[en] Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder among older people, which is characterized by an insidious onset and progressive decline of cognitive functions. Nowadays there is no cure for this disease principally because its etiology is still unknown, although there is growing evidence that multiple pathological processes may be involved, with the confluence of genetic, environmental and aging-related factors. Furthermore, current diagnostic tests for AD show great limitations, including low sensitivity and specificity as well as the impossibility of early detection of the characteristic symptoms of this disease. Therefore, the identification of new biomarkers for diagnosis is critical. The main objective of this Thesis was the optimization of metabolomic and metallomic approaches, and subsequent application for studying the etiology of Alzheimer's disease and the discovery of potential diagnostic biomarkers. Analytical methods developed in works comprised in this Thesis are based on the use of mass spectrometry as detection technique, due to its wide range of applicability, sensitivity and specificity. In order to get a comprehensive metabolomic coverage we optimized multiple complementary analytical platforms, including procedures for direct analysis by mass spectrometry (DI- ESI-MS, FIA-APPI-MS) and its coupling with orthogonal separation techniques (UHPLC-MS, GC-MS, CE-MS). Direct analysis platforms showed a great potential to perform a first metabolic screening in multiple biological fluids and tissues, due to its reduced analysis time and instrumental simplicity. Subsequently, coupled techniques allowed carrying out a more comprehensive investigation of the whole metabolome by using complementary mechanisms of retention. Alternatively, we also developed a metallomic procedure based on the fractionation of metallo-species according to their molecular weight by means of protein precipitation in non-denaturing conditions and subsequent ICP-MS analysis. The application of these metabolomic and metallomic techniques in serum samples from patients with Alzheimer's disease and mild cognitive impairment allowed the identification of numerous pathological mechanisms related to the pathogenesis of this disorder and its progression from pre-clinical stages. Thus, some of the most important findings of this study were the detection of significant changes in the composition of membrane lipids, deficits in energy metabolism and neurotransmitter systems, oxidative stress, hyperammonemia, hyperlipidemia, or an altered homeostasis of multiple metallic and metalloid elements, among others. In turn, these metabolic disturbances were also observed in multiple biological compartments from the APPswe/PSlAE9 model, including serum, brain, liver, kidney, spleen and thymus, thus demonstrating the utility of this transgenic mouse for modelling AD. The comparison of different brain regions showed that the areas most affected by the characteristic neuropathology of this disease were hippocampus and cortex, although other regions were also disrupted to a lesser extent, including the striatum, cerebellum and olfactory bulbs. Furthermore, alterations detected in peripheral organs (i.e. liver, kidney, spleen and thymus) confirm the systemic nature of this neurodegenerative disorder. Finally, a new model of impaired immune function was developed based on the depletion of interleukin-4 gen in APP/PS1 (APP/PS1/TL4-KO) in order to investigate mechanisms underlying to the inflammatory component of AD. Thus, the application of metabolomic techniques revealed alterations in the biosynthesis of histamine, amino acid metabolism, production of eicosanoids and failures in the urea cycle. Therefore, it can be concluded that the combined application of multiple metabolomic and metallomic approaches in different biological matrices, from both human patients and animal models, allows to study in depth the etiology associated with Alzheimer's disease, and discover potential biomarkers of diagnosis.

[es] La enfermedad de Alzheimer (EA) es el trastorno neurodegenerativo más común entre la población de edad avanzada, el cual se caracteriza por un inicio insidioso y un declive progresivo de las funciones cognitivas, En la actualidad no existe una cura para esta enfermedad en gran parte debido a que su etiología es aún desconocida, aunque existe la creciente evidencia de que pueden intervenir múltiples procesos patológicos, donde confluyen factores tanto genéticos como ambientales, o propios del envejecimiento. Además, las actuales pruebas de diagnóstico de la EA muestran grandes limitaciones, incluyendo una baja sensibilidad y especificidad, así como la imposibilidad de detectar de forma precoz la sintomatologia característica de esta enfermedad. Por todo ello, la identificación de nuevos biomarcadores diagnósticos es de vital importancia. El objetivo principal de esta Tesis fue la optimización de procedimientos metaboiómicos y metalómicos, y su posterior aplicación en el estudio de la etiología de la enfermedad de Alzheimer y el descubrimiento de potenciales biomarcadores de diagnóstico. Los métodos analíticos desarrollados en los trabajos que componen esta Tesis se basan en el empleo de la espectrometría de masas como técnica de detección, debido a su amplio rango de apíicabilidad, sensibilidad y especificidad. Con el fin de conseguii- una cobertura metabolómíca integral se optimizaron múltiples plataformas analíticas complementarias, incluyendo procedimientos de análisis directo mediante espectrometría de masas (DI-ESI-MS, FIA-APPI- MS) y su acoplamiento con distintas técnicas de separación ortogonales (UHPLC-MS, GC-MS, CE-MS). Las plataformas de análisis directo mostraron un gran potencial para realizar un primer screening metabòlico de múltiples fluidos y tejidos biológicos, gracias a su reducido tiempo de análisis y simplicidad instrumental. Posteriormente, las técnicas acopladas permitieron llevar a cabo una investigación más exhaustiva de la totalidad del metaboloma mediante el empleo de mecanismos de retención complementarios. Alternativamente, también se desarrolló un procedimiento metalómico basado en el fraccionamiento de metalo-especies según su peso molecular mediante precipitación de proteínas en condiciones no desnaturalizantes y posterior análisis en ICP-MS. La aplicación de estas técnicas metabolómicas y metalómicas en muestras de suero sanguíneo de pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer y deterioro cognitivo leve permitió identificar numerosos mecanismos patológicos relacionados con la patogénesis de esta enfermedad y su progresión desde etapas pre-clínicas. Así, algunos de los hallazgos más importantes de este estudio fue la detección de alteraciones significativas en la composición de lípidos de membrana, déficits en el metabolismo energético y sistemas de neurotransmisión, hiperamonemia, hiperiipidemia, estrés oxidativo, o una homeostasis alterada de múltiples elementos metálicos y metaloides, entre otros. A su vez, estas perturbaciones metabólicas también fueron observadas en múltiples compartimentos biológicos del modelo APPswe/PSÍAE9, incluyendo suero, cerebro, hígado, riñón, bazo y timo, evidenciando así la utilidad de este ratón transgénico para modelar la EA. La comparación de distintas regiones cerebrales demostró que las áreas más afectadas por la neuropatologia característica de esta enfermedad son el hipocampo y la corteza cerebral, aunque otras regiones también se vieron perturbadas en menor medida, incluyendo el estriado, cerebelo y bulbos olfatorios. Además, las alteraciones detectadas en los órganos periféricos (i.e. hígado, rifíón, bazo y timo) confirman la naturaleza sistèmica de este trastorno neurodegenerativo. Por último, se desarrolló un nuevo modelo de función inmune deteriorada basado en la depleción del gen de la interleucina-4 en APP/PS1 (APP/PS1/IL4-KO) con el objetivo de investigar los mecanismos subyacentes a la componente inflamatoria de la EA. Así, la aplicación de técnicas metabolómicas reveló alteraciones en la biosíntesis de histamina, el metabolismo de aminoácidos, producción de eicosanoides y fallos en el ciclo de la urea. De este modo, se puede concluir que la aplicación combinada de múltiples técnicas metabolómicas y metalómicas en distintas matrices biológicas, tanto de pacientes humanos como animales modelo, permite estudiar en profundidad la etiología asociada a la enfermedad de Alzheimer, y descubrir así posibles biomarcadores de diagnosis.