[en] Activation of the Tumor Necrosis Factor Receptor 1 (TNFR1) by its ligand TNFα induces cell death through recruitment of a Death Inducing Signaling Complex (DISC) containing caspase-8 and the adaptor proteins FADD, TRADD, TRAF2 and RIP. This complex causes the cleavage and activation of caspase-8 that leads to apoptosis. However, TNFR1 can also trigger activation of signaling pathways related to cell survival and differentiation, such as the transcription factor NF-kB or MAPK/ERK. In fact, in most cell types it has been shown that survival signaling by TNFα needs to be abrogated in order to induce apoptotic cell death. This has been classically achieved by co-treatment with protein synthesis inhibitors such as Actinomycin D or Cycloheximide, or by direct inhibition of the NF-kB pathway through chemical inhibitors or overexpression of a non-degradable form of IkBα. A previous report in our lab revealed that Actinomycin D sensitizes PC12 cells and cortical neurons to TNFα- induced apoptosis through down-regulation of the antiapoptotic protein Bcl-XL. However, the results showed that this effect was independent of NF-kB or other antiapoptotic proteins such as FLIP-L or IAPs. This thesis analyses the activation of survival pathways by TNFα. In particular, I have established a link between the activation of NF-kB and the MAPK/ERK pathway. I have used PC12 cells, a wellknown model of neuronal cells. Inhibition of the NF-kB pathway in these cells induced a downregulation of the antiapoptotic FLIP-L. My results indicate that TNFα-induced activation of the MAPK/ERK pathway depends on FLIP-L. Furthermore, this signaling cascade does not involve the classical activation of the upstream effector Ras. However, the MAPKKK Raf-1 is necessary to induce ERK1/2 phosphorylation, thus suggesting that FLIP-L subtitutes Ras in this function. The results of this thesis also demonstrate that the MAPK/ERK pathway affords protection from TNFα-induced apoptosis, since abrogation of this signaling cascade renders PC12 sensitive to cell death induced by TNFα in a manner similar to sensitization achieved by NF-kB inhibition. Characterization of the apoptotic pathway shows the implication of JNK, which is necessary to induce cell death when NF-kB is blocked and when MAPK/ERK is inhibited. Moreover, JNK induces the upregulation of Bim, a BH3-only protein classically linked tot the induction of apoptosis. Altogether, this thesis establishes the relevance of the MAPK/ERK pathway as a negative regulator of TNFα-induced apoptosis. Importantly, the results obtained reveal that NF-kB is crucial for the induction of ERK1/2 phosphorylation by TNFα, and that this pathways are linked through the antiapoptotic protein FLIP-L.

[es] La activación del Receptor del Factor de Necrosis Tumoral de tipo 1 (TNFR1) por parte de su ligando específico, TNFα, induce la muerte celular mediante la formación de un complejo de señalización inductor de muerte (DISC) que contiene caspasa-8 junto con las proteína adaptadoras FADD, TRADD, TRAF2, y RIP. Este complejo provoca la activación de caspasa-8 que lleva a la apoptosis. Sin embargo, TNFR1 también puede iniciar la activació de vías de señalización relacionadas con la superviviencia celular y la diferenciación, tales como el factor de transcripción NF-kB o la vía MAPK/ERK. De hecho, en la mayoría de tipos celulares se ha demostrado que la señalización de supervivencia iniciada por TNFα debe ser bloqueada para inducir la muerte celular apoptótica. Esto se ha conseguido clásicamente mediante el cotratamento con inhibidores de la síntesis proteíca como Actinomicina D o Cicloheximida, o mediante la inhibición directa de la vía de NF-kB a través de inhibidores químicos o la sobreexpresión de una forma no degradable de IkBα. Un trabajo previo de nuestro própio laboratorio reveló que la Actinomicina D sensibiliza las células PC12 y las neuronas corticales a la apoptosis inducida por TNFα a través de una disminución en la expression de la proteína antiapoptótica Bcl-XL. No obstante, les resultados demostraron que este efecto era independiente de NF-kB o de otras proteínas antiapoptóticas como FLIP-L o las IAPs. En esta tesis se analiza la activación de vías de supervivencia por parte de TNFα. En particular, he establecido una relación entre la activació de NF-kB y la vía de MAPK/ERK. He utilizado la línea celular PC12, un modelo bien establecido de células neuronales. La inhibición de la vía de NF-kB en estas células indujo la reducción de la expression de FLIP-L. Mis resultados indican que la activación de la vía MAPK/ERK depende de FLIP-L. Además, esta cascada de señalización no implica la clásica activación de Ras, la proteina efectora que actúa por encima en la vía. Sin embargo, la MAPKKK Raf-1 es necesaria para inducir la fosforilación de ERK1/2, lo que sugiere que FLIP-L podria substituir a Ras en su función. Los resultados de esta tesis también demuestran que la vía MAPK/ERK protege a las células de la apoptosis inducida por TNFα, dado que la inhibición de esta señalización sensibiliza las células PC12 a la muerte celular inducida por TNFα de forma similar a la sensibilización conseguida mediante la inhibición de NF-kB. La caracterización de esta señalización apoptótica muestra la implicación de JNK, que es necesaria para inducer la muerte celular cuando NF-kB está bloqueado y cuando se inhibe MAPK/ERK. Es más, JNK induce un aumento en la expresión de Bim, una proteina BH3-only relacionada clásicamente con la apotosis. En resumen, esta tesis establece la relevancia de la vía MAPK/ERK como regulador negativo de la apoptosis inducida por TNFα. Es importante destacar que los resultados obtenidos revelan que NF-kB es crucial para la inducción de la fosforilación de ERK1/2 por TNFα, y que estas vías de señalización estan relacionadas a través de la proteína antiapoptótica FLIP-L.