[en] Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced by certain fungal species of the genera Aspergillus and Penicillium. OTA is well known as a contaminant of a large variety of foods, feeds and beverages worldwide. Cereal-based foodstuffs are the most important OTA-contaminated foods for human consumption. Wine has been shown to be frequently contaminated with OTA and thus contributes significantly to human exposure to this mycotoxin. Studies in rodents show that exposure to OTA promotes the development of kidney and liver tumours. The International Agency for Research on Cancer (IARC) classified OTA in the group 2B (possibly carcinogenic to humans), because there are insufficient data about its carcinogenicity to humans. This PhD thesis had two general objectives: i) to assess the bioaccessibility of OTA in red wine, and ii) to assess OTA cytotoxicity, genotoxicity and gene expression modulation. With regard to OTA bioaccessibility, a study was conducted with red wine at three contamination levels (1.0-4.0 μg/L) using an in vitro dynamic digestion model. The results showed that OTA is highly bioaccessible in the gastric chyme (103-128%) but much less bioaccessible in the intestinal chyme (<26%). The digestion system was also used to evaluate the transformation of OTA to OTα; the amount of OTα generated in gastric digestion was found to range from 5.1% to 19.1%, while the amount generated in intestinal digestion did not exceed 5%. OTA cytotoxicity was evaluated by means of different in vitro assays with two human cell lines (Caco-2 and HepG2 cell lines) and primary human lymphocytes. Viability assays showed that low doses of OTA (0.075-45 μM) did not cause viabilities below 65%. At the same doses, significant damage was observed in the membrane integrity of differentiated Caco-2 cells and a cytostatic effect in lymphocytes treated with 15 μM OTA. In Caco-2 cells, the effect of exposure to low OTA doses, alone and in combination with the mycotoxin deoxynivalenol (DON), was evaluated, as was the apparent protective effect of the antioxidant resveratrol (RES), a natural compound found in red wine. Co-exposure to both mycotoxins significantly increased the cytotoxicity of both compounds in vi Caco-2 cells, without an increase in the generation of reactive oxygen species (ROS). Co-exposure to OTA or DON with RES did not diminish the cytotoxicity; on the contrary, an increase in the cytotoxicity was observed that was not associated with an increase in ROS production. OTA doses lower than 45 μM were used to assess the gene expression modulation of the xenobiotic transformation system (CYP P450 system genes), as well as of the COX-2, LOX-5, and MRP2 genes. To this end, the gene expression level was investigated in a co-culture system of Caco-2 and HepG2 (transwell culture plates) to simulate intestinal absorption and hepatic metabolism. The results suggest that OTA was able to strongly modulate gene expression over time, and that the time of exposure to OTA had a greater effect on expression gene and membrane integrity (as measured by transepithelial electrical resistance) than the dose of toxin used in the treatments. With regard to the OTA genotoxicity assessment, OTA was shown to be a genotoxic mycotoxin, because it was able to induce micronucleus (MN) formation in human lymphocytes. Moreover, in a comet assay, OTA increased the percentage of DNA in the comets and caused an accumulation of DNA in the comets' tails by delaying the DNA repair pathway. Our results show that further research is needed to understand the mode of action of OTA, especially considering its possible association with human cancer development. Our findings on OTA cytotoxicity and genotoxicity at low doses support the theory that OTA should be considered a non-threshold carcinogen.

[es] La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina producida por varias especies de mohos de los géneros Aspergillus y Penicillium. Es bien conocido que la OTA es una de las micotoxinas más ubicuas, ya que se ha encontrado a nivel mundial en una gran variedad de alimentos tanto de origen vegetal como animal. Los productos para consumo humano elaborados a base de cereales son el grupo de alimentos que presenta una mayor contaminación por OTA. El vino es un alimento que se encuentra contaminado con frecuencia con OTA y que puede tener una importante contribución a la exposición humana a esta micotoxina. Estudios en roedores han demostrado que la OTA es capaz de promover el desarrollo de tumores renales y hepáticos. La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) ha clasificado a la OTA en el grupo 2B (posible compuesto carcinógeno para el hombre), porque los datos que demuestran la carcinogenicidad de la OTA en humanos aún son insuficientes. Esta tesis doctoral tuvo dos objetivos generales: i) evaluar la bioaccesibilidad de la OTA en vino tinto, y ii) evaluar la citotoxicidad, genotoxicidad y la modulación de la expresión génica por la OTA. En el caso de la bioaccesibilidad de la OTA, se llevó a cabo un estudio en vino tinto con tres niveles de contaminación de OTA (1,0-4,0 μg/L) en un sistema in vitro de digestión dinámica simulada. Los resultados de este estudio mostraron que la OTA es altamente bioaccesible en jugo gástrico (103-128%), pero es poco bioaccesible en el jugo intestinal (<26%). Adicionalmente, en este sistema se evaluó también la transformación de la OTA a OTα, encontrando que la cantidad de OTα generada en la digestión gástrica varió entre el 5,1-19,1%, mientras que en el compartimento intestinal no excedió del 5%. La evaluación de la citotoxicidad de la OTA fue llevada a cabo usando varios ensayos in vitro, y tres tipos de cultivos celulares (linfocitos humanos, y las líneas celulares Caco-2 y HepG2). Los ensayos de viabilidad mostraron que bajas dosis de OTA (0,075-45 μM) no causan viabilidades por debajo del 65%. Aplicando estas mismas dosis, tras 24 h de exposición se detectó un daño significativo en la integridad de la membrana celular de las células Caco-2 diferenciadas y un efecto citostático en linfocitos humanos tratados con 15 μM de OTA. viii En el caso de las células Caco-2, se estudió el efecto de la exposición a bajas dosis de OTA, sola o de forma conjunta con la micotoxina deoxinivalenol (DON), y se evaluó el presunto efecto protector del antioxidante resveratrol (RES), compuesto naturalmente presente en el vino tinto. La co-exposición a ambas micotoxinas aumentó significativamente la citotoxicidad de ambos compuestos en las células Caco-2, sin aumentar por ello la producción de especies reactivas del oxígeno (ERO). La co-exposición de OTA o DON con RES no disminuyó la citotoxicidad, más bien al contrario, se observó un aumento de la citotoxicidad no asociado con un aumento en la producción de ERO. Se usaron dosis bajas de OTA, inferiores a 45 μM, para evaluar la expresión de genes del sistema biotransformador de xenobióticos (genes del grupo CYP P450), así como la de los genes COX-2, LOX-5, y MRP2. Para ello se empleó un sistema de co-cultivo de células Caco-2 y HepG2 (placas de cultivo transwell) para simular la absorción intestinal y el metabolismo hepático. Los resultados indican que la OTA es capaz de modular fuertemente la expresión de los genes estudiados a lo largo del tiempo, teniendo, por lo general, el tiempo de exposición a la OTA un mayor efecto sobre la modulación de los genes y la integridad de la membrana (medida por la resistencia eléctrica transepitelial) que las diferentes dosis de toxina utilizadas en los tratamientos. En cuanto a la evaluación de la genotoxicidad de la OTA, se ha demostrado que la OTA es un micotoxina genotóxica capaz de inducir formación de micronúcleos en linfocitos humanos, así como de, en un ensayo cometa, incrementar el porcentaje de ADN en el cometa, y causar la acumulación del mismo en las colas de los cometas mediante un retraso en el sistema de reparación del ADN. Los resultados obtenidos indican que se deben realizar mayores esfuerzos para entender el modo de acción de la OTA, especialmente teniendo en cuenta su posible relación con el desarrollo del cáncer en los seres humanos. Los hallazgos sobre la citotoxicidad y genotoxicidad de la OTA a bajas dosis apoyan la teoría de que la OTA debería de ser considerada un carcinógeno sin umbral.