[en] This thesis studies protein allosteric sites from a structural and evolutionary perspective. Allostery is a fundamental aspect of life at the molecular level, the most common and powerful mechanism of protein activity regulation: through binding of a ligand to a site which is not the active site. This phenomenon was first described more than 50 years ago and it still captures the attention of researchers, while fully understanding its mechanisms remains a grand scientific challenge. Furthermore, allosteric sites have been increasingly calling the attention of medicinal chemists and pharmaceutical companies, given their potential for the development of novel therapeutics. The thesis is presented as a 'compendium of published articles'. The first article was published at the beginning of 2010 describing the first stage of the thesis, a series of large-scale computational analyses to characterize putative small-molecule binding sites by integrating publicly available information on protein sequences, structures and active sites for more than a thousand protein families. By identifying common pockets across different structures of the same protein family a method was developed to measure the pocket's structural conservation. Characterization of putative ligand-binding sites followed using different measures such as sequence conservation, structural flexibility, electrostatic potential and structural conservation. The most relevant finding was the unexpected lack of correlation between the two conservation measures, of sequence and structure, for many of the predicted cavities. This general finding was also observed in specific cases of allosteric proteins, where the active site was conserved both in terms of structure and sequence but the allosteric site was conserved only from the structural perspective and did not show conservation at the sequence level. The second article was published at the end of 2012, it explores the relationship between protein flexibility and allosteric effects defining a computational methodology to predict the presence and location of allosteric sites on protein structures. Besides the dynamical aspects assessed through normal mode analysis, the method also incorporates the structural conservation measure defined in the first article. The predictive approach was benchmarked against a large data set of allosteric proteins of known structure obtaining 65% positive predictive value. After the second publication, the method has been implemented in the form of a freely available web-server aimed to support the work of researchers in the field of allosterism, both to improve the understanding of this fundamental form of protein function regulation and to serve applied purposes in the area of drug design and discovery.

[es] La presente tesis estudia los sitios alostéricos desde una perspectiva estructural y evolutiva. La regulación alostérica es un aspecto fundamental de la vida a nivel molecular, ya que es el mecanismo más potente y frecuente en la regulación de la actividad proteica: mediante la unión de un ligando a un sitio que no es el sitio activo. Este fenómeno fue descrito por primera vez hace más de 50 años y desde entonces no ha dejado de captar la atención de la comunidad científica, llegando incluso a ser calificado como 'el segundo secreto de la vida', después del código genético. Sin embargo, la comprensión cabal de los mecanismos involucrados continúa siendo un gran desafío científico. Actualmente, los sitios alostéricos han despertado un creciente interés por parte de expertos en química medicinal y compañías farmacéuticas, dado su potencial para el desarrollo de nuevos fármacos. La tesis se presenta como un 'compendio de publicaciones'. El primer artículo fue publicado a principios del año 2010 y describe la primera etapa del proyecto, una serie de análisis computacionales a gran escala para caracterizar sitios de unión a ligando integrando información referente a secuencia, sitios activos y estructura para más de mil familias proteicas. Mediante la identificación de sitios de unión comunes en distintas estructuras de la misma familia proteica, se desarrolló un método para medir la conservación estructural de dichos sitios. Esta metodología permitió realizar una caracterización de sitios de unión considerando distintos aspectos, como la conservación evolutiva a nivel de secuencia, flexibilidad estructural, potencial electrostático y conservación estructural. El descubrimiento más significativo fue la inesperada falta de correlación entre las medidas de conservación de secuencia y estructura para muchos de los sitios de unión predichos. Este hallazgo es válido también para casos específicos de proteínas alostéricas, donde el sitio activo está conservado tanto a nivel de secuencia como de estructura, pero el sitio alostérico sólo presenta conservación a nivel estructural y no de secuencia. El segundo artículo fue publicado a fines del año 2012 y explora la relación entre la flexibilidad proteica y la regulación alostérica, definiendo una metodología computacional para la predicción de sitios alostéricos en estructuras proteicas. Más allá de los aspectos dinámicos que fueron estudiados mediante el análisis de modos normales, el método también incorpora la medida de conservación estructural desarrollada en el primer artículo. El sistema predictivo fue puesto a prueba utilizando un extenso conjunto de proteínas alostéricas de estructura conocida, obteniendo un valor predictivo positivo de 65%. Después de la segunda publicación, el método se ha implementado como servidor web para brindar apoyo a la investigación de la regulación alostérica, tanto para extender el conocimiento de esta forma fundamental de regulación de la actividad proteica, como para ayudar en la aplicación de dichos conocimientos al desarrollo de nuevos fármacos con objetivos terapéuticos.