[en] In this thesis, unnatural MUC1 glycopeptides were developed according to a structure-guided design by utilizing already reported data to enhance their affinity in vitro toward well-characterized antibodies by implementing synthetic Tn surrogates at key positions in the amino acid sequence. The main objectives of this thesis are to exploit the biological properties of MUC1 to develop novel cancer vaccine candidates and cancer diagnostic tools. In this regard, although MUC1 glycopeptides hold great promise as potential cancer vaccine candidates, MUC1-based vaccines usually result in a weak immune response since the antigen is a self-antigen. To tackle this problem, we have carefully engineered synthetic antigens with precise chemical modifications. To be effective and stimulate a robust immune response in mice, artificial antigens must mimic the structure of the natural antigen in solution and have an equivalent or higher binding affinity towards anti-MUC1 antibodies. As a proof of concept, we have developed a glycopeptide that contains a noncanonical amino acid (2S,3R)- 3-hydroxynorvaline. The unnatural antigen fulfills these two properties and effectively mimics the threonine-derived antigen. Despite an enthalpy-entropy balance, this synthetic glycopeptide had a slightly higher binding affinity than its natural counterpart. When conjugated with gold nanoparticles, the vaccine candidate stimulated the formation of specific anti-MUC1 IgG antibodies in mice and showed efficacy comparable to that of the natural derivative. The antibodies also exhibited cross-reactivity selectively targeting human breast cancer cells. These results underscore the promise of structure-based rational design to advance cancer vaccine development. Furthermore, we developed a novel vaccine candidate utilizing an unnatural MUC1 glycopeptide and a protein carrier. This glycopeptide contains a (4S)-4-fluoro-L-proline and an α-S-GalNAc-Thr at key positions in the amino acid sequence and is specifically conjugated to the immunogenic protein carrier CRM197. The conjugation method involves the selective reduction and re-bridging of one of the disulfide bridges in CRM197, allowing the attachment of a single copy of the non-natural MUC1 glycopeptide. This strategy provides a chemically defined and homogeneous vaccine while maintaining the structural integrity of the carrier protein as well as its immunogenicity. The resulting vaccine elicits a robust Th1-like immune response in mice and generates antibodies capable of recognizing human cancer cells expressing tumor-associated MUC1 on their surface. When tested in mouse models of colon adenocarcinoma and pancreatic cancer, the vaccine is effective both prophylactically and therapeutically, significantly delaying tumor growth. In therapeutic applications, improved outcomes are observed when the vaccine was combined with an anti-PD1 checkpoint inhibitor. In parallel, we also have attempted to develop diagnostic assays based on unnatural MUC1 glycopeptides. For that reason, we modified the acetamide of the GalNAc moiety in unnatural Tn surrogates to enhance their binding affinity to the 5E5 antibody using a structure-guided design These Tn mimics were placed in short peptides showcasing the 5E5 epitope and were tested in terms of binding affinity against the respective antibody, exhibiting showing significantly enhanced binding affinity. Then, the best peptide candidates were modified accordingly and were implemented in two state-of-the-art diagnostic assays for detecting cancer. Even though the experiments are ongoing, and only limited data is available, the first results seem promising.

[es] En esta tesis se han desarrollado glicopéptidos no naturales de MUC1 utilizando un diseño racional basado en estructura. Este trabajo se ha apoyado en datos previamente reportados con el fin de mejorar la afinidad de estos derivados in vitro con anticuerpos bien estudiados, incorporando sustitutos sintéticos de Tn en posiciones clave de la secuencia de aminoácidos. El objetivo principal de esta tesis consiste en aprovechar las propiedades biológicas de MUC1 para desarrollar nuevos candidatos a vacunas contra el cáncer, así como herramientas de diagnóstico temprano de tumores. En este sentido, aunque los glicopéptidos de MUC1 tienen un gran potencial como vacunas contra el cáncer, las vacunas basadas en MUC1 generalmente generan una respuesta inmune débil en ratones, ya que se trata de un auto-antígeno. Para abordar este problema, hemos diseñado antígenos sintéticos con modificaciones químicas sutiles y precisas. Para ser efectivos y estimular una respuesta inmune robusta en ratones, los antígenos artificiales deben imitar la estructura del antígeno natural en disolución y poseer una afinidad equivalente o superior con anticuerpos anti-MUC1. Como prueba de concepto, hemos desarrollado un glicopéptido que contiene un aminoácido no canónico (2S,3R)-3-hidroxinorvalina. Este antígeno no natural cumple con ambas propiedades y mimetiza, por tanto, eficazmente el antígeno derivado de la treonina. Este glicopéptido sintético mostró una afinidad ligeramente superior a su análogo natural. Además, cuando se conjugó con nanopartículas de oro, la potencial vacuna estimuló la formación de anticuerpos IgG específicos contra MUC1 en ratones y mostró una eficacia comparable a la del derivado natural. Los anticuerpos también demostraron reactividad cruzada, dirigiéndose selectivamente a células humanas de cáncer de mama. Estos resultados destacan el potencial del diseño racional basado en estructura para avanzar en el desarrollo de vacunas contra el cáncer. Además, desarrollamos un nuevo candidato a vacuna utilizando un glicopéptido no natural de MUC1 y una proteína imunogénica. Este glicopéptido contiene (4S)-4-fluoro-L-prolina y α-S-GalNAc-Thr en posiciones clave de la secuencia y está unido de forma específica a la proteína CRM197. El método de conjugación implica la reducción selectiva y el reensamblaje de uno de los puentes disulfuro en la proteína, permitiendo la unión de una sola copia del glicopéptido no natural de MUC1. Esta estrategia proporciona una vacuna química y estructuralmente definida, manteniendo la integridad estructural e inmunogenicidad de la CRM197. La vacuna resultante genera una respuesta inmune robusta de tipo Th1 en ratones y produce anticuerpos capaces de reconocer células cancerígenas humanas que expresan MUC1 asociado a tumores en su superficie. En modelos murinos de adenocarcinoma de colon y cáncer de páncreas, la vacuna ha demostrado ser eficaz tanto en aplicaciones profilácticas como terapéuticas, retrasando significativamente el crecimiento tumoral en ambos escenarios. En aplicaciones terapéuticas, se observaron mejores resultados cuando la vacuna se combinó con un inhibidor de punto de control anti-PD1. Paralelamente, hemos intentado desarrollar ensayos diagnósticos basados en glicopéptidos no naturales de MUC1. En este sentido, hemos modificado el grupo N-acetilo del GalNAc para desarrollar miméticos de Tn con el fin de mejorar la unión al anticuerpo 5E5. Estos derivados de Tn se integraron en péptidos cortos que contienen el epítopo 5E5, mostrando una afinidad significativamente mejorada. Posteriormente, los mejores candidatos se han implementado en dos ensayos diagnósticos de última generación para la detección de cáncer. Si bien los experimentos aún están en curso y los datos disponibles son limitados, los primeros resultados parecen bastante prometedores.