[ca] Els tumors acumulen mutacions que poden generar neoantigens privats, quan s'originen d'alteracions úniques del pacient; o compartits, a l'originar-se de mutacions recurrents en punts calents de gens impulsors del càncer, les quals se succeeixen en múltiples pacients. Quan els pèptids derivats de neoantigens compartits es presenten en al·lels d'HLA prevalents, es consideren neoantigens públics, els quals representen dianes terapèutiques ideals per les immunoteràpies contra el càncer per diverses raons. Primer, són específics del tumor, vitals per al manteniment del fenotip maligne i tenen una alta probabilitat de ser clonals o expressats per la majoria de cèl·lules canceroses. Segon, gràcies a la seva alta recurrència, ofereixen la possibilitat de desenvolupar teràpies basades en cèl·lules T modificades genèticament amb receptors de cèl·lules T (TCR) específics, ampliant l'aplicabilitat de la teràpia adoptiva amb cèl·lules T a múltiples pacients. Malgrat la identificació de centenars de mutacions recurrents, tan sols una petita fracció de neoantigens públics immunogènics i TCR reactius han sigut identificats. En aquesta tesi, hem seguit una aproximació d'immunopeptidòmica basada en espectrometria de masses (IP-MS) per descobrir pèptids derivats de neoantigens compartits presentats en al·lels d'HLA-I prevalents. Posteriorment, vam detectar i caracteritzar TCRs específics per a aquests pèptids, els quals podrien ser utilitzats per desenvolupar noves teràpies basades en cèl·lules T dirigides contra neoantigens públics. Primerament, vam dissenyar una plataforma cel·lular basada en cèl·lules HLA-I monoal·lèliques per identificar neoantigens públics derivats de 35 mutacions recurrents en 13 gens impulsors del càncer i 12 al·lels d'HLA-I altament prevalents en la població caucàsica. Amb aquest objectiu, vam generar quatre constructes (HSTMG) codificant per les mutacions recurrents seleccionades i 12 B2M_HLA-I quimeres per als al·lels prioritzats. Seguidament, vam generar una línia cel·lular nul·la pel gen B2M mitjançant CRISPR/Cas9 per a l'obtenció de cèl·lules B2M KO sense expressió d'HLA-I en la superfície cel·lular. Les cèl·lules tumorals B2M KO van ser co-electroporades amb ARN derivat d'una quimera B2M_HLA-I i un dels quatre HSTMGs per a generar cèl·lules HLA-I monoal·lèliques amb expressió de les mutacions recurrents d'interès. Posteriorment, vam realitzar IP-MS en cèl·lules que expressaven un total de 37 combinacions HSTMG-B2M_HLA-I per tal d'identificar pèptids processats i presentats de forma natural en HLA-I. Finalment, els neoantigens detectats van ser validats usant espectrometria de monitoratge de reacció paral·lela (PRM-MS). Mitjançant aquesta plataforma vam validar 49 parelles de pèptid-HLA-I derivats de 23 neoantigens compartits presentats en 10 al·lels d'HLA-I. A més, el nostre mètode basat en cèl·lules HLA-I monoal·lèliques va capturar 19 dels 29 neoantigens públics reportats prèviament i 33 noves parelles de neoepítops-HLA-I. Per determinar si algun dels neoantigens públics candidats podien ser reconeguts per limfòcits T, vam dur a terme experiments de sensibilització in vitro amb limfòcits de sang perifèrica d'una pacient amb càncer de mama. Aquesta estratègia va generar dues reactivitats específiques de cèl·lules T restringides a HLA-A*11:01 per PIK3CAp.E545K i TP53p.R248Q, així com una resposta restringida a HLA-C*04:01 per PIK3CAp.R88Q. En seqüenciar els TCRS d'aquestes cèl·lules T reactives, vam identificar tres TCRs reactius, cadascun d'ells específic per un dels tres neoantigens públics mencionats. Notablement, els tres TCRs reactius van demostrar un reconeixement preferencial de les seves dianes en el context de processament i presentació per cèl·lules tumorals in vitro, indicant un gran potencial per al desenvolupament de teràpies basades en cèl·lules T. En resum, el nostre mètode basat en IP-MS de cèl·lules HLA-I monoal·lèliques, va permetre identificar una gran varietat de neoantigens públics candidats. Aquestes identificacions amplien el número de dianes terapèutiques disponibles per a la immunoteràpia del càncer. A més, la identificació dels TCRs específics per a neoantigens públics obre la possibilitat de generar noves teràpies basades en cèl·lules T aplicables a múltiples pacients amb càncer.

[en] Tumors accumulate genetic alterations, some of which may generate "non-self" epitopes recognized by T cells, known as neoantigens. These antigens can arise from private mutations unique to each individual or from shared mutations in hotspot regions of driver genes that occur in multiple cancer patients. When prevalent HLA alleles present epitopes from shared neoantigens, they become public neoantigens. These are ideal targets for cancer immunotherapies for multiple reasons. First, they are exquisitely tumor-specific, vital for sustaining the malignant phenotype, and have a higher likelihood of being clonal or expressed by most cancer cells. Second, due to their high conservation, they offer the possibility of developing off-the-shelf TCR T-cell-based therapies, broadening the applicability of adoptive T-cell therapy to multiple patients. However, despite the identification of hundreds of cancer driver mutations, only a small fraction of immunogenic public neoantigens and reactive TCRs have been identified. In this thesis, we used a mass spectrometry-based (MS-based) HLA-I immunopeptidomics approach to discover hotspot-derived mutant peptides presented on highly prevalent HLA-I alleles. In addition, we aimed to detect and characterize T-cell receptors (TCRs) targeting these peptides, which could be used to develop novel off-the-shelf TCR-based T-cell therapies targeting public neoantigens. We developed an HLA-I monoallelic cell platform to identify public neoantigens arising from 35 recurrent mutations across 13 cancer driver genes and 12 highly prevalent HLA-I alleles in the Caucasian population. We first constructed four hotspot tandem minigene (HSTMG) constructs encoding these mutations and B2M_HLA chimeras encompassing the prioritized alleles. Next, we generated a B2M null tumor cell line using CRISPR/Cas9, lacking cell surface HLA-I expression. B2M KO tumor cells were then co-electroporated with in vitro transcribed RNA encoding one B2M_HLA chimera and one of the four HSTMGs to generate HLA-I monoallelic cells expressing recurrent mutations. Last, shotgun MS-based immunopeptidomics was performed on cells expressing a total of 37 HSTMG-B2M_HLA combinations to identify naturally processed and presented HLA-I peptides, which were then validated using parallel reaction monitoring mass spectrometry. Using this strategy, we detected 49 mutant peptide-HLA pairs derived from 23 shared cancer neoantigens presented across 10 HLA-I alleles. Moreover, our method, based on transient HLA-I monoallelic cells, captured 19 previously reported epitopes and, more importantly, 33 novel candidate public neoantigen-HLA pairs. To determine whether some of the putative public neoantigens could be recognized by T cells, we carried out in vitro sensitization experiments using peripheral blood lymphocytes from a breast cancer patient. This strategy raised two HLA-A*11:01-restricted T-cell reactivities specific for PIK3CAp.E545K and TP53p.R248Q, as well as an HLA-C*04:01-restricted response targeting PIK3CAp.R88Q. By sequencing the TCRs of these reactive T cells, we identified three neoantigen-specific TCRs, each displaying specific recognition of the neoantigen compared to the wild-type counterpart. Interestingly, the three reactive TCRs recognized their target when processed and presented by tumor cells in vitro, underscoring their potential to develop off-the-shelf T-cell therapies. In summary, we identified a diverse array of candidate public neoantigens through comprehensive MS-based immunopeptidomics screening of HLA-I monoallelic cells. These findings expand the number of shared actionable targets for cancer immunotherapy. Furthermore, the discovered TCRs reactive to public neoantigens pave the way for T-cell-based therapies applicable to multiple cancer patients.