[en] Wine is a food product with an undeniable traditional character, especially in the Mediterranean area where its production dates back to the first human populations. Spain is currently the worlds leading vineyard, with 13% of the total vine cultivation surface devoted to wine production (2021 data available at www.fev.es/sector-cifras/), which translates into a contribution of 2.2% of gross value added and the maintenance of 2.4% of employment in Spain between direct and indirect jobs (Analistas Financieros Internacionales, 2020). The wine sector is present in all the Spanish regions, being an important income source for rural areas, acting as an accelerator of the territory and helping to solve the challenge of territorial depopulation, thanks to the direct production of wine, the presence of accessory industries (timber, cork industry, vineyards, etc.) or through wine tourism (International Financial Analysts, 2020). In recent years there has been an unprecedented increase of temperatures (NOAA Global Climate Report for 2020), accompanied by changes in the level and distribution of precipitation. This context of climate change is affecting a large number of crops, especially in drier regions such as the Mediterranean area. In the specific case of vines, a typical crop in the region, a clear change has been observed in the ripening pattern of the berries due to these climatic alterations. In recent decades, an increasing gap has been observed between the accumulation of sugars within the berry (technological maturity) and organoleptic maturity due to the accumulation of phenolic and aromatic compounds (Jones and Webb, 2010; Holland and Smith, 2010; Keller, 2010; Mira de Orduña, 2010). Producing a wine with sufficient organoleptic quality to be accepted by the consumer involves delaying the harvest beyond the optimal point of sugar concentration. This increase in sugars results, through the fermentation process itself, in an increase in the concentration of ethanol, and therefore in an increase in the alcohol content of the wine. It is estimated that since 1980 commercial wines have increased their alcohol content by 1% every decade. This pattern of increase has been observed in all types of wines and productive areas (Jones et al., 2005; van Leeuwen and Darriet, 2015), being even more severe in warmer regions, traditionally with higher wine productions (Alston et al., 2011; Godden et al., 2015). The increase in alcohol content is a serious problem for the wine industry from several points of view: High ethanol concentrations can seriously affect the winemaking process by preventing both yeasts (alcoholic fermentation) and lactic acid bacteria (malolactic fermentation) from optimal development (Bisson, 1999; Bruescher et al., 2001; Coulter et al., 2008; Graça da Silveira et al., 2002), resulting in stuck fermentations and/or unpalatable wines. Even if the winemaking process is completed, an excess of alcohol generates a sensory imbalance by increasing the solubility of certain volatile compounds, affecting their perception (Goldner et al., 2009; Pickering et al., 1998; Hartmann et al., 2002; Le Berre et al., 2007; Robinson et al., 2009). In addition, todays society is highly interested in healthy lifestyle and moderate alcohol consumption, so high alcoholic beverages have a reduced place in the market (Schmidtke et al., 2012; Saliba et al., 2013). There are even public measures for highly alcoholic beverages that penalise their international marketing. These measures could even affect the export/import of wine (de Barros Lopes et al., 2003; Contreras et al., 2014). There are numerous approaches to try to alleviate this problem, from crop management to avoid ripening delays (like leaf removal, soil management, or crop relocation) (Stoll et al., 2010; Whiting, 2010; Schmidtke et al., 2011; Ozturk and Anli, 2014), to wine de-alcoholization through filtration and evaporation systems, that require subsequent wine restructuring (Akyereko et al, 2021; Catarino and Mendes, 2011; Labanda et al., 2009; Gonçalves et al., 2013; Diban et al., 2008; Fedrizzi et al., 2014), through to the removal of part of the sugar content from the must by dilution, filtration or enzymatic treatments (Pickering et al., 1998; 1999). All of them have advantages and disadvantages, being approaches that are difficult to implement at the industrial level, would entail serious cost overruns, or could negatively impact consumer perception. Nevertheless, some of them are valid solutions that are being investigated and optimised for transfer to the industrial sector. In this doctoral thesis, a microbiological approach is presented as a possible solution to the increasing alcohol content of wines. This consists of the modification of the alcoholic fermentation process to reduce the ethanol yield of the yeasts, with the objective of minimising the changes in the final product. It could be approached along two main lines: the modification of the ethanol yield of Saccharomyces cerevisiae and/or the use of alternative yeasts outside the Saccharomyces genus. S. cerevisiae is an organism highly specialised in alcoholic fermentation. It is the main agent of the fermentation process and there are lines specifically adapted to the fermentation of grape must (wine strains) (Liti et al., 2009; Peter et al., 2018). These strains have a high tolerance to the stress factors inherent to the oenological environment, such as high sugar concentrations (high osmotic pressure), low pH, high pressures, the presence of sulphite (SO32-), a wide range of temperatures, and ethanol, which they produce in large quantities. This combination of characteristics means that S. cerevisiae, although initially found in a very low proportion, is capable of very quickly displacing the rest of the microbiota present in greater abundance in the must at the beginning of fermentation. This high specialization in the fermentation process is related to an ethanol yield which is not only higher than that of other species but is also a very homogeneous characteristic throughout the species, as described in Chapter 1. On the other hand, there are a plethora of yeast species with a fermentation profile more suited to the objective of a lower ethanol yield. However, these species, even when they survive the initial phases of fermentation, end up being displaced by S. cerevisiae, precisely because of their lesser adaptation to must fermentation, making it necessary to improve their resistance to such crucial stress factors as the presence of sulphite (SO32-), temperature, or low pH. This doctoral thesis proposes the use of S. cerevisiae to reduce the alcohol content of wine by diverting sugar consumption from ethanol production to CO2 generation through the respiratory capacity of yeasts. Specifically, the aim is to solve a problem inherent to this approach by means of different strategies. It has been shown that although it is possible to reduce ethanol production by favouring respiration through the maintenance of aerobic conditions during fermentation, this same aerobiosis produces, for reasons as yet unknown, an undesirable increase in acetic acid production, which means that this strategy cannot be applied in wine production. Chapter 1 explores the natural diversity of S. cerevisiae in search of strains with lower acetic acid production, identifying possible candidate strains for industrial application, and the aeration process for a selected strain is fine-tuned. Chapter 2 addresses the study of the relationship between the flexibilization of carbon catabolite repression (ability to consume secondary sugars in the presence of glucose) and lower acetic acid production, which serves as the basis for the design of a directed evolution to obtain strains with low acetic acid production in aerobiosis carried out. Finally, Chapter 3 explores the reduction of acetic acid by regulating aerobic conditions, not just by controlling airflow but through oxygen consumption by the alternative yeast Metschnikowia pulcherrima (Chapter 3).

[es] El vino es un alimento tradicional, especialmente en los países del área mediterránea donde su producción se remonta a las primeras poblaciones humanas. España alberga el primer viñedo a escala mundial, con un 13% de la superficie de cultivo total de vid destinada a la producción de vino (datos de 2021, disponibles en www.fev.es/sector-cifras/), lo que se traduce en una aportación del 2.2% del valor añadido bruto y en el mantenimiento del 2.4% de empleo en España entre puestos de trabajo directos e indirectos (Analistas Financieros Internacionales, 2020). El sector vitivinícola está presente en todas las comunidades autónomas españolas, siendo una importante fuente de ingresos para las zonas rurales, actuando como un dinamizador del territorio y colaborando con el reto del despoblamiento territorial, bien gracias a la producción directa de vino, a la presencia de industrias accesorias (maderera, industria del corcho, del vidrio y otras) o mediante el enoturismo (Analistas Financieros Internacionales, 2020). En los últimos años se ha observado un incremento sin precedentes de las temperaturas en la superficie terrestre (NOAA Global Climate Report for 2020), acompañado de cambios en el nivel y distribución de las precipitaciones. Este contexto de cambio climático está afectando a gran número de cultivos, especialmente en las regiones más secas como el área mediterránea. En el caso concreto de la vid, cultivo típico de estas zonas, se ha observado un claro cambio en el patrón de maduración de las bayas debido a estas alteraciones climáticas. En las últimas décadas se ha visto un desfase cada vez mayor entre la acumulación de azúcares dentro de la baya (madurez tecnológica) y la madurez organoléptica debida a la acumulación de compuestos fenólicos y aromáticos (Jones y Webb, 2010; Holland y Smith, 2010; Keller, 2010; Mira de Orduña, 2010). A causa de este desfase, lograr la producción de un vino con suficiente calidad organoléptica para el consumidor supone retrasar la vendimia más allá del punto óptimo de concentración de azúcares. Este aumento de azúcares se traduce, por el propio proceso de fermentación, en un incremento en la concentración de etanol y, por tanto, en un aumento en la graduación alcohólica del vino. Se estima que desde 1980 los vinos comerciales han aumentado su contenido alcohólico en un 1% cada década, observándose este patrón de aumento en todo tipo de vinos y áreas de producción (Jones et al., 2005; van Leeuwen y Darriet, 2015), con una tendencia aún más severa en las regiones más cálidas, tradicionalmente de mayor producción vitivinícola (Alston et al., 2011; Godden et al., 2015). El aumento del contenido alcohólico supone un grave problema para la industria vitivinícola desde varios puntos de vista: Grandes concentraciones de etanol pueden alterar el proceso de elaboración, al evitar que tanto levaduras (fermentación alcohólica) como bacterias del ácido láctico (fermentación maloláctica) se desarrollen de manera óptima (Bisson, 1999; Bruescher et al.,2001; Coulter et al., 2008; Graça da Silveira et al., 2002) dando lugar a paradas fermentativas y/o defectos organolépticos. Aunque el proceso de elaboración se llegase a completar, un exceso de grado alcohólico genera un desequilibrio sensorial al aumentar la solubilidad de ciertos compuestos volátiles, impidiendo su percepción (Goldner et al., 2009; Pickering et al., 1998; Hartmann et al., 2002; Le Berre et al., 2007; Robinson et al., 2009). Además, la sociedad actual busca cada vez más un estilo de vida saludable y un consumo de alcohol moderado, de forma que bebidas de alta graduación tienen cada vez menos cabida en el mercado (Schmidtke et al., 2012; Saliba et al., 2013), existiendo incluso medidas de salud pública que gravan la comercialización internacional de bebidas de alta graduación y que podrían llegar a afectar a la exportación-importación de vino (de Barros Lopes et al., 2003; Contreras et al., 2014). Existen numerosos abordajes para tratar de paliar este problema, desde el manejo del cultivo para evitar el desfase en la maduración (por ejemplo, deshojado, manejo del suelo o deslocalización de cultivos) (Stoll et al., 2010; Whiting, 2010; Schmidtke et al., 2011; Ozturk y Anli, 2014) hasta la desalcoholización del vino mediante sistemas de filtración y evaporación, que exigen una posterior reestructuración del vino (Akyereko et al., 2021; Catarino y Mendes, 2011; Labanda et al., 2009; Gonçalves et al., 2013; Diban et al., 2008; Fedrizzi et al., 2014), pasando por la eliminación de parte del contenido en azúcares del mosto mediante dilución, filtración o tratamientos enzimáticos (Pickering et al., 1998; 1999). Todos ellos presentan ventajas e inconvenientes, siendo en la mayoría de los casos abordajes difíciles de implementar a nivel industrial, que supondrían un elevado sobrecoste, o que podrían tener un impacto negativo en la percepción del consumidor. No obstante, algunos de estos abordajes son soluciones válidas que están siendo investigadas y optimizadas para su transferencia al sector industrial. En esta tesis doctoral se presenta como posible solución al aumento de grado alcohólico el abordaje del problema desde un punto de vista microbiológico, modificando el proceso de fermentación alcohólica. Este enfoque apuesta por reducir el rendimiento de etanol de las levaduras con el objetivo de modificar al mínimo el producto final. Puede llevarse a cabo mediante dos líneas principales: la modificación del rendimiento en etanol de Saccharomyces cerevisiae y/o la utilización de levaduras alternativas al género Saccharomyces. S. cerevisiae es un organismo altamente especializado en la fermentación alcohólica, siendo su agente principal y existiendo cepas adaptadas específicamente a la fermentación del mosto de uva (cepas vínicas), (Liti et al., 2009; Peter et al., 2018). Estas cepas presentan una gran tolerancia a los factores de estrés propios del medio enológico, como gran tolerancia a grandes concentraciones de azúcares (alta presión osmótica) bajo pH, altas presiones, presencia de sulfito (SO32-), amplio rango de temperaturas y una alta resistencia a la toxicidad del etanol, que producen en grandes cantidades. Esta combinación de características hace que S. cerevisiae sea capaz de desbancar al resto de la microbiota presente en el mosto muy rápidamente conforme se inicia la fermentación, aun cuando esté en una proporción muy baja inicialmente. Esta especialización, que hace de S. cerevisiae el organismo fermentador por antonomasia, dificulta enormemente la modificación de su rendimiento en etanol, que además de ser más alto que el que presentan otras especies es una característica enormemente homogénea en toda la especie, como se describe en el capítulo 1. Por otro lado, existen multitud de especies de levadura con un perfil de fermentación más adecuado para el objetivo de un menor rendimiento alcohólico. Sin embargo, estas especies, aun cuando sobreviven durante las fases iniciales de la fermentación, acaban siendo desplazadas por S. cerevisiae, precisamente por su menor adaptación a la fermentación del mosto, haciéndose necesario un trabajo de mejora para aumentar su resistencia a factores de estrés tan cruciales como la presencia de sulfito (SO32-), temperatura o pH bajo. En esta tesis doctoral se propone el uso de S. cerevisiae para reducir el grado alcohólico del vino mediante la desviación del consumo de azúcares de la producción de etanol hacia la generación de CO2 mediante la capacidad respiratoria de las levaduras. En concreto, se pretende solventar mediante distintas aproximaciones un problema inherente a esta propuesta, el exceso de producción de ácido acético por parte de S. cerevisiae en las condiciones de cultivo necesarias para que tenga lugar la respiración (aerobiosis). En este trabajo se explora la diversidad natural de S. cerevisiae en busca de cepas con una menor producción en ácido acético, identificando posibles cepas candidatas para su aplicación industrial, y se pone a punto el proceso de aireación para una cepa seleccionada (capítulo 1). Se aborda el estudio de la relación entre la flexibilización de la represión por catabolito (capacidad de consumir otros azúcares en presencia de glucosa) y la menor producción de ácido acético, que sirve de base para el diseño de una evolución dirigida con el objetivo de obtener cepas con baja producción de ácido acético en aerobiosis (capítulo 2). Finalmente, se explora la reducción de ácido acético por medio de la regulación de las condiciones de aerobiosis, no mediante el control del flujo de aire, sino gracias al consumo de oxígeno por parte de la levadura alternativa Metschnikowia pulcherrima (capítulo 3).