[en] In the study of male fertility in all species, the first and most basic parameters in sperm quality is its motility, count and morphology and how to maintain these important factors as a viable spermatozoon. Male infertility is usually associated with the presence of abnormal semen parameters. Spermatozoa with adequate rates of all these functional parameters could still be not able to fertilize and/or develop a zygote. Thus, it is clear that routine examination of the semen and the spermatozoa in the ejaculate cannot assess the process of capacitation or detect the DNA fragmentation or sperm mitochondrial dysfunction. Sperm DNA plays a critical role in normal embryo development as the genetic information passed on to the next generation depends on sperm DNA integrity. The research for this thesis was performed with the aim of using animal models to find the best way to measure DNA fragmentation in semen samples and evaluate the effect of oxidative stress on the viability and motility of spermatozoa. To this end, four experiments were performed, but only three of them are presented in this document. Firstly, in order to establish fish sperm activation conditions, it was necessary to study the effect of activation media in a range of osmolality and storage time and evaluate sperm motility parameters over time in zebrafish (Danio rerio). In Experiment 2, demonstrated how H2O2, as one the important oxidative stress agents, could affect the DNA fragmentation level and motility of zebrafish sperm. However, measurements of the halo area did not agree with the subjective sperm DNA fragmentation (SDF) rate. In this sense, it demonstrated, for the first time, an evolution of DNA fragmentation using morphometric criteria in human sperm (Experiment 3). The final experiment (Experiment 4) is included as an extended abstract in the Annexe 2. In this experiment, the Murciano-Granadina male goats were used to evaluate the correlation between semen cooled conservation conditions and DNA integrity, oxidation level, and mitochondrial activity in sperm using flow cytometry technologies. The results of Experiment 1 demonstrated that the sperm motility rate was higher and the duration was prolonged with the activation medium with the highest osmolality. With regard to kinetic sperm parameters, we observed almost all the velocity parameters (VCL, VSL and VAP) increased significantly in a high osmolality medium. Total motility and velocity values of sperm were significantly lower after cool storage at 4°C for 24 h. With regard to Experiment 2, we observed the motility of zebrafish sperm, mainly progressive motility, decreased as H2O2 increased. Moreover, SDF increased as the H2O2 concentration increased. However, measurements of the halo area did not agree with the subjective SDF rate. Using a SCD (sperm chromatin dispersion) test is a common way to determine the SDF level in cells. This test was based on using the presence of halo for SDF evaluation. Finally, in Experiment 3, we demonstrated that the actual expansion of the halo is a continuous variable that cannot be reduced to one discrete value by choice. The DNA strands of sperm chromatin are highly condensed by protamines. In some mammals, chromatins contain a highly organised and compact structure which is more compact than the other species or human sperm.

[es] En el estudio de la fertilidad masculina en todas las especies animales, la movilidad espermática, junto a la concentración y morfometría son los parámetros principales y más básicos en la evaluación de la calidad de los espermatozoides. La infertilidad masculina habitualmente se asocia con tasas anormales de estos parámetros seminales. Aún teniendo, los espermatozoides tasas adecuadas de todos estos parámetros no se puede garantizar la capacidad de fertilizar y/o desarrollar un cigoto. Por lo tanto, está claro que el examen rutinario del semen y los espermatozoides en la eyaculación no puede evaluar otros parámetros importantes en el proceso de fecundación como es capacitación espermática o detectar la fragmentación del ADN o la disfunción mitocondrial de los espermatozoides. El ADN del esperma juega un papel crítico en el desarrollo normal del embrión ya que la información genética transmitida a la próxima generación depende de la integridad del ADN del esperma. Los trabajos de investigación de los que consta esta tesis se realizaron con el objetivo de utilizar modelos animales para esclarecer la mejor manera de medir la fragmentación del ADN de manera lo más objetiva posible, en muestras de semen y evaluar el efecto del estrés oxidativo sobre la viabilidad y motilidad de los espermatozoides. Para este fin, se realizaron cuatro experimentos, pero solo tres de ellos se presentan en este documento. En primer lugar, para establecer las condiciones de activación de los espermatozoides del pez, fue necesario estudiar el efecto de los medios de activación en un rango de osmolaridad y tiempo de almacenamiento y evaluar los parámetros de motilidad espermática a lo largo del tiempo en el pez cebra (Danio rerio). En el Experimento 2, se estudió cómo el H2O2, como uno de los agentes importantes del estrés oxidativo, podría afectar al nivel de fragmentación del ADN y la movilidad de los espermatozoides en el pez cebra. Sin embargo, las mediciones del área del halo de la cabeza del espermatozoide no estaban coincidentes con la tasa subjetiva de fragmentación del ADN espermático (SDF). En este sentido, se demostró, por primera vez, una evolución de la fragmentación del ADN utilizando criterios morfométricos en esperma humano (Experimento 3). El experimento final (Experimento 4) se incluye como un resumen extendido en el Anexo 2. En este experimento, se usaron machos cabríos de Murciano-Granadina para evaluar la correlación entre las condiciones de conservación de semen refrigerado y la integridad del ADN, nivel de oxidación y actividad mitocondrial en espermatozoides utilizando la tecnología de citometría de flujo para su evaluación. Los resultados del Experimento 1 mostraron como la tasa de movilidad de los espermatozoides era más elevada y que su duración se prolongaba cuando la activación se realizaba en el medio de activación con la osmolalidad más alta. Con respecto a los parámetros cinéticos, observamos que casi todos los parámetros de velocidad (VCL, VSL y VAP) aumentaron significativamente en un medio con la osmolalidad alta. La movilidad total y los valores de velocidad de los espermatozoides fueron significativamente menores después de su conservación a 4 ° C durante 24 h. Respecto al Experimento 2, observamos que la movilidad de los espermatozoides de pez cebra, principalmente la movilidad progresiva, disminuyó a medida que aumentaba el H2O2. Por otra parte, la SDF aumentó a medida que aumentaba la concentración de H2O2. Sin embargo, las mediciones del área de halo no concordaron con la tasa subjetiva de SDF. El uso de una prueba de SCD (dispersión de cromatina de esperma) es una forma habitual para determinar el nivel de SDF en las células. Esta prueba se basó en el uso de la presencia de halo para la evaluación de SDF. Finalmente, en el Experimento 3, demostramos que la expansión real del halo es una variable continua que no se puede reducir a un valor discreto por elección. Las cadenas de ADN de la cromatina espermática están altamente condensadas por las protaminas. En mamíferos, las cromatinas contienen una estructura altamente organizada y compactada aún más que otras especies o espermatozoides humanos.