[en] The aim of this doctoral thesis has been to analyze and interpret the information related to the ecophysiology of several Spanish populations of zebra mussel (Dreissena polymorpha) in different locations of the Ebro River and in the Sitjar reservoir of the Mijares River collected in 2009 within the project: "Study of the genetic structure and ecological differentiation of Spanish populations of the zebra mussel (Dreissena polymorpha) against environmental factors of natural and anthropogenic origin. Scientific bases for its sustainable environmental control (CEBRAPOP)". The physiological, biochemical and protein expression parameters, as well as metal and metallothionein levels of each of the selected populations were compared. In this study, seven populations of zebra mussels located in different points of the Ebro River and one in the Mijares river, characterized by high levels of contamination by metals of industrial origin, were selected. Zebra mussel specimens were collected in several locations of the Ebro River near the chemical plant, four of them upstream (Caspe bridge and Caspe Lago, Fayón and Mequinenza) and three downstream (Flix reservoir, Flix factory and Riba-roja). Finally, the Sitjar reservoir on the Mijares River was included since it appeared in the reports of the Júcar River Basin as an area affected by the expansion of this species. The animals were dissected at the collection point, separating the shell from the soft tissue (and in some cases storing the digestive gland and gills independently) to subsequently study the accumulation of metals, as well as to determine the selected physiological parameters and carry out the proteomic study. Regarding the accumulation of metals, it was found that the populations located upstream of Flix (Caspe, Mequinenza and Fayón) presented low levels of toxic metals in the digestive gland, which in the case of cadmium (Cd) were between 0.12 and 0.30 µg.g-1 and in the case of mercury (Hg) between 0.87 and 2.06 µg.g-1. Flix and the populations located downstream (Riba-roja and Flix reservoir) and close to the chlor-alkali plant had elevated levels of Cd (0.98 µg.g-1) and Hg (14.91 µg.g-1). In addition, parameters indicative of their osmoregulatory status (water content index, DWI) were lower than those of upstream populations. The Sitjar population had the highest lead content of all the populations studied, with a mean value of 0.24 µg.g-1in the digestive gland. Copper (Cu) and Zinc (Zn) levels in the two tissues were found to be fairly uniform among all study populations in autumn, consistent with the existence of regulatory mechanisms for essential metals. However, the content of Cu in the digestive gland in spring and that of Zn in both tissues in autumn was variable among populations. 11 As with metal content, metallothionein (MT) content was higher in the digestive gland than in the gills in all populations. MT content in the gills was negatively correlated with Cd and Hg content. In the digestive gland, MT concentration values presented a positive correlation with Cd and Hg content, so that populations downstream of Flix (with higher Hg and Cd) presented higher MT values, possibly as a consequence of the activation of cellular defense mechanisms against chemical stress. In the population near the Flix factory, MT values in the digestive gland reached 2439 µg.g-1 , while in the upstream localities these values were four times lower. Na+/K+-ATPase activity in gills was higher and more variable among populations in spring than in autumn. The proteomic study carried out on mussel gills using DIGE methodology allowed us to define protein expression patterns characteristic of each population studied and to relate them to environmental factors including metal contamination. A total of 3626 proteins were detected, finding significant differences in their abundance among the different populations in 161 of them. Using the hierarchy method, it was found that the populations of Fayón (Ebro River), whose tissues present high levels of essential metals Cu, Zn and potassium (K), and the population of Sitjar (Mijares River), with high values of Pb in the gills, presented a similar expression pattern between them and quite different from the rest of the populations. On the other hand, the Caspe and Mequinenza populations, upstream of Flix, where Cd, Pb and Hg contamination was lower than in the rest of the populations, showed a similar protein expression pattern between them. The Caspe Lago population was somewhat different from the other two. The protein profiles of the populations of Flix Fábrica, Embalse de Flix and Riba-roja (all of them in the Ebro river), with higher values of toxic metals in their tissues than in the rest of the populations, did not allow a good separation between the populations of the different localities as there was an overlap that made it difficult to differentiate them from each other as there was no predominance of proteins with higher or lower abundance. Among the 35 proteins selected for their differential expression between populations, it was found that the most relevant biological functions were: cellular processes (25%), response to stimuli and metabolism (14%), and finally regulation and transport (8%). The most significant molecular functions were: catalytic activity (37%), binding (24%) and transporter activity (3%). The main cellular components were: cytoplasm (22%), cellular anatomical regions (22%), membrane (14%) and organelle (8%). These 35 proteins can be grouped into 4 classes: structural proteins (e.g. actin, spectrin, and tubulin), heat stress response proteins (e.g. HSP90, HSP83), ion transport proteins (e.g. V-type proton ATPase) and metabolism proteins (e.g. proteosome, thiolase). 12 In general, this study has allowed us to differentiate the zebra mussel populations according to the values of contaminants present in the specific tissues selected (digestive gland and gills), as well as the levels of MT and the changes seen in the pattern of protein expression in each locality. It has also been possible to relate the osmoregulatory status of these organisms to the characteristics of their natural habitat, such as the availability of nutrients (phosphorus), essential metals (Cu and Zn) and K. Those populations located in the upper reaches of the Ebro River with a lower affectation by pollutants and a higher amount of nutrients are those with individuals with a better physiological status. However, the localities geographically close to the municipality of Flix (downstream), offer a more hostile habitat, and the zebra mussels must adapt cellularly and biochemically to the toxicity of heavy metals by means of defences such as MT. On the other hand, the population of the Sitjar reservoir is an example of the adaptation of this species to unfavourable abiotic factors such as the presence of lead.

[es] El objetivo de la presente Tesis doctoral ha sido analizar e interpretar la información relativa a la ecofisiología de varias poblaciones españolas de mejillón cebra (Dreissena polymorpha) en diferentes puntos del río Ebro y en el embalse de Sitjar del rio Mijares recogidas en el año 2009 dentro del proyecto:" Estudio de la estructura genética y diferenciación ecológica de las poblaciones españolas del mejillón cebra (Dreissena polymorpha) frente a factores ambientales de origen natural y antropogénico. Bases científicas para su control ambiental sostenible (CEBRAPOP)". Se han comparado los parámetros fisiológicos, bioquímicos y de expresión proteica de cada una de las poblaciones, así como los niveles de metales y metalotioneina. En este estudio se seleccionaron siete poblaciones de mejillón cebra localizadas en diferentes puntos del río Ebro y una en el rio Mijares, caracterizados por altos niveles de contaminación por metales de origen industrial. Se recogieron ejemplares de mejillón cebra en varias localizaciones del río Ebro próximas a la planta química, cuatro de ellas corriente arriba (Caspe puente y Caspe Lago, Fayón y Mequinenza) y tres situadas corriente abajo (Embalse de Flix, fábrica de Flix y Riba-roja). Por último, se incluyó el embalse de Sitjar en el río Mijares ya que en los informes de la Cuenca Hidrográfica del Júcar aparecía como zona afectada por la expansión de esta especie. Los animales fueron diseccionados en el punto de recogida, separando la concha del tejido blando (y en algunos casos almacenando la glándula digestiva y las branquias independientemente) para con posterioridad estudiar la acumulación de metales, así como para determinar los parámetros fisiológicos seleccionados y realizar el estudio proteómico. Respecto a la acumulación de metales se encontró que las poblaciones situadas corriente arriba de Flix (Caspe, Mequinenza y Fayón) presentaban niveles de metales tóxicos bajos en la glándula digestiva, que en el caso del cadmio (Cd) estaban entre 0,12 y 0,30 µg.g- 1 y en el caso del mercurio (Hg) entre 0,87 y 2,06 µg.g- 1 . Flix y las poblaciones situadas corriente abajo (Ribaroja y embalse de Flix) y próximas a la planta cloro-alcalina tenían elevados niveles de Cd de 0,98 µg.g-1 y de Hg (14,91 µg.g- 1 ). Además, los parámetros indicativos de su estado osmorregulatorio (índice de contenido hídrico, DWI por sus siglas en inglés) eran inferiores a los de las poblaciones situadas corriente arriba. La población de Sitjar es la que presentaba un contenido mayor de plomo respecto de todas las poblaciones estudiadas, con un valor medio de 0,24 µg.g-1 en glándula digestiva. Se encontraron niveles de cobre (Cu) y Zinc (Zn) en los dos tejidos bastante uniformes entre todas las poblaciones de estudio en otoño siendo coherente con 8 la existencia de mecanismos de regulación para los metales esenciales. Sin embargo, el contenido de Cu en la glándula digestiva en primavera y el de Zn en ambos tejidos en otoño fue variable entre poblaciones. Al igual que ocurre con el contenido en metales, el contenido de metalotioneína (MT) fue mayor en la glándula digestiva que en las branquias en todas las poblaciones. El contenido de MT en las branquias se correlacionó de forma negativa con el contenido de Cd y Hg. En la glándula digestiva los valores de concentración de MT presentaron una correlación positiva con el contenido de Cd y Hg, de forma que las poblaciones situadas corriente abajo de Flix (con mayor cantidad de Hg y Cd) presentaron mayores valores de MT, posiblemente como consecuencia de la activación de mecanismos de defensa celular ante el estrés químico. En la población próxima a la Fábrica de Flix se alcanzaron valores de MT en glándula digestiva de 2439 µg.g -1 mientras que en las localidades corriente arriba estos valores fueron cuatro veces inferiores. La actividad Na+/K+-ATPasa en las branquias fue mayor y más variable entre poblaciones en primavera que en otoño. El estudio proteómico realizado en las branquias de los mejillones mediante metodología DIGE permitió definir patrones de expresión proteica característico de cada población de estudiada y relacionarlo con factores ambientales incluyendo la contaminación por metales. Se detectaron 3626 proteínas, encontrándose diferencias significativas en su abundancia entre las diferentes poblaciones en 161 de ellas. A través del método de jerarquía de grupos se comprobó que las poblaciones de Fayón (río Ebro), cuyos tejidos presentan niveles elevados de metales esenciales Cu, Zn y de potasio (K), y la población de Sitjar (río Mijares), con altos valores de Pb en las branquias, presentaron un patrón de expresión similar entre ambas y bastante diferente al resto de las poblaciones. Por otra parte, las poblaciones de Caspe y Mequinenza, corriente arriba de Flix, donde la contaminación por Cd, Pb y Hg fue menor que en el resto de las poblaciones, mostraron un patrón de expresión de proteínas similar entre ellas. La población de Caspe Lago fue algo diferente de las otras dos. Los perfiles proteicos de las poblaciones de Flix Fábrica, Embalse de Flix y Riba-roja (todas ellas en el río Ebro), con valores más altos de metales tóxicos en sus tejidos que en el resto de las poblaciones, no permitieron una buena separación entre las poblaciones de las diferentes localidades al existir un solapamiento que dificulta diferenciarlas entre sí al no haber un predominio de proteínas con mayor o menor abundancia. De las 35 proteínas seleccionadas por su expresión diferencial entre poblaciones se encontró que las funciones biológicas más relevantes fueron: procesos celulares (25%), respuesta a estímulos y metabolismo (14%), y por último regulación y el transporte (8%). Las 9 funciones moleculares más significativas fueron: actividad catalítica (37%), unión (24%) y actividad de un transportador (3%). Los componentes celulares principales fueron: citoplasma (22%), regiones anatómicas celulares (22%), membrana (14%) y orgánulo (8%). Estas 35 proteínas pueden agruparse en 4 clases: proteínas estructurales (ej. actina, espectrina, y tubulina), de respuesta al estrés térmico (ej.: HSP90, HSP83), de transporte iónico (ej. V-tipo protón ATPasa) y de metabolismo (ej. proteosoma, tiolasa). En general, este estudio ha permitido diferenciar las poblaciones de mejillón cebra en función de los valores de los contaminantes presentes en los tejidos específicos de los mejillones cebra (glándula digestiva y branquias) así como de los niveles de MT y los cambios apreciados en el patrón de expresión proteica de cada localidad. También se ha podido relacionar el estado osmorregulatorio de estos organismos en función de las características de su hábitat natural, como la disponibilidad de nutrientes (fósforo), de metales esenciales (Cu y Zn) y de K. Aquellas poblaciones situadas en el curso alto del río Ebro con menor afectación por contaminantes y mayor cantidad de nutrientes son las que presentan individuos con mejor estado fisiológico. Sin embargo, las localidades próximas geográficamente al municipio de Flix (corriente abajo), ofrecen un hábitat más hostil, debiendo los mejillones cebra adaptarse celular y bioquímicamente a la toxicidad de los metales pesados mediante defensas como la MT. Por otra parte, la población del embalse de Sitjar es un ejemplo de la adaptación de esta especie a factores abióticos desfavorables como es la presencia de plomo.