[en] In this Doctoral Thesis, the evaluation of the toxic effects produced by the T-2 toxin and its metabolites HT-2, neosolaniol (Neo), T2-triol and T2-tetraol has been carried out using alternative methods to animal testing. Specifically, in silico predictive models and in vitro models using human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells. Since T-2 is the most cytotoxic mycotoxin of the trichothecenes, the results obtained may contribute to a better understanding of its toxicological mechanisms of action. This will allow a more accurate risk assessment to be made and appropriate measures to be taken to prevent or mitigate harm following exposure. For this purpose, the toxicological properties and ADME processes of T-2, HT-2, Neo, T2-triol and T2-tetraol were evaluated using the in silico predictive methods AdmetSAR and SwissAdme. After potential toxic effects were observed, the toxicity of T-2 and its metabolites HT-2, Neo, T2-triol and T2-tetraol was evaluated in an in vitro model using HepG2 cells individually and in combination. IC50 values ranging from 59.6 to 2770 nM were obtained. Next, T-2 and its main biotransformation products were identified and quantified in the extra- and intracellular medium after 24 h of T-2 exposure to HepG2 cells, showing complete metabolization of T-2 fluctuating levels of its metabolites both in the cellular fraction and in the culture medium, with HT-2 being the major one. Due to the coexistence of T-2 and its metabolites, the type of interaction between them was determined and different effects were found depending on the combination of mycotoxins and the concentrations in the mixture. Thus, antagonistic effects are observed for combinations of T-2 + T2-triol, T-2 + Neo, Neo + T2-triol, Neo + T2-tretraol and Neo + HT-2, and both antagonistic effects at low and additive effects at high concentrations for combinations of T-2 + HT-2, T-2 + T2-tetraol, T2-triol + HT-2, T2-triol + T2-tretraol and T2-tetraol + HT-2. As a possible mechanism of toxicological action, the ability of T-2 and its metabolites to generate reactive oxygen species (ROS) and the protective role of cellular and enzymatic defense systems were evaluated. In terms of cellular defense, a general decrease in glutathione (GSH) was observed after exposure to mycotoxins. However, depending on the mycotoxin and the concentration tested, a wide range of results were observed in terms of enzymatic defense (glutathione peroxidase, GPx; glutathione transferase, GST), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in HepG2 cells. The role of GSH and related enzymes (GPx and GST) in the defense of HepG2 cells exposed to T-2 and its metabolites was confirmed by the increase in their activity at the cellular level after the addition of N-acetyl-cysteine (NAC) and the decrease after the addition of D-L-buthionine-(S, R)-sulfoximine (BSO). The cytoprotective effect of bioactive substances present in legumes (red beans), microalgae (Tetraselmis chuii and Phaeodactylum tricornutum) and fish hydrolysates, all of which are components of the Mediterranean diet and are known their high antioxidant content, was also evaluated. Moreover, exposure of HepG2 cells to T-2 revealed an alteration in cell proliferation with cell cycle disruption, which could be related to the processes of cell death, apoptosis and necrosis. In addition, DNA damage was observed after T-2 exposure as determined by genotoxicity assays, namely the micronucleus assay and the comet assay. However, exposure to T-2 did not induce mutagenic effects using the bacterial reverse gene mutation assay. Finally, a three-dimensional (3D) cellular model of liver cell spheroids was used in microfluidic devices to simulate the in vivo biological environment and to obtain more accurate and relevant results for the study of T-2 cytotoxicity in liver models. Two 3D cell culture models were investigated and compared in microfluidic devices: monoculture spheroids with HepG2 cells and co-culture spheroids with HepG2 and LX2 cells. The models were used to assess the cytotoxic effects of T-2 by different measures, such as cell viability, albumin, hepatic metabolic enzymes and inflammatory cytokines. The results obtained with co-culture spheroids in microfluidic devices confirmed that the effects observed after T-2 exposure represent a more realistic approach to liver conditions than those obtained with monoculture spheroids or in standard plates. In conclusion, the results obtained indicate that T-2 and its metabolites could represent a risk to human health. Therefore, further knowledge of the mechanisms of toxicity would be necessary to prevent adverse effects of T-2 and its metabolites and to reduce dietary exposure in order to protect consumer health.

[es] En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la evaluación de los efectos tóxicos producidos por la toxina T-2 y sus metabolitos HT-2, neosolaniol (Neo), T2-triol y T2-tetraol mediante métodos alternativos a la experimentación animal, concretamente modelos de predicción in silico y modelos in vitro en células de hepatocarcinoma humano (HepG2). Debido a que la T-2 es la micotoxina más citotóxica de los tricotecenos, los resultados obtenidos pueden contribuir a un mayor conocimiento de sus mecanismos de acción toxicológica. De esta manera se puede realizar una evaluación del riesgo más precisa, y adoptar medidas adecuadas para prevenir o mitigar el daño producido tras su exposición. Para ello, se evalúan las propiedades toxicológicas y de los procesos ADME de la T-2, HT-2, Neo, T2-triol y T2-tetraol utilizando los métodos de predicción in silico AdmetSAR y SwissAdme. Tras observarse potenciales efectos tóxicos, se procede a la evaluación de la toxicidad de la T-2 y sus metabolitos HT-2, Neo, T2-triol y T2-tetraol en un modelo in vitro, con células HepG2 de forma individual y combinada, mostrando valores de IC50 entre 59,6 y 2770 nM. A continuación, se identifica y cuantifica la T-2 y sus principales productos de biotransformación en el medio extra e intracelular tras 24 h de exposición de la T-2 a las células HepG2, observándose la completa metabolización de T-2 y la fluctuación de los niveles de sus metabolitos tanto en la fracción celular como en el medio de cultivo, siendo HT-2 el mayoritario. Debido a la coexistencia de la T-2 y sus metabolitos, se determina el tipo de interacción entre ellos, y se evidencian diferentes efectos dependiendo de la combinación de micotoxinas y las concentraciones en la mezcla. Así, se observa efectos antagónicos en las combinaciones de T-2 + T2-triol, T-2 + Neo, Neo + T2-triol, Neo + T2-tretraol y Neo + HT-2, y efectos antagónicos a concentraciones bajas y aditivos a altas en las combinaciones de T-2 + HT-2, T-2 + T2-tetraol, T2-triol + HT-2, T2-triol + T2-tretraol y T2-tetraol + HT-2. Como posible mecanismo de acción tóxica, a continuación se evalúa la capacidad de la T-2 y sus metabolitos de generar especies reactivas de oxígeno (ROS) y el papel protector de los sistemas de defensa celular y enzimático. Respecto a la defensa celular, se observa una disminución general del glutatión (GSH) tras la exposición a las micotoxinas. Sin embargo, se observa una gran variedad de resultados, dependiendo de la micotoxina y de la concentración evaluada, en cuanto a la defensa enzimática (glutatión peroxidasa, GPx; glutatión transferasa, GST), catalasa (CAT) y superóxido dismutasa (SOD) en las células HepG2. El papel del GSH y las enzimas relacionadas (GPx y GST) en la defensa de las células HepG2 expuestas a la T-2 y sus metabolitos se confirma con el incremento de su actividad a nivel celular tras la adición de N-acetil-cisteína (NAC) y la reducción tras la adición de D-L-butionina-(S, R)-sulfoximina (BSO). Por otra parte, también se evalúa el efecto citoprotector de sustancias bioactivas presentes en legumbres (judías rojas), microalgas (Tetraselmis chuii y Phaeodactylum tricornutum) e hidrolizados de pescado, todos ellos componentes de la dieta Mediterránea y debido a su alto contenido en antioxidantes. Por otra parte, la exposición de las células HepG2 a la T-2 pone de manifiesto una alteración de la proliferación celular observada con la disrupción del ciclo celular, que podría estar relacionado con los procesos de muerte celular apoptosis y necrosis. Además, se observa daño al ADN tras la exposición a T-2, el cual se determinó a través de ensayos de genotoxicidad, concretamente el ensayo de micronúcleos y el ensayo del cometa. No obstante, la exposición a T-2 no causó efecto mutagénico mediante el ensayo de la mutación genética reversa bacteriana. Finalmente, se aplica un modelo celular tridimensional (3D) de esferoides de células hepáticas en dispositivos microfluídicos para simular el entorno biológico in vivo y obtener resultados más precisos y relevantes para el estudio de la citotoxicidad de la T-2 en modelos hepáticos. Se estudian y comparan dos modelos de cultivo celular 3D en dispositivos microfluídicos: esferoides de monocultivo con células HepG2 y esferoides de co-cultivo con células HepG2 y LX2. Con estos modelos, se evalúan los efectos citotóxicos de la T-2 mediante diferentes procesos, tales como viabilidad celular, albúmina, enzimas metabólicas hepáticas y citoquinas inflamatorias. Los resultados obtenidos con los esferoides de co-cultivo en dispositivos microfluídicos confirman que los efectos observados tras la exposición de la T-2 presentan un enfoque más realista de las condiciones hepáticas que los obtenidos con esferoides de monocultivo o en placas estándar. En resumen, los resultados obtenidos indican que la T-2 y sus metabolitos podrían suponer un riesgo para la salud humana. Por lo que sería necesario ampliar los conocimientos de los mecanismos de toxicidad para poder prevenir efectos adversos de la T-2 y sus metabolitos y reducir la exposición a través de la dieta para proteger la salud del consumidor.