[ca] La resistència a antibiòtics està considerada una de les principals amenaces a la salut pública del segle XXI per la OMS. A causa del seu consum excessiu i incorrecte, els bacteris han desenvolupat mecanismes per fer-les front y així, ser capaços de sobreviure a la seva presència. Quan un bacteri desenvolupa el gen que li dota de resistència, disposa de diversos mecanismes amb el que pot cedir aquesta resistència a bacteris veïns. Aquest procés és conegut com transferència horitzontal de gens, i és la principal causa de la propagació dels gens de resistència a antibiòtics. Podem distingir entre 3 subtipus, sent la conjugació la més comú. La conjugació és la transferència de material genètic des d'un bacteri donant a un altra receptor i requereix contacte directe entre cèl·lules. La seva característica principal és la presència d'un plasmidi conjugatiu. En aquest treball, s'ha estudiat el plasmidi conjugatiu pLS20, del bacteri Gram positiu Bacillus subtilis. És una elecció d'estudi interessant donant que B. subitlis pertany al filo Firmicutes, sent aquest el filo predominant al intestí humà. El intestí humà funciona com un reservori genètic de resistència a antibiòtics. A més, pLS20 té interès biotecnològic degut a la seva existència en B. sutiblis natto, el quin és important en producció alimentària. Entendre com es regula la conjugació i reunir informació sobre les proteïnes que participen al procés conjugatiu és molt important per poder acabar amb la propagació de la resistència a antibiòtics. Per tant, aquesta tesi està centrada en l'estudi estructural i molecular de diverses proteïnes de pLS20. En primer lloc, el circuit regulador que controla la expressió de gens del principal operon conjugatiu ha estat estudiat, en la quina participen Rco, Rap i Phr*. Hem caracteritzat estructuralment el domini de tetramerització de Rco i hem vist que comparteix similitud amb la família de proteïnes p53. A més, hem determinat que Rco té diferents estats de oligomerizació en funció del pH, probablement a causa de la interfície de tetramerització composta per residus carregats. Així mateix, la unió entre Rap i Rco a diferents estequiometries i l'efecte de Phr* en la formació del complex han sigut analitzats per cromatografia de exclusió molecular. Respecte a Rap, s'ha avaluat la possibilitat de regulació creuada amb altres sistemes de Rap per assajos de unió. En segon lloc, hem treballat amb Reg576, una proteïna reguladora que participa en la regulació de gens involucrats en el establiment del plasmidi una vegada transferit a la cèl·lula receptora. Hem identificat al seu lloc d'unió al ADN y hem mutat un residu conservat per concloure que la unió no es veu afectada. D'altra banda, hem obtingut diferents disposicions y grups espacials de la proteïna a més de la que ja està depositada, revelant que Reg576 cristal·litza amb relativa facilitat. Finalment, hem investigat P34, proteïna involucrada en adhesió cel·lular que té un paper igualment important que la regulació del procés conjugatiu. Hem determinat que és una proteïna TIE (tioèster, Isopeptídic, èster) ja que hem caracteritzat estructuralment el seu domini tioèster, denominat TED. Mitjançant la introducció de la mutació de la cisteïna que participa en el enllaç tioèster, no hem observat cap canvi significatiu en l'estructura de la proteïna, però hem mesurat canvis dràstics en la funcionalitat. En definitiva, aquests resultats suposan un important avanç en la comprensió sobre la regulació de la conjugació i el contacte entre cèl·lules per començar la transferència de gens del plasmidi pLS20. Donada la importància de las proteïnes estudiades, no descartem l'opció de utilitzar aquestes proteïnes com futures dianes de fàrmacs per detenir la propagació de la resistència a antibiòtics.

[es] La resistencia a antibióticos está considerada una de las principales amenazas a la salud pública del siglo XXI por la OMS. Debido a su consumo excesivo e incorrecto, las bacterias desarrollan mecanismos para hacerles frente y así, ser capaces de sobrevivir en su presencia. Cuando una bacteria desarrolla el gen que le dota de resistencia, dispone de varios mecanismos para cederlo a las bacterias colindantes. Este proceso es conocido como transferencia horizontal de genes y es la principal causa de la propagación de los genes de resistencia a antibióticos. Podemos distinguir entre 3 subtipos, siendo la conjugación la más común. La conjugación es la transferencia activa de material genético desde una bacteria donante a otra receptora y requiere contacto directo entre células. La característica primordial es la presencia de un plásmido conjugativo. En este trabajo, se ha estudiado el plásmido conjugativo pLS20, de la bacteria Gram positiva Bacillus subtilis. Es una elección de estudio interesante ya que B. subtilis pertenece al filo Firmicutes, siendo este el filo predominante en el intestino humano. El intestino humano funciona como una reserva genética de resistencia a antibióticos. Además, pLS20 tiene interés biotecnológico debido a su existencia en B. subtilis natto, el cual es importante en producción alimentaria. Entender cómo se regula la conjugación y reunir información sobre las proteínas específicas que participan en el proceso conjugativo es muy importante para poder acabar con la propagación de la resistencia a antibióticos. Así, este trabajo está centrado en el estudio estructural y molecular de varias proteínas de pLS20. En primero lugar, se ha estudiado el circuito regulatorio que controla la expresión de genes del principal operon conjugativo, en el cual participan Rco, Rap y Phr*. Hemos caracterizado estructuralmente el dominio de tetramerización de Rco, descubriendo que comparte similitud con la familia de proteínas p53. Además, hemos determinado que Rco posee distintos estados de oligomerización en función al pH, probablemente debido a su interfaz de tetramerización compuesta de residuos cargados. Asimismo, la unión entre Rap y Rco a distintas estequiometrías y el efecto de Phr* en la formación del complejo han sido analizados por cromatografía de exclusión molecular. Respecto a Rap, se ha evaluado la posibilidad de regulación cruzada con otros sistemas de Rap mediante ensayos de unión. En segundo lugar, hemos trabajado con Reg576, una proteína que participa en la regulación de genes involucrados en el establecimiento del plásmido una vez transferido a la célula receptora. Hemos identificado su sitio de unión en el ADN y mutado un residuo conservado para concluir que la unión no se ve afectada. Hemos obtenido diferentes empaqueteamientos cristalinos y grupos espaciales de la proteína además de la que ya está depositada, lo cual revela que Reg576 es una proteína que cristaliza con relativa facilidad. Finalmente, hemos investigado P34, proteína involucrada en adhesión celular que juega un papel igualmente importante que la regulación en el proceso conjugativo. Hemos determinado que es una proteína TIE (tioéster, isopeptídico, éster) ya que hemos caracterizado estructuralmente su dominio tioéster, denominado TED. Mediante la introducción de la mutación de la cisteína que participa en el enlace tioéster, no hemos observado ningún cambio significativo en la estructura de la proteína, sin embargo, hemos medido cambios drásticos en la funcionalidad. En definitiva, estos resultados suponen un importante avance en la comprensión sobre la regulación de la conjugación y el contacto entre células para comenzar la transferencia de genes del plásmido pLS20. Dada la importancia de las proteínas estudiadas, no descartamos la opción de utilizar estas proteínas como futuras dianas de fármacos para detener la propagación de la resistencia a antibióticos.