[ca] El virus de l'hepatitis B (VHB) afecta uns 296 milions de persones arreu del món, més del 5% coinfectades amb el virus de l'hepatitis delta (VHD), causant l'hepatitis vírica més greu. El VHD presenta un domini d'ARN auto-catalític, la ribozima, i una regió que codifica per l'única proteïna viral, l'antigen delta (HDAg). El VHD és un virus satèl·lit del VHB i inhibeix la seva expressió. El mecanisme d'aquesta inhibició encara no es coneix totalment. L'activació de l'interferó tipus I (IFN-I) i l'activació d'enzims mutagènics (APOBEC/AID o ADAR1) podrien desenvolupar un paper important. Ambdós virus presenten una elevada variabilitat genètica i circulen com una barreja dinàmica de variants estretament relacionades entre sí, denominades quasiespecies (QS). La seqüenciació massiva (NGS) permet un anàlisi complex de la QS així com l'estudi de la seva evolució i detecció d'haplotips minoritaris. Aquesta tesis té com a objectiu analitzar la variabilitat de la QS del VHD i del VHB mitjançant NGS. Està composada de dos estudis principals: • Estudi de la conservació i evolució de la QS de pacients amb hepatitis crònica delta (CHD) a la ribozima i la comparació amb la regió 5'HDAG. • Inspeccionar l'impacte del VHD en la variabilitat del VHB i el paper del IFN-I en un model de ratolí VHB-transgènic superinfectat, amb el receptor del IFNalfa/beta inactivat (IFNAR-KO). En el primer estudi es van recollir mostres longitudinals de sèrum de 25 pacients amb CHD i es va analitzar la QS mitjançant NGS (Miseq, Illumina) per a determinar la conservació de la ribozima i la seva evolució i comparar-la amb el 5'-HDAG. Es van analitzar in vitro les mutacions més rellevants observades en la ribozima. La QS de la ribozima estava globalment conservada, amb una regió hiperconservada (nt715-745). No es van observar diferències en la QS al llarg del temps. Es van detectar tretze mutacions, tres amb major freqüència: T23C, T69C i la deleció C64. Aquesta última va reduir 1log la replicació del VHD in vitro. En comparació amb el d'HDAG, aquest últim era el més complex i variable. La QS viral va evolucionar de forma diferent depenent de la regió analitzada. En el segon estudi, els ratolins HBVtg wildtype (WT) o IFNAR-KO van ser injectats amb vectors adenoassociats (AAV) amb VHD (superinfecció) o luciferasa (monoinfecció). L'expressió del VHB es va analitzar quantificant l'ADN i l'ARN circulants així com l'ARN intrahepàtic (ARNpg). La QS del ARNpg es va analitzar mitjançant NGS als 7-21 dies post-infecció (dpi) en les regions X i SRT del VHB i el 5'HDAG del VHD. El VHD va determinar una inhibició de l'ADN i l'ARN circulants del VHB, però limitada en el ARNpg. La QS del SRT va ser més complexa als 7dpi que als 21 dpi, a diferència del HBX. Es van identificar múltiples SNVs en ambdós temps, especialment transicions C->T (típiques de APOBEC/AID) en totes les condicions experimentals. Entre les variacions no comunes, algunes afectaven principalment als ratolins superinfectats i no semblaven estar associats amb l'activitat d'enzims mutagènics. La QS del VHD va ser més complexa en els ratolins WT que els KO, especialment als 21dpi, amb major freqüència de transicions G->A típiques de ADAR1. En l'estudi centrat en el VHD vam identificar una regió hiperconservada de la ribozima com a possible diana de teràpia gènica, i vam observar que la QS del 5'-HDAG evolucionava més ràpid que la ribozima. En el segon estudi, vam veure que els enzims mutagènics podien contribuir a la variabilitat del VHB i el VHD. Cal destacar que algunes mutacions, especialment en ratolins superinfectats, podrien produir-se de forma independent del IFN-I, suggerint que podrien estar implicades altres vies o inclús l'ARN polimerasa circular.

[es] El virus de la hepatitis B (VHB) afecta a unos 296 millones de personas, más del 5% coinfectadas con el virus de la hepatitis delta (VHD), causando la hepatitis vírica más grave. El VHD presenta un dominio de RNA auto-catalítico, la ribozima, y una región que codifica para la única proteína viral, denominada antígeno delta (HDAg). El VHD es un virus satélite del VHB e inhibe fuertemente la expresión de su "helper". No se conoce completamente el mecanismo de esta inhibición. La activación del interferón tipo I (IFN-I) y la activación de enzimas mutagénicas (APOBEC/AID o ADAR1) podrían ser relevantes. Ambos virus presentan alta variabilidad genética y circulan como una mezcla dinámica de variantes estrechamente relacionadas, denominadas quasiespecies (QS). La secuenciación masiva (NGS) permite un análisis complejo de la QS, además del estudio de su evolución y detección de haplotipos minoritarios. Esta tesis busca analizar la variabilidad de la QS del VHD y del VHB mediante NGS. Compuesta por dos estudios principales: • Estudio de la conservación y evolución de la QS de pacientes con hepatitis crónica delta (CHD) en la ribozima y su comparación con la región 5'HDAG. • Inspeccionar el impacto del VHD en la variabilidad del VHB y el papel del IFN-I en un modelo de ratón VHB-transgénico superinfectado, con el receptor del IFNalfa/beta noqueado (IFNAR-KO). En el primer estudio, se recogieron dos muestras longitudinales de suero de 25 pacientes con CHD y se analizó la QS mediante NGS (Miseq, Illumina) para determinar la conservación de la ribozima, su evolución y comparar esta última con el 5'-HDAG. Se analizaron in vitro las mutaciones más relevantes observadas en la ribozima. La QS de la ribozima estaba globalmente conservada, con una región híperconservada (nt715-745). No se observaron diferencias en el QS con el tiempo. Se detectaron trece mutaciones, tres con mayor frecuencia (T23C, T69C y deleción C64). La deleción C64 redujo 1log la replicación del VHD in vitro. En comparación con el 5'HDAG, éste era más complejo y variable. En términos de evolución, la QS viral evolucionó de forma diferente según la región analizada. En el segundo estudio, los ratones HBVtg wild-type (WT) o IFNAR KO fueron inyectados con vectores adenoasociados (AAV) con VHD (superinfección) o luciferasa (monoinfección). La expresión del VHB se analizó cuantificando el ADN y el ARN circulantes y el ARN intrahepático (ARNpg). La QS del ARN viral intrahepático se analizó mediante NGS a los 7 y 21 días post-infección (dpi) en las regiones X y SRT del VHB y el 5'HDAG del VHD. El VHD determinó una inhibición en el ADN y el ARN circulantes del VHB, pero limitada en el ARNpg. La QS del SRT fue más compleja a los 7dpi que a los 21dpi, a diferencia del HBX. Se identificaron múltiples SNVs en ambos tiempos, especialmente C->T transiciones (típicas de APOBEC/AID) en todas las condiciones experimentales. Entre las variaciones no comunes, algunas afectaban principalmente a los ratones superinfectados y no parecían estar asociadas con la actividad de enzimas mutagénicas. La QS del VHD fue más compleja en los ratones WT que en los KO, especialmente a los 21dpi, con mayor frecuencia de transiciones G->A típicas de ADAR1. En el estudio centrado en el VHD identificamos una región híperconservada de la ribozima como posible diana de terapia génica, y observamos que la QS del 5'-HDAG evolucionaba más rápido que la ribozima. En el segundo estudio, vimos que las enzimas mutagénicas podían contribuir a la variabilidad del VHB y el VHD. Destacamos que algunas mutaciones, especialmente en ratones superinfectados, podrían producirse independientemente del IFN-I, sugiriendo que podrían estar implicadas otras vías o incluso la ARN polimerasa celular.