[ca] Les síndromes de depleció i delecions múltiples de l'ADN mitocondrial (ADNmt) (MDDS) són malalties caracteritzades pel manteniment incorrecte de l'ADNmt que resulta en alteracions quantitatives (depleció) i/o qualitatives (delecions múltiples i mutacions puntuals) de l'ADNmt. Aquestes síndromes són malalties minoritàries amb presentació clínica heterogènia, que inclou quadres moderats en pacients adults o presentacions molt greus en edats pediàtriques. Les MDDS estan causades per mutacions en gens nuclears que codifiquen proteïnes que participen en el manteniment de l'ADNmt a través de diferents mecanismes: (I) a través de la maquinària de replicació de l'ADNmt, (II) a través del metabolisme dels desoxiribonucleòsids trifosfat (dNTPs), (III) a través de la regulació de la dinàmica mitocondrial o (IV) a través d'un mecanisme desconegut. Els desoxiribonucleòsids (dNs) van ser proposats com a tractament per una de les formes de MDDS, la miopatia per dèficit de TK2 (enzim que participa en l'anabolisme dels dNTPs). Aquesta aproximació va mostrar eficàcia en models murins de la malaltia, en una cohort de pacients i, actualment, es troba en fase d'assaig clínic. Posteriorment, estudis in vitro han mostrat que els dNs també estimulen la replicació de l'ADNmt en cèl·lules amb mutacions en POLG (ADN polimerasa mitocondrial) i en MPV17 (que participa en el manteniment de l'ADNmt a través d'un mecanisme desconegut). Aquests resultats semblen indicar que el mecanisme terapèutic dels dNs implica un increment en les quantitats de dNTPs que estimula la replicació de l'ADNmt. Per aquest motiu, els dNs es podrien estendre a MDDS no causades per alteracions en el metabolisme de dNTPs. Aquesta tesi consta de 3 blocs diferenciats. En el primer bloc s'ha avaluat l'eficàcia dels dNs per a algunes formes de MDDS in vitro i in vivo. Els estudis in vitro s'han fet administrant dNs a fibroblasts en cultiu de pacients amb mutacions en 10 gens associats a MDDS, la majoria d'ells no relacionats amb el metabolisme de dNTPs. Els resultats han revelat que els dNs estimulen la replicació de l'ADNmt en gairebé tots els casos on hi ha depleció de l'ADNmt in vitro. Per tant, el seu ús es podria estendre a MDDS no relacionades amb el metabolisme de dNTPs. Els estudis in vivo s'han fet administrant dNs a ratolins Dguok-/-, un altre gen associat a MDDS que participa en el metabolisme de dNTPs. Aquests estudis han mostrat absència d'efecte terapèutic, potser degut a la baixa biodisponibilitat dels dNs purínics i/o manca de la seva fosforilació. Donat que les alteracions en les concentracions de dNTPs causades pels dNs són potencialment genotòxiques, en el segon bloc de la tesi s'ha estudiat la seguretat gènica del tractament analitzant la integritat i fidelitat de còpia de l'ADNmt (presència de delecions i mutacions puntuals) mitjançant PCR llarga i seqüenciació massiva. S'han analitzat mostres d'ADN obtingudes en els experiments d'eficàcia in vitro, teixits de ratolins Dguok-/- i Tk2-/- on s'havia testat l'eficàcia in vivo i sang de pacients amb dèficit de TK2 sotmesos al tractament amb dNs durant mesos o anys. En aquest darrer cas, també s'ha analitzat la mutagènesi utilitzant un panell de gens nuclears. Tots aquests estudis han mostrat absència de genotoxicitat del tractament. Finalment, en el tercer bloc de la tesi, s'ha estudiat el rol del transportador equilibratiu de nucleòsids ENT1 sobre l'efecte terapèutic dels dNs en el context del dèficit de TK2. Aquests estudis, realitzats en ratolins Tk2-/- i Ent1-/-, han revelat que ENT1 és un mediador necessari per l'efecte terapèutic dels dNs en aquesta malaltia associat a l'entrada de dNs en el cervell dels ratolins. Aquests resultats obren la porta a modular l'activitat del transportador per millorar l'eficàcia dels dNs.

[en] Mitochondrial DNA (mtDNA) depletion and multiple deletions syndromes (MDDS) are diseases characterized by incorrect maintenance of mtDNA resulting in quantitative (depletion) and/or qualitative (multiple deletions and point mutations) alterations of mtDNA. These syndromes are rare diseases with heterogeneous clinical presentations, ranging from moderate symptoms in adult patients to severe manifestations in children. MDDS are caused by mutations in nuclear genes that encode proteins that participate in the maintenance of mtDNA through different mechanisms: (I) through the mtDNA replication machinery, (II) through deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) metabolism, (III) through regulation of mitochondrial dynamics or (IV) through an unknown mechanism. Deoxyribonucleoside (dN) supplementation was proposed as a treatment for a type of MDDS, the myopathy due to TK2 deficiency (an enzyme that participates in dNTP anabolism). This approach showed efficacy in murine models of the disease, in a cohort of patients, and is currently under clinical trial. Subsequently, in vitro studies have shown that dNs also stimulate mtDNA replication in cells with mutations in POLG (mitochondrial DNA polymerase) and in MPV17 (which participates in mtDNA maintenance through an unknown mechanism). These results seem to indicate that the therapeutic mechanism of dNs involves a dNTP expansion that stimulate mtDNA replication. For this reason, dNs can be extended to MDDS not caused by alterations in dNTP metabolism. This thesis has 3 working blocks. In the first block, the efficacy of dNs for some MDDS has been evaluated in vitro and in vivo. In vitro studies have been carried out by administering dNs to patient-derived fibroblasts with mutations in 10 genes associated to MDDS, most of them not involved in the metabolism of dNTPs. The results have revealed that dNs stimulate mtDNA replication in almost all cases when there is in vitro mtDNA depletion. Therefore, dNs could be extended to MDDS not related to dNTP metabolism. In vivo studies have been carried out by administering dNs to mice lacking Dguok (Dguok-/-), another gene associated with MDDS that participates in the metabolism of dNTPs. These studies have shown absence of therapeutic effect, probably due to the low bioavailability of purine dNs and/or lack of their phosphorylation. Given that alterations in dNTP concentrations caused by dNs are potentially genotoxic, in the second block of the thesis the genetic safety of the treatment has been studied by analysing the integrity and replication fidelity of the mtDNA (presence of deletions and point mutations) using long PCR and next generation sequencing. The DNA samples used for these analyses were obtained from different sources: (I) from the in vitro efficacy studies, (II) from tissues of Dguok-/- and Tk2-/- mice tested for in vivo dN efficacy and (III) from blood of patients with TK2 deficiency treated with dNs during months or years. Moreover, nuclear DNA was studied in blood from TK2 deficient patients under treatment using a sequencing panel. All these studies have shown absence of genotoxicity caused by dN treatment. Finally, in the third block of the thesis, the role of the equilibrative nucleoside transporter ENT1 in the therapeutic effect of dNs in the context of TK2 deficiency has been studied. These studies, performed in Tk2-/- and Ent1-/- mice, have revealed that ENT1 is necessary for the therapeutic effect of dNs in this disease and it has a role importing dNs into the mouse brain. These results open the door to modulate the activity of this transporter to improve dNs efficacy.