[en] Epigenetic therapies have not shown a very great efficacy when used as a single agent for cancer treatment and, currently, only a few epidrugs have been approved for its clinical use, mainly against haematological cancers. However, the reversibility of the biochemical modifications they target make them very much appealing for their use as adjuvants in combined settings, as a means to modulate resistant phenotypes and to sensitize cancer cells to other kind of therapies. Although current epigenetic therapies are based on DNA methyltransferases inhibitors and histone deacetylases inhibitors, there are many different modifications that regulate chromatin activity. Amongst them, it is of particular relevance the methylation of lysine and arginine residues in histones, that is carried out by methyltransferases that also modify non-histone proteins. Prior to this Doctoral Thesis, our laboratory designed a series of chemical derivatives from tea catechines with inhibitory activity on the dihydrofolate reductase enzyme. One of these derivatives, TMCG, in combination with DIPY drug, demonstrated to efficiently block the methionine cycle and to reduce SAM levels, the molecule that acts as the methyl group donor in cellular methylation reactions. Due to its hypomethylating properties, this combination was named HMT. Taking into account the variety of molecules and processes that can be affected by hypomethylation (DNA, histones, non-histone proteins, etc.) and its pro-apoptotic effect on different kinds of epithelial cancer cell lines, it was proposed that HMT could be of utility as an adjuvant for the sensitization of cancer cells to DNA damage-inducing therapies. According to this, the Main Objective of this Doctoral Thesis was to study the epigenetic mechanisms responsible for breast cancer resistance to ionizing radiation, and to assess the effectiveness of a hypomethylating therapy on breast cancer cells and its ability to sensitize them to ionizing radiation. In order to accomplish this objective, different experimental models were used: breast cancer cell lines, syngeneic and xenograft mouse models, and human breast tumour biopsies. Moreover, samples were analysed with a variety of biochemistry techniques (western blot, protein immunoprecipitation, mass spectrometry, metabolite quantification, etc.), cellular biology techniques (viability, apoptosis, migration and invasion assays; immunofluorescence and immunohistochemistry; flow cytometry, etc.) and molecular biology techniques (quantitative PCR, chromatin immunoprecipitation, transitory gene silencing through siRNAs, stable gene silencing by CRISPR/Cas9, gene overexpression, DNA methylation assays, etc.). Appropriate statistical tests were applied to the results obtained through these techniques. The analysis of samples from the different experimental models through this battery of techniques gave rise to the following results, which were put in context according to previous observations in the scientific literature: First, we observed that shortly after irradiation there is an increase in ATP and SAM levels that favours the activity of, at least, some protein methyltransferases. In these conditions, arginine methyltransferase PRMT1 methylates BRCA1, which dissociates from Bcl-2 in the cytosol and migrates to the nucleus together with BARD1. In the nucleus, the complexes formed by methylated BRCA1 and BARD1 promote DNA damage repair by homologous recombination. The anti-apoptotic protein Bcl-2 migrates to the mitochondria. These results show that BRCA1 methylation by PRMT1 could represent a resistance mechanism against radiotherapy in breast cancer cells, as it promotes DNA damage repair and facilitates the anti-apoptotic activity of Bcl-2. Second, we demonstrated that the HMT treatment sensitizes breast cancer cells to ionizing radiation. Because of its hypomethylating effects, the HMT treatment prevents the recruitment of repair proteins to sites of double strand break (DSBs) induced by radiation. Specifically, it inhibits the dimethylation of H4K20 and H3K79 histones, carried out by MMSET and DOT1L, respectively. The absence of these epigenetics marks prevents from the recruitment of 53BP1, that mediates DSBs repair by non-homologous end joining. Likewise, HMT treatment also inhibits the methylation of BRCA1 and its migration to the nucleus, so that DSBs cannot either be repaired by homologous recombination. Therefore, the HMT treatment promotes apoptosis in response to ionizing radiation. This occurs to an extent that is superior to that observed with the use of two other drugs tested: one that inhibits DNA methylation and other that inhibits protein methylation mediated by SET9. The HMT treatment also diminishes the mesenchymal phenotype in favour of the epithelial one, and reduces the ability of breast cancer-initiating cells for self-renewal. Finally, we studied the role of lysine methyltransferase SET9 in establishing the phenotype of breast cancer cells. We observed that high SET9 levels favour the acquisition of epithelial phenotypes, while low levels promote the acquisition of mesenchymal phenotypes and migration abilities. Furthermore, the study of human breast tumour biopsies revealed the potential use of SET9 as a biomarker. Benign tumours and tumours from patients with complete pathological remission showed high mRNA SET9 expression, in contrast with the low SET9 mRNA expression of tumours from patients suffering from disease recurrence. Immunohistochemistry assays also evidenced that low staining was associated with the development of metastasis. These studies reveal the importance of cellular methylation processes in the acquisition of tumour phenotypes and in the resistance to ionizing radiation in breast cancer, and prove the potential utility of hypomethylating therapies in the fight against this disease

[es] Las terapias epigenéticas han demostrado una eficacia muy limitada contra el cáncer cuando se usan como tratamiento único y, en la actualidad, solo un pequeño número de estos fármacos está aprobado para uso clínico, principalmente contra cánceres de origen hematológico. No obstante, el carácter reversible de las modificaciones bioquímicas contra las cuáles están dirigidas ha hecho que las terapias epigenéticas se postulen como potencialmente beneficiosas administradas en forma de adyuvantes, de manera que puedan modular los fenotipos resistentes y sensibilizar a las células tumorales a otro tipo de terapias. Aunque las terapias epigenéticas actuales están basadas en inhibidores de metiltransferasas de ADN e inhibidores de desacetilasas de histonas, son muchas las modificaciones que regulan la actividad de la cromatina. Entre ellas destaca la metilación de histonas en residuos de lisina y arginina, que es llevada a cabo por metiltransferasas que también modifican proteínas no histonas. Con anterioridad a esta Tesis Doctoral, en nuestro laboratorio se diseñaron una serie de derivados químicos de las catequinas del té, con actividad inhibidora sobre la dihidrofolato reductasa. La combinación de uno de estos derivados, el TMCG, con el fármaco DIPY, demostró inhibir eficazmente el ciclo de la metionina y reducir los niveles de SAM, la molécula donadora de grupos metilo en las reacciones de metilación celulares. Por su capacidad hipometilante, esta combinación se denominó HMT. Dada la multitud de moléculas y procesos que pueden verse afectados por la hipometilación (ADN, histonas, proteínas no histonas, etc.) y su acción apoptótica sobre líneas celulares de diferentes tipos de cáncer epitelial, se planteó la utilidad del HMT como adyuvante para la sensibilización de las células tumorales a terapias de daño en el ADN. De acuerdo con esto, el Objetivo Principal de esta Tesis Doctoral fue estudiar los mecanismos epigenéticos que contribuyen a la resistencia del cáncer de mama a la radioterapia y plantear una terapia hipometilante eficaz para su tratamiento y con capacidad para evitar dicha resistencia. Para llevar a cabo este objetivo, se usaron diferentes modelos experimentales: líneas celulares de cáncer de mama, modelos singénicos y de xenoinjerto en ratón, y biopsias de tumores de mama humanos. Además, se emplearon una gran variedad de técnicas de bioquímica (western blot, inmunoprecipitación de proteínas, espectrometría de masas, cuantificación de metabolitos, etc.), biología celular (ensayos de viabilidad, de apoptosis, de migración, de invasión; inmunocitofluorescencia e inmunohistoquímica; citometría de flujo, etc.) y biología molecular (PCR cuantitativa, inmunoprecipitación de cromatina, silenciamiento génico transitorio mediante siRNAs, silenciamiento génico estable mediante CRISPR/Cas9, sobreexpresión génica, ensayos de metilación del ADN, etc.). Los resultados obtenidos mediante estas técnicas se sometieron luego a las pruebas estadísticas apropiadas. El análisis de las muestras de los diferentes modelos experimentales mediante esta batería de técnicas dio lugar a los siguientes resultados, que se pusieron en contexto con las observaciones previas recogidas en la literatura científica: En primer lugar, observamos que a las pocas horas tras la irradiación tiene lugar una subida en los niveles de ATP y SAM que favorece la actividad de, al menos, algunas metiltransferasas de proteínas. En estas condiciones, la metiltransferasa de argininas PRMT1 metila a BRCA1, que se disocia de Bcl-2 en el citosol y migra al núcleo junto con BARD1. En el núcleo, los complejos formados por la forma metilada de BRCA1 y BARD1 promueven la reparación del daño en el ADN mediante recombinación homóloga. La proteína antiapoptótica Bcl-2 migra a la mitocondria. Estos resultados parecen evidenciar que la metilación de BRCA1 por PRMT1 es uno de los mecanismos de resistencia del cáncer de mama a la radioterapia, en tanto que promueve la reparación de las lesiones del ADN y facilita la actividad antiapoptótica de Bcl-2. En segundo lugar, comprobamos que el tratamiento HMT sensibiliza a las células tumorales de mama la radiación ionizante. Por su carácter hipometilante, el tratamiento HMT impide el reclutamiento de las proteínas de reparación a los sitios de rotura de doble hebra del ADN (DSBs) inducidos por la irradiación. Concretamente, impide la dimetilación de las histonas H4K20 y H3K79 mediada por las metiltransferasas MMSET y DOT1L, respectivamente. La ausencia de estas marcas epigenéticas impide el reclutamiento de 53BP1, que media la reparación de las DSBs mediante la unión de extremos no homólogos. Asimismo, el tratamiento HMT impide la metilación de BRCA1 y su migración al núcleo, por lo que las DSBs tampoco pueden ser reparadas mediante recombinación homóloga. El tratamiento HMT promueve así la apoptosis en respuesta a la radiación ionizante, en una medida que es superior a la observada con el uso de otros dos fármacos ensayados: uno que inhibe la metilación del ADN y otro que inhibe la metilación de proteínas mediada por SET9. El tratamiento HMT también disminuye el fenotipo mesenquimal en favor del epitelial y reduce la capacidad de autorrenovación de las células con capacidad iniciadora de tumores. Por último, se estudió el papel de la metiltransferasa de lisinas SET9 en el fenotipo de las células tumorales de mama y se observó que altos niveles de SET9 favorecen el fenotipo epitelial, mientras que bajos niveles promueven el fenotipo mesenquimal y la capacidad de migración. Asimismo, el estudio de su expresión en biopsias de tumores de mama humanos reveló su potencial utilidad como biomarcador. Los tumores benignos y los tumores de pacientes con remisión completa de la enfermedad mostraron altos niveles de ARNm de SET9, en comparación con los bajos niveles presentados por los tumores de pacientes con enfermedad recurrente. Las tinciones inmunohistoquímicas también revelaron que bajos niveles de tinción se asociaron al desarrollo de metástasis. Estos estudios ponen de manifiesto la importancia de los procesos de metilación celulares en la adquisición de fenotipos tumorales y de resistencia a la radiación ionizante en cáncer de mama y evidencian la potencial utilidad de las terapias hipometilantes en la lucha contra esta enfermedad.