[en] The glucoamylases (GAs) are important enzymes in the biotechnological industry. They are widely used for processing starch to simple sugars and ethanol. Saccharomyces cerevisiae (var diastaticus) carries genes designated STA that encode secreted glucoamylase (Yamashita et al., 1987). These enzymes present an atypical structure with two well defined parts, an amino-terminal domain, rich in residues of serine and threonine and a carboxy-terminal domain that contains catalytic domain. These enzymes in yeast lack a starch binding domain (SBD) present in others fungi glucoamylases that represent an important shortcoming for the digestion of insoluble starch. In this doctoral thesis we have studied the structural and functional properties of the Saccharomyces STA1- encoded glucoamylase. Furthermore we have modificated the enzyme using directed evolution to obtain mutant variants with improved properties. The improvement of activity opens interesting possibilities for the development of new fermentatives procedures that would allow the direct transformation of starch in ethanol. We have obtained S. cerevisiae strains, of laboratory and industrial origin, capable of overproducing this enzyme. The improvement of the production has allowed the biochemical characterisation of the enzyme, focusing on the study of the properties derivated from the extreme glycosilation that the protein presents. On the other hand, S. cerevisiae GA has been characterized structurally, obtaining and analyzing three-dimensional models of the enzyme domains. This model allowed the construccion and analysis of an engineered version of S. cerevisiae GA, which contains the starch binding domain from Aspergillus niger. The resulting hybrid enzyme has substrate binding capability and hydrolyses insoluble starch. Last but not least, we have improved the catalytic efficiency of the enzyme using random mutagenesis and recombination in yeast. Thus, we have obtained a yeast strain that secretes a more effective enzymatic variant.

[es] RESUMEN La glucoamilasa (GA) es uno de los enzimas producidos en mayor cantidad por la industria biotecnológica. Se emplea en el procesado del almidón degradándolo y liberando residuos de glucosa al medio. Saccharomyces cerevisiae (var. diastaticus) posee genes denominados STA que codifican GAs (Yamashita et al 1987). Este enzima presenta una estructura atípica ya que posee un dominio N-terminal, rico en residuos de serina y treonina (STRD o Ser and Thr rich-domain) ausente en las otras GAs fúngicas y carece de un dominio de unión al almidón o (SBD o "Starch Binding domain) presente en la mayoría enzimas. La ausencia de este dominio hace que la GA de S. cerevisiae sea ineficaz en la degradación de almidón insoluble, necesaria para el procesado de las formas de almidón utilizadas en la industria. La presente tesis doctoral tiene como objetivo el estudio de las propiedades estructurales y funcionales de la glucoamilasa codificada por el gen STA1 de Saccharomyces cerevisiae así como la modificación del enzima, utilizando técnicas de ingeniería de proteínas, para obtener variantes con propiedades mejoradas y con mayor eficiencia catalítica. La mejora de sus propiedades abre interesantes posibilidades en el desarrollo de nuevos procedimientos fermentativos que permitirían la transformación directa de almidón en etanol. Se han obtenido estirpes de S. cerevisiae, de laboratorio y de origen industrial, capaces de sobreproducir el enzima ya que la levadura produce glucoamilasa en baja proporción. La mejora en la producción ha permitido la caracterización bioquímica del enzima, en concreto, se han analizado sus propiedades fisico-químicas y catalíticas. Especialmente se han estudiado las propiedades derivadas de la extrema glicosilación que presenta esta proteína. Por otro lado, se ha caracterizado estructuralmente la GA de S. cerevisiae obteniendo y analizando modelos tridimensionales de los dominios que conforman el enzima. En base a los estudios de los modelos obtenidos se ha construido un enzima híbrido, por adición de un dominio SBD, para conferir al enzima de mayor afinidad por el substrato y en consecuencia mayor capacidad catalítica. Por último se han mejorado las propiedades intrínsecas del enzima, mediante técnicas de mutagénesis aleatoria obteniendo una estirpe de levadura que secreta una variante enzimática más eficaz. __________________________________________________________________________________________________