[en] Minimal fragments of Bax are able to reproduce the membrane permeabilizing acti- vity of the protein, including capacity to release cytochrome c from mitochondria and to activate apoptosis in cells. These facts mean that the activity of the protein can be viewed as the addition of activities of constituent parts, which is the basis of any reduc- tionist strategy for investigating complex systems. However, the molecular mechanism of Bax protein fragments were poorly known. In particular, while the active species of Bax in the membrane is an oligomer, the aggregation state of the active fragments was unknown. Additionally, the size of the pores and their density in the membrane had not been determined. On the other hand, Bax has been show to exhibit membrane remo- delling activity, but this had not been investigated in minimal active fragments of this protein. Finding satisfactory solutions to these problems constituted the objective of the Thesis. The single-pore properties were investigated for the case of a fragment contai- ning the helix 5 of Bax (Bax-α5). For that, we ﬁrst developed a methodology based on leakage measurements in single giant unilamelar vesicles (GUVs), using simultaneously two probes of diﬀerent size. Through an exhaustive analysis of probe diﬀusion kinetics we were able to size and count single pores in single GUVs. The pores have a radius of ~5.6 nm and a surprisingly low density, meaning that only a minority of membrane bound peptides are actually forming pores. By means of circular dichroism spectroscopy and through labelling of the peptide with pirene we were able to ﬁnd evidence of an oligomeric state in the membrane (possibly a dimer) for a fragment of Bax including parts of helices α5 and α6 (Bax-α56), but not for Bax-α56, which appears to be mo- nomeric. We also found that Bax-α56 exhibits marked membrane remodelling activity in GUVs. In contrast, the remodelling activity of Bax- 5 was weak. We hypothesize that the remodelling activity is linked to the membrane curving capacity of peptide dimers, with a coiled-coil structure similar to the association of helices α5 and α6 in a well cha- racterized Bax domain-swapping dimer. We also observed strong membrane remodelling activity for the case of Bak-α56, designed from the protein Bak, which also has been found to form a domain-swapping dimer. From these data we suggest that helices α5 and α6, in a dimeric state, are responsible of the membrane remodelling activity in both Bax and Bak, via membrane curvature induction. We also propose that the two proteins may have a direct role in mitochondrial dynamics, through membrane remodelling, and that this new function is played by structures corresponding to the domain-swapping dimers, which were considered to be non functional.

[es] Los fragmentos mínimos de Bax son capaces de reproducir la actividad permeabilización de membranas de la proteína, incluyendo la capacidad de liberar el citocromo c del interior de las mitocondrias y de activar la apoptosis en las células. Estos hechos significan que la actividad de la proteína puede ser vista como la adición de actividades de sus partes constituyentes, que además es la base de cualquier estrategia reduccionista para investigar sistemas complejos. Sin embargo, el mecanismo molecular de acción de los fragmentos de la proteína Bax es poco conocido. En particular, aunque la especie activa de Bax en la membrana es un oligómero, el estado de agregación de los fragmentos activos era desconocido. Además, no se había determinado el tamaño de los poros y ni su densidad en la membrana. Por otra parte, se ha demostrado que Bax presenta actividad de remoción de membrana, pero esto no se había investigado en fragmentos activos mínimos de esta proteína. El objetivo de la tesis fue encontrar soluciones satisfactorias a estos problemas. Las propiedades de un solo poro fueron investigadas para el caso de un fragmento que contenía la hélice 5 de Bax (Bax-α5). Para ello, primero desarrollamos una metodología basada en mediciones de fugas en vesículas unilamelares gigantes únicas (GUVs), utilizando simultáneamente dos sondas de diferente tamaño. A través de un análisis exhaustivo de las cinéticas de sonda de fusión, hemos sido capaces de dimensionar y contar los poros individuales en GUVs individuales. Los poros tienen un radio de ~ 5,6 nm y una densidad sorprendentemente baja, lo que significa que sólo una minoría de péptidos unidos a la membrana están formando realmente poros. Por medio de la espectroscopia de dicroísmo circular y mediante el etiquetado del péptido con pirene pudimos encontrar evidencia de un estado oligomérico en la membrana (posiblemente un dímero) para un fragmento de Bax que incluía partes de las hélices α5 y α6 (Bax-α56). También se encontró que Bax-α56 exhibe marcada membrana remodelación actividad en GUVs. Por el contrario, la actividad de remodelación de Bax-5 fue débil a la misma concentración. Se plantea la hipótesis de que la actividad de remodelación está ligada a la capacidad de curvatura de la membrana de los dímeros peptídicos, con una estructura en espiral enrollada similar a la asociación de las hélices α5 y α6 en un dímero de intercambio de dominio Bax bien caracterizado. También se observó una fuerte actividad de remodelación de membrana para el caso de Bak-α56, diseñado a partir de la proteína Bak, que también se ha encontrado para formar un dominio de intercambio de dímero. A partir de estos datos se sugiere que las hélices α5 y α6, en estado dimérico, son responsables de la actividad de remodelación de la membrana tanto en Bax como en Bak, a través de la inducción de la curvatura de la membrana. También proponemos que las dos proteínas pueden tener un papel directo en la dinámica mitocondrial, a través de la remodelación de la membrana, y que esta nueva función es desempeñada por estructuras correspondientes a un "domain-swapping dimer", que se consideraron no funcionales.