[en] Introduction: Cutaneous Skeletal Hypophosphatemia Syndrome (CSHS) is an ultra-rare mosaic disorder caused by postzygotic RAS mutations that is defined by the association of epidermal and/or melanocytic nevi, fibroblast growth factor-23 (FGF23) excess, and a skeletal dysplasia. Because of its rarity, CSHS has been inadequately characterized. Further, unknown are the roles of RAS mutations in dysplastic bone formation and the source and physiopathology of FGF23 overproduction in CSHS. Thesis hypotheses: 1) A thorough phenotypic assessment of patients with CSHS, and the analysis of all potential reported CSHS cases will provide important clinical information, 2) Dysplastic bone is the source of FGF23 overproduction in CSHS and, 3) The generation of appropriate experimental models will inform of CSHS's physiopathology. Objectives: 1) To clinically characterize CSHS through the study of a cohort of subjects and a review of all reported cases, 2) To identify the physiopathology of FGF23 overproduction in CSHS, 3) To investigate the effects of hyperactive Ras on dysplastic bone formation. Subjects and methods: Five CSHS subjects were phenotyped and underwent prospective data collection. A review of the literature identified 51 subjects in whom the findings were compatible with CSHS. Data on nevi, bone histology, mineral and skeletal alterations, abnormalities in other tissues, and response to treatments of hypophosphatemia were analyzed. To assess the effects of RAS mutations on FGF23 production in "bone-like" cells, FGF23 production/gene expression was measured in 1) human bone marrow stromal cells (hBMSCs) and 2) IDG-SW3 cells transduced with mutated adenoviral RAS constructs, in 3) mutant hBMSCs from a CSHS patient, and in 4) IDG-SW3 cells treated with media in which mutant CSHS hBMSCs had been cultured. To further characterize CSHS bone histology, an ossicle formation assay was performed by transplanting mutant CSHS hBMSCs subcutaneously into immunocompromised mice. Finally, 3 tissue-specific mutant Ras knock-in mouse models were designed through Cre-Lox recombination technology to investigate the effects of activating Ras mutations in bone. The models consisted in the activation of a LoxP-STOP-LoxP-KrasG12D (LSL-KrasG12D) transgene through 3 different Cre-recombinases driven by the following promoters: 1) tamoxifen-inducible 3.6 kb collagen type I α-1, 2) tamoxifen-inducible paired-related homeobox gene-1(Prx1), and 3) non-inducible Prx1. Results: From a clinical standpoint, fractures, limb deformities, and scoliosis affected most CSHS subjects. Hypophosphatemia was not present at birth. Bone histology only revealed severe osteomalacia without other obvious abnormalities. Skeletal dysplasia was reported in all anatomical compartments. Phosphate and calcitriol supplementation was effective in treating rickets in most patients. Convincing data that nevi removal improved blood phosphate levels was lacking. An age-dependent improvement in mineral abnormalities was observed. A spectrum of extra-osseous/extra-cutaneous manifestations that included both benign and malignant neoplasms was present in many subjects, although osteosarcoma remains unreported. From an experimental standpoint, increased FGF23 production/expression was not detected with any of the experimental conditions in the in vitro experiments. Poor bone formation with the ossicle assay hampered histological characterization of the ossicles. No abnormal findings were detected in the models featuring the tamoxifen-inducible promoters. No double transgenic offspring harboring both LSL-KrasG12D and the non-inducible Prx1-Cre recombinase were identified. Conclusions: The study of patients and reports of subjects with CSHS provided relevant and novel clinical information. Also, the analysis of affected patient tissues allowed further appreciation of the effects of hyperactive RAS in different organs. Still, the source of excess FGF23 in CSHS remains unknown, although data indicate it is probably not produced by the nevi. Other conclusions include the lack of suitability of BMSCs to study FGF23 production/expression, the poor reproducibility of the subcutaneous ossicle formation assay, and the lethality of widespread Kras mutations in early embyrionic skeletal cells in mice.

[es] Introducción: El síndrome Cutaneo Esquelético Fosfatémico (SCEF) es una enfermedad mosaica ultrarara causada por mutaciones RAS postzygóticas que se define por la asociación de nevus epidérmicos y/o melanocíticos, sobreproducción de factor de crecimiento fibroblastico-23 (FGF23), y lesiones displásicas óseas. Dada su rareza, el SCEF no ha sido caracterizado adecuadamente. Asimismo, se desconoce el papel de las mutaciones RAS en la génesis de las lesiones óseas, así como la fisiopatología de la sobreproducción de FGF23 en el SCEF. Hipótesis: 1) El fenotipado de pacientes con SCEF así como el análisis de todos los casos de SCEF publicados proveerán información clínica relevante, 2) Las lesiones óseas displásicas son la fuente de sobreproducción de FGF23 en el SCEF, y 3) La creación de modelos experimentales adecuados informarán sobre la fisiopatología del SCEF. Objetivos: 1) Caracterizar el SCEF clínicamente mediante el estudio de una cohorte de sujetos y una revisión bibliográfica de todos los casos publicados, 2) Identificar el tejido responsable de la sobreproducción de FGF23 en el SCEF, y 3) Investigar los efectos de las mutaciones RAS en el desarrollo de lesiones óseas. Sujetos y métodos: 5 sujetos con SCEF fueron fenotipados de manera exhaustiva. Se identificaron 51 casos en la revisión bibliográfica compatibles con SCEF. Se recogieron y analizaron datos sobre la histología ósea, alteraciones esqueléticas, minerales, cutáneas y de otros tejidos, así como las respuestas a diferentes tratamientos para la hipofosfatemia en los sujetos de la cohorte y la literatura. Se evaluaron los efectos de las mutaciones RAS en la producción/expresión de FGF23 en células humanas mesenquimales de médula ósea (hBMSCs) y en células IDG-SW3 transducidas con adenovirus portadores de mutaciones RAS, en hBMSCs mutantes procedentes de un paciente con SCEF, y en células IDG-SW3 tratadas con medio de cultivo de hBMSCs mutantes. Se trasplantaron subcutáneamente hBMSCs mutantes en ratones inmunocomprometidos para generar osículos con características histológicas de SCEF. Se crearon 3 modelos de ratones transgénicos mediante la recombinación Cre-Lox que se basaban en la activación del transgén LoxP-STOP-LoxP-KrasG12D mediante los siguientes promotores de recombinasa Cre: la porción 3.6kb del colágeno 1 alpha-1 inducible por tamoxifeno, Prx1 inducible por tamoxifeno, y Prx1 no inducible. Resultados: La mayor parte de sujetos con SCEF presentaban fracturas, deformidades esqueléticas, y escoliosis. La hipofosfatemia no estaba presente en el nacimiento. Se detectó osteomalacia severa en la histología ósea sin otras alteraciones. Se identificaron lesiones diplásicas en todos los compartimentos esqueléticos. La suplementación con fosfato y calcitriol fue efectiva en la mayoría de sujetos para el raquitisimo/hipofosfatemia. La extirpación de los nevus no se asoció de manera clara con un incremento de la fosfatemia. Se observó una mejoría de las alteraciones minerales asociadas a la edad. Se identificaron en muchos sujetos varias manifestaciones extra-óseas/extra-cutáneas, incluyendo neoplasias, pero no se identificaron cánceres óseos. No se detectaron incrementos de FGF23 en ninguno de los experimentos in vitro. No se pudieron caracterizar adecuadamente los osículos dada una formación ósea insuficiente. No se identificaron anormalidades en los modelos de ratón inducibles. No se identificó ningún ratón doble transgénico para la Prx1 cre-recombinasa y LoxP-STOP-LoxP-KrasG12D. Conclusiones: el fenotipado de la cohorte y la revisión bibliográfica proporcionó información clínica relevante. No obstante, el tejido responsable de la sobreproducción de FGF23 en el SCEF sigue sin conocerse pero los resultados sugieren que los nevus no son la fuente. Otras conclusiones incluyen la falta de idoneidad de las hBMSCs para estudiar la producción FGF23, la escasa eficiencia/reproducibilidad de la formación ósea mediante la implantación de hBMSCs en ratones inmunocomprometidos, y la letalidad de la expresión generalizada de mutaciones Kras en células esqueléticas embrionarias murinas.