[en] MNGIE is a rare metabolic disease caused by recessive mutations in the TYMP gene, which encodes the enzyme TP. This causes a systemic accumulation of nucleosides which results in mitochondrial toxicity that is usually lethal during the first decades of life. The goal of the present work was to achieve an efficient integration of the human TYMP cDNA on introns of the Tymp and Alb genes of murine hepatocytes by the coordinated action of two elements: CRISPR/Cas9 system and TYMP cDNA templates. These templates were designed to be integrated in a region downstream a genomic promoter, so that the TYMP cDNA expression will be under its control. In the case of the Alb locus the successful gene editing produced a hybrid Alb-hTP protein with a secretory ability. With this approach, hepatocytes would be permanently edited and the TYMP cDNA would be expressed long-term, thus overcoming the problem of loss of transgene expression often detected in conventional gene therapies. Two distinct strategies were tested. In the first one, CRISPR/Cas9 RNAs were delivered by nanoparticles (NPs). This allowed a high but transient expression. We tested NPs of two different sources: polymeric NPs (PNPs) of GEMAT-IQS, and lipid NPs (LNPs) of Acuitas Therapeutics®. In the second approach, CRISPR/Cas9 was delivered as DNA inside AAV vectors. Both in vitro and in vivo results corroborated that the TYMP cDNA could be successfully inserted in both loci. We also assessed the presence of TYMP mRNA and functional TP protein in the edited cells. In vivo experimentation was performed with the mice model of MNGIE. The Thd and dUrd plasma levels of treated animals were monitored to assess the effectivity of the different genome editing approaches. The best results were obtained in animals treated with LNPs carrying the CRISPR/Cas9 RNAs and rAAV2/8 vectors carrying the DNA templates. These mice showed a consistent and stable biochemical correction that correlated with the presence of TYMP mRNA and functional TP enzyme in liver cells. Moreover, mice of the Alb locus gene editing group presented significant TP activity in plasma, which confirms that the hybrid enzyme can be successfully secreted and maintains its activity in plasma. However, the reduction of plasma nucleoside levels was not enough to reach the levels observed in WT mice, so there is room for optimization. Unexpectedly, in some cases genome edition was observed in the absence of CRISPR/Cas9, which suggests that the DNA templates alone could trigger the correct insertion through homologous recombination. All these results confirm that our genome editing approach is viable, although we need to increase the overall efficiency of the procedure to achieve a full biochemical correction in the murine model of MNGIE.

[es] El MNGIE es una enfermedad metabólica rara causada por mutaciones recesivas en el gen TYMP, el cual codifica la enzima TP. Esto causa una acumulación sistémica de nucleósidos que provoca toxicidad mitocondrial, y normalmente acaba siendo letal durante las primeras décadas de vida. El objetivo de este trabajo era conseguir una integración eficaz del ADNc humano de TYMP dentro de un intrón de los genes Tymp y Alb en hepatocitos por la acción coordinada de dos elementos: la CRISPR/Cas9 y los templates con el ADNc de TYMP. Estos templates fueron diseñados para ser integrados en una región subsecuente a un promotor genómico, de forma que la expresión del ADNc de TYMP estaría bajo su control. En el caso del locus Alb, la edición génica correcta produciría una proteína híbrida Alb-hTP que tendría capacidad secretora. Con esta aproximación, los hepatocitos serían editados permanentemente y el ADNc de TYMP sería expresado a largo plazo, de forma que se resolvería el problema de pérdida de expresión del transgén a menudo detectada en terapias génicas convencionales. Se probaron dos estrategias diferentes. En la primera, los ARNs de la CRISPR/Cas9 fueron introducidos por nanopartículas (NPs). Esto permitió una expresión elevada pero transitoria. Se probaron dos NPs diferentes: las NPs poliméricas (PNPs) de GEMAT-IQS, y las NPs lipídicas (NPLs) de Acuitas Therapeutics®. En la segunda estrategia, el sistema CRISPR/Cas9 fue librado como ADN dentro de vectores AAV. Los resultados in vitro e in vivo corroboraron que el ADNc de TYMP podía ser insertado con éxito en los dos loci. También corroboramos la presencia de ARNm de TYMP y de proteína TP funcional dentro de las células editadas. La experimentación in vivo se hizo con el modelo de ratones de MNGIE. Los niveles plasmáticos de Thd y dUrd de los animales tratados fueron monitorizados para valorar la eficiencia de las diferentes estrategias de edición génica. Los mejores resultados se obtuvieron en los animales tratados con las NPLs que llevaban los ARNs de la CRISPR/Cas9 y los vectores rAAV2/8 que llevaban los templates de ADN. Estos ratones presentaron una corrección bioquímica estable y consistente que se correlacionó con la presencia de ARNm TYMP y de enzima TP funcional en las células del hígado. Además, los ratones editados en el locus Alb presentaron una actividad TP significativa plasma, lo cual confirma que la enzima híbrida puede ser secretada con éxito manteniendo su actividad en plasma. Aun así, la reducción de niveles plasmáticos de nucleósidos no fue suficiente para lograr los niveles detectados en los ratones WT, de forma que hay espacio para la optimización. Sorprendentemente, en algunos casos la edición génica se produjo en ausencia de la CRISPR/Cas9, lo cual sugiere que los templates de ADN solos podrían provocar la inserción correcta a través de recombinación homóloga. Todos estos resultados confirman que nuestra estrategia de edición génica es viable, a pesar de que necesitamos aumentar la eficiencia global del procedimiento para conseguir una corrección bioquímica total en el modelo de MNGIE.