[en] Autologous T cells expressing chimeric antigen receptors (CARs) have been approved as advanced therapy medicinal products (ATMPs) against several type B malignancies. However, a main drawback comes from their autologous nature which limits the amount of patients that can be treated and precludes its standardization. Allogeneic CAR-T cells are an alternative to simplify this complex and time-consuming process. In this Doctoral Thesis, we have studied the feasibility (efficacy and safety) of TCR knockdown (TCRKO) to generate universal allogeneic CAR-T cells. In addition, we have investigated metabolic intervention with small molecules as a way to improve CAR-T cell products, including TCRKO CAR-T cells. Specifically, the work carried out has been divided into two main objectives: Determination of genome editing efficacy and safety to generate Universal CAR-T cells. For this, we had the collaboration of Dr Manel Juan who donated the CAR ARI-0001, a second generation αCD19 CAR approved by the Spanish Agency for Medicines and Medical Devices (AEMPS) within the framework of Hospital Exemption for the treatment of patients older than 25 years with Relapsed/Refractory acute B cell lymphoblastic leukemia (R/R B-ALL). First, the efficacy and potential safety concerns that arise after disruption of the TRAC locus using the CRISPR/Cas9 system were analyzed. We show that the use of CRISPR/Cas9 delivered as ribonucleoparticles (RNPs) allows highly efficient TCR depletion (over 80%) without significant alterations in T cell phenotype. However, we have also found that efficient TCRKO can lead to on-target large deletions in the genome, indicating a potential risk of this procedure. As expected, TCR elimination of ARI-CAR-T cells efficiently prevented allogeneic responses. Importantly, the procedure did not significantly alter ARICAR- T cell phenotype, while maintaining a similar antitumor activity ex vivo and in vivo compared to unedited ARI-CAR-T cells (WT ARI-CAR-T cells). These results demonstrate that, although some risks of genotoxicity still exist, TRAC disruption is a feasible strategy for the generation of functional universal ARI-CAR-T cells. In this sense, our next step will be to validate the process under escalation and good manufacturing practices (GMP) to propose a clinical trial and/or hospital exemption for the treatment of patients with type B lymphomas or leukemias who have no other options and who can not access commercial CAR-T therapy. Metabolic intervention with small molecules to favour CAR-T products enriched in memory T cells. On the other hand, in this thesis we have also tried to address one of the problems that current CAR-T therapies encounter: their exhaustion/lack of persistence before eliminating all the tumor cells in patients, especially important in allogeneic CAR-T cell therapies. In this direction, there is strong evidence that a greater presence of memory T cells, with a high capacity for selfrenewal and pluripotency (T stem cell memory, TSCM), is directly correlated with a better therapeutic response. Based on these studies, we entered in collaboration with Prof. Pedro Romero, who had developed various procedures to reprogram T cell phenotype through metabolic intervention. In this direction, we studied whether metabolic intervention during ex vivo expansion could be a method to improve the antitumor activity of allogeneic TCRKO CAR-T cells. Specifically, we evaluated two inhibitors, one for the mitochondrial enzyme isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) and another for the mitochondrial pyruvate transporter (MPC). These studies revealed an increase in TSCM phenotype in WT and TCRKO ARI-CAR-T cells treated with the inhibitor for MPC (MPCi), although not with the inhibitor for IDH2 (IDHi). MPC inhibition did not compromise CAR-T cell expansion or cytokine production. ARI-CAR-T cells pre-treated with MPCi showed a higher antitumor effector function which varies depending on the model used. This variability in increasing efficacy needs to be investigated in animal models and, based on the results, we will propose its future application in protocols for the generation of allogeneic CART cells.

[es] Las células T autólogas modificadas con receptores de antígeno quiméricos (CARs) han sido aprobadas como medicamentos de terapia avanzada (ATMPs) contra varias neoplasias malignas de tipo B. Sin embargo, su naturaleza autóloga impide su aplicación a todos los pacientes que la necesiten, así como la estandarización de esta terapia. Las células CAR-T alogénicas son una alternativa para simplificar este proceso complejo y lento. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado la viabilidad (eficacia y seguridad) de la eliminación del TCR (TCRKO) para generar células CAR-T alogénicas universales. Además, hemos investigado la intervención metabólica con moléculas pequeñas como una estrategia para mejorar los productos de células CAR-T, incluidas las células TCRKO CAR-T. En concreto, el trabajo realizado se ha dividido en dos bloques principales: Determinación de la eficacia y seguridad de la edición genómica para generar células CAR-T universales. Para ello se contó con la colaboración del Dr Manel Juan y su donación del CAR ARI-0001, un CAR αCD19 de segunda generación aprobado por la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS) en el marco de la Exención Hospitalaria para el tratamiento de pacientes mayores de 25 años con leucemia linfoblástica aguda de células B Recidivante/Refractaria (R/R LLA-B). En primer lugar, se analizó la eficacia y los potenciales problemas de seguridad que surgen tras la interrupción del locus TRAC utilizando la tecnología CRISPR/Cas9. Demostramos que el uso de CRISPR/Cas9 entregado como ribonucleopartículas (RNPs) permite una depleción en la expresión del TCR altamente eficiente (más del 80%) sin alteraciones significativas en el fenotipo de las células T. Sin embargo, también encontramos que la edición del locus TRAC puede conducir a grandes deleciones en el genoma, lo que indica un potencial riesgo de este procedimiento. Tal y como se esperaba, la eliminación del TCR en las células ARI-CAR-T impidió eficientemente las respuestas alogénicas. Además, el procedimiento utilizado no alteró de manera significativa su fenotipo, manteniendo una actividad antitumoral similar ex-vivo e in vivo en comparación con células ARI-CAR-T sin editar (WT ARI-CAR-T cells). Estos resultados demuestran que, aunque todavía existen algunos riesgos de genotoxicidad, la interrupción del TRAC es una estrategia factible para la generación de células ARI-CAR-T universales y funcionales. En este sentido, nuestro siguiente paso será validar el proceso en condiciones de escalado y buenas prácticas de fabricación (GMP) para proponer un ensayo clínico y/o exención hospitalaria para el tratamiento de pacientes con linfomas o leucemias tipo B que hayan agotado otras opciones y que no puedan acceder al tratamiento con CAR-T comerciales. Intervención metabólica con pequeñas moléculas para favorecer productos CAR-T enriquecidos en células T memoria. Por otro lado, en esta tesis también intentamos abordar uno de los problemas con los que se encuentran las terapias CAR-T actuales: su agotamiento/falta de persistencia antes de eliminar todas las células tumorales en los pacientes, especialmente importante en la terapia con células CAR-T alogénicas. En esta dirección, existe fuerte evidencia de que una mayor presencia de células T memoria, con alta capacidad de autorrenovación y pluripotencialidad (células T madre memoria, TSCM), se correlaciona directamente con una mejor respuesta terapéutica. En base a estos trabajos, entramos en colaboración con el Prof. Pedro Romero, desarrollador de diversos procedimientos para reprogramar el fenotipo de las células T mediante intervención metabólica. En esta dirección estudiamos si la intervención metabólica durante la expansión ex vivo podría ser un método para mejorar la actividad antitumoral de las células TCRKO CAR-T alogénicas. En concreto, evaluamos dos inhibidores, uno para la enzima mitocondrial isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) y otro para el transportador mitocondrial de piruvato (MPC). Estos estudios relevaron un incremento en el fenotipo TSCM en células WT y TCRKO ARI-CAR-T tratadas con el inhibidor para MPC (MPCi), aunque no con el inhibidor para IDH2 (IDH2i). La inhibición de MPC no comprometió la expansión de las células CAR-T ni la producción de citoquinas. Las células ARI-CAR-T pre-tratadas con el MPCi mostraron una función efectora antitumoral superior, pero variable en función del modelo utilizado. Esta variabilidad en el incremento de la eficacia precisa ser investigada en modelos animales y, en función de los resultados, propondremos su futura aplicación en protocolos de generación de células CAR-T alogénicas.