[en] Background Cyanobacteria are photosynthetic autotrophs that have tremendous potential for fundamental research and industrial applications due to their high metabolic plasticity and ability to grow using CO2 and sunlight. CRISPR technology using Cas9 and Cpf1 has been applied to different cyanobacteria for genome manipulations and metabolic engineering. Despite significant advances with genome editing in several cyanobacteria strains, the lack of proper genetic toolboxes is still a limiting factor compared to other model laboratory species. Among the limitations, it is essential to have versatile plasmids that could ease the benchwork when using CRISPR technology. Results In the present study, several CRISPR-Cpf1 vectors were developed for genetic manipulations in cyanobacteria using SEVA plasmids. SEVA collection is based on modular vectors that enable the exchangeability of diverse elements (e.g. origins of replication and antibiotic selection markers) and the combination with many cargo sequences for varied end-applications. Firstly, using SEVA vectors containing the broad host range RSF1010 origin we demonstrated that these vectors are replicative not only in model cyanobacteria but also in a new cyanobacterium specie, Chroococcidiopsis sp., which is different from those previously published. Then, we constructed SEVA vectors by harbouring CRISPR elements and showed that they can be easily assimilated not only by conjugation, but also by natural transformation. Finally, we used our SEVA-Cpf1 tools to delete the nblA gene in Synechocystis sp. PCC 6803, demonstrating that our plasmids can be applied for CRISPR-based genome editing technology. Conclusions The results of this study provide new CRISPR-based vectors based on the SEVA (Standard European Vector Architecture) collection that can improve editing processes using the Cpf1 nuclease in cyanobacteria.

[es] Introducción: Las cianobacterias son autótrofos fotosintéticos con alta plasticidad metabólica y capacidad para crecer utilizando CO2 y luz solar, lo que hace que tengan un tremendo potencial en aplicaciones industriales. La tecnología CRISPR se ha utilizado en la edición genética de cianobacterias en procesos de ingeniería metabólica. A pesar de los avances significativos en la edición del genoma en varias cepas de cianobacterias, la falta de herramientas genéticas adecuadas sigue siendo un factor limitante en comparación con otras especies de laboratorio modelo. Entre las limitaciones, una de las principales es contar con un banco plásmidos versátiles que puedan facilitar el uso de la tecnología CRISPR. Resultados: En este estudio se desarrollaron varios vectores CRISPR-Cpf1 basados en los plásmidos SEVA (Figura 1). La colección SEVA son vectores con elementos modulares que se pueden intercambiar y modificar llamados cargos (p. ej. Origen de replicación, resistencia, etc.). Como primer paso se probaron plásmidos con un origen de replicación RSF1010, de amplio espectro. Estos plásmidos fueron capaces de transformar no solo cianobacterias modelo si no también una cianobacteria extremófila, Chroococcidiopsis sp. Una vez verificada la capacidad de transformación, se construyeron vectores SEVA con los elementos del sistema CRISPR-Cpf1 y se demostró que la capacidad de transformación se mantenía en todas las cepas de cianobacterias probadas, también se pudo transformar naturalmente Synechosystis sp. Finalmente, como prueba de concepto se procedió a la deleción sin marca del gen nblA en Synechocystis sp. PCC 6803, demostrando que los plásmidos SEVA basados en la tecnología CRISPR-Cpf1 construidos en este trabajo se pueden usar para la modificación genética de cianobacterias. Conclusiones: En este estudio se han desarrollados vectores de edición genética mediante el sistema CRISPR-Cpf1 basados en los plásmidos SEVA. De acuerdo a los resultados obtenidos estos vectores son de fácil manipulación en el laboratorio, capaces de transformar por conjugación o naturalmente diferentes especies de cianobacterias, además de presentar una tasa alta de eliminación del plásmido para futuras ediciones. Todo esto hace que los plásmidos obtenidos sean una herramienta de gran utilidad con una amplia gama de aplicaciones que pueden ir desde la ingeniería metabólica y estudios de ciencia básica.