[ca] La Fibrosis quística (FQ) és la malaltia genètica recessiva letal més freqüent a la població caucàsica. Més de 1600 mutacions al gen CFTR han estat descrites com a responsables de FQ i/o han estat associades a altres malalties com l¿absència bilateral de conductes deferents, la pancreatitis crònica i les bronquiectàsies. El procés d'splicing està estrictament regulat per diferents seqüències genòmiques i factors de transcripció. Aquest fi engranatge és susceptible de veure's afectat de forma absoluta o parcial per la presència de mutacions, donant lloc a un número variable de transcrits i, en conseqüència, a un ampli espectre fenotípic. Per determinar la rellevància clínica dels nivells d'expressió de CFTR, l'objectiu principal d'aquest treball ha estat l'estudi dels mecanismes moleculars subjacents en mutacions CFTR que afecten l'splicing, mitjançant el desenvolupament de tècniques complementàries per la seva caracterització a nivell de DNA, RNA i proteïna. Per dur a terme aquest objectiu s'ha emprat l'epiteli nasal, una mostra accessible, que ens ha permès, l'anàlisi d'expressió del gen i la localització de la proteïna CFTR. La seva caracterització genòmica ha estat fonamental per la identificació de mutacions i SNPs, i ha permès la formació acurada de grups d'estudi (individus controls, portadors i pacients). L'RT-qPCR ha estat una tècnica essencial i la normalització de dades n'és un pas imprescindible per determinar l'expressió. En aquest treball s'ha aplicat un procés acurat de selecció de gens de referència (geNorm, NormFinder, Kruskal-Wallis) i s'han validat els gens GUSB i PMCA4 com la millor combinació per l'estudi de l'expressió de CFTR. L'anàlisi in silico i qualitatiu de més de 30 mutacions missense, nonsense i d'splicing al gen CFTR ha permès la identificació de transcrits aberrants en les mutacions c.580-1G>T, c.2657+5G>A i c.3718-1G>A. La quantificació de transcrits per la mutació c.2657+5G>A ha portat a la identificació d'un nou al·lel complex amb el cSNP c.2562T>G (p.=). A nivell proteic, la manca de proteïna observada en les tres mutacions correlaciona amb els nivells de transcrits quantificats en cada una de elles, i ambdós ho fan amb el fenotip dels individus portadors de mutacions d'splicing. En conclusió, l'anàlisi quantitativa de transcrits ha mostrat una correlació amb el fenotip d'individus portadors de mutacions d'splicing, i en conseqüència pot ser útil com a paràmetre complementari per a l'avaluació de teràpies moleculars dirigides a la correcció d'splicings aberrants.

[en] Cystic fibrosis (CF) is the most common recessive genetic disease in Caucasian population. Over 1,600 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene sequence variations have been identified in patients with cystic fibrosis (CF) and/or related disorders such as congenital bilateral absence of the vas deferens, chronic pancreatitis and bronchiectasis. The splicing process has been shown to be regulated in multiple ways. An interplay of cis-acting sequences and trans-acting factors modulates splicing by the interaction of many complexes, proteins, DNA domains, etc. This fine machinery is susceptible to be disrupted by mutations and single nucleotide polymorphism leading to a variable number of transcripts and therefore to a broad phenotypic spectrum. The purpose of this work has been to study the subjacent molecular mechanism of CFTR mutations that affect the efficiency of splicing as well as to develop complementary techniques for its characterization at DNA, RNA and protein level in epithelial cells; by doing so we aim to determine the clinical relevance of CFTR expression levels. In order to reach our goals we used nasal epithelium, an accessible sample that allowed us to study CFTR gene expression and CFTR protein localization. Mutations and single nucleotide polymorphism analysis was done in all individuals to accurately group them into controls, carriers and patients. Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was essential to determine the expression level of CFTR. As Normalization of qPCR data is a necessary step reference genes must be selected for each gene/tissue. Therefore, we applied an accurate approach to select reference genes for CFTR expression analysis (geNorm, NormFinder, Kruskal-Wallis). GUSB and ATP2B4 have been validated as the most reliable gene combination. An in silico analysis along with a qualitative assessment of more than 30 CFTR mutations (missense, nonsense and splicing) identified an aberrant transcript for three of the mutations analyzed, c.580-1G>T, c.2657+5G>A and c.3718-1G>A. Its quantification led to the identification of a novel complex allele c.2562T>G (p.=)-c.2675+5G>A. At the protein level, the lack of CFTR on the membrane for the three mutations analyzed correlated with both the transcript level observed and patient phenotypes. In conclusion, CFTR quantitative transcript analysis showed a clear correlation with the phenotype of individuals carrying a splicing mutation. Therefore, it could be a useful parameter for the evaluation of aberrant splicing-targeted therapies.