[ca] La unió neuromuscular (NMJ) utilitza mecanismes de plasticitat per adequar l'alliberament d'acetilcolina (ACh) dins d'un entorn molt dinàmic. Els receptors muscarínics d'acetilcolina (mAChRs) participen com a autoreceptors, ajustant la neurotransmissió. El subtipus M1 activa la proteïna quinasa C (PKC) per potenciar la transmissió, mentre que l'M2 inhibeix la proteïna quinasa A (PKA) per reduir-la. En la passada dècada, grans descobriments ens han aportat un coneixement electrofisiològic extens sobre la senyalització muscarínica. Tanmateix, les dades moleculars segueixen sent escasses i el rol d'alguns segons missatgers resta desconegut. Així doncs, aquesta tesi es realitza amb l'objectiu de caracteritzar com els receptors M1 i M2 modulen les isoformes de PKA i PKC, les seves proteïnes reguladores i les dianes d'exocitosi. Hem analitzat la cascada muscarínica al múscul diafragma de rata usant inhibidors selectius i generals de M1, M2, nPKCε, cPKCβI, PKA i PDK1 i analitzant cada alteració mitjançant Western blot, així com fraccionament subcel·lular i co-immunoprecipitació. També hem fet ús de tècniques immunohistoquímiques i microscòpia confocal per corroborar la localització presinàptica de les molècules d'interès. Els resultats mostren que els nivells del receptor M1 són disminuïts per la via de l'M2. Respecte a la senyalització de la PKA, l'M2 inhibeix la seva activitat regulant la subunitat Cβ a la baixa, la subunitat RIIα/β a l'alta i alliberant RIβ i RIIα al citosol, el que redueix la fosforilació de SNAP-25 (Thr138) i CREB. L'M1 s'interposa en la senyalització M2/PKA reincorporant les subunitats R a la membrana. Respecte la senyalització PKC, ambdós M1 i M2 poden activar la quinasa mestra PDK1, que promou la maduració de les isoformes de PKC βI i ε presinàptiques. L'M1 recluta les dues PKC madures a la membrana i promou la fosforilació de Munc18-1, SNAP-25 i MARCKS. Al contrari, l'M2 regula a la baixa la PKCε de forma dependent de PKA, el que inhibeix la síntesi de Munc18-1 i la seva fosforilació. El treball present contribueix a comprendre l'acció conjunta i interdependent dels receptors M1 i M2 per regular la neurotransmissió.

[es] La unión neuromuscular (NMJ) utiliza mecanismos de plasticidad para adecuar la liberación de acetilcolina (ACh) a un entorno muy dinámico. Los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChRs) participan como autorreceptores, ajustando la neurotransmisión. El subtipo M1 activa la proteína quinasa C (PKC) para potenciar la transmisión, mientras que el M2 inhibe la proteína quinasa A (PKA) para reducirla. La interesante investigación de la pasada década nos ha aportado un extenso conocimiento electrofisiológico sobre la señalización muscarínica. Aun así, los datos moleculares siguen siendo escasos y el rol de algunos segundos mensajeros permanece desconocido. Así pues, esta tesis tiene el objetivo de caracterizar cómo los receptores M1 y M2 regulan las isoformas de PKA y PKC, sus proteínas reguladoras y las dianas de exocitosis. Para ello, hemos analizado la cascada muscarínica en el músculo diafragma de rata usando inhibidores selectivos y generales de M1, M2, nPKCε, cPKCβI, PKA y PDK1 y analizando dichas alteraciones mediante Western blot, fraccionamiento subcel·lular y co-inmunoprecipitación. También hemos hecho uso de técnicas inmunohistoquímicas y confocales para corroborar la localización presináptica de nuestras moléculas de interés. Los resultados muestran que los niveles del receptor M1 son disminuidos por la vía del M2. Respecto a la señalización PKA, M2 inhibe su actividad total disminuyendo la subunidad Cβ, aumentando las subunidades RIIα/β y liberando a RIβ y RIIα al citosol, lo que reduce la fosforilación de SNAP-25 (Thr138) y CREB. El receptor M1 se interpone en la señalización M2/PKA reincorporando las subunidades R a la membrana. Respecto la señalización PKC, ambos M1 y M2 pueden activar la quinasa maestra PDK1, que promueve la maduración de las isoformas PKCβI y ε presinápticas. M1 recluta las dos PKC maduras a la membrana y promueve la fosforilación de Munc18-1, SNAP-25 y MARCKS. Al contrario, el M2 inhibe la PKCε de forma dependiente de PKA, lo que también disminuye la síntesis de Munc18-1 y su fosforilación. Este trabajo contribuye a comprender la acción conjunta e interdependiente de los receptores M1 y M2 sobre la neurotransmisión.