[en] The global healthcare landscape is confronted with a mounting crisis: the pervasive challenge of antimicrobial resistance (AMR) and multidrug resistance (MDR) bacteria. Helicobacter pylori a WHO priority pathogen that prevails in 44.3% of the global population. To combat this infection, medical practitioners employ the use of triple or quadruple chemotherapy, a treatment strategy that combines various antibiotics and antimicrobial compounds with bismuth and a proton pump inhibitor (PPI). Unfortunately, a recent meta-analysis conducted in the United States has painted a disheartening picture, indicating that the individual rates of resistance for antibiotics such as clarithromycin, metronidazole, and levofloxacin exceed a worrisome 30%. According to the World Health Organization (WHO), there are currently 80 antibacterial products in various stages of clinical development for priority pathogens across the globe. Among these, 43 represent new antibiotics with the potential to treat severe bacterial infections. However, there is only one antibiotic, TNP-1293, and two non-traditional products, Rhu-pGSN and SVT-1C469, in the clinical trial phase for H. pylori. This urgent situation underscores the need for the development of new antibiotics, ideally with narrow-spectrum capabilities, to effectively combat drug-resistant H. pylori. One promising avenue for antimicrobial development lies in the essential metabolic pathways that bacteria rely on. This study focused on selected compounds from a high-throughput screening process designed to inhibit H. pylori flavodoxin. Hp-Fld, an essential protein for H. pylori, holds a distinct advantage as a candidate for anti-H. Pylori drug development due to its absence as an independent protein in humans. The primary focus of this study was to evaluate the antimicrobial spectrum of these compounds and elucidate their mechanisms of action. We have explored specific mutations in flavodoxin residues to comprehend how these compounds interacted with Hp-Fld. The resulting isothermal titration calorimetry (ITC) analysis unveiled the A55 pocket as the likely binding site for these inhibitors. Additionally, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) data supported these findings, revealing structural changes induced by compound binding within the drug-binding pocket, composed of three highly dynamic peptides. We have ventured beyond the compounds' immediate antimicrobial effects, seeking to understand their systemic impacts and the potential of multi-omics approaches for uncovering antibacterial modes of action. The study revealed that four out of the five compounds exhibited strong interactions with CagA, a major virulence factor of H. pylori. Network analysis of CagA-associated proteins unveiled systemic regulation and the potential to influence the type four secretion system. Most compounds, excluding IVk, demonstrated the ability to target multiple essential proteins. FtsZ, a prominent target in three out of the five compounds, and FtsA, implicated in cell division site localization, stood out as promising targets. AtpD, a protein within the ATP-synthase complex, was also extensively targeted, particularly by compound IVj, indicating its potential as an ATP-synthase blocker, a hypothesis supported by the observed reduction in ATP production. The process of validating predefined target, flavodoxin, often presents challenges due to the limited solubility shifts that occur upon drug binding. Nevertheless, the study observed significant changes in flavodoxin solubility in response to compound IVj. Methodologically, the research demonstrated the enhanced resolution of multi-omics data processing when incorporating target deconvolution techniques. In essence, the study showcased how the integration of diverse techniques can significantly enrich our understanding of intracellular events, thereby contributing to the advancement of antimicrobial drug development. Shifting the focus to another critical healthcare challenge, phenylketonuria (PKU) emerges as a significant concern. PKU is associated with over 1000 disease-related phenylalanine hydroxylase (PAH) variants and is primarily treated through lowphenylalanine diets, alongside pharmaceutical interventions like Kuvan and Pegvaliase. Enzyme engineering holds promise for addressing PKU and various therapeutic applications. This study explores the potential of stabilizing PAH via mutations, with a particular focus on the hybridization domain. The introduction of cysteine substitutions, leads to the formation of stabilizing disulfide bonds within the dimers, effectively enhancing protein stability. This innovation represents a promising avenue for more effective therapies in the context of PKU treatment. While the existing treatments for PKU have yielded positive results, they are not without limitations. The enzyme engineering approach opens doors to a new realm of possibilities, offering potential improvements in the efficacy of PKU therapies. A crucial aspect of this research revolves around the structural dynamics of PAH. We have achieved a fine resolution of 3.6 Å with cryo-electron microscopy for one of our mutants. However, the intricate details of side-chain interactions remained partially unresolved, mainly due to the inherent flexibility of the PAH tetramer. Structural analysis unveiled the C2 symmetry of the PAH tetramer, with two monomers exhibiting distinct densities for the regulatory domain, while the other two lacked such density. This observation indicates a high degree of flexibility within the tetramer. Initial biophysical and structural data analysis indicates that the introduction of cysteine bonds enhanced enzymatic activity and bolstered protein stability, possibly by inducing flexibility within the regulatory domain. In summary, these studies underscore the vital importance of addressing challenges posed by antimicrobial resistance and phenylketonuria. The research not only underscores the urgent need for the development of new antibiotics, particularly those targeting drugresistant bacteria like H. pylori, but also emphasizes the potential of enzyme engineering as a transformative approach in the realm of genetic disorders such as PKU.

[es] El panorama sanitario mundial se enfrenta a una crisis cada vez mayor: el desafío omnipresente de la resistencia a los antimicrobianos (AMR) y las bacterias multirresistentes (MDR). Helicobacter pylori es un patógeno prioritario de la AMR presente en el 44,3% de la población mundial. Para combatir esta infección, los médicos emplean la quimioterapia triple o cuádruple, una estrategia de tratamiento que combina diversos antibióticos y compuestos antimicrobianos con bismuto y un inhibidor de la bomba de protones (IBP). Por desgracia, un reciente metaanálisis realizado en Estados Unidos ha dibujado un panorama desalentador, al indicar que las tasas individuales de resistencia de antibioticos como la claritromicina, el metronidazol y la levofloxacina superan un preocupante 30%. Según la Organización Mundial de la Salud (AMR), actualmente hay 80 productos antibacterianos en diversas fases de desarrollo clínico para patógenos prioritarios en todo el mundo. Entre ellos, 43 representan nuevos antibióticos con potencial para tratar infecciones bacterianas graves. Sin embargo, solo hay un antibiótico, TNP-1293, y dos productos no tradicionales, Rhu-pGSN y SVT-1C469, en fase de ensayo clínico para H. pylori. Esta situación subraya la necesidad urgente de desarrollar nuevos antibióticos, a ser posible de espectro reducido, para combatir eficazmente el H. pylori farmacorresistente. Una vía prometedora para el desarrollo de antimicrobianos reside en las vías metabólicas esenciales de las que dependen las bacterias. Este estudio se centro en compuestos seleccionados a partir de un proceso de cribado de alto rendimiento diseñado para inhibir la flavodoxina de H. pylori. La Hp-Fld, una proteína esencial para H. pylori, presenta una clara ventaja como candidata para el desarrollo de fármacos anti-H. pylori debido a su ausencia, como proteína independiente, en humanos. El objetivo principal de este estudio ha sido evaluar el espectro antimicrobiano de estos compuestos y dilucidar sus mecanismos de acción. Hemos explorado mutaciones especificas en residuos de flavodoxina para comprender como interaccionaban estos compuestos con Hp-Fld. El análisis resultante de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) revelo que el bolsillo A55 es el sitio de unión mas probable para estos inhibidores. Ademas, los datos de espectrometría de masas con intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) corroboraron estos hallazgos, revelando cambios estructurales inducidos por la unión del compuesto dentro del bolsillo de unión al fármaco, compuesto por tres péptidos altamente dinámicos. Nos hemos aventurado mas allá de los efectos antimicrobianos inmediatos de los compuestos, tratando de entender sus impactos sistémicos y el potencial de los enfoques multiomicos para descubrir los modos de acción antibacteriana. El estudio ha revelado que cuatro de los cinco compuestos presentaban fuertes interacciones con CagA, un importante factor de virulencia de H. pylori. El análisis de la red de proteínas asociadas a CagA revelo una regulación sistémica y la posibilidad de influir en el sistema de secreción de tipo cuatro. La mayoría de los compuestos, salvo IVk, demostraron la capacidad de dirigirse a múltiples proteínas esenciales. FtsZ, una diana prominente en tres de los cinco compuestos, y FtsA, implicada en la localización del lugar de división celular, destacaron como dianas prometedoras. AtpD, una proteína del complejo ATPsintetasa, también se vio ampliamente afectada, en particular por el compuesto IVj, lo que indica su potencial como bloqueante de la ATP-sintetasa, una hipótesis respaldada por la reducción observada en la producción de ATP. El proceso de validación de una diana predefinida, la flavodoxina, suele plantear dificultades debido a los limitados cambios de solubilidad que se producen tras la union del farmaco. No obstante, el estudio observo cambios significativos en la solubilidad de la flavodoxina en respuesta al compuesto IVj. Desde el punto de vista metodologico, la investigacion demostro la mayor resolucion del procesamiento de datos multiomicos cuando se incorporan tecnicas de deconvolucion de dianas. En esencia, el estudio mostro como la integracion de diversas técnicas puede enriquecer significativamente nuestra comprension de los acontecimientos intracelulares, contribuyendo asi al avance del desarrollo de farmacos antimicrobianos. La fenilcetonuria (PKU) es otro problema sanitario importantes. La fenilcetonuria se asocia a mas de 1000 variantes de la fenilalanina hidroxilasa (PAH) relacionadas con la enfermedad y se trata principalmente con dietas bajas en fenilalanina, junto con intervenciones farmaceuticas como Kuvan y Pegvaliase. La ingenieria enzimatica es prometedora para abordar la PKU y diversas aplicaciones terapeuticas. Este estudio explora el potencial de estabilizacion de la PAH mediante mutaciones, con especial atencion al dominio de hibridación. La introducción de sustituciones de cisteina, conduce a la formacion de puentes disulfuro estabilizadores dentro de los dimeros, mejorando eficazmente la estabilidad de la proteína. Esta innovación proporciona una vía prometedora para terapias mas eficaces en el contexto del tratamiento de la PKU. Aunque los tratamientos existentes para la PKU han dado resultados positivos, no están exentos de limitaciones. El enfoque de la ingeniería enzimática abre las puertas a un nuevo campo de posibilidades, ofreciendo mejoras potenciales en la eficacia de las terapias de la PKU. Un aspecto crucial de esta investigación gira en torno a la dinámica estructural de la PAH. Para uno de nuestros mutantes, hemos logrado una buena resolucion de 3,6 A con criomicroscopia electrónica. Sin embargo, los intrincados detalles de las interacciones de , las cadenas laterales quedaron parcialmente sin resolver, principalmente debido a la flexibilidad inherente del tetramero PAH. El analisis estructural desvelo la simetria C2 del tetramero PAH, con dos monomeros que mostraban densidades distintas para el dominio regulador, mientras que los otros dos carecian de dicha densidad. Esta observación indica un alto grado de flexibilidad dentro del tetramero. El analisis inicial de los datos biofisicos y estructurales indica que la introduccion de enlaces de cisteina mejoro la actividad enzimatica y reforzo la estabilidad de la proteina, posiblemente induciendo flexibilidad dentro del dominio regulador. En resumen, estos estudios subrayan la importancia vital de abordar los retos que plantean la resistencia a los antimicrobianos y la fenilcetonuria. La investigacion no solo subraya la urgente necesidad de desarrollar nuevos antibioticos, en particular los dirigidos contra bacterias resistentes a los farmacos como la H. pylori, sino que tambien pone de relieve el potencial de la ingenieria enzimatica como enfoque transformador en el ambito de los trastornos geneticos como la PKU.