[en] RNA viruses are probably some of the most pervasive parasites that can be found in all life forms. These infectious agents seem particularly prone to causing emerging diseases in plants, humans and other animals. Their abilities to escape the immune system, evade antiviral strategies or to jump to new species are a direct consequence of their enormous capacity to evolve quickly. Understanding basic processes of evolutionary change may be a necessary primary step in designing new intervention strategies. One of the key characteristics of RNA viruses, especially from an evolutionary perspective, is their capacity for mutation. Knowing mutation rates and the molecular spectrum of spontaneous mutations is important to understanding how the genetic composition of viral populations evolves. Previous studies have shown that the rate of spontaneous mutations for RNA viruses widely varies between 0.01 and 2 mutations per genome and generation, with plant RNA viruses always occupying the lower side of this range. Here we analyse the spontaneous mutational spectrum 20 and the mutation rate of Tobacco etch potyvirus (TEV), a model system of positive sense RNA viruses. Our experimental set up minimizes the action of purifying selection on the mutational spectrum, thus giving a picture of what types of mutations are produced by the viral replicase. We have estimated that the spontaneous mutation rate for this virus was in the range 10-6 - 10-5 mutations per site and generation. Our estimates are in the same biological ballpark as previous values reported for plant RNA viruses. Recombination is a virus characteristic that also contributes significantly to the diversity and evolution of viruses. The recombination rate depends on two parameters: the frequency of genetic exchange between viral genomes within an infected host cell and the frequency of co-infected cells. Despite this importance, only one direct quantification of the in vivo recombination rate for an RNA virus during host infection has been reported: the in vivo recombination rate for Cauliflower mosaic virus (CaMV) (Froissart et al., 2005) was reported to be 4×10-5 events per nucleotide site and per replication cycle. In plant potyviruses, in vivo observations have 21 shown that strains of the same virus segregate spatially during mixed infections. This segregation shall minimize the chances of two genotypes to co-infect the same cells and henceforth, precludes template switching and recombination events during genomic RNA replication. To reconcile these confronting observations, we have evaluated the in vivo TEV recombination rate and multiplicity of infection (MOI). TEV recombination rate was estimated to 1.03×10−5 recombination events per nucleotide site and generation. This value is in the same order of magnitude than TEV mutation rate, suggesting that recombination should be at least as important as point mutation in creating variability. The multiplicity of cellular infection is defined as the number of viral genome infecting effectively a cell. Two recent studies have reported in vivo MOI estimates for Tobacco mosaic virus (TMV) and CaMV, using sophisticated approaches to measure the distribution of two virus genotypes over host cells. Here, we present a detailed analysis of spatial and temporal dynamics of the cellular MOI during colonization of a host plant by TEV. We observe a low frequency of virus-infected 22 cells (mean ± SD: 0.100 ± 0.073), and cells infected by both virus variants (mean ± SD: 0.012 ± 0.023). A new, model-selection- based method was used to determine the MOI, and the predicted MOIs values were low, ranging from 1.0 (leaf three, 3 days post inoculation (dpi)) to 1.6 (leaf four, 7 dpi). Finally, high genetic diversity in viral population gives rise to a cloud of variants; linked through mutation, interacting and contributing collectively; also called quasi-species. Viral populations can rapidly adapt to dynamic environments, remaining remarkably unstable under certain conditions as observed during evolution of TEV in case of genetic and functional redundancy. Large deletions and multiple defective particles were observed after various passages of long time TEV infection in transgenics plants expressing the viral replicase NIb. This result demonstrates the great genome plasticity of RNA virus and their capacity to eliminate any useless genetic load.

[es] Los virus de ARN son probablemente algunos de los parásitos más extendidos que se pueden encontrar en todas las formas de vida. Estos agentes infecciosos parecen particularmente propensos a causar enfermedades emergentes en plantas, seres humanos y otros animales. Sus habilidades para escapar al sistema inmune, evadir estrategias antivirales o para infectar a nuevas especies son una consecuencia directa de su enorme capacidad para evolucionar rápidamente. Comprender los procesos básicos del cambio evolutivo puede ser unos de los principales pasos necesarios en el diseño de nuevas estrategias de intervención. Desde una perspectiva evolutiva, una de las principales características de los virus de ARN es su capacidad para mutar. El conocimiento de las tasas de mutación y el espectro molecular de mutaciones espontáneas son importantes para entender la evolución de la composición genética de las poblaciones virales. Estudios anteriores han demostrado que la tasa de mutaciones espontáneas de los virus de ARN varía 14 ampliamente entre 0.01 y 2 mutaciones por genoma y generación, ocupando los virus de plantas la parte inferior de esta escala de valores. En este estudio, se propuso analizar el espectro mutacional y la tasa de mutación del virus del grabado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV), como modelo para los virus de ARN de cadena positiva. Nuestro experimento minimiza la acción purificadora de la selección en el espectro mutacional, dando así una imagen exacta de qué tipo de mutación ha producido la replicasa viral. Hemos calculado la tasa de mutación espontánea de este virus, hallándose en el intervalo de valores entre 10-6 - 10-5 mutaciones por sitio y generación. Nuestras estimaciones se encuentran en el mismo rango de valores que los anteriormente descritos para otros virus ARN de plantas. La recombinación de un virus de ARN es un parámetro evolutivo que contribuye significativamente a la diversidad y a la evolución de los virus. La tasa de recombinación depende de dos parámetros: de la frecuencia de intercambio genético entre genomas virales dentro de una célula infectada del huésped y de la frecuencia de las células doblemente-infectadas. A pesar 15 de la importancia del conocimiento de dichos factores, actualmente solo se ha estimado experimentalmente la tasa de recombinación del retrovirus virus del mosaico de la coliflor (Cauliflower mosaic virus, CaMV) (Froissart et al., 2005), mediante una cuantificación in vivo y directa de la tasa de recombinación de dicho virus durante la infección de un huésped. Dicha tasa se estimó en 4×10-5 eventos de recombinación por nucleótido y por ciclo de replicación. En los potyvirus, observaciones in vivo han demostrado que aislados del mismo virus se segregan espacialmente durante infecciones mixtas. Esta segregación debería reducir al mínimo la posibilidad de dos genotipos de infectar las mismas células y así limitar eventos de recombinación durante la replicación del ARN viral. Para conciliar estas observaciones, hemos evaluado la tasa de recombinación y la multiplicidad de infección (MOI) del virus TEV, in vivo. La tasa de recombinación se estimó en 1.03×10-5 eventos de recombinación por nucleótido y generación. Este valor se encuentra en el mismo orden de magnitud que la tasa de mutación del TEV, lo que sugiere que la recombinación tiene una importancia 16 comparable a la mutación puntual en la creación de variabilidad. La multiplicidad de infección celular se define como el número de genomas virales que logran infectar de manera eficaz una célula. Dos estudios recientes han mostrado estimaciones in vivo de la MOI para el virus del mosaico del tabaco (Tobacco mosaic virus, TMV) y del CaMV, gracias a métodos sofisticados que miden la distribución de dos genotipos virales en las células del huésped. Aquí presentamos un análisis detallado de la dinámica temporal y espacial de la MOI celular durante la colonización de una planta por el TEV. Observamos una baja frecuencia tanto del número de células infectadas por el virus (media ± SD: 0.100 ± 0.073), como de las infectadas por dos genotipos del TEV (media ± SD: 0.012 ± 0.023). Se usó un nuevo método basado en un modelo de selección para determinar la MOI. Los valores de MOI predichos fueron bajos, oscilando entre 1.0 (hoja tres, 3 días después de la inoculación (dpi)) a 1.6 (hoja cuatro, 7 dpi). Por último, la alta diversidad genética de las poblaciones virales da lugar a una nube de variantes, todas 17 vinculadas a través de mutación, que interactúan y contribuyen colectivamente, conocido también por el término de cuasiespecies. Las poblaciones virales pueden adaptarse rápidamente a sus entornos dinámicos, y son notablemente inestables en determinadas condiciones como hemos demostrado en este trabajo durante la evolución del TEV en el caso de redundancia genética y funcional. Después de varios pasos a tiempos largos de infección en plantas transgénicas que expresan la replicasa viral NIb, se observaron grandes deleciones y múltiples partículas defectuosas. Este resultado demuestra la gran plasticidad del genoma de los virus ARN y su capacidad para eliminar cualquier carga genética innecesaria.