[en] Nowadays, one of the strategies used to preserve fertility is the obtaining of PI oocytes from natural cycles so as to mature them in vitro (IVM) and then vitrify them until their transference. This work intends to reverse the order of the two techniques used and assess if the rates of survival (SuR), maturation (MR), parthenogenetic activation (AR) and development until blastocyst (DR) improve. In addition, it aims to study whether the metaphase plate configuration of the MII oocytes matured in vitro is affected by the use of vitrification at its immature (PI) or mature (MII) stage. Also, this work pretends to describe changes in the oocyte ultrastrucure after devitrification of PI and IVM to MII, compared to PI IVM without preservation. For this purpose, 1113 oocytes from stimulated cycles of IVF / ICSI were used, rejecting 28 oocytes that showed vacuoles or sings of degeneration in the cytoplasm. The oocytes were randomly distributed in the two groups of study [G1 (497): VITRI + IVM and G2 (543): IVM + VITRI] and one control group [G0 (45): IVM]. All this was carried out in two phases; in the first one, a gametes culture media was used as the media for IVM, while in the second phase, embryonic culture media supplemented with SSS and hMG was used until the blastocyst stage. All media and components used in the IVM media are commercialized, being highly reproducible. In the first phase, the working conditions for the second phase were established, optimizing the vitrification protocol, the parthenogenetic activation and the embryonic development until blastocyst stage. In the second phase, a control group was included and the following techniques were carried out: immunocytochemistry (TCN) to G1 and G2 groups and transmission electron microscopy to G1 and G0 groups. Each technique was performed individually in order to maintain the oocyte traceability and to compare the generated rates of each of the procedures with the 17 clinic and lab variables collected. AR, DR and CNR comparable in the two study groups were obtained. However, the SuR and RT was better in the G1 vs G2. The ultrastructural pattern of human IVM oocytes was similar between the oocytes vitrified at PI stage and no vitrified oocytes, except from microvilli and cortical granules that changed their number, distribution and electrodensity (G1 vs G0). These results show that: (i) vitrification is a useful technique for the cryopreservation of both mature (MII) and immature (PI) oocytes, (ii) the embryonic culture media adequately supplemented until blastocyst stage may be a valid alternative to replace IVM commercial media, (iii) vitrification can have and activating effect on the restart of meiosis, but the mechanism of action is still unknown, (iv) the configuration of the metaphase plate did not show significant differences when comparing IVM oocytes before or after its vitrification (G1 vs G2), (v) TEM revealed that vitrification determined an altered pattern of microvilli and cortical granules, and (vi) the individual study of each of the clinic and lab variables allowed us to observe: the influence of the stimulus days in the SuR, the protocol of hypophyseal suppression in the AR and the fertilization/estradiol in the DET. Therefore, this thesis validates the strategy of vitrification of PI oocytes and its further IVM.

[es] En la actualidad una de las estrategias empleadas para la preservación de la fertilidad, es la obtención de ovocitos PI de ciclos naturales con el fin de madurarlos in vitro (MIV) y posteriormente vitrificarlos hasta su transferencia. En este trabajo se propone invertir el orden de las dos técnicas empleadas, y valorar si mejoran las tasas de supervivencia (TSu), maduración (TM), activación partenogenota (TA) y desarrollo hasta blastocisto (TD). También, se pretende examinar si la configuración de la placa metafásica del ovocito MII madurado in vitro, se ve afectada por realizar su vitrificación en estadio inmaduro (PI) o maduro (MII). Además, describir los cambios en la ultraestructura ovocitaria tras desvitrificar PI y MIV hasta MII, en comparación con los PI MIV sin preservación. Para ello se incluyeron 1113 ovocitos procedentes de ciclos estimulados para FIV/ICSI, rechazando 28 ovocitos que presentaban vacuolas o signos de degeneración en su citoplasma. El resto de ovocitos fueron aleatoriamente distribuidos en los dos grupos de estudio [G1 (497): VITRI + MIV y G2 (543): MIV + VITRI] y en un grupo control [G0 (45): MIV]. Todo ello se llevó a cabo en dos fases, en la primera se empleó como medio de MIV un medio de cultivo para gametos, mientras que en la segunda fase se utilizó un medio de cultivo embrionario hasta blastocisto, suplementado con SSS y hMG. Todos los medios y componentes utilizados en el medio de MIV estaban comercializados, siendo altamente reproducibles. En la primera fase se establecieron las condiciones de trabajo para la segunda fase, optimizando el protocolo de vitrificación, activación partenogenota y desarrollo embrionario hasta blastocisto. En la segunda fase se incluyó un grupo control y se realizó técnicas de: inmunocitoquímica (TCN) al G1 y G2 y microscopía electrónica de transmisión al G1 y G0. Cada técnica se realizó de forma individualizada para poder mantener la trazabilidad ovocitaria y comparar las tasas generadas de cada uno de los procedimientos con las 17 variables clínicas y de laboratorio recogidas. Se obtuvieron TA, TD y TCN comparables en los dos grupos de estudio. Sin embargo, la TSu y TM fue mejor en el G1 vs G2. El patrón ultraestructural de ovocitos humanos MIV fue similar entre los ovocitos vitrificados en PI y no vitrificados, salvo las microvellosidades y gránulos corticales que modificaron su número, distribución y electrodensidad (G1 vs G0). Estos resultados muestran que: (i) la vitrificación es una técnica útil para la criopreservación tanto de ovocitos maduros (MII) como inmaduros (PI), (ii) el medio de cultivo embrionario hasta blastocisto suplementado adecuadamente puede ser una alternativa válida para sustituir a los medios de MIV comerciales, (iii) la vitrificación puede tener un efecto activador del reinicio de la meiosis, pero se desconoce cuál es el mecanismo de acción, (iv) la configuración de la placa metafísica no presentó diferencias significativas al comparar los ovocitos MIV previa o posteriormente a su vitrificación (G1 vs G2), (v) el TEM reveló que la vitrificación determinaba un patrón alterado de microvellosidades y gránulos corticales, y (vi) el estudio individual de cada una de las variables clínicas y de laboratorio nos permitió observar: la influencia de los días de estímulo en la TSu, el protocolo de supresión hipofisiaria en la TA y la fecundación/estradiol en la TDE. Por todo ello, este trabajo de tesis valida la estrategia de vitrificar ovocitos PI y posteriormente MIV.