[en] The protein phosphatase Ppz1 of the model organism S. cerevisiae is divided into two distinct regions: an unstructured N-terminal domain and a C-terminal catalytic domain. The catalytic domain shares a high identity with the PP1c phosphatases. Ppz1 is one of the major determinants of salt homeostasis, negatively regulating the main K+ entry channels, Trk1 and Trk2, and inhibiting the transcription of the ENA1 gene, which encodes the Ena1 ATPase responsible for exporting Na+ and K+. Moreover, Ppz1 is negatively regulated by two subunits: ScHal3 and Vhs3, with ScHal3 being the most relevant in vivo. S. cerevisiae encodes a third protein structurally related to ScHal3 and Vhs3, called Cab3, which is not an inhibitor of Ppz1. The ScHal3 and Vhs3 proteins are moonlighting proteins, forming a heterotrimer, together with Cab3. This complex generates the enzyme PPCDC, which catalyses the third reaction in the coenzyme A synthesis pathway. Despite the identity between PP1c and Ppz, ScHal3 does not regulate PP1c. Through chemical crosslinking and sequence analysis studies, our laboratory identified two distinctive residues between PP1c and Ppz phosphatases (lysines in PP1c that are mostly acidic amino acids in Ppz) wich are likely interacting with ScHal3. The first objective of this thesis has been to verify if these two residues (D566 and D615) are key elements in Ppz1 for the regulation of the phosphatase mediated by ScHal3. We have shown that residue D615 is a differential structural determinant between PP1c and Ppz, and that it could contribute to the specific mechanism of regulation of Ppz phosphatases by Hal3-type proteins. The PPCDC from Arabidopsis thaliana is a homotrimer composed of three AtHal3 subunits. In the second chapter of the Thesis we identify two residues (G115 and L117), located in the hydrophobic core of the PPCDC of A. thaliana that could be relevant in the formation of the trimeric enzyme. To verify this, we constructed mutated versions of these residues and their equivalents in ScHal3 (L403 and L405). After their characterization, we show that these residues are not relevant in the formation of functional PPCDC neither in A. thaliana nor in S. cerevisiae. However, it was shown that the amino acid L405 of ScHal3 is an important residue for the interaction between Ppz1 and ScHal3, and therefore, for the regulation of the phosphatase. Finally, we describe a functional mapping of the N-terminal extension of ScHal3 trying to find relevant motifs for the regulation of Ppz1. After characterizing multiple mutated versions of ScHal3, we have identified the 90K-R-X3-VTFS98 motif as essential for Ppz1 inhibition. Our results suggest that there must be specific interactions between the two N-terminal regions of Ppz1 and ScHal3. Comparative analysis of fungal ScHal3-like proteins and phenotypic assays with hybrid versions of CaCab3 and CaHal3 proteins from C. albicans provide evidence that the 90K-R-X3-VTFS98 motif, or slightly degenerate versions, is essential for the regulation of the Ppz. This motif could be a determinant of the moonlighting capacity of fungal Hal3 or Cab3-like proteins.

[es] La proteína fosfatasa Ppz1 del organismo modelo S. cerevisiae se divide en dos regiones diferenciadas: i) un dominio N-terminal desestructurado y un dominio catalítico C-terminal. El dominio catalítico guarda una alta identidad con las fosfatasas PP1c. Ppz1 es uno de los mayores determinantes de la homeostasis salina, regulando negativamente los principales canales de entrada de K+, Trk1 y Trk2, e inhibiendo la transcripción del gen ENA1, que codifica la ATPasa Ena1 encargada de exportar Na+ y K+. A su vez, Ppz1 está regulada negativamente por dos subunidades: ScHal3 y Vhs3, siendo ScHal3 la más relevante in vivo. S. cerevisiae posee una tercera proteína relacionada estructuralmente con ScHal3 y Vhs3, denominada Cab3, que no es un inhibidor de Ppz1. Las proteínas ScHal3 y Vhs3 son proteínas moonlighting. Junto con Cab3, forman un heterotrímero que conforma el enzima PPCDC, el cual que cataliza la tercera reacción en la vía de síntesis de coenzima A. Pese a la identidad entre las PP1c y las Ppz, ScHal3 no regula las PP1c. Mediante estudios de entrecruzamiento químico y de análisis de secuencias nuestro laboratorio identificó dos residuos distintivos entre las fosfatasas PP1c y las Ppz (lisinas en PP1c que son mayoritariamente aminoácidos ácidos en Ppz) que posiblemente interaccionen con ScHal3. El primer objetivo de esta Tesis ha sido comprobar si estos dos residuos son elementos clave en Ppz1 (D566 y D615) en la regulación de la fosfatasa mediada por ScHal3. Hemos demostrado que el residuo D615 es un determinante estructural diferencial entre las PP1c y las Ppz, y que puede contribuir al mecanismo específico de regulación de las fosfatasas Ppz por proteínas tipo Hal3. La PPCDC de Arabidopsis thaliana es un homotrímero compuesto por tres subunidades de AtHal3. En el segundo capítulo de la Tesis identificamos dos residuos (G115 y L117), ubicados en el núcleo hidrofóbico de la PPCDC de A. thaliana que podían ser relevantes en la formación de este enzima. Para verificarlo, construimos versiones mutadas en estos residuos y sus equivalentes en ScHal3 (L403 y L405). Tras caracterizarlas, demostramos que estos residuos no son determinantes en la formación de PPCDC funcionales ni en A. thaliana, ni en S. cerevisiae. Sin embargo, se puso de manifiesto que el aminoácido L405 de ScHal3 es un residuo importante para la interacción entre Ppz1 y ScHal3 y por tanto para la regulación de la fosfatasa. Por último, realizamos un mapeo funcional de la extensión N-terminal de ScHal3 tratando de encontrar motivos relevantes para la regulación de Ppz1. Tras la caracterización de múltiples versiones mutadas de ScHal3 hemos identificado el motivo 90K-R-X3-VTFS98 como imprescindible para la inhibición de Ppz1. Nuestros resultados sugieren que debe de haber interacciones específicas entre las regiones N-terminales de Ppz1 y ScHal3. El análisis comparativo de proteínas fúngicas similares a ScHal3 y los ensayos fenotípicos con versiones híbridas de las proteínas CaCab3 y CaHal3 de C. albicans nos aportan evidencias de que el motivo R/K-R/K-X3-VTFS, o versiones ligeramente degeneradas, es esencial para la regulación de las Ppz. Este motivo podría ser un determinante de la capacidad moonlighting de las proteínas tipo Hal3 o Cab3 de hongos.