[en] Porcine epidemic diarrhea (PED) virus (PEDV) causes a major swine gastrointestinal disease globally. Current outbreaks have been attributed to emerging viral strains that originated after 2010 through genetic recombination. Among these, non-S INDEL strains are associated with most severe clinical cases, while S INDEL strains result in milder disease outcomes. Nevertheless, both strains exhibit reduced virulence after multiple cell passages, driven by poorly understood mechanisms. This PhD thesis investigated whether PEDV virulence loss correlates with genomic alterations from repeated cell passages. Study I examined genome mutations alongside clinical, pathological, and virological profiles of wild-type and cell-adapted S INDEL and non-S INDEL strains in newborn piglets. Results confirmed that virulence decreases with an increasing number of cell passages. Additionally, cell-adapted PEDV strain prevented intestinal damage and the disease onset in suckling piglets. In contrast, comparative analysis of non-S INDEL and S INDEL strains revealed that the severity of the disease correlated with the extent of intestinal damage, which was more pronounced in suckling piglets inoculated with non-S INDEL strains, suggesting strain-dependent clinical outcomes. Furthermore, specific mutations in the genomic regions of non-structural proteins (nsp)-2, 3, 4, 12, and 15, as well as the N-terminal domain (NTD) of the S1 domain, HR1 and HR2 of the S2 domain, open reading frame (ORF) 3, and N, were identified in cell-adapted S INDEL strain and may have contributed to the lesser virulence. In conclusion, genomic differences between both strains might have accounted for strain-dependent clinical outcomes. Piglet age also influences PEDV severity, with newborn piglets exhibiting the most severe clinical signs, while older piglets remain asymptomatic. This age-dependent difference may be attributed to variations in intestinal development and innate immune responses of the intestinal mucosa. Study II explored these differences by characterizing intestinal expression of type I and III interferons (IFNs) and pro-inflammatory cytokines in suckling and weaned piglets inoculated with S INDEL and non-S INDEL strains. Both strains caused comparable intestinal atrophy, viral replication, and fecal viral loads in all piglets. However, weaned piglets mounted a stronger antiviral response, including enhanced expression of type I and III IFNs, Th1- and Th17-related pro-inflammatory cytokines, and widespread upregulation of IFN-stimulated genes (ISGs) in the intestinal mucosa. In contrast, suckling piglets showed weaker innate immune responses, correlating with more severe clinical signs. These findings suggest that IFNs, ISGs, and pro-inflammatory cytokines play a role in mitigating PEDV severity. PEDV primarily targets enterocytes in the small intestine, but emerging evidence suggests potential involvement of other cells, such as alveolar macrophages and nasal epithelial cells, indicating potential pulmonary replication. Although the role of these cells in the pathogenesis of the disease remains unclear, it has been suggested that the spike (S) protein might facilitate the adaptation of PEDV to other cells and influence shifts in viral tropism. In study II, both PEDV strains were also inoculated via the intranasal route in suckling and weaned piglets to explore this possible alternative transmission pathway. Although viral RNA was detected in the nasal turbinate and lungs of some animals (Study II), no respiratory disease or further digestive complications were observed. Study III, analyzed in vitro different macrophagic cell lines, such as porcine alveolar macrophages (PAMs), 3D4/21, and nasal epithelial cells, and revealed PEDV internalization but no evidence of active viral replication or activation of inflammatory or antiviral responses. These findings suggest that, while alternative cell types may internalize PEDV, their role in pathogenesis is limited. However, genomic variations in domains such as the receptor-binding domain (RBD), S1/S2 cleavage site, fusion peptide (FP), heptad repeated (HR)1, and HR2 suggest that the S protein may be involved in PEDV tropism and its potential pulmonary invasion.

[es] El virus PEDV es un importante patógeno gastrointestinal a nivel mundial. Los brotes recientes se asocian a cepas emergentes del 2010 debido a recombinación genética. Mientras que las cepas no-S INDEL se asocian con cuadros clínicos más graves, las cepas S INDEL generan brotes más leves. Sin embargo, ambas cepas pierden virulencia tras múltiples pases celulares, un proceso impulsado por mecanismos moleculares aún desconocidos. La pérdida de virulencia de PEDV podría estar relacionada con alteraciones genómicas adquiridas durante varios pases celulares, por lo que en el Estudio I se correlacionó las mutaciones en el genoma de ambas cepas con los perfiles clínicos, patológicos y virológicos observados en lechones recién nacidos. Los resultados mostraron que la virulencia disminuye conforme aumentan los pases celulares. Además, la cepa adaptada a células previno el daño intestinal y la aparición de la enfermedad en lechones lactantes. Por otro lado, los lechones inoculados con no-S INDEL presentaron un daño intestinal más severo, lo que confirma que la gravedad de la enfermedad depende de la cepa. Se identificaron mutaciones específicas en las regiones genómicas de las nsp-2, 3, 4, 12 y 15, así como el NTD del dominio S1, HR1 y HR2 del dominio S2, ORF3 y N de la cepa S INDEL adaptada a células, lo que podría haber contribuido a la menor virulencia. Las diferencias genómicas observadas entre las cepas no-S INDEL y S INDEL podrían explicar los resultados clínicos dependientes de la cepa. La edad de los lechones también influye en la gravedad de los brotes. Si bien los lechones recién nacidos son más vulnerables, los lechones mayores permanecen asintomáticos. Esta diferencia podría deberse a variaciones en el desarrollo intestinal y en la respuesta inmune innata de la mucosa intestinal. En el Estudio II se caracterizó la expresión intestinal de interferones (IFN) de tipo I y III, y citocinas proinflamatorias en relación con la progresión de la enfermedad en lechones lactantes y destetados inoculados con cepas S INDEL y no-S INDEL. Ambas cepas causaron atrofia intestinal, replicación y cargas virales fecales similares en todos los lechones. Sin embargo, los lechones destetados desarrollaron una respuesta antiviral más robusta, con mayor expresión de IFN tipo I y III, citocinas proinflamatorias relacionadas con Th1 y Th17, y ISGs en la mucosa intestinal. Por el contrario, los lechones lactantes mostraron respuestas inmunitarias innatas más débiles, lo que se asoció con síntomas clínicos más graves. Esto sugiere que los IFNs, ISGs y las citocinas proinflamatorias son clave para mitigar la gravedad del PEDV. Aunque PEDV infecta principalmente enterocitos del intestino delgado, otras células, como macrófagos alveolares y células epiteliales nasales, podrían estar involucradas en una posible replicación pulmonar. El papel de estas células en la patogénesis sigue sin esclarecerse, pero se ha planteado que la proteína S podría facilitar la adaptación viral a diferentes células e influir en el tropismo viral. En el Estudio II, se inocularon ambas cepas de PEDV por vía intranasal en lechones lactantes y destetados para evaluar esta posible vía alternativa de transmisión. Aunque se detectó ARN viral en cornetes nasales y pulmones (Estudio II), no se observaron signos de enfermedad respiratoria ni complicaciones digestivas adicionales. En el Estudio III, se analizó la susceptibilidad de macrófagos alveolares porcinos, células 3D4/21 y epiteliales nasales a PEDV. Si bien se detectó internalización viral en estas células, no se observó replicación activa ni activación de respuestas inflamatorias o antivirales, por lo que su función sigue siendo desconocida. Sin embargo, variaciones en dominios como el RBD, S1/S2, FP, HR1 y HR2, sugieren que la proteína S podría estar involucrada en el tropismo del PEDV y en su potencial invasión pulmonar.