[ca] La lactosa és un dissacàrid de la llet produït per gaire bé tots els mamífers. Per a la seva digestió cal que sigui hidrolitzada per la lactasa (EC. 3.3.1.23), que és produïda per les cèl·lules epitelials de l'intestí prim, donant lloc a galactosa i glucosa. La seva deficiència o baixa quantitat (hipolactàsia) pot produir diversos símptomes incloent inflor, dolor abdominal, flatulències i diarrea. L'avaluació de la deficiència de la lactasa és principalment important en pediatria i en gastroenterologia a causa de l'elevada incidència de l'alteració genètica de la lactasa en aquests grups poblacionals (65%). La majoria dels mètodes de diagnòstic són invasius i dràstics i no són adequats per a ser aplicats a infants. Davant d'aquesta situació, un nou mètode no invasiu va ser desenvolupat. Aquest es basa en l'administració de 4-O-β-D-galactopiranosil-D-xilose (gaxilosa), un anàleg estructural de la lactosa. Aquest compost també es substrat per la lactasa i és hidrolitzat donant lloc a galactosa i xilosa. Aquest segon és absorbit passivament per l'intestí prim i és eliminat per orina on pot ser fàcilment detectat per un mètode colorimètric senzill. La síntesi química de la gaxilosa necessita de l'ús de grups protectors i de llargs i complexes etapes sintètiques per arribar a rendiments de producció baixos (9%). La ruta biosintètica utilitzant galactosiltransferases implica diverses dificultats tècniques i costos elevats. Les glicosidases tenen la capacitat de formar enllaços o-glicosídics per transglicosidació amb costos baixos. Els desavantatges d'aquesta metodologia són els baixos rendiments limitats per la competència de l'activitat hidrolítica i els problemes de purificació per la formació de regioisòmers o altres productes. La β–galactosidasa d'Escherichia coli va ser seleccioionada entre altres enzims per la producció de gaxilosa a nivell industrial. Després de diversos passos de purificació el rendiment obtingut és del 20-23%. Aquest treball pretén augmentar el rendiment en la producció de gaxilosa. Primer, les condicions de reacció es van modificar per tal d'augmentar l'activitat enzimàtica de transglicosidació. D'altra banda, es va buscar un altre enzim per ser utilitzat en la producció de gaxilosa. Estudis bibliogràfics i experimentals van permetre la selecció d'un nou enzim capaç de sintetitzar més gaxilosa, arribant a un rendiment final del 35% utiiltzant 3,3 cops menys enzim (amb la corresponent disminució dels costos de producció). Tot i que el nou enzim presentava una activitat de transglicosidació superior a l'enzim d'E. coli, la seva activitat hidrolítica romanent no permetia augmentar-ne més el rendiment. Per modificar l'activitat enzimàtica i augmentar la síntesi de gaxilosa es va optar per utilitzar modificar l'enzim amb enginyeria de proteïnes (racional i aleatòria).

[es] La lactosa es un disacárido de la leche producido por casi todos los mamíferos. Para su digestión debe ser hidrolizado per la enzima lactasa (EC. 3.3.1.23), que es producida por las células epiteliales del intestino delgado, dando lugar a glucosa i galactosa. Su deficiencia o baja concentración (hipolactasia) puede producir diversos síntomas como son hinchazón, dolor abdominal, flatulencias y diarrea. La evaluación de la deficiencia de la lactasa es importante en pediatría y gastroenterología por la elevada frecuencia de esta alteración genética (65%). La mayoría de los métodos de diagnóstico son invasivos y drásticos y no son adecuados para su uso en población infantil. Frente a esta situación, se desarolló un nuevo método no invasivo. Éste se basa en la administración de 4-O-β-D-galactopiranosil-D-xilose (gaxilosa), un análogo estructural de la lactosa. Este compuesto también es sustrato de la lactasa y es hidrolizado dando lugar a galactosa y xilosa. El segundo se absorbe pasivamente a través del intetsino delgado y se elimina a través de la orina donde puede ser detectado por un método colorimétrico senzillo. La síntesi química de la gaxilosa requiere del uso de grupos protectores y de largos y complejos pasos de síntesis para llegar a rendimientos de producción bajos (9%). La ruta biosintética utilizando galactosyltransferasas comporta dificultades técnicas y costes elevados. Por otro lado, las glicosidasas tienen la capacidad de síntesis de glicósidos por transglicosidación con costes bajos. La principal desventaja de esta metodologia son los bajos rendimientos por la actividad hidrolítica de la enzima y los problemas de purificación por la formación de regioisómeros y/u otros productos. La β-galactosidasa de Escherichia coli fue seleccionada, entre otras enzimas, para la producción de gaxilosa a nivel industrial. Después de varios pasos de purificación el rendimiento es del 20-23%. Este trabajo pretende aumentar el rendimiento de la producción de gaxilosa. Primero se modificaron las condiciones de reacción para aumentar la activitat enzimática de transglicosidación. Por otro lado, se buscó otra enzima para la producción industrial. Estudios bibliográficos y experimentales permitieron la selección de una nueva enzima capaz de sintetitzar más gaxilosa, llegando a un rendimiento del 35% utilizando 3,3 veces menos enzima (con la consecuente disminución de los costes de producción). Aunque la nueva enzima presentaba una actividad de transglicosidación mayor, la actividad hidrolítica remanente no permite aumentar el rendimento. Para modificar la actividad enzimática y aumentar la síntesis de gaxilosa se decidió modificar la enzima mediante ingeniería de proteínas (racional y aleatoria).