[en] Synthetic fungicides are the primary means to reduce losses caused by postharvest diseases. However, public concern for their negative impact on human health and environment associated with undesirable chemical residues on fruit and proliferation of fungicide–resistant isolates have impelled the search for alternative methods. Biological control using microorganisms has emerged as an effective alternative to control postharvest diseases and to produce quality fruit free of fungicide residues. However, the development of a successful biocontrol product requires a strong knowledge about the antagonistic ability and mechanisms of action used by the microbial agent to disease suppression and the possibility for its production and formulation to commercial application. In this context, Bacillus subtilis strain CPA–8 isolated from nectarines surface in the Postharvest Pathology Laboratory from IRTA centre (Lleida) has shown a significant capacity for biocontrol of postharvest diseases of stone fruit. Its future use on a commercial level depends on its antagonistic potential to control fruit postharvest diseases as well as an optimum production and formulation systems. This thesis has the main objective to evaluate key aspects involved in development of B. subtilis CPA–8 as an effective biocontrol agent of postharvest diseases on fruit. To achieve this objective, first, the CPA–8 growth and production of endospores and antifungal substances were characterized. Then, biocontrol potential of B. subtilis CPA–8 was tested against the main postharvest decay on oranges, apples and stone fruit (Chapter 1). Based on these results, the mechanism of action used by CPA–8 to suppress postharvest pathogens, particularly against Monilinia spp. causing brown rot in stone fruit was studied (Chapter 2). Based on chemical, molecular and biological analysis the key factors involved in the biocontrol activity of CPA–8 against Monilinia spp. were identified. Next step was optimizing B. subtilis CPA–8 production by developing a low cost medium that provide maximum bacterium growth and maintain its biocontrol efficacy (Chapter 3). First, different media combining economical nitrogen and carbon sources from commercial products and by–products were evaluated. Second, CPA–8 production was scaled up in a 5–liter bioreactor and the efficacy to control of Monilinia spp. in peaches was evaluated. The final step was B. subtilis CPA–8 formulation by spray drying (Chapters 4 and 5). This method was selected because it is a cost effective technique for bacteria preservation and results of Chapter 1 indicated that CPA–8 was heat resistant by endospores production capacity. These endospores had also demonstrated good antifungal activity against fruit postharvest pathogens. First, the role of endospore production by B. subtilis CPA–8 on its survival to spray–drying process was investigated by comparing CPA–8 with the biocontrol agent Pantoea agglomerans CPA–2 as model of heat–sensitive and non–spore forming bacterium (Chapter 4). Finally, carriers/protectants were evaluated to prepare CPA–8 formulations by spray drying; and with the best CPA–8 formulations rehydration media, shelf life stability and biocontrol efficacy during storage were evaluated (Chapter 5). The results obtained in Chapter 1 indicated that CPA–8 produces cells, heat–resistant endospores and compounds with high antifungal activity in vitro against the major fruit postharvest pathogens Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum and Penicillium expansum. Treatment of cells, endospores and cell–free supernatants of CPA–8 showed different efficacy levels to control fugal decay on oranges, apples and stone fruit, obtaining the best results against Monilinia spp. on stone fruit with disease reductions up to 100%. Dose tests demonstrated that different CPA–8 treatments at 108, 107 and 106 CFU mL–1 were effective against Monilinia spp., similar or better than Serenade Max®, a commercial biocontrol product based in a B. subtilis strain. Experimental evidence suggested that B. subtilis CPA–8 has biocontrol potential to control postharvest diseases on several fruit types, particularly against peach brown rot. The mode of action study (Chapter 2) showed that cell free supernatants and butanolic extracts from liquid cultures of B. subtilis CPA–8 had a strong antifungal activity in vitro against Monilinia spp. similar to that observed with cell suspensions. Fengycin, iturin and surfactin lipopeptides were identified by TLC in butanolic extracts from cell free supernatants of CPA–a by comparison with the B. subtilis reference strains UMAF6614 and UMAF6639, indicating that antibiosis could be the major factor involved in the CPA–8 biological control ability. TLC–bioautography analysis showed that CPA–8 antifungal activity was associated only with fengycin lipopeptide. These results were definitively supported by mutagenesis analysis targeted to suppress fengycin biosynthesis by disruption of the fenB gene. PCR and TLC–bioautography analysis allowed to identify CPA–8 transformants with reduced or suppressed antifungal activity and to select the defective phenotype associated with the lack of fengycin bands. Fruit trials confirmed that fengycin–defective mutants lost their ability to control peach brown rot disease in comparison with CPA–8 wild type strain or Serenade Max®. Taken together our data indicate that fengycin–like lipopeptides play a major role in the biological control potential of B. subtilis CPA–8 against peach brown rot. The results obtained in Chapter 3 indicate that high production levels of B. subtilis CPA–8 (>3×109 CFU mL–1) could be achieved in a low cost medium based on defatted soy flour 44 % (40 g L–1) with sucrose (20 g L–1) or molasses (5 g L–1). CPA–8 production in the optimized low cost medium was scaled–up in a 5–L bioreactor at 30 °C under shaking at 200 rpm and with air flow of 100 L h–1 and production was maintained around 3×109 CFU mL–1. Fruit trials with cells and cell free supernatants obtained from CPA–8 grown in optimized medium maintained biocontrol efficacy against M. fructicola in peaches showing disease reduction up to 95 %, similar to the treatment from bacterium grown in expensive laboratory media. CPA–8 populations survived in wounds on inoculated peaches, regardless of the culture media used. The results could be used to provide a reliable basis for the fermentation scaling–up process to an industrial level. The results obtained in Chapters 4 and 5 indicate that B. subtilis CPA–8 is heat resistant to high temperatures involved in spray–drying process by endospore production comparing with the heat sensitive and non–spore forming P. agglomerans CPA–2. The 72–h–old CPA–8 cultures spray–dried showed the best survival with 32.3 % viable cells recovery and a final concentration product of 3.3×109 CFU g–1, while CPA–2 viability was lower than 2 %. Heat resistance of CPA–8 was also depending on growth time, being 72–h–old culture more resistant than 24–h–old culture, probably due to the higher content of endospores. These results suggest that endospore production improves CPA–8 resistance to spray–drying formulation system. The study of carriers/protectants addition in spray–drying CPA–8 formulations showed that four different combinations of skim milk and MgSO4 provided reasonable recovery powder (28–38 %) and moisture content (7–13 %). CPA–8 survival varied considerably among spray–dried 24– and 72–h–old formulations. The 72 h–old CPA–8 culture spray dried showed the highest survival (28–32 %) and a final concentration product of 1.6–3.3×109 CFU g–1, while viability of 24 h–old culture formulations were lower than 1 %. Rehydration media as water or phosphate buffer provided good recovery of dried cells from CPA–8 formulations as well as skim milk or sucrose both at 10%. This result is a practical advantage. CPA–8 formulations after 4 and 6 month of storage at 4 °C (cold) or at 20 °C (room temperature) maintained survival and efficacy to control brown rot caused by Monilinia spp. on nectarines and peaches achieving disease incidence reductions among 90 and 100 %. Spray drying could be considered a suitable method to obtain stable and effective formulations of B. subtilis CPA–8. In conclusion, the studies in this thesis demonstrated the biocontrol potential of B. subtilis CPA–8 to control postharvest diseases of fruit and established the bases for subsequent implementation of production and formulation at commercial level.

[es] La limitación en el uso de fungicidas para el control de enfermedades en postcosecha de fruta es un grave problema en el sector frutícola actual. Debido a esto, el uso de estrategias alternativas como el control biológico microbiano son fundamentales para la producción de fruta de calidad. Sin embargo, el desarrollo de programas de biocontrol eficaces requiere de un fuerte conocimiento de la capacidad de control y los mecanismos de acción usados por el agente microbiano que se pretende emplear, así como de la posibilidad para que éste pueda ser producido y formulado a nivel comercial. En este contexto, la bacteria Bacillus subtilis cepa CPA–8 aislada de la superficie de nectarinas en el Laboratorio de Patología de Postcosecha del Centro IRTA (Lleida) ha demostrado tener una importante capacidad de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta de hueso. Su futuro uso a nivel comercial depende del estudio de su potencial de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta; así como del desarrollo de procesos para su óptima producción y formulación. La presente tesis tiene como objetivo fundamental evaluar aspectos clave para el desarrollo de B. subtilis CPA–8 como agente eficaz de control biológico de enfermedades de postcosecha de fruta. Para cumplir con este objetivo, en primer lugar, se realizó un análisis detallado de las características biológicas de la cepa CPA–8 como su crecimiento en medio de cultivo, producción de endosporas y sustancias antifúngicas; así como su potencial para el control de importantes podredumbres de postcosecha de naranja, manzana y fruta de hueso (Capítulo 1). Con estos resultados el siguiente paso fue estudiar el modo de acción usado por B. subtilis CPA–8 para la supresión de patógenos de postcosecha, concretamente contra Monilinia spp. causante de la podredumbre marrón en fruta de hueso (Capítulo 2). Mediante la combinación de herramientas de análisis químico, molecular y biológico se determinaron los principales factores implicados en la capacidad antagónica de la cepa CPA–8 contra Monilinia spp. El siguiente paso fue optimizar la producción de B. subtilis CPA–8, para lo cual se desarrolló un medio de cultivo de bajo coste que proporcionase un crecimiento alto y mantuviese la eficacia de biocontrol (Capítulo 3). Primero se buscaron fuentes de nitrógeno y carbono económicas entre productos comerciales y subproductos agroalimentarios. Posteriormente se realizó el escalado de producción de la bacteria en un bioreactor de 5 L y se comprobó la efectividad para el control de Monilinia spp. en melocotones. El paso final fue la formulación de B. subtilis CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5). Este método fue seleccionado por dos motivos, por un lado porque ésta es una técnica de secado viable para formulación de bacterias a bajo coste y en base a los resultados obtenidos en el capítulo 1 sobre la capacidad de la bacteria para producir endosporas resistentes al calor y eficaces contra patógenos de postcosecha de fruta. Primero se realizó un estudio comparativo del efecto de la atomización sobre la supervivencia de B. subtilis CPA–8 y del agente de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2 (Capítulo 4). Posteriormente se realizó una evaluación de las sustancias protectoras/material de soporte más adecuadas para la atomización de la cepa CPA–8, y de los mejores productos atomizados se evaluaron los distintos medios de rehidratación y la actividad antifúngica; así como su vida útil y efectividad durante conservación (Capítulo 5).Los resultados obtenidos en el capítulo 1 indicaron que B. subtilis CPA–8 produce células, endosporas resistentes al calor y compuestos que tienen una alta actividad antagónica in vitro contra los principales patógenos de postcosecha de fruta Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum y Penicillium expansum. Los tratamientos de células, endosporas y sobrenadantes libres de células de la cepa CPA–8 mostraron diferentes niveles de efectividad para el control de podredumbres en naranja, manzana y fruta de hueso, presentando los mejores resultados contra Monilinia spp. en fruta de hueso con reducciones de la incidencia de la enfermedad hasta del 100 %. El ensayo de dosis de diferentes tratamientos de la cepa CPA–8 a 108, 107 y 106 UFC mL–1 fueron efectivos contra Monilinia spp., de forma similar o mejor que Serenade Max®. El estudio del modo de acción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 2) demostró que los sobrenadantes libres de células provenientes de cultivos líquidos tenían una alta actividad antifúngica in vitro contra Monilinia spp. similar a la observada con suspensiones celulares. Los análisis mediante PCR y bioautografía en TLC de extractos butanólicos de estos sobrenadantes en comparación con los de las cepas de referencia de B. subtilis UMAF6614 y UMAF6639, revelaron la producción de las principales familias de lipopéptidos antifúngicos conocidos en Bacillus (fengicinas, iturinas y surfactinas), lo que apuntó a la antibiosis como el principal mecanismo de acción implicado en la capacidad de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Las fracciones correspondientes a las fengicinas fueron las responsables de la actividad inhibitoria de la cepa CPA–8 frente a Monilinia spp. Estos resultados fueron definitivamente corroborados mediante la construcción de mutantes de B. subtilis CPA–8 defectivos para la producción de fengicina interrumpiendo la expresión del gen fenB. Los análisis por PCR y bioautografía en TLC revelaron que los mutantes defectivos de la cepa CPA–8 perdieron la capacidad de inhibir a Monilinia spp. por su incapacidad para producir fengicinas. Los ensayos de efectividad en fruta utilizando tratamientos provenientes de los mutantes de la cepa CPA–8 demostraron que éstos habían perdido su capacidad para controlar la podredumbre causada por Monilinia spp. con porcentajes de incidencia similares a los observados en el control sin tratar, mientras que los tratamientos con la cepa parental o Serenade Max® presentaron reducciones de enfermedad de hasta el 100 %. Todos estos resultados demostraron que la producción de fengicinas juega un papel muy importante en la efectividad de B. subtilis CPA–8 para controlar la podredumbre marrón del melocotón; y que éste resulta ser el principal mecanismo de acción implicado en su capacidad de biocontrol. En la optimización de la producción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 3) los resultados obtenidos demostraron que se pueden conseguir altos niveles de biomasa (superiores a 3×109 UFC mL–1) usando dos medios de bajo coste compuestos por harina de soja desengrasada 44 % a 40 g L–1 como fuente de nitrógeno en combinación con sacarosa a 20 g L–1 o melaza a 5 g L–1 como fuentes de carbono. Además la producción de la cepa CPA–8 en este medio de bajo coste pudo ser escalada a nivel de laboratorio en un bioreactor de 5 L de capacidad a 30 °C, con agitación de 200 rpm y flujo de aire de 100 L h–1, manteniendo las concentraciones de la bacteria a 3×109 UFC mL–1. Los ensayos en fruta con tratamientos de la cepa CPA–8 crecida en el medio optimizado de bajo coste demostraron que ésta mantenía su eficacia de biocontrol contra M. fructicola en melocotones con reducciones de enfermedad de hasta el 95 %, similar a los tratamientos de la bacteria crecidos en medios de laboratorio. Las poblaciones de CPA–8 sobrevivieron en heridas de melocotones inoculados, independientemente de los medios de cultivo utilizados. Estos resultados proporcionan una base fiable para la producción de la cepa CPA–8 a nivel industrial. En la formulación de B. subtilis CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5) los resultados demostraron que esta bacteria es capaz de sobrevivir a las altas temperaturas del proceso (32.3 % de viabilidad y 3.3×109 UFC g–1 de concentración final de producto), comparado con P. agglomerans CPA–2 utilizada como modelo de bacteria sensible al calor y no formadora de endosporas que no fue resistente (menos del 2 % de viabilidad). La supervivencia de la cepa CPA–8 a la atomización estuvo directamente relacionada con su capacidad para producir endosporas resistentes a las altas temperaturas. La resistencia al calor de la cepa CPA–8 además dependió de la fase de crecimiento, siendo el cultivo de 72 h, más resistente que el de 24 h, probablemente por su mayor contenido de endosporas. Los resultados obtenidos en el estudio de la sustancia protectora/material de soporte más adecuada para la atomización de B. subtilis CPA–8 demostraron que cuatro diferentes combinaciones de leche desnatada en polvo y MgSO4 proveían una buena recuperación de polvo (28–38 %) y contenidos de humedad del 7–13 %. La supervivencia de la cepa CPA–8 varió considerablemente en los atomizados con los cultivos de 24 h y los de 72 h. Las formulaciones de 72 h mostraron una mayor supervivencia (28–32 %) y con concentraciones finales entorno a 1.6–3.3×109 UFC g–1, mientras que la viabilidad de los atomizados de 24 h fue inferior al 1 %, por lo cual se seleccionaron para su posterior evaluación. Diferentes rehidratantes como el agua o tampón fosfato proporcionaron una buena recuperación de células viables en las formulaciones de CPA–8 similares a las obtenidas en leche desnatada en polvo o sacarosa al 10 % por lo que el agua puede utilizarse como rehidratante con la ventaja a nivel práctico que supone. El estudio de la vida útil de las formulaciones de la cepa CPA–8 almacenadas a 4 °C (frío) y a 20 °C (temperatura ambiente) demostró que la viabilidad se mantuvo o disminuyó ligeramente entorno a 0.2–0.3 log durante 6 meses de almacenamiento. Además después de 4 y 6 meses de almacenamiento estas formulaciones controlaron la podredumbre marrón causada por Monilinia spp. en nectarinas y melocotones mostrando reducciones de la incidencia de la enfermedad entre el 90 y 100 %. Los resultados obtenidos demostraron que la atomización podría ser un método de secado adecuado para obtener formulaciones estables y eficaces de B. subtilis CPA–8. En conclusión los estudios realizados en esta tesis demuestran el potencial del agente de biocontrol B. subtilis CPA–8 para el control de enfermedades de postcosecha de fruta y sientan las bases para su posterior implementación de la producción y formulación a nivel comercial