[en] The potential health benefits of human milk oligosaccharides (HMO) have been studied for many years. It is well known that these oligosaccharides provide a protective barrier and nutritive support that infants with poor access to breast milk do not acquire in the first years of life. Human milk is considered to be unique among mammals in terms of the quantity and complexity of its oligosaccharides. To date, 130 chemical structures within HMO have been identified. No other natural resources provide access to these complex oligosaccharides in such large amounts, and until now, large scale synthesis of HMO has not been possible by any traditional organic chemistry methodology. Enzymatic synthesis is an alternative synthetic tool since enzymes can form the new glycosidic linkage between carbohydrates with high regio- and stereoselectivity. The objective of this thesis is to evaluate the use of Lacto-N-biosidase from Bifidobacterium bifidum (LnbB) as an efficient biocatalyst in the following two ways: i) the structural-functional study of LnbB and ii) protein engineering of LnbB to generate biocatalysts able to synthesize the target lacto-N-tetraose. Here, we have analysed the domain organization of GH20 enzymes, and accordingly, have defined two models of domain architectures. Model A, contains at least two domains, a non-catalytic GH20b domain, and the catalytic GH20 which is always accompanied with an extra α-helix. In contrast, Model B consists only of the catalytic GH20 domain. By expressing different truncated forms of LnbB, we have described the structural requirements for functionality of GH20 enzymes, and in particular for LnbB, to obtain a minimal functional unit that retains the enzymatic activity. With regard to the synthesis of lacto-N-tetraose using new engineered LnbB proteins as biocatalysts, we envisage two different enzymatic strategies. First, the glycosynthase strategy, in which the activated donor is the corresponding synthetic sugar oxazoline and the enzyme, a mutant on the assisting residue, is able to transfer the donor to an acceptor without hydrolysis of the product. Second, the enhanced transglycosidase strategy, in which, a new generation of mutants on the acceptor subsites of the enzyme will be able to more favourably accommodate a sugar acceptor instead of water, and thus, increase transglycosylation activity.

[es] Los efectos beneficiosos que los oligosacáridos de la leche materna (OLM) confieren a la salud de los lactantes se han estudiado durante años. Estos oligosacáridos proporcionan una barrera protectora y un soporte nutritivo esenciales, a los que, los niños que no toman leche materna no tienen acceso. La leche humana se considerada única respecto al resto de leches de mamíferos en cuanto a cantidad y complejidad de oligosacáridos. Actualmente, se han identificado más de 130 estructuras químicas diferentes de OLM, y no se dispone de ningún recurso natural que proporcione acceso a estas estructuras tan complejas y en cantidad suficiente. Del mismo modo, la síntesis química es complicada debido a la estructura tan compleja y diversa que presentan los OLM, y por el momento, la síntesis en gran escala no ha sido posible. La síntesis enzimática, en cambio, se presenta como una herramienta alternativa de síntesis de éstas moléculas complejas dado que, en la naturaleza las enzimas son las responsables de formar enlaces glicosídicos entre carbohidratos con alta regio- y estereoselectividad. El objetivo de esta tesis es evaluar el uso del enzima Lacto-N-biosidase de Bifidobacterium bifidum (LnbB) como un biocatalizador eficiente desde dos perspectivas diferentes: i) el estudio estructural-funcional de LnbB y ii) la generación de biocatalizadores capaces de sintetizar el oligosacárido de interés (lacto-N-tetraosa) mediante ingeniería de proteínas en el enzima LnbB. En esta tesis, hemos analizado la organización de los dominios de enzimas GH20, y, en consecuencia, hemos definido dos modelos de arquitecturas de dominio. El Modelo A contiene al menos dos dominios, un dominio GH20b no catalítico y el GH20 catalítico, que siempre se presenta acompañado de una α-hélice extra. Por el contrario, el Modelo B consiste únicamente en el dominio catalítico GH20. Mediante la expresión de diferentes formas truncadas de LnbB, hemos descrito los requerimientos estructurales para la funcionalidad de las enzimas GH20, y en particular para LnbB, de modo que se obtenga la unidad funcional mínima que conserve la actividad enzimática. Respecto a la síntesis de la lacto-N-tetraosa usando como biocatalizador nuevas proteínas de LnbB obtenidas mediante ingeniería, hemos contemplado dos estrategias enzimáticas diferentes. En primer lugar, la estrategia de glicosintasa, en la que el enzima (un mutante en el residuo asistente) es capaz de transferir el correspondiente dador activado (azúcar sintético derivado de oxazolina) a un aceptor, sin hidrólisis del producto. En segundo lugar, la estrategia de transglicosilación mejorada, en la que, una nueva generación de mutantes en los sitios de unión al aceptor serán capaces de acomodar de manera más favorable un aceptor de azúcar en lugar de una molécula de agua, y de este modo, aumentar la actividad de transglicosilación.