[en] The objective of this thesis consisted of the characterization of novel groups of RTs linked to CRISPR-Cas systems. An initial analysis of the different distribution of RTs in bacteria and archaea indicates that specific prokaryotic groups have recruited particular types of RTs in order to improve their responses in the environmental conditions of their ecological niche. Then, further analysis focused on the RTs related to CRISPR-Cas systems clustering them in 15 phylogenetic clades which at least present three evolutionary origins supporting a "multiple origins" model. These RTs are found alone, fused to the C-termini of the Cas1 domain (RTCas1) or as a multidomain protein (Cas6RTCas1). Furthermore, most RTs are associated with type III CRISPR-Cas systems, whereas a few examples are related to types I-A and VI. The first criterion for the functional characterization of RT-containing CRISPRCas systems was to determine the exogenous RT activity in vitro of several RT homologs. Then, the study focused on two systems: the adaptive operon from the Cyanobacterium Scytonema hofmanni PCC 7110, which harbor an RT alone, and that from the Proteobacterium Vibrio vulnificus YJ016, that contain an RTCas1 fusion protein. In both systems, the purification of the different proteins of the adaptive operon allows to study their interactions, demonstrating that the two different V. vulnificus Cas2 proteins, Cas2A and Cas2B, form a stable heterodimer complex. In vivo assays revealed that the RTCas1-Cas2A-Cas2B adaptive operon from V. vulnificus YJ016 is able to acquire spacers in a heterologous host (E. coli) in a process in which the two different Cas2 are required. Moreover, mutation in the RT active site strongly impaired novel acquisition events. It has been also demonstrated that this system is able to acquire spacers directly from RNA. In addition, the analysis of the acquired spacers and their sequence revealed particular features that may be related to a specific recognition by the adaptive operon. Finally, assays in the natural host have confirmed that the V. vulnificus type III-D CRISPR-Cas interference module is functional as long as their DNA target is transcriptionally active.

[es] El objetivo planteado en esta tesis doctoral consistió en la caracterización de nuevos grupos de RTs haciendo especial hincapié en aquellos asociados a los sistemas CRISPR-Cas. Un primer análisis de la distribución diferencial de estas enzimas entre bacterias y arqueas reveló que determinados grupos de procariotas han reclutado ciertos tipos de RTs para mejorar su respuesta a las condiciones ambientales de su nicho ecológico. Posteriormente, el análisis se focalizó en las RTs asociadas a los sistemas CRISPR-Cas clasificándolos en 15 clados filogenéticos con al menos tres orígenes evolutivos diferentes apoyando un modelo de "múltiples orígenes" para esta asociación. Estas RTs se pueden encontrar solas, fusionadas en su extremo Cterminal a un dominio Cas1 (RTCas1) o formando parte de una proteína multidominio (Cas6RTCas1). Además, la mayoría de estas enzimas forman parte de sistemas CRISPR-Cas de tipo III, aunque también existen ejemplos minoritarios asociados a tipo I-A y a tipo VI. Para la caracterización funcional de los sistemas CRISPR-Cas que contienen RTs, primero se determinó la actividad RT exógena in vitro de diversos candidatos, centrando finalmente el estudió en dos sistemas: el operón adaptativo de la Cianobacteria Scytonema hofmanni PCC 7110, que contiene una RT sin fusionar, y el de la Proteobacteria Vibrio vulnificus YJ016, que presenta una fusión RTCas1. En ambos sistemas, la purificación de las distintas proteínas pertenecientes al operón adaptativo ha permitido estudiar su interacción, demostrando como resultado más relevante que las proteínas Cas2A y Cas2B del sistema de V. vulnificus forman un complejo heterodimérico estable. Ensayos in vivo demostraron que el operón adaptativo (RTCas1-Cas2A-Cas2B) de V. vulnificus YJ016 es capaz de adquirir espaciadores en un hospedador heterólogo (E. coli) en un proceso que requiere la presencia de las dos Cas2. Además, la adquisición se reduce drásticamente mediante mutaciones en el sitio activo de la RT. También se verificó que este sistema es capaz de adquirir espaciadores directamente de moléculas de ARN. Por otro lado, el análisis de los espaciadores adquiridos y de su secuencia reveló características particulares que podrían estar relacionadas con su reconocimiento específico por parte del operón adaptativo. Finalmente, ensayos en el hospedador natural han revelado que el módulo interferente de este sistema CRISPR-Cas de tipo III-D es activo, requiriendo para ello la transcripción de su ADN diana