[en] Alpha-1-antitrypsin deficiency (AATD) is a genetic disorder characterized by low serum levels of alpha-1-antitrypsin protein (AAT) and a high risk of developing early onset emphysema and liver disease. About 125 allelic variants of the AAT gene have been described. The most common normal AAT allele is the M variant, and the most frequent deficient variants are Z and S. However, another rare deficient variant, called Mmalton, which causes a deficiency similar to variant Z, is considered to be the second cause of severe AATD in Spain. This variant is difficult to detect with the common diagnostic techniques (serum AAT measurement and phenotype characterization). This fact has contributed to a misclassification of this variant and the subsequent underestimation of its real prevalence in the population. Thus, we designed an allele-specific genotyping technique for the detection of the Mmalton variant and we tested its applicability using whole blood, DBS (dried blood spot) and serum samples. Results showed the utility of this technique for the rapid and cost-effective characterization of a deficiency variant with a difficult detection. Moreover, this method could be adapted for the study of the most prevalent rare variants in each region. When genotyping is required, DNA from whole blood or DBS sample is necessary. Occasionally these kinds of samples are not available in the laboratory and additional new extraction is required, causing a significant delay in AATD diagnosis. To avoid this, we developed allele-specific genotyping and exonic sequencing of AAT gene protocols using DNA present in serum samples (sample used at the first steps of the diagnosis). These techniques were incorporated to the laboratory diagnostic algorithm, allowing the complete diagnosis using an only kind of sample and thus, avoiding the delay generated when genotyping is necessary. With the purpose of promoting the expansion of screening programs for the identification of AATD individuals, buccal swab samples were assessed as an alternative to DBS samples. This kind of sample is easy to collect, store and deliver and it recovers a large amount of DNA, resulting in an easy genotyping. Results showed these methodologies may be useful to expand AATD screening programs and complete the diagnostic without delay. The algorithm proposed in this study allows a complete AATD diagnosis avoiding two main problems: significant delay when the doctor performs the diagnostic request and the underdiagnosis of the rare AAT variants.

[es] El déficit de alfa-1-antitripsina (DAAT) es una enfermedad genética que se caracteriza por la presencia de niveles bajos de la proteína alfa-1-antitripsina (AAT) en suero y causa principalmente desarrollo temprano de enfisema pulmonar y hepatopatía. Se han descrito alrededor de 125 variantes alélicas del gen de la AAT. El alelo normal más común en la población es el M, y las variantes deficitarias más frecuentes son la S y la Z, siendo esta última causante de un déficit severo. Sin embargo, otra variante deficitaria rara, llamada Mmalton, causante de un déficit similar al alelo Z, es considerada la segunda causa de DAAT en España. Esta variante es difícil de caracterizar mediante las técnicas de diagnóstico habituales (cuantificación de AAT en suero y fenotipado). Este hecho, ha contribuido a la clasificación errónea de esta variante y con ello, a la subestimación de su prevalencia real en la población. Por ello, en esta tesis se diseñó una técnica de genotipado alelo-específico para la detección de la variante Mmalton y se testó su aplicabilidad utilizando muestras de sangre total, DBS (gota de sangre seca) y de suero. Los resultados mostraron la utilidad de esta técnica para la caracterización rápida y coste-efectiva de una variante deficitaria de difícil detección. Así mismo, este método puede ser adaptado para la detección de las variantes raras más prevalentes de cada región. Cuando se ha de realizar el genotipado, es necesario ADN procedente de sangre total o DBS. En ocasiones estas muestras no están disponibles en el laboratorio, por lo que se debe realizar una nueva extracción, generando un retraso en el diagnóstico del DAAT. Para evitar esto, se desarrollaron protocolos de genotipado alelo-específico y secuenciación exónica del gen de la AAT utilizando muestra de suero (muestra utilizada en los primeros pasos del diagnóstico). Estas técnicas fueron incorporadas al algoritmo de diagnóstico del laboratorio, permitiendo realizar un diagnóstico completo utilizando un solo tipo de muestra y por tanto, evitando el retraso generado cuando el genotipado era necesario. Por otro lado, con el fin de incrementar los programas de cribado para la identificación de individuos con DAAT, se presentó la muestra de frotis bucal como una alternativa al DBS. Esta muestra es fácil de obtener, almacenar y enviar y permite disponer de gran cantidad de ADN para la realización del genotipado. Los resultados mostraron que las metodologías descritas ayudan a promover la expansión de los programas de detección del DAAT y mejorar la rapidez de su diagnóstico. El algoritmo propuesto en el presente trabajo, permite realizar un diagnóstico completo del DAAT evitando dos problemas principales del diagnóstico de esta enfermedad, como son el significativo retraso producido una vez el clínico realiza la petición de diagnóstico y el infradiagnóstico de las variantes raras de la AAT.