[en] Sepsis is a serious global health problem. In addition to its high incidence, this syndrome presents a high mortality being responsible for huge health expenditure. The pathophysiology of sepsis is very complex and it is not well-understood yet. However, it is widely accepted that the initial phase of sepsis is characterized by a hyperinflammatory response while the late phase is characterized by immunosuppression and immune anergy, increasing the risk of secondary infections. Sepsis is defined as a life-threating organ dysfunction caused by a dysregulated host response to infection. The granule exocytosis pathway is one of the most important host defense mechanism against infected or transformed cells. It is specifically used by effector cytotoxic cells and consists of the liberation of cytotoxic granules contents after the formation of an immunological synapse between effector and target cell, where the protein perforin will form pores in the target cell membrane allowing the entrance of granzymes (gzms) in the cytosol of the target cell. Gzms are a family of serine proteases classified according to their cleavage specificity. Recent evidence suggests that GzmB is the one with the greatest cytotoxic capacity, while the cytotoxicity of others such as GzmA and GzmK has not been completely clarified. It has been suggested that GzmA could act as a proinflammatory mediator and could play an important role in the pathogenesis of sepsis. Furthermore, recent in vitro findings suggest that GzmK may also act as a proinflammatory mediator. However, its role in sepsis is unknown. We decided to analyze the role of GzmA in abdominal sepsis using a model of CLP induced sepsis and an E. coli induced sepsis model. In the CLP model, our results showed that GzmA deficient mice are protected from sepsis. In addition, WT mice treated with an extracellular GzmA inhibitor increased their survival, which was correlated with a reduction in the expression of proinflammatory cytokines. It was also demonstrated that the absence of GzmA did not influence the bacterial load in blood and spleen and GzmA did not affect bacterial replication in macrophages in vitro, suggesting that GzmA has no role in the bacterial control. Furthermore, the analysis of GzmA in lymphoid cells following CLP showed that it was mainly expressed in NK cells. We also analyzed the role of GzmK in an E. coli induced sepsis model due to the similarities of this protease with GzmA. Our results suggested that, although GzmA and GzmK are not involved in the control of the infection, mice deficient in GzmA or GzmK showed a lower sepsis score in comparison with WT mice suggesting the role of both proteases in sepsis pathophysiology. However, only GzmA deficient mice exhibit increased survival, which correlated with reduced expression of proinflammatory cytokines. Besides, the inhibition of GzmA during bacterial sepsis using serpinb6b improved survival and reduced the expression of IL-6 confirming that the inhibition of GzmA might be sufficient to improve survival irrespectively of the presence of other inflammatory granzymes, like GzmK. Mechanistically, we found that active extracellular GzmA induces the production of IL-6 in macrophages by a TLR4 and MyD88 pathway. Finally, we analyzed the role of Gzms in a viral model of sepsis using Influenza A virus. Our results showed that the absence of GzmB and GzmK reduced survival suggesting the importance of both proteases in the control of the viral infection. While the absence of GzmA increased survival in influenza viral sepsis suggesting that this protease play an important role in influenza viral sepsis pathophysiology. Furthermore, we studied the role of Gzms after an influenza A infection to understand their importance in a secondary infection by S. pneumoniae. Our results showed that GzmA and GzmB deficient mice are protected against a secondary infection suggesting that both proteases play an important role in the immunosuppression state of sepsis.

[es] La sepsis es un grave problema de salud mundial. Además de una alta incidencia, este síndrome tiene una elevada mortalidad y es responsable de un enorme gasto sanitario. La fisiopatología de la sepsis es muy compleja y aún no se comprende bien. Sin embargo, es ampliamente aceptado que la fase inicial de la sepsis se caracteriza por una respuesta hiperinflamatoria mientras que la fase tardía se caracteriza por una fase de inmunosupresión y anergia inmune, aumentando el riesgo de infecciones secundarias. La sepsis se define como una disfunción orgánica potencialmente mortal causada por una respuesta desregulada del huésped a una infección bacteriana, viral o fúngica. La vía de exocitosis granular es uno de los mecanismos de defensa más importantes del sistema inmune frente a células infectadas o transformadas. Es utilizado específicamente por células citotóxicas efectoras y consiste en la liberación de gránulos citotóxicos que, luego de la sinapsis inmunológica, liberan perforina permitiendo la entrada de granzimas en el citosol de la célula diana. La perforina es una glicoproteína cuya función es permitir la entrada de granzimas en la célula diana provocando la muerte celular o inflamación. Las granzimas son una familia de serin-proteasas clasificadas según su especificidad de corte. Se ha observado que la GzmB tiene mayor capacidad citotóxica, mientras que la citotoxicidad de otras como la GzmA y la GzmK no está clara. La GzmA podría actuar como mediador proinflamatorio y jugar un papel importante en la patogenia de la sepsis. Además, hallazgos in vitro recientes sugieren que la GzmK puede actuar como un mediador proinflamatorio. Sin embargo, se desconoce su papel en la sepsis. En este estudio analizamos el papel de la GzmA en la sepsis abdominal utilizando un modelo de sepsis inducida por CLP y un modelo de sepsis inducida por E. coli. En el modelo de CLP, nuestros resultados mostraron que los ratones deficientes en GzmA están protegidos contra la sepsis. Además, los ratones WT tratados con un inhibidor extracelular de GzmA aumentaron su supervivencia, lo que se correlacionó con una reducción en la expresión de citoquinas proinflamatorias. También se demostró que la ausencia de GzmA no influyó en la carga bacteriana en sangre y bazo y la GzmA no afectó la replicación bacteriana en macrófagos in vitro, lo que sugiere que la GzmA no tiene ningún papel en el control bacteriano. Además, el análisis de GzmA en células linfoides después del CLP mostró que se expresaba principalmente en células NK. También analizamos el papel de GzmK en un modelo de sepsis inducida por E. coli debido a las similitudes de esta proteasa con la GzmA. Nuestros resultados sugirieron que, aunque la GzmA y la GzmK no están involucradas en el control de la infección, los ratones deficientes en GzmA o GzmK mostraron una puntuación de sepsis más baja en comparación con los ratones WT, lo que sugiere el papel de ambas proteasas en la fisiopatología de la sepsis. Sin embargo, solo los ratones deficientes en GzmA exhiben una mayor supervivencia, lo que se correlaciona con una expresión reducida de citoquinas proinflamatorias. Además, la inhibición de GzmA durante la sepsis bacteriana utilizando serpinb6b mejoró la supervivencia y redujo la expresión de IL-6, lo que confirma que la inhibición de GzmA podría ser suficiente para mejorar la supervivencia independientemente de la presencia de otras granzimas inflamatorias, como GzmK. Respecto al mecanismo molecular, encontramos que la GzmA extracelular activa induce la producción de IL-6 en macrófagos por una vía TLR4 y MyD88. Finalmente, analizamos el papel de las Gzms en un modelo viral de sepsis utilizando el virus de Influenza A. Nuestros resultados mostraron que la ausencia de GzmB y GzmK redujo la supervivencia, lo que sugiere la importancia de ambas proteasas en el control de la infección viral. Mientras que la ausencia de GzmA aumentó la supervivencia en la sepsis viral por influenza, lo que sugiere que esta proteasa juega un papel importante en la fisiopatología de la sepsis viral por influenza. Además, estudiamos el papel de las Gzms después de la infección por influenza para entender su importancia en una infección secundaria por la bacteria S. pneumoniae. Nuestros resultados mostraron que los ratones deficientes en GzmA y GzmB están protegidos contra una infección secundaria, lo que sugiere que ambas proteasas juegan un papel importante en el estado de inmunosupresión de la sepsis.