[en] The presence of autoantibodies is a serological hallmark of SSc, as it has been reported that 95% of patients present anti-nuclear autoantibodies (ANAs) by indirect immunofluorescence (IIF). However, in our cohort of SSc patients, a significant group presenting heterogeneous clinical manifestations, no specific SSc-related autoantibodies were detected by commercial assays. More specifically, from 307 SSc patients consulting during the 2013 to 2020 period in Vall d'Hebron University Hospital, 68 (22.1%) were negative for all tested SSc-specific autoantibodies. Nevertheless, 32 (47.1%) were ANA positive by IIF, indicating that this group of patients probably presented ANAs that were not identified by commercial assays based on detecting specific autoantibodies. Therefore, the main objective of this thesis was to develop novel autoantibody detection strategies to be able to identify specific autoantibodies in the patients that tested negative by commercial assays. Furthermore, this study also aimed to assess the association of autoantibodies identified by these novel strategies with distinct clinical phenotypes. Two novel approaches based on immunoprecipitation were developed together with an ELISA. After implementing these new approaches, only 7.2% (22 patients) of the entire cohort remained negative for specific autoantibodies. Therefore, 67.6% of the initially negative patients were found to be positive for at least one autoantibody when tested with these new approaches. Moreover, 87.5% of patients who were ANA positive by IIF were detected as positive using the novel methods. On the other hand, 50% of the 36 patients who were ANA negative by IIF were found to have specific autoantibodies using the new approaches. Specifically, anti-U11/U12 snRNP and anti-IFI16 autoantibodies were the most commonly detected in this group, with 16.7% and 16.3% of patients testing positive for these antibodies, respectively. This indicates that autoantibodies targeting antigens not highly expressed in HEp-2 cells may go undetected by IIF, which is usually used as a first screening step for SSc-related autoantibodies. Consequently, our data indicates that these autoantibodies could be missed when following standard diagnostic protocols. The novel detection methods also revealed several previously unreported autoantibodies in SSc patients. These included antibodies against C/D box snoRNPs, 7SK snRNP, mitochondrial tRNA synthetases, cytoplasmic vault complexes, NVL and RPA. Due to the small number of patients with most of these new autoantibodies, statistically significant associations between them and specific clinical phenotypes could not be established. However, we were able to establish that patients presenting reactivity against C/D box snoRNPs distinct to U3, U8 or U13 snoRNP, do indeed present mild clinical manifestations, similar to what is observed in anti-centromere positive patients, and ssSSc subset. On the other hand, we also found that anti-NVL autoantibodies were associated with a new clinical phenotype of SSc defined by recalcitrant calcinosis, synchronous cancer and limited cutaneous form of the disease. Furthermore, regarding anti-IFI16 autoantibodies, we confirmed that they are highly prevalent autoantibodies in lcSSc, as previously reported. More importantly, we found that the presence of this autoantibody is associated with PAH and a poorer overall prognosis. In conclusion, by the development of the new strategies for autoantibody detection in SSc, we have detected three autoantibodies, anti-C/D box snoRNPs, anti-NVL, and anti-IFI16, associated with the ssSSc and lcSSc subset but with very distinct clinical manifestations. This further reinforces the hypothesis that detecting autoantibodies enables a better subclassification of SSc patients than the traditional approach, which relies primarily on assessing the extent of skin involvement. Consequently, our data demonstrates that detecting these autoantibodies could be of great utility in establishing a more targeted therapeutic follow-up in SSc patients.

[es] La presencia de autoanticuerpos es un biomarcador característico de la esclerosis sistémica (SSc), ya que el 95% de los pacientes presentan autoanticuerpos antinucleares (ANA) mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI). Sin embargo, en nuestra cohorte de pacientes con SSc, un grupo considerable con manifestaciones clínicas heterogéneas no presentaba autoanticuerpos específicos según los ensayos comerciales. En concreto, de 307 pacientes visitados entre 2013 y 2020 en el Hospital Universitario Vall d'Hebron, 68 (22,1%) fueron negativos para todos los autoanticuerpos específicos de SSc evaluados. No obstante, el 47,1% de estos pacientes resultaron ANA positivos por IFI, lo que sugiere que presentaban ANA no detectados por las pruebas comerciales. Por ello, el objetivo principal de esta tesis fue desarrollar nuevas estrategias de detección de autoanticuerpos y evaluar su asociación con fenotipos clínicos. Se desarrollaron dos métodos novedosos basados en la inmunoprecipitación junto con un ELISA. Tras implementar estos nuevos métodos, solo el 7,2% (22 pacientes) de toda la cohorte permaneció negativo para los autoanticuerpos específicos. Por lo tanto, se encontró que el 67,6% de los pacientes que inicialmente eran negativos presentaban al menos un autoanticuerpo cuando se evaluaban con estos nuevos enfoques. Además, el 87,5% de los pacientes que fueron ANA positivos por IFI fueron detectados como positivos utilizando los nuevos métodos. Por otro lado, el 50% de los 36 pacientes que eran ANA negativos por IFI presentaban autoanticuerpos específicos utilizando los nuevos métodos. En concreto, los autoanticuerpos anti-U11/U12 snRNP y anti-IFI16 fueron los más comúnmente detectados en este grupo, con el 16,7% y el 16,3% de los pacientes resultando positivos para estos anticuerpos, respectivamente. Esto indica que los autoanticuerpos dirigidos contra antígenos que no se expresan de manera abundante en las células HEp-2 pueden pasar desapercibidos mediante IFI, que se utiliza habitualmente como primer paso de cribado para los autoanticuerpos relacionados con la SSc. En consecuencia, nuestros datos indican que estos autoanticuerpos podrían no detectarse al seguir los protocolos diagnósticos estándar. Los nuevos métodos de detección también revelaron varios autoanticuerpos previamente no informados en pacientes con SSc. Estos incluían anticuerpos contra C/D box snoRNPs, snRNP 7SK, sintetasas de tRNA mitocondriales, complejos de vault citoplasmáticos, NVL y RPA. Debido al pequeño número de pacientes con la mayoría de estos nuevos autoanticuerpos, no se pudieron establecer asociaciones estadísticamente significativas entre ellos y fenotipos clínicos específicos. Sin embargo, pudimos establecer que los pacientes que presentaban reactividad contra C/D box snoRNPs, distintos de los U3, U8 o U13 snoRNP, presentan manifestaciones clínicas leves, similar a lo observado en pacientes positivos para anticuerpos anti-centrómero y en el subtipo ssSSc. Por otro lado, también encontramos que los autoanticuerpos anti-NVL se asocian con un nuevo fenotipo clínico de SSc definido por calcinosis recalcitrante, cáncer sincrónico y la forma cutánea limitada de la enfermedad. Además, en cuanto a los autoanticuerpos anti-IFI16, confirmamos que son altamente prevalentes en lcSSc, como se ha informado anteriormente. Más importante aún, encontramos que la presencia de este autoanticuerpo se asocia con la hipertensión arterial pulmonar y un peor pronóstico general. En conclusión, mediante el desarrollo de nuevas estrategias para la detección de autoanticuerpos en la SSc, hemos detectado tres autoanticuerpos, anti-C/D box snoRNPs, anti-NVL y anti-IFI16, asociados con los subtipos ssSSc y lcSSc, pero con manifestaciones clínicas muy distintas. Esto refuerza aún más la hipótesis de que la detección de autoanticuerpos permite una mejor subclasificación de los pacientes con SSc que el enfoque tradicional, que se basa principalmente en evaluar la extensión de la afectación cutánea. En consecuencia, nuestros datos demuestran que la detección de estos autoanticuerpos podría ser de gran utilidad para establecer un seguimiento terapéutico más dirigido en los pacientes con SSc.