[en] In the acute myocardial infarct, the ischemic tissue dies unless coronary flow is restored. However, flow restoration causes by itself the death of cardiomyocytes which have survived the ischemic period reducing the benefits of reperfusion. This phenomenon, known as lethal reperfusion injury, consists in necrotic cell death ocurring at the onset of reperfusion and whose extension depends on the duration of the ischemic period. Cytosolic Ca2+ overload is one of the main determinants of reperfusion injury. Ca2+ contributes to necrosis induction through different mechanisms including hypercontracture, mytochondrial dysfunction and activation of enzymes such as calpains. Calpains are Ca2+-dependent proteases and their activation increases sarcolemmal fragility in ischemia/reperfusion. This increase in the membrane fragility facilitates sarcolemmal rupture by means of degradation of structural proteins such as fodrin, which forms membrane cytoskeleton backbone. Calpains also participate in endogenous cardioprotection mechanisms, like ischemic preconditioning, which inhibits these proteases and reduces sarcolemmal fragility. The first part of this thesis characterizes the mechanisms regulating calpain activity during ischemia/reperfusion. The results demonstrate that calpains activate during reperfusion while translocation to membrane is observed during ischemia; the possibility of translocation implying a preactivation state is ruled out as calpains activation during reperfusion is not inhibited by reduction of their translocation. In a Ca2+ overload model without ischemia, intracellular acidosis prevents calpains activity, demonstrating that low pH is one of the factors inhibiting calpains during ischemia. These results show that calpains are activated exclusively during reperfusion and their pharmacological inhibition after ischemia could be an effective strategy against reperfusion injury. In the second part a new reperfusion injury mechanism mediated by calpains is proposed. Their activity during reperfusion proteolyzes fodrin and ankyrin, causing the disanchorage of Na+/K+-ATPase ± subunits from the membrane cytoskeleton and the reduction in the activity of the pump. Na+/K+-ATPase dysfunction during the first minutes of reperfusion impairs the normalization of the Na+ gradient, favouring more Ca2+ entry through the Na+/Ca2+ exchanger and resulting in Ca2+-dependent cell death. The third part studies the role of calpains in cardioprotection. Initially, it is demonstrated that ischemic preconditioning protects Na+/K+-ATPase function through calpains inhibition, improving Na+ recovery kinetics during the first minutes of reperfusion and reducing cell death. Furthermore, our results demonstrate that a delay in intracellular pH recovery is essential for the cardioprotective effects of ischemic postconditioning. Prolongation of acidosis at the onset of reperfusion prevents calpain activation and this effect explains, at least in part, the cardioprotective effects of postconditioning. Finally, pharmacological inhibition of calpains exclusively during reperfusion protects the myocardium at risk in an in vivo rat experimental model, proving the potential of calpains as therapeutical targets aimed to reduce myocardial infarct size. In conclusion, the results presented in this thesis provides evidence of an important role of calpains in reperfusion injury and demonstrates that their inhibition is a potentially useful strategy to limit infarct size.

[es] En el infarto agudo de miocardio el tejido isquémico no sobrevive a no ser que se restaure el flujo coronario. Sin embargo, esta restauración del flujo causa por sí misma la muerte de cardiomiocitos que han sobrevivido al periodo isquémico, reduciendo notablemente los beneficios de la reperfusión. Este fenómeno, conocido como daño letal por reperfusión, se caracteriza por una muerte celular de tipo necrótico que tiene lugar principalmente en los primeros minutos de la reperfusión y cuya extensión depende de la duración del episodio isquémico. La sobrecarga de Ca2+ citosólico es uno de los principales determinantes del daño por reperfusión. El Ca2+ contribuye a la inducción de necrosis a través de tres mecanismos principales: la hipercontractura, la disfunción mitocondrial y la activación de enzimas como las calpaínas. Las calpaínas son proteasas dependientes de Ca2+ cuya activación aumenta la fragilidad del sarcolema en la isquemia/reperfusión. Esta fragilidad facilita la ruptura del sarcolema mediante la degradación de proteínas estructurales como la fodrina, que forma la base del citoesqueleto de membrana. Las calpaínas también participan en mecanismos endógenos de protección como el precondicionamiento isquémico, que inhibe estas proteasas y reduce la fragilidad sarcolemal. La primera parte de esta tesis evalúa la idoneidad de las calpaínas como diana terapéutica en un modelo de corazón aislado de rata. En este trabajo se descarta por primera vez la activación de las calpaínas durante la isquemia, situación que haría inútil cualquier tratamiento realizado durante la reperfusión. En cambio se observa translocación de la m-calpaína a membrana durante la isquemia; la posibilidad de que este fenómeno implicara un estado de preactivación es descartada al no inhibirse su activación durante la reperfusión cuando se inhibe su translocación. En un modelo de sobrecarga de Ca2+ sin isquemia la acidosis inhibe la actividad de las calpaínas, demostrándose que la acidosis es uno de los factores que previenen su activación durante la isquemia. Estos resultados indican que las calpaínas se activan exclusivamente durante la reperfusión y su inhibición farmacológica postisquémica podría ser una estrategia eficaz frente al daño por reperfusión. La segunda parte propone un nuevo mecanismo de daño por reperfusión mediado por las calpaínas. Su actividad durante la reperfusión provoca la degradación de fodrina y anquirina, dando lugar a la disociación de las subunidades ± de la Na+/K+-ATPasa del citoesqueleto de membrana y con ello a una disminución en su actividad. La reducida actividad de la Na+/K+-ATPasa impide una rápida normalización del gradiente de Na+, favoreciendo la entrada de Ca2+ a través del intercambiador Na+/ Ca2+ y por tanto la muerte por reperfusión. La tercera parte estudia el papel de las calpaínas en la cardioprotección. Por un lado demuestra que el precondicionamiento isquémico a través de la inhibición de las calpaínas protege la función de la Na+/K+-ATPasa, mejorando la cinética de recuperación del Na+ en el inicio de la reperfusión y reduciendo la muerte celular. Por otro lado se demuestra que el retraso en la normalización del pH intracelular es esencial en la cardioprotección otorgada por el postcondicionamiento isquémico, y que uno de los efectos de la prolongación de la acidosis en la reperfusión es la inhibición de las calpaínas, cuya actividad se correlaciona con la muerte celular. Finalmente, la inhibición farmacológica de las calpaínas exclusivamente en la reperfusión protege el miocardio en riesgo en un modelo de rata in vivo, demostrando el potencial de las calpaínas como diana terapéutica dirigida a reducir el tamaño del infarto. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis demuestran la importancia de las calpaínas en el daño por reperfusión así como la posible utilidad terapéutica de su inhibición en el infarto agudo de miocardio.