[en] The study of the use of enzymes as industrial biocatalysts has been increased in the last decades, since they offer several advantages as their ability to accept a wide range of substrates, high specificity and selectivity, allowing mild reaction conditions. One of the most promising fields of their application is the production of compounds with biological activity for therapeutical purposes. This doctoral thesis is a contribution to the research of horse liver alcohol dehydrogenase (HLADH) as biocatalyst, particularly its ability to oxidize Cbz-amino alcohols to obtain valuable compounds as Cbz-amino aldehydes to produce Cbz-aminopolyols, and Cbz-β-aminoacids. Therefore, Cbz-ethanolamine and Cbz-β-amino propanol were selected as model compounds. First, alcohol dehydrogenases from different origins as yeast and horse liver (commercial and in house) were tested for the oxidation of Cbz-ethanolamine. In house HLADH was selected as the best biocatalyst, in terms of specific activity and kinetic parameters. Moreover, HLADH catalyzed oxidation of Cbz-ethanolamine was performed and the direct formation of the acid, Cbz-glycine, was observed. Several methods were tested to promote the production of the intermediate product (aldehyde, Cbz-glycinal), but only the use of semicarbazide hydrochloride allowed obtaining Cbz-glycinal by its capture as Cbz-glycinal semicarbazone, yielding up to 84% with less than 12% Cbz-glycine yield. Cbz-glycinal semicarbazone acid hydrolysis with formaldehyde provided 48.5% of Cbz-glycinal recovery. Nevertheless, the amount of impurities, mostly formaldehyde, made it not such a good substrate for a further aldol addition to dihydroxyacetone phosphate (DHAP) catalyzed by aldolases in order to obtain aminopolyols (chapter 4). On the other hand, coupling the oxidation of Cbz-ethanolamine by HLADH and the aldol addition of DHAP catalyzed with rhamnulose-1-phosphate aldolase (RhuA) with DHAP pulses addition did not produce Cbz-aminopolyols, forming only 64.1% yield of Cbz-glycine (chapter 5). Next, the high oxidative ability of HLADH was also exploited to produce Cbz-β-alanine from Cbz-β-amino propanol; a complete conversion was obtained at 72 h in a batch mode. In order to enhance the productivity, a fed-batch operation was proposed providing 88.4% Cbz-β-alanine yield at 96 h with 2.3-fold improved productivity compared to the batch operation (chapter 6). Finally, the study of NAD+ cofactor regeneration was carried out by enzymatic and electrochemical methods. Enzymatic substrate-coupled regeneration of NAD+ was studied using acetaldehyde as second substrate with an almost complete conversion to Cbz-β-alanine in the first 2 h of reaction in a batch operation. However, fed-bach mode was not so efficient (65% conversion at 2 h, only one pulse addition of substrate), and the reaction was stopped at 2 h (chapter 6). Direct electrochemical regeneration of NAD+ using a filter-press microreactor was performed by coupling it with the HLADH catalyzed oxidation of Cbz-β-amino propanol for the production of Cbz-β-alanine. Employing a batch operation 77.1% Cbz-β-amino propanol conversion and a complete regeneration was obtained at 24 h. Meanwhile, the fed-bach operation increased the production maintaining 80.0% conversion and one half of complete cofactor regeneration conversion at 51 h (chapter 7).

[es] El estudio del uso de las enzimas como catalizadores industriales se ha incrementado en las últimas décadas debido a que éstas ofrecen muchas ventajas, tales como: su capacidad para aceptar un amplio rango de sustratos, su alta especificidad y selectividad y permiten el uso de condiciones suaves de operación. Uno de los campos de aplicación más prometedores es la producción de compuestos con actividad biológica para fines terapéuticos. Esta tesis doctoral es una contribución en la investigación de la enzima alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HLADH) como biocatalizador, específicamente su capacidad de oxidar Cbz-aminoalcoholes para obtener compuestos de interés como Cbz-aminoaldehídos para producir Cbz-aminopolioles, y Cbz-β-aminoácidos. Asimismo, se seleccionó la Cbz-etanolamina y el Cbz-β-aminopropanol como compuestos modelos. Primero, se realizó un estudio de la enzima alcohol deshidrogenasa de diferente origen, como la de levadura e hígado de caballo (comercial y purificada en el laboratorio), en la oxidación de Cbz-etanolamina. Se eligió la enzima purificada en el laboratorio extraída a partir de un hígado de caballo como el mejor biocatalizador, en términos de actividad específica y parámetros cinéticos. Además, se llevó a cabo la oxidación de Cbz-etanolamina catalizada por HLADH y se observó la formación directa del ácido, Cbz-glicina. Se evaluaron diferentes métodos para promover la producción del producto intermedio (el aldehído, Cbz-glicinal), mas solamente el empleo de clorhidrato de semicarbazida permitió la obtención de Cbz-glicinal por medio de su captura como Cbz-glicinal semicarbazona, obteniéndose un rendimiento de hasta 84%, con menos de 12% de rendimiento de Cbz-glicina. La hidrólisis ácida del Cbz-glicinal semicarbazona con formaldehido proporcionó una recuperación de Cbz-glicinal de 48.5%. Sin embargo, debido a la cantidad de impurezas, principalmente formaldehido, éste no pudo ser considerado como un buen candidato para la posterior adición aldólica con dihidroxiacetona fosfato (DHAP) catalizada por aldolasas para obtener Cbz-aminopolioles (Capítulo 4). Por otra parte, no se produjeron Cbz-aminopolioles mediante el acoplamiento de la reacción de oxidación de Cbz-etanolamina por HLADH y la adición aldólica de DHAP catalizada por ramnulosa-1-fosfato aldolasa (RhuA) con pulsos de DHAP, obteniéndose solamente Cbz-glicina, con un rendimiento de 64.1% (capítulo 5). Posteriormente, se aprovechó la alta capacidad oxidativa de la enzima HLADH para producir Cbz-β-alanina a partir de Cbz-β-aminopropanol; se obtuvo una conversión completa del sustrato a las 72 h empleando una operación tipo batch. De manera de aumentar la productividad, se propuso la adición de pulsos de sustrato, el cual proporcionó un rendimiento de Cbz-alanina de 88.4% a las 96 h y permitió el incremento de la productividad en 2.3 veces, comparado con la operación tipo batch (capítulo 6). Finalmente, se realizó un estudio de la regeneración del cofactor NAD+ empleando métodos enzimáticos y electroquímicos. Se evaluó la regeneración enzimática por acoplamiento de sustratos utilizando acetaldehído como segundo sustrato, el cual proporcionó una conversión completa hacia β-alanina en las primeras dos horas de reacción, con una operación tipo batch. Sin embargo, ésta no fue tan eficiente al añadir pulsos de sustrato (se obtuvo 65% de conversión a las 2 h y solamente pudo añadirse un pulso) y la reacción se detuvo a las 2 h (capítulo 6). Se realizó una regeneración electroquímica directa del cofactor NAD+ empleando un microreactor tipo filtro prensa, mediante el acoplamiento con la reacción de oxidación de Cbz-β-aminopropanol para la producción de Cbz-β-alanina. Se obtuvo una conversión de Cbz-β-aminopropanol de 77.1% y una regeneración completa del cofactor a las 24 h con una operación tipo batch. Mientras tanto, se observó una conversión de alrededor 80% y una regeneración de la mitad de la cantidad inicial de cofactor a las 51 h, empleando una operación tipo batch con pulsos de Cbz-β-aminopropanol (capítulo 7).