[ca] Aquesta tesi és divideix en dos temes en funció dels enzims estudiats: quitina desacetilases i glicosidases. En ambdós casos, l'objectiu és modificar l'especificitat per substrat per dissenyar nous biocatalitzadors. Les quitina desacetilases actuen sobre la quitina per obtenir el quitosà. Els quitosans són una família de polisacàrids compostos de N-acetil-glucosamina i glucosamina. Els oligosacàrids de quitosà han demostrat ser molècules bioactives amb una gran varietat d'aplicacions en els camps de la biotecnologia i la biomedicina. Amb l'objectiu de superar els problemes de la desacetilació química de la quitina per l'obtenció del quitosà és va utilitzar l'alta selectivitat en termes de preferència per substrat i rendiments de producte de les reaccions enzimàtiques. La resolució de l'estructura 3D de la quitina desacetilasa de Vibrio cholera en complex amb diferents substrats va ser una fita clau en l'establiment del model Subsite Capping Model per racionalitzar els patrons de desacetilació específics d'aquesta família d'enzims. L'objectiu principal del primer tema de la tesi consisteix en l'avaluació de les relacions estructura-funció amb l'objectiu de donar suport a la hipòtesi del Subsite Capping Model i modificar l'especificitat per substrat de la quitina deacetilasa de Vibrio cholera cap a nous biocatalitzadors. Després de dissenyar un assaig de cribratge d'alt rendiment que permet determinar l'activitat desacetilasa en quitooligosacàrids, és van preparar una sèrie de mutants que implicaven des del loop 5 als subsetis positius que envolten el centre actiu de l'enzim basats tant, en un disseny racional així com d'evolució dirigida. Els experiments estructurals i cinètics dels mutants dissenyats permeten concloure que la modificació de la dinàmica dels loops afecta no només l'especificitat del substrat, sinó també el mecanisme d'unió, canviant el mecanisme de selecció conformacional de l'enzim wild-type a un mecanisme d'ajustament induït permeten així dilucidar els determinants moleculars que defineixen l'especificitat per substrat. El segon tema de la tesi tracta sobre l'enginyeria de la família de les glucosidases per estudiar i modificar les interaccions enzim-substrat amb una potencial classe de substrats, els septanòsids, anells de set membres, no naturals que són homòlegs a l'anell de piranosa. L'objectiu és redissenyar una glucosidasa per acceptar septanòsids amb la finalitat de convertir-se en un nou sistema biortogonal amb diverses aplicacions en el camp de la biotecnologia. En la present tesi és va aconseguir la síntesi de septanòsids cromogènics com a substrats potencials per al cribatge d'un panell de glicosidases. És va identificar la beta-glucosidasa de Streptomyces sp. com a principal candidat potencial per a l'enginyeria de l'activitat hidrolasa. Els estudis preliminars de mutagènesi van identificar una sèrie de residus del centre actiu com a candidats per a la preparació de biblioteques combinatòries per dissenyar l'especificitat del enzim. Així mateix, experiments in silico van establir una premissa per a noves configuracions de septànosids per augmentar el panell de substrats disponibles per a més estratègies d'evolució dirigida.

[en] This thesis is divided in two distinct topics based on the enzymes studied: chitin deacetylases and glycosidases. In both cases the goal is to engineer substrate specificity to design novel biocatalysts. Chitosans are a family of polysaccharides of N-acetyl-glucosamine and glucosamine. Chitosan oligosaccharides have proven to be bioactive molecules in a broad variety of applications in the fields of biotechnology and biomedicine. One way to overcome the problems of chemical deacetylation of chitin is using the high selectivity in terms of substrate preference and product yields of the enzymatic procedures. The solution of the 3D structure of the Vibrio cholera Chitin deacetylase in complex with different substrates was a milestone in the establishment of the Subsite Capping Model to rationalize CDAs specific deacetylation patterns. The main objective of the first thesis topic comprises the evaluation of structure-function relationships aiming to support the Subsite Capping Model hypothesis and modify the substrate specificity of the Vibrio cholera Chitin deacetylase towards novel biocatalysts. After designing a high throughput screening (HTS) assay for deacetylase activity on chitooligosaccharides, we prepared a series of mutants involving loop 5 at the positive subsites of the binding cleft based on rational design and directed evolution approaches. Structural and kinetic experiments of designed mutants concluded that modifying the dynamics of enzyme loops affects not only the substrate specificity towards new specificities, but also the binding mechanism, switching the conformational selection mechanism of the wt enzyme to an induced fit mechanism in a triple Proline to Glycine mutant that allowed us to elucidate the molecular determinants that define substate specificity. The second thesis topic on glycosidase engineering was a test bed to investigate and influence enzyme·ligand interactions with a different class of potential substrates, seven-member ring septanosides, unnatural druggable glycomimetics that are pyranose homologues. The aim is to engineer a Streptomyces sp. beta-glucosidase to accept septanoside substrates that may become a novel biorthogonal system with applications in chemical biology. In this work, the synthesis of chromogenic septanosides as potential glycosidase substrates was achieved for screening a panel of glycosidases. A b-glucosidase from Streptomyces was identified as a potential candidate for engineering septanoside hydrolylase activity. Preliminary mutagenesis studies identified a number of active site residues as candidates for the preparation of combinatorial libraries to engineer septanoside specificity. Likewise, docking experiments established a premise for new septanoside configurations to increase the panel of substrates available for further directed evolution strategies.