[en] Metabolomics focuses on the study of metabolites in biological samples of varying complexity: cells, tissues, biofluids, etc. The detection and quantification of metabolites provide information representative of the physiological state of an organism or the condition in a pathology, as well as the relationship to various perturbations or stimuli. Currently, the most commonly used technique for metabolite detection is mass spectrometry (MS), usually combined with a separation technique, mainly liquid chromatography or gas chromatography (LC or GC, respectively). The complexity of biological matrices presents one of the main limitations of metabolomic analysis due to the multitude of existing metabolites and their wide range of polarity, from very polar species such as amino acids or carboxylic acids to non-polar species such as ceramides or triglycerides. Moreover, these species coexist at concentrations covering several orders of magnitude, from pg mL−1 in some hormones to mg mL−1 in metabolites such as glucose. Another problem is the presence of interfering species, such as salts and proteins, which complicate the analysis of metabolites either wholly or partially. For this reason, it is essential to design and optimize the sample preparation process in order to achieve adequate levels of three of the basic analytical properties: sensitivity, selectivity and precision. In addition to these limitations, existing databases are not as up-to-date as those in other omics disciplines, although more or less complete databases exist depending on the platform. Conversely, there are no standardized protocols for the metabolomic analysis of certain samples, as some aspects still require validation. Furthermore, there is no protocol for mass spectrometry detection that guarantees a good level of compound identification without thorough training of the personnel involved. Therefore, the motivation behind this research is to exploit the potential offered by MS to develop new analytical strategies for the identification and quantification of metabolites and to overcome the limitations associated with the analytical process. From this motivation, the general aim of this PhD Thesis was to design strategies to study the potential of mass spectrometry analyzers in the targeted and exhaustive metabolomic analysis of lipid metabolites, as well as applications of targeted analysis in nutritional metabolomics. This aims to improve current methods and meet existing needs in the analytical, clinical and nutritional fields. This Thesis is composed of three sections, classified according to the field of metabolomics studied (lipidomics or nutritional metabolomics) and the key instrument for methodological development (high- or low-resolution mass spectrometry). In Section A, titled Methodological development in targeted analysis in lipidomics, three methods were developed for the determination of endocannabinoids and steroids. Firstly, a method based on on-line solid phase extraction with liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (SPE–LC–MS/MS) was proposed for the analysis of endocannabinoids and analogous compounds in human serum (Chapter 1). This methodological approach is fully automated, which provides a clear superiority over conventional sample preparation strategies [1]. Secondly, a methodology based on gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry (GC–MS/MS) was developed for the determination of sex steroids in human plasma (Chapter 2). This strategy includes a sample preparation for the extraction, purification and derivatization of steroids in human plasma, with the aim of reducing the use of toxic solvents and improving the sensitivity of the method compared to existing methods in the literature [2]. Finally, a SPE–LC–MS/MS configuration was developed for the evaluation of the full panel of steroids in human serum (Chapter 3), using a similar approach to that described in Chapter 1, but improving the analytical performance of the method described in Chapter 2. This method offers a rapid alternative in sample preparation by minimizing human involvement in the process and the time required for derivatization. This remarkable improvement has been made possible by the preconcentration power of on-line solid phase extraction (SPE), which allows excellent levels of sensitivity to be achieved [3]. These methods for the determination of steroids have highlighted the advantages and disadvantages to be considered in order to implement the most appropriate analytical platform depending on the interest of the metabolites to be determined. In Section B, titled Methodological development for the comprehensive determination of metabolites in lipidomics, two methodologies for the determination of two lipid families, acylcarnitines (ACs) and ceramides, are presented. This development was made possible by the combination of data acquisition modes: on the one hand, the "data independent acquisition" (DIA) mode, by studying the fragmentation mechanisms of the target lipid families, significantly improved the identification level of these metabolites; on the other hand, the use of the "data dependent acquisition" (DDA) mode allowed the development of strategies for the semi-quantitative determination of 47 ACs (Chapter 4) [4] and 49 ceramides (Chapter 5) [5], in both cases in human serum. Both proposals were implemented in two SPE–LC–MS/MS setups for the targeted analysis of a large number of ACs and ceramides. Finally, Section C, titled Applications of targeted analysis in nutritional metabolomics, focused on the evaluation of the effect on the profile of a set of metabolites in the human body caused by the consumption of certain foods, by means of targeted analysis using different biological samples. On the one hand, using the methodology for the determination of ACs in Chapter 4 and a method based on gas chromatography coupled to a flame ionization detector (GC–FID) for the determination of fatty acids (FAs), the effect of the consumption of a low-calorie, low-fat meat product on both families of metabolites was evaluated. To this end, the basal (fasting) and postprandial profiles were obtained at 1 and 4 h for this study (Chapter 6) which included two groups with very different anthropometric parameters, one obese and the other normal weight. The effects observed at the metabolic level in the obese group suggest an improvement in metabolic status after the first dose, with a possible improvement in long-term metabolic status similar to that seen in the postprandial studies compared. On the other hand, a novel methodology was developed and optimized to eliminate as many interferences as possible present in urine samples, such as salts and urea, allowing a better purification of the analytes of interest, in this case tyrosol and hydroxytyrosol phenols, for their subsequent analysis by LC–MS/MS (Chapter 7). This has provided a tool for assessing changes in the levels of these metabolites caused by the consumption of foods rich in these phenols, such as (extra) virgin olive oil [6]. The conclusions of Section A, which focuses on methodological development in targeted analysis in lipidomics, are as follows: - The fully automated SPE–LC–MS/MS setup was used for the quantitative analysis of 14 endocannabinoids and analogues compounds. The analysis was performed after rapid chromatographic separation. The on-line SPE step proved efficient in removing the major ionization suppression interferents, allowing simultaneous preconcentration of the analytes and their quantification at pg mL−1 levels, thus avoiding conventional sample preparation steps. In addition, analysis time was drastically reduced and errors associated with the analytical process and human intervention were eliminated [1]. - A GC–MS/MS-based method was developed for the quantitative determination of sex steroids in human plasma at concentrations below ng mL−1, with estrogens detectable at the pg mL−1 level. Most remarkable were the low limits of quantification (LOQ) achieved using a QTOF analyzer, largely due to clean-up and extraction effects coupled with the mild ionization effect provided by negative chemical ionization (NCI). In this way, LOQs similar to those previously reported for estrogens in QqQ were achieved. This method was tested in 15 male volunteers and yielded values consistent with those reported in the Human Metabolome Data Base (HMDB) [2] - A method for the quantitative analysis of 16 steroids in human serum by SPE–LC–MS/MS has been developed. The automation provided by on-line SPE simplifies the sample preparation process and avoids conventional steps, reducing associated errors and analysis time. In addition, the time required to analyze all the analytes was reduced by using the fast polarity switching option, allowing all the analytes to be determined in a single analysis in multiple reaction monitoring (MRM) mode. The combined effects of clean-up and enrichment allow LOQs in the order of pg mL−1 to be achieved. The proposed method provides a comprehensive overview of steroidogenesis by determining different classes of steroids, namely androgens, estrogens, progestogens, glucocorticoids and a mineralocorticoid. Sensitivity, precision and accuracy make this method a competitive option for the determination of steroids in clinical trials [3]. Regarding the methodological development for the comprehensive determination of metabolites in lipidomics in Section B: - Two strategies were developed for the identification, confirmatory analysis and quantification of ACs and ceramides in human serum. The fragmentation mechanism studied using the DIA analysis method allowed the identification and confirmation of 47 ACs (classified according to the length of the hydrocarbon chain and the number of unsaturations) and 49 ceramides (classified according to the length, degree of unsaturation and number of hydroxyl groups of the sphingoid base and the esterified fatty acid). - The quantitative methods developed are based on a SPE–LC– MS/MS configuration in DDA mode, which achieves high sensitivity and selectivity with a previous sample preparation consisting of a simple dilution from a small volume of serum. The proposed strategies have been applied, on the one hand, to a cohort of obese and normal weight individuals to determine the reference levels in terms of percentages and concentrations of ACs (Chapter 4) [4] and, on the other hand, to the CORDIOPREV cohort to determine the reference levels of the identified ceramides and their distribution in human serum (Chapter 5) [5]. - This combination of DIA/DDA in LC–MS/MS supports the identification and quantification of numerous analogous metabolites characterized by a common fragmentation scheme. Finally, the applications of targeted analysis in nutritional metabolomics in Section C, focusing on the postprandial study of the lipid profile and the evaluation of (extra) virgin olive oil consumption, present the following conclusions: - Blood levels of ACs and total FAs profiles in the fasting state were established, as well as the evolution of basal levels during the postprandial period after ingesting a meat product low in calories and fat (Chapter 6). The behavior of the AC subfamilies was similar in the obese and normal weight groups, with the associated differences in levels maintained according to obesity status. The observed decrease in glucose, insulin and saturated fatty acids (SFAs) levels as well as the increase in polyunsaturated fatty acids (PUFAs) levels observed in the obese group during the postprandial period suggest a tendency to approach the levels of a normal weight individual. Therefore, this intake may be associated with a notable effect on the metabolism of obese individuals and may be useful in the prevention and reduction of obesity and obesity-related diseases. - A novel protocol based on SPE was developed and validated for sample preparation prior to the qualitative and quantitative determination of phenolic metabolites of (extra) virgin olive oil in urine (Chapter 7). The combination of syringe SPE and LC–MS/MS with a suitable ionization agent allowed satisfactory sensitivity to be achieved without the need for derivatization steps or solvent evaporation, thus simplifying sample preparation compared to previously published methods. The proposed method can be applied with a dual strategy: qualitative for the characterization of phenolic metabolite profiles of (extra) virgin olive oil in urine by LC–MS/MS with DIA mode, and quantitative for the determination of metabolized phenols such as tyrosol and hydroxytyrosol by implementing an acid hydrolysis step. The method was tested on a cohort of volunteers before and after consumption of extra virgin olive oil (EVOO) to evaluate its performance and proved to be very suitable for applications with large sample cohorts due to its high simplicity, processing speed and low cost [6]. As an overall conclusion of this PhD Thesis, the development of methods with high levels of sensitivity, selectivity and precision should be highlighted thanks to the different strategies combined in the analytical process; its application has shown that these methodological improvements make it possible to meet needs in the analytical, clinical and nutritional fields.

[es] La metabolómica se centra en el estudio de los metabolitos en muestras biológicas de distinta complejidad: células, tejidos, biofluidos, etc. La detección y cuantificación de metabolitos aporta información representativa del estado fisiológico de un organismo o la situación en una patología, así como la relación con distintas perturbaciones o estímulos. En la actualidad, la técnica de detección de metabolitos más empleada es la espectrometría de masas (MS) que suele emplearse acoplada a una técnica de separación, principalmente la cromatografía de líquidos o la de gases (LC o GC, respectivamente). La complejidad de las matrices biológicas es una de las principales limitaciones del análisis metabolómico debido a la multitud de metabolitos existentes y su amplio rango de polaridad, que abarca desde especies muy polares, como aminoácidos o ácidos carboxílicos, hasta no polares como ceramidas o triglicéridos. Además, estas especies coexisten en concentraciones que cubren diferentes ordenes de magnitud, desde pg mL−1 en algunas hormonas, hasta mg mL−1 en metabolitos como la glucosa. Otro problema es la presencia de especies interferentes, como las sales y las proteínas, que complican total o parcialmente el análisis de los metabolitos. Por este motivo, se hace imprescindible el diseño y optimización del proceso de preparación de muestra, para alcanzar niveles adecuados de tres de las propiedades analíticas básicas: sensibilidad, selectividad y precisión. A estas limitaciones se añade que las bases de datos existentes no están tan actualizadas como las de las otras disciplinas ómicas, aunque dependiendo de la plataforma, hay bases de datos más o menos completas. Por otro lado, no existen protocolos estandarizados para abordar el análisis metabolómico de determinadas muestras, ya que aún quedan aspectos por validar. Además, la detección mediante espectrometría de masas no tiene un protocolo que garantice un buen nivel de identificación de compuestos sin una formación exhaustiva del personal involucrado en esta tarea. Por ello, la motivación de esta investigación es aprovechar el potencial que ofrece la MS para desarrollar nuevas estrategias analíticas para la identificación y cuantificación de metabolitos y superar las limitaciones. asociadas al proceso analítico. De esta motivación se desprende el objetivo general de esta Tesis Doctoral, que fue diseñar estrategias que permitan estudiar el potencial de los analizadores de espectrometría de masas en el análisis metabolómico dirigido y exhaustivo de metabolitos lipídicos, así como aplicaciones de análisis dirigido en metabolómica nutricional, para mejorar métodos actuales y cubrir necesidades existentes en las áreas analítica, clínica y nutricional. Esta Tesis Doctoral se compone de tres secciones, clasificadas según el área de la metabolómica en estudio (lipidómica o metabolómica nutricional) y la instrumentación clave para el desarrollo metodológico (espectrometría de masas de alta o baja resolución). En la Sección A, titulada Desarrollo metodológico en el análisis dirigido en lipidómica, se diseñaron tres métodos para la determinación de endocannabinoides y esteroides. En primer lugar, se propuso un método basado en extracción en fase sólida en línea con cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem (SPE–LC–MS/MS) para el análisis de endocannabinoides y compuestos análogos en suero humano (Capítulo 1). Esta propuesta metodológica está completamente automatizada, lo que aporta una clara superioridad frente a estrategias de preparación de muestra convencionales [1]. En segundo lugar, se desarrolló una metodología basada en cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tándem (GC– MS/MS), que permitió la determinación de esteroides sexuales en plasma humano (Capítulo 2). Esta estrategia recoge una preparación de muestra para la extracción, purificación y derivatización de esteroides en plasma humano, buscando una reducción del uso de disolventes tóxicos, así como una mejora de la sensibilidad del método en comparación a las metodologías existentes en la bibliografía [2]. En último lugar, se desarrolló una configuración SPE–LC– MS/MS para la evaluación del panel completo de esteroides en suero humano (Capítulo 3) siguiendo un planteamiento similar al del Capítulo 1, pero mejorando las prestaciones analíticas del método incluido en el Capítulo 2. Este método ofrece una alternativa rápida en la preparación de muestra, ya que se minimiza la participación humana durante el proceso, así como el tiempo requerido durante la derivatización. Esta notable mejora fue posible gracias al poder de preconcentración que ofrece la extracción en fase sólida (SPE) en línea, que permite alcanzar niveles excelentes de sensibilidad [3]. Estos métodos para la determinación de esteroides pusieron de manifiesto las ventajas e inconvenientes a considerar para implantar la plataforma analítica más adecuada en función del interés de los metabolitos a determinar. En la Sección B, titulada Desarrollo metodológico para la determinación exhaustiva de metabolitos en lipidómica, se recogen dos metodologías para la determinación de dos familias lipídicas, acilcarnitinas (ACs) y ceramidas. Este desarrollo fue posible por la combinación de los modos de adquisición de datos: por un lado, el modo "data independent acquisition" (DIA) mediante el estudio de los mecanismos de fragmentación de las familias lipídicas objetivo mejoró notablemente el nivel de identificación de estos metabolitos; por otro lado, el empleo del modo "data dependent acquisition" (DDA) permitió el desarrollo de estrategias para la determinación semicuantitativa de 47 ACs (Capítulo 4) [4] y de 49 ceramidas (Capítulo 5) [5], en los dos casos en suero humano. Ambas propuestas se materializaron en dos configuraciones SPE–LC–MS/MS para el análisis dirigido de un alto número de ACs y ceramidas. Por último, la Sección C, titulada Aplicaciones de análisis dirigido en metabolómica nutricional, se centró en la evaluación del efecto producido en el perfil de un conjunto de metabolitos en el organismo humano por la ingesta de determinados alimentos, mediante análisis dirigido, utilizando distintas muestras biológicas. Por un lado, empleando la metodología para determinación de ACs del Capítulo 4 y un método basado en cromatografía de gases acoplada a un detector de ionización por llama (GC–FID) para determinar ácidos grasos (FAs), se evaluó el efecto en ambas familias de metabolitos por la ingesta de un producto cárnico bajo en calorías y grasas. Para ello se determinó el perfil en estado basal (ayuno) y durante el postprandio a 1 y 4 h. Este estudio (Capítulo 6) se conformó por dos grupos con parámetros antropométricos muy distintos, uno de ellos caracterizado por presentar obesidad y el otro por poseer un peso normal. Los efectos observados a nivel metabólico en el grupo con obesidad indican una mejora del estado metabólico tras la primera ingesta, con una posible mejoría del estado metabólico a largo plazo en similitud con estudios postprandiales cotejados. Por otro lado, se desarrolló y optimizó una metodología novedosa para eliminar el mayor número posible de interferentes presentes en muestras de orina, como sales y urea, permitiendo una mayor purificación de los analitos de interés, en este caso los fenoles tirosol e hidroxitirosol, para su posterior análisis mediante LC–MS/MS (Capítulo 7). De este modo, se consiguió una herramienta para poder evaluar cambios producidos en los niveles de estos metabolitos por la ingesta de alimentos ricos en estos fenoles, como el aceite de oliva virgen (extra) [6]. Las conclusiones derivadas de la Sección A, centrada en desarrollo metodológico en el análisis dirigido en lipidómica son: - Con la configuración SPE–LC–MS/MS completamente automatizada se logró el análisis cuantitativo de 14 endocannabinoides y compuestos análogos, tras una rápida separación cromatográfica. La etapa de SPE en línea demostró su eficiencia en la eliminación de los principales interferentes que causan supresión de la ionización, permitiendo simultáneamente la preconcentración de los analitos y su cuantificación a niveles de pg mL−1, evitando así etapas de preparación de muestra convencionales. Además, se logró reducir drásticamente el tiempo de análisis y eliminar los errores asociados al proceso analítico y a la intervención humana [1]. - Se ha desarrollado un método basado en GC–MS/MS para la determinación cuantitativa de esteroides sexuales en plasma humano a concentraciones inferiores a los ng mL−1, siendo posible detectar estrógenos a nivel de pg mL−1. Lo más destacable fueron los bajos límites de cuantificación (LOQ) conseguidos con un analizador QTOF, que en gran medida se debieron a los efectos de limpieza y extracción sumados al efecto de la ionización suave proporcionada por la ionización química negativa (NCI). De esta forma, se alcanzaron valores de LOQ similares a los reportados en QqQ para estrógenos hasta el momento. Este método fue probado en 15 hombres voluntarios, proporcionando valores acordes a los recogidos en Human Metabolome DataBase (HMDB) [2]. - Se ha desarrollado un método para el análisis cuantitativo de 16 esteroides en suero humano mediante SPE–LC–MS/MS. La automatización que proporciona la SPE en línea simplifica el proceso de preparación de muestra y evita etapas convencionales, reduciendo los errores asociados y el tiempo de análisis. Además, se consiguió reducir el tiempo requerido para el análisis de todos los analitos gracias al uso de la opción "fast polarity switching" (cambio rápido de polaridad), lo que permitió determinarlos todos en un único análisis en el modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM). Los efectos combinados de limpieza y preconcentración hacen posible alcanzar LOQs del orden de pg mL−1. El método propuesto ofrece una visión general completa de la esteroidogénesis mediante la determinación de diferentes clases de esteroides; a saber, andrógenos, estrógenos, progestágenos, glucocorticoides y un mineralocorticoide. La sensibilidad, la precisión y la exactitud hacen de este método una opción competitiva para la determinación de esteroides en estudios clínicos [3]. En cuanto al desarrollo metodológico para la determinación exhaustiva de metabolitos lipídicos de la Sección B: - Se han desarrollado dos estrategias para la identificación, el análisis confirmatorio y la cuantificación de ACs y ceramidas en suero humano. El mecanismo de fragmentación estudiado mediante la modalidad de análisis DIA permitió la identificación y confirmación de 47 ACs (clasificadas en base a la longitud de la cadena hidrocarbonada y el número de insaturaciones) y 49 ceramidas (clasificadas por la longitud, grado de insaturación y número de grupos hidroxilo de la base esfingoide y el ácido graso esterificado). - Los métodos cuantitativos desarrollados están basados en una configuración SPE–LC–MS/MS en modo DDA, logrando alta sensibilidad y selectividad con una preparación de muestra previa que consiste simplemente en una dilución a partir de un pequeño volumen de suero. Las estrategias propuestas se han aplicado, por un lado, a una cohorte compuesta por individuos obesos y de peso normal para determinar los niveles de referencia en porcentajes y concentraciones de las ACs (Capítulo 4) [4]; y, por otro lado, a la cohorte CORDIOPREV para determinar los niveles de referencia de las ceramidas identificadas y su distribución en suero humano (Capítulo 5) [5]. - Esta combinación DIA/DDA en LC–MS/MS respalda la identificación y cuantificación de numerosos metabolitos análogos caracterizados por un esquema de fragmentación común. Por último, las aplicaciones de análisis dirigido en metabolómica nutricional de la Sección C, centradas en el estudio postprandial del perfil lipídico y en la evaluación del consumo de aceite de oliva virgen (extra), presentan las siguientes conclusiones: - Se han establecido los niveles en sangre de los perfiles de ACs y FAs totales en estado de ayuno, así como la evolución de niveles basales durante el postprandio tras la ingesta de un producto cárnico bajo en calorías y en grasas (Capítulo 6). El comportamiento de las subfamilias de ACs ha sido similar entre los grupos con obesidad y con peso normal, manteniendo las diferencias asociadas a los niveles de acuerdo con el estado de obesidad. El descenso observado en los niveles de glucosa, insulina y ácidos grasos saturados (SFAs) así como el aumento en ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) hallado en el grupo de individuos obesos durante el periodo postprandial sugiere una tendencia a aproximarse a los niveles propios de un individuo de peso normal. Por tanto, se puede asociar esta ingesta con un notable efecto sobre el metabolismo de individuos con obesidad, resultando útil para la prevención y reducción de la obesidad y enfermedades asociadas a esta condición. - Se ha desarrollado y validado un protocolo novedoso basado en SPE para la preparación de muestras antes de la determinación cualitativa y cuantitativa de metabolitos fenólicos del aceite de oliva virgen (extra) en la orina (Capítulo 7). La combinación de SPE en jeringa y LC–MS/MS con un agente de ionización adecuado ha permitido alcanzar niveles de sensibilidad satisfactorios sin necesidad de etapas de derivatización o evaporación del disolvente, lo que simplifica la preparación de la muestra en comparación con los métodos publicados anteriormente. El método propuesto se puede aplicar con una estrategia dual: cualitativa para la caracterización de perfiles de metabolitos fenólicos del aceite de oliva virgen (extra) en orina mediante LC–MS/MS con modo DIA, y cuantitativa para la determinación de fenoles metabolizados como tirosol e hidroxitirosol mediante la implementación de una etapa previa de hidrólisis ácida. El método ha sido aplicado a una cohorte de voluntarios antes y después de una ingesta de aceite de oliva extra (EVOO) para evaluar su rendimiento, resultando ser muy apropiado para aplicación a grandes cohortes de muestras debido a su alta simplicidad, velocidad de procesamiento y bajo costo [6]. Como conclusión global de esta Tesis Doctoral se debe destacar el desarrollo de métodos con altos niveles de sensibilidad, selectividad y precisión gracias a las diferentes estrategias combinadas en el proceso analítico; su aplicación ha puesto de manifiesto que, estas mejoras metodológicas permiten cubrir necesidades en el ámbito analítico, clínico y nutricional.