[en] The S. cerevisiae Ser/Thr protein phosphatase Ppz1 is an important component in the maintenance of monovalent cation (K+ and Na+) homeostasis and, as such, impinges in multiple cellular processes, such as cell cycle progression, cell integrity maintenance. Cation homeostasis is a key factor for the survival of any single cell, particularly for microorganisms that, like yeasts, must confront environmental changes. Although Ppz1 is an enzyme related to the ubiquitous type-1 phosphatase (PP1c), Ppz-like enzymes are only found in fungi, including pathogenic ones. Two regulatory subunits of S. cerevisiae Ppz1 have been identified, Hal3 and Vhs3, which bind to the catalytic C-terminal half of Ppz1 and strongly inhibit its phosphatase activity. Modulation of PP1c by its many regulatory subunits has been extensively characterized, interestingly, Hal3 does not appear structurally similar to known PP1c inhibitors, with the exception of the presence of an RVxF related sequence, which is found in most PP1c regulators. This motif interacts with a hydrophobic groove of the phosphatase, whose structure is also conserved in Ppz1. However, Hal3 does not bind or inhibit in vitro yeast PP1c and this motif seems to not be relevant for its interaction with Ppz1. Therefore, Hal3 seems to be rather specific towards Ppz1, suggesting that the mechanism of Ppz1 regulation by Hal3 might differ from those found for PP1c regulatory subunits. A major goal of this work was to gain insight into the specific regulatory mechanisms of Ppz1 by Hal3. To this end, two experimental approaches were undertaken. Firstly, a genetic screen was devised to identify Ppz1 mutations that would release Ppz1 from Hal3 regulation. A library of Ppz1 versions carrying random mutation in its C-terminal catalytic domain was generated and a functional screen in the slt2 background carried out. This screen yielded 36 variants, of which 9 carried single and 4 double amino acid changes. In vivo and in vitro characterization of these variants demonstrated that all of them affected the inhibitory capacity to be inhibited by, but not to interact with Hal3. Mapping the mutated residues in a Ppz1 model localized these residues in one of the region equivalent to that recognized on PP1c by Inhibitor-2. Secondly, we developed successful strategies to co-express in E. coli and to purify the protein complex formed by Ppz1 (C-terminal half) and Hal3. These preparations allowed the generation of diverse crystals. However, despite the many efforts to improve the obtained crystals, they were not of enough quality to obtain a high resolution data sets as to resolve the three-dimensional structure of the complex. It was demonstrated years ago that Hal3 is a moonlighting protein, because in addition to its role in Ppz1 regulation, Hal3 contributes (together with Cab3 and Vhs3) to the generation of an atypical heterotrimeric PPCDC enzyme This essential and conserved enzyme exists as a homotrimeric flavoprotein in most eukaryotic species, and requires in the active site the presence of specific His and Cys residues, as well as a conserved Asn. The search of fungal genomes for the presence of putative PPCDC enzymes revealed that Schizosaccharomyces pombe contains a unique ORF (SPAC15E1.04, named here SpHal3)) that could encode a Hal3 homolog. We demonstrate that this gene has an unusual structure, being the result of a gene fusion event, containing a Hal3-like segment necessary for PPCDC activity (similar to ScHal3) in the N-terminal region and the sequence that encodes the thymidylate synthase enzyme in the C-terminus. Our results showed that SPAC15E1.04 is expressed as a single polypeptide and that the SpHal3 N-terminal half is sufficient to decide PPCDC activity, were the C-terminal half is able to provide TS function in S. cerevisiae. Our results confirmed the multifunctional nature of this fusion gene and demonstrated that it is an essential gene.

[es] La proteína Ser / Thr fosfatasa Ppz1 de S. cerevisiae es un componente importante en el mantenimiento de la homeostasis de cationes monovalentes (K+ y Na+) y, como tal, incide en múltiples procesos celulares, tales como la progresión del ciclo celular y el mantenimiento de la integridad celular. La homeostasis de cationes es un factor clave para la supervivencia de cualquier célula, particularmente para los microorganismos que, como las levaduras, deben hacer frente a los cambios ambientales. Aunque Ppz1 es un enzima relacionado con la ubicua fosfatasa tipo 1 (PP1c), las enzimas tipo Ppz sólo se encuentran en hongos, incluyendo patógenos. Se han identificado dos subunidades reguladoras de S. cerevisiae Ppz1, Hal3 y Vhs3, que se unen a la mitad C-terminal catalítica de Ppz1 e inhiben fuertemente su actividad fosfatasa. La modulación de PP1c por sus muchas subunidades reguladoras ha sido ampliamente caracterizada, interesantemente, Hal3 no parece estructuralmente similar a los inhibidores de PP1c conocidos, con la excepción de la presencia de una secuencia relacionada con RVxF, que se encuentra en la mayoría de los reguladores de PP1c. Este motivo interactúa con un surco hidrofóbico de la fosfatasa, cuya estructura también se conserva en Ppz1. Sin embargo, Hal3 no se une o inhibe in vitro la PP1c de levadura y este motivo parece no ser relevante para su interacción con Ppz1. Por lo tanto, Hal3 parece ser bastante específico hacia Ppz1, lo que sugiere que el mecanismo de regulación de Ppz1 por Hal3 podría diferir de los encontrados para PP1c subunidades reguladoras. Un objetivo principal de este trabajo fue obtener una visión de los mecanismos específicos de regulación de Ppz1 por Hal3. Con este fin, dos enfoques experimentales se llevaron a cabo. En primer lugar, se diseñó un cribado genético para identificar las mutaciones de Ppz1 que liberarían Ppz1 de la regulación de Hal3. Se generó una biblioteca de las versiones de Ppz1 que portaban mutación aleatoria en su dominio catalítico C-terminal y se llevó a cabo un cribado funcional en el fondo slt2. Este cribado produjo 36 variantes, de las cuales 9 llevaron simple y 4 doble cambios de aminoácidos. La caracterización in vivo e in vitro de estas variantes demostró que todas ellas afectaron la capacidad inhibitoria de ser inhibida por, pero no para interactuar con Hal3. La asignación de los residuos mutados en un modelo de Ppz1 localizó estos residuos en una región equivalente a la reconocida en PP1c por el Inhibitor-2. Segundamente, desarrollamos estrategias exitosas para coexpresar en E. coli y purificar el complejo de proteínas formado por Ppz1 (mitad C-terminal) y Hal3. Estas preparaciones permitieron la generación de diversos cristales. Sin embargo, a pesar de los muchos esfuerzos para mejorar los cristales obtenidos, no fueron de suficiente calidad para obtener conjuntos de datos de alta resolución como para resolver la estructura tridimensional del complejo. Hace años se demostró que Hal3 es una proteína multifuncional, porque además de su papel en la regulación de Ppz1, Hal3 contribuye (junto con Cab3 y Vhs3) a la generación de un enzima PPCDC heterotrimérico atípico. Este enzima esencial y conservado existe como una flavoproteína homotrimérica en la mayoría de las especies eucarióticas, y requiere en el centro activo la presencia de residuos His y Cys específicos, así como un Asn conservado. La búsqueda de genomas fúngicos para la presencia de enzimas putativo PPCDC reveló que Schizosaccharomyces pombe contiene un único ORF (SPAC15E1.04, llamado aquí SpHal3)) que podría codificar un Hal3 homólogo. Demostramos que este gen tiene una estructura inusual, siendo el resultado de un evento de fusión génica, que contiene un segmento de tipo Hal3 necesario para la actividad PPCDC (similar a ScHal3) en la región N-terminal y la secuencia que codifica la enzima timidilato sintasa en el extremo C-terminal. Nuestros resultados mostraron que SPAC15E1.04 se expresa como un único polipéptido y que la mitad N-terminal de SpHal3 es suficiente para determinar la actividad de PPCDC, si la mitad C-terminal es capaz de proporcionar la función TS en S. cerevisiae.