[en] The main objective of this thesis was to evaluate the potential of various biotic strategies and the effectiveness of nanobodies designed to neutralise different virulence factors of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4+, aiming to improve piglet response to health challenges during early stages. The thesis explores the effects of these additives on intestinal colonisation, immune response, and digestive function, shedding light on the possible mechanisms of action involved. To achieve these objectives, four studies were conducted. The first study (Chapter 4) involved young suckling piglets fed artificial milk. This study assessed the impact of supplementing milk formulas with different additives on the development of intestinal microbiota, the animal's metabolic response, and the development of digestive function. Specifically, it evaluated the effect of a synbiotic combination of Bifidobacterium longum subsp. infantis CECT 7210, Lactobacillus rhamnosus NH001, galacto-oligosaccharides (GOS), and human milk oligosaccharides (HMO), with or without the bioactive peptide osteopontin. In this study, 96 piglets aged 4-5 days were distributed into 32 pens over four periods (8 pens per treatment). This combination of additives successfully modified the microbial population of suckling piglets towards a more beneficial profile, achieving a greater reduction of potentially dysbiotic species such as Helicobacter and Campylobacter, and increased fermentative activity with higher concentrations of short-chain fatty acids. All three supplemented diets also promoted changes in gene expression, suggesting greater hormonal and enzymatic function, increased nutrient transport function, and reduced intestinal inflammatory tone. The second study (Chapter 5) evaluated the potential of a synbiotic combination in newly weaned piglets challenged orally with ETEC F4+. Experimental treatments included supplementation with Saccharomyces cerevisiae Sc 47, short-chain fructo-oligosaccharides (scFOS), or their synbiotic combination. In this study, 96 piglets aged 21 days were distributed into 32 pens (8 pens per treatment). All three supplemented diets promoted a reduction in the incidence of diarrhoea in the days following the challenge. This improvement was linked to lower pathogen counts in the different intestinal compartments, suggesting a more beneficial microbiological profile. The third and fourth studies (Chapter 6) evaluated the effectiveness of different nanobodies specifically designed to neutralise the virulence factors F4 (fimbria), LT, and Stx2e (toxins) of ETEC through different experimental designs: an ETEC F4+ challenge model similar to that in Chapter 5, and a field trial on a commercial farm. In the challenge model, 96 piglets aged 21 days were distributed into 32 pens and assigned to three experimental treatments: a control treatment, supplementation with nanobodies, or ZnO as a positive control (10-11 pens per treatment). Nanobodies promoted improvements in growth and clinical signs of the animals after the challenge, as well as a reduction in faecal pathogen excretion. The field trial was conducted on a commercial farm. In this case, a total of 528 piglets aged 21 days were distributed into 32 pens and divided into three treatments: a control treatment, supplementation with nanobodies, or ZnO as a positive control (16 pens per treatment). Nanobodies reduced the incidence of diarrhoea and numerically decreased faecal toxin shedding. Additionally, the additive increased the weight of the animals, primarily due to enhanced growth in low-weight piglets. In conclusion, all tested strategies (synbiotics and nanobodies), despite acting through different mechanisms of action, demonstrated beneficial effects on the intestinal ecosystem and the response of piglets to early-stage health challenges. For practical application, a complementary use of these strategies could prove to be an effective approach to addressing post-weaning diarrhoea issues.

[es] El objetivo principal de esta tesis ha sido evaluar el potencial de diferentes estrategias bióticas así como la efectividad de nanoanticuerpos diseñados para neutralizar diferentes factores de virulencia de Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) F4+, para mejorar la respuesta del lechón frente a los desafíos sanitarios de las primeras edades. La tesis investiga el efecto de estos aditivos sobre el proceso de colonización intestinal, la respuesta inmunitaria o la función digestiva intentando poner algo más de luz sobre los posibles mecanismos de acción involucrados. Para lograr estos objetivos, se realizaron cuatro estudios. El primero de ellos (Capítulo 4), se llevó a cabo con lechones lactantes alimentados con leche artificial. En este estudio se evaluó el impacto de suplementar las fórmulas lácteas sobre el desarrollo de la microbiota intestinal, la respuesta metabólica del animal y el desarrollo de la función digestiva. En concreto, se evaluó el efecto de la combinación sinbiótica de Bifidobacterium longum subsp. infantis CECT 7210, Lactobacillus rhamnosus NH001, galacto-oligosacáridos (GOS) y oligosacáridos de la leche humana (HMO), combinada o no con un péptido bioactivo, la osteopontina. En este estudio participaron 96 lechones de 4-5 días de vida, distribuidos en 32 corrales (8 corrales/tratamiento). Esta combinación de aditivos logró modificar la población microbiana de los lechones orientándola hacia un perfil más beneficioso. Logró una disminución de especies potencialmente disbióticas, como Helicobacter o Campylobacter, y una mayor actividad fermentativa, con aumento de la concentración de ácidos grasos de cadena corta. Las tres dietas suplementadas promovieron además cambios en la expresión génica, sugiriendo una mayor función hormonal y enzimática, mayor función de transporte de nutrientes y una disminución del tono inflamatorio intestinal. En un segundo estudio (Capítulo 5), se evaluó el potencial de una combinación sinbiótica en lechones recién destetados desafiados oralmente con ETEC F4+. En este caso, los tratamientos experimentales incluyeron la suplementación con Saccharomyces cerevisiae Sc 47, con fructo-oligosacáridos de cadena corta (scFOS) o bien la combinación sinbiótica de ambos. En este segundo estudio, 96 lechones de 21 días de vida fueron distribuidos en 32 corrales (8 corrales/tratamiento). Las tres dietas suplementadas promovieron una disminución de la incidencia de diarrea. También se encontraron menores recuentos del patógeno en los diferentes compartimentos intestinales, sugiriendo un perfil microbiológico más beneficioso. En un tercer y cuarto estudio (Capítulo 6), se evaluó la efectividad de diferentes nanoanticuerpos diseñados específicamente para neutralizar los factores de virulencia F4 (fimbria), LT y Stx2e (toxinas) de ETEC mediante diferentes diseños experimentales: un modelo de desafío por ETEC F4+ y una prueba de campo en granja comercial. En el modelo de desafío, 96 lechones de 21 días de vida fueron distribuidos en 32 corrales y tres tratamientos: control, suplementado con nanoanticuerpos o con ZnO (10-11 corrales/tratamiento). Los nanoanticuerpos promovieron una mejora en el crecimiento y los signos clínicos de los animales después del desafío, y una reducción en la excreción fecal del patógeno. En el estudio de campo, un total de 528 lechones de 21 días de vida fueron distribuidos en 32 corrales y tres tratamientos: control, suplementado con nanoanticuerpos o con ZnO (16 corrales/tratamiento). Los nanoanticuerpos disminuyeron la incidencia de diarrea y disminuyeron numéricamente las toxinas excretadas fecalmente. Además, el aditivo incrementó el peso de los animales, principalmente debido a un mejor crecimiento de los lechones de poco peso. En conclusión, todas las estrategias testadas (sinbióticas y nanoanticuerpos), a pesar de actuar mediante mecanismos de acción diferentes, demostraron efectos beneficiosos sobre el ecosistema intestinal y la respuesta de los lechones a los desafíos sanitarios de las primeras edades. De cara a su aplicabilidad, un posible uso complementario podría resultar eficaz frente a la problemática de las diarreas post-destete.