[ca] La producció de proteïnes recombinants en plantes representa una oportunitat per a la seva obtenció i utilització comercial. L'objectiu principal d'aquesta tesi industrial ha estat el desenvolupament de sistemes vegetals de producció de proteïnes, eficients i competitius econòmicament, amb possibilitats de portar-les al mercat. Per fer-ho hem explorat dos sistemes: els cultius cel·lulars de Daucus carota i les fulles de Nicotiana benthamiana, cadascun d'ells amb els seus avantatges i limitacions. Com a prova de concepte, ambdós sistemes van ser utilitzats per a la producció d'"insulin-like growth factor 1" (IGF1), un pèptid d'alt valor afegit per a les indústries cosmètica i farmacèutica. S'assajaren vàries estratègies innovadores per a millorar els rendiments de producció augmentant l'expressió gènica i reduir costos de purificació del producte. A més, l'activitat biològica de l'IGF1 i els seus derivats produïts en planta va ser avaluada en comparació amb pèptids sintètics. Com a primera estratègia s'assajaren supressors del silenciament de l'ARN d'origen viral per tal d'incrementar l'expressió gènica. En assajos d'expressió transitòria amb la proteïna verda fluorescent com a marcadora, seleccionàrem la proteïna P1b del ipomovirus Cucumber vein yellowing virus (CVYV). Els nostres resultats amb línies cel·lulars de pastanaga sobreexpressores de l'IGF1 o el seu pèptid derivat CPP-IGF1 (variant dissenyada per a millorar la seva penetració en cèl·lules humanes) mostraren que en combinació amb P1b s'arribava a rendiments de producció 4 vegades majors que les línies sense el supressor del silenciament. A més, els pèptids foren dirigits al medi de cultiu per facilitar el seu aïllament mitjançant una simple clarificació. En assajos d'activitat, les fraccions obtingudes confirmaren ser capaces d'incrementar la divisió de fibroblasts humans. En relació amb l'estabilitat de la producció, s'observà una reducció propera al 33% després de vint-i-un cicles de propagació successius, per la qual cosa s'implementà la criopreservació de les línies transgèniques per mantenir els rendiments de producció originals, i així establir bancs cel·lulars per usos futurs. Alhora, es desenvolupà un sistema de producció transitòria de l'IGF1 i el CPP-IGF1 en fulles de N. benthamiana utilitzant un vector derivat del virus del mosaic del tabac, Tobacco mosaic virus (TMV). Aquest sistema va permetre reduir el temps d'obtenció del pèptid actiu, encara que en comparació amb la producció a les línies cel·lulars l'obtenció del producte no fou tan senzilla. Per tal de facilitar la purificació de l'IGF1 a partir de les matrius vegetals, aplicàrem una estratègia innovadora basada en fusions a oleosina per dirigir la producció a cossos lipídics. Aquesta tecnologia ja havia estat utilitzada en llavors, però no en cultius cel·lulars i escassament en fulles. Les nostres observacions mostraren la presència d'abundants cossos lipídics en nombrosos cultius cel·lulars incloent-hi els de D. carota amb l'excepció de les dues espècies model analitzades, Nicotiana tabacum i Arabidopsis thaliana. Desafortunadament, l'expressió estable de fusions a l'oleosina sembla que va afectar greument al creixement dels calls cel·lulars, pel que s'exploraren alternatives de la seva aplicació a la producció en fulles. Per tal d'augmentar la quantitat de cossos lipídics, la producció de les fusions a l'oleosina es realitzà simultàniament amb la d'inductors de l'acumulació de triacilglicerols utilitzant elements clau de la seva ruta biosintètica en A. thaliana: l'enzim DGAT1 i el factor de transcripció WRI1. Quan ambdós inductors foren co-expressats en combinació amb fusions a oleosina i l'IGF1 en plantes de N. benthamiana, es va obtenir fins 1 μg/g d'IGF1 unit als cossos lipídics, fàcilment aïllable i actiu. El nostre treball proporciona evidències que la utilització de supressors del silenciament de l'ARN, els vectors virals i la tecnologia de les oleosines contribueixen al potencial de les matrius vegetals per a la producció de proteïnes d'interès.

[en] The production of proteins in plant cell cultures and whole plants represents great opportunities to develop products for commercial use. The main objective of this industrial thesis was to develop economic and efficient plant production systems to bring proteins of interest to the market. We explored two different systems, Daucus carota cell cultures and Nicotiana benthamiana leaves, each having advantages and drawbacks depending on the intended use of the products. As a proof of concept, both systems were applied in the production of the human insulin-like growth factor 1 (IGF1), a high value peptide for the cosmetic and therapeutic industries. Innovative strategies to enhance gene expression and to facilitate product purification were used to improve yields and to reduce costs. Moreover, the biological activity of the produced IGF1 and derivatives was evaluated and compared to the chemically synthesized peptides to demonstrate the usefulness of production systems. Our first approach to enhance gene expression and improve peptide yields was with RNA silencing suppressors (RSSs). Using transient expression assays and the green fluorescent protein (GFP) as reporter, we selected the P1b from the Cucumber vein yellowing virus (CVYV) Ipomovirus as the RSSs to enhance gene expression in carrot cell cultures. Our results demonstrated that transgenic lines overexpressing IGF1 or the derivative CPP-IGF1 (a variant tailored to enhance the delivery to human cells) reached up to 4-fold higher peptide yields in combination with P1b than without. The IGF1 or CPP-IGF1 was targeted to the culture media being easily purified by simple clarification of suspensions. Moreover, we found that the media containing the produced IGF1 or CPP-IGF1 stimulated the division of human fibroblasts. A cryopreservation process was applied to the transgenic lines to avoid the reduction in peptide production found over successive propagation cycles. This allowed us to recover the original yields, opening up the possibility of establishing master cell banks. We also developed a transient production system of IGF1 and CPP-IGF1 using N. benthamiana leaves and a derived tobacco mosaic virus vector. This system resulted in similar yields of active peptides to cell cultures with the main advantage of shortening production times, although requiring more complex downstream purification. Our innovative strategy to facilitate the purification of IGF1 from plant matrices was the use of oleosin fusion technology for lipid droplet (LDs) targeting. This technology has been previously used in LD-rich seeds, but unexplored in plant cell cultures or LD-poor tissues such as leaves. Our work showed that model cell cultures from Nicotiana tabacum or Arabidopsis thaliana were an exception, as many other plant cell cultures, including D. carota cells, do contain a large number of LDs and are susceptible to produce oleosin fusion proteins. However, as the stable expression of oleosin fusions severely affected callus cell growth, we tested the technology in transient expression in leaves. Due to the low level of LDs in leaves, oleosin fusion proteins production was in combination with triacylglycerol (TAG) induction to increase LD content simultaneously. For this purpose, key components of the TAG biosynthetic pathway, A. thaliana derived elements such as the enzyme DGAT1 and the regulatory factor WRI1 were co-expressed with the IGF1 oleosin fusion proteins in N. benthamiana leaves. Using this strategy, we obtained yields up to 1 μg/g of IGF1 bound to LDs, easily purified and fully active. Our work provides evidence of the potential of plant matrices to produce valuable peptides. Also, the oleosin technology, the use of RSSs and viral vectors explored will serve to overcome some of the known limitations of plant systems to produce active products of industrial interest.