiu, millora la biodisponibilitat de NO, desactiva les CHE i millora la hipertensió portal en dos models de cirrosi en rata. La disminució de la pressió portal observada en les rates tractades amb rivaroxaban no es va associar a canvis en el flux sanguini portal en cap dels dos models, suggerint que el principal efecte ve de la disminució en la resistència vascular intrahepàtica. De fet, es va observar una disminució de la resistència vascular intrahepàtica en fetges de rates tractades amb rivaroxaban quan es va avaluar en un sistema de perfusió ex vivo amb el flux controlat. L'estudi dels mecanismes de la millora en la funció microcirculatòria hepàtica van mostrar que rivaroxaban disminuïa els nivells d'estrès oxidatiu, probablement pel menor reclutament de cèl·lules inflamatòries. També augmentava els nivells de GMPc, millorava la resposta a dosis creixents d'acetilcolina i disminuïa l'expressió del marcador d'activació de CES, el factor von Willebrand. Tot això indicava que el tractament amb rivaroxaban té un efecte important en la millora de la disfunció endotelial en el fetge cirròtic. D'altra banda també es va estudiar l'efecte de rivaroxaban sobre les CHE. Es va observar que el tractament amb rivaroxaban disminuïa els marcadors d'activació i proliferació de les CHE que correlacionen amb la seva capacitat de síntesi de matriu extracel·lular. Aquest efecte no es va associar a canvis importants en el contingut de fibra en el fetge. Degut als canvis observats en els nivells d'activació de les CHE, es temptador especular que un tractament més llarg amb rivaroxaban s'associaria a una disminució en els nivells de fibrosi hepàtica. Això està recolzat pels efectes beneficiosos observats a sobre les alteracions del parènquima: estudis ultraestructurals realitzats mitjançant microscopia electrònica van confirmar que les rates tractades amb rivaroxaban tenien una menor formació de membrana basal en els sinusoides hepàtics i que els hepatòcits tenen més projeccions, suggerint una millor estructura del sinusoid hepàtic. Finalment, es va confirmar una disminució del contingut de fibrina en les rates tractades amb rivaroxaban, suggerint una disminució de la microtrombosi hepàtica. Els efectes beneficiosos deguts al tractament amb rivaroxaban no es van associar a efectes deleteris en l'hemodinàmica sistèmica ni en un augment de sagnats durant el tractament. El tercer estudi aporta nova informació, fins ara no coneguda, sobre el potencial dany de l'estès oxidatiu mitocondrial en les cèl·lules hepàtiques durant la cirrosi i sobre l'ús dels antioxidants dirigits a mitocondri com a estratègia terapèutica per a la hipertensió portal i la cirrosi. Tal i com s'ha explicat anteriorment, les CHE són les principals cèl·lules implicades en la síntesi de matriu extracel·lular que contribueix en l'augment de la resistència vascular intrahepàtica en la cirrosi. Tenint en compte que l'augment de l'estrès oxidatiu en la cirrosi és un dels principals mecanismes que activen les CHE i que els mitocondris són un dels principals productors d'espècies reactives d'oxigen, aquest estudi es va centrar en avaluar els efectes de l'antioxidant dirigit a mitocondri, mitoquinona en l'estrès oxidatiu, fenotip de les CHE, la fibrosi hepàtica i la hipertensió portal en models pre-clínics de cirrosi. Els resultats del present estudi mostren que el tractament amb mitoquinona disminueix l'estrès oxidatiu hepàtic, desactiva les CHE i disminueix la fibrosi hepàtica i la hipertensió portal en les rates cirròtiques. Estudis anteriors van demostrar el rol de l'estrès oxidatiu en la fisiopatologia de la cirrosi i la hipertensió portal. En el present estudi demostrem que el tractament amb mitoquinona va aconseguir disminuir els nivells d'estrès oxidatiu, com altres teràpies utilitzades com ara el tempol o el resveratrol, però amb la diferència que la mitoquinona té l'avantatge de ser administrada oralment. A més a més, les altres teràpies antioxidants no poden dirigir-se a l'interior del mitocondri i, per tant, no poden contrarestar l'estrès oxidatiu mitocondrial que pot resultar en dany i disfunció mitocondrial i endegar una cascada de conseqüències deletèries per a la cèl·lula com ara la inflamació o la mort cel·lular. El nostre estudi demostra que part de l'estrès oxidatiu observat en els fetges cirròtics prové del mitocondris dels hepatòcits i de les CHE. A més, demostrem que la mitoquinona es capaç de disminuir l'estrès oxidatiu mitocondrial en els principals tipus cel·lulars hepàtics. Aquest augment de l'estrès oxidatiu mitocondrial en la cirrosi pot ser causat, almenys en part, per la disminució en l'expressió i l'activitat de la isoforma mitocondrial de la superòxid dismutasa, que s'ha vist disminuïda en la cirrosi. És important destacar que el tractament amb mitoquinona és capaç de disminuir l'activació de les CHE de rata tant in vitro com in vivo. A més, la desactivació de les CHE es va confirmar tant en CHE aïllades de biòpsies humanes, en la línia cel·lular humana de CHE, LX2, i en el model ex vivo per a l'estudi de mostres de fetge humanes, els talls de precisió de fetges humans (hPCLS). Aquests efectes es van evidenciar quan es va veure que la proliferació de les CHE estava disminuïda però no la seva viabilitat. Per confirmar la capacitat terapèutica de la mitoquinona, es va avaluar els seus efectes en dos models de cirrosi. Les observacions in vivo van demostrar que el tractament amb mitoquinona disminuïa la pressió portal, sense canvis en el flux sanguini portal, suggerint una disminució en la resistència vascular intrahepàtica. A més, els animals tractats amb mitoquinona van tenir una disminució del contingut de fibra hepàtica en ambdós models. Suggerint que la disminució de la fibrosi hepàtica és el principal mecanisme amb el que la mitoquinona disminueix la pressió portal, ja que no es van trobar efectes importants de la mitoquinona sobre el to vascular hepàtic almenys durant el temps de tractament estudiat, i que altres antioxidants sí que han demostrat una millora de la disfunció endotelial. A més, es sap que els nivells de les espècies reactives d'oxigen estan directament lligades a la inflamació. Per això vam analitzar l'expressió dels marcadors CD68 i CD163 com a marcadors d'inflamació. En aquest estudi vam observar una disminució del nombre de cèl·lules positives per CD68, suggerint un efecte de la mitoquinona en la reducció de la inflamació hepàtica. Aquests resultats només es van observar en el model de CCl4 i no en el de TAA, suggerint que la reducció de la inflamació pot contribuir a la millora de la fibrosi hepàtica però no és el principal mecanisme. Les diferències observades entre els dos models de cirrosi, pot ser degut a les diferències intrínseques dels dos models. De fet, s'ha descrit que el model induït per CCl4 acumula més estrès oxidatiu que el model per TAA, fent així el model per CCl4 més susceptible per a una teràpia antioxidant que no el model de TAA. Tot i això, cal destacar que tots els beneficis observats pel tractament amb mitoquinona no es van associar a efectes deleteris en els animals cirròtics en cap dels dos models.

[en] The present doctoral thesis is focused in the development of new therapeutical strategies for the treatment of portal hypertension, one of the main complications of cirrhosis. Increase in portal pressure is directly related to the increased intrahepatic vascular resistance, mainly due to increased vascular tone and increased hepatic fibrosis. Therefore, the main objective of the present doctoral thesis was to study the use of the anticoagulants enoxaparin and rivaroxaban, and the mitochondrial-directed antioxidant mitoquinone and to evaluate their effects on intrahepatic vascular resistance and portal pressure in preclinical models of cirrhosis with portal hypertension. On the one hand, the results of the present doctoral thesis concluded that the anticoagulants, both the anti-thrombin like enoxaparin and the anti-factor Xa (thrombin-independent) rivaroxaban significantly improve portal pressure of animals with cirrhosis and portal hypertension mainly due to improved vascular tone and hepatic fibrosis. On the other hand, we observed that mitochondrial oxidative stress was increased in cirrhotic livers and hepatocytes and hepatic stellate cells were the main cells producing mitochondrial oxidative stress. Furthermore, we confirmed the beneficial effects of antioxidants on cirrhosis. The results concluded that the mitochondrial-directed antioxidant mitoquinone decreased significantly portal pressure and intrahepatic vascular resistance. Moreover, an important deactivation of the main cells producing collagen was observed both in rat and in human cells. These results suggest that anticoagulant and antioxidant treatment may be a potential therapeutical strategy for the treatment of portal hypertension in cirrhotic patients.