[ca] El mal plegament i l'agregació amiloide de la transtiretina (TTR) s'associa amb un grup de trastorns de pronòstic fatal coneguts com a amiloïdosi per TTR (ATTR). Aquestes malalties són majoritàriament hereditàries i són causades per mutacions que desestabilitzen l'estat natiu de la TTR. Cal indicar que la deposició de la variant natural de la proteïna sembla ser una causa freqüent d'insuficiència cardíaca en les persones majors. Unes certes molècules petites que s'uneixen a la TTR poden actuar com a estabilitzadors cinètics, impedint la dissociació del tetràmer i, per tant, l'agregació. En aquest context, el nostre grup va reposicionar tolcapone, una molècula aprovada per la FDA per a la malaltia de Parkinson, com un potent inhibidor de l'agregació de TTR. A més, en ser capaç de travessar la barrera hematoencefàlica podria suposar una opció per a l'amiloïdosi leptomeníngia, intractable en data d'avui. En la present tesi, demostrem que tolcapone s'uneix i inhibeix l'agregació de les variants de TTR associades amb l'amiloïdosi leptomeníngia, evidencies que suggereixen que podríem estar davant del primer fàrmac d'ampli espectre pel tractament de totes les manifestacions de la malaltia. Les estructures dels complexos cristal.logràfics (TTR:tolcapone) van revelar la possibilitat de millorar la seva potència mitjançant l'establiment de contactes addicionals amb la proteïna. Combinant el disseny racional i les simulacions de dinàmica molecular hem dissenyat el M-23, una molècula que presenta una de les majors afinitats per la TTR descrites actualment. L'estructura cristal·lina confirma que, com es pretenia, M-23 forma nous i forts contactes amb la TTR, la qual cosa condueix a una major estabilització del tetràmer tant in vitro com en sèrum en compració amb tolcapone. Aquests resultats ens van animar a continuar avançant el M-23 com a fàrmac per a l'ATTR, malgrat que el seu deficient perfil farmacocinètic en compromet el seu ús terapèutic. En aquest context, vam desenvolupar el PITB, un derivat de M-23 que manté les interaccions que estableix amb la TTR al mateix temps que millora la seva farmacocinètica. La caracterització estructural i biofísica de la interacció de PITB amb TTR va revelar que s'uneix amb alta afinitat tant a la proteïna de tipus salvatge com a les dues variants de TTR més significatives clínicament, les estabilitza i n'inhibeix la seva agregació. A més a més, cal remarcar que el PITB exerceix un major efecte estabilitzador del tetràmer en plasma de pacients que tolcapone, la qual cosa unit a la seva destacable farmacocinètica fan del PITB un candidat molt prometedor per al tractament de l'ATTR i a un cost assequible per als pacients. Malgrat que s'han obtingut molts coneixements en base a l'estudi de les estructures tridimensionals, aquestes no aporten llum sobre la dinàmica de les alteracions conformacionales implicades en l'amiloidogenicidad de les variants de TTR ni quan volem avaluar l'efecte de llligands estabilitzadors. Amb l'objectiu de cobrir aquesta necessitat, en el present treball explotem el potencial de dues tècniques analítiques de petjada peptídica basades en l'espectrometria de masses com són l'intercanvi de deuteri per hidrogen (HDX) i l'oxidació fotoquímica ràpida de proteïnes (FPOP). Les dades obtingudes ens han proporcionat informació rellevant a nivel de residu tant de l'efecte de les mutacions patogèniques de la TTR com de la unió dels agents estabilitzants analitzats. En conseqüència, destacar que aquestes tècniques ens permeten establir una alternativa molt prometedora i que no ha estat explorada prèviament per al cribatge personalitzat d'estabilitzadors cinètics de TTR dirigits a variants específiques. En conjunt, els resultats obtinguts en aquesta tesi proporcionen una comprensió significativa dels determinants estructurals de l'estabilització cinètica de TTR, i donen suport al desenvolupament dels estabilitzadors cinètics com a fàrmacs prometedors per al tractament de l'ATTR.

[en] Transthyretin (TTR) misfolding and amyloid aggregation is associated with a group of fatal disorders known as TTR amyloidosis (ATTR). Most of these diseases are hereditary, being caused by mutations that destabilize TTR's native state. Noteworthy, wild-type protein deposition also occurs and is considered a common cause of heart failure in the elderly. Small molecules that bind TTR can act as kinetic stabilizers, preventing tetramer dissociation and thus aggregation. In this context, our group repurposed tolcapone, an FDA-approved molecule for Parkinson¿s Disease, as a potent TTR aggregation inhibitor. Importantly, tolcapone¿s unique ability to cross the blood-brain barrier suggests that it could be an option for leptomeningeal amyloidosis, a rare type of ATTR that cannot be addressed with any of the current therapies. In the present thesis, we demonstrated that tolcapone binds to and inhibits the aggregation of TR variants associated with leptomeningeal amyloidosis, suggesting that it can become the first broad-spectrum drug to treat all manifestations of the disease. Despite the excellent performance of tolcapone, the structures of TTR:tolcapone complexes revealed that it could be redesigned to establish more contacts with the protein, which could improve its potency. By combining rational design and molecular dynamics simulations we discovered M-23, a molecule that presents one of the highest affinities for TTR reported thus far. The crystal structure confirmed that, as intended, M-23 forms new and strong contacts with the protein, leading to a higher tetramer stabilization both in vitro and in serum relative to tolcapone. These results encouraged us to further develop M-23 into a drug for ATTR, yet its poor pharmacokinetic profile could compromise its therapeutic use. In this context, we developed PITB, a M-23 derivative that keeps the interactions it establishes with TTR while improving its pharmacokinetics. The structural and biophysical characterization of PITB interaction with TTR revealed that it binds with high affinity to both the wild-type protein and the two most clinically significant TTR variants, stabilizes them, and inhibits their aggregation. Most importantly, PITB exerted a higher tetramer stabilizing effect in plasma from patients than tolcapone, which together with its remarkable pharmacokinetics make of PITB a very promising candidate to treat ATTR and at an affordable cost for all patients. While much insight has been gained in these studies through three-dimensional structures, they do not shed light into the dynamics of the conformational alterations involved in the amyloidogenicity of disease-related TTR variants or assess the effect of molecular binders. To address this gap, in this thesis we exploited the potential of two mass spectrometry-based footprinting methods, hydrogen deuterium exchange (HDX) and fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). The data obtained provided valuable insights into the effect of pathogenic mutations and kinetic stabilizers on TTR structure, opening a new avenue for the personalized screening of TTR kinetic stabilizers targeting specific variants. All in all, the results obtained in this thesis provide significant understanding of the structural-determinants of TTR kinetic stabilization, and support the development of the molecules presented here as drugs to treat ATTR.