[en] The enzyme tyrosinase or polyphenol oxidase (EC 1.14.18.1) is a cupoprotein, widespread in nature, from fungi, bacteria, plants and animals. It catalyzes two consecutive reactions, the hydroxylation of monophenols to o-diphenols and the oxidation of the latter to o-quinones using molecular oxygen. 1. OBJECTIVES The main objective of this thesis is to deepen the catalysis of tyrosinase in its monophenolase activity. At the same time, a methodology for the study of inhibitors on the diphenolase activity of the enzyme is discussed. As specific objectives, the following stand out: • Discuss the classification of the main depigmenting agents described in the bibliography. • Analyze the spectrophotometric methods that use MBTH (3-Methyl-2-benzothiazolone hydrazone) as a coupled nucleophile to measure the formation of the product in monophenolase activity, with respect to the spectrofluorimetric methods that measure the disappearance of L-tyrosine in the presence of borate. • Deepen the study of monophenolase activity, for which four types of substrates have been chosen (A, L-tyrosine type; B, hydroquinone type; C, 4-tert-butylphenol type and D, deoxyarbutin type). • Analyze the docking of these compounds (monophenols) to the met and oxy tyrosinase forms. • Develop an analytical expression for the degree of inhibition in diphenolase tyrosinase activity that enables the determination of IC50. • Confirm that docking studies help to discern whether a molecule can be a substrate for the enzyme. • Study molecules that are enzyme substrates and discuss whether docking confirms this behavior. Application to 4-bromophenol and 4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone. 2. METHODOLOGY To advance in this study, ultraviolet/visible spectrophotometric techniques, nuclear magnetic resonance techniques to determine 13C-NMR spectra, simulation techniques to verify the predictions of the theoretical behavior of the enzyme and also docking techniques to be able to predict the interactions of the different enzymatic species with the different ligands. 3. CONCLUSIONS The study of the tyrosinase monophenolase activity has been deepened, both in the kinetic and structural aspects as well as in the applied ones. The study of the inhibition of diphenolase activity has also been addressed, proposing a methodology for the characterization of inhibitors. As specific conclusions, the following stand out: • It is proposed that 4-n-butylresorcinol, α-arbutin and β-arbutin be removed from the list of depigmenting agents, because they have been shown to be tyrosinase substrates in the presence of hydrogen peroxide or L-dopa. • The spectrofluorimetric measurements are more sensitive than the spectrophotometric ones. In the case of the spectrofluorimetric ones, it was proposed to follow the disappearance of the substrate, L-tyrosine, but a lack of linear response occurs when its concentration increases. • The monophenols are grouped into: Type A, are those in which the evolution of o-quinone causes the accumulation of o-diphenol in the reaction medium. Type B, are those monophenols for which the evolution of o-quinone does not allow the accumulation of o-diphenol in the medium, because it is oxidized by the oxygen in the solution. Type C, are the monophenols that originate very stable o-quinones and, therefore, do not evolve by accumulating o-diphenol in the medium. Type D, are those that do not release o-diphenol into the environment and whose o-quinone is very stable. • The analytical expression of the IC50 parameter has been developed based on the apparent inhibition constants and for each inhibition mechanism, in the case of the tyrosinase enzyme. In the same way, an experimental design and data analysis based on the degree of inhibition are proposed. • From the docking studies of different molecules to the oxytyrosinase form, it is confirmed for the indicated molecules (4-bromophenol and 4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone) the usefulness of docking in the prediction of substrates of the enzyme.

[es] La enzima tirosinasa o polifenol oxidasa (EC 1.14.18.1) es una cupoproteína, muy extendida en la naturaleza, desde hongos, bacterias, plantas y animales. Cataliza dos reacciones consecutivas, la hidroxilación de monofenoles a o-difenoles y la oxidación de estos últimos a o-quinonas utilizando oxígeno molecular. 1. OBJETIVOS El objetivo principal de esta tesis es profundizar en la catálisis de tirosinasa en su actividad monofenolasa. Al mismo tiempo, se discute una metodología para el estudio de inhibidores sobre la actividad difenolasa de la enzima. Como objetivos específicos se destacan: • Discutir la clasificación de los principales despigmentantes descritos en la bibliografía. • Analizar los métodos espectrofotométricos que utilizan como nucleófilo acoplado MBTH (3-Metil-2-benzotiazolona hidrazona) para medir la formación de producto en la actividad monofenolasa, respecto a los métodos espectrofluorimétricos que miden la desaparición de L-tirosina en presencia de borato. • Profundizar en el estudio de la actividad monofenolasa, para ello se han elegido cuatro tipos de sustratos (A, tipo L-tirosina; B, tipo hidroquinona; C, tipo 4-terc-butilfenol y D, tipo desoxiarbutina). • Analizar el docking de estos compuestos (monofenoles) a las formas metatirosinasa y oxitirosinasa. • Desarrollar una expresión analítica para el grado de inhibición en la actividad difenolasa de tirosinasa que posibilite la determinación de IC50. • Confirmar que los estudios de docking ayudan a discernir si una molécula puede ser sustrato de la enzima. • Estudiar moleculas que son sustratos de la enzima y discutir si el docking confirma este comportamiento. Aplicación al 4-bromofenol y 4-(4-hidroxifenil)-2-butanona. 2. METODOLOGIA Para avanzar en este estudio se han utilizado técnicas espectrofotométricas ultravioleta/visible, técnicas de resonancia magnética nuclear para determinar espectros de 13C-RMN, técnicas de simulación para poder comprobar las predicciones del comportamiento teórico de la enzima y también técnicas de docking para poder predecir las interacciones de las distintas especies enzimáticas con los distintos ligandos. 3. CONCLUSIONES Se ha profundizado en el estudio de la actividad monofenolasa de tirosinasa, tanto en los aspectos cinéticos y estructurales como en los aplicados. También se ha abordado el estudio de la inhibición de la actividad difenolasa, proponiendo una metodología para la caracterización de inhibidores. Como conclusiones específicas se destacan: • Se propone que se saquen de la lista de despigmentantes al 4-n-butilresorcinol, α-arbutina y β-arbutina, porque se demostró que son sustratos de tirosinasa en presencia de peróxido de hidrogeno o de L-dopa. • Las medidas espectrofluorimétricas son más sensibles que las espectrofotométricas, en el caso de las espectrofluorimétricas se propuso seguir la desaparición de sustrato, L-tirosina, pero se produce una falta de respuesta lineal al aumentar la concentración de ésta. • Los monofenoles los agrupamos en: Tipo A, son aquellos en los que la evolución de la o-quinona origina la acumulación de o-difenol en el medio de reacción. Tipo B, son aquellos monofenoles para los que la evolución de la o¬-quinona no permite la acumulación de o-difenol en el medio, porque se oxida por el oxígeno de la disolución. Tipo C, son los monofenoles que originan o-quinonas muy estables y, por lo tanto, no evolucionan acumulando o-difenol en el medio. Tipo D, son aquellos que no liberan o-difenol al medio y cuya o-quinona es muy estable. • Se ha desarrollado la expresión analítica del parámetro IC50 en función de las constantes aparentes de inhibición y para cada mecanismo de inhibición, en el caso de la enzima tirosinasa. Del mismo modo se propone un diseño experimental y análisis de datos en base al grado de inhibición. • A partir de los estudios de docking de distintas moléculas a la forma oxitirosinasa, se confirma para las moléculas indicadas (4-bromofenol y 4-(4-hidroxifenil)-2-butanona) la utilidad del docking en la predicción de sustratos de la enzima.