[en] Oxidative stress is present in many diseases and it is produced in cells when an imbalance between oxidants and antioxidants occurs, favoring an oxidant status which produce reactive oxygen and nitrogen species. Lipids in plasma membrane are one of the preferential targets giving rise to lipid peroxidation. This process modifies membrane properties such as membrane fluidity, a very important physical feature known to modulate membrane protein localization and receptor-ligand binding. Aims: 1) To evaluate the effect of oxidative stress on plasma membrane fluidity regionalization of single living THP-1 macrophages and MEC-1 lymphocytes. 2) To analyze, in these cells, the relationship between lipid peroxidation and membrane fluidity. 3) To study the effect of oxidative stress on receptor-ligand binding and membrane fluidity: lipopolysaccharide/toll-like receptors (TLR2/4) in macrophages and progesterone-induced blocking factor (PIBF)/PIBF-receptor in lymphocytes. Material and Methods: Two-photon microscopy was standardized for the first time in Universidad Autónoma de Barcelona by our laboratory, to analyze membrane fluidity in single living cells. It was also developed a new software application to analyze membrane lipid domain size and number. Cellular oxidative stress was induced by H2O2; the fluorescent probe Laurdan was applied to evaluate plasma membrane fluidity changes. LPS in macrophages or soluble PIBF in lymphocytes were used to analyze receptor-ligand interactions under oxidative stress. Results: Macrophages showed a significant H2O2 concentration dependent increase in the frequency of rigid lipid regions, mainly attributable to lipid rafts, at the expense of the intermediate fluidity regions. Under oxidative stress conditions, an increase in number, but not in size, of lipid raft domains was detected. Macrophage activation by LPS increase the frequency of fluid regions, which was inhibited by oxidative stress. Concerning macrophage function, secretion of TNFα under oxidative conditions was decreased. Lymphocytes showed a significant increase in the frequency of rigid lipid regions, at the expense of fluid regions, under oxidative stress conditions. Upon PIBF binding to its receptor, lymphocyte plasma membrane became more rigid due to clustering of lipid rafts. However, when PIBF bound lymphocytes were placed in oxidizing conditions, lipid raft clustering was inhibited and PIBF binding to its receptor was also decreased. Conclusions: 1) In single living cells plasma membrane lipid dynamics was evaluated. 2) An important general consequence of oxidative stress is that both in macrophages and lymphocytes plasma membrane becomes more rigid. 3) Receptor-ligand interactions have an effect on membrane fluidity, which vary greatly between the two cell types studied: macrophages and lymphocytes. Upon receptor-ligand binding, macrophage plasma membrane became more fluid while lymphocytes plasma membrane became more rigid. Our results suggest that lipid raft clustering is linked to cell function: upon PIBF binding to its receptor lipid raft clustering occurs in lymphocytes; however, upon LPS/TLR2/4 lipid raft clustering does not occur in macrophages. 4) Nevertheless, the effect induced by receptor-ligand binding on membrane fluidity was inhibited during oxidative stress in both cases.

[es] El estrés oxidativo (OS) es característico de muchas enfermedades y se produce cuando hay un desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes, lo cual favorece un estado oxidativo que genera especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno. Los lípidos de la membrana plasmática son dianas preferentes del OS y ello tiene como consecuencia la peroxidación lipídica. Este proceso modifica propiedades de la membrana tales como su fluidez, característica física muy importante conocida por modular la localización de las proteínas de membrana y las uniones receptor-ligando. Objetivos: 1) Evaluar el efecto del OS en la regionalización de la fluidez en la membrana plasmática de células vivas tales como macrófagos THP-1 y linfocitos MEC-1, de manera individualizada. 2) Analizar, en estas células, la relación entre la peroxidación lipídica y la fluidez de membrana. 3) Estudiar el efecto del OS sobre la unión receptor-ligando y sobre la fluidez de membrana: lipopolisacárido/receptores de tipo Toll (TLR2/4) en macrófagos y progesterone-induced blocking factor (PIBF)/PIBF-receptor en linfocitos. Material y Métodos: Se estandarizó la metodología two-photon microscopy por primera vez en la Universidad Autónoma de Barcelona, para analizar la fluidez de membrana en células vivas individuales. Conjuntamente se ha desarrollado un nuevo software capaz de medir el tamaño y el número de los dominios lipídicos de membrana. El OS se indujo mediante H2O2 y se empleó la sonda fluorescente Laurdan para detectar las diferencias de fluidez en la membrana plasmática. Se utilizaron LPS y PIBF soluble en macrófagos y linfocitos respectivamente, para analizar interacciones receptor-ligando en condiciones OS. Resultados: En los macrófagos se observó un aumento significativo, dependiente de la concentración de H2O2, en la frecuencia de regiones lipídicas rígidas principalmente compuestas por dominios lipid raft, a expensas de las regiones de fluidez intermedia. Asimismo, se detectó en condiciones de OS, un mayor número, aunque no un mayor tamaño, de dominios lipid raft. La activación de macrófagos con LPS incrementó la frecuencia de regiones fluidas en las membranas, efecto que fue inhibido en condiciones de OS. En cuanto a la función de los macrófagos, se detectó una disminución en la secreción de TNFα en condiciones oxidantes. En los linfocitos se observó un aumentó significativo en la frecuencia de regiones lipídicas rígidas, a expensas de las regiones fluidas, en condiciones de OS. Por otro lado, la unión del PIBF a su receptor, provocó un aumentó en la rigidez de la membrana plasmática debido al clustering de dominios lipid raft. Por el contrario, cuando se indujo OS en linfocitos en presencia de PIBF, se inhibió el clustering de dominios lipid raft y también disminuyó el reconocimiento del receptor de PIBF a su ligando. Conclusiones: 1) Se ha evaluado en células vivas, de forma individual, la dinámica lipídica de la membrana plasmática. 2) Una consecuencia general importante es que, durante el OS, tanto en macrófagos como en linfocitos la membrana plasmática se vuelve más rígida. 3) La fluidez de membrana cambia de forma distinta en los dos tipos celulares estudiados, como consecuencia de las interacciones receptor-ligando: durante la unión LPS-TLR2/4 se observó un aumento en la fluidez de la membrana plasmática de los macrófagos y, por el contrario, durante la unión PIBF/PIBF-R la membrana de los linfocitos se rigidificó, aumentando el clustering de los dominios lipid raft. 4) No obstante, en ambos casos el OS inhibió los cambios en la fluidez de membrana inducidos por la unión receptor-ligando.