[en] The differentiation capacity of mesenchvmal stem cells (MSCs) towards chondrocytes, in a process called chondrogenesis, provides them a great therapeutic potential for the repalr of cartJlage defects in rheumatic diseases such as osteoarthritis (OA). However, the molecular mechanisms underlving the chondrogenesis process are still in part unknown. Proteomic tools enable us to globallv analvze cellular activitv, obtaining proteomic profiles that provide us information about the present connections between proteins and ceJlular pathwavs. In this work, we have emploved different proteomic strategies in order to elucidate the molecular mechanisms involved in the chondrogenesis process of bone marrow MSCs, with the purpose of identify new chondrogenic markers useful for molecular monitorization in cell therapv-based approaches for cartllage repair. Firstly, we standardized SILAC labeling in bone marrow MSCs in order to carry out quantitatlve proteomic experiments. Once the SILAC method was optimized, its application aJlowed us to describe the modulations of intraceJlular proteins during the chondrogenic differentiation of MSCs. 65 proteins exhibited a significant modulation of their levels between the two different stages of chondrogenic differentiation (daV 2 vs. dav 14). Most of these proteins were involved in cellular metabolism and glvcolvsis. Next, we emploved a double-SILAC strategy, followed bV nanoLC-ESI·MS analysis, to Identify and quantify the extraceJlular proteins of M5Cs at davs 2 and 14 of chondrogenesis. Using this methodology, we found alterations in the abundance of 34 proteins between the two time points evaluated. Most of the proteins increased at day 14 were cartilage-specific ECM proteins. Proteoglvcan 4 (PRG4) and TIMP1 were validated bV immunoassavs so both have a valuable potential use as biomarkers of chondrogenic differentiation. Flnallv, we confirmed the utilltV of mass spectrometry imaging (MSI) for the characterization of the lipids involved in chondrogenesis. In this studv, we confirmed that M5Cs mobilize the sphingomvelin during their differentiation toward chondrocytes and the phosphocholine-related lipids could be markers of the undifferentiated stage.

[es] La capacidad de diferenciación de las células madre mesenquimales (MSCs) hacia condrocitos, en un proceso conocido como condrogénesis, concede a estas células un gran potencial terapéutico para la reparación de los defectos del cartílago característicos de enfermedades reumáticas como la artrosis. Sin embargo los mecanismos moleculares que participan en este proceso de diferenciación no son del todo conocidos. las técnicas proteómicas posibilitan analizar globalmente la actividad celular, ya que permiten obtener perfiles proteicos que proporcionan Información sobre las conexiones existentes entre las proteínas y las rutas o procesos celulares en las que participan. En este trabajo se han empleado diferentes metodologías proteómicas para estudiar los mecanismos moleculares que participan en la diferenciación condrogénica de las MSCs obtenidas de médula ósea, con el fin de identificar nuevos marcadores condrogénicos que puedan emplearse en la monitorización de terapias celulares encaminadas a la reparación del cartílago. Inicialmente se estandarizó el marcaje metabólico SILAC en MSCs aisladas de médula ósea para llevar a cabo los estudios proteómicos cuantitativos. Una vez optimizado este método, su aplicación nos permitió describir las proteínas intracelulares cuya abundancia se altera durante el proceso de diferenciación de las MSCs. Los niveles de expresión de 65 proteínas se modularon significativamente entre los dos estadios celulares analizados (indiferenciado (día 2) y diferenciado (día 14)). La mayor parte de estas proteínas estaban involucradas en el metabolismo celular y en la glucólisis. En base a este trabajo, decidimos realizar otro estudio en el que aplicamos el doble marcaje SILAC seguido de un análisis nanolC-ESI-MS para identificar y cuantificar las proteínas secretadas por las MSCs a los dlas 2 y 14 del proceso condrogénico. Mediante esta estrategia, se detectaron cambios significativos en la abundancia de 34 proteínas entre los dos tiempos analizados. la mayor parte de las protelnas aumentadas a día 14 son proteínas relacionadas con la matriz extracelular del cartílago, y entre ellas validamos mediante inmunoensayo el incremento de proteoglicano 4 (PRG4)y TIMP1 como potenciales biomarcadores de diferenciación condrogénica.Finalmente, se comprobó la utilidad de las técnicas de imagen mediante espectrometría de masas (MS Imaging) para la caracterización de lipldos involucrados en el proceso de diferenciación. En este último estudio demostramos que las MSCs metabolizan la esfingomielina durante la diferenciación condrogénica, V que la fosfocolina V sus derivados son posibles marcadores de indiferenciación de MSCs