[en] Diabetes is a complex metabolic disease for which there is currently no cure and is associated with severe secondary complications, caused largely by poor glycaemic control. Achievement of normoglycemia with exogenous insulin treatment requires the use of high doses of hormone, which increases the risk of life-threatening hypoglycemic episodes. We previously demonstrated that a single intramuscular administration of two AAV serotype 1 (AAV1) vectors expressing insulin and glucokinase produce 4 years of disease correction in diabetic dogs. The first part of this study focused on the evaluation of efficacy and safety after 8 years of treatment. It is demonstrated how these dogs maintain glycemic control without the need of exogenous insulin for a period of up to 8 years after a single administration of the therapeutic vectors. Long term metabolic normalization was demonstrated by the multi-annual quantification of serum levels of glycosylated proteins (fructosamine), triglycerides and cholesterol and the correct response of the treated animals to the oral glucose tolerance test. The persistence of the viral genomes and the expression and activity of the therapeutic transgenes were confirmed in multiple samples of the treated muscles. In addition, no signs of pathology were observed in the histopathological analysis of the same muscles. In the second part of the study, dual AAV1 vectors were generated that encoded together insulin and glucokinase. The generation of a dual vector will allow to increase the therapeutic efficacy since all the genetically modified cells will express the two components of the "glucose sensor", while a reduced viral dose with minimize potential toxicity, and simplify both the production and regulatory processes required for future clinical application. The design of the modular system allowed for the generation and evaluation of conformations and combinations of coding and regulatory sequences. These were evaluated in vitro to demonstrate that the dual vectors with the two units in opposite conformation mediated a greater expression of both transgenes. The data in the studies performed in healthy and diabetic mice administered with the dual vectors confirmed that efficacy was superior to that obtained in the mice treated with the individual vectors. Therefore, the data obtained in both parts of this work demonstrate the long-term functionality and safety of intramuscular administration of AAV1 vectors encoding insulin and glucokinase to counteract diabetes while providing the basis for future clinical translation of a this type of gene therapy strategy, using a single dual AAV1 vector expressing both genes.

[es] La diabetes tipo 1 es una enfermedad metabólica compleja para la cual actualmente no hay cura y está asociada con complicaciones secundarias graves, causadas en gran parte por un control glucémico deficiente. El logro de la normoglucemia con el tratamiento exógeno con insulina requiere el uso de altas dosis de la hormona, lo que aumenta el riesgo de episodios hipoglucémicos potencialmente mortales. En nuestro laboratorio se ha demostrado previamente que una única administración intramuscular de dos vectores AAV de serotipo 1 (AAV1) que expresaban insulina y glucoquinasa produjo corrección de la enfermedad en perros diabéticos durante 4 años. La primera parte de este trabajo se centró en la evaluación de la eficacia y seguridad tras 8 años de tratamiento. Los perros tratados contrarrestaron la hiperglucemia sin necesidad de insulina exógena durante un período de al menos 8 años después de una única administración de los vectores terapéuticos. La normalización metabólica sostenida se demostró mediante la cuantificación plurianual de los niveles séricos de proteínas glucosiladas (fructosamina), triglicéridos y colesterol y la buena respuesta de los animales tratados a la prueba oral de tolerancia a la glucosa. La persistencia de los genomas virales así como la expresión y actividad de los transgenes terapéuticos se atestiguaron en múltiples muestras de los músculos tratados. Además, no se observaron signos de patología en el análisis histopatológico de los mismos. En la segunda parte, se generaron vectores AAV duales que codificaban conjuntamente insulina y glucoquinasa. La generación de un vector dual, permitirá incrementar la eficacia terapéutica de la aproximación ya que todas las células modificadas genéticamente expresarán los dos componentes del "sensor de glucosa". Asimismo, permite disminuir la dosis viral lo que, por un lado, minimiza la potencial toxicidad, y por otro, facilita los procesos de producción y regulatorios requeridos para una futura aplicación clínica. Los vectores duales mostraron mayor eficacia que la combinación de sus respectivos controles individuales. De entre los diferentes vectores duales con diversas conformaciones y combinaciones de secuencias codificantes y reguladoras generados, el vector con las dos unidades transcripcionales en conformación opuesta medió mayor expresión de los transgenes terapéuticos. Además, entre los vectores generados, el vector "L" (AAV1-miniCMV-hIns-RSV-hGck) fue el que mostró una expresión in vitro más alta tanto de insulina como de glucoquinasa. Los datos en los estudios realizados en ratones diabéticos tratados con el vector dual confirmaron una eficacia superior a la obtenida en los ratones tratados con los vectores individuales. Por tanto, los datos obtenidos en esta tesis doctoral demuestran la eficacia y seguridad a largo plazo de la administración intramuscular de los vectores AAV que codifican para insulina y glucoquinasa para contrarrestar la diabetes y sientan las bases para la futura translación a la clínica de esta estrategia terapéutica.