[en] Numerous non-persistent pesticides, such as organophosphate and pyrethroid insecticides, fungicides or herbicides, and other chemical compounds such as phthalates, widely present in household items, have shown pro-estrogenic and anti-androgenic effects, being classified as endocrine disruptors chemicals (EDCs). The processes involved in pubertal timing are potentially vulnerable to EDCs, and exposure at critical windows of development could be implicated in the secular trend of puberty observed in boys and girls in recent decades. Interindividual genetic variations could confer greater susceptibility to potential adverse health effects of hormonally active compounds. The first specific objective of this doctoral thesis was to conduct a systematic review of epidemiological studies assessing the association between early exposure to non-persistent pesticides and pubertal development (age at the onset and/or state of sexual maturation). A systematic search was carried out using MEDLINE and SCOPUS databases, including original articles published up to November 2020. The PRISMA guidelines were used, and the quality of the evidence was assessed using the GRADE scale. Thirteen studies were selected after excluding non-original and non-human studies. Exposure to different types of pesticides has been associated with altered puberty timing in girls and/or boys in eight studies. In utero exposure to atrazine has been related to earlier age of menarche in girls; exposure to organophosphate (OP) pesticides has been related to delayed sexual development in boys and girls in one study; childhood pyrethroid exposure has been associated with pubertal delay in girls and pubertal advancement in boys in two studies, respectively; prenatal/ exposure to multiple pesticides has been linked to earlier puberty onset in girls and pubertal delay in boys childhood, in two studies respectively, while living in rural area during childhood was associated to a greater age at menarche in one study and to an earlier puberty onset in boys in other study. The second objective was to evaluate the association between exposure to nonpersistent pesticides and pubertal development in 7-11-years-old boys and girls. A crosssectional study was carried out. Four insecticide metabolites (TCPy, chlorpyrifos metabolite; IMPy, diazinon metabolite; DETP, non-specific organophosphate metabolite and 3-PBA, pyrethroid metabolite) and the fungicide metabolite ethylene-bisdithiocarbamate (ETU) were quantified in urinary samples of 939 boys and 606 girls from the Childhood and Environment (INMA) cohort study carried out in Asturias, Gipuzkoa Numerous non-persistent pesticides, such as organophosphate and pyrethroid insecticides, fungicides or herbicides, and other chemical compounds such as phthalates, widely present in household items, have shown pro-estrogenic and anti-androgenic effects, being classified as endocrine disruptors chemicals (EDCs). The processes involved in pubertal timing are potentially vulnerable to EDCs, and exposure at critical windows of development could be implicated in the secular trend of puberty observed in boys and girls in recent decades. Interindividual genetic variations could confer greater susceptibility to potential adverse health effects of hormonally active compounds. The first specific objective of this doctoral thesis was to conduct a systematic review of epidemiological studies assessing the association between early exposure to non-persistent pesticides and pubertal development (age at the onset and/or state of sexual maturation). A systematic search was carried out using MEDLINE and SCOPUS databases, including original articles published up to November 2020. The PRISMA guidelines were used, and the quality of the evidence was assessed using the GRADE scale. Thirteen studies were selected after excluding non-original and non-human studies. Exposure to different types of pesticides has been associated with altered puberty timing in girls and/or boys in eight studies. In utero exposure to atrazine has been related to earlier age of menarche in girls; exposure to organophosphate (OP) pesticides has been related to delayed sexual development in boys and girls in one study; childhood pyrethroid exposure has been associated with pubertal delay in girls and pubertal advancement in boys in two studies, respectively; prenatal/ exposure to multiple pesticides has been linked to earlier puberty onset in girls and pubertal delay in boys childhood, in two studies respectively, while living in rural area during childhood was associated to a greater age at menarche in one study and to an earlier puberty onset in boys in other study. The second objective was to evaluate the association between exposure to nonpersistent pesticides and pubertal development in 7-11-years-old boys and girls. A crosssectional study was carried out. Four insecticide metabolites (TCPy, chlorpyrifos metabolite; IMPy, diazinon metabolite; DETP, non-specific organophosphate metabolite and 3-PBA, pyrethroid metabolite) and the fungicide metabolite ethylene-bisdithiocarbamate (ETU) were quantified in urinary samples of 939 boys and 606 girls from the Childhood and Environment (INMA) cohort study carried out in Asturias, Gipuzkoa Granada, Sabadell and Valencia. As pubertal assessment, the Tanner scale and the Pubertal Development Scale (PDS) were used. The association between each metabolite and the probability of being stage ≥2 for each pubertal milestone was examined using multivariate logistic regression. Effect modification by BMI was explored by interaction terms and stratified analysis. In girls, DETP and ETU exposure was associated with higher odds of overall pubertal development on the PDS, and ETU was also associated with higher odds of breast development in non-overweight girls. In boys, detection of TCPy, ETU, and 3-PBA were associated with higher odds of genital development, and the association for ETU and 3-PBA were significant only in normal/underweight and overweight/obese children, respectively. In contrast, DETP was associated with delayed puberty in overweight/obese children. The third objective was to evaluate the effect of prenatal exposure to phthalates on the pubertal development of boys and girls from Gipuzkoa, Sabadell and Valencia INMA cohorts. Urinary metabolites of six different phthalate diesters (DEP, DiBP, DnBP, BBzP, DEHP, and DiNP) and non-phthalate plasticizer DINCH® were quantified in two urine samples collected during pregnancy from mothers participating in the INMA Spanish cohort study. Pubertal assessment of their children at age 7-10 years (409 boys, 379 girls) was conducted using the parent-reported PDS. Modified Poisson and Weighted Quantile Sum (WQS) regression was employed to examine associations between prenatal phthalates and risk of puberty onset, adrenarche, and gonadarche. Effect modification by child weight status was explored by stratified analysis. Prenatal exposure to DEHP, DEP, and DnBP was associated with a higher risk of puberty onset in boys, and DEHP with a higher risk of adrenarche in girls. In contrast, exposure to BBzP and DINCH® was associated with a lower risk of adrenarche in overweight/obese boys. In overweight girls, DiBP, DnBP, and DINCH® were associated with a slightly increased risk of gonadarchia. Exposure to phthalate mixture, assessed by quantile sum regression, was not associated with puberty in boys or girls. The fourth objective was to examine the association between urinary biomarkers of non-persistent pesticides and sexual maturation in 14 to 17 years old boys from the INMA cohorts of Granada and Menorca. Urinary metabolites were measured in single spot urine samples, including: TCPy, IMPy, DETP and diacid malathion (MDA), malathion metabolite; the non-specific pyrethroid metabolites 3-PBA and dimethylcyclopropane carboxylic acid (DCCA); the 1-naphthol (1-N), carbaryl metabolite and ETU. Sexual maturation was assessed using Tanner stages, self-reported Pubertal Development Scale, and testicular volume (TV). Multivariate logistic regression was employed to examine associations between urinary pesticide metabolites and the odds of being in Tanner stage 5 of genital development (G5) and pubic hair growth; stage ≥4 of overall pubertal development, gonadarche, and adrenarche; or having mature TV (≥25 mL). Exposure to DETP, TCPy, and MDA was associated with a decrease in pubertal maturation (gonadal for DETP and TCPy and adrenal for MDA), while 1-N was associated with an increase in adrenal maturation and decreased testicular volume. Exposure to 3-PBA was associated with smaller testicular size. The fifth objective was to evaluate the relationship between exposure to pesticides and serum concentrations of sex hormones in male adolescents and the possible interaction with polymorphisms in genes involved in pesticide metabolism. For this purpose, two cross-sectional studies were carried out in 16 to 17 years old boys from the INMA Granada cohort. In the first study, urinary concentrations of organophosphate metabolites: TCPy, IMPy, DETP and DEDTP were measured in the urine sample of 134 boys, and in the second study, the urinary metabolites ETU, 3-PBA and 1-N were quantified in 117 boys. For both studies, the serum concentrations of the main sex and thyroid hormones were measured and alterations in the PON1, CYP2C19 and CYP2D6 genes were examined. Exposure to TCPy was associated with increased level of dehydroepiandrosterone (DHEA-S) and decreased oestradiol (E2), FSH, and antimullerian hormone (AMH); the detection of IMPy with increased E2, DHEA-S, FSH, AMH and prolactin and with lower levels of SHBG and LH; DETP detection was marginally associated with elevations in testosterone and triiodothyronine (T3) and decreases in FSH, AMH, and prolactin levels. The effect of IMPy and DETP on DHEAS and TT levels, respectively, was higher in subjects that carried the PON1 55MM genotype, while the effect of TCPy, IMPy, and DETP on thyroid hormone levels was higher in PON1 192QR/RR or 55MM genotype carriers. In the second study, exposure to 3-PBA was associated with elevated T3, while 1-N with elevated DHEA-S and decreased E2 and FSH. Poor CYP2C19 and CYP2D6 metabolizers (GA and AA genotype carriers) showed a greater increase in DHEA-S for detected versus undetected 1-N compared with GG genotype carriers. Poor CYP2D6 metabolizers (1846GA and AA genotypes) evidenced increased cortisol for detected versus undetected ETU. The magnitude of some of the associations was stronger for the carriers of the mutations in the analysed genes. In conclusion, the results of this doctoral thesis suggest that exposure to different classes of non-persistent pesticides and other endocrine disruptors, during critical window such as childhood and pregnancy, could be associated with variations in the concentrations of sexual hormones, in pubertal development and sexual maturation of boys and girls and that nutritional status and individual genetic susceptibility can modify these associations

[es] Diversos pesticidas no persistentes, como insecticidas organofosforados y piretroides, fungicidas y herbicidas, y otros compuestos químicos presentes en productos de consumo de uso cotidiano, como los ftalatos, poseen actividad estrogénica y/o antiandrogénica, siendo clasificados como disruptores endocrinos (DEs). Los procesos implicados en el desarrollo de la pubertad son potencialmente vulnerables a la acción de los DEs y la exposición en momentos críticos del desarrollo podría ser una de las causas atribuidas a la tendencia hacia el adelanto de la pubertad observada en las últimas décadas, especialmente en las niñas. Además, determinadas variantes genéticas podrían conferir mayor susceptibilidad a los potenciales efectos adversos en salud de los pesticidas y otros contaminantes ambientales. El primer objetivo específico de esta Tesis Doctoral fue realizar una revisión sistemática de la evidencia epidemiológica de asociación entre la exposición temprana a pesticidas no persistentes y desarrollo puberal (edad de inicio o estado de maduración sexual). Para ello, se realizó una búsqueda sistemática en las bases de datos MEDLINE y SCOPUS de los artículos publicados hasta noviembre de 2020 y se excluyeron los estudios no epidemiológicos, no originales, publicados en idiomas diferentes al inglés, español, italiano o portugués y los estudios en los que el desarrollo puberal o la maduración sexual no era la variable respuesta principal. En la metodología se siguieron las directrices de la guía PRISMA y la calidad de las evidencias se evaluó mediante la escala GRADE. Trece estudios cumplían los criterios de inclusión y ocho de ellos describían asociaciones significativas con alteraciones en la edad de inicio de la pubertad. Así, la exposición in utero a herbicidas tipo atrazina se relacionó con menarquia más temprana en un estudio; la exposición infantil a insecticidas organofosforados (OPs) se asoció con retraso en el desarrollo puberal en ambos sexos en otro estudio, mientras que la exposición a insecticidas piretroides se asoció con retraso en la maduración sexual en niñas y adelanto puberal en niños en dos estudios, respectivamente. La exposición prenatal a múltiples pesticidas se relacionó con adelanto puberal en niñas y retraso puberal en niños en dos estudios, respectivamente, mientras que el residir en áreas rurales durante la infancia se relacionó con retraso en la edad de la menarquia en niñas en un estudio y con adelanto puberal en niños en otro. El segundo objetivo fue evaluar la asociación entre la exposición a pesticidas no persistentes y el desarrollo puberal de niños y niñas con edad entre 7 y 11 años. Para ello se realizó un estudio transversal en el que se cuantificaron cuatro metabolitos de insecticidas (TCPy, metabolito de clorpirifós; IMPy, metabolito de diazinón; DETP, metabolito no específico de insecticidas OPs y 3-PBA, metabolito genérico de piretroides) y el metabolito de fungicidas bisditiocarbamatos de etileno, etilentiourea (ETU), en muestras urinarias de 939 niños y 606 niñas que participan en el estudio de cohortes multicéntrico Infancia y Medio Ambiente (INMA) en Asturias, Gipuzkoa, Granada, Sabadell y Valencia. Para la evaluación puberal de los niños se empleó la escala de Tanner y la Escala de Desarrollo Puberal (PDS). Mediante regresión logística multivariante, se examinó la asociación de cada metabolito con la probabilidad de estar en estadío ≥2 para cada hito puberal. Se exploró además el efecto modificador del índice de masa corporal (IMC) mediante análisis estratificado (peso bajo/normal versus sobrepeso/obesidad). En las niñas, se observó que mayores concentraciones urinarias de DETP y ETU se asociaban con mayor probabilidad de haber iniciado la pubertad según la PDS, y que las concentraciones de ETU también se asociaban con mayor probabilidad de haber iniciado el desarrollo mamario, especialmente en niñas con peso bajo/normal. En los niños, la detección de TCPy, ETU y 3-PBA se asoció con mayor probabilidad de haber iniciado el desarrollo genital, siendo la asociación con ETU y 3-PBA significativa solo en niños con peso bajo/normal y sobrepeso/obesidad, respectivamente. En cambio, DETP se asoció con retraso puberal en niños con sobrepeso/obesidad. El tercer objetivo fue evaluar la asociación entre la exposición prenatal a ftalatos y el desarrollo puberal de niños y niñas de las cohortes INMA de Gipuzkoa, Sabadell y Valencia en la misma ventana temporal (7-10 años). Un total de 409 niñas y 379 niños participaron en el estudio. Se recogieron muestras de orina de las madres durante el embarazo, en las que se analizaron los metabolitos de 6 ftalatos (DEP, DiBP, DnBP, BBzP, DEHP y DiNP) y el plastificante no ftalato DINCH®. Se examinó la asociación entre la exposición prenatal a ftalatos y el desarrollo puberal evaluado mediante la PDS cumplimentada por los padres. Para ello, se utilizó la regresión de Poisson con varianza robusta. Para evaluar el posible papel del IMC como factor modificador se realizó análisis estratificado. En niños, la exposición prenatal a DEHP, DEP y DnBP estaba asociaba con un mayor riesgo de haber iniciado la pubertad, y en niñas, la exposición a DEHP se asoció con mayor riesgo de adrenarquia. En cambio, BBzP y DINCH® se asociaron con menor riesgo de adrenarquia en niños con sobrepeso/obesidad. En niñas con sobrepeso, DiBP, DnBP y DINCH® se asociaron con un riesgo ligeramente mayor de gonadarquia. El efecto combinado de la exposición a la mezcla de ftalatos, evaluado mediante regresión de suma de cuantiles ponderada (WQS), no se asoció con la pubertad en ninguno de los dos sexos. El cuarto objetivo de esta Tesis Doctoral fue examinar la asociación entre la exposición a pesticidas no persistentes y el estado de maduración sexual en 201 adolescentes varones de 14 a 17 años de edad, participantes de las cohortes INMA de Granada y Menorca. Se cuantificaron los metabolitos urinarios TCPy, IMPy, DETP y malatión diácido (MDA), metabolito de malatión; los metabolitos inespecíficos de los piretroides 3-PBA y ácido dimetilciclopropano carboxílico (DCCA); el 1-naftol (1-N), metabolito de carbarilo y ETU. La maduración sexual se evaluó mediante la escala de Tanner, la PDS y medición de volumen testicular (VT). Se empleó regresión logística multivariante para examinar la asociación de cada metabolito con la probabilidad de estar en estadío 5 de Tanner, estadío ≥4 de la PDS y de presentar VT ≥25 mL. La exposición a DETP, TCPy y MDA se asoció con una menor maduración sexual (gonadal para DETP y TCPy y adrenal para MDA), mientras que 1-N se asoció con mayor maduración adrenal pero menor VT. El quinto y último objetivo fue evaluar la relación entre la exposición a pesticidas no persistentes y las concentraciones séricas de hormonas sexuales en adolescentes varones de la cohorte INMA-Granada y la posible interacción con polimorfismos (SNPs) en genes involucrados en el metabolismo de pesticidas. Para ello se realizaron dos estudios transversales en adolescentes de la cohorte de Granada que participaron en visita de seguimiento a la edad de 15-17 años: en el primero se cuantificaron las concentraciones urinarias de los metabolitos de insecticidas OPs: TCPy, IMPy, DETP y DEDTP, y en el segundo se cuantificaron los metabolitos urinarios ETU, 3-PBA y 1-N. Para ambos estudios se cuantificaron las concentraciones séricas de las principales hormonas sexuales y tiroideas y se examinaron las frecuencias de los SNPs de PON1, CYP2C19 y CYP2D6. La exposición a TCPy se asoció con un aumento de los niveles de dehidroepiandosterona sulfato (DHEA-S) y disminución de estradiol (E2), hormona folículo estimulante (FSH) y hormona anti-Mülleriana (AMH); la detección de IMPy con aumento de los niveles de E2, DHEA-S, FSH, AMH y prolactina y con menores niveles de hormona luteinizante (LH) y de la proteína transportadora de hormonas sexuales (SHBG); la detección de DETP se asoció, aunque de forma no significativa, con aumento de los niveles de testosterona y triiodotironina (T3) y disminución de FSH, AMH y prolactina. El efecto de IMPy y DETP sobre los niveles de DHEA-S y testosterona, respectivamente, fue mayor en los adolescentes portadores del genotipo PON1 55MM, asociado a menores concentraciones de PON1, mientras que el efecto de TCPy, IMPy y DETP sobre los niveles de hormona tiroidea fue mayor en los adolescentes con menor capacidad de metabolización, portadores de los genotipos PON1 192QR/RR o 55MM. En el segundo estudio, la exposición a 3-PBA se asoció con mayores niveles de T3, mientras que 1-N con aumento de DHEA-S y disminución de E2 y FSH. La magnitud de las asociaciones observadas para 1-N y DHEA-S era más fuerte en los portadores de las variantes de pérdida de función CYP2C19*2 y CYP2D6*4. Además, se observó una asociación entre la detección de ETU y niveles de cortisol solo en los portadores de los genotipos 1846GA y AA del gen CYP2D6. En conclusión, los resultados de esta Tesis Doctoral sugieren que la exposición a determinados pesticidas no persistentes y otros DEs como los ftalatos en etapas de especial vulnerabilidad, como la infancia y el embarazo, podría estar asociada con alteraciones en el desarrollo puberal y en las concentraciones de hormonas sexuales, siendo el estado nutricional y la susceptibilidad genética individual factores que pueden modificar dichas asociaciones.