[en] Introduction: Peripheral blood contained in placental vessels after birth has a high amount of hemopoietic progenitors with long term repopulating ability. Then, this tissue has become an interesting alternative for transplantation. Stem cells collected are limited by the small volume available, and influence the engraftment, resulting in a delayed short-term engraftment. Clinical experiences shown a correlation between committed progenitor infused and speed of myeloid engraftment. Furthermore, a shorten aplasia promotes a decrease in transplant related mortality. Specific conditions maintain hemopoiesis in vitro. Using defined combination of cytokines progenitor cells can be generated in vitro, in a called expansion cultures. Hypothesis: Hemopoietic progenitor coinfusion obtained after expansion can accelerate neutrophil recovery after cord blood transplantation. Objectives: To evaluate a method to generated expanded progenitors in terms of efficacy, applicability and clinical result. The specific objectives developed have been published: - definition of expansion culture conditions allowing the generation of committed progenitor (Haematologica 1999; 84:493-98) - adaptation of basic condition defined to a clinical grade practice: animal-origin protein and serum-free conditions (Haematologica 1999; 84:675-82) - technological protocol development based in cord-blood CD34+ cell expansion for clinical use (Transfusion 2000; 40:625-31) Results: 1) Role of CD34-cell positive selection in expansion: Progenitor expansion is significantly higher using CD34+ cells than mononuclear cells at 105 cells/ml (16-fold vs 1 respectively). 2) Cell generation depending cytokine combination: exogenous additon of early-acting cytokines and intermediate and/or late-acting ones promotes a higher generation. Minimum combination promoting CFU expansion (4-times at 6-days) contains SCF and G-CSF. 3) Continous feeding of cytokines: At 6-days, daily cytokine feeding promotes 2-times more expansion than the unique addition of cytokine at day 0. 4) Serum-free culture: Fetal calf serum can be successfully substituted by commercial serum-free media supplemented with broad spectrum cytokines: SCF, IL3 and IL6. Expansion rate is equivalent by a decrease in coefficient of variation was observed (107% vs 61%) 5) Role of FLT3-l and TPO in stem cell expansion: Stem cell maintenance is necessary to obtain a constant progenitor cell generation in medium-long term cultures. The analysis of CAFC 5th weeks in expansion cultures has shown the combination including SCF, FLT3-L, IL6, IL3 y MIP-1-alfa as the most benefit (up to 95% of cells were recovered after 6-days of culture). Furthermore, the substitution of IL3 and MIP-1-alfa with TPO has increased the recovery up to 145% of starting CAFC. 6) Description of a positive selection method after CB thawing: Method consists of the use of a clinical available technology (Isolex-300i from Baxter) adapted to cryopreserved cord blood samples: use of 9C5-monoclonal antibody (anti-CD34) sensitized immunobeads and addition of a human recombinant DNAase-based buffer. A purity and yield of 69% and 52% was obtained. 7) Selection and expansion of progenitor cells in semipermeable bags for clinical use: Expansion starts in Teflon bags after positive selection using the above described direct immunomagnetic methodology. The assessment of number of CD34+ cells before cryopreservation and after 6-day expansion in serum-free medium containing SCF, FLT3-L, IL6 and TPO shows an increase of 7-times the CD34+ cells number. 8) Pilot study: double CB transplant. This strategy was used in 5 clinical transplants. The number of progenitor cells was incresed in 100% aprox (0,23x106 CD34 expanded cells/kg). Only molecular chimera was observed until day 14 but neutrophils counts in peripheral blood were lower than 500/ml. Unmanipulated cord blood engrafted between 17-27 days. Discusion: The described methodology allows the generation of committed progenitor cells. One-log amplification in 6-days was achieved. But this increase had subclinical effects. Experiences published by other authors have shown early presence of neutrophil cells in peripheral blood after infusion of more than 40x106 NC/kg. To achieve this number of cells from cord blood a 3 log expansion of progenitor cells is necessary, and this should be obtained increasing the time of expansion. To do this, a new protocol based in 14-days expansion must be proposed. Conclusions: The described methodology is a therapeutic platform that allows its adaptation and development to different clinical-biological objectives based on ex vivo expansion of progenitor cells.

[es] Introducción: La sangre de cordón umbilical (SCU) contiene una elevada cantidad de progenitores hemopoyéticos (PH) circulantes con capacidad de repoblación medular a largo plazo. Como consecuencia, dicho tejido se ha convertido en alternativa para trasplante. El volumen limitado condiciona que el número absoluto de células madre sea bajo, repercutiendo en la probabilidad de injerto, fundamentalmente a corto plazo. La evaluación de las experiencias clínicas iniciales han permitido demostrar la correlación entre dosis de PH comprometidos infundidos y velocidad de injerto mieloide. Además, la rápida recuperación de granulocitos y plaquetas disminuye la morbimortalidad relacionada con el procedimiento. La hemopoyesis puede mantenerse in vitro aplicando unas condiciones de cultivo específicas. Mediante la utilización de citoquinas selectivas se pueden generar células in vitro con características funcionales definidas, en unos cultivos llamados de expansión. Hipótesis: La coinfusión de PH obtenidos mediante expansión reducirá el tiempo de neutropenia tras trasplante de SCU. Objetivos: La evaluación de la eficacia, aplicabilidad y resultados de un método de generación de PH mediante expansión. Para ello se han desarrollado los siguientes objetivos específicos, que han sido publicados: - definición de las condiciones de cultivo de expansión que permitan generar PH diferenciados (Haematologica 1999; 84: 493-98). - adaptación de las condiciones básicas de expansión a los requerimientos de los protocolos clínicos: utilización de medios libres de suero y proteínas de origen animal (Haematologica 1999; 84: 675-82). - desarrollo de un protocolo tecnológico de expansión de células CD34+ seleccionadas de SCU y su aplicación clínica (Transfusion 2000; 40: 625-31). Resultados: 1) Papel de la selección celular en el cultivo: A concentración de 105 células/ml la amplificación de PH es significativamente mayor partiendo de células seleccionadas que de células mononucleadas (16 veces mayor). 2) Generación de células según combinación de citoquinas: la adición de citoquinas de acción temprana, de acción intermedia y/o tardía promueve una mayor generación de PH comprometidos, así la presencia de SCF y G-CSF es necesaria para amplificar 4 veces el n° de células nucleadas en 6 días. 3) Presencia continuada de citoquinas: En cultivos de 6 días, existe un mayor rendimiento proliferativo (hasta 2 veces más) si se adicionan citoquinas diariamente, y/o se utilizan formas glicosiladas que aumentan su vida media. 4) Cultivo libre de suero: Es posible substituir la función del suero de ternera fetal utilizando medios libres de suero comerciales y citoquinas de amplio espectro: SCF, IL6 e IL3. Se consiguen tasas de expansión equivalentes y se disminuye el coeficiente de variación (107% frente 61%). 5) Papel de FLT3-L y TPO en la expansión: Para generar de forma continua PH comprometidos es necesario mantener funcionales las células madre hemopoyéticas. Mediante el análisis de las células formadoras de área en empedrado (CAFC) de 5 semanas, se ha podido de terminar que la combinación más beneficiosa incluye SCF, FLT3-L, IL6, IL3 y MIP-1a (recuperación del 95% de CAFC a los 6 días de cultivo). La substitución de IL3 y MIP por TPO mejora los resultados y permite recuperar hasta un 145% de CAFC. 6) Método de selección positiva tras descongelación de SCU: Se ha adaptado un método de uso clínico (Isolex-300i de Baxter) para pequeñas muestras de SCU criopreservadas. Se realiza sensibilización previa de las bolas magnéticas con el monoclonal anti-CD34 (9C5) y se adiciona un tampón con DNAasa recombinante humana. La pureza media es del 69% y la recuperación del 52%. 7) Selección y expansión en bolsas semipermeables para uso clínico: Se realiza la selección celular con el método inmunomagnético directo descrito y se traspasan las células obtenidas a bolsas semipermeables de Teflon para expansión. Tras 6 días de cultivo en medio libre de suero en presencia de SCF, FLT3-L, IL6 y TPO, las células CD34+ iniciales se incrementan 7 veces. 8) Estudio piloto: doble trasplante de SCU (una unidad expandida, otra no manipulada). Este método se utilizó en 5 procedimientos clínicos. Se incrementó el n° de PH en un 100% aproximadamente (0,23x106 CD34 expandidas /kg). Sólo se detectó quimera molecular de la unidad expandida los primeros 14 días. La recuperación de neutrófilos se produjo en los días 17-27 a partir de la unidad no manipulada. Discusión: El método descrito permite la generación de PH comprometidos. Durante 6 días de cultivo se amplifica 1 logaritmo el contenido inicial. Este aumento no tiene relevancia clínica. Experiencias de otros autores han mostrado que las células expandidas son capaces de generar neutrófilos en sangre periférica cuando se infunden alrededor de 40x106 CN/kg. Esto supone incrementar hasta 3 logaritmos la expansión, y sólo puede conseguirse incrementando el tiempo de cultivo con el método propuesto. Para ello, se debe establecer un protocolo de al menos 14 días de expansión. Conclusiones: El método biotecnológico descrito, constituye una plataforma terapéutica que permite su desarrollo y adaptación a diferentes objetivos clínico-biológicos basados en la expansión ex vivo de PH.