[ca] La criopreservació d'oòcits i embrions de mamífers s'ha convertit en una part integral de la reproducció assistida tant en humans com en espècies veterinàries. No obstant això, els mètodes utilitzats per a criopreservar oòcits i embrions bovins encara mostren deficiències. Mitjançant l'ús de principis fonamentals i models informàtics, les estimacions dels mètodes òptims es poden aconseguir mitjançant una anàlisi racional, amb el potencial d'estalviar una quantitat significativa de recursos en reduir les opcions per a provar mitjançant mètodes empírics. No obstant això, molts dels formalismes de transport que s'utilitzen actualment es basen en suposicions limitants de solució diluïda, sovint apropiades en condicions fisiològiques, però rares vegades adequades en criobiologia, on els crioprotectors s'utilitzen sovint en concentracions elevades. Per tant, el primer objectiu d'aquest treball va ser examinar els efectes de l'augment de les concentracions de CPA sobre la permeabilitat a l'aigua i al CPA en oòcits bovins immadurs i madurats in vitro a través de dos enfocaments matemàtics: el formalisme 2P i el formalisme no diluït. Els resultats van mostrar que la concentració de CPA va afectar la permeabilitat de la membrana del CPA, amb efectes diferencials segons l'etapa de maduració de l'oòcit i el tipus específic de CPA. A més, quan es van comparar els dos enfocaments de modelatge, el primer utilitzant supòsits de solució diluïda i el segon no restringit a aquests supòsits, els resultats mostraren que només existien lleugeres diferències entre les prediccions dels dos models durant els passos d'addició de CPA, i una major diferència durant la primera etapa d'eliminació de CPA. Pel fet que les solucions de vitrificació contenen una alta concentració de crioprotectors, la permeabilitat de la membrana plasmàtica es converteix en un aspecte important per a minimitzar la toxicitat dels CPAs. En conseqüència, el segon objectiu va ser estudiar el paper de les aquagliceroporines en el moviment d'aigua i CPAs en oòcits MII bovins. Els nostres resultats van demostrar que els oòcits bovins MII van expressar AQP3 i AQP7 però no AQP9 quan es van exposar a una solució hiperosmòtica amb l'expressió d'AQP3 regulada a l'alça després de l'exposició a Me2SO, i de l'AQP7 després de l'exposició a EG. A més, també vam demostrar que l'expressió exògena d'AQP7 és possible en oòcits madurats in vitro, i sembla facilitar la difusió d'aigua quan els oòcits bovins MII es troven en presència de solucions de sacarosa o Me2SO però no de EG. No obstant això, aquesta acuaporina no està involucrada en el moviment de Me2SO i EG. Finalment, es va avaluar l'eficiència del model teòric resultant del primer estudi. Basant-nos en observacions osmòtiques in silico i in vitro, vam proposar protocols de deshidratació més curts a diferents temperatures (25°C enfront de 38.5°C) com un primer pas cap a la definició d'un mètode de criopreservació òptim. Les observacions in vitro del comportament osmòtic dels oòcits van indicar que el temps necessari perquè els oòcits aconsegueixin el volum cel·lular d'equilibri després de l'exposició a la solució d'equilibri estàndard va ser de 2 min 30 s a 38.5°C i de 5 min 30 s a 25°C. Posteriorment , vam provar l'eficiència dels temps d'exposició optimitzats per a cèl·lules específiques per a cada temperatura abans de la vitrificació/escalfament en la configuració del fus meiòtic dels oòcits, la fragmentació de l'ADN i el desenvolupament embrionari. Com a resultat, vam poder reduir amb èxit el temps necessari per a preparar oòcits bovins per a la vitrificació a 2 min 30 s quan la vitrificació es va realitzar a 38.5°C, obtenint resultats similars en morfologia del fus, fragmentació de l'ADN i desenvolupament embrionari que els oòcits de control frescos.

[en] The cryopreservation of mammalian oocytes and embryos has become an integral part of assisted reproduction in both humans and veterinary species. However, the methods used to cryopreserve bovine oocytes and embryos still have significant shortcomings. By using fundamental principles and computer modeling, estimates of optimal methods can be achieved through rational analysis, with the potential to save a significant amount of resources by narrowing the choices to test via empirical methods. Nevertheless, many of the transport formalisms currently used are based on limiting dilute-solution assumptions often appropriate under physiological conditions, but rarely appropriate in cryobiology where cryoprotectants are often used at high concentrations. Thus, the first objective of this work was to examine the effects of increasing CPA concentrations on water and CPA membrane permeability in immature and in vitro matured bovine oocytes through two different mathematical approaches: the 2P formalism and the nondilute formalism. Results showed that CPA concentration affected membrane CPA permeability, with differential effects depending upon the maturation stage of the oocyte and the specific CPA type. Moreover, when two modeling approaches were compared, the first one using dilute solution assumptions, and the second one not restricted to those assumptions, results indicated that only slight differences exist between the two models' predictions during the CPA loading steps while a greater difference was observed between models during the first stage of CPA removal. Because vitrification solutions contain a high concentration of cryoprotectant, permeability of the plasma membrane becomes an important aspect to minimize CPA toxicity. Accordingly, the second objective was to study the role of aquaglyceroporins in the movement of water and CPA in MII bovine oocytes. Our results demonstrated that MII bovine oocytes expressed AQP3 and AQP7 but not AQP9 when exposed to hyperosmotic solution being AQP3 expression up-regulated after exposure to Me2SO while AQP7 was overexpressed after being in contact with EG hyperosmotic solutions. Moreover, we also demonstrated that exogenous expression of AQP7 is possible in in vitro matured oocytes, and it seems to facilitate water diffusion when bovine MII oocytes are in presence of sucrose or Me2SO solutions but not EG solution. However, this aquaporin is not involved in the movement of Me2SO and EG. Finally, the efficiency of the theoretical model resulting from the first study was assessed. Based on in silico and in vitro osmotic observations, we proposed shorter dehydration-based protocols at different temperatures (25°C vs 38.5°C) as a first step towards defining an optimal cryopreservation method. In vitro observations of the oocytes' osmotic behavior indicated that the time required for the oocytes to reach the equilibrium cell volume upon exposure to standard equilibrium solution was 2 min 30 s at 38.5°C and at 5 min 30 s at 25°C. Subsequently, we tested the efficiency of the optimized cell-specific exposure times for each temperature prior to vitrification/warming on oocyte spindle configuration, DNA fragmentation and further embryo development. As a result, we were able to successfully reduce the necessary time to prepare bovine oocytes for vitrification to 2 min 30 s when vitrification was carried out at 38.5°C, obtaining similar results on spindle morphology, DNA fragmentation and embryo development than fresh control oocytes.