[ca] Aquesta tesi s'enfoca en la caracterització estructural i funcional de les propietats biològiques de les RNases antimicrobianes de la superfamília de la RNasa A. Concretament, s'han assolit els següents objectius a curt termini: La caracterització estructural i funcional de la RNasa 6 per cristal·lografia de raigs X, dinàmica molecular, mutagènesi dirigida i anàlisis enzimàtics destaca el paper clau de les regions remotes d'unió al substrat. A part, hem identificat un possible segon centre actiu en la RNasa 6. Finalment, un estudi evolutiu dels diversos membres de la superfamília de la RNasa A ha revelat una tendència clara, al llarg de l'evolució en vertebrats, des de la preferència de guanina cap a la d'adenina en l'arquitectura de la regió secundària d'unió a bases B2. Al llarg del treball experimental realitzat en aquesta tesi, hem buscat la caracterització del mecanisme d'acció bactericida de les RNases, una de les principals línies de recerca del nostre grup de recerca. En aquest treball, ens hem enfocat específicament en l'optimització del pèptid antimicrobià derivat de l'N-terminal de la RNasa 3, ECP(5-17P24-36), i en el disseny d'una RNasa quimèrica antimicrobiana (RNasa 3/1). Respecte el pèptid ECP(5-17P24-36), s'ha optimitzat mitjançant diverses metodologies, arribant a la conclusió que el millor candidat antimicrobià és el seu enantiòmer total D-ECP(5–17P24–36). Pel que fa a la RNasa 3/1, aquesta incorpora les característiques estructurals de les RNases 1 i 3, combinant així la seva elevada activitat catalítica i bactericida, respectivament. Es va dissenyar un primer constructe amb èxit, malgrat que no presentava els mateixos nivells d'activitat bactericida que la RNasa 3. Aleshores, vam dissenyar dues versions noves de la RNasa 3/1 que incorporaven el loop C-terminal de la RNasa 3, en el qual es va identificar un motiu estructural específic associat al reclutament de l'autofagosoma. És interessant destacar la capacitat de la primera versió de la quimera RNasa 3/1 d'endarrerir l'adquisició de resistència a la colistina en un assaig evolutiu in vitro d'exposició a la colistina en cultius d'Acinetobacter baumannii. En global, aquests resultats ajudaran a elucidar el mode d'unió a l'RNA de les ribonucleases i el seu mecanisme antimicrobià, així com la seva contribució en el sistema immunitari innat, amb prometedores aplicacions farmacològiques.

[en] This thesis project focuses on the structural-functional characterization of the biological properties of antimicrobial RNases from the RNase A superfamily. Specifically, the following short-term goals have been achieved: Structural and functional characterization of RNase 6 by X-ray crystallography, molecular dynamics, site-directed mutagenesis and enzymatic analysis have highlighted the key role of remote binding subsites. Besides, we have identified in RNase 6 a putative novel secondary active site. In addition, an evolutionary study of several members of the RNase A superfamily have revealed a clear drift from guanine to adenine preference at the secondary base binding site (B2) architecture along vertebrate evolution. During this thesis' experimental work, we have pursued the characterization of RNases' bactericidal mechanism of action, a long-term object of study in our research group. Here, we have specifically focused on the optimisation of the antimicrobial peptide derived from RNase 3, ECP(5-17P24-36), and the design of a chimeric antimicrobial RNase (RNase 3/1). Regarding the N-terminus peptide ECP(5-17P24-36), it has been optimised by several methodologies. We have concluded the best antimicrobial candidate to be its total enantiomer, D-ECP(5-17P24-36). As for RNase 3/1, this chimera encompasses structural features from RNases 1 and 3 parental proteins to combine both high catalytic and bactericidal activities. A first construct was successfully achieved, albeit not reaching the bactericidal activity levels of RNase 3. Therefore, we designed two more versions of RNase 3/1 that incorporate the RNase 3 C-terminus loop. A specific tag motif was identified in that region associated to autophagosome recruitment. Interestingly, the hybrid chimera RNase 3/1 was able to delay the acquisition of bacterial resistance to colistin using an in vitro evolutionary exposure assay in Acinetobacter baumannii cultures. Overall, the results shed light on the elucidation of substrate binding architecture and antimicrobial mechanism of action of RNases and their contribution to the innate immune system, with promising pharmacological applications.