[en] Introduction: Colorectal cancer (CRC) is the third most common malignancy and the second leading cause of cancer-related mortality worldwide. The analysis of circulating tumor cells (CTCs) and circulating tumor DNA (ctDNA), two key components of liquid biopsy (LB), has emerged as a prognostic and predictive biomarker in various cancer types, including colorectal cancer. LB techniques enable real-time patient monitoring and support risk stratification for recurrence and/or metastasis, aiding therapeutic decisionmaking. This thesis aims to identify early recurrences in colon cancer through the analysis of circulating tumor cells (CTCs) and circulating tumor DNA (ctDNA). The specific objectives are as follows: 1) To establish a semi-automated protocol for the isolation and multi-phenotyping of CTCs. 2) To determine the prognostic value of CTCs for risk stratification of recurrence. 3) To evaluate the prognostic significance of ctDNA concentration and fragment profile. 4) To correlate the presence and number of CTCs with ctDNA concentration. Materials and Methods: Peripheral blood samples (10 ml) were collected from patients with colon cancer (CC), excluding those with rectal cancer. The study was divided into two phases: 1. Phase I: Included 16 patients focused on the development and optimization of the protocol for CTC isolation and characterization. 2. Phase II: Incorporated a validation cohort of 31 patients where both CTCs and ctDNA were analyzed. This phase included two subgroups: o Cohort 1: 5 patients with stage I CC and 18 patients with stage II CC. o Cohort 2: 8 patients with stage III CC. Additionally, Cohort 3 consisted of 30 healthy donors as the control group. Blood samples were collected at two critical time points: a baseline sample, taken two hours before surgery, and another one month after surgery. Patients in Phase II were followed for two years to monitor for tumor recurrence. For CTC analysis, isolation, and phenotypic characterization, a methodology combining two semi-automated platforms was used: IsofluxTM®, a microfluidics-based cell isolation platform (Fluxion Biosciences), and ImageStreamX®, an advanced flow cytometer capable of capturing integrated fluorescence signals and high-resolution fluorescence images. This approach enabled detailed and precise CTC characterization. For ctDNA analysis, circulating free DNA (cfDNA) was processed automatically from plasma using Maxwell® technology. Once isolated, concentration and quality were determined using Qubit® and Bioanalyzer Agilent 1000® systems. To characterize the fragment profile of tumor ctDNA, the TapeStation® platform was employed. Both protocols were specifically developed for this doctoral thesis. Data analysis was performed using the STATA statistical software, version 16. Results: Of the 31 patients included in Phase II, three experienced tumor recurrence in the form of metastases. Of these, only one presented CTCs in the post-surgery sample. In one of the three cases, it was not possible to evaluate the dynamics of CTCs. The concentration of ctDNA was significantly higher in colon cancer patients compared to healthy controls, with a particularly notable increase in stage II patients. Furthermore, ctDNA fragments were observed to be shorter (100–200 bp) compared to cfDNA from controls. This pattern was particularly pronounced in women, who exhibited a higher frequency of short ctDNA fragments. Additionally, the cfDNA concentration was significantly elevated in baseline samples from patients with CTC clusters. However, this difference was not observed in follow-up samples. Discussion: The integration of CTC and ctDNA analysis provides a more comprehensive and dynamic understanding of tumor heterogeneity in real time. Studying the number and subpopulations of CTCs allows for a detailed assessment of tumor heterogeneity, identifying predominant and potentially more aggressive tumor subclones. Simultaneously, the fragmentomic profile of ctDNA offers valuable information for the early detection of tumor recurrence and enables the analysis of specific mutations that may serve as therapeutic targets in personalized treatments. Conclusions: The findings of this research provide a solid foundation for considering liquid biopsies as promising tools in the management of early-stage colon cancer. However, further multicenter studies are essential to confirm the clinical utility of these technologies. Additionally, continued efforts are needed to validate and standardize these methods to ensure their widespread application in clinical practice.

[es] Introducción: El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tumor más incidente y el segundo de mayor mortalidad en el mundo. El análisis de las células tumorales circulantes (CTCs) y de ADN circulante tumoral (ctDNA), dos de los analitos de la Biopsia Líquida (BL), han emergido como biomarcadores pronósticos y predictivos, en diferentes tipos de cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal. Las técnicas de BL permiten la monitorización en tiempo real de los pacientes, así como la estratificación del riesgo de recidiva y/o metástasis ayudando a la toma de decisiones terapéuticas. Esta tesis tiene como objetivo general la identificación precoz de las recidivas en cáncer de colon mediante el análisis de células tumorales circulantes (CTCs) y ADN circulante tumoral (ctDNA). Así, los objetivos específicos desarrollados son: 1) la puesta a punto de un protocolo semiautomatizado de aislamiento y multifenotipado de CTCs. 2) Determinar el valor pronóstico de las CTCs para la estratificación del riesgo de recaída. 3) Determinar el valor pronóstico de la concentración y perfil de fragmentos del ctDNA y 4) Correlacionar la presencia y número de CTCs con la concentración de ctDNA. Material y métodos: Se obtuvieron 10 ml de sangre periférica de pacientes con cáncer de colon (CC), excluyendo a aquellos con cáncer de recto. El estudio se estructuró en dos fases: 1. Fase I: Incluyó 16 pacientes y se centró en el desarrollo y optimización del protocolo para el aislamiento y caracterización de CTCs. 2. Fase II: Incorporó una cohorte de validación de 31 pacientes en los que se analizó tanto las CTCs como el ctDNA, divididos en dos subgrupos: o Cohorte 1: 5 pacientes con CC en estadio I y 18 pacientes en estadio II. o Cohorte 2: 8 pacientes con CC en estadio III. Además, se incluyó una Cohorte 3 formada por 30 donantes sanos como grupo control. Se realizaron extracciones de sangre en dos momentos clave: una extracción basal, realizada dos horas antes de la cirugía, y otra al mes posterior a la intervención quirúrgica. Los pacientes de la fase II fueron seguidos durante un período de dos años para monitorear la aparición de recidivas tumorales. Para el análisis, aislamiento y caracterización fenotípica de las CTCs se empleó una metodología basada en la combinación de dos plataformas semiautomatizadas: IsofluxTM®, una plataforma de aislamiento celular mediante tecnología de microfluídica (Fluxion Biosciences), e ImageStreamX®, un citómetro de flujo avanzado que permite captar señales de fluorescencia integradas y obtener imágenes de fluorescencia de alta resolución. Este enfoque permitió una caracterización detallada y precisa de las CTCs. Para el análisis de ctDNA, se procesó el ADN libre circulante (cfDNA) del plasma de forma automatizada utilizando la tecnología Maxwell®. Una vez aislado, se determinó su concentración y calidad mediante los sistemas Qubit® y Bioanalyzer Agilent 1000®. Para la caracterización del perfil de fragmentación del ctDNA tumoral, se empleó la plataforma TapeStation®. Ambos protocolos fueron desarrollados específicamente para la ejecución de esta tesis doctoral. El análisis de los datos obtenidos se llevó a cabo utilizando el software estadístico STATA, versión 16. Resultados: De los 31 pacientes incluidos en la fase II, tres desarrollaron recidiva tumoral en forma de metástasis. De estos, solo uno presentó CTCs en la muestra obtenida después de la cirugía. En uno de los tres casos no fue posible evaluar la dinámica de las CTCs. La concentración de ctDNA fue significativamente mayor en los pacientes con cáncer de colon en comparación con los controles sanos, con un aumento especialmente notable en aquellos en estadio II. Además, se observó que los fragmentos de ctDNA tenían una longitud menor (100-200 pb) en comparación con el cfDNA de los controles. Este patrón fue particularmente pronunciado en las mujeres, quienes presentaron una mayor frecuencia de fragmentos cortos de ctDNA. Por otro lado, se identificó que la concentración de cfDNA era significativamente más alta en las muestras basales de pacientes que presentaban clústeres de CTCs. Sin embargo, esta diferencia no se mantuvo en las muestras obtenidas durante el seguimiento. Discusión: La integración del análisis de CTCs y ctDNA permite obtener una visión más completa y dinámica de la heterogeneidad tumoral en tiempo real. El estudio del número y las subpoblaciones de CTCs ofrece una evaluación detallada de la heterogeneidad tumoral, permitiendo identificar subclones tumorales predominantes y potencialmente más agresivos. Paralelamente, el perfil fragmentómico del ctDNA proporciona información valiosa para la detección temprana de recidivas tumorales y posibilita el análisis de mutaciones específicas, que pueden servir como dianas terapéuticas en tratamientos personalizados. Conclusiones: Los hallazgos de esta investigación constituyen una base sólida para considerar las biopsias líquidas como herramientas prometedoras en el manejo del cáncer de colon en estadios tempranos. Sin embargo, es fundamental llevar a cabo estudios multicéntricos adicionales para confirmar la utilidad clínica de estas tecnologías. Asimismo, es necesario avanzar en su validación y protocolización para garantizar su aplicación estandarizada en la práctica clínica.