[en] Identification of higher-order oligomers localized in the plasma membrane is essential for understanding the decoding properties of molecular networks controlling cell-to-cell communication. Bioluminescence and fluorescence resonance energy transfer techniques (BRET and FRET, respectively) have been fundamental for the demonstration of homodimers and heterodimers of heptaspanning membrane receptors. We introduce a sequential BRET-FRET (SRET) approach that allows the identification of heteromers with three different heptaspanning membrane receptors. By means of SRET, complexes of cannabinoid CB1, dopamine D2 and adenosine A2A receptors, which are colocalized in striato-pallidal GABA neurons and importantly participate in motivational and motor control, have been identified in living cells. The interactions in these complexes involve hydrophilic intracellular domains that contain evolutionarily conserved arginine-rich epitopes, whose guanidinium groups form salt bridges with a phosphorylated serine or threonine residues from a CK1/2 consensus site. Experiments with selective mutation of these reactive amino acids demonstrated that each protomer in the A2A-CB1-D2 receptor heteromer contains two intracellular key domains that establish selective electrostatic interactions with intracellular domains of the other two protomers. Mutation-induced disruption of the quaternary structure of the A1-CB1-D2 receptor heteromer led to functional modifications (change in MAPK signaling), which allowed their identification in rodent brain tissue. A new mechanism by which cocaine modulates dopaminergic neurotransmission is described. Sigma-1 receptors heteromerizes with dopamine D1 receptors in living cells and cocaine binding to sigma-1 receptors induces significant structural changes in the D1-sigma-1 receptor heteromer. D1-sigma-1 receptor heteromerization introduces a new perspective to understand the molecular basis of cocaine addiction.

[es] La identificación de oligómeros formados por varios protómeros en la membrana plasmática es esencial para decodificar las propiedades de las redes moleculares que controlan la comunicación intercelular. En este estudio se combinan las técnicas de BRET (bioluminescense resonance energy transfer) y FRET (fluorescence resonance energy transfer) en una nueva técnica denominada SRET (sequential BRET-FRET), que permite la identificación de heterómeros formados por tres proteínas diferentes. Con la técnica de SRET y también con la combinación de las técnicas de BRET i complementación bimolecular (BiFC) se han identificado heterómeros de receptores de cannabinoides CB1, de dopamina D2 y de adenosina A2A en células vivas. El SRET y el BRET con BiFC son dos técnicas muy valiosas para identificar complejos heteroméricos de más de dos receptores de neurotransmisores, que va a permitir entender mejor la integración de las señales a nivel molecular. Los heterómeros de receptores acoplados a proteína G (GPCR) son complejos macromoleculares con características funcionales propias, diferentes de las de los receptores individuales. Se sabe muy poco sobre la estructura cuaternaria de los heterómeros de GPCR, responsable de las características funcionales propias de estos complejos. En este estudio, se muestra, por primera vez, una clara evidencia del papel de las interacciones electrostáticas en la formación de la estructura cuaternaria de los heterómeros entre los receptores A2A de adenosina, D2 de dopamina y CB1 de cannabinoides. Estos resultados nos permiten proponer el primer modelo de estructura cuaternaria de heteromultímeros de receptores. La proteína de unión de calcio, calmodulina (CaM), es capaz de unirse a la porción N-terminal del largo tercer bucle intracelular del receptor D2 de dopamina, en un epítopo rico en argininas que también se encuentra implicado en la unión a la proteína Gi/o y al receptor de adenosina A2A, en la formación del heterómero A2A-D2. En este estudio, se muestran evidencias de la interacción de la calmodulina con el receptor A2A y de la formación de oligómeros de receptores A2A-CaM-D2. Por otro lado, se han detectado cambios conformacionales en el oligómero de receptores A2A-CaM-D2 inducidos por calcio y se ha visto que el calcio modula de forma selectiva la señalización vía MAPK de los receptores A2A y D2 en el heterómero A2A-D2. Estos resultados pueden tener implicaciones en desórdenes de los ganglios basales debido a que los heterómeros de receptores A2A-D2 están siendo considerados como objetivo en el desarrollo de agentes antiparkinsonianos. Por otro lado, en este estudio se describe un nuevo mecanismo mediante el cual la cocaína modula la función de los receptores D1 de dopamina. Por primera vez, se demustra la capacidad de los receptores sigma-1 para heteromerizar con homómeros de receptores D1 de dopamina en células vivas. De acuerdo con una interacción molecular entre ambos receptores, la coexpresión de los receptores sigma-1 y dopamina D1 provoca una alteración de la distribución subcelular del receptor sigma-1 que se ve potenciada con la cocaína. La unión de la cocaína a los receptores sigma-1 provoca cambios estructurales en el heterómero y aumenta fuertemente la producción de AMPc inducida por los agonistas del receptor D1. Este efecto es debido al receptor sigma-1, ya que no se observa en células tratadas con ARNi para el receptor sigma-1 o en ratones KO para el receptor sigma-1. En conjunto, estos resultados demuestran que la cocaína puede ser capaz de modular la transmisión dopaminérgica mediada por el receptor D1, mediante la interacción con una de sus proteínas de unión, el receptor sigma-1. Estos resultados introducen una nueva perspectiva para entender las bases moleculares de la adicción a cocaína.