[en] Microorganisms of the Enterobacteriaceae family are opportunistic pathogens that normally are part of the human and other mammal intestinal microbiota. Some enterobacteria species possess intrinsic AmpC beta-lactamase genes in their chromosome, and mutations in those genes can cause the increase in their spectrum of action. On the other hand, the enterobacteria are able to acquire resistance mechanisms to different antibiotic families. In the last years, concerns do exist about the spread of carbapenemase genes due to the difficulty to treat infections caused by carbapenemase expressing bacteria. In this thesis, the detection and characterization of AmpC beta-lactamase and carbapenemase genes have been carried out in enterobacteria isolates; as well as the development of new carbapenemase detection methods. The first objective was to isolate and to characterize enterobacteria from healthy human fecal samples. The resistance phenotype and the presence of AmpC and Extended spectrum beta-lactamases (ESBL) were analyzed in the 70 obtained islates. Resistance to ampicillin was detected in 57% of the isolates, 22 with AmpC phenotype and 3 with ESBL phenotype. Among the 22 isolates with AmpC phenotype, the species-specific ampC gene was detected in 21 isolates (13 Citrobacter freundii complex, 8 Enterobacter cloacae). Moreover, at least two copies of the blaCMY-2 gene were localized in an IncK conjugative plasmid of 78 Kb in an Escherichia coli ST405 isolate. The prevalence of enterobacteria with plasmidic ampC genes in healthy humans was of 1,4 %. The second objective was the characterization of enterobacteria from clinical origin. Eighty-one isolates suspicious of harbouring AmpC beta-lactamases or belonging to species that carry cAmpC, were studied. ampC genes were detected in 57 of these isolates, 8 of them of plasmid location (E. coli, Citrobacter, Proteus and Klebsiella) and with chromosomal location in the 49 remaining isolates (24 Citrobacter, 16 Enterobacter, 7 Morganella and 2 Proteus). The presence of other resistance genes was studied in all the isolates from both origins. The ESBL-positive isolates recovered from fecal samples of healthy humans carried blaSHV-12 (2 isolates) and blaCTX-M-15+blaOXA-1 (1) genes. A wide diversity of beta-lactam resistance genes was detected, as well as the presence of resistance genes to aminoglycosides, sulfamides, chloramphenicol, tetracyclines, rifampicin and quinolones. Class 1 integrons were detected in 20 isolates, with diverse gene cassette arrays; class 2 integrons were detected in 3 isolates. The third objective was to analyze the polymorphism in ampC and qnrB genes among the Citrobacter, Enterobacter and Morganella genera, as well as to study the clonal diversity of isolates of both origins. A high degree of polymorphism of ampC genes was detected, as well as in the ampR gene and in the ampR/ampC intergenic regions. A total of 29 CMY variants, 15 ACT, 4 DHA and 2 MIR were detected. Among the detected variants, 43 had not been previously described, for this reason they were included in GenBank and www.lahey.org/Studies. The isolates of these genera, not only showed a high varieties ty in these genes, but also diversity of clones among the isolates. Moreover, 12 qnrB variants were detected among the 18 positive-qnrB-Citrobacter isolates (5/13 of fecal samples/clinical samples, respectively). The qnrB50 variant has been described for the first time in this thesis. The fourth objective was to carry out the biochemical characterization of ESAC betalactamases, as well as to study the avibactam effect on isolates with ESAC phenotype. The study determined that Asn298 deletion was the responsible of ESAC phenotype. This deletion did not affect the beta-lactamase inhibition by avibactam. The changes in aminoacid sequence in the studied ESAC beta-lactamases did not modify the inhibition effect of avibactam. The fifth objective was to characterize the carbapenem resistance mechanisms among carbapenem resistant enterobacteria including two clinical cases of special relevance. The first clinical case was due to an infection by a multiresistant E. coli ST448/B1 that had 6 betalactamase encoding genes (blaVIM-1, blaKPC-3, blaSHV-12, blaOXA-9, blaTEM-1a and blaCMY-2), as well as other 11 resistance genes and the virulence factor fimA gene. This isolate harbored the new class 1 integron In916, non previously reported.The second case was related to a coinfection in a patient by carbapenem resistant C. freundii and P. aeruginosa isolates. Both isolates carried the blaVIM-2 gene into class 1 integrons, but with different structures and promoters among them. This study is the first description of a blaVIM-2-carrying C. freundii isolate in Spain. Finally, the sixth objective was the generation of a phenotypic carbapenemase detection protocol. In this study, a new algorithm for the phenotypic carbapenemase detection is proposed. This algorithm includes two new phenotypic methods that are based on the use of inhibitors and that allows the differentiation of the diverse carbapenemases types, including OXA-48.

[es] Las enterobacterias son patógenos oportunistas que habitualmente se encuentran en la microbiota intestinal humana y de otros mamíferos. Algunas especies de enterobacterias poseen genes codificantes de beta-lactamasas AmpC de manera intrínseca en su cromosoma y determinadas mutaciones en dichos genes puede provocar el aumento de su espectro de acción. Por otra parte, las enterobacterias son capaces de adquirir mecanismos de resistencia a diferentes familias de antibióticos. En los últimos años ha aumentado la preocupación por la diseminación de genes codificantes de carbapenemasas debido a la dificultad en el tratamiento de infecciones por bacterias que los portan. En esta tesis se ha llevado a cabo la detección y caracterización de genes de beta-lactamasas AmpC y de carbapenemasas en enterobacterias, así como el desarrollo de nuevos métodos que permitan su detección. El primer objetivo fue aislar y caracterizar enterobacterias de muestras fecales de individuos sanos. Se obtuvieron 70 aislados en los que se analizó el fenotipo de resistencia y la presencia de fenotipo AmpC y beta-lactamasa de espectro extendido (BLEE). Se detectó un 57% de aislados resistentes a ampicilina, 22 con fenotipo AmpC y 3 con fenotipo BLEE. De los 22 aislados con fenotipo AmpC, se detectó el gen cromosómico ampC especie-específico en 21 aislados (13 Citrobacter freundii complex, 8 Enterobacter cloacae) y al menos dos copias del gen blaCMY-2 localizado en un plásmido conjugativo IncK de 78 Kb, en un aislado de Escherichia coli ST405. La prevalencia de aislados portadores de genes ampC plasmídicos fue del 1,4 %. El segundo objetivo fue la caracterización de enterobacterias de origen clínico. Se estudiaron 81 aislados sospechosos de portar beta-lactamasa AmpC o pertenecientes a especies poseedoras de cAmpC. En 57 de estos aislados se detectaron genes ampC, 8 de ellos de localización plasmídica (E. coli, Citrobacter, Proteus y Klebsiella) y los 49 restantes de localización cromosómica (24 Citrobacter, 16 Enterobacter, 7 Morganella y 2 Proteus). En todos los aislados de ambos orígenes se estudió la presencia de otros genes de resistencia. Los aislados de muestras fecales de individuos sanos con fenotipo BLEE portaban blaSHV-12 (2 aislados) y blaCTX-M-15+blaOXA-1 (1). Se detectó una amplia variedad de genes de resistencia a betalactámicos, así como la presencia de genes de resistencia a aminoglucósidos, sulfamidas, cloranfenicol, tetraciclinas, rifampicina y quinolonas. Se caracterizaron 20 integrones de clase 1 con gran diversidad en sus estructuras y 3 integrones de clase 2. El tercer objetivo fue analizar el polimorfismo de los genes ampC y qnrB cromosómicos de los géneros Citrobacter, Enterobacter y Morganella; así como estudiar su diversidad clonal en los aislados de ambos orígenes. Se detectó un alto grado de polimorfismo de los genes ampC, así como del gen ampR y de las regiones intergénicas ampR/ampC. Se obtuvo un total de 29 variantes de CMY; 15 de ACT, 4 de DHA y 2 de MIR. Entre las variantes detectadas, 43 no habían sido descritas anteriormente, por lo que se incluyeron en GenBank y www.lahey.org/Studies. Los aislados de estos géneros no sólo mostraron una alta variedad en estos genes sino que también mostraron una alta diversidad clonal entre ellos. Además, se detectaron 12 variantes del gen qnrB entre los 18 aislados de Citrobacter qnrB-positivos (5/13 de muestras fecales/clínicas, respectivamente). La variante qnrB50 ha sido descrita por primera vez . El cuarto objetivo planteado fue la caracterización bioquímica de una beta-lactamasa ESAC, así como el estudio del efecto del avibactam en aislados con este fenotipo. El estudio realizado determinó que la deleción Asn289 era la responsable de la generación del fenotipo ESAC, que a su vez no afectó la inhibición de la beta-lactamasa por avibactam. Las alteraciones en la secuencia aminoacídica de las beta-lactamasas ESAC estudiadas no modificaron la acción del inhibidor avibactam. El quinto objetivo planteado fue la caracterización de los mecanismos de resistencia a carbapenémicos. En este estudio destacan la caracterización completa de los aislados, portadores de beta-lactamasas de interés, procedentes de dos casos clínicos. El primer caso clínico se debía a la infección por un aislado de E. coli ST448/B1 multirresistente que presentó 6 genes codificantes de beta-lactamasas (blaVIM-1, blaKPC-3, blaSHV-12, blaOXA-9, blaTEM-1a y blaCMY-2) así como otros 11 genes de resistencia a distintos antibióticos, y el gen de virulencia fimA. En este aislado se detectó un integrón de clase 1 que no había sido descrito previamente (In916). El segundo caso se trataba de una coinfección por C. freundii y P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos. Ambos aislados poseían el gen blaVIM-2 en integrones de clase 1 con diferentes estructuras y promotores. Este estudio es la primera descripción de C. freundii portador de blaVIM-2 en nuestro país. Finalmente, el sexto objetivo planteado fue la generación de un protocolo de detección fenotípica de carbapenemasas. En este estudio se propone un nuevo algoritmo para la detección fenotípica de carbapenemasas. En este algoritmo se incluyen dos métodos fenotípicos nuevos basados en el uso de inhibidores y permite la diferenciación de los distintos tipos de carbapenemasas, incluyendo OXA-48.