[ca] S'han estudiat en profunditat els mecanismes apoptòtics, constituint un factor substancial en la mort neuronal després de diferents tipus de danys en el SNC. No obstant això, molt poc es sap sobre l'activació dels mecanismes apoptòtics en les cèl·lules glials i la seva rellevància en la terminació de la resposta glial. La caspasa-3 ha estat definida clàssicament com la principal executora de la mort cel·lular programada i li han estat atribuïts recentment altres papers no apoptòtics de participació en esdeveniments cel·lulars, incloent-hi la proliferació cel·lular, la regulació del cicle cel·lular, i la participació en vies cel·lulars apoptòtiques i antiapoptòtiques després d'un dany excito-tòxic en el cervell immadur de rata. Per aquest propòsit, s'ha utilitzat un model de excitotoxicitat ben caracteritzat, que ha consistit en la inducció d'un dany cerebral mitjançant una injecció intracortical de N-methyl-D-asparate (NMDA) en rates postnatals en el 9è dia de vida (P9). La mort cel·lular, les proteïnes apoptòtiques i antiapoptòtiques van ser analitzades a diferents terminis de supervivència després de la lesió per assaigs enzimàtics i anàlisis de doble fluorescència amb microscopia confocal. Els primers resultats com la caspase-3 clivada es presentava en neurones danyades amb els nuclis TUNEL+, encara que va ser observada majoritàriament en el nucli d'astròcits activats en l'hemisferi lesionat sense associació amb fragmentació del ADN, des de les 4 hores post-lesió (hpl) fins a la formació de la cicatriu glial als 7-14 dies, sense trobar-se associació amb marcatge amb TUNEL. L'activitat enzimàtica de la caspasa-3 va ser detectada a les primeres hores post-lesió i coincidint amb els fragments clivados per caspasas de la proteïna acídica fibrilar (CCP-GFAP) en astrocitos. No obstant això, sobre llargs terminis de supervivència, quan sorgia la hipertròfia astroglial, la caspasa-3 astroglial generalment no es va correlacionar amb el clivage de CCP-GFAP, però en canvi es va relacionar amb l'expressió de novo de vimentina. Per altra banda, la caspasa-3 clivada no s'ha vinculat a proliferació cel·lular. Aquests resultats inicials van mostrar l'evidència d'un paper gens tradicional de les caspases en la funció astroglial, suggerint que la seva activació pot ser important per a la reestructuració del citoesquelet després d'un dany. Secundàriament, al avaluar les vies d'activació de la caspasa-3 en neurones i cèl·lules glials, l'activació espai-temporal de les vies apoptòtiques intrínseca i extrínseca va ser analitzada. Es va expressar principalment en les neurones danyades corticals i hipocampals, una important contribució de la via intrínseca a través de la gran proporció de caspasa-9 activa amb l'activació neuronal de la caspase-3 i mort cel·lular. Per altra banda, la caspasa-8 va presentar una reduïda correlació amb la caspasa-3, i característicament es va presentar amb especificitat en les capes corticals. En les cèl·lules glials, l'activació de la caspasa-9, caspasa-8, i també p53, altra molècula que activa la caspasa-3 indirectament, va ser significant tant sols en la capa cortical VI i en el corpus callosum, suggerint que la caspasa-3 astroglial no es correlaciona generalment amb les clàssiques vies d'activació. La tercera part d'aquesta tesi es va focalitzar en l'estudi de les molècules antiapoptòtiques, com diversos inhibidors de l'apoptosis (IAPs) i les proteïnes heat shock (HSPs), conegudes com inhibidors de la caspasa-3 clivada en altres tipus cel·lulars. Les neurones van presentar una apreciable expressió de HSC70/HSP70 i cIAP-2, encara que aquestes es correlacionaven pobrament amb caspasa-3 en aquest tipus cel·lular. En astròcits , la survivina i la chaperona HSP25/27 van mostrar una forta correlació amb caspasa-3 en diverses regions cerebrals i a diversos terminis de supervivència, sent aquestes proteïnes destacades candidates per al bloqueig de l'activitat enzimàtica de la caspasa-3, la qual podria acumular-se en absència de mort astroglial. En conclusió, aquesta tesi ha descobert nous rols no apoptòtics de la caspasa-3 en cèl·lules astroglials i suggereix mecanismes de bloqueig de la caspasa-3, ajudant al coneixement dels mecanismes emprats pels astròcits per enfrontar-se al dany en el cervell immadur.

[gl] Os mecanismos apoptóticos estudiáronse en profundidade, constituíndo un papel substancial na morte neuronal despois de diferentes tipos de dano no SNC. Nembergantes, moi pouco se sabe acerca da activación dos mecanismos apoptóticos nas células gliais e a sua relevancia na terminación da resposta glial. A caspasa-3 definiuse clásicamente coma principal executura da morte celular programada, fóronlle recentemente atribuídos outros papeis non-apoptóticos, participando en acontecementos celulais, incluíndo proliferación, regulación do ciclo celular, e vías apoptóticas e antiapoptóticas despois dun dano excitotóxico no cerebro inmaduro de rata. Para este propósito, utilizáronse un modelo de excitotoxicidade ben caracterizado, que consiste na inducción dun dano cerebral mediante unha inxección intracortical de N-methyl-D-asparate (NMDA) en ratas postnatais no día 9 de vida (P9). A morte celular, as proteínas apoptóticas e antiapoptóticas foron analizadas a distintos tempos de supervivencia despois da lesión por ensaios enzimáticos e análise de doble fluorescencia con microscopía confocal. Os primeiros resultados coa caspasa-3 clivada presentábanse en neuronas dañadas cos núcleos TUNEL+, aunque foi observada maioritariamente no núcleo de astrocitos activados no hemisferio lesionado sen asociación con fragmentación do ADN, dende tempos máis cedos, ás 4 horas post-lesión (hpl) ata a formación da cicatriz glial ós 7-14 días, sen encontrarse asociación co marcaxe con TUNEL. A actividade enzimática da caspasa-3 foi detectada as primeiras horas post-lesión e coincidindo cos fragmentos clivados por caspasas da proteína acídica fibrilar (CCP-GFAP) en astrocitos. Sen embargo, a tempos longos de supervivencia, cando surxe a hipertrofia astroglial, a caspasa-3 astroglial xeralmente non correlacionou co clivaxe de CCP-GFAP, pero si se relacionou coa expresión de novo de vimentina. Por outra banda, a caspasa-3 clivada non se vinculou á proliferación celular. Estes resultados iniciais mostraron a evidencia dun non-tradicional papel das caspasas na función astroglial, suxerindo que a sua activación pode ser importante para a reestructuración do citoesqueleto despois dun dano. Secundariamente, ó evaluar as vías de activación da caspasa-3 en neuronas e nas células gliais, a activación espacio-temporal das vías apoptóticas intrínseca e extrínseca foron analizadas. Expresouse principalmente nas neuronas dañadas corticais e hipocampais, unha importante contribución da vía intrínseca através da gran proporción de caspasa-9 activa coa activación neuronal da caspase-3 e morte celular. Por outra banda, a caspasa-8 presentou unha reducida correlación coa caspasa-3, e característicamente presentou especificidade nas capas corticais. Nas células gliais, a activación da caspasa-9, caspasa-8, e tamén p53, outra molécula que activa a caspasa-3 indirectamente, foi soamente significante na capa cortical VI e no corpus callosum, suxerindo que a caspasa-3 astroglial non se correlaciona xeralmente coas clásicas vías de activación. A terceira parte desta tesis focalizouse no estudio das moléculas antiapoptóticas, coma varios inhibitores de apoptosis (IAPs) e as heat shock proteins (HSPs), coñecidas coma inhibidoras da caspasa-3 clivada noutros tipos celulares. As neuronas presentaron unha importante expresión de HSC70/HSP70 e cIAP-2, anque estas pobremente correlacionábanse coa caspasa-3 neste tipo celular. En astrocitos , a survivina e a chaperona HSP25/27 mostraron unha forte correlación con caspasa-3 en varias rexións cerebrais e a varios tempos de supervivencia, sendo estas proteínas destacadas candidatas para o bloqueo da actividade enzimática da caspasa-3, a cal podría acumularse en ausencia de morte astroglial. En conclusión esta tesis destapou novos roles non apoptóticos da caspasa-3 en células astrogliais, suxerindo mecanismos de bloqueo da caspasa-3 e axudou á mellor comprensión dos mecanismos empregados polos astrocitos para enfrentarse ó dano no cerebro inmaduro.