[en] hiPSC have been historically used to generate human disease models in a dish. In that way, we will have an ideal model to study molecular and functional aspects of the diseases and also it will help us to develop new therapeutic approaches. Familial platelet disorder with associated myeloid malignancy (FPDMM) is a rare platelet disorder caused by mutations in RUNX1 gene, characterized by thrombocytopenia, abnormal platelet function and an increased risk of developing other blood disorders or cancers. We propose to generate a human FPDMM model with a non-previously reported mutation in exon 6 of RUNX1. We generated a hiPSC line by cellular reprogramming of PBMC from a FPDMM patient using non-integrative Sendai viruses expressing Yamanaka reprogramming factors. Through functional and genetic analyses we completed the characterization of the new hiPSC cell line. First, the presence of the RUNX1 mutation was confirmed by Sanger sequencing. STR analysis demonstrated the genetic identity between the original mononuclear cells from the patient and the hiPSC cell line. RT-PCR verified the silencing of exogenous reprogramming genes and the activation of endogenous pluripotency genes. Also, the expression of surface pluripotency markers was demonstrated by flow cytometry. The new hiPSC line showed a normal karyotype and positive activity for alkaline phosphatase. Finally, to demonstrate the capacity of hiPSC line to differentiate into the three germ layers in vitro and in vivo, embryoid bodies and teratoma formation assays were accomplished. In both cases, specific structures from endoderm (ciliated epithelium), mesoderm (cartilage) and ectoderm (neural rosettes) were demostrated. Besides, we also detected the expression of representative markers of the three germ layers. The generation of this line represents a great tool to study the biology of this disease, and also allows us to apply new therapies for the treatment of FPDMM, such as phenotypic correction by gene therapy or testing of new drugs. Finally, our laboratory had generated several models of Bernard-Soulier syndrome (BSS) deficient in GP9. This disease is a rare monogenic platelet disorder caused by congenital deficiency of the GPIb-IX-V glycoprotein complex due to mutations in GP1BA, GP1BB or GP9 and characterized by macrochrombocytopenia and severe bleeding. Our last aim was to validate one of this disease model and its corresponding rescued hiPSC cell line, in which GP9 wildtype gene was introduced by lentiviral vectors. We performed the megakaryocytic differentiation in both hiPSC lines. We observed that both produced CD34+ hematopoietic progenitors, CD34+CD41a+ megakaryocyte progenitors and CD41a+ cells, in a similar way. Interestingly, during the evaluation of the terminal megakaryocytic differentiation of these precursors, we confirmed that the original non-rescued hiPSC cells were unable to progress and to generate CD42a+ and CD41a+CD42a+ mature megakaryocytic cells. However, GP9-rescued cells were able to progress and produced mature megakaryocytes. These results show that gene therapy has been efficient to restore GPIX expression on megakaryocytes' surface and can also become a therapeutic approach for patients with BSS carrying GP9 mutations in the next future.

[es] Históricamente, el empleo de hiPSC se ha basado en la generación in vitro de modelos humanos de enfermedad. Por tanto, disponemos de un modelo ideal para estudiar los aspectos moleculares y funcionales implicados en el desarrollo de enfermedades, además de poder desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. El trastorno plaquetario familiar con neoplasia mieloide asociada (FPDMM) es una enfermedad plaquetaria rara, causada por mutaciones en el gen RUNX1 y caracterizada por presentar trombocitopenia, función plaquetaria anormal y un mayor riesgo de desarrollar otros trastornos sanguíneos o cánceres. Proponemos generar un modelo humano de FPDMM con una mutación no reportada en el exón 6 de RUNX1. Generamos una línea hiPSC mediante la reprogramación celular de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una paciente con FPDMM, empleando virus Sendai no integrativos que expresan los factores de reprogramación de Yamanaka. Mediante análisis funcionales y genéticos completamos la caracterización de la nueva línea celular hiPSC. En primer lugar, se confirmó la presencia de la mutación en RUNX1 por secuenciación Sanger. Análisis de polimorfismos (STR) demostraron la identidad genética entre las PBMC de la paciente y la línea celular hiPSC. Mediante RT-PCR se comprobó el silenciamiento de los genes exógenos de reprogramación y la activación de los genes endógenos de pluripotencia. Además, la expresión de marcadores de pluripotencia se demostró por citometría de flujo. La línea hiPSC mostró un cariotipo normal y actividad positiva para fosfatasa alcalina. Finalmente, para comprobar la capacidad de diferenciación a las tres capas germinales del embrión de la nueva línea hiPSC, se realizaron ensayos funcionales de formación de cuerpos embrionarios y formación de teratomas. En ambos casos, se demostraron estructuras específicas de endodermo (epitelio ciliado), mesodermo (cartílago) y ectodermo (rosetas neurales). Además, también detectamos la expresión de marcadores representativos de las tres capas germinales. La generación de esta línea representa una gran herramienta para estudiar la biología de esta enfermedad, y además nos permite aplicar nuevas terapias para el tratamiento de FPDMM, como la corrección fenotípica mediante terapia génica o ensayo de nuevos fármacos. Finalmente, nuestro laboratorio había generado varios modelos celulares del Síndrome de Bernard-Soulier (BSS) deficientes en GP9. Esta enfermedad es un trastorno plaquetario monogénico poco frecuente, causado por la deficiencia congénita del complejo glicoproteico GPIb-IX-V debido a mutaciones en GP1BA, GP1BB o GP9 y caracterizado por macrotrombocitopenia y sangrados severos. Nuestro último objetivo se centró en validar uno de estos modelos de enfermedad y su correspondiente línea hiPSC rescatada por terapia génica lentiviral mediante la expresión del gen silvestre GP9. Realizamos la diferenciación megacariocítica de las líneas hiPSC generadas. Observamos que ambas líneas producen progenitores hematopoyéticos CD34+, progenitores megacariocíticos CD34+CD41a+ y células CD41a+, de forma similar. Durante la evaluación de la diferenciación megacariocítica terminal de estos precursores, confirmamos que las células no rescatadas son incapaces de progresar y generar megacariocitos maduros CD42a+ y CD41a+CD42a+. Sin embargo, y de forma destacada las células rescatadas son capaces de progresar y madurar hasta megacariocitos maduros CD41a+CD42a+. Estos resultados muestran que la terapia génica ha sido eficiente al restaurar la expresión de GPIX en la membrana de los megacariocitos y además puede convertirse en una aproximación terapéutica en un futuro próximo para pacientes con BSS que presentan mutaciones en GP9.