[en] I targeted nuclear-encoded green fluorescent protein (eGFP) to rice mitochondria using six mitochondrial pre-sequences with diverse phylogenetic origin. I investigated their effectiveness by immunoblot analysis, confocal and electron microscopy in callus and regenerated plants. I confirmed that COX4, SU9 targeting peptides effectively targeted eGFP to rice mitochondria regardless of their origin. I used this methodology to dissect and express extremely oxygen sensitive nitrogenase Fe Protein NifH and its maturase NifM in rice mitochondria to overcome the most challenging bottleneck of engineering biological nitrogen fixation in cereals. Therefore, I was able to express and purify substantial amounts of NifH from rice callus, and I confirmed that the isolated NifH carried out the fundamental role of NifH enzymatic activity required to engineer nitrogen fixation, including electron transfer, and FeMo-co biosynthesis. I was thus able to demonstrate for the first-time stable expression and activity of a nitrogenase component in any cereal. I have further used CRISPR/Cas9 to mutate the OsSBEIIb (encoding starch branching enzyme IIb), which is required for the synthesis of densely branched amylopectin in the rice endosperm. I investigated the effects of the inactivation of individual starch biosynthesis enzyme in rice starch and overall metabolism. Homozygous mutant plants, in which OsSBEIIb was completely inactivated, produced opaque seeds with depleted starch reserves whose amylose content increased from 19.6 to 27.4% and resistant starch (RS) content increased from 0.2 to 17.2%. Because of the mutation there was a general increase in the accumulation of sugars, fatty acids, amino acids, and phytosterols in the mutant endosperm, suggesting that intermediates in the starch biosynthesis pathway increased flux through spillover pathways causing a profound impact on the accumulation of multiple primary and secondary metabolites.

[es] Conseguí dirigir la proteína verde fluorescente codificada en el núcleo (eGFP) a las mitocondrias de arroz utilizando seis pre-secuencias mitocondriales con diverso orígen filogenético. Investigué su efectividad mediante análisis de inmunotransferencia, microscopía confocal y electrónica tanto en callos como en plantas regeneradas. Confirmé que los péptidos COX4, SU9 dirigían eficazmente eGFP a las mitocondrias de arroz independientemente de su origen. Utilicé esta metodología para diseccionar y expresar la proteína NifH nitrogenasa Fe, extremadamente sensible al oxígeno, y su maturasa NifM en las mitocondrias de arroz, superando así el cuello de botella más desafiante de la ingeniería de la fijación biológica de nitrógeno en los cereales. Por lo tanto, pude expresar y purificar cantidades sustanciales de NifH a partir de callos de arroz y confirmé que la NifH aislada desempeñaba el papel fundamental de la actividad emzimática de NifH necesaria para diseñar la fijación de nitrógeno, incluida la transferencia de electrones y la biosíntesis de FeMo-co. De esta manera pude demostrar, por primera vez, la expresión y actividad estables de un componente nitrogenasa en cualquier cereal. También usé CRISPR / Cas9 para mutar el OsSBEIIb (que codifica la enzima ramificadora de almidón IIb), que se requiere para la síntesis de amilopectina densamente ramificada en el endospermo del arroz. Investigué los efectos de la inactivación de la enzima de biosíntesis de almidón individual en el almidón de arroz y en su metabolismo general. Las plantas mutantes homocigotas, en las que OsSBEIIb estaba completamente inactivado, produjeron semillas opacas con reservas de almidón agotadas cuyo contenido de amilosa aumentó de 19.6 a 27.4% y el contenido de almidón resistente (RS) aumentó de 0.2 a 17.2%. Debido a la mutación, hubo un aumento general en la acumulación de azúcares, ácidos grasos, aminoácidos y fitoesteroles en el endospermo mutante, lo que sugiere que los intermediarios en la vía de biosíntesis del almidón aumentaron el flujo a través de vías indirectas causando un profundo impacto en la acumulación de múltiples metabolitos primarios y secundarios.