[en] Isoprenoids are one of the largest families of metabolites in nature, and they are especially diverse in the plant kingdom. Among them, carotenoids, tocopherols and phylloquinone are interesting for their role as vitamins. Plants synthesize these compounds in chloroplasts to contribute to photosynthesis and photoprotection. In the case of carotenoids, their highest levels are found in specialized plastids named chromoplasts, which are typically found in non-green pigmented organs such as flower petals and ripe fruits but only occasionally in leaves. The general goal of this thesis has been testing new strategies for the enrichment of leafy vegetables in isoprenoid vitamins through a system developed in our lab to induce the conversion of chloroplasts into chromoplasts in leaves. The tool is based on the capacity of the crtB enzyme from the bacterium Pantoea ananatis to boost the production of phytoene and the ability of leaves to convert this extra phytoene into downstream carotenoids with the concomitant changes in plastid ultrastructure. The availability of this system allowed to define two specific objectives: (1) to characterize the physiological context of the crtB-induced phenotype in Nicotiana benthamiana leaves and (2) to test different strategies exploiting this crtB-based system to improve leaf biofortification. In the first part of the thesis, we demonstrate that the non-reversible chloroplast-to-chromoplast differentiation phenotype triggered by plastid-localized crtB is associated with a rapid loss of photosynthetic activity caused by the accumulation of phytoene. This phenomenon makes the chloroplast competent for chromoplastogenesis. The transition is then completed once phytoene is converted into downstream carotenoids by endogenous enzymes. We also demonstrate that treatments that cause altered redox balance of the photosystems and oxidative stress facilitate chromoplast differentiation. In the second part of the thesis, we characterize the structural changes associated with crtB-mediated chromoplast differentiation in leaves. During the process plastoglobules increase in number and size. Plastoglobules are used to store phytoene and other isoprenoids (including pro-vitamin A β-carotene, vitamin E tocopherols, and vitamin K phylloquinone. We also show that plastoglobules are the site of localization and action of the crtB protein and demonstrate that conditions that promote plastoglobule proliferation (such as high light) can be used to further promote the accumulation of isoprenoid vitamins. Our results show that the combination of crtB with genes involved in the biosynthesis of such vitamins can further increase their levels. Lastly, we show that β-carotene can be further accumulated by combining the crtB-mediated chromoplastogenesis with an engineered extraplastidial pathway. We also show that the optimizations of the crtB system can be applied to biofortify edible green leafy vegetables such as lettuce, hence contributing to the development of new functional foods.

[es] Los isoprenoides son una de las familias más grande de metabolitos en la naturaleza y son especialmente diversos en el reino vegetal. Entre ellos, los carotenoides, los tocoferoles y la filoquinona tienen un interés especial por su papel como vitaminas. Las plantas sintetizan estos compuestos en cloroplastos para contribuir a la fotosíntesis y fotoprotección. En el caso de los carotenoides, sus niveles más altos se encuentran en plastos especializados llamados cromoplastos, que se encuentran típicamente en órganos pigmentados no verdes como pétalos de flores y frutos maduros, pero solo ocasionalmente en hojas. El objetivo general de esta tesis ha sido probar nuevas estrategias para el enriquecimiento de verduras en vitaminas isoprenoides a través de un sistema desarrollado en nuestro laboratorio para inducir la conversión de cloroplastos en cromoplastos en hojas. La herramienta se basa en la gran capacidad de la enzima crtB de la bacteria Pantoea ananatis para producir fitoeno y la capacidad de las hojas para convertir este fitoeno adicional en carotenoides posteriores con cambios concomitantes en la ultraestructura de los plástos. La disponibilidad de este sistema permitió definir dos objetivos específicos: (1) caracterizar el contexto fisiológico del fenotipo inducido por crtB en hojas de Nicotiana benthamiana y (2) probar diferentes estrategias aprovechando este sistema basado en crtB para mejorar la biofortificación de hojas. En la primera parte de la tesis, demostramos que el fenotipo no reversible de diferenciación de cloroplasto a cromoplasto desencadenado por crtB en plastos se asocia con una rápida pérdida de actividad fotosintética causada por la acumulación de fitoeno. Este fenómeno hace que el cloroplasto pase a ser competente para la cromoplastogénesis. Luego, la transición se completa una vez que el fitoeno se convierte en carotenoides posteriores mediante enzimas endógenas. También demostramos que los tratamientos que causan un equilibrio redox alterado de los fotosistemas y un estrés oxidativo facilitan la diferenciación de los cromoplastos. En la segunda parte de la tesis, caracterizamos los cambios estructurales asociados con la diferenciación de cromoplastos mediada por crtB en hojas. Durante el proceso, los plastoglóbulos aumentan en número y tamaño y se utilizan para almacenar fitoeno y otros isoprenoides, incluidos β-caroteno (pro-vitamina A), tocoferoles (vitamina E) y filoquinona (de vitamina K). Los plastoglobulos son el sitio de localización y acción de la proteína crtB y demostramos que las condiciones que estimulan la proliferación de plastoglóbulos (como la luz intensa) se pueden utilizar para promover aún más la acumulación de vitaminas isoprenoides. Nuestros resultados muestran que la combinación de crtB con genes involucrados en la biosíntesis de dichas vitaminas puede aumentar aún más sus niveles. Por último, mostramos que β-caroteno se puede acumular aún más combinando la cromoplastogénesis mediada por crtB con una vía extraplastidial sintetica. También demostramos que las optimizaciones del sistema crtB se pueden aplicar para biofortificar vegetales de verduras como la lechuga, contribuyendo así al desarrollo de nuevos alimentos.