[en] The following dissertation is a far-reaching work with the purpose to find a new macro-type biomarker that could be objectively and non-invasively measured as an indicator of DED, specifically at its early stage. Attempting to achieve this goal, it proposes new metrics of tear dynamics quantification. By tracking visit-to-visit longitudinal trends of these measures over a period of one year, it explores their role in supporting DED diagnosis in subjects reported with incipient symptomatology. The hypothesis behind developing the new macro-type biomarkers of DED is that the loss of homeostasis of the tear film, which describes the core pathophysiological mechanism of DED, may not only be expressed as disturbed tear film morphology, but also by a lack of equilibrium between hydro-dynamic processes occurring in the tear fluid or tear menisci. These phenomena are in a state of equilibrium regulated by the lacrimal functional unit (LFU). A disturbance of this subtle balance may ultimately lead to DED. Based on the abovementioned observation, the tear clearance rate (TCR) and tear turnover rate (TTR) were chosen as the potential macro-type biomarkers of DED. The multifactorial nature of the disease can be expressed by TCR or TTR, as they consider all the hydrodynamic phenomena occurring in the tear fluid and were shown to perform well in DED differential diagnosis. Several ocular measures that could be interpreted as potential quantifiers of TCR or TTR, have been developed. Further, several existing ocular measures have been identified as potential DED biomarkers. These measures and quantifiers can be non-invasively assessed and objectively analysed and thus are appropriate to fulfil DED definition and, what is most important, can be assessed in a clinical setting. This includes tear osmolarity, meniscometry, tear film stability assessment with non-invasive, objective technique and TCR estimation with optical coherence tomography (OCT). This dissertation is divided into two major parts: Experimental part and the longitudinal study of biomarkers' trends. The experimental chapter (Chapter II), in a form of three separate experiments, proposes new methodologies for tear dynamic quantification. The second part (Chapter III) describes the one-year-long longitudinal study, which was arranged to follow the above-mentioned visit-to-visit biomarkers' trends. It is of interest to develop simpler and, by extension, more clinically applicable methodologies for TCR quantification. Techniques described in Chapter II can be used to follow, analyse and quantify different aspects of tear fluid dynamics. Temporal measures of TCR and TTR were reported in several studies as markers of the integrity of the LFU and tear exchange on the ocular surface. These measures have the potential to become the new macro-type biomarkers of DED. Considering the probable applicability of TCR measurements in supporting DED diagnosis, this dissertation proposes such new solutions. It describes two alternative methodologies for TCR assessment - one that utilizes the newly-developed device for corneo-scleral topography to follow tear fluorescence intensity decay after fluorescein instillation (Experiment 1) and the latter, which allows estimation of an early-phase TCR (Experiment 3) with the use of spectral-domain OCT-based dynamic meniscometry algorithm proposed in the Experiment 2. To observe temporal, longitudinal changes in ocular physiology (Chapter III), subjects were fitted with modern, daily disposable Silicon Hydrogel (SiHy, Delefilcon A) or Hydrogel (Hy, Omafilcon A) soft contact lenses. Free supply of lenses aided attendance outcomes and ensuing a systematic schedule, which made the study design more robust and has minimized the number of drop-outs. The clinical part of the study lasted for 12 months. The hypothesis driving this longitudinal study was that contact lens wear will somehow impact ocular physiology over the period of 12 months, so the biomarkers' trends can be observed. The longitudinal study protocol consisted of: • qualifying visit (Baseline visit); • contact lens fitting visit (following day - 'Day 2' visit); • contact lens fit control at two weeks after refitting; • follow-up visits at three months, six months and 12 months post-refitting; • post-study assessment after three days (Control visit). Laboratory temperature (°C) and humidity (%RH) were monitored. The most appropriate ocular measures to fulfil the definition of DED and its sub-classifications were chosen from the ones that could be estimated in a clinical setting. Thus, the protocol of measurement included chronologically: • Ocular Surface Disease Index (OSDI) evaluation and calculation; • 5-Item Dry Eye Disease Questionnaire (DEQ-5); • tear meniscus height (TMH) measurements with Oculus Keratograph 5M (K5M); • tear osmolarity measurements acquired from the inferior tear meniscus with TearLab Osmolarity System; • non-invasive tear film break-up times (NIKBUT) assessment with K5M; • slit lamp anterior eye examination. Subsequently, ocular measures proposed in the experimental part were used as additional DED biomarkers, including: • dynamic meniscometry (tear meniscus height, depth and area estimation) assessed with OCT; • TCR assessment based on dynamic tear meniscus morphology and was followed by: • ocular surface and lid wiper staining with lissamine green and fluorescein; • infrared meibography recording with K5M. Measurements were performed with objective, automated and clinically applicable methods, using infrared radiation and non-invasive alternatives to traditional measures, whenever possible. The methods for assessing tear dynamics were proven to be not time-consuming, easy to perform and clinically applicable. Fluorescein profilometry (Experiment 1) can be used to follow subtle, dynamic changes occurring in the tear film on the whole exposed corneo-scleral surface and the measurements are not limited by corneal permeability to fluorescein. The method was also reported repeatable. A custom-written software allowing dynamic meniscometry (Experiment 2) was proposed to enhance the precision of tear meniscus morphology measurements with OCT, by minimizing the effect of tear meniscus nonconfluence after each blink on the reported estimations. OCT can be used as a rapid, qualitative and quantitative method of determining tear meniscus parameters and TCR. With this new algorithm, tear meniscus parameters can be calculated more precisely. It was also observed that the dynamic meniscometry method may provide clinicians with different information than the meniscometry performed based on static, single OCT B-scan. OCT-based measurements of early-phase TCR (Experiment 3) are non-invasive, relatively rapid and simpler to perform than the traditionally used tear exchange tests. OCT allows more in-depth visualization of tear menisci and TCR observation. Fifty-five subjects participated for the whole duration of the longitudinal study. The group mean age was (mean ± standard deviation) 26 ± 4 y/o and was ranging from 20 to 37 y/o. Based on the contact lens fitting procedure, 38 subjects (25 females and 3 males) were fitted with Silicone-Hydrogel (SiHy) and 17 subjects (11 females and 6 males) were fitted with Hydrogel (Hy) daily disposable soft contact lenses. Since there were no statistically significant differences noted between right and left eye of each subjects and between SiHy and Hy-fitted group or the group of males and females in any of the assessed ocular measures, the group of subjects was unified into one cohort and temporal changes of biomarkers' trends were analysed for the whole study group. Non-parametric two-way ANOVA showed statistically significant temporal trends in OSDI and DEQ-5 in subjects with incipient symptomatology and temporal changes in tear osmolarity, non-invasive objective measures of tear film break-up time (M-NIKBUT and F-NIKBUT), tear meniscus height assessed with dynamic meniscometry, TCR and in staining with vital dyes, lid wiper epitheliopathy (LWE) scores, corneal thickness and quantification of Meibomian gland drop-out. Statistically significant difference between Baseline and Control visit was not noted in some of these measures, suggesting that the temporal changes induced by contact lenses could be short-term. No statistically significant differences were noted in bulbar and limbal redness scores, which may suggest that changes observed in the study are not of inflammatory nature. Over the time-course of the study, a gradual decrease of tear clearance and tear osmolarity was observed. Tear meniscus area significantly negatively linearly correlated with tear osmolarity. Additionally, dynamic meniscometry method was proven to be sensitive enough to reveal potential changes in ocular surface shape. This dissertation proposes new metrics of tear dynamics quantification and explores the pathophysiological role of several ocular biomarkers of tear homeostasis. By tracking visit-to-visit trends of several potential biomarkers over the period of one year, it shows that tear osmolarity may be used to track slight changes in tear film physiology. Changes in tear osmolarity corresponded with the beneficial effect of contact lens wear on the tear film both in habitual, symptomatic contact lens wearers and in subjects initially reported as asymptomatic. All changes in tear osmolarity over a period of one year were statistically significant. Additionally, meniscometry based on dynamic changes of tear meniscus height seemed to respond to very subtle changes in tear meniscus parameters over the time-course of the study. These changes were additionally expressed as changes in OCT-based TCR. Summarizing, this dissertation proposes new methods of tear clearance and turnover assessment and shows that tear osmolarity, TCR and dynamic meniscometry measures could be used as potential biomarkers for supporting DED diagnosis, that are sensitive enough to follow the progression of subtle ocular changes in time and response to effective therapy.

[es] La siguiente disertación supone un trabajo de largo alcance con el propósito de encontrar un nuevo biomarcador de tipo macro que podría ser determinado de forma objetiva y no invasiva como indicador de ojo seco (DED), específicamente en su estado temprano. Para lograr este objetivo, se proponen nuevas métricas de cuantificación de la dinámica lagrimal y se explora el papel fisiopatológico de biomarcadores potenciales en el DED incipiente, mediante el seguimiento visita a visita de tendencias longitudinales de estas medidas durante un periodo de tiempo de un año, en sujetos con sintomatología incipiente. La hipótesis tras el desarrollo de nuevos biomarcadores de tipo macro de DED es que la pérdida de homeostasis de la película lagrimal, que describe el mecanismo fisiopatológico esencial del DED, puede ser expresada no solo como una morfología alterada de la película lagrimal, sino también por una falta de equilibrio entre los procesos hidrodinámicos que ocurren en fluido lagrimal o meniscos lagrimales. Estos fenómenos están en un estado de equilibrio regulado por la unidad funcional lagrimal. Una disrupción en este sutil equilibrio llevará en último término a DED. Basándose en la observación anteriormente mencionada, la tasa de eliminación lagrimal (TCR) fue seleccionada como un potencial macro-biomarcador de DED. La naturaleza multifactorial del DED puede ser expresada por la TCR, dado que considera todos los fenómenos hidrodinámicos que ocurren en el fluido lagrimal y ha mostrado funcionar bien en el diagnóstico diferencial de DED. En este trabajo, varias medidas oculares y protocolos que podrían ser interpretados y utilizados como potenciales cuantificadores de TCR han sido desarrollados. Es más, algunas de las medidas oculares ya existentes han sido identificadas como biomarcadores potenciales de DED. Estas medidas y cuantificadores, que pueden ser determinados de forma no invasiva y analizados objetivamente, son apropiados para completar la definición de DED y, lo que resulta de mayor importancia, pueden ser evaluados en un contexto clínico. Esta tesis doctoral ha sido dividida en dos partes principales: Parte experimental y Estudio de tendencia de biomarcadores. El capítulo experimental (Capítulo II), en forma de tres experimentos separados, propone nuevas metodologías para la cuantificación dinámica de la lágrima. La segunda parte (Capítulo III) describe el estudio longitudinal de un año de duración, que fue diseñado para seguir las tendencias visita a visita de los biomarcadores anteriormente mencionados. Es de interés desarrollar metodologías más simples y, por extensión, más aplicables clínicamente para la cuantificación de la eliminación lagrimal. Las técnicas descritas en el capítulo experimental pueden ser utilizadas para seguir, analizar y cuantificar diferentes aspectos de la dinámica del fluido lagrimal. Las medidas temporales de eliminación y renovación lagrimal fueron referidas en varios estudios como marcadores de la integridad de la unidad funcional lagrimal (LFU) e intercambio lagrimal sobre la superficie ocular. Dichas medidas tienen el potencial de convertirse en los nuevos macro-biomarcadores de DED. Considerando la probable aplicabilidad de las medidas de TCR en el apoyo al diagnóstico de DED, esta disertación propone tales nuevas soluciones en forma de tres experimentos separados. Describe dos metodologías alternativas para la determinación de TCR – una que emplea el instrumento recientemente desarrollado para la determinación de topografía corneo-escleral para seguir el decrecimiento de intensidad de fluorescencia lagrimal tras instilación de fluoresceína (Experimento 1) y el último, que permite la estimación de TCR en fase temprana (Experimento 3) con el uso de un algoritmo de meniscometría dinámica basada en tomografía óptica de coherencia (OCT) propuesto en el Experimento 2, en el que tres métodos diferentes para medir los parámetros de menisco son comparados. Los métodos para evaluar la dinámica lagrimal han demostrado ser procedimientos de corta duración, fáciles de llevar a cabo, y clínicamente aplicables. La perfilometría con fluoresceína (Experimento 1) puede ser utilizada para seguir cambios sutiles, dinámicos que ocurren en la película lagrimal en toda la superficie corneo-escleral expuesta y no está limitada por la permeabilidad corneal a la fluoresceína. El método ha mostrado también ser repetible. Un software personalizado para determinar meniscometría dinámica (Experimento 2) fue propuesto como un modo de mejorar la precisión de las medidas de morfología de menisco lagrimal con OCT, minimizando el efecto de la no-confluencia tras cada parpadeo en las estimaciones referidas. La OCT puede ser utilizada como un método rápido, cualitativo y cuantitativo para la determinación de parámetros del menisco lagrimal y tasa de eliminación lagrimal. Con este nuevo algoritmo, los parámetros de menisco lagrimal pueden ser calculados de forma más precisa tras cada parpadeo. También se ha observado que la meniscometría dinámica proporciona al clínico con información diferente que la meniscometría basada en un único corte tomográfico tipo-B estático. Las medidas basadas en OCT de la tasa de eliminación temprana (Experimento 3) son no-invasivas, relativamente rápidas y más simples de llevar a cabo que las pruebas lagrimales tradicionalmente utilizadas. La OCT permite una visualización de los meniscos lagrimales y de la eliminación lagrimal en mayor profundidad. Básicamente, el estudio longitudinal fue organizado para seguir las tendencias de los biomarcadores de acuerdo con el principal objetivo de la presente disertación, con el TCR incluido en el protocolo. Para observar los cambios temporales, longitudinales, en la fisiología ocular (estudio de tendencia de biomarcadores), se adaptaron lentes de contacto actuales a los voluntarios, desechables diarias de silicona hidrogel (SiHy, Delefilcon A) o hidrogel (Hy, Omafilcon A). El protocolo fue diseñado considerando las limitaciones de tiempo y costes. El suministro gratuito de lentes favoreció los resultados de asistencia, siguiendo un calendario sistemático, que hizo el diseño del estudio más robusto y minimizó el número de abandonos. La parte clínica del estudio duró 12 meses. La hipótesis que orientó este estudio longitudinal fue que el porte de lentes de contacto tendría impacto de alguna forma en la fisiología ocular en el transcurso del periodo de 12 meses, de modo que las tendencias de los biomarcadores podrías ser observadas. El protocolo del estudio longitudinal consistió en una visita de cualificación (basal), la visita de adaptación de lentes de contacto (día siguiente – visita del día 2), una visita de adaptación de lente de contacto a las dos semanas y visitas de seguimiento a los tres meses, seis meses y doce meses tras la adaptación, seguidas por la visita de evaluación post-estudio tras tres días (Control). La temperatura (°C) y humedad (%RH) del laboratorio fueron monitorizados. Las medidas más adecuadas para completar la definición de DED y sus subclasificaciones fueron seleccionadas a partir de aquellas que podrían ser determinadas en un entorno clínico. Por ello, el protocolo de medidas incluyó cronológicamente: índice de enfermedad de superficie ocular (OSDI) y Cuestionario de Ojo Seco de 5-items, altura de menisco lagrimal (TMH) medida con Keratograph 5M (K5M), medidas de osmolaridad lagrimal adquiridas a partir del menisco lagrimal inferior con el TearLab Osmolarity System®, tiempo de rotura lagrimal no invasiva con el Keratograph® (NIKBUT) y exploración de segmento anterior con lámpara de hendidura, siguiendo un protocolo estricto. Posteriormente, las medidas oculares propuestas en la parte experimental del proyecto fueron utilizadas como biomarcadores adicionales de DED. Ello incluyó meniscometría dinámica (estimación de altura, profundidad y área de menisco lagrimal) y determinación de TCR basado en la morfología dinámica del menisco lagrimal inferior adquirida con OCT. La cuantificación de TCR fue seguida por tinción palpebral con verde de lisamina y meibografía infrarroja obtenida con K5M. Las medidas fueron determinadas utilizando los métodos más objetivos, automatizados y clínicamente aplicables, utilizando radiación infrarroja y alternativas no invasivas a las medidas tradicionales, siempre que fue posible. Cincuenta y cinco sujetos participaron durante toda la duración del estudio. La edad promedio del grupo fue de (media ± desviación estándar) 26 ± 4 años en un rango que comprendía desde los 20 a los 37 años. Basado en los criterios de adaptación de lentes de contacto llevado a cabo en el día 2, a 38 sujetos (25 mujeres/13 hombres) y a 17 sujetos (11 mujeres/6 hombres) se les adaptó lentes de contacto desechables diarias de hidrogel de silicona (SiHy) e hidrogel (Hy), respectivamente. Dado que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ojos derecho e izquierdo, adaptados con SiHy y Hy, hombres y mujeres, en ninguno de las métricas oculares medidas y las lentes tenían características de borde similares, el grupo de sujetos fue unificado en una única cohorte y los cambios temporales en tendencia de biomarcadores fueron analizados para el grupo de estudio en conjunto. La limitación para este estudio fue la falta de control en las condiciones ambientales del estudio. Los cambios en las condiciones ambientales pueden ser debidos a cambios estacionales y no pudieron ser evitados en este estudio. Sin embargo, no se encontró correlación estadísticamente significativa entre la temperatura del laboratorio y humedad con ninguna de las medidas oculares evaluadas, excepto para la valoración de epiteliopatía palpebral. El análisis no paramétrico ANOVA mostró tendencias temporales estadísticamente significativas en OSDI y DEQ-5 en sujetos con sintomatología incipiente, en osmolaridad lagrimal, tiempos de rotura lagrimal objetiva no invasiva M-NIKBUT y F-NIKBUT, altura de menisco lagrimal evaluada mediante meniscometría dinámica y medidas de eliminación lagrimal y tinción con tinciones vitales, puntuaciones de epiteliopatía palpebral, espesor corneal y cuantificación de alteración de glándulas de Meibomio. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las visitas basal y control en algunas de estas medidas, sugiriendo que los cambios temporales inducidos por las lentes de contacto y evaluadas con este método, podrían ser a corto plazo. Tampoco se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los valores de enrojecimiento bulbar y limbal, lo que podría sugerir que los cambios observados en el estudio no son de naturaleza inflamatoria. En el transcurso del estudio, un decrecimiento gradual de la eliminación lagrimal fue probablemente debido a cambios en la morfología del saco conjuntival. El área de menisco lagrimal está significativa y negativamente correlacionada linealmente con la osmolaridad lagrimal. Adicionalmente, el método de meniscometría dinámica ha probado ser lo suficientemente sensible para revelar cambios potenciales en la forma de la superficie ocular. En resumen, la presente tesis propone nuevas métricas de cuantificación de la dinámica lagrimal y explora el papel fisiopatológico de varios biomarcadores oculares de la homeostasis lagrimal. A través de las tendencias visita a visita de varios biomarcadores potenciales durante un periodo de un año, se muestra que la osmolaridad lagrimal puede ser utilizada para seguir cambios sutiles en la homeostasis de la película lagrimal. Los cambios en la osmolaridad lagrimal se correspondieron con el efecto beneficioso del porte de lentes de contacto sobre la película lagrimal tanto en portadores habituales de lentes de contacto sintomáticos, como en sujetos inicialmente clasificados como asintomáticos. Todos los cambios en la osmolaridad lagrimal durante el periodo de un año fueron estadísticamente significativos. Adicionalmente, la meniscometría basada en cambios dinámicos en la altura de menisco lagrimal parecía responder a cambios muy sutiles en los parámetros de menisco lagrimal durante el tiempo de desarrollo del estudio. Estos cambios fueron expresados adicionalmente como cambios en la eliminación lagrimal basada en OCT. En resumen, este estudio propone nuevos métodos de evaluación de la eliminación y reemplazo lagrimal y muestra como la osmolaridad lagrimal, eliminación lagrimal y meniscometría dinámica podrían ser utilizados como potenciales biomarcadores para apoyar el diagnostico de DED, y son lo suficientemente sensibles para seguir la progresión de cambios sutiles con el tiempo y la respuesta a terapia efectiva.