[en] The spontaneous alcoholic fermentation of wine is a microbial process resulting from the sequential action of different non-Saccharomyces and Saccharomyces yeasts. The use of selected cultures of S. cerevisiae in fermentations is a widespread practice in the oenological industry that has contributed to better control of vinifications, but also to a simplification of the microbial communities that participate in fermentations, leading to a loss of complexity and certain standardization of the wines. To avoid the homogeneity of the wines inoculated with commercial strains of S. cerevisiae, the use of selected non-Saccharomyces yeasts in sequential fermentations with S. cerevisiae has been proposed. This practice allows obtaining some of the advantages of spontaneous fermentations such as greater organoleptic complexity, but with greater control of the process. The aim of this work was to select non-Saccharomyces yeast strains for its use as inoculums in the production of quality red wines. The study began with 103 isolates from different oenological ecosystems of the D.O.Ca. Rioja. In an initial stage, the clonal characterization and the study of the SO2 resistance of the strains was carried out, as well as the killer activity and possible interactions with other yeasts present in vinifications, such as S. cerevisiae and B. bruxellensis. The next step was the characterization of the strains based on their ability to produce enzymes of oenological interest. 13 enzymatic activities related to the aroma and colour and clarification of the wines were evaluated. The results showed high intraspecific variability, which highlighted the importance of selection at clonal level. In the next stage of the selection process, the oenological behaviour and the production of aromatic compounds of the strains in pure fermentations were studied. Significant differences were detected in the parameters analysed between the different non-Saccharomyces yeast species studied. In the case of the strains belonging to the same species, differences were found in a smaller number of parameters. However, among them were included parameters with a great impact on the quality of the wine, such as volatile acidity. The results also showed that none of the studied strains was able to complete the fermentation, which indicated that their use in winemaking required sequential inoculation with S. cerevisiae. For this reason, the following tests evaluated the characteristics of the strains in sequential inoculations with S. cerevisiae. Moreover, it was detected that two of the L. thermotolerans strains grew together with T. delbrueckii, so it was decided to include this combination as a mixed inoculum in the following assays. In the next stage of the process, the evolution of the aromatic composition was evaluated, as well as the effect on the composition of anthocyanins and stilbenes of the wines sequentially fermented with non-Saccharomyces/S. cerevisiae. The implantation controls of the inoculated non-Saccharomyces yeasts showed that T. delbrueckii and L. thermotolerans strains and the mixed inocula constituted by those same species remained for a longer time in the medium. In addition, it was observed that the mixed inocula maintained the initial proportions during the first days of fermentation. At the end of the fermentation, only the wines inoculated with T. delbrueckii and L. thermotolerans, yeasts that remained the longest in the medium, differed from the others due to their aromatic profile. Regarding the analyses related to colour, the results showed that the wines fermented sequentially with M. pulcherrima, T. delbrueckii, Z. bailii and C. zeylanoides presented higher levels of total anthocyanins and higher values of the total polyphenol index. (TPI) with respect to those found in wines made only with S. cerevisiae. In the last stage of the selection process, the oenological behaviour of the selected yeasts was evaluated in wines of three grape varieties: Tempranillo, Grenache and Graciano. Most of the differences due to the inoculation strategy were detected in Tempranillo variety. The changes produced in the characteristics of the wine could be due to the greater implantation and permanence of the inocula during the fermentation in this variety. The non-Saccharomyces strains used in the inocula had been originally isolated in Tempranillo, which explains their pre-adaptation to the must characteristics. Throughout the selection process, the inoculum formed by T. delbrueckii and L. thermotolerans had shown a greater capacity to implant in the medium during fermentation, remaining for a longer time in the tanks. On the other hand, the combination of the characteristics of the two strains that constitute the inoculum allowed the release of compounds of interest for the quality of wine such as ethyl lactate, glycerol or lactic acid. Likewise, the wines made with this combination of yeasts showed higher contents of vitisin B, relevant for color stability.This inoculum also showed interesting enzymatic activities to improve the colour and aroma of wine. Considering its positive characteristics for the quality of the wines, and since there is no inoculum composed of these non-Saccharomyces yeast species on the market, the mixed inoculum of T. delbrueckii and L. thermotolerans could have the potential to be commercialized, which is why it is the one that has finally been selected in this study.

[es] La fermentación alcohólica espontánea del vino es un proceso microbiano resultante de la acción secuencial de diferentes levaduras no-Saccharomyces y Saccharomyces. El uso de cultivos seleccionados de Saccharomyces (S.) cerevisiae en las fermentaciones es una práctica extendida en la industria enológica que ha contribuido a un mejor control de la vinificación, pero también a una simplificación de las comunidades microbianas que participan en las fermentaciones, dando lugar a una pérdida de complejidad y cierta estandarización de los vinos. Para evitar la homogeneidad de los vinos inoculados con cepas comerciales de S. cerevisiae, se ha propuesto el empleo de levaduras no-Saccharomyces seleccionadas en fermentaciones secuenciales con S. cerevisiae. Esta práctica permite obtener algunas de las ventajas de las fermentaciones espontáneas como una mayor complejidad organoléptica, pero con un mayor control del proceso. El objetivo de este trabajo fue seleccionar cepas de levaduras no-Saccharomyces para su empleo como inóculos en la elaboración de vinos tintos de calidad. El estudio comenzó con 103 aislados procedentes de diferentes ecosistemas enológicos de la Denominación de Origen Calificada (D.O.Ca.) Rioja. En una etapa inicial se llevó a cabo la caracterización clonal y el estudio de la resistencia al SO2 de las cepas, así como la actividad killer y las posibles interacciones con otras levaduras presentes en las vinificaciones, como S. cerevisiae y Brettanomyces (B.) bruxellensis. El siguiente paso fue la caracterización de las cepas en base a su capacidad para producir enzimas de interés enológico. Se evaluaron 13 actividades enzimáticas relacionadas con el aroma, el color y la clarificación de los vinos. Los resultados mostraron una gran variabilidad intraespecífica, lo que puso de manifiesto la importancia de la selección a nivel clonal. En la siguiente etapa del proceso de selección se estudió el comportamiento enológico y la producción de compuestos aromáticos de las cepas en fermentaciones puras. Se detectaron diferencias significativas en los parámetros analizados entre las distintas especies de levaduras no-Saccharomyces estudiadas, mientras que en el caso de las cepas pertenecientes a la misma especie se encontraron diferencias en un menor número de parámetros. Sin embargo, entre ellos se encontraban algunos con gran impacto en la calidad del vino, como la acidez volátil. Los resultados también mostraron que ninguna de las cepas estudiadas fue capaz de completar la fermentación, lo que indicó que su empleo en vinificación requería la inoculación secuencial con S. cerevisiae. Por esta razón, en los siguientes ensayos se evaluaron las características de las cepas en inoculaciones secuenciales con S. cerevisiae. Además, se detectó que dos de las cepas de Lachancea (L.) thermotolerans crecían junto con Torulaspora (T.) delbrueckii, por lo que se decidió incluir esta combinación como inóculo mixto en los siguientes ensayos. El proceso de selección continuó con el estudio de la evolución de la composición aromática durante la fermentación alcohólica, así como el efecto en la composición de antocianos y estilbenos de los vinos elaborados con inoculaciones secuenciales no-Saccharomyces/S. cerevisiae. Los controles de implantación de las levaduras no-Saccharomyces inoculadas mostraron que las cepas de T. delbrueckii y L. thermotolerans y los inóculos mixtos constituidos por esas mismas especies permanecieron durante más tiempo en el medio, manteniendo la proporción inicial durante los primeros días de la fermentación. Al final de la misma, solo los vinos inoculados con T. delbrueckii y L. thermotolerans se diferenciaron de los demás por su perfil aromático. En cuanto a los análisis relacionados con el color, los resultados mostraron que los vinos fermentados secuencialmente con Metschnikowia (M.) pulcherrima, T. delbrueckii, Zygosaccharomyces (Z.) bailii y Candida (C.) zeylanoides presentaban niveles más elevados de antocianos totales y valores más altos del índice de polifenoles totales (IPT) respecto a los encontrados en los vinos elaborados solo con S. cerevisiae. En la última etapa del proceso de selección se evaluó el comportamiento enológico de las levaduras seleccionadas en vinos de tres variedades de uva: Tempranillo, Garnacha y Graciano. La mayor parte de las diferencias debidas a la estrategia de inoculación se detectaron en la variedad Tempranillo. Los cambios producidos en las características del vino podrían deberse a la mayor implantación y permanencia de los inóculos durante la fermentación en esta variedad. Las cepas de no-Saccharomyces empleadas en los inóculos habían sido originalmente aisladas en Tempranillo, lo que podría explicar su preadaptación a las características del mosto. A lo largo del proceso de selección, el inóculo formado por T. delbrueckii y L. thermotolerans había mostrado una mayor capacidad para implantarse en el medio durante la fermentación, permaneciendo durante un tiempo más prolongado en los depósitos. Por otro lado, la combinación de las características de las dos cepas que forman el inóculo permitió la liberación de compuestos de interés para la calidad del vino como lactato de etilo, glicerol o ácido láctico. Asimismo, los vinos elaborados con esta combinación de levaduras mostraron mayores contenidos de vitisina B, relevante para la estabilidad del color. Este inóculo presentaba además actividades enzimáticas interesantes para mejorar el color y el aroma del vino. Considerando sus características positivas para la calidad de los vinos, y dado que no existe en el mercado un inóculo compuesto por estas especies de levaduras no-Saccharomyces, el inóculo mixto de T. delbrueckii y L. thermotolerans podría tener potencial para ser comercializado, por lo que es el que finalmente ha sido seleccionado en este estudio.