[en] Introduction: The oncogenic signaling of KIT/PDGFRA is pivotal to the biology of GIST, a human malignant mesenchymal neoplasm that features myogenic differentiation. Despite targeted inhibition of these receptors provides a major clinical benefit, GIST cells adapt to KIT/PDGFRA driver suppression and eventually develop resistance, which usually occurs due to the polyclonal expansion of tumor subpopulations bearing KIT/PDGFRA secondary mutations. Remarkably, the molecular mechanisms underlying adaptive resistance in GIST remain unclear. Interestingly, KIT oncogenic signaling is largely driven by PI3K/mTOR and RAS/MAPK pathways regardless of KIT primary or secondary mutations. Hypothesis: The dissection of KIT-downstream pathways will allow the identification of critical elements involved in the process of the adaptation to treatment, thus emerging as potential therapeutic targets to enhance the clinical efficacy of KIT/PDGFRA inhibitors. Methods: Clinically representative GIST cell models were used, in vitro and in vivo, throughout. KIT-downstream pathways were characterized through pharmacological screenings. RNA sequencing studies identified Atrogin-1 as a critical gene co-regulated by KIT-downstream pathways. Functional studies were performed on viral gene overexpression and knock-down models to elucidate Atrogin-1 regulation and role in GIST. Proof-of-concept studies evaluated the preclinical impact of co-targeting KIT and the ubiquitin-pathway (UP) in GIST. Results: In vitro and in vivo studies revealed PI3K/mTOR and MEK1/2 as the most essential KIT-downstream mediators. RNA sequencing underscored Atrogin-1 (aka FBXO32, a SCF E3 ubiquitin-ligase and the main effector of muscular atrophy in cachexia) as the most differentially expressed gene co-regulated by PI3K/mTOR and MEK1/2, resulting in increased expression upon inhibition of KIT, or KIT-downstream pathways. Functional studies and ChIP demonstrated that KIT and/or KIT-downstream signaling regulates Atrogin-1 expression through FOXO3a. Atrogin-1 proved to have a pro-survival role in GIST leading to apoptosis evasion and treatment adaptation upon KIT or KIT-downstream pathways inhibition through induction of cell quiescence. Atrogin-1 function was restricted to GIST cell lineage, being absent in other KIT- and kinase-driven neoplasms. Moreover, a significant increase in Atrogin-1 expression was shown in post-imatinib (IM) GIST tumor samples compared to pre-IM and also by IHC in a tissue microarray from pre- and post-IM GIST samples. Finally, combined inhibition of KIT and the UP with imatinib and TAK-243 (an UAE specific inhibitor), respectively, showed enhanced anti-tumor activity compared to single-agent IM. Conclusions: Atrogin-1 emerges as a crucial KIT-dependent and GIST cell lineage-specific pro-survival factor, which drives adaptation to KIT targeted inhibition through induction of cell quiescence. Atrogin-1 highlights the ubiquitin proteome system as a therapeutic vulnerability. Accordingly, combined KIT and UP inhibition results in a novel therapeutic strategy to overcome tumor cell adaptation in the treatment of GIST patients.

[es] Introducción: La señalización oncogénica de KIT/PDGFRA es fundamental para la biología del GIST, una neoplasia mesenquimal maligna humana que presenta diferenciación miogénica. A pesar de que la inhibición selectiva de estos receptores proporciona un importante beneficio clínico, las células de GIST se adaptan a la supresión de KIT/PDGFRA y acaban desarrollando resistencias, que suelen producirse debido a la expansión policlonal de subpoblaciones tumorales portadoras de mutaciones secundarias en KIT/PDGFRA. Cabe destacar que el mecanismo molecular subyacente a la resistencia adaptativa en GIST sigue sin estar claro. Es importante señalar que la señalización oncogénica de KIT se canaliza en gran medida por las vías PI3K/mTOR y RAS/MAPK, independientemente del tipo de mutación primaria o secundaria en KIT. Hipótesis: El estudio de las vías activadas por KIT permitirá identificar elementos críticos implicados en el proceso de adaptación al tratamiento, emergiendo así como potenciales dianas terapéuticas para potenciar la acción anti-tumoral de los inhibidores de KIT/PDGFRA. Métodos: A lo largo de todo proyecto se utilizaron modelos celulares in vitro e in vivo de GIST clínicamente representativos. Se caracterizaron las vías de señalización de KIT mediante estudios farmacológicos. Los estudios de secuenciación de ARN identificaron a Atrogin-1 como un gen crítico corregulado por las vías de KIT. Se realizaron estudios funcionales en modelos de sobreexpresión y silenciamiento de genes mediante vectores virales para dilucidar la regulación de Atrogin-1 y su papel en GIST. Se realizaron estudios de prueba de concepto para evaluar el impacto preclínico de inhibición conjunta de KIT y de la cascada ubiquitinización (CU) en GIST. Resultados: Estudios in vitro e in vivo revelaron que PI3K/mTOR y MEK1/2 son los mediadores más esenciales de las vías activadas por KIT. La secuenciación del ARN puso de manifiesto que Atrogin-1 (también conocido como FBXO32, una SCF ubiquitina-ligasa E3, y el principal efector de la atrofia muscular en la caquexia) es el gen más expresado de forma diferencial de entre todos los corregulados por las vías PI3K/mTOR y RAS/MAPK, lo que resulta en un aumento de la expresión tras la inhibición de KIT o de las vías activadas por KIT. Estudios funcionales demostraron que KIT y/o las vías activadas por KIT regulan la expresión de Atrogin-1 a través de FOXO3a. Atrogin-1 demostró tener un papel pro-supervivencia en el GIST ya que ayuda a las células de GIST a evitar la apoptosis, permitiendo la adaptación al tratamiento tras la inhibición de KIT o sus vías, todo ello a través de la inducción de la quiescencia celular. Está función de Atrogin-1 está restringida al linaje celular del GIST, ya que no se observó en otros tumores con alteraciones en KIT o en otros receptores tirosina quinasa. Además, se demostró, mediante inmunohistoquímica y datos de microarray de expresión, un aumento significativo de la expresión de Atrogin-1 en muestras tumorales de GIST tras el tratamiento con imatinib en comparación con las muestras previas al tratamiento. Por último, la inhibición combinada de KIT y la CU usando imatinib y TAK-243 (un inhibidor específico de UAE), respectivamente mostró una mayor actividad antitumoral en comparación con el tratamiento únicamente con imatinib. Conclusiones: Atrogin-1 es un factor pro-supervivencia crucial, dependiente de KIT y específico del linaje celular de GIST, que participa en la adaptación a la inhibición dirigida de KIT a través de la inducción de la quiescencia celular. Atrogin-1 subraya la relevancia del sistema de ubiquitin-proteosoma como potencial diana terapéutica. Así, la inhibición combinada de KIT y la CU es una nueva estrategia terapéutica para revertir la adaptación de las células tumorales al tratamiento en los pacientes de GIST.