[ca] L'hepatoencefalopatia deguda a mutacions en GFM1, també coneguda com a deficiència combinada de la fosforilació oxidativa de tipus 1 (COXPD1), és una malaltia mitocondrial recessiva causada per mutacions al gen nuclear que codifica el factor d'elongació de la traducció mitocondrial G1 (EFG1). Els pacients solen manifestar una greu encefalopatia lligada sovint a insuficiència hepàtica, d'aparició neonatal i progressió ràpida, que normalment desencadena la mort durant les primeres setmanes o anys de vida. Fins ara, l'estudi de la COXPD1 s'ha dut a terme principalment sobre models in vitro i la manca d'un model animal apropiat ha representat una limitació important per tal d'aprofundir en la fisiopatologia de la malaltia i testar potencials aproximacions terapèutiques. En aquest treball s'han generat dos al·lels mutants per a el gen Gfm1 murí: un al·lel knock-in (KI) amb la mutació antisentit p.R671C, identificada en almenys 10 pacients que han sobreviscut més d'un any, i un al·lel knock-out (KO). Aquests han permès obtenir el model de ratolí homozigot KI (Gfm1R671C/R671C) i l'heterozigot compost KI/KO (Gfm1R671C/-). La mutació KO en homozigosi va resultar letal durant el desenvolupament embrionari, mentre que els ratolins Gfm1R671C/R671C van ser viables i mostraren un creixement normal. La mutació p.R671C va comportar una reducció dràstica de la quantitat de proteïna EFG1 mitocondrial a tots els teixits estudiats, causant als ratolins Gfm1R671C/R671C una reducció de la traducció mitocondrial i de l'activitat del complex IV (CIV) de la cadena respiratòria (RC) en fetge a les 6 setmanes d'edat. L'afectació de la traducció mitocondrial es va mantenir a les 50 setmanes d'edat, però va deixar d'observar-se l'afectació del CIV. El model Gfm1R671C/-, amb supervivència normal almenys fins les 80 setmanes d'edat, va manifestar una reducció d'EFG1 més pronunciada en mitocondris de fetge i cervell en comparació amb els ratolins Gfm1R671C/R671C. En conseqüència, els animals Gfm1R671C/- de 8 i 30 setmanes d'edat van experimentar una disminució significativa de la traducció mitocondrial als dos teixits diana que, al seu torn, va donar lloc a una disfunció clara del sistema OXPHOS: nivells inferiors dels complexos CI i CIV acoblats, amb la reducció subsegüent de les seues activitats enzimàtiques. Malgrat això, als ratolins Gfm1R671C/- no es va detectar cap alteració patològica a nivell hepàtic o neuromuscular associada al fenotip COXPD molecular. D'altra banda, actualment no existeix una cura per a la COPXD1 i la teràpia gènica es situa com a una possible estratègia apropiada per al seu tractament. Al segon bloc de la tesi es va iniciar un estudi preclínic de teràpia gènica utilitzant vectors adenoassociats (rAAV) per introduir una còpia correcta del gen GFM1 humà als ratolins Gfm1R671C/-. Una única injecció intravenosa d'un vector AAV9 amb la seqüència codificant de GFM1 sota el control del promotor de l'alfa-1-antitripsina humana, d'expressió hepàtica, (ssAAV9-hAAT-GFM1) en ratolins Gfm1R671C/- de 6 setmanes d'edat (5E+12 gv/kg), va donar lloc a una recuperació parcial de la quantitat d'EFG1 mitocondrial al fetge a les 4 setmanes del tractament. Addicionalment, va restituir els nivells dels complexos CI i CIV acoblats i de les seues activitats enzimàtiques al teixit diana, demostrant la funcionalitat de l'EFG1 codificada pel gen terapèutic. Per tant, a partir del treball realitzat en aquesta tesi s'ha obtingut el ratolí Gfm1R671C/- amb un clar fenotip molecular disfuncional que el situa com a un bon model animal de la COXPD1. A més a més, es mostra com l'ús de rAAV per proveir de la versió correcta del gen GFM1 aconsegueix recuperar la funció d'EFG1 de forma eficaç, apuntant a la teràpia gènica com una estratègia factible i prometedora per al tractament de la COXPD1.

[es] La hepatoncefalopatía debida a mutaciones en GFM1, también conocida como deficiencia combinada de la fosforilación oxidativa de tipo I (COXPD1), es una enfermedad mitocondrial recesiva causada por mutaciones en el gen nuclear que codifica el factor de elongación de la traducción mitocondrial G1 (EFG1). Los pacientes suelen manifestar una encefalopatía grave, combinada a menudo con insuficiencia hepática, de aparición neonatal y progresión rápida, que normalmente desencadena la muerte durante las primeras semanas o años de vida. El estudio de la COXPD1 se ha llevado a cabo principalmente sobre modelos in vitro y la falta de un modelo animal apropiado ha representado hasta ahora una limitación importante para poder profundizar en la fisiopatología de la enfermedad y testar potenciales aproximaciones terapéuticas. En este trabajo se han generado dos alelos mutantes para el gen Gfm1 murino: un alelo knock-in (KI) con la mutación antisentido p.R671C, identificada al menos en 10 pacientes que han sobrevivido más de un año, y un alelo knock-out (KO). Estos han permitido obtener el modelo de ratón homocigoto KI (Gfm1R671C/R671C) y el heterocigoto compuesto KI/KO (Gfm1R671C/-). La mutación KO en homocigosis resultó letal durante el desarrollo embrionario, mientras que los ratones Gfm1R671C/R671C fueron viables y mostraron un crecimiento normal. La mutación p.R671C dio lugar a una reducción drástica de la proteína EFG1 mitocondrial en todos los tejidos estudiados, causando en los ratones Gfm1R671C/R671C una reducción de la traducción mitocondrial y de la actividad del complejo IV (CIV) de la cadena respiratoria (RC) en hígado a las 6 semanas de edad. La afectación de la traducción mitocondrial se mantuvo a las 50 semanas de edad, pero dejó de observar-se la afectación del CIV. El modelo Gfm1R671C/-, con supervivencia normal al menos hasta las 80 semanas de edad, manifestó una reducción de EFG1 más pronunciada en mitocondrias de hígado y cerebro en comparación con los ratones Gfm1R671C/R671C. En consecuencia, los animales Gfm1R671C/- de 8 y 30 semanas de edad experimentaron una disminución significativa de la traducción mitocondrial en los tejidos diana, que, a su vez, dio lugar a una disfunción clara del sistema OXPHOS: niveles inferiores de los complejos I y IV ensamblados, junto con la reducción consiguiente de sus actividades enzimáticas. A pesar de esto, en los ratones Gfm1R671C/- no se detectó ninguna alteración patológica a nivel hepático o neuromuscular asociada al fenotipo COXPD molecular. Por otra parte, actualmente no existe una cura para la COXPD1 y la terapia génica se sitúa como una posible estrategia apropiada para su tratamiento. Por ello, se inició un estudio preclínico de terapia génica utilizando vectores adenoasociados (rAAV) para introducir una copia correcta del gen GFM1 humano en los ratones Gfm1R671C/-. Una única inyección intravenosa de un AAV9 con la secuencia de GFM1 bajo el control del promotor de la alfa-1-antitripsina humana, de expresión hepática, (ssAAV9-hAAT-GFM1) en ratones Gfm1R671C/- de 6 semanas de edad (5E+12 gv/kg), dio lugar a una recuperación parcial de la cantidad de EFG1 mitocondrial en el hígado a las 4 semanas del tratamiento. Asimismo, se restituyeron los niveles de los complejos I y IV ensamblados y de sus actividades enzimáticas en el tejido diana, demostrando la funcionalidad de la proteína EFG1 codificada por el gen terapéutico. Así pues, a partir de este trabajo se ha obtenido el ratón Gfm1R671C/- con un claro fenotipo molecular disfuncional que lo sitúa como un buen modelo animal de la COXPD1. Además, se muestra como el uso de rAAV para proveer de la versión correcta del gen GFM1 consigue recuperar la función de EFG1 de forma eficaz, apuntando a la terapia génica como una estrategia factible y prometedora para el tratamiento de la COXPD1.