[en] Membrane proteins perform different functions in the cell, controlling molecular trafficking and facilitating signal transduction. However, the study of these proteins is challenging due to their particular physicochemical characteristics. One critical step in the synthesis of membrane proteins is their insertion into the lipid bilayer. Generally, this process occurs through a co-translational mechanism, where insertion is coupled to the translation process. This co-translational pathway has been widely studied and the machinery involved in the process is well known. However, some proteins follow a different route for insertion which molecular details are poorly characterized. This alternative route is known as post-translational, because the insertion in the bilayer occurs once the protein translation is complete. In the first part of this thesis, we have described an experimental procedure to identify proteins involved in membrane protein insertion through the post-translational route. For this purpose we desinged a chimera containing the Staphylococcus aureus nuclease followed by the transmembrane fragment of Glycoforin A, located at the carboxyl terminal end of the chimera. An identical chimeric protein lacking the transmembrane segment was used as a control. Next, we analyzed the interactome associated with both chimeras using different strategies (mass spectrometry, chemical cross-linking, non-reducing / reducing two-dimensional gels and cell fractionation) with the aim of finding proteins that associate specifically with the chimera containing the transmembrane domain. We identified XXXX proteins interacting with our membrane chimera. Next, we validate the interaction of two of these proteins (HslU, with chaperone function and MetH, involved in methionine metabolism) using molecular exclusion chromatography techniques, light scattering assays and identification of cross-linked peptides within mass spectra. In this work we have identify new components of the post-translational route. However, their precise role on the insertion of Ct anchoring proteins remains elusive. Understanding protein interactions can provide a strong foundation for the complete understanding of cell mechanisms, information that is valuable for drug discovery and development. Identification of the protein-protein interactions between host cells and viruses has allowed the identification of many components involved in viral infection, which may be potential targets for vaccine or drug development. In the second part of the thesis, we analyzed the cellular proteins present in viral particles of the Nipah virus using mass spectrometry techniques. Nipah virus belongs to the family Paramyxoviridae, composed of single-stranded RNA viruses with negative genome polarity and lipid envelope. We currently lack specific treatments against Nipah virus. This virus infects a wide range of animals and causes severe disease and death in people, making it a public health concern. To identify the cellular proteins incorporated in the Nipah virion, VLPs (Virus Like Particles) were generated by transfection of human cells with the viral proteins F, G and M. Next, VLPs produced were purified and the cellular components analyzed by mass spectrometry. We identified 67 host protein in the viral particles. These proteins i participate mainly in the transport of membrane vesicles from internal membranous compartments to the plasma membrane or viceversa. Collectively, our data might contribute to decipher viral budding necessities and particularly to a more profound knowledge of NiV life cycle.

[es] Las proteínas de membrana tienen funciones muy diversas en la célula, desde controlar el tráfico molecular hasta facilitar la transducción de señales. Sin embargo, el estudio de estas proteínas supone todo un reto por sus particulares características fisico-químicas. Su naturaleza hidrofóbica requiere un elevado control durante su síntesis. Uno de los pasos críticos en esta síntesis es la inserción en la bicapa lipídica. Generalmente, este proceso se produce a través de un mecanismo (co-traduccional) acoplado al proceso de traducción. Esta vía co-traduccional ha sido ampliamente estudiada y la maquinaria implicada en el proceso se conoce con bastante profundidad. Sin embargo, algunas proteínas (aquellas que presentan el primer segmento transmembrana lejos del inicio de la proteína) siguen una ruta para su inserción diferente. Esta ruta alternativa, es conocida como post-traduccional, debido a que la inserción en la bicapa se produce tras la traducción de la proteína. Los detalles moleculares de esta vía alternativa están pobremente caracterizados. En la primera parte de esta tesis hemos descrito un procedimiento experimental para identificar proteínas involucradas en la inserción de proteínas de membrana a través de la ruta post-traduccional. Para ello hemos creado una quimera que contiene la nucleasa de Staphylococcus aureus seguida del fragmento transmembrana de Glicoforina A (proteína modelo de membrana) en el extremo carboxilo terminal. Una proteína quimérica idéntica, pero carente del segmento transmembrana fue utilizada como control. A continuación, hemos analizado el interactoma de ambas quimeras utilizando diferentes estrategias experimentales como espectrometría de masas, entrecruzamiento químico, geles de dos dimensiones no reductores/reductores y fraccionamiento celular con la esperanza de encontrar proteínas que se asocien de manera específica a la quimera con segmento transmembrana y que participen en el proceso de inserción de la misma. A continuación, validamos la interacción de dos de las proteínas identificadas (HslU, una proteína con función chaperona y MetH, una proteína implicada en el metabolismo de la metionina) mediante técnicas de cromatografía de exclusión molecular, ensayos de luz dispersada e identificación de los fragmentos entrecruzados. Los datos obtenidos nos han permitido identificar nuevos componentes de la ruta post-traduccional así como analizar la multifuncionalidad del proteoma de E.coli, . Comprender las interacciones entre proteínas facilita información sobre el funcionamiento de las mismas y, entre otras aplicaciones, puede resultar de utilidad para el diseño de fármacos. De hecho, el estudio de las interacciones proteína-proteína entre la célula hospedadora y los virus, ha permitido la identificación de componentes celulares implicados en la infección viral, que pueden ser potenciales dianas para el desarrollo de vacunas o medicamentos con acción antiviral. En esta segunda parte de las tesis, hemos analizado mediante técnicas de espectrometría de masas las proteínas celulares presentes en partículas virales (VLPs) del virus Nipah. Este virus pertenece a la familia Paramyxoviridae, la cual está compuesta por virus con genomas de ssRNA de cadena negativa y envoltura lipídica. Actualmente carecemos de tratamientos específicos contra el virus Nipah, siendo estos una prioridad en la investigación biomédica debido a la alta tasa de mortalidad asociada a la infección y el amplio rango de hospedadores a los que puede afectar. Para identificar las proteínas celulares incorporadas en el virión de Nipah, se generaron VLPs (Virus Like Particles) mediante la transfección de las proteínas virales F, G y M en cultivos celulares humanos. Posteriormente las VLPs producidas fueron purificadas y los componentes celulares asociados a las mismas analizados mediante espectrometría de masas. Nuestros resultados mostraron la presencia de proteínas celulares en las VLPs de Nipah que participaban principalmente en el transporte de proteínas y/o vesículas desde los compartimentos internos hasta la superficie celular. Estas proteínas celulares podrían tener una implicación en el ciclo viral y son por lo tanto potenciales dianas terapéuticas contra el virus Nipah.