[en] The greatest advances in the biomedical field would not have been possible without microscopy. The higher the resolution of the image obtained, the more details one can know about the sample. In the last few decades, microscopy have progressed from differentiating objects at millimetres of distance to the nanoscale. The latter accuracy is achieved using the contemporary super resolution microscopy, including Single Molecule Localization Microscopy, examples of which are the fluorescence microscopy techniques PALM and STORM. This kind of imaging method is done by stochastically activating and deactivating a set of fluorescent molecules distributed in a sample, taking a picture of it with a CCD camera in every switch, and then processing all the frames to obtain a final image. However, nowadays precision is of tens of nanometres, which suggests that there is still room for improvement. Furthermore, the state?of?the?art super resolution techniques still exhibit certain drawbacks such as overlapping between emitters PSFs and the difficulty to make molecular tracking especially due to photobleaching. Therefore, some techniques have recently been developed to improve super resolution microscopy, such as MINFLUX and DeepSTORM. MINFLUX aims to minimize the number of emitted photons required for the localization of molecules with the main objective of being able to do molecular tracking, while DeepSTORM focuses on eliminating the overlapping of PSFs using a Deep Learning algorithm to create a phase mask that generates a suitable PSF for this purpose. In this project both techniques are to be combined expecting to obtain highly accurate estimations of the emitters? two?dimensional positions with resolutions of units of nanometres, while avoiding overlapping of PSFs in highly dense samples and minimizing the number of photons emitted per fluorophore.

[es] Los mayores avances en el campo biomédico no habrían sido posibles sin la microscopía. Cuanto más alta es la resolución de la imagen obtenida, más detalles se pueden conocer de la muestra. En las últimas décadas, la microscopía ha progresado desde la diferenciación de objetos a milímetros de distancia hasta la nanoescala. Esta última precisión se logra utilizando la microscopía contemporánea de súper resolución, incluyendo la Microscopía de Localización de Moléculas Únicas, ejemplos de las cuales son las técnicas de microscopía de fluorescencia PALM y STORM. Este tipo de método de obtención de imágenes se realiza activando y desactivando estocásticamente un conjunto de moléculas fluorescentes distribuidas en una muestra, tomando una fotografía de la misma con una cámara CCD en cada cambio, y luego procesando todos los fotogramas para obtener una imagen final. Sin embargo, hoy en día la precisión es de decenas de nanómetros, lo que sugiere que todavía hay margen de mejora. Además, las técnicas de súper resolución de última generación todavía presentan ciertos inconvenientes como la superposición entre las PSF de los emisores y la dificultad de hacer seguimiento de la trayectoria molecular, especialmente debido al efecto conocido como photobleaching. Es por eso que recientemente se han desarrollado algunas técnicas para mejorar la microscopía de súper resolución, como MINFLUX y DeepSTORM. MINFLUX tiene por objetivo reducir al mínimo el número de fotones emitidos necesarios para la localización de las moléculas con el objetivo principal de poder hacer el seguimiento molecular, mientras que DeepSTORM se centra en eliminar la superposición de las PSF utilizando un algoritmo de Deep Learning para crear una máscara de fase (phase mask) que genere una PSF adecuada para este fin. En este proyecto se combinarán ambas técnicas esperando obtener estimaciones muy precisas de las posiciones bidimensionales de los emisores con resoluciones de unidades de nanómetros, evitando al mismo tiempo la superposición de PSF en muestras muy densas y reduciendo al mínimo el número de fotones emitidos por cada fluoróforo.