[en] INTRODUCTION Antithrombin is a key N-glycoprotein in the haemostatic system due to its anticoagulant activity, a function amplified by heparin. Antithrombin is encoded by the SERPINC1 gene. Genetic variants in SERPINC1 are responsible for more than 75% of cases of antithrombin deficiency, a dominant disorder that constitutes the main and most serious hereditary thrombophilia. The correct diagnosis of antithrombin deficiency is important not only to know the molecular basis of thrombosis and to facilitate family screening, but also because it helps in the clinical management of the patient, including the duration and type of anticoagulant treatment. Although the disorder has been known for almost 60 years, challenges remain in antithrombin deficiency. Thus, this disorder may be underestimated, due to the limitations of available, mostly functional, diagnostic methods. Moreover, the molecular basis of the clinical heterogeneity in patients with antithrombin deficiency is poorly understood. AIMS 1. To compare different methods of molecular diagnosis of antithrombin deficiency, showing their weaknesses and strengths. 2. To define the functional and clinical effect of variants in SERPINC1 affecting arginine residues potentially involved in the interaction with heparin. 3. To identify natural variants in SERPINC1 that generate new N-glycosylation sequences, and to characterise their functional consequences and clinical impact. 4. Characterisation of the functional and pathological effect of new mutations in SERPINC1 identified by non-targeted sequencing in cohorts of patients with thrombosis. METHODOLOGY - We analysed plasma antithrombin and the SERPINC1 gene in 663 patients, 588 patients with suspected antithrombin deficiency and 75 COVID patients in whom the whole exome was sequenced. - We identified SERPINC1 variants in databases (HGMD®, GnomAD and in published manuscripts), which were analysed by assessing secretion, glycosylation and function of the variant antithrombin generated by targeted mutagenesis and expressed in HEK-EBNA cells. Both plasma and recombinant antithrombins were analysed by Western blot, PNGase F digestion, functional assays with different proteases, chromogenic assays, cross-linked immunoelectrophoresis, and ELISA. Molecular study of SERPINC1 was performed by MLPA, Sanger sequencing and nanopore. RESULTS/CONCLUSIONS - Structural variants account for 5-8% of cases with antithrombin deficiency. The combination of a point mutation and a structural variant, if present, is very rare in antithrombin deficiency. - The identification of false positives by MLPA advises careful design of probes to avoid polymorphic regions and validation of any positive result. - Mutations of arginine residues in antithrombin have heterogeneous consequences, both biochemically and clinically. - We identified the third heterozygosis composed of variants affecting heparin affinity, with very high thrombotic risk. - The generation of new N-glycosylation sequences in SERPINC1 resulting from natural mutations has considerable heterogeneity in terms of occupancy, functional consequences (secretion or heparin affinity defects) and clinical implications (generating moderate or severe deficiencies). - Glycosylation efficiency could be modulated by modifying glucose availability. - There are many SERPINC1 variants identified by gene sequencing in thrombosis patients that are not easily detected by commercial functional methods. - Our results recommend the development of an antithrombin deficiency assessment system based on FVIIa inhibition.

[es] INTRODUCCIÓN La antitrombina es una N-glicoproteína clave en el sistema hemostático por su actividad anticoagulante, función que amplifica la heparina. La antitrombina está codificada por el gen SERPINC1. Variantes genéticas en SERPINC1 son responsables de más del 75% de los casos con deficiencia de antitrombina, desorden dominante que constituye la principal y más grave trombofilia hereditaria. El correcto diagnóstico de la deficiencia de antitrombina es importante no solo para conocer la base molecular de la trombosis y facilitar un cribado familiar, sino porque también ayuda en el manejo clínico del paciente, incluyendo la duración y tipo de tratamiento anticoagulante. Aunque es un desorden conocido desde hacer casi 60 años, quedan retos por resolver en la deficiencia de antitrombina. Así, este desorden podría estar subestimado, por las limitaciones de los métodos diagnósticos disponibles, mayoritariamente funcionales. Por otra parte, la base molecular de la heterogeneidad clínica en los pacientes con deficiencia de antitrombina es poco conocida. OBJETIVOS 1. Comparar diferentes métodos de diagnóstico molecular de la deficiencia de antitrombina, mostrando sus debilidades y fortalezas. 2. Definir el efecto funcional y clínico de variantes en SERPINC1 que afectan a residuos arginina potencialmente implicados en la interacción con la heparina. 3. Identificar variantes naturales en SERPINC1 que generen nuevas secuencias de N-glicosilación, y caracterizar sus consecuencias funcionales e impacto clínico. 4. Caracterización del efecto funcional y patológico de nuevas mutaciones en SERPINC1 identificadas mediante secuenciación no dirigida en cohortes de pacientes con trombosis. METODOLOGÍA - Analizamos la antitrombina del plasma y el gen SERPINC1 en 663 pacientes, 588 pacientes con sospecha de deficiencia de antitrombina y 75 pacientes COVID en los que se secuenció el exoma completo. - Identificamos variantes de SERPINC1 en base de datos (HGMD®, GnomAD y en manuscritos publicados), que fueron analizadas evaluando la secreción, glicosilación y función de la antitrombina variante generada mediante mutagénesis dirigida y expresadas en células HEK-EBNA. Tanto las antitrombinas plasmáticas como las recombinantes se analizaron mediante Western blot, digestión con PNGasa F, ensayos funcionales con diferentes proteasas, ensayos cromogénicos, inmunoelectroforesis cruzada, y ELISA. El estudio molecular de SERPINC1 se realizó mediante MLPA, secuenciación de Sanger y nanoporo. RESULTADOS /CONCLUSIONES - Las variantes estructurales suponen entre el 5 y el 8% de casos con deficiencia de antitrombina. La combinación de una mutación puntual y una variante estructural, si existe, es muy rara en la deficiencia de antitrombina. - La identificación de falsos positivos por MLPA aconsejan un diseño cuidadoso de las sondas que evite regiones con polimorfismos y la validación de todo resultado positivo. - Las mutaciones de residuos arginina en la antitrombina tienen consecuencias heterogéneas, tanto bioquímica como clínicamente. - Identificamos la tercera heterocigosis compuesta de variantes que afectan la afinidad por heparina, con muy alto riesgo trombótico. - La generación de nuevas secuencias de N-glicosilación en SERPINC1 resultado de mutaciones naturales tienen considerable heterogeneidad atendiendo tanto a su ocupación como a las consecuencias funcionales (defectos de secreción o de afinidad por heparina) y las implicaciones clínicas (generando deficiencias moderadas o graves). - La eficacia de glicosilación podría modularse modificando la disponibilidad de glucosa. - Existe un elevado número de variantes de SERPINC1 identificadas mediante secuenciación del gen en pacientes con trombosis que no se detectan fácilmente con los métodos funcionales comerciales. - Nuestros resultados recomiendan el desarrollo de un sistema de evaluación de deficiencia de antitrombina basado en la inhibición del FVIIa.