[ca] L'interès creixent en l'ús de partícules similivíriques (VLPs) com a candidats vacunals, vectors per a teràpia gènica i càncer, i nanotransportadors per a l'administració de fàrmacs ha incrementat la demanda de plataformes de biomanufactura eficients i escalables. La seva similitud estructural amb els virus, sense els components virals infecciosos, els converteix en candidats excel·lents per a aquestes aplicacions. Tanmateix, la seva fabricació implica processos complexos, incloent la producció mitjançant cultiu cel·lular, purificació i formulació per complir amb els estàndards clínics. Aquesta tesi aborda els desafiaments crítics en el bioprocessament de VLPs en quatre capítols, centrant-se en la purificació, formulació i funcionalització de les VLPs de VIH. La purificació de les VLPs és una fase crucial en el bioprocés per a l'eliminació de contaminants com ara vesícules extracel·lulars, proteïnes de les cèl·lules hoste i ADN. Al Capítol Ú, es comparen diverses tecnologies per optimitzar la purificació de les VLPs. El procés de purificació proposat inclou quatre passos clau: clarificació mitjançant filtració en profunditat i filtració estàndard, concentració i purificació intermèdia a través de filtració de flux tangencial o cromatografia multimodal, captura utilitzant cromatografia d'intercanvi iònic, cromatografia d'interacció hidrofòbica i afinitat per heparina, i poliment amb cromatografia d'exclusió per mida. L'estudi avalua cada pas en base al rendiment, la puresa i l'eficiència en l'eliminació de contaminants. Es defineix un procés de purificació integral basat en els millors resultats obtinguts en cada pas. Aquest procés aconsegueix un rendiment global del 38% i una puresa del 64%, complint amb els estàndards reguladors per a contaminants d'ADN i proteïnes. El Capítol Dos es centra en l'optimització de les formulacions de liofilització per a les VLPs de VIH mitjançant Disseny d'Experiments. S'avaluen diversos excipients, incloent crio-lio protectors, agents de càrrega, tampons, modificadors de tonicitat i surfactants, pel seu impacte en la mida, concentració i qualitat de les VLPs. La formulació optimitzada composta per sacarosa, arginina, TrisHCl, clorur de sodi i polisorbat 80 preserva amb èxit la integritat de les VLPs. Els estudis de termoestabilitat demostren que les característiques d'integritat estructural es mantenen a 4°C durant 4 setmanes, tant en forma liofilitzada com reconstituïda. Al Capítol Tres, els avenços en purificació i formulació s'apliquen per desenvolupar un procés biotecnològic complet, incloent una producció en perfusió seguida per un procés de purificació en tres passos. La producció en perfusió millora 2.4 vegades la productivitat volumètrica de les VLPs en comparació amb resultats anteriors. Els processos de purificació que segueixen, incloent l'aclariment secundari i la cromatografia d'intercanvi aniònic mostren valors aproximats de puresa del 60%. El pas final de liofilització manté la integritat de les VLPs. La funcionalització de les VLPs per a l'administració dirigida de fàrmacs representa una alternativa en la teràpia contra el càncer. Al Capítol Quatre s'explora l'ús de les VLPs de VIH funcionalitzades amb el pèptid T22, un conegut antagonista del receptor CXCR4 associat a diversos càncers. Les VLPs produïdes en cèl·lules HEK293 i purificades mitjançant el procés de purificació proposat al capítol ú es funcionalitzen mitjançant reaccions químiques. Els estudis in vitro demonstren que les VLPs funcionalitzades amb T22 es dirigeixen i penetren en cèl·lules positives per CXCR4 de forma específica, amb un augment notable en la fluorescència intracel·lular en comparació amb les VLPs no funcionalitzades. Aquesta especificitat ressalta el potencial de les VLPs com a nanotransportadors per a l'administració selectiva de fàrmacs. En general, aquesta tesi proporciona una exploració integral de la purificació, formulació i funcionalització de les VLPs de VIH-1, abordant desafiaments clau i obrint el camí per a la seva aplicació clínica com a vacunes i teràpies dirigides contra el càncer.

[es] El creciente interés en el uso de partículas similares a virus (VLP) como candidatos vacunales, vectores para terapias génicas y oncológicas y nanoportadores para la administración de fármacos ha generado una mayor demanda de plataformas de biofabricación eficientes y escalables. Su similitud estructural con los virus los convierte en excelentes candidatos. Sin embargo, su fabricación implica procesos complejos, incluida la producción mediante cultivo celular, purificación y formulación para cumplir con los estándares clínicos. Esta tesis aborda los desafíos críticos en el bioprocesamiento de las VLPs a través de cuatro capítulos, centrándose en la purificación, formulación y funcionalización de las VLPs basadas en la poliproteína Gag del VIH-1. La purificación de las VLPs es una fase crucial en el bioproceso de estas nanopartículas. El Capítulo Uno profundiza en la comparación de tecnologías para optimizar la purificación de las Gag VLPs. El proceso de purificación propuesto abarca cuatro pasos: clarificación mediante filtración profunda y filtración estándar, concentración y purificación intermedia mediante filtración de flujo tangencial o cromatografía multimodal, captura mediante cromatografía de intercambio iónico, interacción hidrofóbica y afinidad por heparina, y pulido con cromatografía de exclusión por tamaño. Se evalúa cada paso según el rendimiento, la pureza y la eliminación de contaminantes. Se ha definido un proceso de purificación integral en base a los mejores resultados obtenidos en cada paso. Este proceso produjo una recuperación general del 38 % y una pureza del 64 %. Los niveles de ADN y proteínas contaminantes cumplieron con los estándares regulatorios. El Capítulo Dos se centra en la optimización de formulaciones de liofilización para las Gag VLPs mediante un enfoque de Diseño de Experimentos. Se evalúan varios excipientes, incluidos crio-lio protectores, agentes de carga, tampones, modificadores de tonicidad y tensioactivos, para determinar su impacto en el tamaño, la concentración y la calidad de las VLPs. La formulación optimizada compuesta por sacarosa, arginina, TrisHCl, cloruro de sodio y polisorbato 80 preserva con éxito la integridad de las VLPs. Los estudios de termoestabilidad muestran que las características de integridad estructural se mantienen a 4°C durante 4 semanas, tanto en forma liofilizada como reconstituida. En el Capítulo Tres se aplican los avances en purificación y formulación para desarrollar un bioproceso completo. Esto incluye una producción previa basada en perfusión seguida de un proceso de purificación. El enfoque basado en perfusión produce una mejora 2.4 veces en la productividad volumétrica de las VLPs en comparación con resultados anteriores. El proceso de purificación que incluyó la clarificación secundaria y la cromatografía de intercambio aniónico, muestran valores aproximados de pureza del 60%. El paso final de liofilización mantuvo la integridad de las VLPs. La funcionalización de las VLPs para la administración dirigida de fármacos representa una alternativa importante en la terapia del cáncer. En el Capítulo Cuatro se analiza el uso de las Gag VLPs funcionalizadas con el péptido T22, conocido antagonista del receptor CXCR4 el cual está asociado a varios cánceres. Las VLPs producidas en células HEK293 y purificadas mediante el proceso propuesto en el capítulo uno se han funcionalizado mediante reacciones químicas. Los estudios in vitro han demostrado que las VLPs funcionalizadas se dirigen específicamente y penetran en las células CXCR4 positivas, con un aumento notable de la fluorescencia intracelular en comparación con las VLPs no funcionalizadas. Esta especificidad resalta el potencial de las VLPs como nanoportadores para la administración selectiva de fármacos. En general, esta tesis proporciona una exploración integral de la purificación, formulación y funcionalización de las Gag VLP del VIH-1, abordando desafíos claves y allanando el camino para su aplicación clínica como vacunas y terapias dirigidas contra el cáncer.