[en] Kidney transplantation (KT) is the best therapeutic approach for chronic kidney diseases (CKD) leading to an irreversible kidney failure. However, the follow-up of kidney function is still delicate. Renal biopsy is the gold-standard procedure to diagnose most of renal pathologies, including graft dysfunctions after KT. However, this invasive method is of limited repeatability and often describes an irreversible renal damage. Conversely, urine is an easily accessible, minimally invasive fluid. Thus, the information contained in this fluid, and particularly in urinary extracellular vesicles (uEVs), may be a potential source to unravel new biomarkers associated with renal pathologies. Nowadays, several methods have been described to enrich uEVs, although most of them render a mixture of proteins, lipoproteins and cell debris that may be masking relevant biomarkers. Therefore, the first aim of the present thesis is to evaluate size-exclusion chromatography (SEC) as a suitable method to isolate uEVs. Our results demonstrated that urine ultrafiltration followed by SEC is a suitable option to isolate uEVs, considerably reducing the presence of soluble contaminants. This methodology could permit more accurate analyses of EV-related biomarkers when further characterized by -omics technologies compared with other approaches. The second aim of the thesis is to investigate whether uEV profiling can differentiate the state of the kidney of living donors (LD) from deceased donors (DD) and compared to normo-functional patients after KT (NFP). This end would be of interest to elucidate if the drug therapy administrated affects the kidneys and, ultimately, their uEVs composition. Among other differences, next generation sequencing revealed that miR-326 was found significantly over-represented in LD, and miR-7706 was found only present in NFP, which are related with apoptosis and cell survival, respectively. Moreover, 70 proteins were differentially over-expressed in LD compared to NFP. Of note, the majority of these proteins were related with cell metabolism, which could be related to the immunosuppressive therapy of NFP. To summarize, in this pilot study we found that RNA and protein profile are substantially different between LD, DD and NFP, although these differences did not have a significant impact in short term renal function (one year). Overall, the results and differential profile of protein and miRNAs described in this thesis between kidney donors and NFPs suggest that in future comparative studies in post-KT patients uEVs from NFPs are the appropriate control rather than uEVs from LDs. Finally, we have analysed the glycosylation pattern of uVEs of donors (LD and DD) and post-KT patients showing graft dysfunction. For what we think is the first time, we have described the presence of fucoses in the uVEs. Moreover, despite the reduced cohort of this pilot study, we describe some differences in the lectin-binding assays between donors and patients. Yet, these findings must be confirmed in further studies.

[es] El trasplante renal (TR) es la mejor aproximación terapéutica para la enfermedad renal crónica (ERC) en estado terminal. Sin embargo, en la práctica clínica, la monitorización de la función renal se realiza, principalmente, mediante métodos indirectos. Respecto a los métodos directos, la biopsia renal (BR) es el método de referencia en el diagnóstico de la mayoría de patologías renales, incluyendo la disfunción del injerto renal. No obstante, esta técnica es invasiva, de limitada repetitividad y, a menudo, describe un daño ya irreversible. En cambio, la orina es un biofluido de fácil acceso y, prácticamente, de nula invasividad. Por lo tanto, la información contenida en este fluido, y en concreto en las vesículas extracelulares de orina (oVEs), es una potencial fuente de nuevos biomarcadores de patología renal. Actualmente existen diversos métodos de aislamiento de oVEs, aunque la mayoría de ellos obtienen una mezcla compleja de proteínas, lipoproteínas y restos celulares que podrían enmascarar biomarcadores relevantes. Por este motivo, el primer objetivo de la presente tesis es evaluar la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) como método de aislamiento de oVEs. Nuestros resultados demuestran que la ultrafiltración de la orina seguida de SEC es una opción adecuada para aislar oVEs, ya que reduce considerablemente la presencia de contaminantes solubles. Esta metodología permite un análisis más preciso de los biomarcadores asociados a oVEs mediante las aproximaciones ómicas. El segundo objetivo de la presente tesis es caracterizar el perfil de las oVEs de donantes vivos (DV) y donantes cadáver (DC), y compararlo con pacientes trasplantados normo-funcionales (FRN), con el fin de averiguar si la terapia farmacológica afecta al riñón y, en consecuencia, a la composición de las oVEs. Los resultados de secuenciación masiva mostraron que el miR-326 estaba significativamente sobrerrepresentado en DV, mientras que el miR-7706 solamente se detectó en FRN. Estos miRNAs se relacionan con la apoptosis y la supervivencia celular, respectivamente. Por otra parte, se identificaron 70 proteínas sobre-expresadas en los DV respecto a los FRN. La mayoría de estas proteínas estaban relacionadas con el metabolismo celular. Estas diferencias pueden ser debidas al tratamiento inmunosupresor de los FRN. En resumen, en este estudio piloto hemos descrito que el perfil transcriptómico y proteómico de los DV, DC y FRN es diferente, aunque estas diferencias parecen no tener un impacto significativo en la función del injerto a corto plazo (1 año). En general, los resultados y el perfil diferencial de proteínas y miRNAs entre los donantes de órganos y los FRN sugieren que en futuros estudios comparativos en pacientes post-TR, las oVEs del paciente FRN son el grupo control apropiado en lugar de las oVEs de los donantes. Finalmente, hemos analizado el patrón de glicosilación de las oVEs entre donantes y pacientes post-TR con disfunción del injerto. Que sepamos, esta es la primera descripción de la presencia de fucosas en las oVEs. Adicionalmente, hemos descrito algunas diferencias en los ensayos de unión a lectinas entre donantes y pacientes. Estos hallazgos deben ser confirmados en futuros estudios.