[en] Enzyme design is the scientific field that aims at discovering and/or optimizing biomolecules to reach new-to-Nature reactions. It is an area in wild expansion and constitutes one of the cornerstones of the transition of chemical practices towards greener alternatives. An elegant way to construct novel biocatalysts is through the embedding of organometallic cofactors into biological scaffolds, leading to the so-called Artificial Metalloenzymes (ArMs). These hybrids bridge the catalytic versatility of the organometallic compound with the substrate and spatial specificity of the biological host. The design of ArMs has spread increasingly during the last two decades taking clear advantage of the major expansion of structural biology and the maturity of organometallic catalysis. Molecular modelling aims to help designers to provide with structural information that could serve for constructing optimum biocatalysts. However, despite the increasing improvement of the computation performance and the exponential development of new simulation techniques, the complexity of dealing with transition metal including systems has promoted modellers not to explore the ArM constructs. The InSiliChem group, in which this Ph.D. has been performed, has focused on developing a specific framework for the study and design of ArMs. In particular, this has been based on the development of in silico multiscale strategies including standard computational methods. This Ph.D. aims at increasing the potentiality of our computational platform for ArM design by 1) including classical Molecular Dynamics simulations into the integrative computational framework and 2) testing the validity of the methodology for the design of real case ArMs. The results obtained could be summarize as follows: • The catalytic mechanism of two novel ArMs were decoded using the updated computational pipeline. These were a copper-Phenanthroline containing hydratase based on the Lactococcus Multidrug Resistance Regulator (LmrR) and a variety of novel mutants based on Streptavidine-Noyori complexes for cyclic imine reduction reaction. The study revealed the importance of the contribution of the MD simulations to decode the catalytic mechanism of these ArMs and to assess the impact of second sphere mutations on the catalytic tendencies. (Chapter 4) • Using the same approach, calculations were carried out for the in silico design of hydratases, but in this case based on the inclusion of a novel unnatural amino acid. This was first applied to the LmrR scaffold, for which mutants suggested via computation for optimum enantiomeric excess (ee) were then experimentally assessed with success. Next, based on the experience obtained, we expanded the de novo exercise towards the design of Artificial Metallopeptides. (Chapter 5) • The final part of the work focused on deciphering molecular variables that our previous studies showed to be far more complex than expected. This was the impact of the active site configuration to define the catalytic activity of the ArMs. In particular, we decoded the rearrangement of a variety of LmrR-heme complex for the cyclopropanation reaction to proceed. From this study it clearly appeared that the flexibility of the receptor is key for the porphyrin based ArMs to reach their catalytic activity. To further assess the importance of this molecular variable, we expanded this work to the study of distinct naturally occurring heme binding proteins. (Chapter 6) Overall, this Ph.D. represents a step forward on the methodological development of the computer based enzyme design. Furthermore, it sheds light on how transition metal compounds could cooperate with biological scaffolds at the molecular level with the focus on the de novo design of new biocatalysts.

[es] El diseño enzimático es el área basada en el descubrimiento y/o optimización de biomoléculas para el desarrollo de reacciones químicas no naturales. Es un área que se encuentra en su mayor crecimiento y constituye uno de los puntos clave en la transición de la química hacia alternativas más ecológicas. Una manera elegante de sintetizar nuevos biocatalizadores es mediante la inclusión de cofactores organometálicos en estructuras biológicas, dando lugar a lo que se conoce como Metaloenzimas Artificiales (ArMs). Estos híbridos combinan la versatilidad catalítica de los compuestos organometálicos con la especificidad de los receptores biológicos. El diseño de ArMs ha crecido exponencialmente en las últimas dos décadas gracias al desarrollo de áreas como la biología estructural y la catálisis organometálica. La modelización molecular trata de guiar los diseños proporcionando información estructural para la construcción de catalizadores óptimos. Sin embargo, a pesar de los avances en rendimiento computacional y de nuevas técnicas computacionales, la complejidad del trato de sistemas que contienen metales de transición hace que el área de los ArMs no sea propiamente explorado por los modelizadores. El grupo InSiliChem, dónde se ha desarrollado este Ph.D., se centra en el desarrollo de estrategias para el estudio y el diseño de ArMs. En particular, se basa en el desarrollo de estrategias computacionales multinivel que incluyen una gran variedad de técnicas computacionales. Este Ph.D. trata de aumentar el potencial de la plataforma computacional para el diseño de ArMs 1) mediante la incorporación de distintas técnicas como la simulación de Dinámica Molecular (MD) y 2) validando el procedimiento mediante el diseño de casos enzimáticos reales. Los resultados obtenidos se resumen en los siguientes puntos: ·Se ha descrito el mecanismo catalítico de dos nuevas ArMs. Estas son: una hidratasa basada en el receptor LmrR (Lactococcus Multidrug Resistance Regulator) que incluye un cofactor de Fenantrolina unida a cobre; y una variedad de mutantes de complejos de Streptavidina-Noyori capaces de realizar la reducción de iminas cíclicas. Este estudio revela la importancia de la contribución de las simulaciones MD como parte del protocolo computacional para la decodificación del mecanismo catalítico de los nuevos enzimas, así como el impacto de la segunda esfera de coordinación en las tendencias catalíticas. (Capítulo 4) ·Basándonos en la misma metodología, se han modelizado nuevas hidratasas basadas en la inclusión de amino acidos no naturales (U18). Primero, aplicados a la proteína LmrR, para la que fueron computacionalmente propuestos nuevos mutantes más eficaces en cuanto a la enantioselectividad del sistema (fueron después experimentalmente validados). Después, basándonos en la experiencia adquirida, el concepto de novo fue expandido al diseño de Metalopéptides Artificiales. (Capítulo 5) ·La última parte del trabajo se centra en descifrar variables moleculares que en los estudios previos han resultado de gran relevancia. Entre ellos, la relación entre la configuración estructural del centro activo y la actividad catalítica del ArM. En particular, se ha estudiado la adaptabilidad de una variedad de complejos LmrR-hemo claves para el transcurso de la reacción de ciclopropanación. Los resultados sugieren que la flexibilidad del receptor es un punto crítico para que los ArMs basados en el grupo hemo adquieran actividad catalítica. Con el objetivo de profundizar más en la importancia de esta variable molecular, este estudio se ha expandido, además, a proteínas naturales reconocedoras del grupo hemo. (Capítulo 6) En conclusión, este Ph.D. representa un paso adelante en el desarrollo metodológico del diseño computacional de Metaloenzimas Artificiales. El trabajo realizado clarifica la importancia de la cooperación a nivel molecular entre los compuestos basados en metales de transición y sus receptores biológicos. Ésto facilita el camino hacia nuevos diseños de biocatalizadores basados en Metaloenzimas Artificiales.