[en] The improvement in the performances of global agricultural or food systems significantly affects by the control of pests and pathogens. The more healthy, environmental and sustainable integrated pest management (IPM) strategies are demanded in the modern agriculture. One of the most important strategy or biotechnology rely on Bacillus thuringiensis (Bt) and its secreted insecticidal proteins has been the most economically successful use to control pests to date. Recently, a new subfamily of vegetative insecticidal proteins (Vip3) produced during the vegetative growth phase of Bt was considered as the combined use with the other Bt proteins, especially that have been reported evolving distinct resistant (Cry toxins) with long-term commercial use. Despite Vip3 proteins have been revealed that no sequence or homology similarity with Cry proteins and are toxic to a wide variety of Lepidoptera, its mode of action is yet not completely elucidated. To better apply and understand the Vip3 proteins, in this doctoral we investigate the potential interaction of combination use (insecticidal spectrum, cross resistance, interaction), then we analyze the critical residues on the structure and toxicity through mutagenesis, and use these critical mutations to shed the light on the mode of action of Vip3 proteins. Firstly we investigate ten Bt toxins (Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ah, Cry1Fa, Cry2Aa, Cry2Ab, Cry1Ie, Vip3Aa19, Vip3Aa16, and Vip3Ca) toxicities and their combination of use at lab against Mythimna separata, which is a destructive pest of agricultural crops in East Asia. The bioassays results revealed that LC50 (lethal concentration for 50% mortality) values (Cry1Ac/Vip3Aa19/Vip3Ca < Cry1Ab/Cry2Aa/Vip3Aa16 < Cry2Ab/Cry1Fa/Cry1Ah < Cry1Ie) ranged from 1.6 to 78.6 µg/g (toxin/diet) for those toxins. In addition, the interactions between Vip3 and Cry proteins in this study indicated the synergism was tested only in the combination group Vip3Aa16 and Cry1 toxins, that the significant groups (Vip3Aa16 and Cry1Fa, Vip3Aa16 and Cry1Ie) showed around 6.3 to 9.2 fold (or synergetic factors) than expected. We also tested the toxicities of Vip3 (Vip3Aa and Vip3Ca) proteins against different Cry1A-, Cry2A-, Dipel- and Vip3-resistant insect species. Comparing the toxicities of Vip3 proteins between resistant Cry1A proteins, Dipel (Helicoverpa armigera, Trichoplusia ni, Ostrinia furnacalis and Plodia interpunctella) or Cry2Ab (H. armigera and T. ni) and susceptible strains, there were not cross-resistant detected in these insects. In contrast, the strong cross-resistance to the Vip3Ca protein was observed in Vip3Aa (or Vip3Aa/Cry2Ab) resistant H. armigera colonies. Moreover, Vip3Aa protein was tested almost lost the toxicity in O. furnacalis (only showed moderate growth inhibition at the highest concentration tested (100 µg/g)), but Vip3Ca protein was highly toxic. Besides, a colony of Vip3Aa resistant M. separata was obtained and also tested the susceptibility to Cry1Ab and Cry1F, it also suggested no cross resistance between Cry1 and Vip3Aa proteins. To shed light on the structure of Vip3 proteins, we analyzed the trypsin fragmentation of several critical mutants (or patterns) of the Vip3Af protein obtained through alanine scanning mutagenesis. Based on protease digestion patterns, their effect on oligomer formation, and theoretical cleavage sites, we generated a map of the Vip3Af protein with five domains: domain I ranges amino acids (aa) 12–198, domain II aa199–313, domain III aa314–526, domain IV aa527–668, and domain V aa669–788. The effect of some mutations on the ability to form a tetrameric molecule revealed that domains I–III are required for tetramerization, while domain V is not, domain IV is not clear. In addition, 12 mutants of the Vip3Af protein were generated by site-directed mutagenesis, which are from critical residues to constitute the integrity of oligomer and unique mutation (at N-terminal) only observed in some Vip3 proteins. Finally ten of these mutants were successfully expressed and tested for stability and toxicity against three insect pests (Spodoptera frugiperda, Spodoptera littoralis and Grapholita molesta). Regarding toxicity, only the mutant M34L (change of Met34 to Lys34) significantly increased the toxicity in S. littoralis, whereas the other mutants (or substitutions) did not improve, or even decreased. The profiles of these site- directed mutagenesis upon trypsin treatmen in the SDS-PAGE (stability) and toxicity showed that, residue 483 required an acidic residue, and residue 552 an aromatic residue, the others are still not clear. The mode of action of Vip3 proteins is still debatable currently. To clear the details, we firstly analyzed the stability of proteolytic fragments (activated Vip3Af protein) digested by commercial trypsin and S. frugiperda midgut juice in vitro. The results revealed a misleading degradation patterns of Vip3Af was observed with trypsin or midgut juice in the SDS-PAGE. However, the gel filtration chromatography indicated that, under native conditions (incubated with inhibitor before heat for SDS-PAGE), Vip3Af is stable and as a tetramer for protoxin or activation. The identification of the proteolytic fragments suggested a cleavage site (aa 198/199) renders two fragments of approximately 20 kDa and 65 kDa (activation) which still strongly remain together (as tetramer) and that are no further processed even at high protease concentrations. The understanding of the role of specific binding to membrane receptors is so critical to determine their specificity. In this part, we have set up a new binding condition of 125I-Vip3Af to S. frugiperda and Spodoptera exigua brush border membrane vesicles (BBMV), and the specific binding was observed to BBMVs. Heterologous competitions revealed that, Cry1Ac and Cry1F did not compete for Vip3Af binding sites; Vip3Aa shares the same binding sites with Vip3Af, but that Vip3Ca merely shares partially. Using the truncated Vip3Af molecules (DI-III, DI-IV, DIV-V, and DIV) by trypsin treatment of selected critical alanine-mutants as competitors (compete with 125I-Vip3Af), the results showed that only those molecules containing domains I to III (DI-III and DI-IV) were able to compete with the trypsin-activated Vip3Af protein for binding, and that molecules only containing either domain IV or domains IV and V (DIV and DIV-V) were unable to compete with Vip3Af. These results were further confirmed with competition experiments using 125I-DI-III. In addition, cell viability assays showed that the truncated proteins DI-III and DI-IV were as toxic to Sf21 cells as the activated Vip3Af (or DI-V), DIV-V is totally lost the toxic (at the concentration C=100 ug/ml) suggesting that domains IV and V are not necessary for the toxicity to Sf21 cells. But the domains IV and V is necessary to the toxicity in vivo, and the function need further research. Finally, a field population of M. separata was collected and subjected to laboratory selection with either Vip3Aa, Cry1Ab or Cry1F proteins. And only the Vip3Aa resistant (>3061-fold) M. separata strain was rapidly obtained after 8 or 9 generations, no remarkable Cry1Ab or Cry1F resistance was observed at the same selected time. Analysis of the difference of labeled 125I-Vip3Aa binding to BBMVs from larvae from the susceptible and resistance insects revealed no any qualitative or quantitative binding difference. It suggests that altered binding to midgut membrane receptors is not the main mechanism of resistance to Vip3Aa protein. The results we obtained are helpful to the applied strategy of Bt toxins and give to a better understanding of the protein structure and function of Vip3A proteins, which will be guided for the strategies in pest management or resistance management. In addition, the identification of the binding domains of Vip3A is so critical to shed light on the mode of action of Vip3 proteins.

[es] El control de plagas y patógenos ha tenido un efecto importante en la mejora del rendimiento de los sistemas agrícolas a nivel mundial. Diferentes tipos de insecticidas químicos se han usado extensivamente durante mucho tiempo para el control de plagas de insectos. Debido a la aparición de resistencias, problemas de contaminación de aguas y problemas de salud humana causados por dichos insecticidas de síntesis, la agricultura moderna necesita una estrategia de gestión integrada de plagas más saludable, respetuosa con el medio ambiente y sostenible. El uso de Bacillus thuringiensis (Bt) y sus proteínas insecticidas para el control de plagas es una de las estrategias biotecnológicas más importantes hasta la fecha. Además, los genes que codifican sus proteínas insecticidas han sido transferidos a plantas, las cuales están siendo utilizadas comercialmente, desde 1996 en gran parte del mundo para el control eficiente de numerosas plagas de insectos. En los últimos años, una nueva subclase de proteínas insecticidas secretables (Vip3) producida durante el crecimiento vegetativo de Bt se ha considerado para la aplicación combinada con las convencionalmente empleadas proteínas Cry, cuya aplicación se ve amenazada por la aparición de poblaciones de insectos resistentes. Las proteínas Vip3 no tienen homología de secuencia con las proteínas Cry y son tóxicas para insectos lepidópteros, sin embargo, su modo de acción todavía no se conoce completamente. En este proyecto de tesis, con el objetivo de mejorar su aplicación en el control biotecnológico de plagas y la comprensión del modo de acción de las proteínas Vip3, se estudiaron diversos aspectos de su actividad insecticida (espectro de acción, resistencia cruzada e interacción con otras proteínas), y se realizó un estudio de los residuos clave para el mantenimiento de la estructura tridimensional y la toxicidad de la proteína Vip3Af mediante mutagénesis dirigida. También analizamos la posible implicación de la unión a receptores en la aparición de resistencia utilizando una cepa resistente que había sido seleccionada con Vip3Aa. En primer lugar, se investigó la toxicidad de 10 toxinas Bt (Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ah, Cry1Fa, Cry2Aa, Cry2b, Cry1Ie, Vip3Aa19, Vip3Aa16 y Vip3Ca) frente a Mythimna separata (plaga agrícola muy destructiva en Asia y Australia), así como su aplicación combinada mediante bioensayos llevados a cabo en laboratorio. Los resultados mostraron que la concentración letal media LC50 (Cry1Ac/Vip3Aa19/Vip3Ca < Cry1Ab/Cry2Aa/Vip3Aa16 < Cry2Ab/Cry1Fa/Cry1Ah < Cry1Ie) osciló entre 1,6 y 78,6 µg/g (toxina/dieta). Además, sólo se detectaron efectos sinérgicos para las combinaciones entre la proteína Vip3Aa16 y proteínas Cry1. Las combinaciones de Vip3Aa16 con Cry1Fa y Vip3Aa16 con Cry1Ie mostraron un aumento de toxicidad (o factor sinérgico) de 6,3 a 9,2 veces más de lo esperado. También se probó la toxicidad de dos proteínas Vip3 (Vip3Aa y Vip3Ca) en diferentes insectos resistentes a Cry1A y Dipel (Helicoverpa armigera, Trichoplusia ni, Ostrinia furnacalis y Plodia interpunctella), resistentes a Cry2A (H. armigera y T. ni) y resistentes a Vip3 (H. armigera). No se detectó resistencia cruzada para las proteínas Vip3 en insectos resistentes a proteínas Cry1A, Cry2A y Dipel, pero sí se detectó resistencia cruzada a Vip3Ca en la cepa de H. armigera resitente a Vip3Aa y Cry2b. Además, la proteína Vip3Aa provocó una inhibición moderada del crecimiento en O. furnacalis (sólo a la concentración máxima de ensayo (100 µg/g)), mientras que la proteína Vip3Ca mostró ser altamente tóxica frente a esta especie. Por otra parte, una cepa de M. separata resistente a Vip3Aa se obtuvo y se caracterizó la toxicidad ejercida por las proteínas Cry1Ab y Cry1F, confirmando la ausencia de resistencia cruzada entre las proteínas Cry1 y Vip3Aa. Estos resultados concuerdan con los de estudios previos que muestran la falta de resistencia cruzada entre las proteínas Vip3 y Cry en diferentes especies, por el contrario, se encontró una fuerte resistencia cruzada entre Vip3Ca y Vip3Aa en H. armigera (una cepa resistente seleccionada con Vip3Aa). Varios estudios demostraron que los sitios de unión juegan un papel crítico en el mecanismo de resistencia a Cry, pero Vip3Aa no comparte sitios de unión con las proteínas Cry1 o Cry2. Nuestros resultados sobre la falta de resistencia cruzada entre las proteínas Vip3 y Cry están de acuerdo con las diferencias en el modo de acción de las mismas. Además, a diferencia de la proteína Vip3Aa, Vip3Ca fue muy activa para las larvas de O. furnacalis (tanto susceptibles como resistentes a Cry1Ab), lo que permitió descubrir que Vip3Ca es una toxina potencial en el control de O. furnacalis. Las proteínas Vip3A no comparten secuencia ni homología estructural con las proteínas Cry, son de interés práctico debido a su eficaz actividad insecticida contra una amplia gama de insectos lepidópteros, e incluso muestran una potente actividad frente a algunas plagas agronómicamente importantes que tienen poca o ninguna susceptibilidad a las proteínas Cry. Ello las convierte en candidatos potenciales para complementar las proteínas Cry en cultivos Bt para ampliar el espectro insecticida y con fines del manejo de la resistencia. Recientemente, el modo de acción propuesto de las proteínas Vip3 consiste en que, una vez ingeridas (protoxinas de Vip3) por las larvas de lepidópteros, éstas son procesadas por las proteasas intestinales dando lugar a un corte en la proteína, atraviesan la membrana peritrófica, reconocen y se unen a los receptores en la membrana epitelial del intestino medio y, mediante una serie de pasos todavía desconocidos, dan lugar a poros en la membrana, lo cual produce la parálisis y degeneración completa de las células del epitelio intestinal y finalmente a la muerte del insecto. Sin embargo, algunos detalles están todavía por dilucidar. Con el objetivo de arrojar luz sobre los dominios funcionales y estructurales putativos de las proteínas Vip3, hemos utilizado mutantes de alanina Vip3Af seleccionados por su pérdida de toxicidad, identificados a partir de un trabajo previo. La mayoría de estos mutantes se distribuyen en tres clusters a lo largo de la proteína (N-terminal, medio y C-terminal) y muestran patrones proteolíticos alterados tras la digestión con tripsina. En este estudio, analizamos el efecto de mutaciones seleccionadas sobre la estructura tridimensional de la proteína mediante cromatografía de filtración en gel, tanto para la protoxina sin activar, como después de tratada con tripsina. Los cromatogramas de dichos mutantes mostraron que Vip3Af tipo salvaje (wt) era un tetrámero de pH 7,4 a 10,0, y no se vio afectado por el tratamiento con tripsina (a pH 9,0). Posteriormente, basándonos en los patrones de digestión de proteasas, su efecto sobre la formación de oligómeros y los sitios de escisión teóricos, junto con el de trabajos anteriores, pudimos generar un mapa de la proteína Vip3Af con cinco dominios: dominio I rangos de aminoácidos (aa) 12-198, dominio II aa199–313, dominio III aa314–526, dominio IV aa527–668 y dominio V aa669–788. La comparación de los distintos mutantes en cuanto a su capacidad de formar tetrámeros indicaron que el dominio I-III es necesario para la oligomerización, mientras que el dominio V no lo es y el papel del dominio IV en este aspecto del modo de acción de la proteína no está claro. En un estudio posterior, con la finalidad de producir variantes de la proteína Vip3Af con actividad insecticida incrementada, se generaron 12 nuevos mutantes de la proteína Vip3Af por mutagénesis dirigida en residuos puntuales clave para la integridad del oligómero y mutaciones puntuales en el extremo N-terminal. Nueve de estos mutantes (M34L, K284Q, E483D, E483H, W552H, W552F, N682K-G689S, G689S, G689E) se clonaron y expresaron con éxito. Las mutaciones M34L y K284Q se eligieron a partir de un análisis mediante comparación de secuencias de proteínas entre diferentes proteínas Vip3, mientras que el resto se eligió en función de los residuos clave que previamente se vio que afectaban significativamente la actividad insecticida. Los nuevos mutantes se probaron contra tres insectos plaga (S. frugiperda, Spodoptera littoralis y Grapholita molesta). Los resultados revelaron que el mutante M34L (Met34 a Leu34) aumentó significativamente su toxicidad frente a S. littoralis,aunque no hubo cambios significativos con S. frugiperda o G. molesta. El resto de mutantes no mejoraron (K284Q, E483D, W552F) o incluso disminuyeron (E483H, W552H, N682K-G689S, G689S, G689E) su capacidad tóxica frente a estas especies plaga. La estabilidad de estos mutantes se estudió mediante la realización de perfiles de tripsinización in vitro en SDS–PAGE. Los resultados indicaron que, para no afectar a la estructura de la proteína, la posición 483 requiere la presencia de un residuo ácido, mientras que la posición 552 requiere un residuo aromático. Para el resto de posiciones estudiadas no se encontró la necesidad de un tipo de residuo concreto. Met34 es un residuo altamente conservado entre la mayoría de las proteínas Vip3 y se encuentra en una región hidrófoba de la hélice α1 que se acopla al núcleo del tetrámero en una cavidad formada por hélices α del mismo monómero. El cambio de Met34 a Leu34 no alteró el patrón proteolítico, lo que indica que el plegamiento de la proteína no se vio afectado. Pero el aumento significativo de actividad en S. littoralis (M34L) indicó que el aminoácido leucina tiene una preferencia helicoidal más alta que la metionina y tiene un valor de hidrofobicidad más alto que contribuye a una mayor estabilización de la hélice α. Con la creciente demanda de una agricultura más sostenible y el tiempo y los costos económicos que suponen el desarrollo de nuevas sustancias activas, la ingeniería de proteínas es una estrategia muy conveniente. El procesamiento proteolítico es un paso bien establecido en el modo de acción insecticida de las proteínas Vip3. Sin embargo, estudios preliminares del análisis de los productos proteolíticos por SDS-PAGE dieron lugar a resultados engañosos en cuanto a que parecía que la proteína se degradara completamente. La observación de que, a mayor tiempo de incubación con tripsina, menor degradación, hizo pensar en un artefacto de la técnica. Para comprobar si la degradación era meramente aparente o era real, analizamos la estabilidad de los fragmentos proteolíticos (proteína Vip3Af activada) digeridos por tripsina comercial y jugo de intestino medio de S. frugiperda in vitro, en ausencia y en presencia de varios inhibidores de proteasas. Los resultados revelaron que se observaban patrones de degradación falsos debido a que la preparación de la muestra antes de cargar en el gel de electroforesis hacía que la proteína cambiara de conformación (se "abriera") antes que la tripsina o las proteasas del jugo intestinal se inactivaran completamente, lo que daba lugar a la exposición de más sitios de corte que en la conformación nativa. El uso de uno de los inhibidores de proteasas, junto con la cromatografía de filtración en gel, revelaron que, en condiciones nativas (incubado con inhibidor antes de calentar para SDS-PAGE), la Vip3Af es estable frente a proteasas y se mantiene como tetrámero tanto en su forma de protoxina como de proteína activada. Esto explicaba por qué, a mayor tiempo de incubación con tripsina (uno o dos días frente a media hora), se obtenían menos degradación de la Vip3Af: la tripsina se había autodigerido antes de calentar la muestra en presencia de SDS. La identificación de los fragmentos proteolíticos reveló un sitio de escisión principal (aa 198/199) que da lugar a dos fragmentos de aproximadamente 20 kDa y 65 kDa (activación) que aún permanecen fuertemente unidos (formando parte del tetrámero) y que no se procesan más incluso a altas concentraciones de proteasa. De manera similar, previamente se había encontrado este efecto en la Vip3Aa, confirmando que ello es una particularidad común en las proteínas de la familia Vip3. Así mismo, y mediante esta misma técnica, se pudieron encontrar sitios de tripsinización secundarios en la proteína Vip3Aa. La identidad de estos fragmentos se confirmó en dos sitios de escisión secundarios adicionales en el fragmento de 65 kDa que dan lugar a dos fragmentos menores de aprox. 45 kDa y 33 kDa. Aunque está bien aceptado que la actividad de Vip3 requiere la unión a receptores de membrana en el intestino medio de los insectos diana, se sabe muy poco sobre cómo las proteínas Vip3 interactúan con los receptores de membrana y qué dominios Vip3 están involucrados. La comprensión del papel de la unión específica a los receptores de membrana es fundamental para determinar su especificidad. Como uno de los objetivos de esta tesis nos propusimos encontrar las condiciones idóneas para analizar la unión de 125I-Vip3Af a vesículas de membrana de borde en cepillo (BBMV) de larvas de insectos susceptibles a dicha toxina. Las especies escogidas fueron S. frugiperda y Spodoptera exigua. Intentos previos en nuestro grupo de investigación fueron infructuosos en cuanto a poder demostrar la unión específica de la Vip3Af a BBMV de estas especies, incluso utilizando las mismas condiciones que se habían puesto a punto para la Vip3Aa. Finalmente pudimos comprobar que la presencia de NaCl interfería en la unión de manera que, eliminando esta sal en el tampón usado en la reacción de unión ligando-receptor, dio lugar a la obtención de las condiciones apropiadas para demostrar la unión específica de la toxina Vip3Af a las BBMV de dichas especies. La unión específica se demostró en ensayos de competencia de la toxina marcada con concentraciones crecientes de la misma toxina no marcada (competidor homólogo). Una vez establecidas estas condiciones, pudimos realizar competencias heterólogas (usando como competidor una toxina distinta a la marcada). Los resultados revelaron que Cry1Ac y Cry1F no competían por los sitios de unión de Vip3Af. Sin embargo, Vip3Aa compitió completamente con la Vip3Af marcada, lo que indica que ambas comparten los mismos sitios de unión en la membrana. Usando Vip3Ca como competidor heterólogo observamos que, aunque había competencia por los sitios de Vip3Af, ésta no era completa, es decir, Vip3Ca no bloqueaba completamente la unión de Vip3Af a las BBMV, aunque sí parcialmente. Esto significa que comparte ciertos sitios pero no todos los utilizados por Vip3Af. Los estudios de unión por competencias heterólogas son una herramienta potente que proporciona información sobre el potencial de resistencia cruzada entre las toxinas Bt, ya que la alteración de los sitios de unión es el principal mecanismo de resistencia a las proteínas Cry. Todos los estudios realizados con insectos resistentes a las proteínas Cry o Vip3A han demostrado una falta de resistencia cruzada significativa entre estas dos familias de proteínas, lo que está respaldado por el hecho de que no comparten sitios de unión. Nuestros resultados con S. exigua y S. frugiperda apoyan la ausencia de sitios de unión compartidos entre las proteínas Cry1 y Vip3. El hecho de haber encontrado sitios comunes para las proteínas Vip3 respalda el hecho de que se haya encontrado resistencia cruzada entre Vip3Aa y Vip3Ca. Mediante el uso de mutantes Ala de Vip3Af inestables a la tripsina, hemos podido generar y purificar moléculas truncadas de Vip3Af con una composición de dominios diferente, aun así manteniendo la estructura tetramérica. Esta estructura se mantiene siempre y cuando se mantengan los dominios I a III. La falta de dominios IV-V no afecta a que se pueda mantener dicha estructura. A partir de tres mutantes Ala de Vip3Af (W552A, I699A y F229A) pudimos generar las moléculas DI-III y DI-IV, que mantienen la estructura tetramérica, y las moléculas DIV y DIV-V. Los dominios IV y V contienen los módulos de unión de carbohidratos y no pueden formar estructuras tetraméricas en ausencia del resto de la proteína. Usando estas moléculas Vip3Af truncadas (DI-III, DI-IV, DIV-V y DIV), producidas por tratamiento con tripsina, encontramos que solo aquellas moléculas que contienen los dominios I a III (DI-III y DI-IV) pudieron competir con la proteína 125I-Vip3Af activada y que las moléculas que solo contenían el dominio IV o los dominios IV y V (DIV y DIV-V) no pudieron competir con Vip3Af. Estos resultados indican que la estructura tetramérica es crucial para poder unirse a las BBMV. Posteriormente realizamos estudios similares de competencias usando la proteína truncada 125I-DI-III. Solo aquellas moléculas que retienen los dominios I a III fueron capaces de competir con la molécula 125I-DI-III por la unión de BBMV. Del mismo modo, y al igual que con 125I-Vip3Af, las proteínas nativas Vip3Af y Vip3Aa desplazaron completamente la unión de la molécula truncada de 125I-DI-III, mientras que Vip3Ca compitió solo parcialmente. También hemos analizado el papel funcional de las moléculas truncadas midiendo su toxicidad para las células Sf21. De acuerdo con los datos de unión, solo la proteína Vip3Af activada con tripsina y las moléculas truncadas que mantienen los dominios I a III eran tóxicas para estas células, lo que indica que la unión observada a las células era funcional. Nuestros resultados están de acuerdo con los publicados con fragmentos de Vip3Aa clonados usando ensayos de unión celular basados en fluorescencia con células Sf9 (aunque no demostraron su funcionalidad). Los resultados de la unión in vitro a BBMV y a las células Sf21, junto con el análisis funcional (toxicidad para las células Sf21), junto con los resultados de otros autores, indican claramente que los dominios I a III son fundamentales para mantener el núcleo funcional de las proteínas Vip3. El dominio III contiene tres láminas antiparalelas que forman un pliegue de prisma β sorprendentemente similar al que se encuentra en las proteínas Cry. Por lo tanto, es un candidato fuerte para ser el dominio que interactúa con el receptor de membrana, ya sea solo o en combinación con el dominio II o los dominios I + II. Estos resultados proporcionan evidencia del papel crítico de los dominios N-terminales (dominios I a III) en el modo de acción de Vip3Af y probablemente todas las proteínas Vip3. Aunque los dominios variables C-terminales IV y V no parecen desempeñar un papel en la unión in vitro y en la toxicidad de las células de cultivo Sf21, se ha demostrado ampliamente que las mutaciones en esos dominios disminuyen drásticamente la actividad insecticida de la proteína Vip3A. El que su presencia sea necesaria para la toxicidad in vivo podría deberse a que los dominios IV y V puedan tener la función de acercar la toxina a la membrana uniéndose a abundantes moléculas glicosiladas (que pueden no estar presentes en las células Sf21), de forma similar a la función de la aminopeptidasa N con la proteína Cry. También es probable que su función in vivo sea aumentar la estabilidad de la estructura tetramérica frente a proteasas del lumen. El estudio de la capacidad de las poblaciones de insectos para desarrollar resistencia es importante para preservar el uso de productos insecticidas Bt y de cultivos Bt. La información sobre las bases genéticas y bioquímicas de la resistencia nos proporciona herramientas para poder hacer frente a esta potencial amenaza. A falta de poblaciones resistentes de campo, es necesario utilizar poblaciones resistentes obtenidas en laboratorio para poder estudiar los mecanismos moleculares implicados en la resistencia. En el presente estudio se sometieron tres subpoblaciones de M. separata, recolectadas en campo, a selección en laboratorio con proteínas Vip3Aa, Cry1Ab y Cry1F. Estas proteínas están siendo actualmente utilizadas en cultivos comerciales de maíz Bt, el cual presenta una alta protección frente a insectos plaga del maíz. Sorprendentemente, la cepa de M. separata resistente a Vip3Aa (> 3061 veces) se obtuvo rápidamente después de 8 o 9 generaciones de selección en laboratorio. Sin embargo, no se obtuvo resistencia notable seleccionando con Cry1Ab o Cry1F en la misma población y durante el mismo número de generaciones. En un estudio realizado por otros investigadores, también se encontró una respuesta rápida similar a la selección de Vip3Aa en H. virescens, alcanzando un nivel de resistencia > 2300 veces mayor en la décima generación. Es importante hacer notar que esta rápida evolución de la selección en condiciones de laboratorio contrasta con los resultados obtenidos con las proteínas Cry1, tanto en nuestro trabajo como por otros autores: una la población de O. furnacalis adquirió un nivel de resistencia a Cry1Ab de alrededor de 100 veces sólo después de 35 generaciones de selección; de manera similar, una población de O. nubilalis desarrolló una resistencia de más de 3000 veces a Cry1F después de 35 generaciones de selección. Esta diferencia en respuesta a la selección, además de reflejar una frecuencia mucho mayor de alelos de resistencia para Vip3Aa, puede sugerir diferencias en los mecanismos de resistencia a las proteínas Vip3Aa y Cry1, lo cual queda en evidencia cuando se estudia la unión de Vip3A a BBMV de insectos resistentes El análisis de la unión de 125I-Vip3Aa a BBMV de larvas de M. separata tanto de insectos susceptibles y resistentes no reveló ninguna diferencia de unión, ya sea cualitativa o cuantitativa. Los resultados sugieren que la unión alterada a los receptores de la membrana del intestino medio no es el principal mecanismo de resistencia a la proteína Vip3Aa. Numerosos estudios han demostrado que la alteración de los receptores de membrana es un mecanismo evolutivo común que confiere altos niveles de resistencia a las proteínas Cry, pero nunca se ha establecido su relación con la resistencia a Vip3A. Las diferencias de unión cualitativas o cuantitativas entre insectos susceptibles y resistentes están en línea con los resultados anteriores con otras cepas resistentes a Vip3Aa de otras especies de insectos para las que no se encontraron diferencias de unión a Vip3Aa. Otros estudios han encontrado una activación más lenta de Vip3Aa por el jugo del intestino medio de las larvas de H. armigera en insectos resistentes a Vip3Aa comparados con los insectos susceptibles, aunque estas pequeñas diferencias no parecen ser la razón principal de los altos niveles de resistencia en dicha cepa. En otro estudio, larvas de H. virescens resistentes a Vip3Aa mostraron niveles drásticamente reducidos de fosfatasa alcalina unida a la membrana, pero no se pudo demostrar su participación en la resistencia. Por lo tanto, a diferencia de las proteínas Cry, la unión alterada a los receptores de membrana no parece ser el principal mecanismo de resistencia a las proteínas Vip3Aa, y deben explorarse otros mecanismos, tales como cambios en otros pasos en el modo de acción de Vip3Aa, ya sea antes (como la activación por proteasas o el secuestro de la toxina por la matriz peritrófica) o después (formación de poros, transducción de señales, apoptosis, ruptura de mitocondrias, etc.) de la unión a la membrana. Estos resultados sugieren que los alelos para la resistencia a Vip3Aa parecen ser relativamente comunes y, por lo tanto, el uso de proteínas Vip3A solas, sin combinarlas con proteínas Cry, no es una estrategia adecuada para la implementación a largo plazo de esta tecnología en el control de plagas. La acción sinérgica encontrada para algunas combinaciones de proteínas Vip3Aa y Cry1 también favorece el uso combinado de estos dos tipos de proteínas insecticidas para un uso mejor y más prolongado de la tecnología de cultivos Bt. En conclusión, en esta tesis analizamos el potencial insecticida de varias proteínas Vip3 y Cry, e intentamos ver la mejor estrategia de su uso combinado (o estrategia piramidal) en cultivos Bt. Los resultados de este estudio serán una referencia importante para subsiguientes desarrollos y aplicaciones de formulaciones de productos basados en Bt, así como los cultivos Bt. Además, los resultados de la identificación del mapa de cinco dominios de la proteína Vip3Af son importantes para entender la relación estructura-función de las proteínas Vip3. Los dominios I a III se han identificado como críticos para mantener el tetrámero y la unión específica a BBMV, que son fundamentales para arrojar luz sobre el modo de acción de las proteínas Vip3. Estos resultados han contribuido a la elucidación de su estructura 3D. Además, la mutación M34L podría incrementar la actividad insecticida, y la identificación de que el residuo 483 ha de ser un residuo ácido, mientras que el 552 un residuo aromático, nos abren la puerta a mejorar la actividad de las proteínas Vip3 mediante ingeniería genética teniendo en cuenta estas limitaciones. Los estudios de unión ligando-receptor, especialmente los de competencias heterólogas, han permitido elaborar un "modelo de receptores" que pone de manifiesto la no utilización conjunta de sitios de unión por las proteínas Cry1 y Vip3. El estudio de la resistencia cruzada llevado a cabo con cepas resistentes está del todo de acuerdo con nuestro "modelo de receptores", en cuanto que no se ha encontrado resistencia cruzada entre proteínas Cry y Vip3. En general, los resultados de esta tesis contribuirán de manera importante al futuro uso y aplicación de las proteínas Vip3 para el beneficio de la agricultura y el medio ambiente.