[en] Apolipoprotein E [apoE] is a multifunctional protein, whose main function is the maintenance of lipid homeostasis, but that also affects many other physiological functions, including inflammation, immunity, antioxidant response, and other. The Apolipoprotein E gene [APOE], in chromosome 19q13.3, presents 3 main alleles, ɛ2, ɛ3 and ɛ4, which code for their respective isoforms apoE2, apoE3 and apoE4. These isoforms differ by an amino acid exchange in positions 112 or 158. While apoE3, the most common isoform, presents cysteine in position 112 and arginine in position 158, apoE2 the least common isoform presents cysteine in both positions and apoE4, which has a worldwide frequency of about 14%, presents arginine in both positions. This amino acid substitution changes the structure and function of the protein. In the case of apoE4, it presents gain of toxic functions and loss of normal functions that cause many pathological alterations. This makes APOE4 carriers more likely to develop many disorders, but especially Alzheimer's Disease [AD]. AD is the most common age-related neurodegenerative disorder. It causes a progressive decline in cognitive functions that eventually leave the individual completely dependent. Thus, AD causes great socio-sanitary, economic and personal burden. The sporadic form of AD is the most common and presents many risk factors. However, the main genetic risk factor is the presence of APOE4, which induces or increases several of the pathological alterations seen in AD, including processing and deposition of tau and amyloid beta [Aβ], oxidative and cellular stress and cell death. However, pathological alterations have been found even in individuals who are cognitively normal. Therefore, knowing the changes caused by APOE4 before the beginning of clinical symptoms might help to better understand the disease and to create better tools for prevention. The aim of this study is to conduct a 11-year prospective longitudinal study with a cohort of subjects carrying at least one APOE4 allele, and compare them with non-carriers. For that, we conducted a follow up of 24 APOE4 carriers (10 homozygous, 14 heterozygous), which had participated in the previous study. We further analyzed other 23 individuals; 15 of which did not have the APOE4 allele and were considered control group; the other 8 presented at least one allele (3 homozygous, 5 heterozygous) and were considered volunteers and evaluated only in cross-sectional analysis. We conducted individual interviews with the participants, and performed neuropsychological tests: The Rey Auditory Verbal Learning Test [RAVLT]; The Stroop Color Word test; The Memory Failures in Everyday questionnaire and The Hamilton Depression Rating Scale. Furthermore, blood samples were drawn and processed to analyze: whole blood reduced [GSH] and oxidized [GSSG] glutathione by spectrophotometry; plasma malondialdehyde [MDA] by High performance liquid chromatography [HPLC]; plasma Interleukin-1β and TNF-α levels by Enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA]; Cell death and reactive oxygen species by flow cytometry; protein expression of calcineurin, regulator of calcineurin 1 [RCAN1], glycogen synthase kinase-3 beta [GSK3β], p38 mitogen-activated protein kinases [p38], phosphorylated-p38 [p-p38] and tau phosphorylated at threonine 231 [p-Tau231] with western blotting [WB]; and gene expression of calcineurin, RCAN1, GSK3β, glutamate-cysteine ligase catalytic subunit [GCLC], glutamate-cysteine ligase modifier subunit [GCLM], glutathione peroxidase 1 [GPx1], eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 2 [PKR], and superoxide dismutase 1 [SOD1] by real-time polymerase chain reaction [qPCR]. We found that the reductive stress previously present in young APOE4 carriers has now reversed and carriers now present increased oxidative damage and cell death, compared with non-carriers. Currently, APOE4 carriers present increased plasma levels of IL-1β, in an allele dose-dependent manner. They also present increased MDA and lower GPx1 expression. Environmental risk factors for AD only influenced MDA levels in heterozygous carriers and not in non-carriers. Moreover, homozygous carriers present lower RCAN1 protein expression when compared with heterozygous and with non-carriers. Conversely, heterozygous carriers presented lower GSK3β gene expression and higher PKR gene expression when compared to non-carriers. This was not associated with alterations in subjective or objective cognition. In conclusion, our results show that inflammation, redox homeostasis and expression of stress-related proteins involved in AD pathology change with age in cognitively healthy APOE4 carriers. Thus, studying APOE4 carriers is important to better understand AD pathology before its clinical onset.

[es] Apolipoproteína E [apoE] es una proteína multifuncional, cuya función principal es el mantenimiento de la homeostasis lipídica, pero que también está involucrada en diversas funciones fisiológicas, como control de la inflamación, de la inmunidad, repuesta antioxidante entre otras. El gene de la apolipoproteína E [APOE], localizado en el cromosoma 19q13.3, presenta 3 alelos principales, ɛ2, ɛ3 and ɛ4, los cuales codifican sus respectivas proteínas, apoE2, apoE3 y apoE4. Estas isoformas se diferencian entre sí por sustituciones de aminoácidos en las posiciones 112 y 158. ApoE3, la isoforma más común, contiene cisteína en la posición 112 y arginina en la posición 158; apoE2, la isoforma menos común, presenta cisteína en ambos sitios; y apoE4, con una frecuencia mundial del alelo ε4 de aproximadamente 14%, presenta arginina en ambas posiciones. La sustitución de un único aminoácido cambia la estructura y la función de la proteína. En el caso de la apoE4, el cambio implica la pérdida de funciones normales y la ganancia de funciones tóxicas, que causan diversas alteraciones patológicas. Esto hace que portadores de APOE4 tengan una mayor predisposición a padecer algunas enfermedades, siendo especialmente relevante la Enfermedad de Alzheimer [EA]. La EA es la enfermedad neurodegenerativa más común relacionada con la edad. Su principal clínica es un deterioro progresivo de las funciones cognitivas, que eventualmente llevan a la completa dependencia. Por eso, la EA tiene un gran impacto socio-sanitario, económico y personal. La forma esporádica de la enfermedad es la más común y presenta diversos factores de riesgo. No obstante, el principal factor de riesgo genético es la presencia de APOE4, la cual induce o aumenta diversas alteraciones patológicas relacionadas con la EA, incluyendo procesamiento alterado de péptido β amiloide [Aβ] y tau, estrés oxidativo y celular y muerte celular. Sin embargo, estas alteraciones patológicas también ocurren en personas cognitivamente sanas portadoras de APOE4, de modo que, conocer las alteraciones causadas por APOE4 en estos sujetos puede ayudar a comprender mejor la EA y a crear mejores métodos preventivos. Objetivos Objetivo General Se pretende conducir un estudio longitudinal prospectivo de una cohorte de 11 años de sujetos portadores de al menos un alelo 4 de la APOE y compararlos con sujetos no-portadores Objetivos Específicos 1) Evaluar el estado cognitivo, oxidativo e inflamatorio actual y los niveles de proteínas relacionadas al estrés en sujetos portadores de al menos un alelo 4 de la APOE cuando comparados a no-portadores. 2) Comparar el estado cognitivo, oxidativo e inflamatorio y los niveles de proteínas relacionadas al estrés a lo largo de los últimos 11 años en sujetos portadores de al menos un alelo 4 de la APOE. Metodología Sujetos y Evaluación Neurocognitiva El estudio actual es un seguimiento de una investigación anterior que culminó con la tesis doctoral de la Dra. María Del Carmen Badía Picazo, con el título "ESTUDIO DE ESTRÉS OXIDATIVO EN HIJOS DE PACIENTES CON ENFERMEDAD DE ALZHEIMER PORTADORES DEL ALELO 4 DE LA APOLIPOPROTEÍNA E." Para el estudio longitudinal, reclutamos los portadores de APOE4 que participaron en el estudio anterior. De estos, 24 accedieron a participar en este seguimiento, 14 heterocigotos y 10 homocigotos. No fue posible contactar los sujetos que formaron el grupo control en 2008, de modo que reclutamos 23 nuevos sujetos con las mismas características de nuestros participantes. De estos, 15 no eran portadores de APOE4 y formaron el grupo control de 2019. Los otros 8 individuos fueron considerados portadores voluntarios e incluidos en el análisis transversal, lo cual incluyó un total de 47 sujetos cognitivamente sanos, 15 de los cuales eran no portadores (grupo control) y 32 eran portadores de APOE4, 19 heterocigotos y 13 homocigotos. Todos los grupos incluían sujetos de ambos sexos, con edad entre 35 y 65 años, de todos los niveles educativos. Todos los participantes viven en la Provincia de Valencia en la Comunidad Valenciana y hablan español como lengua nativa. Los criterios de exclusión fueron: presentar una enfermedad aguda inflamatoria o infecciosa, usar sustancias que pueden afectar el proceso cognitivo, presentar déficits cognitivos o demencia, presentar importante discapacidad visual o auditiva o no firmar el consentimiento informado. La participación en el estudio fue voluntaria y un consentimiento informado fue firmado por todos los participantes. En todo momento se respetaron los principios fundamentales establecidos en la Declaración de Helsinki, en el consejo de Europa relativo a los Derechos Humanos y la Biomedicina, en la Declaración de la UNESCO sobre el genoma humano y los Derechos Humanos, así como los requisitos establecidos en la legislación española en el ámbito de la investigación biomédica, la protección de datos de carácter personal y la bioética. El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Valencia (referencia: H1542117584721). La entrevista y las pruebas cognitivas fueron realizadas individualmente. La entrevista consistió en una serie de preguntas sobre la historia clínica y socio-demográfica de los sujetos. Además, sujetos fueron preguntados sobre la presencia de quejas subjetivas de memoria [QSM] y sobre la presencia de síntomas de ansiedad o depresión. La versión española del test de aprendizaje auditivo verbal de Rey [RAVLT] fue usada para analizar memoria objetiva. Consta de un listado de 15 sustantivos que son leídos al paciente 5 veces y justo después de cada lectura, el paciente debe decir todas las palabras que sea capaz de recordar. De estas repeticiones, el número de palabras recordadas tras el primer intento compone el recuerdo inmediato y la suma de todos los 5 intentos será el ítem aprendizaje. Pasados 30 minutos, se evalúa el recuerdo libre de la primera lista y el número de palabras recordadas compone el recuerdo diferido. Para el análisis transversal, la puntuación fue corregida por la edad, sexo y educación usando datos normativos de la clínica Mayo. Para el análisis longitudinal, la puntuación fue convertida en T-score psicométrico (media de 50 y desviación estándar de 10). Utilizamos el test de colores y palabras de Stroop para evaluar atención y control inhibitorio. La versión española normalizada consta de tres páginas cada una con 100 elementos. En la primera página cada elemento es el nombre de un color (rojo, verde o azul) impreso en tinta negra. La segunda página consiste en 100 elementos iguales ("XXXX") impresos en tinta azul, verde o roja. La tercera página consiste en las palabras de la primera página impresas en los colores de la segunda, mezclados de modo que el color de la tinta y el significado de la palabra no coinciden en ningún caso. Los sujetos deben leer lo más rápido que puedan las palabras en la primera página, y el color de la tinta en la segunda y tercera páginas. La puntuación obtenida se compone de la cantidad de lecturas correctas en 45 segundos en cada página. Para el análisis transversal, la puntuación fue corregida por la edad y educación de acuerdo con las normas del Proyecto NEURONORMA y NEURONORMA adultos jóvenes. Para el análisis longitudinal, la puntuación fue convertida en T-score psicométrico (media de 50 y desviación estándar de 10). Utilizamos el cuestionario de fallos de memoria de la vida cuotidiana [MFE] para investigar el acontecimiento, la frecuencia y los tipos de fallos de memoria. En nuestro estudio, los sujetos leyeron y contestaron los 28 ítems según su experiencia personal y el posible acontecimiento de la imposibilidad de recordar algún suceso. El resultado total es la suma de la puntuación de los 28 ítems. La escala de Depresión de Hamilton, es una escala desarrollada para evaluar la gravedad de los síntomas de depresión en la última semana. La escala contiene 17 ítems, cada uno con puntuación de 0-2 ó 0-4, dependiendo de la variable analizada. En nuestro estudio utilizamos las definiciones de gravedad propuestas por la Asociación Americana de Psiquiatría. Tras la entrevista clínica, se recolectaron muestras de sangre de cada paciente que fueron procesadas para obtener sangre total, plasma y pellets de linfocitos. Métodos Analíticos Glutatión Analizamos glutatión reducido [GSH] y glutatión oxidado [GSSG] con el protocolo descrito por Giustarini y colaboradores, utilizando muestras de sangre total que fueron procesadas y analizadas por espectrofotometría. Cromatografía líquida de alta eficacia [HPLC] La cromatografía líquida de alta eficacia [HPLC] fue utilizada para medir la concentración de malondialdehído [MDA] en plasma, utilizando el método de hidrolisis de lipoperóxidos presentes en la muestra, seguido de la reacción de MDA con 2 moléculas de ácido tiobarbitúrico [TBA]. Esta reacción forma una molécula colorida que puede ser medida por HPLC a 532 nm. Ensayo por inmunoadsorción ligada a enzima [ELISA] El ensayo por inmunoadsorción ligada a enzima [ELISA] fue utilizado para analizar la presencia de apoE4 y los niveles plasmáticos de interleuquina-1β [IL-1β] y del factor de necrosis tumoral alfa [TNF-α]. Citometría de Flujo Utilizamos el citómetro de flujo para determinar niveles de muerte celular utilizando anexina y yoduro de propidio. Además, utilizamos H2DCFDA y dihidroetidio para medir especies reactivas y superóxido, respectivamente, en linfocitos. Western Blotting Se llevó a cabo la técnica del Western Blotting [WB] para determinar la expresión en linfocitos de distintas proteínas: calcineurina, RCAN1, GSK3β, p38, p-p38 y p-Tau231. Reacción en cadena de la polimerasa [PCR] Utilizamos la reacción en cadena de la polimerasa [PCR] para analizar la expresión de los siguientes genes: GCLC (Hs00155249_m1), GCLM (Hs00157694_m1), GPx1 (Hs00829989_gH), GSK3β (Hs00275656_m1), PKR (Hs00169345_m1), calcineurina (Hs00330865_s1), RCAN1 (Hs01120954_m1), SOD1 (Hs00533490_m1) y GAPDH (Hs02786624_g1). Cada muestra fue analizada en triplicado y GAPDH fue analizado en cada placa para ser usado como normalizador. El resultado fue calculado utilizando el método 2-ΔCt. Los cambios en la expresión génica entre 2019 y 2008 fueron calculados como fold change, utilizando la siguiente expresión descrita por Schmittgen & Livak: Fold Change = - 1/2019 mean expression/2008 mean expression. Cambios longitudinales fueron considerados significativos si fold change ≥1.5 y p-value ≤ 0.05. Análisis Estadístico Para el análisis estadístico se usó el programa IBM SPSS Statistics 22. Fueron realizadas pruebas de normalidad en todas las variables, específicamente el test de Kolmogorov-Smirnov con la corrección de Lilliefors. Para el análisis transversal, las comparaciones de 2 medias independientes en muestras paramétricas se realizaron mediante el test T de Student y en muestras no paramétricas se compararon con el test Mann-Whitney y el test Chi cuadrado para variables categóricas. Cuando la comparación de medias implica más de 2 se usaron el test ANOVA para muestras paramétricas y el test Kruskal-Wallis para las no paramétricas. Para el análisis longitudinal, muestras nominales pareadas fueron analizadas con el test de McNemar. Muestras paramétricas pareadas fueron analizadas con el test T de Student pareado y las no paramétricas con el test de Wilcoxon. En todos los test se consideró un resultado estadísticamente significativo cuando el p-valor es menor a 0,05. Resultados y Discusión Los sujetos que participaron en nuestro estudio son de mediana edad (media de edad 51,55 ± 7,9), aproximadamente 60% son mujeres y casi el 50% tiene estudios terciarios. No hay diferencias de sexo, edad o nivel de estudios entre portadores de APOE4 y no-portadores, ni entre los 3 genotipos. APOE4 y Cognición Las quejas subjetivas de memoria [QSM] pueden ser una señal prodrómica de deterioro cognitivo, aunque no todas las personas que las presenten tendrán alteraciones futuras. En nuestro estudio, evaluamos las QSM con una pregunta de respuesta dicotómica (sí o no) y no encontramos diferencias entre portadores y no portadores. No obstante, en el análisis longitudinal, vimos que los sujetos controles actuales presentan más QSM que los controles de hace 10 años. Esto puede deberse a diversos factores, incluyendo edad, ya que personas mayores presentan más quejas de memoria generales que personas más jóvenes. Además, las QSM son comunes en todas las edades, y la percepción de problemas de memoria por un individuo puede cambiar diariamente debido a factores estresantes, ansiedad y depresión. Nosotros vemos esto en nuestro estudio cuando analizamos los resultados de MFE, que mostraron que nuestros sujetos presentan un MFE más bajo que la media española. Además, la mayoría de fallos de memoria en nuestro estudio eran, en realidad, fallos de atención, que son los más frecuentes en individuos sanos. Nuestro estudio incluyó solamente individuos cognitivamente sanos. No obstante, era posible que hubiese pequeñas diferencias a lo largo del tiempo entre controles y portadores de APOE4 en evaluaciones cognitivas objetivas. Por esto, evaluamos memoria objetiva con RAVLT y atención con el test de Stroop, pero no encontramos diferencias entre los 3 genotipos ni a lo largo del tiempo. La depresión es un síntoma neuropsiquiátrico frecuente en la EA. No obstante, la relación entre APOE4 y depresión sigue siendo una incógnita, ya que algunos estudios encontraron un aumento de prevalencia entre portadores mientras que otros estudios no muestran los mismos resultados. Transversalmente, nuestro estudio no muestra diferencias significativas en la prevalencia de depresión entre los sujetos de los 3 genotipos, aunque los portadores de APOE4 muestran tendencia a una mayor prevalencia. Sin embargo, encontramos un aumento significativo a lo largo del tiempo en portadores de APOE4, especialmente entre las mujeres portadoras que presentan una mayor prevalencia que hombres portadores. Además, la prevalencia de depresión en jóvenes y en hombres solo aparece entre portadores de APOE4. Es conocido que las mujeres tienen una mayor susceptibilidad a padecer depresión comparadas con hombres de la misma edad. Nuestros resultados sugieren que los portadores de APOE4 pueden igualmente tener una mayor susceptibilidad. Esto también fue propuesto por Chhibber y Zhao, quienes encontraron que apoE4 interactúa con receptores β de estrógeno en ratones hembras para disminuir la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro y de receptores de serotonina, aumentando el riesgo de depresión. APOE4 e Inflamación La inflamación y las alteraciones del sistema inmune son características comunes de la EA y de la APOE4. En este sentido, nuestros resultados muestran que sujetos homocigotos APOE4 presentan niveles de IL-1β mayores comparado con sujetos heterocigotos y sujetos no portadores. De forma similar, los sujetos heterocigotos presentan niveles más elevados de IL-1β que los sujetos no portadores. IL-1β es una citoquina proinflamatoria, lo que sugiere que APOE4 está relacionada a una mayor inflamación, que es dosis-dependiente incluso en sujetos sanos de mediana edad. Este actual aumento de inflamación contrasta con el estudio anterior, que mostraba que los portadores no presentaban alteraciones inflamatorias. Esto indicaría que la patología relacionada a APOE4 puede variar con la edad. No obstante, el estudio anterior analizó solamente niveles de TNF-α; mientras que nuestro estudio actual midió tanto IL-1β como TNF-α, pero solo pudo analizar IL-1β, puesto que los niveles de TNF-α estaban por debajo del límite de detección. Sin embargo, es posible que los niveles de TNF-α fueran igualmente bajos en los 3 genotipos, lo que indicaría un aumento preferencial de IL-1β en sujetos portadores de APOE4. Ambas citoquinas son proinflamatorias y elevadas por el factor de transcripción NFκβ, que es, por su vez, activado por apoE4. Sin embargo, existen estudios que muestran que únicamente IL-1β se aumenta mediante la ruta C/EBP, un factor de transcripción que eleva los niveles de apoE4 y que es a su vez activado por apoE4. Esta activación diferencial del sistema inmune por apoE4 puede ser la causa del aumento exclusivo de IL-1β en portadores de APOE4 que mostramos en este trabajo. Además, considero importante destacar que los portadores heterocigotos tienen niveles más bajos de IL-1β que portadores homocigotos, puesto que los primeros también expresan otra isoforma de apoE que no estaría directamente implicada en la elevación de los niveles de IL-1β. APOE4 y Daño Oxidativo El estrés oxidativo es un mecanismo patológico importante en la EA, y es especialmente relevante en portadores de APOE4, puesto que este alelo presenta propriedades antioxidantes alteradas. Además, se han descrito alteraciones oxidativas en sujetos portadores sanos. Por lo tanto, decidimos analizar marcadores oxidativos en nuestro estudio. Encontramos que los portadores de APOE4 presentan un aumento de los niveles plasmáticos de MDA y una disminución de la expresión génica de glutatión peroxidasa 1 [GPx1], comparados con los sujetos no portadores. Además, portadores heterocigotos presentan menor expresión génica de superóxido dismutasa 1 [SOD1] comparados con no portadores, la cual ha disminuido a lo largo del tiempo. Esta alteración del estado oxidativo fue apoyada por el aumento longitudinal de MDA que ocurrió solamente en sujetos portadores de APOE4. De modo que de nuestros resultados se puede deducir que, a mediana edad, los portadores de APOE4 presentan daño oxidativo que no estaba presente cuando eran más jóvenes. Esto coincide con otros estudios publicados que muestran un aumento del daño oxidativo en sujetos portadores sanos. Nuestros resultados también coinciden con estudios in vitro y en ratones que encontraron una relación entre APOE4 y una reducción de la expresión o de la actividad de enzimas antioxidantes, incluyendo GPx1. Como nuestros resultados mostraron un aumento de daño oxidativo en portadores de APOE4, también esperábamos un aumento de los niveles de especies reactivas. No obstante, esto no ocurrió. También esperábamos encontrar un aumento de las ratios GSSG/GSH y NADP/NADPH+, que son características de estrés oxidativo. Sin embargo, los sujetos portadores solo presentaron una tendencia a la elevación de las ratios, cuando comparados a los no portadores. Esto puede deberse a los niveles reducidos de GPx1, ya que, sin esta enzima las especies reactivas no pueden reaccionar con la GSH. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que, en sujetos de mediana edad, APOE4 puede inducir un inicio de estrés oxidativo por la reducción de defensas antioxidantes, lo que permite que niveles normales o levemente aumentados de especies reactivas puedan causar daño oxidativo. Además, el estrés reductivo presente anteriormente en nuestros sujetos puede haber incrementado el daño, visto que este tipo de estrés puede causar un aumento de la producción de especies reactivas y puede causar daño oxidativo incluso en la presencia de equivalentes de reducción. Nuestros resultados también mostraron que factores de riesgo ambientales para la EA, como tabaquismo y diabetes, interactúan con apoE4, aumentando los niveles de MDA solamente en sujetos portadores. Esto muestra que factores ambientales y genéticos se combinan para influenciar el estado oxidativo e incrementar la patología. APOE4 y Estrés Celular APOE4 y la EA causan estrés celular y activan diversas vías de respuesta al estrés. La activación de estas vías crea un bucle patológico, ya que aumenta los niveles y/o la activación de varias enzimas que inducen la fosforilación de tau, incluyendo GSK3β, RCAN1 y PKR. Por lo tanto, decidimos analizar estrés y muerte celular en nuestros sujetos. Nuestros resultados mostraron un aumento de la expresión génica de PKR en portadores de APOE4, en especial los sujetos heterocigotos y las mujeres, cuando comparados con los sujetos no portadores. Además, la expresión génica de PKR permaneció aumentada a lo largo del tiempo. Esto coincide con estudios que encontraron un aumento de la actividad de PKR y de la activación de respuestas al estrés relacionadas a APOE4. Distintos tipos de estrés celular pueden estar relacionados a APOE4 en nuestros sujetos. En su juventud estos sujetos presentaban estrés reductivo, que altera el estado redox necesario para el correcto plegamiento de proteínas. Este tipo de estrés también activa la cascada de GSK3β/tau, promoviendo la fosforilación y acumulo de la proteína tau y su toxicidad. Además, hay un aumento de la síntesis y de la renovación de proteínas, lo que aumenta aún más el acumulo de proteínas mal plegadas. Este elevado estrés celular pudo ser visto en el estudio anterior en el aumento de PKR, GSK3β y RCAN1, proteínas relacionadas al estrés, encontrado en portadores de APOE4. No obstante, el estrés celular relacionado a la APOE4 causa disfunción celular de un modo dependiente de la edad. El estrés reductivo crónico en nuestros sujetos pudo haber llevado, con el tiempo, al agotamiento del sistema antioxidante y al daño oxidativo que vemos ahora en nuestros sujetos. Además, el estrés celular crónico causa un agotamiento de las respuestas al estrés que intentan mantener la función celular e inician vías metabólicas de muerte celular programada. Esto vemos en nuestros sujetos portadores, que presentan mayor apoptosis que los no portadores, y un aumento de apoptosis a lo largo del tiempo. Nuestro estudio también encontró una disminución significativa de la expresión proteica y una tendencia a menor expresión génica de RCAN1 en portadores homocigotos cuando comparados a portadores heterocigotos y a no-portadores. Por otro lado, no encontramos diferencias significativas en la expresión de calcineurina, aunque portadores homocigotos tienden a presentar menores niveles de proteína. Longitudinalmente, portadores homocigotos presentaron un cambio en la expresión de estas proteínas; de un aumento de la expresión de ambas proteínas, pasaron a una expresión reducida de RCAN1. Estos resultados son opuestos a lo esperado, ya que la sobreexpresión crónica de RCAN1 en la EA está asociada al daño celular y a la progresión patológica. No obstante, la mayor parte de los estudios en pacientes con EA no consideró la influencia de APOE4. De hecho, un estudio reciente encontró una reducción en la expresión génica y proteica de RCAN1 en el lóbulo frontal de sujetos con EA portadores de APOE4, de un modo dependiente de la cantidad de alelos, lo que está de acuerdo con nuestros resultados. Además, RCAN1 es una proteína inducida por el estrés que protege la célula del estrés agudo. Pero durante el estrés crónico, sus niveles son reducidos, lo que cambia las respuestas celulares y llevan a la muerte celular, como vimos en nuestro estudio. Además, encontramos que los portadores homocigotos de APOE4 presentan expresión reducida de RCAN1 y niveles aumentados de IL-1β cuando se comparan con portadores heterocigotos y a no-portadores; lo que indicaría una relación entre inflamación y respuesta celular al estrés. Esto tiene sentido, visto que la activación mantenida de linfocitos necesaria para aumentar los niveles de IL-1β, se consigue al aumentar la degradación de RCAN1 por la misma vía utilizada en la degradación de la proteína apoE. La mayor retención intracelular de apoE4 y la disfunción de la autofagia que esta causa, pueden ser la causa los niveles de RCAN1 que encontramos en los portadores de APOE4. No obstante, un mismo estímulo puede tener efectos distintos en diferentes órganos; por lo que es posible que los niveles de RCAN1 en el cerebro sean distintos a los encontrados en linfocitos. Encontramos en nuestro estudio que los portadores heterocigotos presentan una expresión génica reducida de GSK3β, mientras que la expresión proteica de esta proteína es similar entre los 3 genotipos. Además, los niveles de esta proteína se encontraban aumentados hace 10 años, lo que ha revertido al normal actualmente. GSK3β tiene un papel central en la EA, donde el aumento de su actividad y expresión están involucradas en la hiperfosforilación de tau y en la producción aumentada de Aβ. No obstante, pocos estudios evaluaron el efecto del genotipo APOE con respecto a esta enzima. En modelos animales se ha visto una relación entre APOE4 y un aumento de la actividad de GSK3β, sin un aumento de los niveles de la proteína. Aunque no hemos evaluado la activación de GSK3β en nuestro estudio, consideramos que es posible que estuviera elevada, independiente de los niveles normales de proteína. Un aumento de activación podría desencadenar un mecanismo compensatorio, el cual podría explicar la menor expresión génica de GSK3β en heterocigotos. Además, como GSK3β induce un aumento de IL-1β, la disminución de su expresión génica en heterocigotos podría ser el motivo de la menor elevación de IL-1β, respecto a los portadores homocigotos. ApoE3 y apoE4 causan una activación e inhibición distinta en diversas vías intracelulares, de modo que es posible que portadores homocigotos y heterocigotos presenten una regulación distinta de ciertas vías, cuando comparados a no-portadores. Las enzimas que analizamos en este estudio están relacionadas con la fosforilación de la proteína tau. Los niveles de p-tau, que estaban elevados en el estudio anterior, ahora se encuentran similares entre sujetos de los 3 genotipos. Esto está de acuerdo con los niveles de enzimas vistos en nuestro estudio; es decir, niveles reducidos de la proteína RCAN1 en homocigotos y reducción de la expresión génica de GSK3β en heterocigotos, aunque ambos tuvieran una tendencia a mayores niveles de pp38 y heterocigotos tuvieran mayores niveles de PKR. Finalmente, nuestro estudio encontró que PKR y p-p38 están más elevadas en mujeres portadoras de APOE4 que en hombres portadores. Además, éstas tienden a tener niveles más bajos de antioxidantes. Por otro lado, hombres portadores de APOE4 tienden a tener un mayor aumento de GSSG y de la ratio GSSG/GSH a lo largo del tiempo que mujeres portadoras. Esta diferencia puede indicar un posible defecto de la homeostasis del sistema redox y mayor estrés celular en mujeres portadoras que en hombres portadores de APOE4. En modelos animales, APOE4 actúa sinérgicamente con sexo para alterar el proteoma, reduciendo la expresión de diversas proteínas y aumentando el estrés oxidativo en aminales APOE4 hembras, respecto a los APOE4 machos. Esto es congruente con el riesgo más aumentado de padecer EA y con mayor patología en mujeres portadoras que en hombres portadores. En resumen, nuestro estudio encontró una reversión del estrés reductivo que presentaban nuestros sujetos portadores de APOE4 en el estudio anterior. Además, estos sujetos ahora presentan un aumento de daño oxidativo, caracterizado por aumento de MDA y reducción de GPx1, y muerte celular, cuando se comparan con los sujetos no portadores. Asimismo, el aumento que existía en el estudio previo en los niveles de proteínas relacionadas al estrés se ha revertido y ahora estas proteínas se encuentran en niveles normales o incluso reducidos, como es el caso de RCAN1. Igualmente, mostramos que los portadores de APOE4 cognitivamente sanos de mediana edad presentan un aumento de inflamación, cuando los comparamos con los no portadores. Además, este aumento es dosis dependiente según a la cantidad de alelos APOE4. Esto no estuvo asociado a alteraciones cognitivas objetivas ni subjetivas. Por lo tanto, nuestros resultados muestran que la inflamación, la homeostasis redox y las vías de estrés celular cambian con la edad en portadores de APOE4, y que el genotipo APOE, el sexo, la edad y factores de riesgo ambientales actúan en conjunto para afectar diversas vías que llevan a la EA. No obstante, nuestro estudio tiene algunas limitaciones. La primera, es importante notar que nuestra muestra es relativamente reducida. Segundo, el estudio longitudinal incluyó portadores de APOE4 que tenían una historia familiar de EA en un padre o una madre, lo que es un factor de riesgo para la EA. Esto fue necesario porque la frecuencia del alelo ε4 no es muy alta y encontrar homocigotos de forma aleatoria implicaría evaluar una gran cantidad de individuos. Tercero, no fue posible evaluar cuantitativamente los resultados longitudinales de WB y PCR. Por último, no pudimos evaluar el mismo grupo control que se utilizó en el primer estudio y, por lo tanto, utilizamos un nuevo grupo control, comparable al primero. A pesar de eso, encontramos resultados importantes que nos ayudan a aclarar los cambios relacionados a APOE4 que ocurren años antes del inicio de los síntomas. Conclusiones 1) Ocurrió una reversión del estrés reductivo presentado por nuestros sujetos portadores de APOE4 en el año 2008. 2) Ocurrió una reversión del aumento de calcineurina, GSK3β y RCAN1, presentado por nuestros sujetos portadores de APOE4 en el año 2008. 3) Los sujetos portadores de APOE4, en nuestro estudio, tienen mayores niveles de inflamación, una reducción de las defensas antiinflamatorias y un mayor daño oxidativo, cuando comparados a sujetos no-portadores. 4) Los efectos de la APOE4 en la inflamación son dependientes de la cantidad de alelos. 5) Hay una mayor activación de vías de estrés celular relacionadas con PKR en sujetos portadores de APOE4, especialmente en mujeres heterocigotos. 6) Portadores de APOE4 de mediana edad no presentan una elevación de la expresión de calcineurina, GSK3β y RCAN1, proteínas relacionadas con la fosforilación de la proteína tau, cuando comparados a no-portadores. 7) Portadores de APOE4 no presentan alteraciones cognitivas a lo largo del tiempo.