[en] Microalgae are a group of photosynthetic microorganisms with high attractiveness due its simple structure and unicellular nature, which facilitates its cultivation and genetic manipulation (Chapter 1). Nowadays, there is increasing interest in microalgae as a source of high-value compounds such as vitamins, antioxidants, lipids, proteins, etc. Moreover, the rapid growth rate outdoors makes them good candidates for bulk production of many compounds, including biodiesel, although its commercial applications are still limited. The best strategy to find microalgae well adapted to the local climatological conditions, able to simultaneously grow at high rates and produce different compounds of biotechnological interest is the selection of new autochthon strains. In chapter 2, the isolation and characterization of a new microalgae isolated from the marshlands of Odiel River is described. The new microalga belonging to the genus Picochlorum, is able to grow at a high growth rate and thrive with adverse conditions. The fatty acids profile of this microalga makes it a promising candidate for the production of biodiesel, and its high content in the carotenoids lutein and zeaxanthin indicates that the microalga could also be a good source of natural eye vitamin supplements. However, for an economically feasible biodiesel production based of this microalga, the lipid content should be significantly increased. In chapter 3 we have optimized the cultivation method of this microalga in order to improve the content of neutral lipids. The optimization of the operation mode, the initial nutrient content and the bioreactor diameter allowed increasing four-fold the final biomass of Picochlorum sp HMl. Furthermore, by mixotrophic and nutritional starvation conditions, the neutral lipids synthesis in the microalga was induced. Nitrate and phosphate starvation resulted in an increase of neutral lipids, of about 2.27 and 2-fold, respectively. With a two-step culture method, a lipid values up to 10 times higher than in the control culture could be achieved. The genetic manipulation of microalgae is a promising strategy claimed for many authors as the best approach to obtain production systems of compunds with commercial interest. Despite the biotechnological interest of microalgae, no robust and stable methods for genetic transformation of most microalga] strains exist and most of the work in this field has been carried out with a couple of strains. In Chapter 4 approaches for the genetic transformation of marine microalgae Tetraselmis suecica, Dunaliella salina and the recently identified Picochlorum sp HMl have been established. Transformation conditions for the three strains were optimized using the gene that confers resistance to the antibiotic paromomycin (APHVIII) and the gene that confers resistance to the antibiotic zeocin (BLE), both under the control of different heterologous promoters. Lipid metabolism is a network involving hundreds of proteins and many subcellular compartments, including plastids, endoplasmic reticulum and lipids granules. The acyl-CoA- diacylglycerol acyltransferase (DGAT) plays an important role in the triacylglycerols biosynthesis, being the last enzyme in the biosynthesis pathway. These lipids have a high value due to both their use in human and animal nutrition and as feedstock for the production of third generation biodiésel. In Chapter 5 the gene EpDGATl from the boraginaceae Echium pitardi was overexpressed in the model microalga Chlamydomonas reinhardtii, by transformation with a binary expression vector. Two obtained transformants were selected in which high gene expression was observed and a constitutive neutral lipids accumulation up 30% over that in the control culture. This is the first time that this gene is overexpressed in Chlamydomonas reinhardtii with satisfactory results, opening a promising line of study for the fatty acids biosynthesis pathway in this and other microalgae, as well as a valuable tool for the development of high added value products in microalgae.

[es] Las microalgas son un grupo de microorganismos fotosintéticos con gran atractivo debido su simple estructura y carácter unicelular, lo que facilita su cultivo y manipulación genética (Capítulo 1). En la actualidad, existe un creciente interés en las microalgas como fuente de compuestos de alto valor añadido como son vitaminas, antioxidantes, lípidos, proteínas, etc. Es más, su rápido crecimiento en el exterior las hace candidatas para la producción a granel de muchos compuestos, incluido biodiésel, aunque sus aplicaciones comerciales ene ste sentido son aún limitadas. La mejor estrategia para encontrar microalgas bien adaptadas a las condiciones climatológicas locales, capaces de crecer a altas velocidades y producir al mismo tiempo diferentes compuestos de interés biotecnológico es la selección de nuevas estirpes autóctonas. En el capítulo 2, se describe el aislamiento y caracterización de una nueva estirpe de microalga aislada de las marismas del Río Odiel. La nueva microalga perteneciente al género Picochlorum, es capaz de crecer a una alta tasa de crecimiento y sobrevivir a condiciones adversas. Las características de su perfil lipídico la hace una prometedora candidata para la producción de biodiésel, igual que su alto contenido en los carotenoides luteína y zeaxantina indican que la microalga podría ser una buena fuente natural de suplementos vitamínicos oculares. No obstante, para que una producción de biodiésel basada en el cultivo de esta microalga sea económicamente factible, el contenido en lípidos debe ser significativamente incrementado-. En el capítulo 3 se ha optimizado el método de cultivo de la microalga con el objetivo de mejorar el contenido en lípidos neutros. La optimización del modo de operación, del contenido inicial de nutrientes y del diámetro del bioreactor permitió incrementar hasta cuatro veces la biomasa final alcanzada en cultivos de Picochlorum sp HMÍ. Por otro lado, mediante el cultivo de la microalga en condiciones mixotróficas y carencias nutricionales, se ha inducido la síntesis de lípidos neutros. La carencia de nitrato y fosfato en el medio de cultivo incrementó el contenido en lípidos neutros en 2,27 y 2 veces respectivamente. Con un método de cultivo en dos fases se podría conseguir valores en lípidos hasta 10 veces mayores que en el cultivo control. La manipulación genética de microalgas es una estrategia prometedora aclamada por muchos como la mejor aproximación para obtener sistemas productores de compuestos de interés comercial. A pesar del interés biotecnológico de las microalgas, actualmente no existen métodos estables para la transformación genética de muchas estirpes de estos microorganismos y la mayoría del trabajo realizado en este campo ha sido llevado a cabo con un par de estirpes. En el capítulo 4 se han establecido aproximaciones a sistemas de transformación genética de microalgas marinas. En este trabajo se han utilizado las microalgas Tetraselmis suecica, Dunaliella salina y, la recientemente identificada, Picochlorum sp HMl debido a su potencial biotecnológico en la producción de compuestos de alto valor añadido. Las condiciones de transformación para las tres estirpes fueron optimizadas utilizando el gen que otorga resistencia a paramomicina (APHVII1) y el gen que otorga resistencia a zeocina (BLE), ambos bajo el control de diferentes promotores heterólogos. El metabolismo lipídico es una red en la que están involucrados cientos de proteínas y muchos compartimentos subcelulares, incluyendo a los plastidios, retículo endoplásmico y gránulos lipídicos. La enzima Acil-CoA-diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) juega un importante papel en la biosintesis de triacilglicéridos, siendo la última enzima de su ruta de síntesis. Este tipo de lípidos tiene un alto valor debido tanto a su uso en nutrición animal y humana, como para la producción de biocombustibles de tercera generación. En el capítulo 5 se ha sobreexpresado el gen EpDGATl de la planta borraginácea Echium pitardi, en la microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii, mediante la transformación con un vector binario de expresión. De los transformantes obtenidos, se han seleccionado dos en los que se ha observado alta expresión del gen y una acumulación constitutiva de hasta un 30% más de lípidos neutros que en el cultivo control. Esta es la primera vez que se consigue sobreexpresar este gen en Chlamydomonas reinhardtii con resultados satisfactorios, abriendo una línea prometedora del estudio de la ruta de síntesis de ácidos grasos en esta y en otras microalgas, así como representa una valiosa herramienta para el desarrollo de productos de alto valor añadido de microalgas.