[en] The paramyxoviruses are RNA virus (-), responsible for different diseases in humans and animals. Specifically, Respiratory Syncytial Virus (RSV) causes death year between 77,000 and 200,000 children and hospitalization of more than 20 million individuals. Currently not own or vaccine or effective treatment. Meanwhile, the Disease Virus (NDV) causes significant economic losses in poultry. The life cycle begins with paramyxoviruses interaction of the virus with the host cell. The virus binding proteins recognize specific receptors on the cell surface. These proteins with protein G in the case of RSV and the HN protein of NDV in the case. The second step consists in the fusion of the viral and cellular membranes, which is produced by the fusogenic activity of the protein F (fusion) of the virus. This step is critical for viral entry as well can be produced by direct fusion to the cytoplasmic membrane level, or the virus can penetrate through endocytosis and subsequently fuse with endocytic membranes. Both ends up causing the release mechanisms of the viral genome into the cell cytoplasm where they can generate new virions. Currently unknown mechanisms which regulate specific receptor recognition and fusion of membranes of paramyxoviruses, specifically Respiratory Syncytial Virus (RSV), with the target cell membrane. In recent years there has been studied in depth endocytosis mechanisms, seeing the many virus used either exclusively or in addition to direct fusion with the plasma membrane, such as RSV and NDV. Knowledge of specific receptors and specific mechanisms of entry of these viruses will establish strategies in developing antiviral therapies. This is especially important because it has no specific treatment for RSV infection, limited to palliative treatments, and may help develop new therapies against RSV. The objectives were addressed: Purpose 1. - Identify receptors paramyxoviruses, RSV and NDV, the surface of the host cell. We used different inhibitors of protein glycosylation to achieve characterize the type of waste which are part of cell receptor proteins of RSV. The precise RSV O-glycosylated receptors for entry into the target cell and the O-glycosylation and N-glycosylation for proper maturation of the protein of new virions. For NDV, our data indicate that the glycolipid remodeling pattern of the target membrane by expression of mammalian sialidases decreases viral fusion and infectivity. Furthermore, using the technique of VOPBA receptor proteins were isolated specific virus for subsequent sequencing and identification. We have seen that the NDV interacts with the protein disulfide isomerase (56kDa), and that interacts with RSV proteins of 28 and 55 kDa Objective 2. - Studying the effect of pH and temperature on the paramyxovirus fusion with cultured cells. Our data show that treatments to increase the acid pH kinetics of RSV fusion, while not see any increase in long melting times. This may be because the pH of this conformational change facilitating the F protein that occurs in vivo. In the case of NDV at acidic pH treatments cause a decrease in fusion kinetics although no overall increase melting at acidic pH. Objective 3. - Analyze the NDV and RSV entry by endocytic mechanisms. Treatments with various endocytosis inhibitors and colocalization experiments indicated that the NDV us used as the attachment mechanism of entry into the target cell. In the case of RSV controversy exists about whether RSV use the endocytic pathway, our data seem to support that RSV would not use the input mechanism. Purpose 1. - Identify receptors paramyxoviruses, RSV and NDV, the surface of the host cell. 1. - GAGs are attached to glycoproteins. We therefore use various inhibitors of the synthesis of glycoproteins: desoximanojirimicina tunicamycin and inhibitors of the N-glycosylation, and BenzilGalNAc as inhibitor of O-glycosylation. The effect of glycosylation was determined by studying the cell-cell fusion (transfer fluorescent probes), syncytia formation, infectivity (immunofluorescence) and degree of virus binding to the cell (flow cytometry). 2. - To raise awareness about the role of sialic acids in the binding and fusion with the host cell NDV, sialidase NEU3 overexpressed by transient transfection. This modified pattern gangliosides (sialoglicol?pidos) of the target cell membrane. Note how this affects the virus-cell fusion and infectivity by fluorescence microscopy. 3. - The third set of experiments consisted VOPBA perform different tests. This technique analyzes the virus in vitro interaction with proteins transferred to a PVDF membrane. Positive proteins were sequenced and characterized by mass spectrometry. Objective 2. - Studying the effect of pH and temperature on the paramyxovirus fusion with cultured cells. The effect of pH and temperature in the melt was analyzed using different approaches: 1. - First fusion was measured viruses probe labeled with octadecyl rhodamine (RSV-NDV-R18 and R18) with cultured cells and reconstituted envelopes of erythrocytes (ghosts). In these experiments we examined the effect of pH on the kinetics of fusion (fluorimetric techniques) and the number of cells positive for rhodamine signal (fluorescence microscopy). Also underwent preinfectadas cells pulsed with different RSV to acid pH and analyzed as said pH affects the activity of viral proteins expressed on the surface of cells. Infectivity was assayed by measuring the formation of syncytia and by immunofluorescence. The infectivity of virus preincubated at acid pH was quantified by counting of syncytia and immunofluorescence. Objective 3. - Analyze the entrance of NDV and RSV by endocytic mechanisms. To check whether these viruses use these input paths culture cells were treated with various inhibitors of endocytosis. The effect of the treatments on entry of the virus was analyzed by flow cytometry, immunofluorescence, syncytia counted and confocal microscopy. The inhibitors used were: 1. - Bisindolylmaleimide: inhibitor of protein kinase C necessary for receptor-mediated endocytosis. 2. - Dinasore: Inhibitory activity of the GTPase dynamin 1, inhibits clathrin-mediated endocytosis and also by caveolae. 3. - Concanamycin A: vacuolar ATPase inhibitor required to produce the lowering of pH which allows cells to enter viruses that require acidic pH. 4. - Monensin: Ionophore preventing endosome acidification and therefore inhibiting the entry of viruses that require acidic pH. 5. - Chloroquine is an alkaline agent that lisosomotr?pico endocytic vesicles. 6. - Nocodazole: microtubule depolymerisation 7. - Methyl-beta-cyclodextrin: cholesterol agent that sequesters selectively inhibits the membranes in vesicle formation of clathrin surrounded and caveolae-mediated endocytosis. 8. - PMA: Composite inhibitor caveolae-mediated endocytosis to phosphorylate caveolin. 9. - Nystatin: antibiotic that binds steroid inhibits caveolae-mediated endocytosis to remove cholesterol from the membrane. 10. - Chlorpromazine cationic amphipathic compound which inhibits recycling and therefore clathrin-mediated endocytosis this protein. Conclusions: 1. The interaction of the ganglioside GD1a determines NDV productive infection of NDV. The receiver GD1a is a determinant of cell infected. 2. The NDV interacts in vitro with the protein disulfide isomerase A3. 3. The NDV shows an organized and directed movement on the surface of HeLa cells, cytoskeleton-dependent movement. 4. NDV proteins colocalize with early endosomes markers at 30 min after infection. 5. NDV can enter the host cell through caveolae-mediated endocytosis, and that inhibitors of this pathway affecting the formation of syncytia, the infectivity of NDV and colocalization with early endosomes. 6. The O-glycosylation of the target membrane proteins of RSV is essential for binding of virus fusion with the cell and the syncytia formation. 7. The extent of N-glycosylation of the target membrane proteins of RSV does not affect the binding or direct fusion with the target cell RSV, whereas N-glycosylation is essential for maturation and infectivity of the progeny. 8. RSV in vitro interacts with different proteins as nucleolin proteoglycans. 9. The activated acid pH RSV fusion culture cells. 10. The RSV uses input mechanisms not dependent endocytic clathrin.

[es] Los paramixovirus son virus RNA (-), responsables de diferentes enfermedades en humanos y animales. Concretamente, el Virus Respiratorio Sincitial (RSV) provoca al a?o la muerte de entre 77.000 y 200.000 ni?os y la hospitalizaci?n de m?s de 20 millones de individuos. Actualmente no se posee ni vacuna ni tratamiento eficaz. Por su parte, el Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV) provoca importantes p?rdidas econ?micas en granjas av?colas. El ciclo de vida de los paramixovirus comienza con la interacci?n del virus con la c?lula hospedadora. Las prote?nas de uni?n del virus reconocen receptores espec?ficos de la superficie celular. Estas prote?nas con la prote?na G en el caso del RSV y la prote?na HN en el caso de NDV. El segundo paso consiste en la fusi?n de las membrana v?rica y celular, lo cual se produce gracias a la actividad fusog?nica de la prote?na F (de fusi?n) del virus. Este paso resulta cr?tico para la entrada del virus ya que bien se puede producir por fusi?n directa a nivel de la membrana citoplasm?tica, o bien el virus puede penetrar mediante endocitosis y fusionar posteriormente con las membranas endoc?ticas. Ambos mecanismos acaban produciendo la liberaci?n del genoma v?rico en el citoplasma celular donde podr? generar nuevos viriones. Actualmente se desconocen los mecanismos concretos que regulan el reconocimiento del receptor y fusi?n de membranas de los paramixovirus, y concretamente del Virus Respiratorio Sincitial (RSV), con la membrana de la c?lula diana. En los ?ltimos a?os se ha profundizado en el estudio de los mecanismos de endocitosis, vi?ndose que muchos virus la utilizan ya sea en exclusividad o complementariamente a la fusi?n directa con la membrana plasm?tica, c?mo es el caso del RSV y NDV. El conocimiento de los receptores espec?ficos y de los mecanismos concretos de entrada de estos virus permitir? establecer las estrategias en el desarrollo de terapias antiv?ricas. Esto es especialmente importante ya que se carece de tratamientos espec?ficos para la infecci?n por RSV, limit?ndose a tratamientos paliativos, y puede ayudar al desarrollo de nuevas terapias frente al RSV. Los objetivos abordados fueron: Objetivo 1.- Identificar los receptores de los paramixovirus, RSV y NDV, de la superficie de la c?lula hospedadora. Hemos utilizado diferentes inhibidores de la glicosilaci?n de prote?nas con el fin de conseguir caracterizar el tipo de residuos que forman parte de las prote?nas receptoras celulares del RSV. El RSV precisa receptores O-glicosilados para la entrada en la c?lula diana y la O-glicosilaci?n y N-glicosilaci?n para la correcta maduraci?n de las prote?nas de los nuevos viriones. En el caso del NDV, nuestros datos indican que el remodelado del patr?n de glicol?pidos de la membrana diana mediante la expresi?n de sialidasas de mam?fero disminuye la fusi?n e infectividad v?ricas. Adem?s, mediante la t?cnica de VOPBA se aislaron las prote?nas receptoras espec?ficas de cada virus, para su posterior secuenciaci?n e identificaci?n. Hemos visto que el NDV interacciona con la Prote?na Disulfuro Isomerasa (56kDa), y que el RSV interacciona con prote?nas de 28 y 55 kDa Objetivo 2.- Estudiar el efecto del pH y la temperatura sobre la fusi?n de los paramixovirus con c?lulas de cultivo. Nuestros datos muestran que los tratamientos a pH ?cido incrementan la cin?tica de la fusi?n del RSV, si bien no se ve ning?n aumento de la fusi?n a tiempos largos. Esto podr?a ser debido a que el pH este facilitando un cambio conformacional de la prote?na F que no ocurre in vivo. En el caso del NDV los tratamientos a pH ?cido provocan una disminuci?n en la cin?tica de fusi?n aunque hay aumento global de la fusi?n a pH ?cido. Objetivo 3.- Analizar la entrada del NDV y RSV por mecanismos endoc?ticos. Los tratamientos con diferentes inhibidores de la endocitosis y experimentos de colocalizaci?n nos indicaron que el NDV la utilizar?a como mecanismo accesorio de entrada en la c?lula diana. En el caso del RSV existe controversia acerca de si el RSV utilizar?a la ruta endoc?tica; nuestros datos parecen apoyar que el RSV no utilizar?a dicho mecanismo de entrada. Objetivo 1.- Identificar los receptores de los paramixovirus, RSV y NDV, de la superficie de la c?lula hospedadora. 1.- Los GAGs se encuentran unidos a glicoprote?nas. Por ello utilizamos diferentes inhibidores de la s?ntesis de glicoprote?nas: tunicamicina y desoximanojirimicina, inhibidores de la N-glicosilaci?n; y BenzilGalNAc como inhibidor de la O-glicosilaci?n. El efecto de la glicosilaci?n se determin? estudiando la fusi?n c?lula-c?lula (transferencia de sondas fluorescentes), la formaci?n de sincitios, la infectividad (inmunofluorescencia) y el grado de uni?n del virus a la c?lula (citometr?a de flujo). 2.- Para ampliar el conocimiento del papel de los acidos sialicos en la uni?n y fusi?n del NDV con la c?lula hospedadora, sobreexpresamos la sialidasa NEU3 mediante transfecci?n transitoria. Con ello modificamos el patr?n de gangli?sidos (sialoglicol?pidos) de la membrana de la c?lula diana. Observamos c?mo ello afecta a la fusi?n virus-c?lula y a su infectividad, mediante microscop?a de fluorescencia. 3.- El tercer grupo de experimentos consisti? en realizar diferentes pruebas de VOPBA. Esta t?cnica analiza la interacci?n in vitro del virus con prote?nas transferidas a una membrana de PVDF. Las prote?nas positivas se secuenciaron y caracterizaron por espectrofotometr?a de masas. Objetivo 2.- Estudiar el efecto del pH y la temperatura sobre la fusi?n de los paramixovirus con c?lulas de cultivo. El efecto del pH y la temperatura en la fusi?n se analiz? mediante diferentes aproximaciones: 1.- En primer lugar se midi? la fusi?n de los virus marcados con la sonda octadecil-rodamina (RSV-R18 y NDV-R18) con c?lulas en cultivo y con envolturas reconstituidas de eritrocitos (ghosts). En estos experimentos se analiz? el efecto del pH sobre la cin?tica de la fusi?n (t?cnicas fluorim?tricas) y el n?mero de c?lulas positivas para la se?al de rodamina (microscop?a de fluorescencia). Tambi?n se someti? a c?lulas preinfectadas con RSV a diferentes pulsos de pH ?cido y se analiz? c?mo afecta dicho pH a la actividad de las prote?nas v?ricas expresadas en la superficie de las c?lulas. La infectividad se analiz? midiendo la formaci?n de sincitios y mediante inmunofluorescencia. La infectividad de virus preincubados a pH ?cido se cuantific? mediante recuento de sincitios e inmunofluorescencia. Objetivo3.- Analizar la entrada del NDV y RSV por mecanismos endoc?ticos. Para comprobar si estos virus utilizan estas rutas de entrada se trataron c?lulas de cultivo con diferentes inhibidores de la endocitosis. El efecto de los tratamientos sobre la entrada de los virus se analiz? mediante citometr?a de flujo, inmunofluorescencia, recuento de sincitios y microscop?a confocal. Los inhibidores utilizados fueron los siguientes: 1.- Bisindolilmaleimida: inhibidor de la prote?na kinasa C necesaria para la endocitosis mediada por receptor. 2.- Dinasore: Inhibidor de la actividad GTPasa de la dinamina 1, inhibe la endocitosis de mediada por clatrina y tambi?n por caveolas. 3.- Concanamicina A: Inhibidor de la ATPasa vacuolar necesaria para producir la bajada de pH que permita entrar en las c?lulas a virus que requiren pH ?cido. 4.- Monensina: Ion?foro que previene la acidificaci?n del endosoma y por tanto inhibe la entrada de virus que requieren pH ?cido. 5.- Cloroquina: Es un agente lisosomotr?pico que alcaliniza las ves?culas endoc?ticas. 6.- Nocodazol: Despolimeriza los microt?bulos 7.- Metil-beta-ciclodextrina: Agente que secuestra selectivamente colesterol de las membranas en inhibe la formaci?n de ves?culas rodeadas de clatrina y endocitosis mediada por caveolas. 8.- PMA: Compuesto inhibidor de la endocitosis mediada por caveolas al fosforilar caveolina. 9.- Nistatina: Antibi?tico que se une a esteroides, inhibe la endocitosis mediada por caveolas al eliminar colesterol de la membrana. 10.- Clorpromacina: Compuesto cati?nico anfip?tico que inhibe el reciclado de clatrina y por tanto la endocitosis mediada por esta prote?na. Conclusiones: 1. La interacci?n del NDV con gangli?sidos GD1a determina la infecci?n productiva del NDV. El GD1a es un receptor determinante de la c?lula a infectar. 2. El NDV interacciona in vitro con la Proteina Disulfuro Isomerasa A3. 3. El NDV muestra un movimiento organizado y dirigido en la superficie de c?lulas HeLa, movimiento que depende del citoesqueleto. 4. Las prote?nas del NDV colocalizan con marcadores de endosomas tempranos a los 30 min postinfecci?n. 5. El NDV puede entrar en la c?lula hu?sped mediante endocitosis mediada por caveolas, ya que los inhibidores de esta ruta afectan a la formaci?n de sincitios, a la infectividad del NDV y a la colocalizaci?n con endosomas tempranos. 6. La O-glicosilaci?n de las prote?nas de la membrana diana del RSV es esencial para la uni?n, fusi?n del virus con la c?lula y la formaci?n de sincitios. 7. El grado de N-glicosilaci?n de las prote?nas de la membrana diana del RSV no afecta a la uni?n ni a la fusi?n directa del RSV con la c?lula diana, mientras que la N-glicosilaci?n es esencial para la maduraci?n e infectividad de la progenie. 8. El RSV interacciona in vitro con prote?nas diferentes a los proteoglicanos como la nucleolina. 9. El pH ?cido activa la fusi?n del RSV con c?lulas de cultivo. 10. El RSV utiliza mecanismos de entrada endoc?ticos no dependientes de clatrina.