[ca] La freqüent contaminació d'aigua subterrània per compostos organohalogenats és un greu problema degut als riscs humans i ecològics que se'n deriven. La bioremediació és un tècnica sostenible que permet superar algunes de les limitacions que presenten els tractaments fisicoquímics. En aquest estudi ens proposem obtenir i caracteritzar cultius que contenen bacteris anaerobis capaços de degradar compostos organohalogenats ambientalment perillosos i que es puguin aplicar per a la bioremediació d'aqüífers in situ. En treballs previs realitzats al nostre laboratori es va obtenir un cultiu enriquit que contenia un bacteri dehalorespirador del gènere Dehalogenimonas a partir de sediments de la desembocadura del riu Besòs (Barcelona) que degrada alcans amb halògens situats en carbons adjacents. En aquesta tesis, s'ha identificat la dehalogenasa reductora (RDasa) d'aquesta Dehalogenimonas implicada en la conversió de dibromur d'etilè (EDB) al compost innocu etilè combinant tècniques de proteòmica basades en gels d'electroforesis, tests enzimàtics i nano-cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (nLC-MS/MS). Aquesta RDasa es va designar com a EdbA. EdbA és la primera RDasa identificada entre les espècies d'aquest gènere bacterià que catalitza una reacció de debromació. A més, és la primera RDasa que s'ha demostrat funcional i que no té cap subunitat B de fixació a la membrana citoplasmàtica codificada de forma adjacent en el seu genoma. Addicionalment, s'ha detectat un enzim ortolog a l'enzim responsable de la degradació de 1,2-diclorpropà a propé (DcpA) com a única RDasa en cultius que transformen 1,2,3-triclorpropà a clorur d'alil mitjançant la combinació de tècniques d'ultracentrifugació, gels d'electroforesis i nLC-MS/MS. Aquesta DcpA es va detectar en la fracció de la membrana tal i com predeien les eines bioinformàtiques emprades. El mecanisme pel qual aquestes dues RDases identificades es fixen a les membranes és encara desconegut. En aquesta treball s'ha obtingut un segon consorci bacterià estable provinent de llots d'una planta de tractament d'aigües residuals industrials i aplicant estratègies de d'enriquiment del cultiu i tècniques de dilució fins a l'extinció. Aquest cultiu fermenta diclorometà (DCM) i dibromometà (DBM) en acetat i format. S'ha demostrat que el bacteri responsable de la fermentació d'aquests dihalometans és un Dehalobacterium i s'ha procedit al seu aïllament. Tanmateix, les interaccions sinèrgiques entre les espècies del consorci han impedit el seu aïllament. Mitjançant la selecció de colònies en cultius semi sòlids, canvis en la composició del medi i l'ús de antibiòtics, s'ha assolit un cultiu on l'abundància de Dehalobacterium és del 67%. Ĺacompanyen bacteris dels gèneres Acetobacterium i Desulfovibrio, tal i com revelen els anàlisis de genoteques. El fraccionament dels isòtops de carboni durant la fermentació de DCM per aquest cultiu s'ha determinat mitjançant l'anàlisi d'isòtops estables de compostos específics (CSIA). El valor obtingut de -27 ± 2‰ difereix del prèviament publicat per una soca de Dehalobacter (-15.5 ± 1.5‰) que també fermentava DCM. Aquests valors són significativament diferent dels obtinguts per bacteris metilotròfics degradadors de DCM (que varien de -45 a -61‰) i podria permetre la distinció entre vies de degradació de DCM en treballs de bioremediació in situ. Finalment, s'ha demostrat que la presència de co-contaminants que es detecten freqüentment amb DCM, tals com tricloroetilè (TCE), 1,2-dicloroetà (1,2-DCA), cis-dicloroetilè (cis-DCE), 1,1,2-tricloroetà (1,1,2-TCA), àcid perfluorooctanoic (PFOA) i 3,4-dicloroanilina (3,4-DCA) no provoca una inhibició significativa en la degradació de DCM pel cultiu amb Dehalobacterium a les concentracions testades. La concentració de cloroform de 100 mg/L provoca una total inhibició. De manera similar, la presència de 200 mg/L d'àcid perfluorooctanosulfonic (PFOS) i ≥ 25 mg/L de diuron provoquen una inhibició severa, impedint la degradació completa de DCM. Tanmateix, l'activitat degradadora de DCM es recupera quan els cultius inhibits es transfereixen a medi fresc sense co-contaminants.

[es] La frecuente contaminación de las aguas subterráneas por compuestos organohalogenados es un grave problema ambiental debido a los riesgos ecológicos y para la salud humana de ella derivados. La bioremediación es una tecnología sostenible que evita algunos inconvenientes que presentan los tratamientos físico-químicos. En este estudio nos proponemos obtener y caracterizar cultivos que contengan bacterias anaerobias que degraden compuestos organohalogenados ambientalmente peligrosos con potencial para la bioremediación in situ de aguas subterráneas. En trabajos previos de nuestro grupo de investigación, se obtuvo un cultivo enriquecido en bacterias del género Dehalogenimonas procedente de sedimentos del estuario del río Besós (Barcelona) que degrada alcanos con halógenos situados en carbonos adyacentes. En esta tesis se ha identificado la dehalogenasa reductora (RDasa) de esta cepa de Dehalogenimonas implicada en la conversión del dibromuro de etileno (EDB) al compuesto inocuo eteno combinando técnicas de proteómica basadas en geles de electroforesis, ensayos enzimáticos y nano-cromatografía líquida de alta resolución (nLC-MS/MS). Esta RDasa es designada EdbA, y constituye la primera RDasa identificada en este género bacteriano que cataliza una reacción de debromación. Además, es también la primera RDasa en ser demostrada funcional sin una subunidad B de anclaje a la membrana codificada de forma adyacente en el genoma. Adicionalmente, se ha detectado una única RDasa en cultivos que transforman 1,2,3-tricloropropano a cloruro de alilo combinando técnicas de ultracentrifugación, geles de electroforesis y nLC-MS/MS. Esta enzima ortóloga a DcpA, la responsable de la degradación de 1,2-dicloropropano a propeno, ha sido detectada en la fracción proteica de membrana, lo cual concuerta con las predicciones realizadas mediante herramientas bioinformáticas. El mecanismo por el cual EdbA y esta DcpA se anclan a la membrana citoplasmática es desconocido, atribuyéndose a proteínas todavía no descritas. En este trabajo se ha obtenido un segundo consorcio bacteriano estable a partir de lodos de una planta de tratamiento de aguas residuales industriales aplicando técnicas de cultivo de enriquecimiento y dilución por extinción. Este cultivo fermenta diclorometano (DCM) y dibromometano (DBM) a acetato y formato. Se ha demostrado que la bacteria responsable de la fermentación pertenece al género Dehalobacterium, y se ha procedido a su aislamiento. Sin embargo, las interacciones sinérgicas existentes entre las especies del consorcio han impedido obtener un cultivo puro. Seleccionando colonias en medio de cultivo semisólido, aplicando antibióticos y cambios en la composición del medio, se ha obtenido una abundancia relativa de Dehalobacterium del 67%. Le acompañan bacterias de los géneros Acetobacterium y Desulfovibrio, tal y como se detectó mediante análisis de genotecas. El fraccionamiento isotópico del carbono durante la fermentación del DCM por este cultivo fue determinado mediante análisis de isótopos estables de compuestos específicos (CSIA). El valor obtenido, -27 ± 2‰, difiere del publicado previamente para una cepa de Dehalobacter que también fermenta el DCM (-15.5 ± 1.5‰). Estos valores son significativamente diferentes de los obtenidos con bacterias metilotróficas degradadoras de DCM (-45 a -61‰), y podrían permitir diferenciar vías de degradación de DCM en trabajos de bioremediación in situ. Finalmente, se ha demostrado que la presencia de co-contaminantes que se detectan frecuentemente con el DCM, como el tricloroetileno (TCE), 1,2-dicloroetano (1,2-DCA), cis-dicloroetileno (cis-DCE), 1,1,2-tricloroetano (1,1,2-TCA), ácido perfluorooctanoico (PFOA) y 3,4-dicloroanilina (3,4-DCA) no provocan una inhibición significativa en la degradación de DCM por parte del cultivo de Dehalobacterium, a las concentraciones estudiadas. Una concentración de cloroformo de 100 mg/L provoca una inhibición total. De manera similar, 200 mg/L de sulfonato de perfluoroctano (PFOS), y ≥ 25 mg/L de diuron provocan una inhibición severa, impidiendo la degradación completa del DCM. Sin embargo, la actividad degradadora de DCM se recupera cuando los cultivos inhibidos se transfieren a medio libre de co-contaminantes.