[en] Neurodevelopmental disorders include cognitive, learning, behaviour, communication and motor disorders, which appear in early childhood, such as intellectual disability (ID) or autism spectrum disorders (ASD). These complex diseases, due to alterations in the developing central nervous system (CNS), may have familial aggregation or be associated with other congenital anomalies or dysmorphic features. Although the cause of these disorders is unknown in many cases, there is clear evidence of their genetic backgrounds, with a large number of described syndromes with ID associated to various copy number variants (CNVs) or epigenetic alterations. The development of the nervous system, neuronal plasticity or synaptic organization are dynamic processes modulated by epigenetic, which mediates between the environment to which we are exposed and whose primary receptor is the CNS, and the information contained in the genes. Alterations of these mechanisms can be genetics, since they affect the gene sequence encoding proteins involved in these processes; or epigenetics, when changes occur in the epigenetic signals without altering the DNA sequence. Based on these premises, this study aims to contribute to the understanding of the etiology and genetic diagnosis of neurodevelopmental disorders. On one hand, by finding genetic alterations related to these disorders, including both, genes involved in epigenetic regulation and CNS differentiation and development, as genomic elements that may contribute in regulation of gene expression, mainly ultra-conserved elements (UCEs) and miRNAs. On the other hand, by searching for epigenetic alterations, focusing on methylation, in whole-genome and in candidate regions of interest, such as differential methylation domains. For this purpose, different approaches have been used in a series of 395 patients with ID and/or ASD of unknown etiology who also have congenital anomalies, dysmorphic features and/or other family history that may be associated with these disorders. In the genome screening searching for genetic alterations, CGH-array has been used as a tool, using both a commercial one (4X44K, G4426B, Agilent Technologies) and a self-designed one, specific for this work, focused on genes and regions of interest in neurodevelopmental disorders. The results obtained by both strategies were confirmed by different techniques (microsatellite markers, MLPA, quantitative PCR or FISH). Also screening mutations in the candidate gene MYT1L was performed by heteroduplex in a series of 69 clinically selected patients, confirming the results obtained by sequencing. For the screening of global genome methylation changes a pilot study by HPLC was performed in a total of 17 patients with a known epigenetic gene alteration and 33 controls. For the screening of specific regions throughout the whole series of patients, 4 imprinted loci (KCNQ1OT1, H19, SNRPN y MEG3) were selected, using a treatment based on methylation sensitive restriction enzyme and semiquantitative multiplex PCR protocol. The results were confirmed by microsatellite markers, to assess possible uniparental disomies, or MS-MLPA. Genetic studies by array have revealed 220 CNVs in 152 patients, 58 of them being carriers of a clear causal CNV. Between 29 and 50% of the patients with a pathological dose change have affected some epigenetic gene whose alteration have clinical impact. Furthermore, a significant enrichment was observed in epigenetic gene in pathological CNVs as opposed to an impoverishment of such genes in benign CNVs. The results confirm the importance of the genes responsible for epigenetic processes in neurodevelopment, and its sensitivity to changes in dose. However, no causal alterations involving only UCEs or miRNAs have been detected, although it has obtained a significant enrichment of these elements in pathological CNVs, suggesting that dysregulation of gene expression, mediated by such elements, could be a factor of predisposition for neurodevelopmental disorders. To try to explain the mechanisms that have led to the CNVs detected in this work, an analysis of the areas of uncertainty where the breakpoints are located was performed, observed in these regions a significant enrichment in repetitive sequences, genes and lincRNAs. These may participate in the formation of chromosomal rearrangements in different ways. Segmental duplications and Alu elements may intervene directly in the complex mechanisms that generate these rearrangements (NAHR, or FoSTeS NHEJ). On the other hand, the transcribed sequences can be vulnerable to breakage, when the chromatin is uncondensed and be exposed during their transcription at key stages as gametogenesis or early stages of embryonic development. Also, the enrichment in genes at the breakpoints could promote the formation of chimeric genes whose phenotype contribution would help to explain the different phenotypic consequences of deletions or duplications apparently equivalent. In this regard, it is estimated that in our study 60% of the deletions with areas of uncertainty less than 315 Kb could form a chimeric gene, confirming also the formation of fusion transcripts in the only three cases studied experimentally. Regarding the application of the specific array design for neurodevelopmental disorders, with a high density of probes on genes and regions with proven clinical value and a selection of genomic probes that allow a good resolution over the entire genome, our results indicate that it is an appropriate strategy to detect both intragenic alterations as larger pathological CNVs. However, the number of pathological intragenic alterations detected is minority, while the benign ones represent a high percentage, so the diagnostic yield of the array for such changes may be low. However, intragenic CNVs in candidate genes for ID can help to clarify the contribution of these genes in neurodevelopmental disorders. In addition, the different results obtained in relation to MYT1L gene, together with the information available in the literature, allow asserting that their haploinsufficiency causes intellectual disability often associated with autism, being obesity a much less common trait than initially stated, which can be due to other factors such as the alteration of different genes in the region. On the other hand, global methylation studies didn't allow to find significant differences between the group of patients with ID and genetic alteration in known genes involved in epigenetic regulation versus control group of healthy individuals, probably due to the large amount of endogenous, exogenous and experimental design factors that can modify these values. According to this, the clinical utility of this strategy as a marker of a disorder of the epigenetic machinery in patients with ID has not been validated. However, the screening of known imprinting loci has allowed the diagnosis of 5 patients, also showing evidence of two new imprinting syndromes, so that the study of methylation patterns in different known imprinted regions in DNA obtained from peripheral blood, can serve as a marker for new imprinting syndromes caused by epigenetic alterations multi-loci. With the results of this study it has been proved that within the genetic causes responsible for neurodevelopmental disorders, the phenotype of patients with idiopathic ID may be due to a combination of factors including, genomic rearrangements, point mutations or epigenetic alterations, hindering the initial clinical evaluation of these patients and the orientation of relevant genetic studies. So in these cases, a complete assessment of these factors can increase the likelihood of reaching an accurate diagnosis that enables proper counsel to families.

[es] Los trastornos del neurodesarrollo engloban desordenes cognitivos, de aprendizaje, comportamiento, comunicación y motores, que aparecen en edad temprana, como la discapacidad intelectual (DI) o los trastornos del espectro autista (TEA). Se trata de patologías complejas, debidas a alteraciones en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC), que pueden presentan agregación familiar o asociarse a otras anomalías congénitas o rasgos dismórficos. Pese a que la causa de este tipo de trastornos en muchos casos es desconocida, existen claras evidencias sobre sus bases genéticas, con un gran número de síndromes descritos que cursan con DI asociados a diversas variantes en número de copias (CNVs) o alteraciones epigenéticas. El desarrollo del sistema nervioso, la plasticidad neuronal o la organización sináptica son procesos dinámicos modulados por la epigenética, que actúa de mediador entre el medio ambiente al que nos vemos expuestos y cuyo receptor principal es el SNC, y la información contenida en los genes. Las alteraciones de estos mecanismos pueden ser génicas, al afectar a la secuencia de genes que codifican para proteínas que participan en estos procesos; o epigenéticas, al producirse cambios en las señales epigenéticas sin alteración de la secuencia del ADN. En base a esto, el presente trabajo pretende contribuir al conocimiento de la etiología y al diagnóstico genético de los trastornos del neurodesarrollo. Por un lado, mediante la búsqueda de alteraciones genéticas relacionadas con este tipo de trastornos, tanto en genes implicados en la regulación epigenética, la diferenciación y el desarrollo del SNC, como en elementos del genoma que puedan intervenir en la regulación de la expresión génica, principalmente elementos ultraconservados (UCEs) y miRNAs. Y por otro lado, con la búsqueda de alteraciones epigenéticas, centrándonos en la metilación del genoma completo y de regiones candidatas de interés, tales como dominios sometidos a metilación diferencial. Para ello se han utilizado distintas aproximaciones en una serie de 395 pacientes con DI y/o TEA de etiología desconocida que presentan además anomalías congénitas, rasgos dismórficos y/o distintos antecedentes familiares que puedan estar relacionados con estos trastornos. En el rastreo del genoma en busca de alteraciones genéticas se ha empleado como herramienta el CGH-array, utilizando, tanto uno comercial (4X44K, G4426B, Agilent Technologies) como otro de diseño propio, específico para este trabajo, centrado en genes y regiones de interés en los trastornos del neurodesarrollo. Los resultados obtenidos por ambas estrategias fueron confirmados por diversas técnicas (marcadores microsatélites, MLPA, PCR cuantitativa o FISH). Además se realizó un rastreo de mutaciones en el gen candidato MYT1L, mediante heterodúplex, en una serie de 69 pacientes clínicamente seleccionada, confirmando los resultados obtenidos por secuenciación. Para el rastreo de cambios en la metilación global del genoma se realizó, en un total de 17 pacientes con alteración conocida en algún gen epigenético y 33 controles, un estudio piloto mediante HPLC, método de referencia para esta determinación. Para el rastreo en regiones específicas, en toda la serie de pacientes, se seleccionaron 4 loci sometidos a impronta (KCNQ1OT1, H19, SNRPN y MEG3) utilizando un protocolo basado en el tratamiento con enzima de restricción sensible a metilación y PCR múltiple semicuantitativa, confirmando los resultados obtenidos mediante marcadores microsatélite, para poder valorar posibles disomías uniparentales, o MS-MLPA. Los estudios genéticos realizados mediante array han permitido detectar 220 cambios de dosis en 152 pacientes, siendo 58 de ellos portadores de alguna CNV claramente causal. Entre el 29 y el 50 % de los pacientes con un cambio de dosis patológico tienen afectado algún gen de la maquinaria epigenética cuya alteración tiene repercusión clínica. Además se observó un enriquecimiento significativo en genes epigenéticos en CNVs patológicas, en contraposición con un empobrecimiento de este tipo de genes entre las CNVs benignas. Los resultados obtenidos confirman la importancia de los genes responsables de los procesos epigenéticos en el neurodesarrollo, y su sensibilidad a los cambios de dosis. Sin embargo, no se han detectado alteraciones causales que afecten exclusivamente a UCEs o miRNAs, aunque se ha obtenido un enriquecimiento significativo de estos elementos en CNVs patológicas, lo que sugiere que la desregulación de la expresión génica, mediada por este tipo de elementos, podría suponer un factor de predisposición para los trastornos del neurodesarrollo. Para intentar explicar los mecanismos que han dado lugar a las CNVs, detectadas en este trabajo, se hizo un análisis de las zonas de incertidumbre donde se localizan los puntos de rotura, observándose en esas regiones un enriquecimiento significativo en secuencias repetitivas, genes y lincRNAs. Estos elementos podrían participar en la formación de los reordenamientos cromosómicos de distintas formas. Las duplicaciones segmentarias y los elementos Alu, podrían intervenir directamente en los complejos mecanismos que generan estos reordenamientos (NAHR, NHEJ o FoSTeS). Por otra parte, las secuencias que se transcriben, pueden ser vulnerables a sufrir roturas, al descondensarse la cromatina y verse expuestos durante su transcripción, en etapas clave como la gametogénesis o estadios tempranos del desarrollo embrionario. Asimismo, el enriquecimiento en genes de los puntos de rotura podría favorecer la formación de genes quimera cuya contribución al fenotipo ayudaría a explicar las diferentes consecuencias fenotípicas de deleciones o duplicaciones aparentemente equivalentes. En este sentido, se ha estimado que en nuestra serie un 60 % de las deleciones con zona de incertidumbre inferior a 315 Kb podría formar un gen quimera, confirmándose además la formación de transcritos de fusión en los únicos tres casos estudiados experimentalmente. En cuanto a la aplicación de un diseño específico de array para los trastornos del neurodesarrollo, con una alta densidad de sondas en genes y regiones con valor clínico demostrado y una selección de sondas genómicas que permitan una buena resolución a lo largo de todo el genoma, nuestros resultados indican que se trata de una estrategia adecuada para detectar tanto alteraciones intragénicas como CNVs patológicas de mayor tamaño. No obstante, el número de alteraciones intragénicas patológicas detectadas es minoritario, mientras que las benignas representan un alto porcentaje, por lo que el rendimiento diagnóstico del array para este tipo de alteraciones puede ser bajo. Sin embargo, las CNVs intragénicas en genes candidatos de DI pueden ayudar a aclarar la contribución de estos genes en los trastornos del neurodesarrollo. Además, los distintos resultados obtenidos en relación al gen MYT1L, junto con la información disponible en la bibliografía permiten aseverar que su haploinsuficiencia causa discapacidad intelectual frecuentemente asociada a autismo, siendo la obesidad un rasgo mucho menos frecuente de lo que inicialmente se indicaba, que puede deberse a otros factores como la alteración de diferentes genes de la región. Por otro lado, los estudios de metilación global no permitieron encontrar diferencias significativas entre el grupo de pacientes con DI y alteración genética conocida en genes implicados en la regulación epigenética frente al grupo control de individuos sanos, probablemente debido a la multitud de factores endógenos, exógenos y de diseño experimental que pueden modificar estos valores, por lo que la utilidad clínica de esta estrategia como marcador de un trastorno de la maquinaria epigenética en pacientes con DI no ha sido validada. Sin embargo, el rastreo en loci conocidos sometidos a impronta ha permitido diagnosticar a 5 pacientes, mostrando además evidencias en dos de ellos de sendos nuevos síndromes de impronta, por lo que el estudio de los patrones de metilación de distintas regiones improntadas conocidas, en ADN obtenido de sangre periférica, puede servir de marcador de nuevos síndromes de impronta causados por alteraciones epigenéticas multi-loci. Con los resultados de este trabajo ha quedado demostrado que dentro de las causas genéticas responsables de los trastornos del neurodesarrollo, el fenotipo de los pacientes con DI idiopática puede deberse a una combinación de factores que incluyen, reordenamientos genómicos, mutaciones puntuales o alteraciones epigenéticas, lo que dificulta la valoración clínica inicial de estos pacientes y la orientación de los estudios genéticos pertinentes. Por lo que en estos casos, realizar una completa evaluación de estos factores, permite aumentar la probabilidad de llegar a un diagnóstico certero que posibilite un correcto asesoramiento a las familias.