[en] Objectives On the light of the highly lipophylic nature of antineoplastic drugs tamoxifen (TMX) and 4-hydroxytamoxifen (HTMX), widely used in the treatmen of patients with ER-positive breast cancer, the general objective of this thesis is to deepen into the effect of those compounds on the structure and functionality of phospholipid membranes. This is translated into the following specific objectives: - To study the interaction of TMX and HTMX with model phospholipid membranes composed of the phospholipid 1,2 dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC). - To analyze the influence of TMX and HTMX on the structure and functionality of systems composed of the phospholipid 1,2 dielaidoylphosphatidylethanolamine (DEPE). - To characterize the molecular mechanism of the permeabilization of phospholipid membranes of various compositions by TMX and HTMX. Methodology These studies have been carried out under a biophysical approach, using experimental techniques and molecular dynamics (MD) simulations widely used in this field. The main experimental techniques are briefly described as follows. - The model membranes have been constituted by multilamellar vesicles (MLV) or unilamellar vesicles (LUV). MLV have been essentially prepared by the thin film hydration method, whereas LUV have been manufactured by polycarbonate filter extrusion. - Differential scanning calorimetry (DSC), has allowed analyzing the effect of the drugs under study on the thermotropic phase behaviour of the phospholipids. From the experimental thermograms phase diagrams were constructed, which allowed to analyze the influence of these compounds on the phase behaviour of the various phospholipids. - Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), which provided information on drug-phospholipid interactions from the effect observed on the characteristic absorption bands arising from the phospholipid polar headgroup (phosphate, carbonyl), as well as from acyl chains (methylene, terminal methyl). - X-Ray diffraction (XRD), allowing measurements both in the small and the wide angle. Our equipment provided electron density profiles of the phospholipids in the absence and presence of TMX and HTMX, analyzing the effect on bilayer thickness, acyl chain organization, and lipid polymorphism. - Fluorescence spectroscopy. This technique has been used to monitor the effect of TMX and HTMX on membrane fluidity, using fluorescent probes such as DPH and TMA-DPH. In addition, the quantitative analysis of membrane permeabilization was carried out using a fluorescent assay with carboxyfluorescein entrapped in LUV. - Complementary to the experimental studies, MD simulations were carried out. In these simulations a lipid bilayer was constructed using the selected phospholipids, and incorporated the drugs under study, always at molar ratios similar to those used in the experimental studies. Simulations were performed using GROMACS, with force field parameters CHARMM36. Initial membrane structures were constructed using Packmol, with productive runs of ca. 120 ns. Graphical plots were done using PyMOL. Results TMX and HTMX affect the phase behaviour of systems composed of the phospholipid DPPC, giving rise to drug-enriched domains within the bilayer (lateral phase separation), but both compounds locate in different regions within the membrane. MD data support the tendency of these compounds to aggregate inside the membrane, and locate TMX all along the bilayer, whereas HTMX is placed closer to the lipid/water interface. Incorporation of TMX into systems composed of DEPE gives rise to a widening of the lamellar-Lβ to lamellar-Lα phase transition, decreasing phase transition temperature. The Lβ/Lα phase transition shows multiple endotherms, indicating a lateral seggregation of TMX/DEPE domains within the plane of the bilayer. TMX and HTMX also displace and widen the lamellar-to-hexagonal-HII phase transition. Phase diagrams show that both drugs facilitate formation of the hexagonal-HII phase. FTIR spectroscopy shows that neither TMX nor HTMX induce a significant perturbation of DEPE bilayer hydration. MD simulations indicate that both compounds do not affect bilayer thickness, area per lipid, or the conformation of DEPE molecules, but do show a different location, and a different aggregation behaviour, of both compounds. TMX provokes rapid and extensive membrane permeabilization in 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glicero-3-phosphocholine (POPC) systems, the effect of HTMX being much weaker. Liposomal contents leakage curves are adjusted to two components, yielding rate constants corresponding to a slow and a fast processes. Interestingly, incorporation of phosphatidylglycerol or phosphatidylethanolamine protects the membrane against drug-induced permeabilization, MD providing data for a feasible explanation. FTIR shows an increase in gauche conformers, and a dehydration of the polar region of the membrane by effect of TMX or HTMX. Conclusions - The results shown in this thesis allow to conclude that TMX, as well as HTMX, incorporate into phospholipid membranes, forming domains segregated with the plane of the bilayer. Whereas TMX can locate all along the bilayer, HTMX is mostly found closer to the lipid/water interface. - Both drugs perturb the region of the phospholipid acyl chains, and dehydrate the polar headgroups region, the effects of TMX being quantitatively more significant. - TMX and HTMX can regulate membrane curvature, and thus to promote formation of non-lamellar phases. - It is shown that TMX, and HTMX to a lesser extent, permeabilize phosphatidylcholine membranes, allowing release of liposome aqueous contents. This action correlates with their distinct capacity to form aggregates, and their different location with the lipid bilayer. - Drug-induced membrane permeabilization is modulated by lipid composition, with phosphatidylglycerol and phosphatidylethanolamine having a protecting role. This is due to increased electrostatic interactions in the region of the polar headgroups, and the possibility of forming hydrogen bonds, what results in a more compact membrane. - Our data could provide a molecular basis for some of the pharmacological actions of TMX, and HTMX, not related to estrogen receptor binding, or even explain some the various side effects concomitant to therapy with these two drugs.

[es] Objetivos Dada la elevada naturaleza lipofílica de los fármacos antineoplásicos tamoxifeno (TMX) y 4 hidroxitamoxifeno (HTMX), de amplia utilización en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama ER-positivos, el objetivo general de esta tesis es profundizar en el efecto de dichas sustancias sobre la estructura y funcionalidad de las membranas fosfolipídicas. Esto se traduce en los siguientes objetivos específicos: - Estudiar la interacción de TMX y HTMX con membranas fosfolipídicas modelo compuestas del fosfolípido 1,2 dipalmitilfosfatidilcolina (DPPC). - Analizar la influencia de TMX y HTMX sobre la estructura y funcionalidad de sistemas compuestos por el fosfolípido 1,2 dielaidilfosfatidiletanolamina (DEPE). - Caracterizar el mecanismo molecular de la permeabilización de membranas fosfolipídicas modelo de distinta composición, por TMX y HTMX. Metodología En estos estudios se ha seguido fundamentalmente una aproximación biofísica, utilizando técnicas experimentales y simulaciones por dinámica molecular (MD) de amplio uso en este campo. Las técnicas experimentales son las siguientes. - Como modelos de membrana se han usado vesículas multilamelares (MLV) y vesículas unilamelares grandes (LUV). Las MLV se han preparado por el método de hidratación de películas finas, y las LUV por el método de extrusión a través de filtros de policarbonato. - Calorimetría diferencial de barrido (DSC), que permite analizar el efecto de los fármacos bajo estudio sobre el comportamiento termotrópico de fase de los fosfolípidos. A partir de los termogramas obtenidos se han elaborado diagramas parciales de fase para el componente lipídico, que han permitido analizar la influencia de estos compuestos sobre el comportamiento de fase de los distintos fosfolípidos, a saber DPPC, DEPE, y otros. - Espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR), que ha aportado información sobre la interacción droga-fosfolípido a partir del efecto sobre bandas de absorción características tanto de la cabeza polar (fosfato, carbonilo), como de las cadenas acílicas (metileno, metilo terminal). El equipo disponible ha permitido realizar barridos de temperatura y analizar estas interacciones tanto en fase gel, como en fase líquido-cristalina. - Difracción de rayos X, que permite medidas tanto en el ángulo estrecho como en el ángulo ancho. Con este equipo se han obtenido los perfiles de densidad electrónica de los fosfolípidos en ausencia y presencia de TMX y HTMX, analizando su efecto sobre el grosor de la bicapa, la organización de las cadenas acílicas, y el polimorfismo lipídico (formación de fases no lamelares, como la fase hexagonal invertida-HII). - Espectroscopía de fluorescencia. Esta técnica se ha usado en primer lugar para monitorizar el efecto de TMX y HTMX sobre la fluidez de la membrana, usando sondas fluorescentes como el DPH y el TMA-DPH. En segundo lugar, para analizar cuantitativamente la permeabilización de bicapas por TMX y HTMX. Para este fin se ha usado un ensayo de fluorescencia basado en la liberación de la sonda fluorescente carboxifluoresceína encapsulada en el compartimento acuoso de LUV. - Como complemento a los estudios experimentales, se ha llevado a cabo simulaciones de MD. En este tipo de simulaciones se ha construido una bicapa lipídica a partir del fosfolípido seleccionado, y se han incorporado los fármacos bajo estudio, a relaciones molares similares a las usadas en los estudios experimentales. Las simulaciones se han realizado con GROMACS, usando parámetros de campo de fuerza CHARMM36. Las estructuras de membrana iniciales se construyeron usando Packmol, y se usaron barridos productivos en torno a 120 ns. Las representaciones gráficas se hicieron con PyMOL. Resultados TMX y HTMX afectan al comportamiento de fase de DPPC, dando lugar a la formación de dominios enriquecidos en el fármaco dentro de la bicapa (separación lateral de fases). Ambos compuestos se localizan en regiones distintas dentro de la membrana. Por otra parte, TMX permeabiliza membranas fluidas, siendo el efecto de HTMX mucho más débil. La MD apoya la tendencia de estos compuestos a formar agregados dentro de la membrana, y localiza al TMX a todo lo largo de la bicapa, mientras que HTMX se localiza más próximo a la interfase lípido/agua. La incorporación de TMX en bicapas de DEPE produce un ensanchamiento progresivo de la transición de fase Lβ/Lα, y disminuye la temperatura de transición. La transición Lβ/Lα presenta múltiples endotermas, indicando una segregación lateral de dominios TMX/DEPE en el plano de la bicapa. TMX y HTMX también ensanchan y desplazan la transición de Lα/hexagonal-HII. A partir de los diagramas de fase se infiere que ambos compuestos facilitan la formación de la fase no lamelar HII. La FTIR muestra que ni el TMX ni el HTMX perturban de modo significativo el estado de hidratación de la bicapa de DEPE. Las simulaciones de MD indican que estos fármacos no afectan el grosor de la membrana, el área/lípido, o la conformación de las moléculas de DEPE. Sí se muestra una localización distinta para ambos compuestos, y una diferente tendencia a la agregación. El TMX provoca la permeabilización de membranas de POPC de modo rápido y extenso, siendo el efecto del HTMX mucho más débil. Las curvas de salida de contenidos liposomales se ajustan a dos componentes, dando dos constantes de velocidad correspondientes a un proceso lento y otro rápido. Es muy interesante el hecho de que la incorporación de fosfatidilglicerol o fosfatidiletanolamina protege a la membrana de la permeabilización inducida por los fármacos, sugiriéndose una explicación a partir de las simulaciones de MD. La FTIR muestra un aumento de confórmeros gauche y una deshidratación de la región polar de la membrana por efecto de TMX y HTMX. Los resultados aportan nueva información que podría explicar algunas de las actividades de estos fármacos no relacionadas con el receptor de estrógenos, o incluso algunos de sus efectos secundarios. Conclusiones - TMX y HTMX se incorporan a membranas fosfolipídicas y forman dominios segregados en el plano de la bicapa. - El TMX se puede localizar a todo lo largo de la bicapa fosfolipídica, mientras que el HTMX se sitúa más próximo a la interfase lípido/agua. - Estos dos fármacos desordenan la zona de las cadenas acílicas, y deshidratan la región de las cabezas polares de los fosfolípidos de la membrana, siendo los efectos del TMX más significativos. - TMX y HTMX pueden regular la curvatura local de la membrana, y así promover la formación de fases no-lamelares. - TMX, y en menor medida HTMX, permeabilizan membranas compuestas de fosfatidilcolina, permitiendo la liberación del contenido acuoso de las vesículas al medio externo. La magnitud de esta acción se correlaciona con la distinta capacidad de formar agregados y la distinta localización de ambos compuestos. - La permeabilización de membranas inducida por estos fármacos está modulada por la composición lipídica. Así, fosfolípidos como el fosfatidilglicerol y la fosfatidiletanolamina estabilizan la membrana frente a la permeabilización. Esto es debido a un aumento de las interacciones electrostáticas en la región de las cabezas polares, y a la posibilidad de formación de enlaces de hidrógeno, lo que se traduce en una membrana más cohesionada. - Nuestros datos pueden aportar una base molecular para algunas de las actividades farmacológicas de TMX y HTMX no relacionadas con el receptor de estrógenos, o incluso explicar alguno de los varios efectos secundarios que presentan.