[en] This thesis project focuses on the structural-functional characterization of the biological properties of antimicrobial RNases from the RNase A superfamily. Specifically, the following short-term goals have been achieved: Structural and functional characterization of RNase 6 by X-ray crystallography, molecular dynamics, site-directed mutagenesis and enzymatic analysis have highlighted the key role of remote binding subsites. Besides, we have identified in RNase 6 a putative novel secondary active site. In addition, an evolutionary study of several members of the RNase A superfamily have revealed a clear drift from guanine to adenine preference at the secondary base binding site (B2) architecture along vertebrate evolution. During this thesis' experimental work, we have pursued the characterization of RNases' bactericidal mechanism of action, a long-term object of study in our research group. Here, we have specifically focused on the optimisation of the antimicrobial peptide derived from RNase 3, ECP(5-17P24-36), and the design of a chimeric antimicrobial RNase (RNase 3/1). Regarding the N-terminus peptide ECP(5-17P24-36), it has been optimised by several methodologies. We have concluded the best antimicrobial candidate to be its total enantiomer, D-ECP(5-17P24-36). As for RNase 3/1, this chimera encompasses structural features from RNases 1 and 3 parental proteins to combine both high catalytic and bactericidal activities. A first construct was successfully achieved, albeit not reaching the bactericidal activity levels of RNase 3. Therefore, we designed two more versions of RNase 3/1 that incorporate the RNase 3 C-terminus loop. A specific tag motif was identified in that region associated to autophagosome recruitment. Interestingly, the hybrid chimera RNase 3/1 was able to delay the acquisition of bacterial resistance to colistin using an in vitro evolutionary exposure assay in Acinetobacter baumannii cultures. Overall, the results shed light on the elucidation of substrate binding architecture and antimicrobial mechanism of action of RNases and their contribution to the innate immune system, with promising pharmacological applications.

[es] Esta tesis se enfoca en la caracterización estructural y funcional de las propiedades biológicas de las RNasas antimicrobianas de la superfamilia de la RNasa A. Concretamente, se han alcanzado los siguientes objetivos en el corto plazo: La caracterización estructural y funcional de la RNasa 6 por cristalografía de rayos X, dinámica molecular, mutagénesis dirigida y análisis enzimáticos destaca el papel clave de las regiones remotas de unión al sustrato. A parte, hemos identificado un posible segundo centro activo en la RNasa 6. Finalmente, un estudio evolutivo de los distintos miembros de la superfamilia de la RNasa A ha revelado una tendencia clara, a lo largo de la evolución en vertebrados, desde la preferencia de la guanina hacia adenina en la arquitectura de la región secundaria de unión a bases B2. A lo largo del trabajo experimental realizado en esta tesis, hemos buscado la caracterización del mecanismo de acción bactericida de las RNasas, una de las principales líneas de investigación de nuestro grupo de investigación. En este trabajo, nos hemos enfocado específicamente en la optimización del péptido derivado del N-terminal de la RNasa 3, ECP(5-17P24-36), y en el diseño de una RNasa quimérica antimicrobiana (RNasa 3/1). Respecto al péptido ECP(5-17P24-36), se ha optimizado mediante varias metodologías, llegando a la conclusión que el mejor candidato antimicrobiano es su enantiómero total D-ECP(5-17P24-36). Por lo que respecta a la RNasa 3/1, esta incorpora las características estructurales de las RNasas 1 y 3, combinando así su elevada actividad catalítica y bactericida, respectivamente. Se diseñó un primer constructo con éxito, pese a que no presentaba los mismos niveles de actividad bactericida que la RNasa 3. Entonces, diseñamos dos nuevas versiones de la RNasa 3/1 que incorporaban el loop C-terminal de la RNasa 3, en el que se identificó un motivo estructural específico asociado al reclutamiento del autofagosoma. Es interesante destacar la capacidad de la primera versión de la quimera RNasa 3/1 de retrasar la adquisición de resistencia a la colistina en un ensayo evolutivo in vitro de exposición a la colistina en cultivos de Acinetobacter baumannii. En global, estos resultados ayudarán a elucidar el modo de unión al RNA de las ribonucleasas y su mecanismo antimicrobiano, así como su contribución en el sistema inmunitario innato, con prometedoras aplicaciones farmacológicas.