[en] This work is focused on the in-depth spectroscopic analysis of horseradish peroxidase (HRP) and chloroperoxidase (CPO), proteins selected for their scientific and industrial relevance. HRP, being extensively employed in immunoassays, has a crucial biochemical role, while CPO's structural and functional resemblance to cytochrome P450 emphasizes its importance in pharmacology. The enzymatic cycle of both peroxidases goes via an oxidized intermediate state, called Compound I. It stores two oxidizing equivalents, one in an iron(IV)-oxo moiety, and one as a free radical on the porphyrin ring or on an amino acid in the protein. Its investigation forms a central aspect of this research. Although abundantly studied, the exact description of the difference in the electronic structure of Compound I of various heme proteins remains challenging. The employed methodologies consist of established techniques, notably Continuous-Wave and Pulsed Electron Paramagnetic Resonance (EPR), UV-Vis spectroscopy, and stopped-flow spectrophotometry, alongside novel methods devised by the author. UV-Vis spectroscopy and stopped-flow spectrophotometry serve as standard tools in biotechnology, allowing the basic characterization and reaction kinetics of enzyme resting states and intermediates involved in enzyme turnover. Pulsed EPR, utilised in an attempt to elucidate the electron spin distribution of the resting state and Compound I forms of HRP and CPO, offers advantages in examining hyperfine interaction between unpaired electron(s) and surrounding nuclei. With the intention of enhance CPO production, an innovative solid substrate method has been explored, promising potential for scalability. Caldariomyces fumago-derived CPO production presents specific challenges due to cultivation and purification demands. Yet, the solid substrate method offers advantages, including increased yields, higher purity and cost-effectiveness, crucial for industrial applications. Furthermore, the author made crucial contributions to the developmental stages of three different rapid freeze quench apparatus used for trapping Compound I from CPO immediately after the initiation of the catalytic cycle. This involvement spanned from mechanical and technical creation to test, improvement and calibration of all three systems. EPR is a fundamental tool in exploring the electronic state of paramagnetic centers in proteins, such as the resting state and Compound I in HRP and CPO. M. Bracci ix Pulsed EPR techniques, such as HYSCORE and ENDOR, were utilized to investigate the resting state of both enzymes, providing insights into the electronic structure of their active centers and highlight their differences. To aid in the interpretation of HYSCORE spectra, a user-friendly graphical interface was developed, based on MATLAB and EasySpin, enabling researchers to manipulate experimental data and conduct simulations, even with minimal coding expertise. A theoretical model of the electronic structure of Compound I, previously proposed and based on the crystal field theory, was revisited. Starting from the energy of the t2g levels of Fe(IV) and a model for the magnetic interaction between the ion and the radical, this theory is suitable for interpreting the features of continuous wave EPR spectra, as demonstrated by the tests performed to literature data on the Compound I of different heme proteins. Subsequently, it was effectively used to simulate the CW EPR spectra of the intermediate of the proteins under investigation in this study. Finally, HYSCORE and ENDOR of the Compound I form of HRP and CPO revealed crucial differences in their 14N and 1H hyperfine couplings, which could be related to the difference in location of the radical.

[es] Este trabajo se centra en el análisis espectroscópico en profundidad de la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la cloroperoxidasa (CPO), proteínas seleccionadas por su relevancia científica e industrial. La HRP, ampliamente empleada en inmunoensayos, tiene un papel bioquímico crucial, mientras que la similitud estructural y funcional de la CPO con el citocromo P450 justifica su importancia en farmacología. El ciclo catalítico de ambas peroxidasas pasa por un estado intermedio oxidado, denominado Compound I que almacena dos equivalentes de oxidación, uno en un ion de hierro(IV)-oxo, y otro como un radical libre en el anillo de porfirina o en un aminoácido en la proteína. Su estudio constituye un aspecto central de esta investigación. Aunque este intermedio catalítico ha sido muy estudiado, la descripción exacta de las diferencias en la estructura electrónica del Compound I en varias hemoproteínas sigue siendo un reto. Las metodologías empleadas son, en parte técnicas establecidas, en particular la espectroscopia de Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) tanto en onda continua como EPR Pulsado, la espectroscopia UV-Vis y la espectrofotometría de flujo detenido, junto con métodos novedosos ideados por el autor. La espectroscopia de EPR es una herramienta fundamental para explorar el estado electrónico de los centros paramagnéticos en proteínas, como el estado de reposo y el Compound I de la HRP y la CPO. La espectroscopia UV-Vis y la espectrofotometría de flujo detenido son herramientas estándar en biotecnología, que permiten la caracterización de las propiedades elementales de los estados de reposo de las enzimas y de los intermediarios implicados en el ciclo catalítico, así como de la cinética de reacción. La espectroscopia de EPR pulsado, utilizado para establecer la distribución del espín electrónico del estado de reposo y el Compound I de la HRP y la CPO, ofrece ventajas en el estudio de la interacción hiperfina entre los electrones desapareados y los núcleos circundantes. Con la intención de mejorar la producción de CPO, se ha explorado un método innovador basado en sustrato sólido, con un potencial prometedor en cuanto a su escalabilidad. La producción de CPO del organismo Caldariozmyces fumago presenta retos específicos debido a sus exigencias de cultivo y purificación. Sin embargo, el método de sustrato sólido ofrece ciertas ventajas, como un rendimiento mejor, y mayor pureza y rentabilidad, que son cruciales para aplicaciones industriales. Además, el autor realizó contribuciones cruciales en las fases de desarrollo de tres instrumentos de congelación rápida diferentes, utilizados para atrapar el Compound I del CPO inmediatamente después del inicio de la reacción. Su contribución abarcó desde el diseño mecánico y técnico, pasando por la prueba, mejora y, finalmente, calibración de los tres sistemas. El desarrollo de la instrumentación de congelación rápida fue fundamental para el estudio EPR del Compound I del CPO. Se utilizaron técnicas de espectroscopia de EPR pulsado, como HYSCORE y ENDOR, para investigar el estado de reposo de ambas enzimas, lo que proporcionó información sobre la estructura electrónica de sus centros activos y puso de relieve sus diferencias. Para facilitar la interpretación de los espectros HYSCORE, se desarrolló una interfaz gráfica fácil de usar, basada en MATLAB y EasySpin, que permite a los investigadores manipular los datos experimentales y realizar simulaciones, incluso sin conocimientos de programación. Se revisó un modelo teórico para la estructura electrónica del Compound I, que había sido propuesto previamente y está basado en la teoría del campo cristalino. Partiendo de la energía de los niveles t2g del Fe(IV) y de un modelo para la interacción magnética entre el ion y el radical, esta teoría es adecuada para interpretar los espectros de EPR en onda continua, como demostraron las simulaciones realizadas a espectros de Compound I de diferentes hemoproteínas obtenidos de la bibliografía. Posteriormente, se utilizó eficazmente este mismo modelo para simular los espectros de EPR en onda continua del intermediario de las proteínas investigadas en este estudio. Finalmente, los espectros HYSCORE y ENDOR del Compound I de HRP y CPO revelaron diferencias cruciales en sus acoplamientos hiperfinos con núcleos 14N y 1H, que podrían estar relacionados con diferencias en la distribución del espín electrónico en el centro catalítico del hemo.