[en] Proteins are involved in a myriad of biological processes such as catalysis, transport, regulation, defense, and providing structure to the cell. Most proteins need to fold into a defined 3D structure to perform such functions. However, this energetically directed process can be kinetically disturbed, resulting in the formation of stable misfolded supramolecular assemblies, including different types of protein aggregates. Protein aggregation stems from the establishment of aberrant intermolecular interactions and has been associated with the onset of several degenerative diseases. In addition, this unwanted reaction limits the development of proteins of biotechnological interest, impacting the production, storage, and commercialization of protein-based drugs. In this regard, strategies aimed to diminish the impact of protein aggregation on therapeutic proteins are pivotal to ensure their correct development as safe and active drugs. In the present doctoral thesis, we demonstrate that a structure-based aggregation predictor, which considers protein stability, successfully assists the redesign of two structurally unrelated proteins, improving their solubility without compromising their active conformation. This approach might replace the expensive trial-and-error assays employed by the pharmaceutical industry, providing an economical alternative for accelerating the development of protein-based drugs. Proteins are widely understood as the building blocks of life and can act as self-assembling entities involved in the creation of different supramolecular structures. Hence, there is an increasing interest in using polypeptides to build up functional and biocompatible nanomaterials; among them, protein inclusion bodies (IBs) have emerged as an attractive architecture. Traditionally considered useless protein deposits formed by misfolded conformations, recent data converge to indicate that IBs act as reservoirs of stable and active protein. These submicrometric particles are produced efficiently and cost-effectively, and are usually sustained by an amyloid-like scaffold where the protein of interest is trapped. Nevertheless, this amyloid conformation necessarily impacts the activity of the protein of interest and can be potentially cytotoxic. To overcome these drawbacks, we aimed at generating novel and improved functional IBs based on the α-helical architecture characteristic of coiled-coils. Using a naturally encoded coiled-coil domain as the scaffolding entity, α-helix-rich and biocompatible functional IBs were obtained in a ready-to-use form. Interestingly, coiled-coil-based IBs present a higher specific activity than their amyloid-like counterparts, since their assembly is guided by native interactions that do not interfere with the folding of the functional moieties. We demonstrate that these coiled-coil-inspired protein nanoparticles can display fluorescent and antibody-capturing activities simultaneously, being biocompatible, stable, and targeting specific antigens when decorated with a single or a combination of antibodies; thus, emerging as a promising technology for biomedical applications. Overall, the work described in the present thesis attempts to provide useful strategies aimed at (I) redesigning therapeutic proteins with enhanced biophysical properties employing in silico tools and (II) developing versatile and tunable multifunctional protein-based nanomaterials sustained by α-helical interactions.

[es] Las proteínas están involucradas en innumerables procesos biológicos como catálisis, transporte, regulación, defensa y estructura celular. Para poder llevar a cabo estas funciones, la gran mayoría de ellas necesitan plegarse en una estructura 3D definida. Sin embargo, este proceso energéticamente favorable puede ser perturbado cinéticamente, dando lugar a la formación de ensamblajes supramoleculares formados por proteínas desplegadas, los agregados proteicos. La agregación de proteínas consiste en el establecimiento de interacciones intermoleculares aberrantes, estando estrechamente relacionada con la aparición de varias enfermedades degenerativas. Además, esta reacción indeseada limita el desarrollo de proteínas con interés biotecnológico, afectando los procesos de producción, almacenamiento y su posterior comercialización. De este modo, las estrategias dirigidas a disminuir el impacto de los procesos de agregación en proteínas terapéuticas son imprescindibles para asegurar el correcto desarrollo de éstas como fármacos seguros y activos. En la presente tesis doctoral, demostramos que un predictor de agregación basado en estructura, y que además tiene en cuenta la estabilidad proteica, asiste de manera exitosa el rediseño de dos proteínas sin relación estructural, mejorando su solubilidad sin comprometer su conformación activa. Esta estrategia podría reemplazar los costosos ensayos de prueba-y-error llevados a cabo por la industria farmacéutica, proporcionando una alternativa económica destinada a acelerar el desarrollo de proteínas terapéuticas. Las proteínas son comúnmente conocidas por ser los cimientos de la vida, pudiendo actuar como entidades capaces de autoensamblarse, dando lugar a la formación de varias estructuras supramoleculares. Por ello, hay un gran interés en el uso de polipéptidos para crear nanomateriales funcionales y biocompatibles; entre los que destacan los cuerpos de inclusión proteicos (IBs). Aunque estos IBs han sido tradicionalmente considerados como depósitos de proteínas inservibles, los datos más recientes indican que los IBs actúan como reservorios de proteína activa y estable. Estas partículas submicrométricas son producidas de manera eficiente y barata, y normalmente están sostenidas por un esqueleto amiloide en el cual reside la proteína de interés. Sin embargo, esta conformación amiloide tiene un impacto en la actividad de la proteína de interés y puede ser potencialmente citotóxica. Para superar estas limitaciones, nuestra estrategia consistió en la creación de nuevos IBs funcionales usando la estructura de hélice-α, característica de los coiled-coils. De este modo, usando un dominio coiled-coil natural como andamio, se obtuvieron IBs funcionales, biocompatibles, ricos en hélice-α y listos para ser usados. De manera interesante, los IBs formados por coiled-coils tienen una actividad específica mayor que sus homólogos amiloides, ya que su ensamblaje viene guiado por interacciones nativas que no interfieren en el correcto plegamiento de las partes funcionales. En esta tesis doctoral, demostramos que las nanopartículas proteicas inspiradas en la estructura coiled-coil pueden albergar fluorescencia y tener la capacidad de unir anticuerpos de manera simultánea, siendo estables y biocompatibles, y pudiendo dirigirse hacia antígenos específicos cuando son decoradas con un anticuerpo o una combinación de éstos, siendo por lo tanto una tecnología prometedora en biomedicina. En resumen, el trabajo descrito en la presente tesis trata de proporcionar estrategias útiles destinadas a (I) rediseñar proteínas terapéuticas con propiedades biofísicas mejoradas mediante el uso de herramientas in silico y (II) desarrollar nanomateriales proteicos versátiles y multifuncionales, basados en interacciones entre hélices-α.