[en] The main research topic of this Thesis is the study of new different probes and their application in biological processes through the innovative fluorescence microscopy technique as fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Fluorescence techniques, and particularly microscopy, represent a non-invasive method characterized by their low toxicity, providing a number of advantages including a high level of sensitivity, specificity and wide concentration range. This work can be divided into the study of two different types of fluorophores, environment-sensitive probes, including solvatochromic and fluorogenic dyes, and long-lifetime probes, such as lanthanide-based biosensors, with their biomedical applications. In the first group, we have included two different probes; one is a silicon-modified xanthene derivative (2-4-TM), that present a strong solvatochromic properties able to detect changes in the environment polarity. We studied the solvatochromic properties and discover a natural adsorption binding of this silicon-modified xanthene derivative to macrostructures. The combination of these properties allowed us to detect in real time changes in the environment polarity around the dye during the initial stages of the β-amyloid (Aβ) aggregation process, using steady-state, time resolved fluorescence spectroscopy and advanced fluorescence imaging techniques such as FLIM. By using FLIM as an excellent approach to study amyloidogenic aggregation as non-invasive detection method, we were able to establish a polarity scale to distinguish the hydrophobicity of the aggregates and differentiate between different types of pre-amyloid Aβ-42 aggregates. The early stages of the β-amyloid (Aβ) peptide aggregation process are of particular interest in understanding the origin of multiple neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease, an important public health problem affecting millions of people worldwide, and one that continues to increase dramatically. The second fluorophore included in the environment-sensitive probes is the aggregation-induced emission (AIE)-based probe, named PEMC. After study its solvatochromic properties, we found that presents preferences for nonpolar media, exhibiting AIE under specific conditions by immobilization. This allowed us to study the rate of its spontaneous incorporation into cells by fluorescence lifetime imaging and to observe its intracellular pattern produced by the AIE. Interestingly, the strong differences in fluorescence intensity and fluorescence lifetime of the different intracellular compartments facilitated selective isolation for detailed study of specific organelles, such as cytoplasm, mitochondria and peripheral F-actin structures in the plasma membrane. Since organelles in eukaryotic cells play a key role in cellular function, the importance of visualizing and monitoring the morphology and activity changes of specific organelles provide very useful information at the subcellular and molecular level that opens up opportunities for use in disease diagnosis and therapy. Respecting long-lifetime probes, we have studied and lanthanide based biothiol sensor, consisting of a small molecule that behaves as a reactive non-fluorescent Michael acceptor, which upon reaction with thiols becomes fluorescent, and an efficient Eu3+ antenna, after selfassembling with this cation in water represents a very innovative and chemically interesting achievement to detect biothiols, and specifically glutathione (GSH). The behaviour of our highly GSH-selective biosensor showed a high potential for studies in murine and human cells of the immune system (CD4+ T, CD8+ T, and B cells) by flow cytometry, being able to capture their baseline differences in intracellular GSH levels. Our biosensor was also successfully monitored intracellular changes in GSH associated with the metabolic variations governing the induction of CD4+ naïve T cells into regulatory T cells (Treg).

[es] El principal tema de investigación de esta Tesis es el estudio de nuevas y diferentes sondas y su aplicación en procesos biológicos a través de la innovadora técnica de microscopía de fluorescencia como es la microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM). Las técnicas de fluorescencia, y en particular la microscopía, representan un método no invasivo caracterizado por su baja toxicidad, proporcionando un gran número de ventajas entre las que se incluyen un alto nivel de sensibilidad, especificidad y un amplio rango de concentración. Este trabajo puede dividirse en el estudio de dos tipos diferentes de fluoróforos, las sondas sensibles al medio ambiente, incluyendo los colorantes solvatocrómicos y fluorogénicos, y las sondas de larga duración, como los biosensores basados en lantánidos, con sus aplicaciones biomédicas. En el primer grupo, hemos incluido dos sondas diferentes; una es un derivado de xanteno modificado con silicio (2-4-TM), que presenta unas fuertes propiedades solvatocrómicas capaces de detectar cambios en la polaridad de su entorno. Durante el estudio de sus propiedades solvatocrómicas descubrimos una unión de adsorción natural de este derivado de xanteno modificado con silicio a macroestructuras. La combinación de estas propiedades nos permitió detectar en tiempo real los cambios en la polaridad del entorno alrededor del colorante durante las etapas iniciales del proceso de agregación del β-amiloide (Aβ), utilizando la espectroscopia de fluorescencia en estado estacionario y resuelta en el tiempo y técnicas avanzadas de obtención de imágenes de fluorescencia como FLIM. Mediante el uso de FLIM como un excelente enfoque para el estudio de la agregación amiloidogénica como método de detección no invasivo, pudimos establecer una escala de polaridad para distinguir la hidrofobicidad de los agregados y diferenciar entre los diferentes tipos de agregados Aβ-42 preamiloides. Las primeras etapas del proceso de agregación del péptido β-amiloide (Aβ) son de especial interés para comprender el origen de múltiples trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer, un importante problema de salud pública que afecta a millones de personas en todo el mundo y que sigue aumentando de forma espectacular. El segundo fluoróforo incluido en las sondas sensibles al medio consiste en la sonda basada en emisión inducida por agregación (AIE, por sus siglas en inglés), denominada PEMC. Tras estudiar sus propiedades solvatocrómicas, descubrimos que presentaba preferencias por medios no polares, exhibiendo AIE en condiciones específicas por inmovilización. Esto nos permitió estudiar su tasa de incorporación espontánea en las células mediante imágenes de tiempo de vida de fluorescencia y observar su patrón intracelular producido por la AIE. Curiosamente, las fuertes diferencias en la intensidad y el tiempo de vida de fluorescencia de los diferentes compartimentos intracelulares facilitaron un aislamiento selectivo para el estudio detallado de orgánulos específicos, como el citoplasma, las mitocondrias y las estructuras periféricas de F-actina en la membrana plasmática. Dado que los orgánulos de las células eucariotas desempeñan un papel fundamental en la función celular, la importancia de visualizar y controlar la morfología y los cambios de actividad de determinados orgánulos proporciona información muy útil a nivel subcelular y molecular en el diagnóstico y la terapéutica de enfermedades. En lo que respecta a las sondas de larga duración, hemos realizado el estudio de un biosensor basado en lantánidos, que consiste en una pequeña molécula que se comporta como un aceptor de Michael reactivo no fluorescente, que al reaccionar con tioles se vuelve fluorescente, y una antena eficiente de Eu3+, que tras autoensamblarse con este catión en agua representa un logro muy innovador y químicamente interesante en la detección de biotioles, y específicamente de glutatión (GSH). El comportamiento de nuestro biosensor altamente selectivo de GSH mostró un alto potencial para estudios en células murinas y humanas del sistema inmune (células T CD4+, T CD8+ y B) por citometría de flujo, siendo capaz de capturar las diferencias basales en sus niveles de GSH intracelular. Nuestro biosensor también fue capaz de monitorizar con éxito los cambios intracelulares de GSH asociados a las variaciones metabólicas que rigen la inducción de las células T naïve CD4+ en células T reguladoras (Treg).