[en] Osteoarthritis (OA) is the most common joint disease in the elderly and it is associated with a progressive loss of articular cartilage, low-grade synovitis and several deleterious alterations in subchondral bone and periarticular tissues. In OA there is an imbalance between joint anabolic and catabolic processes that is aggravated by mechanical stress and accumulation of inflammatory mediators. There is no effective treatment for OA, although new therapies have been investigated, such as the use of mesenchymal stem cells (MSCs) or the products that they release into the extracellular space (secretome). In this thesis we have studied the potential use of extracellular vesicles (EVs) from the secretome of adipose tissue-derived MSCs (ASCs) as a possible heterologous cell-free biological therapy for osteoarthritic joint cells. It is known that MSCs, which have shown immunomodulatory and regenerative properties, release a heterogeneous set of soluble mediators and EVs whose interactions with other cells and tissues could explain the effects of MSCs. EVs are actively secreted by practically all cell types and represent a novel mechanism of intercellular communication both under physiological and pathological conditions. In our work, we have successfully characterized two specific vesicular subtypes in the conditioned medium (CM) of ASCs, of different sizes and compositions, defined as microvesicles (MVs) and exosomes (EXs). Their protein composition has been studied by mass spectrometry and confocal microscopy, identifying several proteins with potential immunomodulatory and protective effects such as annexin A1. Chronic inflammation explains many alterations in OA. The possible immunomodulatory effects of MVs and EXs have been studied in primary osteoarthritic chondrocytes and cartilage explants stimulated with IL-1beta. Our results indicate that both types of EVs replicate or improve the effects of the CM from which they come. They reduced the release of proinflammatory cytokines such as IL-6 and TNFalpha and promoted the synthesis of IL-10 and collagen type II. They also inhibited the production of PGE2 and NO, the MMP enzymatic activity, the transcription of COX-2 and mPGES-1, and the activation of NF-kB and AP-1. EV-Annexin A1 blockade with specific antibodies reversed the inhibition of IL-6 synthesis and the production of collagen type II. In OA, aging leads to oxidative stress and senescence. We have evaluated the anti-senescent effects of EVs in primary osteoarthritic osteoblasts stimulated with IL-1beta, and found that EVs promote the release of IL-10 and inhibit the production of IL-6 and PGE2. They inhibit lipid peroxidation, restore the mitochondrial membrane potential, and reduce senescence-associated beta-galactosidase activity and the accumulation of yH2AX foci. Our results indicate that EVs are relevant actors in the ASC secretome and represent a new therapeutic strategy for the treatment of chronic inflammatory joint diseases.

[es] La osteoartritis (OA) es la enfermedad articular más común en las personad de edad avanzada y se asocia con una pérdida progresiva de cartílago articular, sinovitis de bajo grado y varias alteraciones perjudiciales en el hueso subcondral y los tejidos periarticulares. En la OA hay un desequilibrio entre los procesos anabólicos y catabólicos de las articulaciones que se agrava por el estrés mecánico y la acumulación de mediadores inflamatorios. No existe un tratamiento eficaz para la OA, aunque se han investigado nuevas terapias, como el uso de células madre mesenquimales (MSC) o los productos que liberan en el espacio extracelular (secretoma). En esta tesis, hemos estudiado el uso potencial de las vesículas extracelulares (EV) del secretoma de MSC derivadas de tejido adiposo (ASCs) como una posible terapia biológica heteróloga sin células para las células de la articulación osteoartrítica. Se sabe que las MSC, que han mostrado propiedades inmunomoduladoras y regenerativas, liberan un conjunto heterogéneo de mediadores solubles y EVs cuyas interacciones con otras células y tejidos podrían explicar los efectos de las MSC. Las EVs son secretadas activamente por prácticamente todos los tipos de células y representan un nuevo mecanismo de comunicación intercelular tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. En nuestro trabajo, hemos caracterizado con éxito dos subtipos vesiculares específicos en el medio condicionado (CM) de las ASC, de diferentes tamaños y composiciones, definidas como microvesículas (MV) y exosomas (EX). Su composición de proteínas se ha estudiado mediante espectrometría de masas y microscopía confocal, identificando varias proteínas con posibles efectos inmunomoduladores y protectores, como la anexina A1. La inflamación crónica explica muchas alteraciones en la OA. Los posibles efectos inmunomoduladores de MV y EX se han estudiado en condrocitos osteoartríticos primarios y explantes de cartílago estimulados con IL-1beta. Nuestros resultados indican que ambos tipos de EV replican o mejoran los efectos del CM del que provienen. Redujeron la liberación de citoquinas proinflamatorias tales como IL-6 y TNFalpha y promovieron la síntesis de IL-10 y colágeno tipo II. También inhibieron la producción de PGE2 y NO, la actividad enzimática de MMP, la transcripción de COX-2 y mPGES-1, y la activación de NF-kB y AP-1. El bloqueo de EV-anexina A1 con anticuerpos específicos revirtió la inhibición de la síntesis de IL-6 y la producción de colágeno tipo II. En la OA, el envejecimiento conduce a estrés oxidativo y senescencia. Hemos evaluado los efectos anti-senescentes de los EV en los osteoblastos osteoartríticos primarios estimulados con IL-1beta y encontramos que las EVs promueven la liberación de IL-10 e inhiben la producción de IL-6 y PGE2. Inhiben la peroxidación lipídica, restauran el potencial de membrana mitocondrial y reducen la actividad de la beta-galactosidasa asociada a la senescencia y la acumulación de focos yH2AX. Nuestros resultados indican que los EV son actores relevantes en el secretoma de ASC y representan una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de enfermedades articulares inflamatorias crónicas.