[en] Many enzymes and physiological active proteins are synthesized as inactive precursors or zymogens. Their activation by limited proteolysis is a mechanism of enzymatic regulation. In the present work, it has been studied the fragment released in the proteolytic activation of a porcine pancreatic zymogen, monomeric procarboxypeptidase A (PCPA). Its structural characterization was carried out studying the segment isolated and linked to the active enzyme forming the zymogen in order to test whether its conformation was the same in both cases. The results showed that, once released from the zymogene, the activation segment of PCPA presented a different conformation with a high conformational flexibility. The isolated activation segment showed a significant thermostability, higher than that presented by the proenzyme. Its thermal unfolding was completely reversible and it was observed that the protein was composed by single domain. NMR studies indicated that this segment is a globular protein, which structure is maintained in wide range of pH values, and confirmed its high degree of conformational flexibility. The activation segment of PCPA showed a significant degree of sequence homology with members of the EF-hand calcium binding protein family, with two potential sites for metal binding. Theoretical studies on the secondary structure prediction confirmed the presence of these two regions on its structure. To test whether this segment belonged to the above mentioned protein family, its ability to bind calcium was experimentally tested. The results showed a weak binding of this metal. Thus, it was not possible to consider this protein as a member of the EF-hand calcium binding protein family. Nevertheless, its structure was indeed related to this family of proteins because it was observed that the segment presented a set of characteristics typical of members of this family. It presented ability to bind Tb3+, a metal that can substitute Ca2+, and when its interaction with the dye Stains-all was tested, a similar behaviour to that presented by calmodulin, a protein that belongs to the calcium binding EF-hand protein family, was observed. In a whole the results allowed to conclude that the activation segment of monomeric porcine PCPA is structurally related to the members of the calcium binding EF-hand protein family. This finding is very interesting taking into account the length of this segment (94 residues. A possible evolutive origin can be envisaged. It is not easy to understand that such a long segment has as a unique function to act as inhibitor of an enzyme.

[es] Muchos enzimas y proteínas fisiológicamente activas se sintetizan en forma de precursores inactivos o zimógenos. Su activación por proteólisis limitada es un mecanismo de regulación enzimática. En este trabajo se ha estudiado el fragmento liberado en la activación proteolítica de un proenzima pancreático, la procarboxipeptidasa A (PCPA) monomérica de páncreas porcino. La caracterización estructural de este segmento se llevó a cabo estudiándolo aislado y unido al enzima activo con la finalidad de discernir si la conformación que presenta es la misma en los dos casos. Los resultados indicaron que, un una vez liberado del enzima, el segmento de activación de la PCPA presenta una conformación diferente con un elevado grado de flexibilidad conformacional. El segmento de activación aislado presentó una elevada termoestabilidad, muy superior a la del proenzima, siendo su proceso de desnaturalización reversible y presentando un único dominio estructural. Estudios de resonancia magnética nuclear indicaron que este segmento presenta una estructura globular, la cual se mantiene en un amplio margen de valores de pH, y confirmaron la elevada flexibilidad conformacional. La estructura primaria del segmento de activación de la PCPA presentó una similitud importante con secuencias de proteínas fijadores de calcio de la familia EF-hand con dos potenciales regiones fijadores de este metal. Estudios teóricos de predicción de su estructura secundaria corroboraron la presencia de estas dos regiones. Con la finalidad de comprobar si este segmento pertenecía a la citada familia de proteínas se comprobó experimentalmente su capacidad para a fijar calcio. Los resultados indicaron una débil unión de este metal, por tanto, no se podía considerar este segmento como un miembro de la familia de proteínas fijadores de calcio del tipo EF-hand. No obstante, sí que su estructura se halla relacionada con esta familia de proteínas ya que se observó que presentaba una serie de características que también se dan en les proteínas de esta familia. Presentó capacidad para fijar Tb3+, metal que puede sustituir al Ca2+ y un comportamiento al interaccionar con el colorante Stains-all muy similar al que presenta la calmodulina, una proteína que pertenece a la familia de proteínas fijadoras de calcio tipo EF-hand. Los resultados, permitieron concluir que el segmento de activación de la PCPA de páncreas porcino está estructuralmente relacionado con les proteínas fijadores de calcio de la familia EF-hand. Este aspecto es interesante, teniendo en cuenta la longitud del segmento de activación estudiado (94 aminoácidos), ya que permite hipotetizar un posible origen evolutivo del mismo. No es fácil comprender que un segmento de estas dimensiones pueda tener como única función actuar de inhibidor de un enzima.