[es] La olomoucina y la roscovitina son dos inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) cuyo mecanismo de acción es competir con el ATP por la unión a la enzima. Presentan una alta selectividad "in vitro"ante la CDK1, 2, 5, 7, 9 y las ERKs. Este perfil inhibidor les confiere amplias perspectivas en la terapia antitumoral. En este trabajo, hemos mostrado que la línea de las SH-SY5Y, derivada de neuroblastoma, y la de las HL-60, derivada de una leucemia promielocítica, morían apoptoticamente en respuesta a ambos fármacos. Una caracterización más amplia del proceso apoptótico, evidenció que la expresión forzada de Bcl-2 o de Bcl-XL no conferían resistencia ante ninguna de nuestras drogas. En cambio, sí se hacían parcialmente más resistentes cuando eran tratadas con un inhibidor general de las caspasas (z-VAD-fmk). En consecuencia, nuestra hipótesis fue que nos hallábamos ante una apoptosis por vía extrínseca iniciada por la caspasa 8 (CASP8) y/o la caspasa 10 (CASP10). Curiosamente, dichas caspasas no se expresan en las SH-SY5Y debido a un proceso de metilación génica, y pudimos ver que el tratamiento tampoco inducía su reexpresión. En conclusión, descartamos que las SH-SY5Y iniciasen una vía extrínseca canónica en respuesta a nuestras drogas. Por otro lado, la inhibición de la síntesis proteica en nuestro modelo frenaba la apoptosis. Es más, el z-VAD-fmk junto con, por ejemplo, la cicloheximida, presentaban un sinergismo en el rescate. Esto sugería la coexistencia en nuestro cultivo de distintas subpoblaciones capaces de iniciar diferentes vías apoptóticas. El tratamiento con PD98059 o UO126, dos inhibidores de la via de Erk1/2, se mostró inocuo a la hora de inducir muerte, por lo cual descartamos que la inhibición de Erk1/2 fuera la responsable de la apoptosis. Sorprendentemente, el estudio del estado de fosforilación de Erk1/2, nos permitió constatar que éstas se activaban en respuesta a la olomoucina y la roscovitina. Más sorprende aún, resultó el hecho que la iso-olomoucina, un isómero inactivo de la olomoucina, causara los mismos efectos sobre Erk1/2. Esto nos permitió afirmar que no existía correlación entre la fosforilación de Erk1/2 y la inhibición de las CDKs. En base principalmente a los resultados de la iso-olomoucina, pudimos afirmar que la fosforilación de las ERKs y su subsiguiente activación, no se correlacionaban con la apoptosis, proliferación y diferenciación celular. Finalmente, evidenciamos que las SH-SY5Y diferenciadas se volvían resistentes a la olomoucina y a la roscovitina, hecho a favor de que la inhibición de las CDKs fuera el evento iniciador de la cascada apoptótica. Alternativamente, la olomoucina y la roscovitina están siendo cada vez más estudiadas en el contexto de la terapia combinatoria frente al cáncer. En nuestros experimentos, utilizamos también la R-roscovitina, uno de los dos estereoisómeros de la roscovitina. En su combinación con el docetaxel (DTX), no observamos sinergismo. El caso contrario sucedi´o cuando fue administrada junto a la nutlina-3, un nuevo y prometedor inductor de p53. Vimos como la R-roscovitina sensibilizaba las SH-SY5Y a la apoptosis inducida por la nutlina-3.

[fr] Lólomoucine et la roscovitine sont deux inhibiteurs des kinases d´ependantes de cyclines (CDKs) qui agissent par inhibition competitive via le site d'union de l'ATP. Son profil inhibiteur est tr-es prometteur dans le traitement du cancer. Présentent une grande spécificité "in vitro"face aux CDK1, 2, 5, 7, 9 e aux ERKs. Dans ce travail, nous avons d´emontré que la lignée neuroblastique SH-SY5Y et la promyélocitique HL-60, mouraient apoptotiquement en réponse àces drogues. Une plus large caractérisation de l'apoptose dans les SH-SY5Y a mis enévidence que la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-XL ne se traduisait par une augmentation de la résistance au traitement. Cependant, le traitement avec un inhibiteur général des caspases (z-VAD-fmk) présentaient des effets protecteurs partiels. Au vu de ces résultats, notre hypothèse reposait sur límplication d'une voie extrinsèque d'apoptose qui d´ependait de l'activation de la caspase 8 (CASP8) ou de la caspase 10 (CASP10). Néanmoins, la m´ethylation des gènes des CASP8 et 10 dans les SH-SY5Y empèche l'expression de ces protéines et, plus encore, l'olomoucine et la roscovitine nínduiraient pas la réexpression de ces caspases. En conclusion, l'apoptose par une voie extrinsèque classique pouvait ètreécartée dans notre paradigme expérimental. D'un autre coté, les inhibiteurs de la synthèse des protéines protégeaient les SH-SY5Y de l'apoptose. De manière surprenante, on avait observé l'existence de synergie dans la protection avec z-VAD-fmk et, par exemple, le cycloheximide. Ce fait suggérait la présence de différents sous-poupulations cellulaires dans les SH-SY5Y qui engageaient des voies apoptotiques distinctes. Le manque d'effets toxiques du PD98059 or UO126, deux inhibiteurs de la voie d'Erk1/2, avait écarté l'inhibition de Erk1/Erk2 comme la responsable de l'apoptose. Plus encore, l'olomoucine et la roscovitine induisaient la phosphorylation et subséquente activation d'Erk1/Erk2. De manière surprenante, l'iso-olomoucine, un isomère inactif de l'olomoucine, induisait aussi la phosphorylation et l'activation dans notre modèle cellulaire. Sur base de ces résultats, nous avons conclu que la phosphorylation d'Erk1/Erk2 et son activation, n'avait pas un corr´elat avec l'apoptose, la prolifération et la différentiation cellulaire. Finalement, nous avons mis en évidence que les SH-SY5Y différentiées devenaient résistantes à l'olomoucine ou à la roscovitine. Ce fait suggérait que l'inhibition des CDKs avait un role dans le d´eclenchement de l'apoptose. Alternativement, l'olomoucine et la roscovitine sont de plus en plus étudiées dans le contexte de la th´erapie combinatoire face au cancer. J'ai utilisé la R-roscovitine dans nos expériences, l'un des deux stéréoisomères de la roscovitine. La combinaison avec le docétaxel (DTX) n'avait pas des effets l´etaux synergiques, en revanche la R-roscovitine sensibilisait les SH-SY5Y à lápoptose par la nutline-3, un nouvel agent inducteur de la voie p53.