[en] INTRODUCTION Optic nerve crush (ONC) is a model of degeneration of retinal ganglion cells (RGCs). As a consequence of RGCs death, macroglial and microglial cells (MCs) become activated and change their morphology, and the latter migrate and phagocytose the dead RGCs. The response to ONC is not limited to the injured retina. The contralateral retina responds like the injured retina, but in a modest way. Thus, after ONC in the contralateral retina, activation of MCs, appearance of phagocytic microglia, activation of astrocytes and Müller cells and loss of RGCs are observed. Organotypic retinal cultures (ROCs) are being used as an in vivo surrogate to study the loss of RGCs. OBJECTIVES 1) To study the glial response in axotomised retinas and retinas contralateral. 2) To study and compare the course of RGC death and glial response in ROCs and axotomised retinas. 3) To analyse and quantitatively compare the morphology of MCs in intact, axotomised, contralateral and in ROCs. MATERIAL AND METHODS Adult pigmented C57Bl/6 mice were used. ONC was performed at 0.5 mm and analysis times were 1 to 45 days in vivo and 1 to 7 days in vitro. Immunofluorescence was performed on cut retinas, flat retinas and retinal explants with different markers for the study of different cell populations such as MCs, astrocytes and Müller cells and RGCs. The quantification of RGCs was performed automatically and the quantification of microglia was performed manually. The morphology of the MCs and the fluorescence intensity were analysed using Image J software. RESULTS In the course of glial activation after ONC, the two states of the MCs were characterised. In lesioned retinas, the density of MCs-Iba1+ and MCs-CD68+ in the GCL increased significantly and returned to normal at 45 days. In contralateral retinas, the density of Iba1+-MCs increased significantly at 5 days, while the density of MCs-CD68+ was significantly higher after injury. In cross-sections, the density of MCs increased significantly in lesioned retinas, but not in contralateral retinas. Astrocytes and Müller cells were hypertrophied in both retinas. Comparative analysis of the course of RGC death and microglial activation between ROCs and axotomised retinas showed a similar loss of RGCs-Brn3a+ in both models. In vivo, Brn3a and RBPMS expression was parallel, however, after 5 days the in vitro RBPMS signal is maintained. When testing other RGC markers, it was observed that the number of immunodetected RGCs was the same as when using RBPMS. Quantification of MCs in ROCs showed a lower density than after ONC. Macroglial activation in ROCs occurs earlier than in vivo, and encompasses the entire retina, whereas after ONC it is confined to the RGC complex. Comparative analysis of microglial morphology between the two models showed qualitative changes in the morphology of MCs-Iba1+. In all three experimental groups, (lesioned, contralateral and ROCs retinas), all analysed parameters of the CMs differed from resting MCs. In each experimental group, the activation of the MCs followed specific kinetics, and the morphological changes in the contralateral retinas were more subdued than in the axotomised retina, and in the axotomised retina than in the ROCs. CONCLUSIONS ONC triggers a bilateral and persistent activation of RGCs-Iba1+ and an opposite response of M2 RGCs between both retinas. The death of RGCs in both models is similar for up to 5 days, which means that they may be useful for studying new RGC-protective drugs. In all experimental groups, the MCs undergo changes in the size, number and length of their extensions. These morphological alterations are most marked in ROCs followed by axotomised retinas and finally those found in contralateral retinas.

[es] INTRODUCCIÓN El aplastamiento del nervio óptico (ApNO), es un modelo de degeneración de las células ganglionares de la retina (CGRs). Como consecuencia de la muerte de las CGRs, las células macrogliales y microgliales (CMs) se activan y cambian su morfología, además, estas últimas migran y fagocitan las CGRs muertas. La respuesta al ApNO no se limita a la retina lesionada. La retina contralateral responde como la retina lesionada, pero de una manera moderada. Así, tras el ApNO en la retina contralateral, se observa activación de CMs, aparición de microglía fagocítica, activación de astrocitos y células de Müller y pérdida de CGRs. Los cultivos organotípicos de retina (CORs) se están utilizando como un sustituto in vivo para estudiar la pérdida de CGRs. OBJETIVOS 1) Estudiar la respuesta glial en retinas axotomizadas y contralaterales. 2) Estudiar y comparar el curso de muerte de CGRs y la repuesta glial en CORs y en retinas axotomizadas 3) Analizar y comparar cuantitativamente la morfología de las CMs en retinas intactas, axotomizadas, contralaterales y en CORs. MATERIAL Y MÉTODOS Sé utilizaron ratones adultos pigmentados C57Bl / 6. El ApNO se realizó a 0,5 mm y los tiempos de análisis fueron de 1 a 45 días in vivo y de 1 a 7 días in vitro. Se realizó inmunofluorescencia en retinas a corte, a plano y en explantes de retina con diferentes marcadores para el estudio de distintas poblaciones celulares como las CMs, astrocitos y células de Müller y CGRs. La cuantificación de CGRs se realizó automáticamente y la cuantificación de microglía se realizó manualmente. Mediante el programa Image J se analizó la morfología de las CMs y la intensidad de fluorescencia. RESULTADOS En el curso de activación glial tras ApNO se caracterizaron los dos estados de las CMs. En retinas lesionadas, la densidad de CMs-Iba1+ y CMs-CD68+ en la CCG aumento significativamente volviendo a la normalidad a los 45 días. En las retinas contralaterales, la densidad de las CMs-Iba1+ aumento significativamente a 5 días, mientras que las CMs-CD68+ fue significativamente mayor después de la lesión. En secciones trasversales, la densidad de CMs aumentó significativamente en retinas lesionadas, pero no en contralaterales. Los astrocitos y las células de Müller se hipertrofiaron en ambas retinas. En el análisis comparativo del curso de muerte de CGRs y activación microglial entre CORs y retinas axotomizadas se observó una pérdida de CGRs-Brn3a+ similar en ambos modelos. In vivo, la expresión de Brn3a y RBPMS fue paralela, sin embargo, a partir de 5 días la señal de RBPMS in vitro se mantiene. Al probar otros marcadores de CGRs, se observó que el número de CGRs immunodetectadas era el mismo que al usar RBPMS. La cuantificación de las CMs en los CORs mostró una densidad menor que tras ApNO, La activación macroglial en CORs ocurre antes que in vivo, y abarca toda la retina, mientras que tras ApNO se circunscribe al complejo de CGRs. En el análisis comparativo de la morfología de la microglía entre ambos modelos se observaron cambios cualitativos en la morfología de las CMs-Iba1+. En los tres grupos experimentales, (retinas lesionadas, contralaterales y CORs), todos los parámetros analizados de las CMs difieren de las CMs en reposo. En cada grupo experimental la activación de las CMs siguió una cinética específica, y los cambios morfológicos en las retinas contralaterales fueron más tenues que en la retina axotomizada, y en estas, que en los CORs. CONCLUSIONES El ApNO desencadena una activación bilateral y persistente de las CMs-Iba1+ y una respuesta opuesta de las CMs M2 entre ambas retinas. La muerte de las CGRs en ambos modelos es similar hasta 5 días, lo que significa que pueden ser útiles para estudiar nuevos fármacos protectores de las CGRs. En todos los grupos experimentales, las CMs sufren cambios en el tamaño, número y longitud de sus prolongaciones. Estas alteraciones morfológicas son más marcadas en CORs seguido de retinas axotomizadas y finalmente de los encontrados en las retinas contralaterales.