[en] In this work we have addressed different strategies to advance in the knowledge of the function and regulation of the SPI1 gene, in addition to those of some of the genes that have been found to be involved in it. For this purpose, the development of two genetic screening strategies has been fundamental. The results obtained show that SPI1 induction under nutrient-limited conditions is regulated by the transcriptional factors Sok2p, Phd1p and Msn2/4p. RNAase Pop2p and protein kinase Yak1p would also be necessary for the correct expression of this gene. In addition, through genetic screening studies, we know that its expression is regulated by the concentration of tryptophan and the presence of proteins involved in its synthesis and transport (Tat1/2p and Trp1p), and the role of the YCP4, MSS4 and HOR2 genes is also relevant. A relationship between the cell integrity pathway and gene expression was also established. The role of RSP5, BUL1 and BUL2 in the regulation of SPI1 has been characterized. It was observed that mutants in these genes, under certain adverse conditions, show higher sensitivity than the corresponding wild-type strains. It was also detected which mutants in RSP5 or in BUL1/BUL2 showed lower expression of SPI1. Through global studies, the role of RSP5 in the regulation of gene expression under conditions of nutrient limitation was studied, observing its involvement in the transcriptional regulation of genes related to translation and in cell wall genes (with higher levels in the mutant), as well as in stress response genes and amino acid metabolism and transport genes (which present lower levels in the mutant). In addition, several proteins of the ubiquitination machinery are involved in the regulation of SPI1 under nutrient-limited conditions. Ubc1p, Ubp6p and Ubp14p are required for gene activation, whereas Ubc4p, Ubc6p and Ubp6p have a negative role in its regulation. On the other hand, Rsp5p is involved in the formation of RNA processing bodies, since its hpg1-1 mutant is defective in the formation of these structures. It was also found during this work that the YCP4 gene, another of those identified in our genetic screens, as well as its homolog RFS1, are involved in the regulation of the SPI1 gene. In addition, mutants in these genes were found to be sensitive to certain stress conditions. Global studies carried out with the ycp4drfs1d mutant show that YCP4 and RFS1 are involved in the positive transcriptional control of genes involved in amino acid metabolism, sexual reproduction, cytokinesis and transmembrane transport. On the other hand, they negatively regulate energy and mitochondrial metabolism, translation and ribosomal function, as well as fatty acid biosynthesis. Finally, the knowledge on SPI1 regulation has been applied for biotechnological use. The substitution of the promoter of one of the copies of the gene encoding the stress response transcriptional factor Msn2p in a wine strain for industrial use, results in a genetically modified strain (T73S) with certain desirable characteristics in this type of strains. Thus, T73S is resistant to certain stress conditions, grows better in media with non-fermentable carbon sources, and shows higher expression levels of MSN2 and some stress genes under various stress conditions and during winemaking. In addition, it shows higher viability or sugar consumption rate at certain growth stages, partially coinciding with the higher expression of stress response genes.

[es] En este trabajo se han abordado diferentes estrategias para avanzar en el conocimiento de la función y la regulación del gen SPI1, además de las de algunos de los genes que se han encontrado como implicados en la misma. Para ello ha sido fundamental el desarrollo de dos estrategias de rastreo genético. Los resultados obtenidos muestran que la inducción de SPI1 en condiciones de limitación de nutrientes está regulada por los factores transcripcionales Sok2p, Phd1p y Msn2/4p. También serían necesarios para la expresión correcta de dicho gen la RNAsa Pop2p y la proteína quinasa Yak1p. Además, mediante los estudios de rastreo genético, sabemos que su expresión está regulada por la concentración de triptófano y la presencia de proteínas implicadas en la síntesis y el transporte del mismo (Tat1/2p y Trp1p), además de ser relevante el papel de los genes YCP4, MSS4 y HOR2. También se estableció una relación entre la ruta de integridad celular y la expresión del gen. Se ha caracterizado el papel de RSP5, BUL1 y BUL2 en la regulación de SPI1. Se observó que los mutantes en estos genes, en determinadas condiciones adversas, presentan mayor sensibilidad que las correspondientes cepas silvestres. Se detectó además qué mutantes en RSP5 o en BUL1/BUL2, presentaban menor expresión de SPI1. Mediante estudios globales, se estudió el papel de RSP5 en la regulación de la expresión génica en condiciones de limitación de nutrientes, observándose su implicación en la regulación transcripcional de genes relacionados con la traducción y en genes de pared celular (con mayores niveles en el mutante), así como de genes de respuesta a estrés y del metabolismo y transporte de aminoácidos (que presentan menores niveles en el mutante). Además, varias proteínas de la maquinaria de ubiquitinación están implicadas en la regulación de SPI1 en condiciones de limitación de nutrientes. Ubc1p, Ubp6p y Ubp14p son necesarias para la activación del gen, mientras Ubc4p, Ubc6p y Ubp6p tienen un papel negativo en su regulación. Por otro lado, Rsp5p está implicada en la formación de cuerpos de procesado de RNA, ya que su mutante hpg1-1 es defectivo en la formación de estas estructuras. También se encontró durante este trabajo que el gen YCP4, otro de los identificados en nuestros rastreos genéticos, así como su homólogo RFS1, están implicados en la regulación del gen SPI1. Además, se observó que mutantes en estos genes eran sensibles a determinadas condiciones de estrés. Los estudios globales llevados a cabo con el mutante ycp4drfs1d muestran que YCP4 y RFS1 están implicadas en el control transcripcional positivo de los genes que participan en el metabolismo de aminoácidos, reproducción sexual, citocinesis y transporte transmembrana. Por otro lado, regulan negativamente el metabolismo energético y mitocondrial, la traducción y la función ribosomal, así como la biosíntesis de ácidos grasos. Finalmente, se han aplicado los conocimientos sobre regulación de SPI1 para su uso biotecnológico. La sustitución del promotor de una de las copias del gen que codifica el factor transcripcional de respuesta a estrés Msn2p en una cepa vínica de uso industrial, da como resultado una cepa genéticamente modificada (T73S) con determinadas características deseables en este tipo de cepas. Así, T73S es resistente a determinadas condiciones de estrés, crece mejor en medios con fuentes de carbono no fermentables, y presenta mayores niveles de expresión de MSN2 y de algunos genes con estrés en varias condiciones de estrés y durante la vinificación. Además, presenta mayor viabilidad o velocidad de consumo de azúcares en determinadas fases del crecimiento, coincidiendo parcialmente con la mayor expresión de genes de respuesta a estrés.