[ca] La lactosa és un dissacàrid de la llet produït per gaire bé tots els mamífers. Per a la seva digestió cal que sigui hidrolitzada per la lactasa (EC. 3.3.1.23), que és produïda per les cèl·lules epitelials de l'intestí prim, donant lloc a galactosa i glucosa. La seva deficiència o baixa quantitat (hipolactàsia) pot produir diversos símptomes incloent inflor, dolor abdominal, flatulències i diarrea. L'avaluació de la deficiència de la lactasa és principalment important en pediatria i en gastroenterologia a causa de l'elevada incidència de l'alteració genètica de la lactasa en aquests grups poblacionals (65%). La majoria dels mètodes de diagnòstic són invasius i dràstics i no són adequats per a ser aplicats a infants. Davant d'aquesta situació, un nou mètode no invasiu va ser desenvolupat. Aquest es basa en l'administració de 4-O-β-D-galactopiranosil-D-xilose (gaxilosa), un anàleg estructural de la lactosa. Aquest compost també es substrat per la lactasa i és hidrolitzat donant lloc a galactosa i xilosa. Aquest segon és absorbit passivament per l'intestí prim i és eliminat per orina on pot ser fàcilment detectat per un mètode colorimètric senzill. La síntesi química de la gaxilosa necessita de l'ús de grups protectors i de llargs i complexes etapes sintètiques per arribar a rendiments de producció baixos (9%). La ruta biosintètica utilitzant galactosiltransferases implica diverses dificultats tècniques i costos elevats. Les glicosidases tenen la capacitat de formar enllaços o-glicosídics per transglicosidació amb costos baixos. Els desavantatges d'aquesta metodologia són els baixos rendiments limitats per la competència de l'activitat hidrolítica i els problemes de purificació per la formació de regioisòmers o altres productes. La β–galactosidasa d'Escherichia coli va ser seleccioionada entre altres enzims per la producció de gaxilosa a nivell industrial. Després de diversos passos de purificació el rendiment obtingut és del 20-23%. Aquest treball pretén augmentar el rendiment en la producció de gaxilosa. Primer, les condicions de reacció es van modificar per tal d'augmentar l'activitat enzimàtica de transglicosidació. D'altra banda, es va buscar un altre enzim per ser utilitzat en la producció de gaxilosa. Estudis bibliogràfics i experimentals van permetre la selecció d'un nou enzim capaç de sintetitzar més gaxilosa, arribant a un rendiment final del 35% utiiltzant 3,3 cops menys enzim (amb la corresponent disminució dels costos de producció). Tot i que el nou enzim presentava una activitat de transglicosidació superior a l'enzim d'E. coli, la seva activitat hidrolítica romanent no permetia augmentar-ne més el rendiment. Per modificar l'activitat enzimàtica i augmentar la síntesi de gaxilosa es va optar per utilitzar modificar l'enzim amb enginyeria de proteïnes (racional i aleatòria).

[en] Lactose is a milk disaccharide produced by nearly all mammalian species. For its digestion, it must be hydrolysed to galactose and glucose by lactase (EC 3.2.1.23), which is normally produced by the cells that line the small intestine. Deficiency or low levels of lactase (hypolactase) can cause common symptoms including bloating, abdominal pain or cramps, flatulence and diarrhea. Evaluation of enzyme deficiency is important in pediatrics and gastroenterology due to the high frequency of genetic predisposition (65%). Many of the standard diagnostic procedures are invasive, quite drastic and not applicable to infants and young childen. A non-invasive method was developed based on the use of 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-xylose (gaxilose), a structural analogue of lactose (it only lacks the hydroxymethyl group at position 5). This compound is substrate of the lactase enzyme in vivo, yielding D-galactose and D-xylose. The latter is passively absorbed from the small intestine and is eliminated in the urine where it can be quantified by a colorimetric procedure. Chemical synthesis of gaxilose requires the addition of protective groups and suffers from long, tedious reaction sequences with low overall productivity (9%). The biosynthetic route involving galactosyltransferase enzymes implies technical difficulties (unstable and expensive enzymes) and high costs. Glycosidases have been shown to catalyse the formation of glycosides by transglycosylation at low cost. Disadvantatges of this approach include yield limitations due to competing hydrolysis reactions, and purification problems because of the formation of other regioisomers and by-products. Escherichia coli β-galactosidase was selected to produce gaxilose at industrial level. After an enzymatic reaction and several purification steps, a yield of 20-23% is reached. The present work aims to increase gaxilose production yield by different strategies. First, enzymatic conditions were modified to increase enzymatic gaxilose production. On ther other hand, other enzymes were searched to be used as gaxilose biocatalysts. Bibliographic and experimental studies allowed to find one enzyme able to increase gaxilose yield up to 35% using 3.3-fold less enzyme, and thus diminishing the production costs). Despite the higher transglycosidase activity of the new enzyme, its hydrolase activity did not allow the increase of gaxilose prodution. Protein engineering (random and rational approaches) was used to modify the enzyme activity and increase gaxilose synthesis.