[en] The thesis focused on the biological function analysis of human RNases, emphasizing the immune-regulation action within human macrophages to fight pathogen infection and the potential molecular mechanisms involved. Our laboratory has extensively studied human RNases and found that RNases have a direct antimicrobial activity against diverse bacterial species in vitro, suggesting a physiological host-defense function. In this doctoral thesis, the main goal is to understand how human RNases function in human innate cells against pathogen infection. The majority of the research presented in this thesis is taken from 4 published papers, 1 manuscript submitted and 1 in preparation. Below is a description of each chapter within this thesis: The first chapter mainly summarized the antipathogenic mechanism of human antimicrobial peptides and proteins in mycobacterial infections and their applied therapies against tuberculosis. The second chapter reviewed the immune-regulation functions of human RNase superfamily. 8 human RNase A family members were summarized based on their contribution to innate immunity at the extracellular space. This third chapter focused on screening the antimicrobial profiles of human RNases against M. aurum and identifying their ability to induce autophagy in infected macrophages. Moreover, we found that the antimicrobial and autophagy activities were not dependent on the RNase enzymatic activity. In the fourth chapter, the transcriptome of macrophages treated with RNase3 and RNase3-H15A (a catalytic defective mutant) were compared to identify the molecular mechanism of the immune-regulation action of RNase3. Moreover, we overexpressed the endogenous RNase3 in THP1 derived-macrophage cells and analyzed its effect on the infectivity by Mycobacterium aurum and the Respiratory Syncytial Virus. We identified RNase3 immune-regulation activities on macrophages, either in a ribonucleolytic-dependent or independent manner. We propose that RNase3 directly targets the EGFR receptor. On the other hand, the RNA products cleaved by RNase3 may be responsible for the ribonucleolytic-dependent macrophage immune response. In the fifth chapter, CRISPR/Cas9 gene editing tool was applied to knock out RNase2 in macrophage THP1 cells. Then, RSV infectivity, transcriptome change, and tRNA population were compared in cells with and without endogenous RNase2. Our results indicated that RNase2 is crucial in controlling the macrophage intracellular RSV infection. Transcriptome analysis suggests a direct interaction of RNase2 with the EGFR receptor. In addition, by screening a library of tRNA fragments we identified the tRNA fragments produced by RNase2 that might participate in the virus infection inhibition. In the sixth chapter, we analyzed the enzyme substrate specificity at the secondary nucleotide base binding site and performed a kinetic characterization of the canonical RNase types together with a molecular dynamic simulation of the selected representative family members. The results highlight an evolutionary trend from lower to higher order vertebrates towards an enhanced discrimination for adenine respect to guanine preference, The RNase binding involves specific bidentate polar and electrostatic interactions: Asn to N1/N6 and N6/N7 adenine groups in mammals versus Glu/Asp and Arg to N1/N2, N1/O6 and O6/N7 guanine groups in non-mammals. The study aims to identify the structural basis for the specific recognition of cellular RNA substrates. In conclusion, the results presented in this thesis contribute to understand the role of RNases in innate immune cells and how they facilitate the host clearance of pathogens, which is crucial for designing and developing new therapeutic agents.

[es] La tesis se centró en el análisis de la función biológica de las RNasas humanas, destacando la acción de regulación inmunológica en macrófagos para combatir la infección por patógenos y los posibles mecanismos moleculares involucrados. Nuestro laboratorio descubrió que las RNasas tienen una actividad antimicrobiana directa frente a diversas especies bacterianas in vitro, lo que sugiere una función fisiológica de defensa del huésped. En esta tesis doctoral, el objetivo principal es comprender cómo funcionan las RNasas humanas en las células innatas humanas frente a la infección por patógenos. La mayoría de la investigación presentada en esta tesis se basa en 4 artículos publicados, 1 manuscrito enviado y 1 en preparación. A continuación se incluye una descripción de cada uno de los capítulos que constituyen esta tesis: El primer capítulo resumió el mecanismo antipatógeno de los péptidos y proteínas antimicrobianas humanas en las infecciones por micobacterias y sus terapias aplicadas contra la tuberculosis. El segundo capítulo revisó las funciones de regulación inmunológica de la superfamilia de la RNasa. Se describen los 8 miembros en humanos de la familia de la RNasa A en función de su contribución a la inmunidad innata y su rol en el espacio extracelular. Este tercer capítulo se centró en la detección de los perfiles antimicrobianos de las RNasas humanas contra M. aurum y la identificación de su capacidad para inducir la autofagia en los macrófagos infectados. Además, encontramos que las actividades antimicrobianas y autofágicas no dependían de la actividad enzimática RNasa. En el cuarto capítulo, se comparó el transcriptoma de los macrófagos tratados con RNasa3 y RNasa3-H15A (un mutante sin actividad catalítica) para identificar el mecanismo molecular de la acción inmunoreguladora de la proteína. Además, sobre expresamos la RNasa3 endógena en células THP1 derivadas a macrófagos y analizamos su efecto sobre la infectividad por Mycobacterium aurum y el Virus Respiratorio Sincitial (RSV). Identificamos las actividades de inmunoregulación de la RNasa3 en macrófagos, con y sin actividad ribonucleolítica. Proponemos que la RNasa3 se une directamente al receptor EGFR. Por otro lado, los productos de ARN escindidos por la RNasa3 pueden ser responsables de la respuesta inmune de macrófagos dependiente de la actividad ribonucleolítica. En el quinto capítulo, se editaron genes mediante CRISPR / Cas9 para eliminar la RNasa2 en células THP1 derivadas a macrófagos. A continuación, se comparó la infectividad del RSV, el cambio en el transcriptoma y la población de tRNA en células con y sin RNasa2 endógena. Nuestros resultados indicaron que la RNasa2 es crucial en el control de la infección intracelular de macrófagos por el RSV. El análisis del transcriptoma sugiere una interacción directa de la RNasa2 con el receptor EGFR. Además, al examinar una biblioteca de fragmentos de ARNt identificamos los fragmentos de ARNt producidos por la RNasa2 que podrían participar en la inhibición de la infección vírica. En el sexto capítulo, analizamos la especificidad del sustrato enzimático en el sitio de unión de la base del nucleótido secundario y realizamos una caracterización cinética de los tipos de RNasas canónicas junto con una simulación por dinámica molecular de los miembros más representativos de la familia. Los resultados destacan una tendencia evolutiva en vertebrados de orden inferior a superior hacia una discriminación mejorada de preferencia por la adenina respecto a la guanina. El estudio tiene como objetivo identificar la base estructural para el reconocimiento específico de sustratos de ARN celular. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis contribuyen a comprender la función de las RNasas en las células inmunes innatas y cómo facilitan la eliminación de patógenos por parte del huésped, lo cual es crucial para diseñar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos.