[en] Introduction Endometriosis is a chronic gynecological disease that affects an increasing number of women worldwide. Despite the growing number of articles published in recent years, there are many gaps in knowledge about the etiology and pathophysiology of this disease. In addition, the difficulties in its diagnosis, mainly surgical, and in its treatment, focused on reducing the symptoms, further hinder its approach. Available knowledge suggests that it is a multifactorial disease, in which genetic, immunological, hormonal and environmental factors interact simultaneously. Along with the increase in the incidence of this disease, in recent decades there has been a parallel increase in the environmental presence of synthetic chemical substances with hormonal activity. Many of these chemicals, endocrine-disrupting chemicals (EDCs), are used in cosmetics and personal care products (PCPs), causing the population to be exposed on a daily basis. Since endometriosis is considered a hormone-dependent disease, it is suspected that human exposure to EDCs could be behind the increased risk of this disease. Objective The main objective of this doctoral thesis was to explore the association between exposure to EDCs, specifically to two families of these compounds, parabens-PB and benzophenones-BP, present in cosmetics and PCPs, and risk of onset and development of endometriosis in women of childbearing age. For this goal, the following specific objectives were proposed: Objective 1: To evaluate the concentrations of PBs and BPs in menstrual blood, a matrix in intimate contact with the endometrium, compare the concentrations of these contaminants in menstrual and peripheral blood, and explore related sociodemographic and lifestyle factors. Objective 2: To investigate the associations between exposure to PBs and BPs and risk of endometriosis, as well as with the frequency of use of cosmetics and PCPs, and to evaluate the influence of oxidative stress on the associations found. Objective 3: To describe the expression profile in endometriotic tissue of different genes related to key cell signaling pathways for the development and progression of endometriosis, and to explore their relationship with the concentrations of PBs and BPs in this tissue. Objective 4: To evaluate the biological activity (estrogenic and anti-androgenic) of cosmetic products and formulations of the company Inves Biofarm, and to analyze the presence of different endocrine disruptors. Material and Methods To answer objective 1, PB and BP concentrations were determined in menstrual and peripheral blood samples from healthy Spanish volunteers. Blood concentrations of PBs and BPs were determined by dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLCMS/ MS). Sociodemographic and lifestyle information was obtained by using different questionnaires. To answer objectives 2 and 3, a case-control study was designed, collecting fasting urine samples from women of childbearing age with a confirmed diagnosis of endometriosis by surgery (cases), and from women without a diagnosis of endometriosis, who underwent laparotomy or laparoscopy in the same hospital as the cases, but with a diagnosis of non-malignant disease (controls). Endometriotic tissue samples were also collected from the cases. Urinary concentrations of PBs and BPs were determined by DLLME and UHPLC-MS/MS. Oxidative stress biomarkers were evaluated in all urine samples using different enzyme kits. The expression profiles of 36 genes involved in 9 cell signaling pathways related to endometriosis were determined in endometriotic tissue samples by real-time PCR. Sociodemographic, clinical and surgical information was obtained using different questionnaires. To answer objective 4, we evaluated the concentrations of PBs and BPs and analyzed the estrogenic and anti-androgenic activity of 6 cosmetic products, 1 cosmetic formulation and 2 plastic packages, provided by the private company Inves Biofarm. Results Article 1: All menstrual blood samples had detectable levels of ≥3 of the selected compounds, and 52.6% of the samples contained ≥6 compounds. MeP, PrP, and BP-3 were the most frequently detected compounds (detection frequencies >90.0%). Age, use of PCPs and consumption of some foods (meat, pasta, cheese or dairy products) were related to menstrual blood concentrations of some PBs/BPs. Concentrations of EDCs measured in menstrual and peripheral blood did not correlate, or correlated weakly, with concentrations in peripheral blood being higher. Article 2: The frequency of use of certain cosmetics and PCPs was significantly associated with urinary concentrations of PBs and BPs. After adjusting for possible confounders, the risk of endometriosis was higher when comparing women in the second versus first tertile of MeP (OR=5.63; p<0.001), BP-1 (OR= 5.12; p=0.011), BP-3 (OR=4.98; p=0.008), and ƩBPs (OR=3.34; p=0.032). No significant associations were found when comparing women in the third versus first tertile of exposure. Oxidative stress did not modify the associations found between exposure to PBs/BPs and risk of endometriosis. Article 3: Although inflammation could play a central role in the pathophysiology of endometriosis and is considered as a possible mechanism of action of EDCs, a systematic review of the scientific literature on human exposure to PBs and BPs and inflammatory biomarkers showed the paucity of studies and information in this area of knowledge and the need for further research to get a better understanding on the underlying mechanisms of action of PBs and BPs, and the key role that inflammation could play in endometriosis. Articles 4 and 5: More than half of the selected genes were found to be expressed in >75% of the endometriotic tissue samples analyzed. The concentration of PB and BP congeners analyzed was positively associated with the expression of genes related to key cellular pathways in the development of endometriosis, such as genes for cell adhesion, migration/invasion/metastasis, inflammation, angiogenesis, cell proliferationhormone stimulation, cell cycle, cell differentiation and lipid metabolism. No associations were found between exposure to PBs and BPs and apoptosis genes. Collaboration with the company Inves Biofarm: no detectable concentrations of PBs and BPs were found in any of the plastic packages tested, or in the cosmetic formulation provided. Detectable concentrations of MeP, EtP and PrP were only found in one sample, and BP-3 was detected in four of the received cosmetic products. The plastic packages showed estrogenic and anti-androgenic activity depending on the chosen extraction methodology. Only some cosmetic products and plastic packages extracted with chloroform and acetonitrile showed estrogenic and antiandrogenic activities. Conclusion Human exposure to hormone-active chemicals, present in some cosmetics and PCPs, could increase the risk of endometriosis in women of childbearing age. This exposure could also be related to the expression of genes involved in key cell signaling pathways for the development of this disease. It is therefore necessary to eliminate or restrict the use of PBs or BPs in the composition of cosmetics and PCPs, which could help to decrease human exposure to these EDCs and, therefore, reduce the risk of onset and development of endometriosis.

[es] Introducción La endometriosis es una enfermedad ginecológica crónica que afecta cada vez a un mayor número de mujeres en todo el mundo. A pesar del número creciente de artículos publicados en los últimos años, son muchas las lagunas del conocimiento existentes en torno a la etiología y fisiopatología de esta enfermedad. Además, las dificultades en su diagnóstico, principalmente quirúrgico, y en su tratamiento, enfocado a disminuir la sintomatología, obstaculizan aún más su abordaje. El conocimiento disponible sugiere que se trata de una enfermedad multifactorial, en la que interactúan de forma simultánea factores genéticos, inmunológicos, hormonales y ambientales. Junto con el incremento en la incidencia de esta enfermedad se ha producido, en las últimas décadas, un aumento paralelo de la presencia ambiental de sustancias químicas de síntesis con actividad hormonal. Muchas de estas sustancias químicas, disruptores endocrinos (EDCs), se utilizan en cosméticos y productos de cuidado personal (PCPs), haciendo que la población esté diariamente expuesta. Dado que la endometriosis está considerada como una enfermedad hormono-dependiente, se sospecha que la exposición humana a EDCs podría estar detrás del aumento en el riesgo de esta enfermedad. Objetivo El objetivo principal de esta tesis doctoral fue explorar la asociación entre la exposición a EDCs, específicamente a dos familias de estos compuestos, parabenos-PB y benzofenonas-BP, presentes en cosméticos y PCPs, y el riesgo de aparición y desarrollo de endometriosis en mujeres en edad fértil. Para ello, se propusieron los siguientes objetivos específicos: Objetivo 1: Evaluar las concentraciones de PBs y BPs en sangre menstrual, una matriz en contacto íntimo con el endometrio, comparar las concentraciones de estos contaminantes en sangre menstrual y periférica, y explorar factores sociodemográficos y de estilo de vida relacionados. Objetivo 2: Investigar las asociaciones entre la exposición a PBs y BPs y el riesgo de endometriosis, así como con la frecuencia de uso de cosméticos y PCPs, y evaluar la influencia del estrés oxidativo en las asociaciones encontradas Objetivo 3: Describir el perfil de expresión en tejido endometriósico de diferentes genes relacionados con vías de señalización celular claves para el desarrollo y progresión de la endometriosis, y explorar su relación con las concentraciones de PBs y BPs en este tejido. Objetivo 4: Evaluar la actividad biológica (estrogénica y anti-androgénica) de productos y formulaciones cosméticas de la empresa Inves Biofarm, y analizar la presencia de diferentes disruptores endocrinos. Material y Métodos Para dar respuesta al objetivo 1, se determinaron las concentraciones de PBs y BPs en muestras de sangre menstrual y periférica de mujeres voluntarias españolas sanas. Las concentraciones sanguíneas de PBs y BPs se determinaron mediante microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME) y cromatografía líquida de ultra alta resolución con espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). La información sociodemográfica y de estilo de vida se obtuvo mediante el uso de diferentes cuestionarios. Para dar respuesta a los objetivos 2 y 3, se diseñó un estudio caso-control, recogiendo muestras de orina en ayunas de mujeres en edad fértil con diagnóstico confirmado de endometriosis mediante cirugía (casos), y de mujeres sin diagnóstico de endometriosis, sometidas a laparotomía o laparoscopia en el mismo hospital que los casos, pero con diagnóstico de enfermed no maligna (controles). Se recogieron también muestras de tejido endometriósico de los casos. Las concentraciones urinarias de PBs y BPs se determinaron mediante DLLME y UHPLC-MS/MS. Se evaluaron biomarcadores de estrés oxidativo en todas las muestras de orina mediante diferentes kits enzimáticos. Los perfiles de expresión de 36 genes involucrados en 9 vías de señalización celular, relacionadas con la endometriosis, se determinaron en muestras de tejido endometriosico mediante PCR en tiempo real. La información sociodemográfica, clínica y quirúrgica se obtuvo mediante el uso de diferentes cuestionarios. Para dar respuesta al objetivo 4, se evaluaron las concentraciones de PBs y BPs y se analizó la actividad estrogénica y anti-androgénica de 6 productos cosméticos, además de 1 principio activo y 2 envases de plástico, proporcionados por la empresa privada Inves Biofarm. Resultados Artículo 1: Todas las muestras de sangre menstrual tenían niveles detectables de ≥3 de los compuestos seleccionados, y el 52.6% de las muestras contenían ≥6 compuestos. MeP, PrP y BP-3 fueron los compuestos detectados con mayor frecuencia (frecuencias de detección >90.0%). La edad, el uso de PCPs y el consumo de algunos alimentos (carne, pasta, queso o productos lácteos) se relacionaron con las concentraciones sanguíneas menstruales de algunos PBs/BPs. Las concentraciones de los EDCs medidos en sangre menstrual y periférica no se correlacionaron, o lo hicieron débilmente, siendo las concentraciones en sangre periférica más altas. Artículo 2: La frecuencia de uso de ciertos cosméticos y PCPs se asoció significativamente con las concentraciones urinarias de PBs y BPs. Después de ajustar por posibles factores de confusión, el riesgo de endometriosis fue mayor cuando se compararon a las mujeres en el segundo versus primer tercil de MeP (OR=5.63; p<0.001), BP-1 (OR=5.12; p=0.011), BP-3 (OR=4.98; p=0.008) y ƩBPs (OR=3.34; p=0.032). No se encontraron asociaciones significativas cuando se compararon a las mujeres en el tercer versus primer tercil de exposición. El estrés oxidativo no modificaba las asociaciones encontradas entre exposición a PBs/BPs y riesgo de endometriosis. Artículo 3: A pesar de que la inflamación podría desempeñar un papel central en la fisiopatología de la endometriosis y está considerada como un posible mecanismo de acción de los EDCs, una revisión sistemática de la literatura científica sobre exposición humana a PBs y BPs y biomarcadores inflamatorios mostró la escasez de estudios e información en este área de conocimiento y la necesidad de seguir investigando para comprender mejor los mecanismos de acción subyacentes a los PBs y BPs, y el papel fundamental que podría desempeñar la inflamación en la endometriosis. Artículos 4 y 5: Más de la mitad de los genes seleccionados se encontraron expresados en >75% de las muestras de tejido endometriósico analizadas. La concentración de los congéneres de PBs y BPs analizados se asoció positivamente con la expresión de genes relacionados con vías celulares clave en el desarrollo de la endometriosis, concretamente genes de adhesión celular, migración/invasión/metástasis, inflamación, angiogénesis, proliferación celular-estimulación hormonal, ciclo celular, diferenciación celular y de metabolismo lipídico. No se encontraron asociaciones entre la exposición a PBs y BPs y genes de la apoptosis. Colaboración con la empresa Inves Biofarm: No se encontraron concentraciones detectables de PBs y BPs en ninguno de los envases de plástico analizados, ni tampoco en el principio activo proporcionado. Solo se encontraron concentraciones detectables de MeP, EtP y PrP en una muestra, y de BP-3 en cuatro de los productos cosméticos recibidos. Solamente algunos productos cosméticos y envases de plástico extraídos con cloroformo y acetonitrilo mostraron actividades estrogénica y antiandrogénica. Conclusión La exposición humana a sustancias químicas con actividad hormonal, presentes en algunos cosméticos y PCPs, podría aumentar el riesgo de endometriosis en mujeres en edad fértil. Esta exposición podría también estar relacionada con la expresión de genes involucrados en vías de señalización celular claves para el desarrollo de esta enfermedad. Es necesario, por tanto, eliminar o restringuir el uso de PBs o BPs en la composición de cosméticos y PCPs, lo que podría ayudar a disminuir la exposición humana a estos EDCs y, con ello, el riesgo de aparición y desarrollo de endometriosis.