[ca] Les factories cel·lulars microbianes poden ser utilitzades per produir un ampli rang de bioproductes d'interès per a la biotecnologia industrial, els quals comprenen principalment la producció de proteïnes recombinants i metabòlits. Pichia pastoris (Komagataela phaffii), emergeix com un hostatger prometedor per a la producció de proteïna recombinant (RPP) ja que comparteix moltes característiques amb Saccharomyces cerevisiae, però, mostra avantatges en relació amb el consum d'oxigen, tenir un patró de glicosilació més simple, i una menor secreció de proteïnes endògenes. Per aquestes raons, s'han realitzat grans esforços amb l'objectiu d'optimitzar l'eficiència d'aquest hostatger, els quals poden agrupar-se en dos principals i complementaris enfocaments: l'enginyeria de soques i bioprocés. La present tesi doctoral es va basar en l'ús de tots dos enfocs per tal de millorar bioprocessos de producció de lipases recombinants amb interès industrial. En primer lloc, es va demostrar la importància del coneixement de les cinètiques de producció com una potent eina per al disseny d'estratègies òptimes en la RPP a través de la caracterització de dos clons amb un diferent comportament, a causa de la seva diferent dosi gènica, expressant la lipasa 1 de Candida rugosa sota la regulació del promotor GAP (PGAP) duent a terme cultius en quimiòstat i fed-batch. Els resultats, també justificats mitjançant anàlisi transcripcional de diversos gens clau com important novetat, van demostrar que la cinètica de producció depèn de les característiques intrínseques de cada clon usat. D'aquesta manera, la selecció d'una &#956; adequada per a cada cas permet, d'una manera diferent, un desenvolupament racional del procés per poder optimitzar els bioprocessos RPP. Després, es va avaluar la potencial implementació de la deprivació de carboni (carbon-starving) com una innovadora estratègia que millori les velocitats de producció i rendiments de Crl1 en cultius fed-batch amb una prèvia caracterització fisiològica per a cultius en quimiòstat. Els resultats van evidenciar que l'efecte positiu d'utilitzar aquesta estratègia és altament depenent de les particularitats intrínseques del clon utilitzat. Es va realitzar una anàlisi transcripcional addicional (RNAseq) sobre mostres de quimiòstat, ressaltant la diferència en la transcripció per a tots els gens del llevat. A més, el comportament del bioprocés durant l'ús de promotor GAP (PGAP) es va comparar amb la utilització del promotor induïble AOX1 (PAOX1) duent a terme cultius en quimiòstat per a la producció de Crl1. Tot i que en el cas del PAOX1 es va apreciar una major producció, s'hauria de considerar una avaluació econòmica prèvia a l'escalat del bioprocés, tenint en compte els nombrosos inconvenients de l'ús de metanol com a substrat. Finalment, seguint l'enfocament de l'enginyeria de soques, es va caracteritzar l'ús de dos nous promotors independents de l'ús de metanol sobre l'expressió de la lipasa B de Candida antarctica (CalB) com una poderosa eina que permeti explotar el potencial de P. pastoris a la RPP. Tots dos promotors van mostrar molt millors resultats en comparació als obtinguts amb el PGAP tot i que els patrons de producció entre els promotors va ser significativament diferent per a cada cas. En resum, els resultats mostrats al llarg dels diferents capítols de la present tesi reforcen la utilitat de l'enginyeria de bioprocessos i de soques a través dels diferents estudis realitzats, els quals van permetre obtenir millores significatives en l'eficiència de la RPP. El coneixement dels factors clau involucrats en l'expressió recombinant obre una àmplia finestra de noves oportunitats que fan possible que P. pastoris s'estableixi com una plataforma robusta per a la RPP, mostrant-se altament competitiva enfront dels sistemes convencionals.

[en] Microbial cell factories can be used to produce a wide range of bioproducts of interest for the biotechnological industry, which comprises mainly the production of recombinant proteins and metabolites. Pichia pastoris (Komagataela phaffii), emerges as a promising host for recombinant protein production (RPP) due to it shares many features with Saccharomyces cerevisiae, however, displays some advantages in terms of oxygen consumption, simpler glycosylation pattern, and lower endogenous protein secretion. For these reasons, great efforts have been performed with the objective to optimize the efficiency of this host which can be grouped in two main and complementary approaches: the strain and bioprocess engineering. The present PhD thesis was focused in the use of both approaches, in order to improve the production bioprocess of recombinant lipases with industrial interest. At first, it was demonstrated the importance of the knowledge of production kinetics as strong tool to design optimal strategies for RPP through the characterization of two clones with contrasting production performance, due to its different gene dosage, expressing Candida rugosa lipase 1 (Crl1) regulated under GAP promoter (PGAP) using chemostat and fed-batch cultures. The results, also supported by transcriptional analysis of some target genes as marked novelty, demonstrated that production kinetics depends on the intrinsic characteristics of each clone used. Therefore, the selection of adequate µ for each case enables, in a different way, the rational process development to optimize RPP bioprocesses. Later, it was also evaluated the potential implementation of carbon-starving as innovative strategy to enhance the Crl1 production rates and yields on fed-batch cultures with a previous physiological characterization on chemostat cultivation. Results showed that positive effects observed using this strategy are highly dependent on the specific features of the clone used. An additional transcriptomic analysis (RNAseq) was carried out with chemostat samples, pointing out the difference on the transcription of all the genes of the yeast. In addition, bioprocess performance of the GAP promoter (PGAP) was compared with the inducible AOX1 promoter (PAOX1) by carrying out chemostat cultures producing Crl1. Although PAOX1 displayed higher production, an economical evaluation should be necessary before scale-up of the bioprocess, considering the numerous drawbacks of using methanol as substrate. Finally, following the strain engineering approach, it was characterized the use of two alternative methanol free novel promoters on the expression of lipase B from Candida antarctica (CalB) as strong tool that allows to exploit P. pastoris potential on RPP. Both promoters displayed much better production parameters than the observed with PGAP although the production pattern between promoters were significantly different on each case. Overall, the results presented along the different chapters of this current thesis support the usefulness of bioprocess and strain engineering through the different studies performed, which gave significant improvements in RPP efficiency. The knowledge of key factors involved on recombinant expression opens a window of new opportunities that allows P. pastoris to be established as a robust platform for RPP and showing it as highly competitive to conventional systems.