[en] INTRODUCTION: The mammary gland is a highly dynamic tissue that reaches its maximal functional differentiation during lactation, when, by means of milk production, provides nutrition and immunological protection to the mammalian offspring. When lactation ends and weaning of the pups takes place, the excess tissue that was developed during pregnancy and lactation is no longer needed and mammary gland has to regress to a pre-pregnant state. Involution of mammary gland is an intricate process during which the events that take place are programmed cell death of secretory epithelial cells, differentiation of adipose tissue, and remodelling of the glandular structure. These coordinated events can be classified in two phases, the first being reversible and consisting mainly of apoptosis, and a second irreversible phase where the remodelling of the ductal epithelium takes place and many proteases are involved, such as metalloproteases (MMPs) and cathepsins. Of note, many of the pathways involved in the post-lactation regression process have also been implicated in breast cancer development, and, although epidemiologically speaking, pregnancy and lactation confer women protection from breast cancer, it has been shown that the main hubs that control mammary gland involution are also involved in tumour development and progression. There are many signalling molecules that play a role in involution, being the main four pathways that orchestrate this process STAT5/STAT3, NF-κB, TGF-β and PI3K/AKT. Among these, STAT3 and NF-κB regulate the expression of genes involved in pro-inflammatory response. Previous work from our group demonstrated that one of the pro-inflammatory genes induced during mammary gland involution is inducible nitric oxide synthase (NOS2). This gene is regulated by NF-κB and it is responsible in part for the increase of nitric oxide (NO) levels found in mammary gland upon weaning. AIMS: The aims of this work were: i) to explore the role of NO as a signalling molecule in the regulation of two of the main pathways implicated in the involution process, STAT3 and NF-κB; ii) to study if there are specific nitrosative modifications induced by NO in proteins that are implicated in mammary gland involution, and how these post-translational modifications affect their function; and finally, iii) to find which physiological mechanisms regulated by NO during weaning are also recruited by neoplastic breast cells when exposed to high NO concentrations. RESULTS: In order to study the role of NO in the involution of mammary tissue after lactation, NOS2-KO (knockout) mice were used. No apparent differences were observed between NOS2- KO and WT (wild-type) animals during pregnancy. However, during lactation KO mice produced more milk and their pups gained more weight. Upon cessation of lactation, a notable delay in involution was observed, compared with WT mice. NOS2-KO mice showed increased phosphorylation of STAT (signal transducer and activator of transcription) 5 during weaning, concomitant with increased β-casein mRNA levels when compared with weaned WT glands, both hallmarks of the lactating period. In contrast, activation of STAT3, although maximal at 24h after weaning, was significantly reduced in NOS2-KO mice. Indeed, activation of both STAT3 and NF-κB was observed in WT mice during weaning, concomitant with an increased apoptotic rate. During the same period, less apoptosis, in terms of caspase 3 activity, was found in NOS2-KO mice and NF-κB activity was significantly delayed when compared with WT mice. These results emphasize the role of NO in the fine regulation of the weaning process, since, in the absence of NOS2, the switching on of the cascades that trigger involution is hindered for a time, retarding apoptosis of the epithelial cells and extracellular matrix remodelling. On the other hand, it is well known that NO can act as a reactive species and induce nitrosative modifications in lipids and proteins, leading to gain or loss of function. In proteins, these modifications manifest in two main forms, s-nitrosylation of cysteine thiols and nitration of tyrosine residues. For the second aim of our work we performed proteomic studies in the mammary gland of control lactating and 72h weaned rats that showed that there is an increased pattern of nitrated proteins during weaning when compared with controls. We established the novel finding that cathepsin D (CD) is nitrated during weaning. The expression and protein levels of this enzyme were increased after 8 h of litter removal and this up-regulation declined 5days after weaning. However, there was a marked delay in CD activity since it did not increase until 2 days post-weaning and remained high thereafter. This delay between expression and activity pointed to the possibility of a post-translational modification that allowed for the activation of the protease. In order to find out whether nitration of CD regulates its activity, the previously mentioned NOS2-KO model was used. The expression and protein levels of this enzyme were similar to WT animals, but the proteolytic activity was significantly reduced during weaning in KO compared to WT mice. In vitro treatment of recombinant human CD or lactating mammary gland homogenates with relatively low concentrations of peroxynitrite enhanced the nitration as well as specific activity of this enzyme. Using mass spectrometry, we showed that the residue Tyr168 is nitrated. All of these results point that NO plays a role in the regulation of the pathways involved in mammary gland remodelling after weaning. Lastly, we performed some preliminary work in order to figure out which of the pathways we found to be regulated by NO during the physiological process of involution, were also affected in a luminal breast cancer model. For this, we performed in vitro experiments in which we exposed breast cancer MCF-7 cell line to high concentrations of a NO donor (SIN-1). We saw that even if exposure of cells to high concentrations of NO decreased cell viability, there was also recruitment of pro-survival mechanisms such as AKT and NF-κB. Indeed, we confirmed an increase in levels of phosphorylated AKT as well as a decrease in the NF-κB negative regulator IκBα, which was accompanied with an increase of MMP-9 mRNA levels, a gene known to be regulated at a transcriptional level by NF-κB. This preliminary data point to the possibility that breast tumour cells, upon NO stimulation, activate the same mechanisms observed during weaning. CONCLUSIONS: The absence of NOS2 results in lower NO levels during post-lactational mammary gland involution, which in turn delays this process. The most remarkable differences have been observed specifically in the activation of the Stat5/Stat3 switch and the activation of NF-κB affecting the first phase of the process, where apoptosis is mainly involved, this delay has further impact on the extracellular matrix (ECM) remodelling that takes place during the second phase of involution. Also, NO induces specific post-translational modifications that modulate protein function such as tyrosine-nitration of CD which results in its activation. Finally, in a luminal breast cancer model, in vitro exposure to high concentrations of NO seems to induce contradictory signals since it leads to cell death but the remaining cells present AKT phosphorylation and NF-κB activation, which are pro-survival signals, underlining the important role of this molecule in the fine-tuning of many cellular processes.

[es] INTRODUCCIÓN La glándula mamaria es un órgano dinámico que alcanza su máximo desarrollo funcional con la lactancia, momento en el cual, a través de la producción de leche, aporta nutrientes y protección inmunológica a las crías de los mamíferos. Cuando la lactancia finaliza con el destete, el exceso de tejido glandular debe desaparecer y la glándula sufre una extensa remodelación hasta alcanzar nuevamente un estado pre-gestacional, preparada para un nuevo ciclo. La involución del tejido mamario es un proceso complejo durante el cual se suceden de forma coordinada una serie de eventos como la muerte de las células epiteliales secretoras, la proliferación de tejido adiposo circundante y la remodelación de la estructura glandular. El proceso involutivo puede clasificarse en dos etapas, siendo la primera un proceso reversible en el que predomina la apoptosis, y la segunda fase un fenómeno irreversible, en el que se da la remodelación del epitelio ductal y en el que participan proteasas como las metaloproteasas (MMPs) y las catepsinas. Cabe señalar que las vías de señalización que coordinan este proceso también están implicadas en el desarrollo de cáncer de mama. Es más, si bien desde una perspectiva epidemiológica, el embarazo y la lactancia protegen del desarrollo de neoplasias mamarias a largo plazo, se ha demostrado que los principales mecanismos que controlan la involución también controlan procesos de carcinogénesis. Las cuatro vías principales de señalización que regulan la involución post-lactancia son STAT5/STAT3, NF-κB, TGF-β y PI3K/AKT. Los factores de transcripción STAT3 y NF-κB regulan la expresión de genes de respuesta inflamatoria. Nuestro grupo ha demostrado en trabajos previos que uno de los genes inducidos por NF-κB es la Óxido Nítrico Sintasa Inducible (NOS2). Este enzima es responsable del aumento de los niveles de óxido nítrico (NO) en la glándula mamaria durante el destete. OBJETIVOS: Los objetivos de el presente trabajo son: i) estudiar el papel del NO en la regulación de dos de las principales vías del proceso involutivo, STAT3 y NF-κB; ii) estudiar la existencia de modificaciones postraduccionales inducidas por el NO en proteínas, centrándonos en la nitración de resíduos de tirosina. Posteriormente se trata de esclarecer el efecto de estas modificaciones postraduccionales; iii) estudiar qué mecanismos fisiológicos regulados por NO durante el destete también son activados en células de cáncer de mama que son expuestas a altas concentraciones de NO. RESULTADOS: Para estudiar el papel del NO en la involución de la glándula mamaria tras la lactancia utilizamos ratones knockout (KO) para el gen NOS2 (NOS2-KO). Si bien no se apreciaron diferencias entre los ratones NOS2-KO y los wild-type (WT) durante el embarazo se objetivó que los ratones KO tenían una mayor producción de leche y sus crías una mayor ganancia ponderal durante la lactancia. A su vez, existía un retraso evidente en el inicio de la involución en estos ratones con respecto a los WT. Los animales NOS2-KO presentaban un aumento en la fosforilación de STAT5 durante el destete, con un aumento de los niveles de expresión de β-caseina con respecto al tejido glandular de los WT. Ambos parámetros son características distintivas del período de lactancia. A su vez, si bien en ambos tipos de ratones se objetivó una activación de STAT3, que alcanzó su pico a las 24h tras el destete, esta activación estaba claramente reducida en los ratones NOS2-KO. De hecho, se vio tanto una activación de STAT3 y NF-κB como un aumento de la apoptosis en el tejido glandular de los ratones WT tras el destete; sin embargo, durante el mismo periodo de tiempo, se observó una menor apoptosis (medida como actividad de caspasa 3) así como un retraso en la activación de NF-κB en los ratones KO, en comparación con los WT. Estos resultados sugieren que el NO tiene un papel en la regulación del proceso involutivo post-lactancia, dado que, en ausencia de NOS2, la activación de las cascadas de señalización que rigen la involución se encuentra retrasada, lo cual dilata el inicio de la fase de apoptosis y consecuentemente, de la fase de remodelación tisular. Por otra parte, NO actúa como una especie reactiva e induce modificaciones nitrosativas en lípidos y proteínas, que pueden conllevar activación o inhibición de actividad enzimática. En proteínas estas modificaciones suelen ser s-nitrosilación de tioles de cisteína y nitración de residuos tirosina. Realizamos estudios de nitroproteómica en homogenados de glándula mamaria de rata lactante y tras 72h de destete en los que se demostró un aumento del patrón de nitración durante el destete. Objetivamos que la catepsina D (CD) se nitra durante el destete y que esta modificación postraduccional suponía un aumento en su actividad del 50% en estudios in vitro. El papel de la nitración en la actividad de la CD se confirmó en estudios in vivo mediante los cuales objetivamos que no había diferencias en el procesamiento de la proteasa, pero su actividad proteolítica se encontraba significativamente reducida durante el destete en los ratones KO. Finalmente, mediante un estudio de espectrometría de masas, se determinó que uno de los residuos tirosina nitrados se encontraba en la posición 168 de la cadena pesada. Finalmente, realizamos estudios preliminares para intentar dilucidar qué vías de señalización reguladas por NO durante el destete también se veían afectadas en células de carcinoma de mama. Para ello se utilizó un modelo in vitro de células MCF-7 tratadas con altas concentraciones de SIN-1, un donante de NO. De acuerdo con la literatura, la exposición a concentraciones crecientes de NO inducía disminución de la viabilidad celular, sin embargo, también se objetivó la activación de vías de señalización pro-supervivencia. Concretamente comprobamos que a concentraciones mayores de NO existía un aumento de los niveles de AKT fosforilado y un descenso en IκBα, un inhibidor de NF-κB, el cual se acompañaba de un aumento en los niveles de mRNA de MMP-9, una diana transcripcional de NF-κB. Estos datos preliminares apuntan a la posibilidad de que en células de cáncer de mama, tras estímulo con NO, se activen las mismas vías reguladas por esta molécula durante la involución post-lactancia. CONCLUSIONES: La ausencia de NOS2 implica una disminución en los niveles de NO durante la involución de la glándula mamaria tras el destete, lo cual retrasa pero no impide este proceso fisiológico. Las diferencias más importantes objetivadas han sido a nivel de la activación de las vías STAT3 y NF-κB, lo cual retrasa el inicio de la primera fase del proceso, en la cual la apoptosis predomina. Este retraso también tiene un impacto en la segunda fase de la involución en la que se da la remodelación de la matriz extracelular. Además, el NO induce modificaciones postraduccionales específicas que modulan la función enzimática, por ejemplo la nitración de residuos de tirosina. En este trabajo describimos la nitración de CD que induce su activación. En un modelo de cáncer de mama luminal, la exposición a altas dosis de NO parece inducir señales contradictorias dado que por una parte reduce la viabilidad celular y por otra, active vías anti-apoptóticas como AKT y NF-κB, lo que apunta al papel importante de esta molécula en la regulación de múltiples procesos celulares.