[en] First, we have explored the relationship between in vitro and in vivo protein folding, in an evolutionary context. We have experimentally characterized the in vitro folding of a set of resurrected Precambrian and modern thioredoxins and found that, contrary to previous claims in the literature, the folding rates are not evolutionarily conserved. Thus, ancestral thioredoxins fold much faster in the test tube than their modern counterparts. Extensive mutational analyses have allowed us to identify mutation S74G as responsible for aggravating folding in E. coli thioredoxin. The evolutionary acceptance of this mutation is interpreted as an example of degradation of ancestral features at the molecular level. We propose that unassisted and efficient primordial folding was linked to fast folding encoded at the sequence/structure level. Once an efficient assistance machinery had emerged, mutations that impaired ancient sequence/structure determinants of folding efficiency could be accepted, since those determinants were no longer necessary. We conclude that in vitro and in vivo folding landscapes are disconnected and question the biologically relevance of the in vitro folding rate determinations, except as related to heterologous folding efficiency (see below). In the second part of this thesis, we have addressed a pivotal and common problem in biotechnology, the inefficient heterologous expression of proteins. As a model system thioredoxin from Candidatus Photodesmus katoptron, an uncultured symbiotic bacteria of flashlight fish, has been used. Our results demonstrate its slow in vitro folding (it takes several hours to reach the native state) and inefficient expression in E. coli, leading mostly to insoluble protein. By using a few back-to-the-ancestral mutations at positions selected by computational modelling of the unassisted folding landscape we were able to rescue its inefficient expression. Our results support that the folding of proteins in foreign hosts may be akin to some extent to unassisted folding due to the absence of coevolution of the recombinant protein with the natural chaperones of the new host. More generally, our results provide an approach based on sequence engineering to rescue inefficient heterologous expression with a minimal protein perturbation.

[es] En primer lugar, hemos explorado la relación entre el plegamiento de proteínas in vitro e in vivo, en un contexto evolutivo. Hemos caracterizado experimentalmente el plegamiento in vitro de un conjunto de tiorredoxinas precámbricas y modernas y hemos descubierto que, al contrario de lo que ha sido afirmado recientemente en la literatura, la velocidad de plegamiento no ha sido conservada a lo largo de la evolución. Las tiorredoxinas ancestrales se pliegan mucho más rápido in vitro que sus homólogas modernas. Un extenso análisis mutacional nos ha permitido identificar que la mutación S74G es la responsable de hacer más lento el plegamiento en la tiorredoxina de E. coli. La aceptación evolutiva de esta mutación se interpreta como un ejemplo de degradación de rasgos ancestrales a nivel molecular. En nuestro trabajo, se propone que el plegamiento primordial, supuestamente no asistido y eficiente, está ligado a un plegamiento rápido que debe estar codificado a nivel de secuencia / estructura. Pero, una vez surgió la maquinaria de asistencia para el plegamiento, se aceptaron mutaciones que dañaban los determinantes de secuencia / estructura que codificaban para un plegamiento rápido in vitro, ya que esta característica dejó de ser necesaria. Por tanto, en este trabajo se concluye que los paisajes de plegamiento in vitro e in vivo están desconectados y se cuestiona la importancia biológica de la velocidad de plegamiento in vitro, excepto en los casos de expresión heteróloga (ver más abajo). En la segunda parte de esta tesis, hemos abordado uno de los problemas más comunes en biotecnología, la ineficiente expresión heteróloga de proteínas. Como sistema modelo, se ha utilizado la tiorredoxina de Candidatus Photodesmus katoptron, una bacteria simbiótica no cultivable del pez linterna. Nuestros resultados demuestran que esta proteína presenta un plegamiento in vitro muy lento (necesita varias horas para alcanzar su estado nativo) y su expresión es ineficaz en E. coli, lo que lleva principalmente a la obtención de proteína insoluble. Mediante el uso de mutaciones de vuelta al ancestro, en determinadas posiciones seleccionadas por un modelo computacional del paisaje de plegamiento, pudimos rescatar su expresión. Nuestros resultados apoyan que el plegamiento de proteínas en un huésped diferente, puede ser similar, en cierta medida, al plegamiento no asistido debido a la ausencia de coevolución de la proteína recombinante con las chaperonas naturales del nuevo huésped. De manera más general, nuestros resultados desarrollan un enfoque basado en la ingeniería de secuencias para rescatar la expresión heteróloga ineficaz con una perturbación mínima de la proteína.