[en] Metalloprotein are proteins containing metal ion cofactors. Compared to chemical catalysts, metalloproteins have a well-defined configuration around the active site which ensures higher specificity, selectivity and reaction rates. Metalloproteins are soluble in water, their function can be optimized genetically by modifying an host (e.g. a bacteria) and are biodegradable. Therefore, they are ideal templates for the creation of novel green catalysts and therapeutics. Nonetheless, metalloproteins, as found in nature, are usually not ready for industrial scale-up and may need to be re-designed. Molecular simulations can guide the search for new metalloprotein functionality, cutting the costs of the experimental work. Modeling metalloproteins' function requires the sampling of both the electronic and nuclear degrees of freedom to exhaustively describe their chemical reactivity. The combination of conformational sampling and quantum chemical technique allows to model how they catalyze a reaction or covalently bind a ligand, without missing information about the dynamics of the whole protein. In this thesis, these computational techniques are systematically employed to study and guide present and future design efforts of laccases and hemoglobin. Laccases are copper-containing oxidoreductases that can oxidize a large variety of substrates at expenses of oxygen, which is reduced to water. Therefore, their interest in green chemistry applications: they work with air and produce water as sole by-product. So far, most efforts made to enlarge the chemical space of laccases have focused on increasing the redox potential of the first copper-based electron acceptor, a choice that yielded limited success. Here, it is proposed to focus on the desired substrate, modeling the active site of laccases to better fit and oxidize it. To do so, a computational protocol was developed, based on Monte Carlo sampling of the enzyme-substrate conformational space, followed by quick quantum chemical calculations to score oxidation. The protocol was first validated against experimental data, proving its capability to reproduce data and provide a rationale to laccases functioning. This new tool was then used to improve the oxidation of aniline by a laccase by simulating the effect of certain mutations (amino acid substitutions) which were tested in the lab by our collaborators. As a result, the design mutations significantly improved the oxidation of aniline (which leads to the formation of polyaniline, an organic semiconductor). Another design was carried out which lead to a significant improvement in activity of another laccase toward three different substrates. Therefore, the methodology developed proved to be capable of reproducing and rationalizing experimental results and rendering a la carte design of laccases toward a given (class of) substrates possible. A similar protocol, which uses an empirical computational method instead of quantum chemical techniques, was used to selectively attach a photosensitizer (a molecule that produces a chemical change in another molecule in a photochemical process) to the surface of a laccase. Hemoglobin, a heme-containing protein that carries oxygen from the lungs to the tissue in the body, is a candidate for blood substituent design. However, its design is rendered difficult by the limited knowledge of its functioning. Here, a mixed Monte Carlo-quantum chemical approach was used to support a theory about hemoglobin's allosteric mechanism and structurally characterize the tertiary end-states of the allosteric transition for the first time. These calculations, which were benchmarked against available experimental data, disclosed the role of the amino acids next to the oxygen binding site. This information was used in a subsequent molecular dynamics study which showed how the four subunits of hemoglobin give rise the allosteric response, highlighting the signalling paths and their hierarchy

[es] Las metaloproteínas son proteínas que contienen iones metálicos como cofactores. En comparación con los catalizadores químicos, las metaloproteínas tienen una configuración bien definida alrededor del sitio activo que asegura mejor especificidad, selectividad y velocidad de reacción. Las metaloproteínas son solubles en agua, su función puede ser optimizada genéticamente mediante la modificación de un huésped y son biodegradables. Por lo tanto, son ideales para la creación de nuevos catalizadores verdes y terapéuticos. No obstante, las metaloproteínas, como se encuentran en la naturaleza, no suelen estar listas para la industria y pueden necesitar ser re-diseñadas. Las simulaciones moleculares pueden orientar el diseño de mejores metaloproteınas, reduciendo el trabajo experimental. Modelar la función de las metaloproteınas necesita el muestreo de los grados de libertad electrónicos y nucleares para describir exhaustivamente su reactividad química. La combinación de muestreo conformacional y técnicas de química cuántica permite modelar la catálisis de una reacción o como un ligando se une covalentemente a una metaloproteína, sin omitir información sobre la dinámica de la proteína. En esta tesis, estas técnicas computacionales se utilizan sistemáticamente para estudiar y orientar presentes y futuros esfuerzos de diseño de lacasas y hemoglobina. Las lacasas son oxidorreductasas que pueden oxidar una gran variedad de sustratos y reducir oxígeno a agua. Por lo tanto, tienen interés en las aplicaciones de la química verde: funcionan con aire y producen agua como subproducto. Hasta ahora, la mayoría de los esfuerzos realizados para ampliar el espacio químico de lacasas se han centrado en aumentar el potencial redox del primer aceptor de electrones a base de cobre, una elección que obtuvo un éxito limitado. En este trabajo, se propone centrarse en el sustrato deseado, diseñando el sitio activo de las lacasas para mejor enlace y oxidación. Para ello, un protocolo de cálculo fue desarrollado, basado en el muestreo del espacio conformacional de la enzima-sustrato con técnicas Monte Carlo, seguido de cálculos de química cuántica para cuantificar la oxidación. El protocolo fue validado por primera vez contra datos experimentales, lo que probó su capacidad para proporcionar una justificación de las lacasas de funcionar. A continuación se utilizó esta nueva herramienta para mejorar la oxidación de la anilina por una lacasa, simulando el efecto de ciertas mutaciones que se probaron en el laboratorio por nuestros colaboradores. Como resultado, las mutaciones mejoraron significativamente la oxidación de anilina. Otro diseño produjo una mejora significativa en la actividad de otro lacasa hacía tres sustratos diferentes. Por lo tanto, la metodología desarrollada demostró ser útil para diseñar las lacasas hacia un dado sustrato. Un protocolo similar, que utiliza un método de cálculo empírico en lugar de técnicas de química cuántica, se utilizó para unir selectivamente un fotosensibilizador a la superficie de una lacasa. La hemoglobina, una proteína que contiene cuatro grupos hemo para transportar el oxígeno de los pulmones a los tejidos en el cuerpo, es un candidato para el diseño sustituyente de la sangre. Sin embargo, su diseño se ve dificultado por el limitado conocimiento de su funcionamiento. Aquí, la combinación de técnicas Monte Carlo y química cuántica se utilizó para apoyar una teoría sobre el mecanismo alostérico de la hemoglobina y caracterizar estructuralmente los estados finales de la transición alostérica terciaria por primera vez. Estos cálculos, que fueron comparados con los datos experimentales disponibles, permitieron conocer el papel de los aminoácidos próximos al sitio de unión de oxígeno. Esta información se utilizó en un estudio posterior de la dinámica molecular que mostró cómo las cuatro subunidades de la hemoglobina dan lugar a la respuesta alostérica, destacando las rutas de señalización y su jerarquía.