[ca] Els glicolípids són producte d'alt valor degut a les seves propietats amfipàtiques que els doten d'un ampli rang d'aplicacions en els sectors químic (ex., biosurfactants) o biomèdic (ex., adjuvant de vacunes). Depenent de la unitat lipídica que els forma aquests compostos poden ser classificats en diferents famílies. Si la unitat lpídica és una ceramida o diacilglicerol, el glicolípid resultant es coneixerà com a glicoesfingolípid o glicoglicerolípid (GGL) respectivament. Mentre que els glicoesfingolípids han demostrat jugar un paper clau en diversos processos biològics, els glicoglicerolípids són interessants degut al seu ús potencial per a ser usats com a adjuvants de vacunes o supressors tumorals. Tot i que l'interès per aquests compostos és alt, la seva aplicació es veu obstaculitzada per la seva baixa disponibilitat i alt cost de producció. La síntesi química requereix de complexes passos de protecció i desprotecció per tal d'aconseguir la desitjada regio- i estereoespecificitat de l'enllaç glicosídic que, conseqüentment, comporta una reducció del rendiment i eficiència del procés. Per això, vam considerar l'enginyeria metabòlica com a estratègia potencial per a la producció de glicolípids i ens vam centrar en l'obtenció d'una plataforma d'enginyeria metabòlica en E. coli per tal d'obtenir aquests complexes productes d'interès. En estudis previs, el nostre grup va reportar que la sintasa de glicolípids MG517 de Mycoplasma genitalium era funcional i que s'obtenien glicoglicerolípids a partir de UDP-glucosa (UDP-Glc) i diacilglicerol (DAG). Addicionalment, una primera generació de soques modificades va demostrar que la disponibilitat de DAG era limitant per a la producció de GGL (Mora-Buyé et al., 2012). En el present projecte, cinc estratègies diferents d'enginyeria metabòlica van ser proposades per tal d'augmentar la producció de GGL utilitzant E. coli. Les primeres quatre estratègies tenien com a objectiu incrementar el pool del precursor lipídic, DAG. Sent així, la primera estratègia es basà en augmentar la disponibilitat de DAG a través de l'eliminació de reaccions competitives. Per aconseguir-ho, es van knockejar diferents gens involucrats en la ß-oxidació i l'activació d'àcids grassos (∆tesA i ∆fadE) reportant un increment en la producció de casi el doble. La segona estratègia es va basar en incrementar la disponibilitat d'àcids grassos mitjançant la modulació de factors de transcripció (fabR i fadR). Aquesta estratègia no va reportar un increment de la producció però si un canvi en el perfil lipídic amb un increment d'àcids grassos insaturats. La tercera estratègia es basava en incrementar la conversió dels donadors d'acils a àcid fosfatídic, precursor del DAG, sobreexpressant les aciltransferases PlsC i PlsB. La quarta estratègia es centrà en augmentar la disponibilitat del diacilglicerol per la sobreexpressió de la proteïna de fusió PlsCxPgpB, capaç de redirigir el flux cap a DAG, o CDH promovent la hidròlisi de fosfolípids. D'entre les diferent soques modificades, ∆tesA co-expressant MG517 i la proteïna de fusió PlsCxPgpB va ser la soca més productora, amb un 350% d'increment en la producció de GGL comparant-la amb la soca parental expressant únicament MG517. Especialment interessant és que les soques coexpressant CDH van presentar un canvi en el perfil de GGL cap al lípid diglucosilat (representant al voltant d'un 80% del total de GGLs). Finalment, es va proposar una estratègia metabòlica per incrementar la disponibilitat de l'altre precursor, UDP-Glc. Aquesta cinquena estratègia es va basar en sobre expressar l'enzim GalU, responsable de la biosíntesi d'UDP-Glc, i eliminant l'enzim codificant per la UDP-sucre difosfatasa ushA. No obstant, cap d'aquestes modificacions va aconseguir millorar els nivells de GGLs. Per últim, tal i com va ser reportat pel nostre grup que la fosfatidiletanolamina era intercanviable en les membranes d'E. coli pels nous producte GGL, una llibreria de promotors i RBS va ser dissenyada per tal de disminuir la producció d'aquest fosfolípid, augmentant al mateix temps de la producció de glicolípids.

[en] Glycolipids are products of high-added value due to their amphipathic properties, which endow them with a broad range of applications in the chemical (i.e., biosurfactants) and biomedical sectors (i.e., vaccine adjuvants). Depending on their lipidic moiety, glycolipids are classified in different families. If the lipid moiety is a ceramide or diacylglycerol, the glycolipids are known as glycosphingolipids or glycoglycerolipids respectively. While glycosphingolipids have shown to play essential roles in many biological processes, glycoglycerolipids (GGL) are interesting compounds due to their potential use as vaccine adjuvants or tumor suppressors. Although the interest of these compounds is very high, their applications are hampered by their low availability and high productions costs. Chemical synthesis requires complex protection and deprotection steps to achieve the desired regio- and stereospecificity of the glycosidic linkage, which consequently lower the yield and efficiency of the process. Therefore, we considered metabolic engineering as a potential strategy for the production of glycolipids and we aimed at building up a metabolic engineering platform in E. coli to achieve these complex structures of interest. In previous studies, our group reported that the glycolipid synthase MG517 from Mycoplasma genitalium was functional and glycoglycerolipids were obtained from UDP-glucose (UDP-Glc) and diacylglycerol (DAG). In addition, the first generation of engineered strains demonstrated that the availability of the DAG was the key bottleneck in GGL production (Mora-Buyé et al., 2012). In the present project, five different metabolic strategies were proposed to increase the production of GGL using E. coli. The first four strategies were aimed at increasing the available pool of the lipidic precursor, DAG. Thus, the first strategy was based on increasing DAG availability by removing competing reactions. To achieve so, different genes involved in the ß-oxidation and activation of fatty acids were knocked out (ΔtesA y ΔfadE) reporting an almost 2-fold production increase. The second strategy was based on increasing fatty acids availability by modulating different transcriptional factors (fabR y fadR). Although this strategy did not report an improvement of GGL yield, showed a change in the fatty acid profile with an increase of unsaturated fatty acids. The third strategy was based on increasing the conversion of acyl donors to phosphatidic acid, precursor of DAG, by overexpressing PlsC and PlsB acyltransferases. The fourth strategy was based on increasing diacylglycerol availability by overexpressing the fusion PlsCxPgpB protein that could redirect the flux to DAG or CDH promoting the hydrolysis of phospholipids. Among the different engineered strains, the ∆tesA strain co-expressing MG517 and a fusion PlsCxPgpB protein was the best producer, with a 350% increase of GGL titer compared to the parental strain expressing MG517 alone. Interestingly, the strains co-expressing CDH showed a shift in the GGL profile towards the diglucosylated lipid (up to 80% of total GGLs). Finally, a metabolic strategy was proposed to increase the availability of the other precursor, UDP-Glc. This fifth strategy was based on overexpressing GalU enzyme, which is responsible for the biosynthesis of UDP-Glc, and by removing the UDP-sugar diphosphatase encoding gene ushA. However, none of these modifications further improved the GGL titers. Finally, as it was also reported by our group that phosphatidylethanolamine was exchangeable in the membranes of E. coli by the new GGL compounds, a library of promoters and RBS was designed to decrease the production of this phospholipid trying at the same time to increase the production of glycolipids.