[ca] Els tractaments actuals contra el càncer més enllà de la cirurgia inclouen teràpies que tenen un èxit limitat. Això és degut a efectes secundaris greus, que condueixen a una qualitat de vida reduïda i una baixa efectivitat. L'administració de quimioteràpia mitjançant nanotransportadors promet augmentar la selectivitat d'aquests medicaments. Els nanomaterials tenen propietats fisicoquímiques específiques i úniques que tenen un impacte crucial en el seu comportament biològic. Per tant, les propietats i les dianes biològiques s'han d'estudiar. Encara que l'arsenal de nanomaterials complexos està en constant maduració, les eines utilitzades per caracteritzar amb precisió aquestes entitats continuen sent similars a les que s'utilitzen per als fàrmacs de baix pes molecular. Éls nanomaterials tenen propietats fisicoquímiques que varien molt en comparació dels fàrmacs clàssics. Això significa que requereixen una caracterització més complexa, particularment a la nanoescala i al nivell d'una sola partícula. Actualment, hi ha una manca de tècniques adequades que estiguin optimitzades per avaluar les propietats fisicoquímiques i les dianes biològiques dels nanomaterials, que és una de les principals causes de la seva mala translació a la clínica. En aquesta tesi, proposem el desenvolupament, l'optimització i l'aplicació de tècniques d'imatge avançades com ara la microscòpia de super-resolució (SRM), la microscòpia electrònica de transmissió (TEM) i la microscòpia correlativa òptica i electrònica (CLEM) per caracteritzar i millorar la nostra comprensió dels nanotransportadors. El Capítol 1 demostra l'aplicació de DNA-PAINT i qPAINT a la quantificació de la funcionalització dels lligands de superfície i l'heterogeneïtat a les propietats dels nanomaterials. Així, formulem manualment diverses formulacions de nanopartícules (NPs) PLGA-PEG funcionalitzades amb oligonucleòtids com a lligands model i quantifiquem i comparem el nombre de lligands accessibles a cada formulació. Usant informació obtinguda partícula a partícula i molècula a molècula, DNA-PAINT va permetre l'estudi de l'heterogeneïtat en la funcionalització dels lligands. Els resultats ens van portar a redissenyar i reformular les PLGA-PEG NPs modificant l'arquitectura del PEG en superfície per exposar més lligands funcionals. El Capítol 2 segueix el desenvolupament d'una modalitat de CLEM per a estudiar la interacció entre diferents propietats fisicoquímiques en NPs de PLGA-PEG, com el nombre de lligands i la mida de la NP. Correlacionem la capacitat de quantificació de lligands de DNA-PAINT, amb l'excel·lent resolució de TEM per visualitzar la morfologia de les NPs. Això es va fer en el mateix camp de visió i vam extreure així la informació partícula a partícula. Vam identificar subpoblacions de NPs amb diferents números de lligands, que conferiran diferents comportaments biològics. Vam demostrar que, a diferència del nostre protocol correlatiu, la caracterització dels dos mètodes per separat pot limitar la informació. El Capítol 3 presenta la selecció racional i optimització d'un protocol dSTORM-TEM CLEM per al trànsit intracel·lular de PLGA-PEG NP. El protocol optimitzat ens va permetre visualitzar directament les NP fluorescents a dSTORM, i posicionar-les amb gran resolució a la ultraestructura cel·lular que ofereix TEM. Amb aquesta informació, quantifiquem la distribució de NP en diferents compartiments endo-lisosomals en diferents temps, obtenint una millor comprensió de trànsit intracel·lular. Finalment, quantifiquem el canvi en la distribució intracel·lular de les NP després de la incubació amb l'agent lisomotrópic cloroquina, fet que demostra que promou l'escapament dels endosomes. El Capítol 4 és l'aplicació del protocol dSTORM-TEM optimitzat per estudiar el comportament intracel·lular dels complexos polimèrics de pBAE. Usant dSTORM amb dos colors, vam poder localitzar i quantificar les molècules transportadores (polímers de pBAE) i el seu cargo (pDNA). D'altra banda, usant TEM podem localitzar els complexos amb precisió dins del medi intracel·lular. Comparem la capacitat d'escapar dels endosomes entre dos complexos polimèrics diferents. Per acabar, vam poder suggerir una diferència en els mecanismes d'internalització cel·lular entre les dues formulacions.

[es] Los tratamientos actuales contra el cáncer más allá de la cirugía incluyen quimioterapias que tienen un éxito limitado. La quimioterapia es inespecífica al cáncer, y por lo tanto puede causar efectos secundarios graves que conducen a una calidad de vida reducida. La administración de terapia contra el cáncer mediante nanotransportadores promete aumentar la selectividad de estos medicamentos. Los nanomateriales poseen propiedades fisicoquímicas específicas y únicas que tienen un impacto crucial en su comportamiento, y por eso las propiedades y las dianas biológicas de estos nanotransportadores deben estudiarse. Sin embargo, las herramientas utilizadas para caracterizar estas entidades siguen siendo similares a las que se utilizan para los fármacos de bajo peso molecular. Los nanomateriales tienen propiedades fisicoquímicas que varían mucho en comparación con los fármacos clásicos. Esto significa que requieren una caracterización adicional y más compleja. Actualmente, existe una falta de técnicas adecuadas que estén optimizadas para evaluar las propiedades fisicoquímicas y las dianas biológicas de los nanomateriales, que es una de las principales causas de su mala translación en la clínica. En esta tesis, proponemos el desarrollo y la aplicación de técnicas de imagen avanzadas como la microscopía de super-resolución (SRM), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía correlativa óptica y electrónica (CLEM) para caracterizar y mejorar nuestra comprensión de los nanotransportadores. El Capítulo 1 demuestra la aplicación de DNA-PAINT y qPAINT en la cuantificación de la funcionalización de los ligandos de superficie y la heterogeneidad en las propiedades de los nanomateriales. Así, formulamos varias formulaciones de nanopartículas (NPs) PLGA-PEG funcionalizadas con oligonucleótidos como ligandos modelo y cuantificamos y comparamos el número de ligandos accesibles en cada formulación. Usando información obtenida partícula a partícula y molécula a molécula, DNA-PAINT permitió el estudio de la heterogeneidad en la funcionalización de los ligandos. Los resultados nos llevaron a rediseñar y reformular nuestras PLGA-PEG NPs modificando la arquitectura del PEG en superficie, para exponer más ligandos funcionales en superficie. El Capítulo 2 sigue el desarrollo de una técnica CLEM para estudiar la interacción entre diferentes propiedades fisicoquímicas en PLGA-PEG NPs, como el número de ligandos y el tamaño de la NP. Para hacer esto, correlacionamos la capacidad de cuantificación de ligandos de DNA-PAINT, con la excelente resolución de TEM para visualizar la morfología de las NPs. Eso se hizo en el mismo campo de visión y extrajimos así la información partícula a partícula. Identificamos subpoblaciones de NPS con diferentes números de ligandos, que conferirán diferentes comportamientos biológicos. Demostramos que, a diferencia de nuestro protocolo correlativo, la caracterización los dos métodos por separado puede limitar la información. El Capítulo 3 presenta la selección racional y la optimización de un protocolo dSTORM-TEM CLEM para el tráfico intracelular de PLGA-PEG NPs. El protocolo optimizado nos permitió visualizar directamente las NPs fluorescentes en dSTORM, y posicionarlas con gran resolución en la ultraestructura celular que ofrece TEM. Con esta información, cuantificamos la distribución de NPs en diferentes compartimentos endo-lisosomales en diferentes tiempos. Finalmente, cuantificamos el cambio en la distribución intracelular de las NP tras la incubación con el agente lisomotrópico cloroquina, lo que demuestra que promueve el escape de los endosomas. El Capítulo 4 incluye la aplicación del protocolo dSTORM-TEM optimizado para estudiar el comportamiento intracelular de los complejos poliméricos de pBAE. Usando dSTORM con dos colores, pudimos localizar y cuantificar las moléculas transportadoras (polímeros de pBAE) y su cargo (pDNA). Usando TEM localizamos los complejos con precisión dentro del medio intracelular. Con esta información, comparamos la capacidad de escapar de los endosomas entre dos complejos poliméricos diferentes. Por último, pudimos sugerir una diferencia en los mecanismos de internalización celular entre las dos formulaciones.