[en] Despite having an effective preventive vaccine, the hepatitis B virus (HBV) is a serious global health problem due to its high prevalence (it affects more than 250 million people worldwide) and the morbidity derived from its chronicity, as it is the first virological risk factor in the development of hepatocellular carcinoma (HCC). The HBc protein (encoded by the HBC gene) is essential for the virus. It self-assembles forming the viral capsid and thanks to its wide network of interactions it intervenes in multiple steps of the viral cycle. Although the present therapeutic protocol allows to adequately control the viral replication, the eradication of the infection is not achievable, for which reason new therapeutic strategies are required. Moreover, considering the severity of the disease progression, the identification of viral prognostic factors could be extremely helpful in patients follow-up. In this doctoral thesis we have analysed, through massive sequencing, the conservation and complexity of the quasispecies (QS) of the HBC gene of HBV in patients with chronic hepatitis B at different clinical stages in order to detect both hyperconserved regions (regardless of the clinical stage or the viral genotype) that could serve as possible targets for new therapy and/or diagnostic strategies, and group-specific differences in terms of conservation, mutations and complexity of the QS that could serve as prognostic factors for the disease progression. HBV genome was extracted from serum samples of patients with chronic hepatitis B at different clinical stages and the HBC region was amplified, using a three-steps amplification protocol, divided in two amplicons. The amplicons were later sequenced by Next Genetation Sequencing (NGS) using the MiSeq Illumina platform. Once the viral population was genotyped, the presence of mutations was detected by aligning the sequences obtained for each patient with a consensus sequence of the corresponding genotype. QS conservation, both general and group-related, was studied by calculating the information content. QS complexity was analysed by considering different indexes. We detected some nucleotide and amino acid hyper-conserved regions (regardless of the clinical stage and the viral genotype) that could be used as therapeutic or diagnostic targets. Moreover, some group-specific conservation patterns, that could cover a role in disease progression, were observed. In both studies of the project an amino acid substitution (P79Q) was detected in patients with tumoral injury (HCC). The patients in this clinical stage showed a high QS complexity in one of the HBC amplicons. The P79Q mutation and the high complexity in HCC patients could be used as prognostic factors of tumoral transformation. However, further studies are required to deeply clarify the possible association between these viral factors and the liver injury. In summary, the results here obtained could serve as a basis for the development of panclinic and pangenotypic strategies for the treatment and diagnosis of chronic hepatitis B as well as for the identification of prognostic factors that could be helpful in liver disease progression follow-up.

[es] A pesar de tener una vacuna preventiva eficaz, el virus de la hepatitis B (VHB) es un grave problema de salud mundial debido a su elevada prevalencia (afecta a más de 250 millones de personas en todo el mundo) y a la morbilidad que deriva de su cronicidad, pues es el primer factor virológico de riesgo en el desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC). La proteína HBc (codificada por el gen HBC) es imprescindible para el virus. Se autoensambla formando la cápside viral y gracias a su amplia red de interacciones interviene en múltiples procesos del ciclo viral. Aunque el tratamiento disponible actualmente permite controlar la replicación viral, hoy en día no es posible erradicar la infección, por lo que se necesitan nuevas estrategias terapéuticas. Además, considerando la gravedad de la evolución clínica de la enfermedad, la identificación de factores virológicos que pudieran pronosticar la progresión del daño hepático sería de gran ayuda en el seguimiento de los pacientes. En este proyecto de tesis doctoral se ha analizado, a través de secuenciación masiva, la conservación y la complejidad de la quasiespecies (QS) del VHB en la región del gen HBC en pacientes con hepatitis crónica B en diferentes estados de la enfermedad hepática. Con ello se han querido detectar, tanto regiones hiperconservadas (independientemente del cuadro clínico o el genotipo viral de los pacientes) que pudieran servir de posibles dianas para nuevas estrategias terapéuticas y/o diagnósticas como diferencias en términos de conservación, mutaciones y complejidad de la QS entre los distintos cuadros clínicos analizados que pudieran servir de factores pronósticos del avance de la enfermedad. El genoma del VHB se extrajo a partir de muestras de suero de pacientes con hepatitis crónica por VHB en diferentes etapas clínicas de la enfermedad y la región HBC del genoma viral se amplificó, a través de un sistema de amplificación de tres pasos secuenciales, dividido en dos amplicones. Seguidamente estos se secuenciaron por Next Generation Sequencing (NGS) a través de la plataforma MiSeq Illumina. Una vez hecho el genotipado de la población viral, la presencia de mutaciones se detectó alineando las secuencias obtenidas para cada paciente con una secuencia consenso del genotipo correspondiente. La conservación de la QS, tanto global como por grupo, se analizó calculando el contenido de información. También se analizaron diversos indicadores de complejidad de la QS. Se detectaron regiones (tanto nucleotídicas como aminoacídicas) hiperconservadas independientemente del cuadro clínico y del genotipo viral cuya elevada conservación podría evidenciar su importancia funcional, por lo que podrían ser valiosas dianas de terapia y diagnosis. Además, se evidenciaron regiones conservadas específicamente en ciertos grupos clínicos, lo que sugiere un posible rol de estas regiones en la progresión de la enfermedad hepática. En los dos estudios realizados se detectó una sustitución aminoacídica (P79Q) en los pacientes con lesión tumoral (HCC). En estos mismos pacientes se detectó una elevada complejidad de la QS en la región de uno de los dos amplicones en los que se dividió el gen HBC. La elevada complejidad de la QS y la detección de la sustitución P79Q en los pacientes HCC podrían ser factores pronósticos de la transformación tumoral. Posteriores estudios serán necesarios para analizar con más profundidad la posible asociación entre estos factores y la lesión hepática. En resumen, los resultados obtenidos podrían servir como base para el desarrollo de estrategias panclínicas y pangenotípicas de tratamiento y diagnosis de la hepatitis crónica por VHB, así como para la identificación de factores pronósticos que puedan ayudar en el seguimiento de la enfermedad hepática.