[en] Volatile organic compound (VOC) emissions can cause different problems in the public health and in the environment, acting as a primary pollutant and allowing the formation of secondary pollutants as tropospheric ozone. Due to these problems VOC emissions are regulated in many countries, such as USA and the European Union, in this case by the Council Directive 2010/75/EU. Because of the use of solvents in its productive process, flexographic industry is one of the major contributors to the emissions of these compounds, and biological techniques have been considered as one of the best available technologies for the treatment of VOC emissions in this industrial sector. Among these processes, a new technology the anaerobic bioscrubber is emerging as a feasible technology (patent number WO2015114436A1). In this process, VOC are transferred from the gas phase (air emission) to the liquid phase (water) and then transformed into biogas in an anaerobic expanded granular sludge bed (EGSB) reactor. So, the VOC emissions can be converted into bioenergy. However, the use of EGSB reactors for this process has some inherent barriers as the lack of information about the anaerobic degradation of some of the compounds typically used in the flexographic industry or the loss of biomass in the effluent due to the use of a high up flow liquid velocity. For this last aspect, an alternative configuration to the EGSB reactors should be studied in order to avoid the biomass leakage. In this regard, an anaerobic hybrid reactor configuration, which consists in the installation of a filter of polypropylene rings inside the gas-liquid-solid separator in the upper zone of the reactor, seems to be a good alternative to improve the biomass retention capacity of the EGSB reactors. Furthermore, the flexographic industry uses synthetic organic solvents as glycol ethers, such as 1-ethoxy-2-propanol and/or 1-methoxy-2-propanol, but the anaerobic biodegradation of mixtures of these compounds remain unknown yet. In addition, in the literature there is also barely information available about the possible negative or toxic effect of these glycol ethers on the microbial population responsible of the biotransformation of VOC emission into biogas. In this regard, different molecular techniques, as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and high throughput sequencing technologies, are available to characterize the microbial community and to analyse the microbial evolution in biological systems, such as anaerobic reactors, which can be helpful to check these negative or toxic effects by the presence of some of these solvents. In this context, the main objectives of this PhD thesis are: i) to evaluate an alternative reactor to the EGSB reactor to improve the biomass retention capacity and the performance of a reactor treating glycol ethers and ethanol mixtures; ii) to study the pathways for the anaerobic degradation of glycol ethers as 1-ethoxy-2-propanol (E2P) and 1-methoxy-2-propanol (M2P) used in the flexographic industry and the possible impact on the microbial community; iii) to evaluate the effect of the ethanol / glycol ethers ratio in an EGSB reactor treating mixtures of these compounds; and iv) to compare the performance and microbial communities from laboratory scale reactors and an industrial prototype reactor. An alternative configuration based on the modification of the EGSB with a filter of polypropylene rings, called anaerobic hybrid reactor (AHR), has been compared with the conventional EGSB (control reactor). Both reactors were operated at the same conditions and the experiment was divided in seven stages (from S-I to S-VII). First (S-I), the organic loading rate (OLR) was increased step by step up to 45 kg chemical oxygen demand (COD) m-3 d-1 using a readily biodegradable substrate such as ethanol, then E2P was introduced (S-II and S-III), resulting in a binary mixture of ethanol and E2P, and the total OLR was maintained around 45 kg COD m-3d-1. After that, M2P was also introduced as a new substrate in the reactor feed (ternary mixture of ethanol, E2P and M2P) maintaining the same total OLR (S-IV). Later on, the feeding was switched off to simulate a long-term shutdown of production process, which typically occurs in the printing facilities, and so to check the influence of a long starvation period (S-V). Then, reactors were restarted again by increasing the OLR, step by step with the ternary mixture, and finally, in the last stage the proportion of M2P was slightly increased (S-VI and S-VII). Proportion of glycol ethers in this experiment was always lower than 30% in weight. Results showed a high performance of both reactors with global removal efficiencies (RE) higher than 92% even treating OLR of 54 kg COD m-3 d-1 and RE only decreased below 90% in both reactors during the first days after the feeding of E2P, indicating that biomass was not adapted to this solvent and an adaptation period was needed to be able to metabolize it. The adaptation period was also observed in the evolution of RE of E2P, as only around 20% RE was achieved in both reactors when this compound was introduced, but after 40 - 50 days the RE of E2P increased to 80% and maintained during all the experimental period. Regarding M2P, RE was almost complete (100%) immediately after its introduction in the reactor feed and no adaptation period was needed, which would suggest that both glycol ethers have the same mechanism of degradation. Furthermore, the removal of M2P was practically complete along all the experimental period, even after the increased in its proportion in the feed (S-VII). In addition, during the first days of exposure to the glycol ethers, some intermediate products of their degradation (methanol, acetone and isopropanol) were detected and identified, allowing the clarification of the anaerobic degradation pathways of these compounds. Regarding the biomass retention capacity, the accumulated solids in the effluent (563.2 g in the EGSB reactor and only 293.7 g in the AHR) showed that the AHR had a higher biomass retention capacity than the EGSB reactor. However, the filter installed in the AHR was finally clogged and the rings of the filter had to be replaced by new polypropylene rings to maintain its higher biomass retention capacity. Despite the higher biomass concentration in the AHR, both reactors performed similarly. These results, included in the Chapter 4 of this PhD thesis, have been published in the Journal of Environmental Management (Ferrero, P., San-Valero, P., Gabaldón, C., Martínez-Soria, V., Penya-roja, J.M., 2018. Anaerobic degradation of glycol ether-ethanol mixtures using EGSB and hybrid reactors: Performance comparison and ether cleavage pathway. J. Environ. Manage. 213, 159–167). The dynamics of the microbial community of both reactors was also analysed using different molecular tools, such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and high throughput sequencing technologies. These analyses revealed an important impact in the microbial populations caused by the introduction of both glycol ethers (E2P and M2P). DGGE technique showed an evolution in the bacterial community from the beginning to the end of the experiment. So, some initially predominant bands (inoculum and/or early stages) decreased their intensity in later stages, and the opposite happened with other bands, which appeared or increased their intensity even becoming predominant with the evolution of the experiment. In addition, DGGE also evidenced that sludge bed of both reactors behaved as a mixed reactor, as the same microbial community structure was found in the bottom and in the top ports of both reactors. qPCR results indicated a toxic effect of the glycol ethers over the bacterial and archaeal populations, as both population concentrations decreased after the introduction of E2P. Later, the population concentration values were recovered after 30 days of exposure to this solvent, which also indicated the necessity of an adaptation period of the microorganisms to degrade anaerobically E2P. Besides, when M2P was afterwards introduced into the feed, no negative influence in the concentration of the bacterial population was found, demonstrating that M2P was anaerobically degraded in the same pathway that E2P, so the bacterial population was already adapted to this substrate (M2P). In contrast, archaeal populations as Methanobacteriales and Methanomicrobiales showed a decreased in their population concentrations after the introduction of M2P and also after the increased in the OLR of this substrate, which suggest a toxic effect of M2P over these archaeal populations. Additionally, the results of high throughput sequencing technique emphasized the importance of the type of substrate over the predominance evolution of the microbial communities along the experimental period. Through this technique, Proteobacteria phylum was observed as the predominant phylum when reactors were fed only with ethanol as carbon source, and the predominance of this phylum was replaced by Firmicutes when glycol ethers, especially M2P, were introduced as substrates. This study, included in Chapter 5, was developed in collaboration with the 'Laboratoire du Génie de l'Environment Industriel, IMT Mines Alès, Université de Montpellier' during a research stay carried out under the supervision of Professor Luc Malhautier. Recently, it has been sent for its publication to the journal Bioresource Technology (Ferrero et al., 2018. Link between the anaerobic degradation of glycol ether-ethanol mixtures using EGSB and hybrid reactors and the dynamics of the microbial community structure, Bioresour. Technol. Submitted for decision). To complete the previous study an experiment with high proportion of glycol ethers was carried out using an EGSB reactor. This experiment was divided in 8 stages. First, from stage I to stage III, the start-up of the reactor was carried out using ethanol as only carbon source, increasing the OLR in these stages up to a value of 45 kg COD m-3 d-1. Then, in the following stages (IV-VII), ethanol was progressively replaced by E2P and M2P maintaining the OLR constant at 45 kg COD m-3 d-1, until the last stage (VIII) where only the glycol ethers were fed into the reactor. Reactor had a high performance (RE >95%) during the start-up period, and when glycol ethers were introduced global RE dropped initially to 80% and then it was recovered to 90%, showing again the corresponding adaptation period. Later, when ethanol was progressively replaced by glycol ethers in the feed the global RE slightly decreased, and in the last stage (VIII) where only E2P and M2P (without ethanol) were fed into the reactor, global RE diminished to 80% indicating that the removal of glycol ethers could not be complete. Regarding the individual RE of each compound, a low RE was registered during the first days of exposure to each compound (≈20%), but thereafter their maximum RE were achieved. The maximum RE of E2P was around 70% and it was achieved after 15 days of exposure, while the maximum RE of M2P was 100% and it was achieved after 24 days of exposure. Furthermore, in this last stage (VIII) without ethanol in the feed, a partial degranulation of the sludge bed was observed, which could suggest, among other things, that ethanol is a necessary substrate to maintain the granular structure of the sludge. Extracellular polymeric substances (EPS) content and the microbial community of both kind of final sludges (granulated and degranulated) were studied, revealing that the microbial community of both sludges was almost identical, which indicate that fast changes in the physico-chemical properties of the granular sludge did not cause any change in the structure of the microbial populations. However, the EPS content analysis showed a lower concentration of protein and polysaccharide in the degranulated biomass than in the granulated one, which indicates that the loss of these compounds should be related to the degranulation process. Additionally, specific methanogenic activity (SMA) of each sludge was determined using as substrate both only ethanol or a mixture of ethanol and glycol ethers. Results of SMA analysis demonstrated that: 1) an adaptation period to degrade glycol ethers is needed; and 2) the anaerobic degradation of ethanol carried out by the granular sludge was faster than obtained with the degranulated sludge. This study, included in Chapter 6, has been prepared to be sent for its publication to the journal Applied Microbiology and Biotechnology (Ferrero et al. 2018. Behaviour, stability, and microbial community analysis of EGSB reactor at hihg content of glicol ether solvents in mixtures with etanol. Appl. Microbiol. Biotechnol, ready to be submitted). In the last part of this document, a comparison of the microbial community structure of laboratory reactors and a prototype scale reactor has been shown. For this purpose, samples of biomass of an industrial prototype reactor installed and operated in a printing facility were collected, analysed and compared with those obtained in a laboratory control reactor. The on-site prototype reactor treated mainly ethanol, ethyl acetate and E2P. Typical fluctuations in the OLR derived from changes in the production process of the facility were observed. In spite of these fluctuations stable performance of the reactor was achieved (average RE of 93%) and volatile fatty acids were only accumulated when the organic load was higher than 3 kg COD h-1, which suggested a limit OLR that can be used for assuring the stable operation of the reactor. The microbial community structure was analysed through the DGGE technique and it showed an evolution during the first months of operation in the domains Archaea and Bacteria. Taking into account that the initial inoculum was obtained from a brewery treatment plant, the limitation of the carbon source to only a few organic solvents inherent to the flexographic emissions was suggested to be the cause of this shift. Archaeal populations were the most affected by this change in the carbon source, resulting in a diminution of the biodiversity as the Shannon index showed (from 1.07 to 0.41 in the first 123 days of experiment). Methanosaeta was the dominant microorganism in this domain, and its dominance persist during all the experimental period. The proportion of the archaea Methanospirillum and Methanobacterium increased along the experimental period, which was related to variations in the temperature and in the load, respectively. Regarding the domain of Bacteria, species from Geobacter and Pelobacter genera, which are microorganisms specialised in the ethanol degradation, were the predominant microorganisms. Besides, Methanosaeta and Geobacter are syntrophic partners able to use direct interspecific electron transference for methane production, so the predominance of these species indicated that this phenomenon occurred in the prototype reactor. Comparing laboratory and industrial prototype reactors, both performed similarly with high RE (>90%), showed a similar adaptation period for E2P degradation, and the only difference was the limit value for the organic load associated to the volatile fatty acid accumulation. The microbial community structure showed similar trends in both reactors, with an evolution from the initial sludge during the beginning of the operation in Archaea and in Bacteria. A stable community in the domain of Archaea was finally obtained with the predominance of Methanosaeta. In the domain of Bacteria the predominance of the microorganisms showed a dependence on the used substrate. These results have been published in the Journal of Environmental Management (Bravo, D., Ferrero, P., Penya-roja, J.M., Álvarez-Hornos, F.J., Gabaldón, C., 2017. Control of VOCs from printing press air emissions by anaerobic bioscrubber : Performance and microbial community of an on-site pilot unit. J. Environ. Manage. 197, 287-295)

[es] Antecedentes La emisión de compuestos orgánicos volátiles (COVs) puede causar diferentes problemas en la salud pública y en el medio ambiente, actuando como contaminantes primarios y permitiendo la formación de contaminantes secundarios como el ozono troposférico. Debido a estos problemas, la emisión de COVs está limitada en muchos países tales como EEUU o los pertenecientes a la Unión Europea, en este caso regulado por la directiva 2010/75/EU. Debido al uso de disolventes en su proceso productivo, la industria flexográfica es uno de los sectores que más contribuye a la emisión de este tipo de compuestos, y las técnicas biológicas han sido consideradas como una de las mejores disponibles para el tratamiento de emisiones de COVs en este sector industrial. En este sentido, la transformación de emisiones de COVs en bioenergía podría ser considerada como un proceso emergente y viable que para llevar a cabo este tratamiento, pudiéndose destacar una nueva tecnología para ello: el biolavador anaerobio. En este proceso, los COVs son transferidos de la fase gas (emisión gaseosa) a la fase líquida (agua) y después son transformados en biogás en un biorreactor, pudiéndose destacar el uso del reactor anaerobio de lecho fluidizado (EGSB, por sus siglas en inglés). Sin embargo, el utilización de reactores EGSB en este proceso presenta algunas barreras inherentes al proceso, como la escasa información existente acerca de la degradación anaerobia de algunos compuestos típicamente utilizados en la industria flexográfica, o la pérdida de biomasa en el efluente debido al uso de una elevada velocidad ascensional. Con relación a este último aspecto, el estudio de la operación empleando una configuración alternativa al reactor EGSB, conocida como configuración hibrida, para evitar la pérdida de biomasa ha mostrado resultados prometedores en estudios previos. Así por ejemplo, una configuración de reactor híbrido anaerobio, consistente en la instalación de un filtro en la zona superior del reactor donde se ubica el separador gas-líquido-sólido, podría llegar a ser una buena alternativa para mejorar la capacidad de retención de la biomasa en los reactores EGSB. Por otro lado, la industria flexográfica emplea con frecuencia disolventes orgánicos sintéticos del tipo éteres glicólicos pudiéndose destacar entre ellos el 1-etoxi-2-propanol (E2P) y/o el 1-metoxi-2-propanol (M2P). No obstante, la biodegradación anaerobia de mezclas con estos compuestos era prácticamente desconocida. Además, apenas hay información disponible en la bibliografía sobre el posible efecto negativo o los efectos tóxicos que estos éteres glicólicos pueden tener en la población microbiana anaerobia. En este sentido, la aplicación de diferentes técnicas moleculares, como la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o técnicas de secuenciación masiva, pueden ser de utilidad para caracterizar las comunidades microbianas y para analizar su evolución en sistemas biológicos como los reactores anaerobios. Alcance y objetivos Los objetivos generales de esta tesis doctoral son: i) evaluar una alternativa al reactor EGSB para mejorar la capacidad de retención de biomasa y el rendimiento del reactor tratando mezclas de éteres glicólicos y etanol; ii) estudiar las rutas de la degradación anaerobia de los éteres glicólicos, M2P y E2P, utilizados en la industria flexográfica y el posible impacto que podrían causar en la comunidad microbiana; iii) evaluar el efecto de la relación etanol / éteres glicólicos en un reactor EGSB tratando mezclas de estos compuestos; y iv) comparar el rendimiento y la evolución las estructuras de las comunidades microbianas entre los reactores a escala de laboratorio y un prototipo industrial. Para alcanzar estos objetivos generales se han establecido los objetivos específicos descritos a continuación, correspondientes a los cuatro capítulos de resultados en los que se ha estructurado la tesis (capítulos del 4 al 7). Los objetivos específicos del capítulo 4 titulado "Degradación anaerobia de mezclas de etanol y éteres glicólicos en reactores EGSB e híbrido: Comparación del rendimiento y mecanismo de ruptura del enlace éter" son: • Evaluar la viabilidad de la degradación anaerobia de una mezcla típica de disolventes presentes en la emisión de la industria flexográfica, especialmente los éteres glicólicos como M2P y E2P en un reactor EGSB. • Determinar el comportamiento de un reactor EGSB híbrido modificado con un lecho de anillos de polietileno en la zona superior del reactor donde se lleva a cabo la separación gas-líquido-sólido y comparar la capacidad de retención de biomasa de este reactor con la de un reactor control EGSB. • Profundizar en el estudio de los mecanismos implicados en la ruptura del enlace éter en la degradación anaerobia de los éteres glicólicos M2P y E2P. Los objetivos específicos del capítulo 5 titulado "Degradación anaerobia de mezclas de etanol y éteres glicólicos en reactores EGSB e híbrido: Estudio de la comunidad microbina" son: • Investigar la dinámica de la comunidad microbiana utilizando técnicas de biología molecular para mejorar la comprensión del proceso. • Evaluar la estratificación microbiana en reactores anaerobios de alta carga con elevadas velocidades de flujo ascendente (≈10 m h-1). • Determinar el impacto de la introducción de los éteres glicólicos M2P y E2P en las poblaciones microbianas. Los objetivos específicos del capítulo 6 titulado "Análisis del comportamiento, estabilidad y comunidad microbiana de un reactor EGSB tratando mezclas de disolventes de éteres glicólidos a concentraciones elevadas en mezclas con etanol" son: • Determinar la influencia de la disminución de la proporción de etanol en la estabilidad del fango granular anaerobio y en las comunidades microbianas. • Evaluar el rendimiento y la capacidad de eliminación de los éteres glicólicos M2P y E2P cuando estos son mayoritarios en el alimento. • Analizar la comunidad microbiana en el reactor al tratar relativamente altos valores para las M2P y E2P. Los objetivos específicos del capítulo 7 titulado "Análisis de la comunidad microbiana de un prototipo de biolavador anaerobio tratando emisiones de COVs de una empresa del sector flexográfico" son: • Evaluar las comunidades microbianas en un prototipo de reactor instalado en una industria flexográfica. • Vincular la evolución microbiana con las condiciones de operación y la fuente de carbono presente en las emisiones industriales. • Comparar el rendimiento de la operación y las poblaciones microbianas presentes en los reactores a escala de laboratorio y el prototipo industrial. Materiales y métodos En la presente tesis doctoral se realizaron ensayos a escala de laboratorio simultáneamente en diferentes reactores EGSB, todos ellos con idénticas dimensiones. El volumen efectivo de lecho de fango de cada reactor era de 4 L (1.205 m de altura con un diámetro de 0.065 m) y un volumen total de 19 L incluyendo el elemento de separación Gas/Líquido/Sólido (ubicado a una altura de 1.20-1.60 m) e instalado en la parte superior. La temperatura de los reactores se mantuvo a 25 °C, empleando un sistema de camisa externa con recirculación de agua de un baño termostatizado. En uno de estos reactores se introdujo un relleno compuesto por anillos de polietileno en la parte superior donde se producia la separación de las fases (situado entre 1.40 y 1.57 m en el reactor). Este reactor modificado constituye una configuración alternativa a la convencional, a la que se ha denominado como reactor híbrido anaerobio (AHR, por sus siglas en inglés). Cada uno de estos reactores anaerobios estaba equipado con dos bombas peristálticas que proporcionaron los caudales volumétricos establecidos tanto del alimento, habitualmente 10 L dia-1, y de recirculación deseados, fijado en 32 L h-1, para proporcionar una velocidad ascensional de alrededor de 10 m h-1 en el lecho de fango y de alrededor de 1.0 m h-1 en la zona superior de separación Gas/Líquido/Sólido. En todos los estudios realizados, la puesta en marcha se llevó a cabo inoculando al reactor 4 L de un fango anaerobio granular procedente de una planta de tratamiento de una empresa de fabricación de cerveza. Se incrementó paulatinamente la carga orgánica alimentada manteniendo constante el caudal y aumentando progresivamente la concentración de los compuestos orgánicos (expresada como demanda química de oxigeno, kg DQO m-3 d-1). El alimento al reactor estaba tamponado con bicarbonato sódico a una concentración de 5 g NaHCO3 L-1 y contenía una concentración de magnesio y calcio de 40 mg L-1, además de la ajustada cantidad de los diferentes micronutrientes necesarios. Las primeras etapas de la puesta en marcha se hicieron alimentando únicamente etanol, y posteriormente se incorporaron los éteres glicólicos, E2P y M2P, en diversas proporciones según el experimento diseñado. Periódicamente se analizaron las principales características del efluente líquido de los reactores: concentraciones de DQO, de los distintos COVs, de ácidos grasos volátiles (AGV), y sólidos suspendidos principalmente. El caudal y composición del biogás producido también fue regularmente monitoreado. En el capítulo 4 de esta tesis, el funcionamiento a escala de laboratorio de un reactor EGSB convencional (control) se comparó con el de un reactor con la configuración alternativa que pudiese mejorar la capacidad de retención de biomasa, un AHR. Ambos reactores fueron operados durante más de 300 días bajo idénticas condiciones y el experimento fue dividido en siete etapas donde se varió la carga y/o la composición del alimento. En las primera etapas, la velocidad de carga orgánica (OLR, por sus siglas en inglés) se aumentó paulatinamente hasta 45-55 kg DQO m-3 d-1 utilizando un sustrato fácilmente biodegradable como etanol, para después introducir en posteriores etapas un éter glicólico, el E2P, dando lugar a una mezcla binaria de etanol y E2P, y la OLR total fue mantenida alrededor de 45 kg DQO m-3 d-1. En las siguientes etapas, se introdujo también M2P como nuevo sustrato en el alimento de los reactores (mezcla terciaria de etanol, E2P y M2P) manteniendo la OLR constante. Después, la alimentación se interrumpió para simular una parada larga del proceso productivo, típica en las industrias de impresión flexográfica, y así poder comprobar cómo afecta al reactor un largo periodo de ausencia de sustrato. Después, los reactores fueron puestos en marcha otra vez aumentando la OLR paulatinamente con la mezcla terciaria, y finalmente, en la última etapa la proporción de M2P fue ligeramente aumentada. La proporción de éteres glicólicos nunca superó el 30% en peso en estos experimentos. Para elucidar los mecanismos de reacción se empleó de forma paralela otro reactor EGSB convencional, donde tras la puesta en marcha, alimentando únicamente etanol hasta una OLR de 45 kg DQO m-3 d-1, se empleó una mezcla de etanol y acetona. En el capítulo 6 de esta tesis, y con el objetivo general de determinar la influencia en la degradación anaerobia de la relación etanol/éteres glicólicos, especialmente cuando estos últimos son mayoritarios, se describe el estudio experimental realizado empleando un reactor EGSB convencional a escala de laboratorio. El experimento fue dividido en 8 etapas. Entre la etapa I y la etapa III, se llevó a cabo la puesta en marcha del reactor empleando etanol como única fuente de carbono, aumentando la OLR en las distintas etapas hasta alcanzar un valor de 45 kg DQO m-3 d-1. Después, en las siguientes etapas, el etanol fue sustituido progresivamente por éteres glicólicos, E2P y M2P, manteniendo constante la OLR en 45 kg DQO m-3 d-1, hasta la última etapa donde los éteres glicólicos fueron la única fuente de carbono alimentada al reactor. En el capítulo 7, se llevó a cabo el estudio de la comparativa de la evolución y estructura de la comunidad microbiana presente entre los reactores a escala de laboratorio y un reactor prototipo instalado en una planta industrial del sector flexográfico. El funcionamiento operativo de este reactor prototipo, con unas características operacionales semejantes a las del reactor de laboratorio, no ha sido objeto de estudio o análisis en esta tesis, pero sí las características y dinámica de las poblaciones microbianas presentes en el mismo durante su puesta en marcha y operación. A lo largo de todos estos experimentos, tanto a escala de laboratorio como del prototipo, se tomaron muestras de biomasa en los reactores anaerobios. Estas muestras biológicas se caracterizaron empleando diversas herramientas moleculares principalmente, i) la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (o denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) en inglés); ii) la técnica de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (o quantitative polymerase chain reaction (qPCR) en inglés); y ii) tecnología de secuenciación masiva (en inglés high throughput sequencing technologies). El uso combinado de estas técnicas permitió determinar la biodiversidad microbiana, las abundancias de los diferentes órdenes y filos (bacterias, archaeas, metanosarcinales, metanomicrobiales y metanobacteriales), así como la identificación de las especies predominantes en las diferentes muestras, permitiendo relacionar el rendimiento de los reactores anaerobios con la estructura de las comunidades microbianas presentes, tal como se describe en los capítulos 5, 6 y 7. Resultados y Discusión En el estudio comparativo entre el reactor EGSB convencional (control) y el AHR, los resultados mostraron un alto rendimiento en ambos reactores con eficacias de eliminación (EE) globales mayores al 92% incluso tratando OLR de hasta 54 kg DQO m-3 d-1 y solo bajó por debajo del 90% en ambos reactores durante los primeros días después de la introducción de E2P en el alimento (S-II), indicando que la biomasa no estaba adaptada a este disolvente y se necesitaba un periodo de adaptación para poder de metabolizar este compuesto. Este periodo de adaptación fue también observado en la evolución de la EE del E2P, ya que ésta solo alcanzó un 20% en ambos reactores en el momento de la introducción de este compuesto, pero tras 40 días la EE del E2P aumentó hasta el 80% y se mantuvo a lo largo de todo el periodo experimental. Tras la introducción del M2P (S-IV), su eliminación fue completa (100%) desde el mismo momento de su introducción en el reactor, no apreciándose ningún periodo de adaptación lo que sugeriría que ambos éteres glicólicos presentan el mismo mecanismo de degradación. Además, la eliminación de M2P fue casi completa durante todo el periodo experimental (desde S-IV hasta S-VII), incluso después de aumentar su proporción en el alimento (S-VII). Durante los primeros días de introducción de los éteres glicólicos se detectaron e identificaron algunos productos intermedios de su degradación como son el metanol, la acetona y el isopropanol, lo que se pudo relacionar con la ruta de degradación anaerobia de estos compuestos. En cuanto a la capacidad de retención de biomasa, el AHR mostró una mayor capacidad de retención de biomasa que el reactor EGSB, como se comprobó a partir de los sólidos acumulados en el efluente de cada reactor (563.2 g en el reactor EGSB y solo 293.7 g en el AHR). Sin embargo, el filtro instalado en el AHR finalmente se colmató y los anillos del filtro tuvieron que ser reemplazados por nuevos anillos de polipropileno para mantener su capacidad de retención de biomasa. A pesar de la mayor concentración de biomasa en el AHR, ambos reactores mostraron un rendimiento similar a lo largo de todo el estudio. Estos resultados, que se recogen en el capítulo 4 de esta tesis, han sido publicados en la revista Journal of Environmental Management (Ferrero, P., San-Valero, P., Gabaldón, C., Martínez-Soria, V., Penya-roja, J.M., 2018. Anaerobic degradation of glycol ether-ethanol mixtures using EGSB and hybrid reactors: Performance comparison and ether cleavage pathway. J. Environ. Manage. 213, 159–167). A partir de las muestras de biomasa del estudio anterior, se analizó también la dinámica de la comunidad microbiana de ambos reactores usando diferentes técnicas de biología molecular, como la DGGE, la qPCR y la secuenciación masiva. Estos análisis revelaron un importante impacto en las poblaciones microbianas causadas por la introducción de ambos éteres glicólicos (E2P y M2P). La técnica DGGE mostró una evolución en la comunidad bacteriana desde el principio hasta el final del experimento. De modo que algunas bandas inicialmente predominantes (en el inóculo y/o en etapas tempranas) disminuyeron su intensidad en etapas posteriores, y lo contrario ocurrió con otras bandas, que aparecieron o aumentaron su intensidad, e incluso se convirtieron en predominantes con la evolución del experimento. Además, la DGGE también evidenció que el volumen ocupado por el lecho de ambos reactores se comportó como un reactor de mezcla completa, ya que se encontraron comunidades microbianas con la misma estructura tanto en la parte inferior como en la superior del reactor. Los resultados de la qPCR indicaron un efecto tóxico de los éteres glicólicos sobre las poblaciones de archaeas y bacterias, ya que las concentraciones de las poblaciones disminuyeron después de la introducción de E2P. Los valores de las concentraciones de ambas poblaciones se recuperaron tras 30 días de exposición a este disolvente, lo que corroboró la necesidad de un periodo de adaptación de los microorganismos para degradar anaerobiamente el E2P. Además, cuando posteriormente se introdujo el M2P en el alimento, no se observó ningún efecto negativo sobre la concentración de la población bacteriana demostrando que el M2P era degradado por la misma ruta que el E2P, pues la población bacteriana ya estaba adaptada a este sustrato (M2P). Por contra, la concentración de las poblaciones de archaeas como Methanobacteriales y Methanomicrobiales disminuyeron después de la introducción de M2P y también después de aumentar la OLR de este sustrato, lo que sugiere un efecto tóxico del M2P sobre estas poblaciones de archaeas. Los resultados de la secuenciación masiva enfatizaron la importancia del tipo de sustrato sobre la predominancia y evolución de las comunidades microbianas a lo largo del periodo experimental. A través de esta técnica, el filo Proteobacteria se identificó como predominante cuando los reactores estaban siendo alimentados solo con etanol como fuente de carbono, y la predominancia de este filo fue reemplazada por el filo Firmicutes cuando se introdujeron los éteres glicólicos como sustrato. Este estudio, que se ha incluido en el capítulo 5 de esta tesis, se desarrolló en colaboración con el Laboratoire du Génie de l'Environment Industriel del École des mines d'Alès (Université de Montpellier) durante una estancia de investigación bajo la supervisión del profesor Luc Malhautier. Recientemente, los resultados de esta investigación han sido enviados para su publicación a la revista Bioresource Technology (Ferrero et al. Link between the anaerobic degradation of glycol ether-ethanol mixtures using EGSB and hybrid reactors and the dynamics of the microbial community structure. Bioresource Technology, pendiente de decisión) Posteriormente, en el estudio llevado a cabo para determinar la influencia de elevadas proporciones de los éteres glicólicos en mezclas con etanol en la degradación anaerobia, de nuevo el reactor EGSB convenional de laboratorio presentó un alto rendimiento (EE>95%) durante su puesta en marcha con etanol como única fuente de carbono. Cuando los éteres glicólicos fueron introducidos la EE global de nuevo cayó inicialmente, hasta el 80%, y después se recuperó hasta el 90%, reflejando que la biomasa necesitó un periodo de adaptación para degradar estos compuestos (E2P y M2P), tal como se había obtenido en los experimentos previos. Cuando el etanol era sustituido progresivamente por éteres glicólicos en el alimento como fuente de carbono, la EE global disminuía ligeramente en consonancia, y en la última etapa (VIII) donde solo se alimentó E2P y M2P (sin etanol) al reactor, la EE redujo hasta el 80% indicando que la eliminación de los éteres glicólicos no podría ser completa, en las condiciones de operación utilizadas. Con respecto a la eliminación individual de cada compuesto, se registró una baja EE durante los primeros días de exposición a cada compuesto (≈20%), pero posteriormente se registraron sus máximas EE: la máxima EE del E2P de alrededor del 70% alcanzada tras 15 días de exposición, y la máxima EE del M2P del 100% tras 24 días de exposición. Además, en la última etapa donde no se introdujo etanol en el reactor, se observó una desgranulación parcial del lecho, lo que podría sugerir que el etanol es un sustrato necesario para mantener la estructura granular del fango. Se estudió el contenido en sustancias poliméricas extracelulares (SPE) y la estructura de la comunidad microbiana de ambos tipos de fangos finales (granulado y desgranulado), revelando que la comunidad microbiana de ambos fangos fue casi idéntica, lo que indica que los rápidos cambios en las propiedades físico-químicas del fango granular no causaron ningún cambio en la estructura de las poblaciones microbianas. Sin embargo, el análisis del contenido en SPE mostró una menor concentración de proteínas y polisacáridos en la biomasa desgranulada que en la granulada, lo que indica que la pérdida de estos compuestos está relacionada con el proceso de desgranulación. Adicionalmente, se determinó la actividad metanogénica especifica (SMA, por sus siglas en inglés) de cada fango utilizando diversos sustratos (únicamente etanol o una mezcla entre etanol y los éteres glicólicos). Los resultados del ensayo SMA demostraron: 1) la necesidad de un periodo de adaptación a los éteres glicólicos; y 2) que el fango granular llevó a cabo la degradación anaerobia del etanol más rápidamente que el fango desgranulado. Este estudio, que corresponde con el capítulo 6 de esta tesis, ha sido preparado para ser enviado a la revista Applied Microbiology and Biotechnology (Ferrero et al., Behaviour, stability, and microbial community analysis of EGSB reactor at hihg content of glicol ether solvents in mixtures with etanol, Applied Microbiology and Biotechnology, preparado para su envío). En el último capitulo de esta tesis doctoral, se presenta la comparación de las comunidades microbianas en reactores a escala de laboratorio y a escala real. Diversas muestras de biomasa de un reactor prototipo industrial instalado y operado en una industria flexográfica fueron recogidas, analizadas, y posteriormente comparadas con las obtenidas en los reactores de laboratorio. El reactor industrial trataba principalmente etanol, acetato de etilo y E2P, bajo condiciones fluctuantes de OLR derivadas de los cambios en el proceso productivo de la planta industrial. A pesar de estas fluctuaciones, se alcanzó un rendimiento estable del reactor (EE media de 93%) y sólo se acumularon ácidos grasos volátiles cuando la carga orgánica fue superior a 3 kg h-1, lo que sugirió un límite para la carga orgánica que puede ser tratada asegurando una operación estable del reactor. La estructura de la comunidad microbiana se analizó a través de la técnica DGGE y mostró una evolución durante los primeros meses de operación en los dominios de Archaea y Bacteria. Teniendo en cuenta que el inóculo inicial fue obtenido de una depuradora de aguas residuales de una industria de fabricación de cerveza, la limitación de la fuente de carbono a solo unos pocos disolventes orgánicos propios de las emisiones de la industria flexográfica pudo ser la causa de este cambio. Las poblaciones del dominio Archaeas fueron las más afectadas por este cambio en la fuente de carbono, resultando en una disminución de la biodiversidad como muestra el índice de Shannon (de 1.07 hasta 0.41 en los primeros 123 días de experimento). Methanosaeta fue el microorganismo predominante en este dominio y su predominio persistió a lo largo de todo el periodo experimental. La proporción de la archaea Methanospirillum y Methanobacterium aumentó a lo largo del periodo experimental, lo que fue asociado a variaciones en la temperatura y en la carga orgánica, respectivamente. En cuanto al dominio de Bacteria, los microorganismos predominantes fueron especies del genero Geobacter y Pelobacter, que son microorganismos especializados en la degradación de etanol. Además, Methanosaeta y Geobater son socios sintróficos capaces de usar la transferencia de electrones interespecífica para la producción de metano, así que el predominio de estas especies indicaba la aparición de este fenómeno en el reactor prototipo. Comparando los reactores de laboratorio y el prototipo industrial, ambos tuvieron un rendimiento similar con altas EE (> 90%) y un periodo de adaptación similar para la degradación de E2P, y sólo se encontró la diferencia en el valor límite de carga orgánica asociada a la acumulación de ácidos grasos volátiles. La estructura de la comunidad microbiana mostró una tendencia similar en ambos reactores, con una evolución desde el fango inicial durante el principio de la operación en Archaea y Bacteria. Finalmente, se obtuvo una comunidad estable en el dominio de Archaea con la predominancia de Methanosaeta. En el dominio de Bacteria la predominancia de los microorganismos mostró una dependencia del sustrato empleado. Estos resultados, que se recogen el el capítulo 7, han sido publicados en la revista Journal of Environmental Management (Bravo, D., Ferrero, P., Penya-roja, J.M., Álvarez-Hornos, F.J., Gabaldón, C., 2017. Control of VOCs from printing press air emissions by anaerobic bioscrubber : Performance and microbial community of an on-site pilot unit. J. Environ. Manage. 197, 287-295). Conclusiones y perspectivas Después de un relativamente corto período de aclimatación, se obtuvieron elevadas eficacias de eliminación de las mezclas de etanol con glicoles éter, tales como E2P y M2P, demostrándose que el tratamiento anaerobio con fango granular es una tecnología viable para la biodegradación de estos solventes típicos de la industria flexográfica. De las dos configuraciones de reactores anaerobios probadas, el AHR mostró una capacidad de retención de sólidos mayor que el EGSB, pero ésto no se vió reflejado en una mayor eficacia de eliminación. Ambas configuraciones de reactores eran capaces de eliminar completamente el M2P (con una OLR de M2P de 8.3 kg DQO m-3 d-1) y el 70% del E2P (con una OLR de E2P de 10.6 kg DQO m-3 d-1). Los subproductos detectados (acetona, isopropil alcohol, y metanol) en algunas fases del experimento y los resultados obtenidos con la mezcla etanol-acetona permitieron esclarecer las rutas de degradación de los éteres de glicol estudiados. La evolución microbiana de los fangos dentro de los biorreactores tanto de AHR como de EGSB utilizados para el tratamiento de las mezclas de etanol-glicol éter fue similar, excepto en el material de relleno ubicado en la parte superior del AHR en el que se identificó una población degradante de ácidos grasos volátiles (AGV). No se observó estratificación a lo largo del lecho de fango en ninguno de los reactores indicando un efecto de mezcla elevado dentro de los mismos. Se observó un efecto tóxico de E2P en las densidades bacterianas y de arqueas, mientras que la adición de M2P solo afectó temporalmente a la población de archaeas. La secuenciación masiva resaltó un cambio de predominio desde Proteobacteria a Firmicutes cuando los biorreactores anaeróbicos se alimentaron con M2P. El tratamiento anaerobio de etanol y mezclas de éteres glicólicos, con elevada proporción en éstos últimos, también mostró EE globales relativamente altas (≈ 90%). Sin embargo, se ha demostrado que el etanol es un sustrato importante para el mantenimiento de la estructura granular de los gránulos en la degradación anaerobia, ya que se produjo una desgranulación parcial cuando no se introdujo etanol en la alimentación. El M2P tuvo una RE mayor que el E2P, probablemente debido a una inhibición competitiva enzimática. Los análisis de la comunidad microbiana revelaron una evolución tanto desde el inóculo al fango granular final, como por la adaptación al sustrato a degradar. Esto se debe a que los microorganismos predominantes identificados al final del experimento tenían un metabolismo basado en los sustratos utilizados durante el ensayo. Los análisis de sustancias poliméricas extracelulares mostraron que el contenido de proteínas y carbohidratos de la biomasa desgranulada fue menor que en la biomasa granulada. La relación entre las proteínas y los carbohidratos también disminuyó en la biomasa degranulada, lo que sugiere que este parámetro podría ser un buen indicador de la salud y la estabilidad de los gránulos. El uso de fango granular de una planta de tratamiento de aguas residuales de una fábrica de cerveza como inoculo inicial resultó en una buena estrategia para lograr una alta EE desde el inicio en la operación del reactor prototipo de biolavador anaerobio. Este reactor se mantuvo estable con una elevada EE (93%) a pesar de las variaciones en las condiciones de operación típicas de las emisiones de la industria flexográfica, como la temperatura y la OLR. El cambio en la fuente de carbono a solo unos pocos solventes causó un impacto en la biodiversidad de las comunidades microbianas, que disminuyó inicialmente, especialmente en Archaea. Los microorganismos predominantes identificados en el reactor pueden asociarse a la fuente de carbono y los parámetros operativos, como la temperatura y la carga orgánica. Los reactores a escala de laboratorio y el reactor prototipo funcionaron de manera similar en términos de EE y se encontró que se necesitaba el mismo período de adaptación para degradar el E2P. Además, se encontró una dinámica en la comunidad microbiana similar en ambas escalas, laboratorio y prototipo, con el predominio de las especies Methanosaeta y Geobacter, socios sintróficos que usan el mecanismo basado en la transferencia directa de electrones interespecies, lo que sugiere que éste es importante para transformar en metano los disolventes de las industrias flexográficas. A partir de esta tesis, a fin de obtener un conocimiento más profundo sobre la degradación de estos éteres gicólicos, se podría proponer llevar a cabo los siguientes estudios: I. El mecanismo de degradación de los éteres de glicol mostrado en esta tesis sugiere que se requieren enzimas para la escisión del éter, por lo que la búsqueda de las enzimas responsables de este mecanismo se muestra como un estudio interesante para mejorar el rendimiento y conocer las condiciones, como las necesidades de cofactores, para una mejor función y cinética de estas enzimas. II. El análisis de la comunidad microbiana de los reactores que tratan solventes de industrias flexográficas reveló que Methanosaeta y Geobacter son microorganismos predominantes que juegan un papel importante en la degradación del solvente. Estos microorganismos son socios sintróficos que pueden utilizar la transferencia directa de electrones interespecífica. Por lo tanto, el uso de materiales conductores, como el carbón activado, donde podrían adherirse estos microorganismos parece ser una alternativa atractiva para promover la transferencia de electrones interespecífica directa y el crecimiento de estos microorganismos involucrados en la degradación anaerobia de disolventes de la industria flexográfica.