[en] Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a neuromuscular disorder caused by mutation or loss in SMN1 gene, encoding the ubiquitously expressed Survival Motor Neuron (SMN) protein. SMA is characterized by muscle atrophy, and spinal cord motoneurons (MNs) degeneration. The molecular events behind the selective vulnerability of these MNs to low level of SMN protein are still unknown. The nuclear factor-κB (NF-κB) pathway has recently been emerged having a vital role related to MN survival, and in neurodegenerative disorders. The NF-κB transcription factors regulate genes related to several cellular processes. In the present work, we have analyzed the ability of NF-κB pathway members to regulate Smn and their possible role in SMA pathogenesis. The NF-κB pathway activation is associated with IKKα/IKKβ phosphorylation, and RelA/p50 nuclear translocation (canonical) or IKKα homodimer phosphorylation, and RelB/p52 nuclear translocation (non-canonical). The inhibition of different protein members of both canonical, and non-canonical pathways using shRNA lentiviral transduction methodology in a primary culture of isolated embryonic spinal cord MNs reveals that the selective reduction of RelA induced the reduction of Smn whereas RelB protein reduction had no effect on Smn. In our culture system, reduction of IKKα or IKKβ proteins showed opposite effects on Smn. RT-PCR studies indicate that the shIKKβ-transduced MNs showed increased Smn mRNA levels, whereas it was not observed changes in Smn mRNA in the case of shIKKα- or shRelA-transduced MNs. The double knock-down of IKKα and IKKβ in MNs showed Smn reduction. The knockdown of IKKα and/or IKKβ showed a decrease in RelA phosphorylation, where the phosphorylation of RelA enable RelA/p50 release from its inhibitor in the cytoplasm and facilitates their nuclear translocation. Also, the CREB, one of the transcription factors for Smn was decreased in shIKKα, or in shIKKα- plus IKKβ-transduced MNs, and as well as in shRelA-transduced MNs. But, the shIKKβ MNs exhibited reduced p-RelA but increased CREB level. The shCREB-transduced MNs decreased Smn level, authenticating the regulatory role of CREB on Smn. We observed a reduction in IKKα, IKKβ and p-RelA levels in shSmn-tranduced MNs, and in MNs from a severe type SMA mouse model. Our results show the ability of NF-κB canonical pathway to regulate Smn level and, conversely, this pathway is also altered in Smn-deficient MNs. Together, these observations suggest that the NF-κB pathway has a role in SMA pathogenesis, and could be a therapeutic target for SMA.

[es] La Atrofia Muscular Espinal (SMA) es un trastorno neuromuscular causado por la mutación o deleción del gen SMN1, el cual codifica para la proteína que se expresa ubicuamente SMN (del inglés Survival Motor Neuron). La AME se caracteriza por atrofia muscular y degeneración de las motoneuronas de la médula espinal (MN). Los eventos moleculares detrás de la vulnerabilidad selectiva de las MN con niveles bajos de la proteína SMN se desconocen. La vía del factor nuclear-kB (NF-kB) ha sido implicada recientemente en la supervivencia de las MNs, así como en trastornos neurodegenerativos. Los factores de transcripción NF-kB regulan genes relacionados con varios procesos celulares. En este trabajo hemos analizado la capacidad de los miembros de la vía del NF-κB de regular la proteína SMN y su posible rol en la patogénesis del AME. La activación de la vía del NF-κB está asociada a la fosforilación de IKKα / IKKβ y la translocación nuclear del factor RelA/ p50 (vía canónica) o la fosforilación del homodímero de IKKα y la translocación nuclear del factor RelB / p52 (vía no canónica). Hemos realizado la inhibición de diferentes miembros de estas vías (tanto la canónica como la no canónica) usando la metodología de shRNA, y la transducción mediante el uso de lentivirus, en cultivos primarios de MN embrionarias aisladas de ratón. Hemos demostrado que una reducción selectiva del factor RelA provoca una reducción de la proteína SMN, mientras que una reducción del factor RelB no tiene ningún efecto en los niveles de la SMN. En nuestro modelo celular, la reducción de las proteínas IKKα o IKKβ mostró efectos opuestos sobre la proteína Smn. Mediante la técnica de PCR, hemos observado que la transducción de las MN con el shIKKβ provoca un aumento de los niveles de mRNA de SMN, mientras que la transducción con el shIKKα o el shRelA no cambian los niveles de RNA de SMN. El doble knockdown de IKKα e IKKβ en las MN muestra una reducción de SMN. El knockdown selectivo de IKKα o IKKβ presenta una reducción de la fosforilación del RelA, esta fosforilación permite la liberación de su inhibidor en el citosol y facilita la translocación nuclear. La proteína CREB, uno de los factores de transcripción conocidos para SMN, disminuye con la transducción de las MN con shIKKα o con IKKα e IKKβ a la vez, así como con shRelA. Ahora bien, las motoneuronas transducidas con shIKKβ muestran una reducción de la fosforilación de RelA pero un aumento de los niveles de la proteína CREB. La transducción de las MN con el shCREB disminuyó los niveles de la proteína SMN apoyando el papel regulador de CREB sobre SMN.