[ca] Els mitocondris necessiten mantenir un contingut en dNTPs adequat per a garantir els processos de replicació i reparació del mtDNA. Per tal d'assegurar la disponibilitat d'aquests dNTPs, les cèl·lules eucariotes disposen de dues vies anabòliques diferenciades: la síntesi de novo i la ruta de salvament. Les mutacions en gens nuclears que comporten una pertorbació de l'homeòstasi de dNTPs s'associen a defectes en el manteniment del mtDNA, donant lloc a alteracions en la seva quantitat i qualitat. Tradicionalment s'ha adoptat la idea que totes les espècies de dNTPs es troben en proporcions similars i principalment solubilitzades de forma lliure en la matriu mitocondrial, on són disponibles per a les polimerases i altres enzims que participen en els processos de replicació i reparació del mtDNA. No obstant això, nosaltres hem observat que el dGTP està significativament sobrerepresentat en comparació amb la resta de dNTPs en els mitocondris de cèl·lules humanes i de teixits de ratolí. A més, el dGTP hi apareix majoritàriament associat a proteïna, concretament al complex I de la cadena respiratòria, a través de la seva subunitat NDUFA10. NDUFA10 és una subunitat accessòria de complex I per a la qual no s'hi ha descrit una funció específica, però que resulta essencial per al correcte acoblament de l'holoenzim. No obstant això, la NDUFA10 comparteix el domini funcional dNK (domini dNK, PFAM PF01712) amb diverses les desoxirribonucleòsid quinases que participen a la ruta de salvament per a la síntesi de dNTPs, com ara la TK2, dCK o dGK, amb les quals també comparteix una alta identitat de seqüència. Tots aquests enzims catalitzen la fosforilació dels desoxirribonucleòsids utilitzant ATP com a donador de fosfat. Tanmateix, no s'ha descrit cap activitat quinasa associada a la NDUFA10 o al complex I. A partir dels resultats anteriors, vam generar diferents models experimentals per confirmar la unió del dGTP al complex I i aprofundir en l'estudi d'aquesta interacció. Mitjançant la introducció de mutacions dirigides a la NDUFA10 de línies cel·lulars humanes hem localitzat el lloc d'unió del dGTP dins el domini dNK de la proteïna. A més, hem determinat que aquesta unió és altament específica i estable i es dóna en una proporció estequiomètrica 1: 1. D'altra banda, hem generat un model murí amb les mateixes mutacions en el domini dNK de NDUFA10 que havíem introduït en cèl·lules humanes (Ndufa10E160A; R161A / E160A; R161A o NDUFA10KI). A diferència del que passa amb la proteïna humana, les mutacions introduïdes afecten l'estabilitat de la proteïna NDUFA10 murina, i en conseqüència a l'acoblament i funció del complex I. Els animals NDUFA10KI desenvolupen una cardiomiopatia hipertròfica que causa la seva mort entre les setmanes 25-30 de vida, probablement per una alteració greu de la funció oxidativa mitocondrial deguda a la desestabilització de NDUFA10 al cor. Curiosament, aquestes mutacions semblen tenir conseqüències diferents per a l'estabilitat de la proteïna i el complex I en funció de el teixit analitzat, afectant de forma més lleu al cervell. En qualsevol cas, la disrupció de la interacció NDUFA10-dGTP en els animals NDUFA10KI es tradueix en una dràstica reducció en el contingut mitocondrial de dGTP a tots els teixits estudiats, mentre que no s'observen efectes sobre la resta de dNTPs, el que ens permet confirmar in vivo que la interacció amb el dGTP es produeix a nivell del domini dNK de la NDUFA10. Com que afecta una proporció molt important del dGTP mitocondrial, la interacció descrita amb el complex I a través de la seva subunitat NDUFA10 podria suposar un nou mecanisme de control de la disponibilitat de dNTPs, la qual cosa suposa la primera relació directa descrita entre metabolisme oxidatiu i la síntesi de DNA.

[es] Las mitocondrias necesitan mantener un contenido en dNTPs adecuado para garantizar los procesos de replicación y reparación del DNA mitocondrial (mtDNA). Para asegurar la disponibilidad de estos dNTPs, las células eucariotas disponen de dos vías anabólicas diferenciadas: la síntesis de novo y la ruta de salvamento de dNTPs. Las mutaciones en genes nucleares que se traducen en una perturbación de la homeostasis de dNTPs se asocian a defectos en el mantenimiento del mtDNA, dando lugar a alteraciones en su cantidad y calidad. Tradicionalmente se ha adoptado la idea de que los dNTPs se encuentran en proporciones similares, y principalmente solubilizados de forma libre en la matriz mitocondrial, disponibles para polimerasas y otras enzimas que participan en los procesos de replicación y reparación del mtDNA. Sin embargo, encontramos que el dGTP está significativamente sobrerrepresentado frente al resto de dNTPs en mitocondrias de células humanas y tejidos de ratón. Además, el dGTP aparece mayoritariamente asociado a proteína, concretamente al complejo I de la cadena respiratoria, a través de su subunidad NDUFA10. La NDUFA10 es una subunidad accesoria del complejo I para la que no se ha descrito una función específica dentro del mismo, pero que resulta esencial para el correcto ensamblaje de la holoenzima. Sin embargo, la NDUFA10 comparte el dominio funcional dNK (dominio dNK, pfam PF01712) con varias de las desoxirribonucleósido quinasas que participan en la ruta de salvamento para la síntesis de dNTPs, como son la TK2, dCK o dGK, con las que también comparte una alta identidad de secuencia. Todas estas enzimas catalizan la fosforilación de los desoxirribonucleósidos usando ATP como donador de fosfato. Sin embargo, no se ha descrito ninguna actividad quinasa asociada a NDUFA10 o al complejo I. A raíz de estos resultados, generamos distintos modelos experimentales con la finalidad de confirmar la unión del dGTP al complejo I y profundizar en el estudio de dicha interacción. Mediante la introducción de mutaciones dirigidas en la NDUFA10 de líneas celulares humanas hemos localizado el sitio de unión del dGTP dentro del dominio dNK de la proteína. Además hemos determinado que esta unión es altamente específica y estable, y se da en una proporción estequiométrica de 1:1. Asimismo, hemos obtenido un modelo murino con las mismas mutaciones en el dominio dNK de NDUFA10 que habíamos introducido en células humanas (Ndufa10E160A;R161A/E160A;R161A o NDUFA10KI). A diferencia de lo que ocurre con la proteína humana, las mutaciones introducidas afectan a la estabilidad de la proteína NDUFA10 murina, y con ello al ensamblaje y función del complejo I. Los animales NDUFA10KI desarrollan una cardiomiopatía hipertrófica que causa su muerte entre las semanas 25-30 de vida, probablemente a causa de una alteración grave de la función oxidativa mitocondrial a consecuencia de la desestabilización de NDUFA10 en el corazón. Curiosamente, estas mutaciones parecen tener consecuencias distintas para la estabilidad de la proteína y el complejo I en función del tejido analizado, afectando de forma más leve al cerebro, por ejemplo. En cualquier caso, la disrupción de la interacción NDUFA10-dGTP en los animales NDUFA10KI se traduce en una drástica reducción en el contenido mitocondrial de dGTP en todos los tejidos estudiados, mientras que no se observa ningún efecto sobre el resto de dNTPs, lo que nos permite confirmar in vivo que la interacción con el dGTP se produce a nivel del dominio dNK de la NDUFA10. Al afectar a una proporción tan importante del dGTP mitocondrial, la interacción descrita con el complejo I a través de su subunidad NDUFA10 podría suponer un nuevo mecanismo de control de la disponibilidad de dNTPs, tratándose de la primera relación directa descrita entre metabolismo oxidativo y la síntesis de DNA.