[en] Fabry disease is a lysosomal storage disorder (LSD), a rare disease caused by a gene mutation on the X-chromosome, which encodes α-galactosidase A (GLA) enzyme. The GLA hydrolyzes terminal α-D-galactosyl residuals from neutral glycosphingolipids. Thus, the lack of this enzyme causes the accumulation of these molecules, mainly globotriaosylceramide (Gb3), at the lysosomes of some cells. The actual treatment is based in the enzyme replacement therapy (ERT) which consists in the intravenous administration of the deficient enzyme. However, the success is limited due to substantial drawbacks, like the clearance from the blood stream, the degradation by proteases, the low effectiveness when the organs are already damaged and high cost of the therapy, among others. In recent years, nanotechnology has arised as a powerful tool to develop enzyme-loaded nanosystems in order to ameliorate ERT efficacy and minimize its side effects. The objective of these nanomaterials is to increase the bioavailability of the enzyme, avoid its degradation, control the circulation time and release rate. Nanocarriers can be functionalized with targeting units (like RGD peptide) that provide recognition of markers expressed by sick cells, thus assuring the correct distribution of the enzyme. Probably the most widely used for drug delivery purposes are vesicle and polymer based nanocarriers. Indeed, vesicles have served as convenient delivery vehicles for biologically active compounds since they are non-toxic, biodegradable and non-immunogenic. In vesicle-based nanocarriers, such as liposomes, the pharmacological properties strongly depend on the structural characteristics of the conjugates. Consequently, a high degree of structural homogeneity regarding size, morphology and composition is crucial for their optimum performance. DELOS-SUSP (Depressurization of an Expanded Organic Solution-Suspension) methodology developed by Nanomol group enables the production of colloidal suspensions using compressed CO2 as a co-solvent in a one-step process. This technology allows the preparation of small unilamellar vesicles with large structural homogeneity. Moreover, DELOS-SUSP permits the simultaneous encapsulation of different bioactives like RGD peptide and GLA protein in the liposomes. This PhD Thesis has used these liposomes with RGD and GLA to generate a solid proof of concept for the treatment of Fabry disease. Concretely, the first part of this work has been focused in the precise understanding of the supramolecular organization of these liposomes and their ability to degrade Gb3 in in vitro models. In addition, using a new diafiltration and concentration procedure, these liposomes have achieved the required concentration of GLA to successfully perform in vivo assays. An HPLC methodology has been developed to ensure the pharmaceutical quality of the liposomes carriers in terms of chemical composition. This chemical composition has also been optimized with the addition of a small quantity of the MKC surfactant. Another important objective has been to study the impact of RGD functionalization mode of the nanoliposomes in the physicochemical properties and cellular internalization. All the physicochemical characterizations and the in vitro and in vivo assays, performed in this thesis, contributed to demonstrate that GLA loaded liposomes-RGD have an enormous potential to be used as nanomedicine for the treatment of Fabry disease.

[es] La enfermedad de Fabry es un trastorno de almacenamiento lisosomal (LSD), una enfermedad rara causada por una mutación genética en el cromosoma X, que codifica la enzima α-galactosidasa A (GLA). La GLA hidroliza los residuos terminales de α-D-galactosilo a partir de glicosfingolípidos neutros. Por lo tanto, la falta de esta enzima provoca la acumulación de estas moléculas, principalmente globotriaosilceramida (Gb3), en los lisosomas de algunas células. El tratamiento actual se basa en la terapia de reemplazo enzimático (ERT) que consiste en la administración intravenosa de la enzima deficiente. Sin embargo, hay inconvenientes sustanciales, como la eliminación de la enzima del torrente sanguíneo, la degradación por proteasas, la baja efectividad cuando los órganos ya están dañados y el alto costo de la terapia, entre otros. En los últimos años, la nanotecnología se ha convertido en una potente herramienta para desarrollar nanosistemas cargados de enzima para mejorar la eficacia de ERT y minimizar sus efectos secundarios. El objetivo de estos nanomateriales es aumentar la biodisponibilidad de la enzima, evitar su degradación, controlar el tiempo de circulación y la velocidad de liberación. Estos vehículos pueden funcionalizarse con unidades (como el péptido RGD) que facilitan su reconocimiento por los marcadores expresados en las células enfermas, asegurando así la distribución correcta de la enzima. Probablemente, los más utilizados para la administración de fármacos son los vehículos basados en vesículas y polímeros. De hecho, las vesículas han servido como vehículos de suministro convenientes para compuestos biológicamente activos, ya que no son tóxicos, son biodegradables y no son inmunogénicos. En estos vehículos basados en vesículas, como los liposomas, las propiedades farmacológicas dependen en gran medida de las características estructurales de los conjugados. En consecuencia, un alto grado de homogeneidad estructural con respecto al tamaño, la morfología y la composición es crucial para su rendimiento óptimo. La metodología DELOS-SUSP (Despresurización de una solución-suspensión orgánica expandida) desarrollada por el grupo Nanomol permite la producción de suspensiones coloidales utilizando CO2 comprimido como codisolvente en un proceso de un solo paso. Esta tecnología permite la preparación de pequeñas vesículas unilamelares con gran homogeneidad estructural. Además, DELOS-SUSP permite la encapsulación simultánea de diferentes bioactivos como el péptido RGD y la proteína GLA en los liposomas. Esta tesis doctoral ha utilizado estos liposomas con RGD y GLA para generar una prueba de concepto sólida para el tratamiento de la enfermedad de Fabry. Concretamente, la primera parte de este trabajo se ha centrado en la comprensión de la organización supramolecular de estos liposomas y su capacidad para degradar Gb3 en modelos in vitro. Además, utilizando un nuevo procedimiento de diafiltración y concentración, estos liposomas han alcanzado la concentración requerida de GLA para realizar con éxito ensayos in vivo. Se ha desarrollado una metodología de HPLC para garantizar la calidad farmacéutica de los liposomas en términos de composición química. Esta composición química también se ha optimizado con la adición de una pequeña cantidad del surfactante MKC. Otro objetivo importante ha sido estudiar el impacto del modo de funcionalización RGD de los nanoliposomas en las propiedades fisicoquímicas y la internalización celular. Todas las caracterizaciones fisicoquímicas y los ensayos in vitro e in vivo, realizados en esta tesis, contribuyeron a demostrar que los liposomas-RGD cargados con GLA tienen un enorme potencial para ser utilizados como nanomedicina para el tratamiento de la enfermedad de Fabry.