[en] The deleterious effects of reactive oxygen species (ROS) occur during adulthood, and it has been suggested that excess ROS -oxidative stress- may be a contributing factor in neurodegenerative processes. Glutathione (GSH) is one of the most abundant antioxidants and, in neurological diseases such as Parkinson's disease or mental disorders, GSH deficiency is the earliest known biochemical indicator of neuronal degeneration.This observation has led to the suggestion that oxidative stress may be behind the causes of neuronal dysfunction associated with these neurological disorders. Unfortunately, due to the lack of a sufficiently robust tool, the specific effect of GSH deficiency in the pathogenesis of neurological diseases has never been shown in vivo, thus the actual role of GSH loss-mediated oxidative stress in these disorders still remains elusive. Glutathione is a tripeptide (g-glutamylcysteinilglycine) synthesized by two consecutive ATP-dependent reactions. Glutamate-cysteine ligase (GCL or g-glutamylcysteine synthetase; EC 6.3.2.2) catalyzes the first -and rate-limiting- step, forming g-glutamylcysteine from glutamate and cysteine. This is followed by the glutathione synthetase (EC 6.3.2.3)-catalyzed reaction, which binds glycine to g-glutamylcysteine, forming glutathione. GCL is a heterodimeric enzyme composed of a catalytic (heavy; 73 kDa) and a modulatory (light; 27.7 kDa) subunit. Studies performed with purified GCL have shown that the active site resides at the catalytic subunit, whereas the modulatory subunit increases the affinity of the catalytic subunit for glutamate and decreases the sensitivity to feedback inhibition by GSH . In the brain, where -to the best of our knowledge- the enzyme has never been purified, GCL activity is very weak, although it is higher in astrocytes when compared with neurons.This contributes to the higher resistance of astrocytes, when compared with neurons, against oxidative stress. Astrocytes co-operate with neurons for neuronal antioxidant GSH biosynthesis by supplying GSH precursors. Thus, limiting either the supply of precursors, or the ability of neurons to use them, triggers oxidative stress in neurons leading to neurodegeneration, at least in culture. This has led us to hypothesize that neuronal-specific and temporally-controlled knockdown of GCL in vivo may lead to spontaneous neurological dysfunction, thus possibly mimicking the neurological problems associated with Parkinson's or mental diseases and potentially useful for the identification of novel redox-sensitive proteins involved in neurological disorders. The existing in vivo models for studying GCL, catalytic subunit, deficiency in the brain are scarce and failed. Homozygous knockout mice against GCL, catalytic subunit, are not viable beyond embryonic day 8th, and the heterozygous ones display compensation mechanisms such as increased ascorbate biosynthesis. In addition, this available genetic system does not knockout GCL tissue specifically or temporally controlled, thus being unsuitable to investigate the role of oxidative stress in central nervous system during adulthood. We had previously identified a small hairpin RNA (shRNA) targeted against GCL, catalytic subunit that, in cultured neurons, triggered spontaneous oxidative stress. We have implemented RNAi strategy in vivo to produce a double-conditional mouse expressing the GCL shRNA in the cells of the central nervous system, particularly hippocampal neurons, to recreate oxidative stress in vivo t tissue specific and inducible way. We used Cre-LoxP technology to create mice expressing shGCL in neurons in vivo, and they were characterized biochemically, immuno-histologically and behaviorally. We found a decrease in GCL, and an increase in oxidative markers. We also found sex-dependent effects in behavioural characterization for anxiety, motor ability and memory tasks. In conclusion, here we describe a novel strategy for studying oxidative stress in vivo in a tissue specific and time-controlled manner. This model may open new possibilities to study the involvement of elevated ROS in mental illnesses, such as Alzheimer's disease or anxiety, which are intrinsic to a number of psychiatric disorders including depression, panic attacks, phobias, obsessive-compulsive disorder and post-traumatic stress; however, these diseases currently lack of appropriate in vivo models for research on new therapeutic strategies. Furthermore, since we designed the genetic tool with two unique restriction sites flanking the shRNA sequence, new transgenic mice models could be straightforward generated to knockdown any other protein tissue-specifically in vivo. We believe that the transgenic mouse model herein described may be useful for a better understanding of the consequences of oxidative stress in specific cells in vivo, as well as for assessing novel pharmacological approaches.

[es] Los efectos nocivos de las especies reactivas de ox?geno (ROS) se producen durante la vida adulta , y se ha sugerido que el exceso de ROS- estr?s oxidativo puede ser un factor que contribuye a los procesos neurodegenerativos . El glutati?n ( GSH ) es uno de los m?s abundantes antioxidantes y , en enfermedades neurol?gicas tales como la enfermedad de Parkinson o trastornos mentales , la deficiencia de GSH es el conocido indicador bioqu?mico m?s temprana de degeneration.This neuronales observaci?n ha llevado a la sugerencia de que el estr?s oxidativo puede estar detr?s de la causas de la disfunci?n neuronal asociada con estos trastornos neurol?gicos . Desafortunadamente , debido a la falta de una herramienta suficientemente robusto , el efecto espec?fico de la deficiencia de GSH en la patog?nesis de enfermedades neurol?gicas nunca se ha demostrado in vivo , por lo tanto el papel real de GSH estr?s oxidativo p?rdida mediada en estos trastornos sigue siendo dif?cil de alcanzar . El glutati?n es un trip?ptido ( g - glutamylcysteinilglycine ) sintetizado por dos reacciones dependientes de ATP consecutivos . El glutamato - ciste?na ligasa ( GCL o sintetasa g - glutamilciste?na ; CE 6.3.2.2 ) cataliza la primera y limitante de la velocidad a paso , formando g - glutamilciste?na a partir del glutamato y ciste?na . Esto es seguido por la glutati?n sintetasa (CE 6.3.2.3 ) - reacci?n catalizada , que se une a G glicina - glutamilciste?na , la formaci?n de glutati?n . GCL es una enzima heterodim?rica compuesta de un catalizador (pesado , 73 kDa ) y un modulador ( luz, 27,7 kDa ) subunidad . Estudios realizados con purificada GCL han demostrado que el sitio activo reside en la subunidad catal?tica , mientras que la subunidad modulador aumenta la afinidad de la subunidad catal?tica para el glutamato y disminuye la sensibilidad a la inhibici?n por retroalimentaci?n por GSH . En el cerebro , donde - a lo mejor de nuestro , actividad GCL conocimiento - la enzima no ha sido purificada es muy d?bil , aunque es m?s alta en astrocitos en comparaci?n con neurons.This contribuye a la mayor resistencia de los astrocitos , en comparaci?n con las neuronas , contra el estr?s oxidativo . Los astrocitos cooperan con las neuronas de la bios?ntesis de GSH neuronal antioxidante mediante el suministro de los precursores de GSH . Por lo tanto , ya sea limitando el suministro de los precursores , o la capacidad de las neuronas para usarlos , provoca el estr?s oxidativo en las neuronas que conducen a la neurodegeneraci?n , por lo menos en la cultura . Esto nos ha llevado a la hip?tesis de que desmontables neuronal espec?fica y controlada temporalmente de GCL in vivo puede provocar una disfunci?n neurol?gica espont?nea , lo que posiblemente imitando los problemas neurol?gicos asociados con el Parkinson o las enfermedades mentales y potencialmente ?til para la identificaci?n de prote?nas redox-sensibles novedosos involucrado en trastornos neurol?gicos . Los modelos existentes in vivo para el estudio de GCL , subunidad catal?tica , la deficiencia en el cerebro son escasos y fracasaron. Ratones knockout homocigotos contra GCL , subunidad catal?tica , no son viables m?s all? del d?a 8 de embriones , y los heterocigotos presentan mecanismos de compensaci?n como el aumento de la bios?ntesis de ascorbato. Adem?s , este sistema gen?tico disponible no knockout tejido GCL espec?ficamente o temporalmente controlada , siendo por tanto inadecuados para investigar el papel del estr?s oxidativo en el sistema nervioso central durante la edad adulta . Nos hab?amos identificado previamente una peque?a horquilla de ARN ( shRNA ) dirigido contra GCL , subunidad catal?tica de que, en las neuronas cultivadas, desencadena el estr?s oxidativo espont?neo. Hemos implementado estrategia de ARNi in vivo para producir un rat?n de doble condicional que expresa la GCL shRNA en las c?lulas del sistema nervioso central , en particular las neuronas del hipocampo , para volver a crear el estr?s oxidativo in vivo t tejido de manera espec?fica y en inducible . Utilizamos la tecnolog?a Cre - LoxP para crear ratones que expresan shGCL en las neuronas in vivo , y se caracterizaron bioqu?micamente , inmuno - histol?gica y comportamiento. Se encontr? una disminuci?n en la GCL , y un aumento de los marcadores oxidativos . Tambi?n encontramos efectos dependientes del sexo en la caracterizaci?n del comportamiento para las tareas de ansiedad , la capacidad motora y memoria. En conclusi?n , aqu? se describe una estrategia novedosa para el estudio de estr?s oxidativo in vivo de una manera espec?fica y controlada en el tiempo el tejido . Este modelo puede abrir nuevas posibilidades para el estudio de la implicaci?n de los elevados de ROS en las enfermedades mentales , como la enfermedad o la ansiedad de Alzheimer, que son intr?nsecos a una serie de trastornos psiqui?tricos como la depresi?n , ataques de p?nico , fobias, trastorno obsesivo -compulsivo y el estr?s postraum?tico , sin embargo , estas enfermedades carecen actualmente de apropiado en modelos in vivo para la investigaci?n de nuevas estrategias terap?uticas. Adem?s, puesto que hemos dise?ado la herramienta gen?tica con dos sitios de restricci?n ?nicos que flanquean la secuencia de ARNhc , nuevos modelos de ratones transg?nicos podr?an ser sencilla generada a desmontables cualquier otra prote?na espec?fica de tejido in vivo . Creemos que el modelo de rat?n transg?nico aqu? descrito puede ser ?til para una mejor comprensi?n de las consecuencias del estr?s oxidativo en c?lulas espec?ficas in vivo , as? como para la evaluaci?n de nuevos enfoques farmacol?gicos.