[en] Fanconi anemia (FA) is a rare genetic DNA repair deficiency with vast genetic heterogeneity, multiple private mutations, and high mosaicism rate, still jeopardizing molecular diagnosis in case of variants with difficult characterization or unclear pathogenicity. FA also shows bone marrow failure and enhanced susceptibility to hematologic and solid malignancies. Since current treatments only address hematopoietic defects, it is essential to find new systemic drug-based therapies for FA patients. We sought to cope with these hurdles through: i. Design of an optimized mutation screening strategy based on targeted next generation sequencing and complementary techniques for a faster and exhaustive FA molecular diagnosis. We successfully characterized 14/14 patients from three different complementation groups, and reported a total of 23 genetically distinct alleles, including a founder one. We also developed a statistical analysis to infer copy-number variants (CNVs) from the NGS data, and, for all the 5 gross deletions predicted, we provided detection rates matching with those of CNVs gold standards. Moreover, we described the case of a patient with a large deletion and a known splicing variant compensated by a de novo insertion, elucidating a presumptive natural gene therapy phenomenon in vivo. ii. Validation of cellular systems expressing three stable, but defective FANCA proteins (Arg951Gln, Thr1131Ala, Phe1263del) suitable for high content screening (HCS) to identify drug/s able to rescue mutants' phenotypes. To generate the models, we transduced lentiviral vectors carrying the mutations into a FANCA-deficient line that expresses a fluorescent FANCD2 protein. These cells are unable to mono-ubiquitinate FANCD2 or promote its relocation to DNA repair foci, both hallmarks of FA pathway activity. Despite confirming mutant FANCA expression in all models, only the Phe1263del one exhibited a cellular phenotype compatible with the FANCA-null line; the other wild-type behaving mutants were instead discarded as HCS candidates. We will next monitor Phe1263del correction via fluorescent FANCD2 foci formation with the aim of finding a drug, possibly already approved by the Food and Drug Administration (FDA), for a personalized mutation-dependent therapy towards all FA clinical features. iii. Performance of genome-wide (GW) clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) knockout (KO) screens to dissect novel synthetic interactions (SIs) with FA deficiency. We transduced CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-expressing FANCA-deficient and control lines with two GW KO libraries of guide RNAs (gRNAs), i.e., an in-house and the commercial Toronto KO version 3 (TKOv3) library. Over the screens we did not apply any biological challenge in order to analyze the end phenotypes deriving from the i proliferative competition between the cells subjected to gene KO. To keep gRNAs/phenotypes representation, screens were ended at ~10 cell doublings, and genomic DNA from all replicates was isolated and amplified with barcode-tagged primers for NGS. Bioinformatic and statical analyses have already been run for the in- house library screen, providing a preliminary roster of depleted (lethal SIs) and enriched (viable SIs) hits. Subsequently, we will contrast these results with those of the TKOv3 screen sequencing and validate the best hits to prove the SIs detected and, thus, provide novel druggable targets for FA treatment (viable SIs) and/or new indications for gene alterations sensitizing cancer cells to the inhibition of FA pathway or its interactors (lethal SIs). The achievement of the goals of this thesis project will provide a comprehensive strategy for the current challenges of FA, proceeding from the bench to the bedside and back.

[es] La anemia de Fanconi (FA) es un trastorno genético raro de la reparación del ADN con amplia heterogeneidad genética, múltiples mutaciones privadas y alta tasa de mosaicismo, que todavía prejuzgan el diagnóstico molecular en el caso de variantes de difícil caracterización o de patogenicidad dudosa. Los pacientes con FA también presentan insuficiencia de la medula ósea y mayor susceptibilidad a tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Dado que los tratamientos actuales solo abordan los defectos hematopoyéticos, es indispensable encontrar nuevas terapias farmacológicas sistémicas en FA. Intentamos hacer frente a estos obstáculos a través de: i. Diseño de una estrategia optimizada de cribado mutacional basada en secuenciación dirigida de nueva generación (t-NGS) y en técnicas complementarias para un diagnóstico molecular de FA más rápido y exhaustivo. Caracterizamos 14/14 sujetos pertenecientes a tres grupos de complementación diferentes, y reportamos un total de 23 alelos genéticamente distintos, incluido uno fundador. También desarrollamos un análisis estadístico para inferir variantes de numero de copia (CNVs) a partir de los datos de NGS y, para las 5 deleciones pronosticadas, proporcionamos tasas de detección coincidentes con las de las técnicas de referencia para el estudio de CNVs. Además, describimos el caso de un paciente con una gran deleción y una variante de splicing conocida compensada por una inserción de novo, resultando en un potencial efecto de terapia génica natural in vivo. ii. Validación de sistemas celulares de tres proteínas FANCA mutadas pero estables (Arg951Gln, Thr1131Ala, Phe1263del), aptos para un cribado de alto contenido de fármacos, con el fin de identificar molécula/s capaces de rescatar sus fenotipos. Para generar los modelos, transducimos vectores lentivirales con las mutaciones en una línea deficiente para FANCA que expresa una proteína FANCD2 fluorescente. Estas células no son capaces de mono-ubiquitinar FANCD2 o promover su reubicación en focos de reparación del ADN, características propias de la actividad de la ruta FA. A pesar de confirmar la expresión de la proteína FANCA mutante en todos los modelos, solo el del mutante Phe1263del mostró un fenotipo celular compatible con la línea deficiente para FANCA; por el contrario, los otros dos modelos con comportamiento de tipo salvaje se descartaron como candidatos para el HCS. Posteriormente, monitorearemos la corrección de Phe1263del a través de la formación de focos FANCD2 fluorescentes con el objetivo de encontrar un fármaco, posiblemente ya aprobado por la Food and Drug Administration (FDA), para una terapia mutación- dependiente personalizada para todos los rasgos clínicos de FA. iii. Realización de cribados CRISPR KO en todo el genoma para diseccionar nuevas interacciones sintéticas (SIs) con los genes FA. Transducimos una línea FANCA deficiente y su control, ambos caracterizados por la expresión de Cas9, con dos librerías KO de ARN guía (gRNA), una librería generada en laboratorio ("librería interna") y una comercial denominada Toronto KO version 3 (TKOv3). Durante los cribados no introdujimos ningún estimulo externo, con el fin de analizar los fenotipos resultantes de la competencia proliferativa entre las células sometidas a supresión genética. Para mantener la representación de gRNAs/fenotipos los cribados fueron detenidos después de 10 duplicaciones celulares, tras lo cual aislamos el ADN de todas las réplicas y lo amplificamos con cebadores con código de barras para NGS. A continuación, se llevó a cabo el análisis bioinformático y estadístico del cribado de la "librería interna", redactando una lista preliminar de genes con baja representación (SI letales) y enriquecidos (SI viables). Compararemos estos resultados con los de secuenciación del cribado con la TKOv3 y validaremos los mejores candidatos para probar las SIs. El logro de los objetivos de este proyecto de tesis proporcionará una estrategia integral para los actuales desafíos de AF, desde el laboratorio hasta la cama del paciente y vuelta.