[en] The aim of this Doctoral Thesis is to characterize the Senegalese sole (Solea senegalensis) in much greater depth at the molecular and cytogenetic level. The species has great potential for commercial exploitation in aquaculture but problems of reproductive behavior are hampering this. Various experimental approaches to increase the available genomic resources are considered and applied in this study. Among these approaches are the identification of genetic markers associated with traits of commercial interest such as sex-specific identification, and the attempt to unravel the molecular bases of relevant physiological processes such as sex determination. It is the first time that mapping and characterization of repeated DNA sequences and characterization of the dmrt1 gene have been addressed in this valuable species of flatfish. An initial investigation has been carried out with cell cultures to optimize the production of metaphase plates for cytogenetic analyses. Culture conditions were analyzed for the three tissue types used, blood, spleen and kidney, after changing the combination of the mitogens. The cultures were supplemented with two mitogens, phytohemagglutinin and lipopolysaccharides, which provided dispersed mitotic indices, but definitive and reproducible results were not obtained. However, the use of phytohemagglutinin as a mitogen has been demonstrated to give somewhat better results. In the second part of the Thesis the content of the simple sequence repeats (SSR) and the transposable elements (TEs) is analyzed in fifty-seven BAC clones (spanning 7.9 Mb of the genome) of this species, located on the chromosomes by the technique of multiple fluorescence in situ hybridization (m-BAC-FISH). The SSR analysis revealed an average density of 675.1 loci per Mb and a high abundance (59.69%) of dinucleotide coverage was observed, with "AC" being the most abundant; for the TEs, DNA transposons (Class II) were the most abundant. In Class I, the LINE elements were the most abundant and the hAT family was the most represented in Class II. The Rex / Babar subfamily, observed on the mapping of two BAC clones on chromosome 1 pair, showed a 2551 bp match for these elements. This pair of chromosomes has recently been described as a putative sex proto-chromosome in this species, suggesting the possible role of the Rex element in its evolution. Lastly the molecular characterization of the dmrt1 gene was performed. This gene has a cDNA sequence 2027 bp in length and an open reading frame (ORF) of 1206 bp, that encodes a protein of 402 amino acids. The characteristic DM domain was found in the dmrt1 protein with the anticipated "C2H2C4" structure for the positions of cysteines and histidines to form the zinc finger, as well as an SY domain, rich in serine and tyrosine. Multiple isoforms have been described that were obtained by RACE, BAC screening and PCR with primers, between exons I and IV, and the sequence of a miRNA at the 3'UTR end has also been found. In the phylogenetic tree constructed from the deduced amino acid sequence of the dmrt1 gene, it is observed that the phylogenetic relationship of the dmrt1 gene in S. senegalensis is consistent with the evolutionary position of its species, as it is close to the sequences of other flatfish. The gene structure, with a size of 31.4 Kb, presents 7 exons, with a duplication of exons II and III not reported in previously-published descriptions of the structure of dmrt1, and 6 introns. In the BAC that contains the dmrt1 gene, we observe various satellite DNAs and regions of low complexity that are scattered, together with DNA transposons, and retrotransposons are also widely distributed throughout its sequence. In an intronic position we find the sequence of a SINE that weakens the repeated region. It is proposed that exon duplication would have originated by means of the SINE retrotransposon-mediated exon-shuffling mechanism detected in the second repeat region in the drmt1 gene.

[es] La Memoria de Tesis Doctoral trata sobre una profundización en la caracterización molecular y citogenética del lenguado senegalés (Solea senegalensis). Es una especie que tiene un alto potencial para la acuicultura que se ve obstaculizado por problemas de conducta reproductiva. En este estudio se intentan aplicar algunos enfoques experimentales para aumentar los recursos genómicos disponibles. Entre estas herramientas está la identificación de marcadores genéticos asociados con rasgos de interés comercial como la identificación sexo-específica, y desentrañar las bases moleculares de diferentes procesos fisiológicos como la determinación sexual. Es un valioso pez plano, siendo la primera vez que se aborda el mapeo y la caracterización de DNA repetido y la caracterización del gen dmrt1 en esta especie. En primer lugar, se ha realizado una investigación con cultivos celulares para optimizar la obtención de placas metafásicas para los análisis citogenéticos. Se analizaron condiciones de cultivo para los tres tejidos utilizados, sangre, bazo y riñón después de cambiar la combinación de los mitógenos. Los cultivos se suplementaron con dos mitógenos, fitohemoaglutinina y lipopolisacáridos, que proporcionaron unos índices mitóticos dispersos, sin haber obtenido resultados definitivos y reproducibles, aunque el uso del mitógeno fitohemoaglutinina se ha revelado con unos ligeros mejores resultados. En la segunda parte de la Tesis analizamos el contenido de las repeticiones de secuencia simple (SSR) y de los elementos transponibles (TEs) de cincuenta y siete clones BAC (que abarcan 7.9 Mb del genoma) de esta especie, ubicados en los cromosomas mediante la técnica de hibridación in situ de fluorescencia múltiple (m-BAC-FISH). El análisis SSR reveló una densidad promedio de 675.1 loci por Mb y se observó una alta abundancia (59.69%) de cobertura de dinucleótidos, siendo "AC" la más abundante. Con respecto a los TE, los transposones de ADN (Clase II) fueron los más abundantes. En la Clase I, los elementos LINE fueron los más abundantes y la familia hAT fue la más representada en la Clase II. La subfamilia Rex/Babar, observada en el mapeo de dos clones BAC en el par de cromosomas 1, mostró una coincidencia de 2551 pb para estos elementos. Este par de cromosomas se ha descrito recientemente como un proto-cromosoma sexual putativo en esta especie, destacando el posible papel del elemento Rex en la evolución del mismo. Finalmente, se realizó la caracterización molecular del gen dmrt1 que tiene una secuencia de cDNA de 2027 pb de longitud y 1206 pb de marco de lectura abierto (ORF) y que codifica una proteína de 402 aminoácidos. Se encontró el dominio DM característico en la proteína dmrt1 con la estructura característica "C2H2C4" para las posiciones de cisteínas e histidinas para formar el dedo de zinc y también un dominio SY, rico en serina y tirosina. Se han descrito múltiples isoformas obtenidas por RACE, rastreo BAC y PCR con primers entre exones I y IV, y también se ha encontrado la secuencia de un miRNA en el extremo 3´UTR. En el árbol filogenético construido a partir de la secuencia de aminoácidos deducida del gen dmrt1 se observa que la relación filogenética del gen dmrt1 de S. senegalensis fue consistente con la posición evolutiva de su especie, al estar cercana a las secuencias de otros peces planos. La estructura del gen, con un tamaño de 31,4 Kb, presenta 7 exones con una duplicación de los exones II y III inédita en las estructuras de dmrt1 hasta ahora conocidas, y 6 intrones. En el BAC que contiene al gen dmrt1, observamos diferentes DNAs satélites y regiones de baja complejidad que están dispersos, junto a transposones y retrotransposones de DNA que también están ampliamente distribuidos a lo largo de toda su secuencia. Flaqueando la región repetida encontramos la secuencia de un SINE en posición intrónica. Se propone que la duplicación de los exones se originaría mediante el mecanismo de barajado de exones mediado por el retrotransposón SINE detectado en la segunda región repetida en el gen drmt1.