[en] The biological relevance of sperm contribution to the embryo has been shown to go beyond a mere transmission of the paternal genome. Several findings revealed that human spermatozoa carry a complex population of coding and non-coding RNAs with potential implications in multiple fertility-related pathways. Accordingly, the consideration of these molecules as simple residual pools of earlier processes has been left behind. This new paradigm also opens the possibility for potential applications in the field of male fertility biomarkers. However, sperm transcriptomic analysis has several limitations due to the heterogeneity and delicate nature of these molecules, besides the small amount of RNA contained in spermatozoa. In this context, the objective of this Doctoral Thesis is to characterize the human sperm transcriptome to set up the basis for developing new biomarkers of male fertility. Within this goal, the following aims were undertaken: 1) To optimize specific methodologies of sperm RNA analysis using qRT-PCR and RNA-seq strategies; 2) To provide an integrative profiling and functional characterization of sperm mRNAs and lncRNAs by RNA-seq technologies; and 3) To establish new fertility biomarkers among the transcriptomic cargo of the human spermatozoa. For this purpose, the experimental protocols and data analysis were adapted to the inherent limitations of sperm RNA and to the used transcriptomic technology. Therefore, methods for the elimination of non-sperm cells from semen samples were implemented, together with strict quality controls for ensuring the absence of DNA and non-sperm RNA. Besides, an organic solvent-based method was used for qRT-PCR studies, and non-organic solvent kits were employed for RNA-seq. The obtained data were normalized by specific methods depending on the used technique. In particular, the normalization of sperm miRNA qRT-PCR singleplex studies required the determination of a suitable set of normalizing miRNAs molecules. This was achieved by comparing the results derived from a sperm miRNA expression dataset normalized by: i) the reference Mean Centering Restricted (MCR) method; and ii) the expression level of different miRNAs. The miRNAs hsa-miR-100-5p and hsa-miR-30a-5p showed ubiquitous and stable expressions, and data normalized by their mean expression led to results with an appropriate quality when compared to MCR. Therefore, this miRNA combination was suggested as the most suitable choice for data normalization in further sperm singleplex studies. RNA-seq analysis was used to characterize the sperm transcriptome cargo of fertile individuals. Results revealed a complex network of mRNAs and lncRNAs with a high fragmentation status, but containing a host of ubiquitous transcripts. Gene ontology analyses of the whole set of expressed mRNAs showed an enrichment of spermatogenesis and reproduction processes, which was more significant in the sets of highly expressed, ubiquitous, and highly stable mRNAs. Additionally, the functional profiling of potential cis-target genes of the observed lncRNAs showed a significant involvement in embryo development and cell adhesion. This implication became more evident in those cis-target genes that were not present among the sperm mRNA cargo. Finally, the detection of ubiquitous transcripts and pairs of RNAs with correlated expressions suggested a potential use of these molecules as fertility biomarkers. Accordingly, the presence of sperm miRNA pairs with a correlated expression in fertile individuals that was disrupted in infertile patients of different ethiologies (asthenozoospermia, teratozoospermia, oligozoospermia, and Unexplained Male Infertility or UMI) was evaluated and validated by qRT-PCR. The hsa-miR-942-5p/hsa-miR-1208 pair allowed correctly classifying the 85.71% of infertile individuals, thus achieving the highest potential for discerning infertility cases with seminal alterations. Additionally, the pair hsa-miR-34b-3p/hsa-miR-93-3p was highlighted due to its high potential for discerning UMI patients. Besides, several pairs of ubiquitous lncRNAs and mRNAs were also observed to display a correlated expression in fertile individuals, becoming potential candidates for further biomarker studies.

[es] Se ha demostrado que la contribución del espermatozoide al embrión va más allá de la transmisión del genoma paterno. Diversos estudios han mostrado que el espermatozoide humano contiene una compleja población de RNAs implicados en funciones relacionadas con la fertilidad. Por tanto, la visión de estas moléculas como meros restos de eventos previos ha quedado atrás. Este nuevo paradigma abre las puertas a nuevas aplicaciones del RNA en el ámbito de los biomarcadores de fertilidad. Sin embargo, los análisis transcriptómicos en espermatozoides presentan diversas limitaciones debidas a la heterogeneidad y delicada naturaleza de estas moléculas, además de la poca cantidad de RNA contenida en dichas células. En este contexto, el objetivo de esta Tesis Doctoral es caracterizar el transcriptoma del espermatozoide humano y establecer las bases para desarrollar nuevos biomarcadores de fertilidad masculina. Dentro de este objetivo, se plantearon las siguientes metas: 1) optimizar metodologías específicas para analizar el RNA espermático mediante qRT-PCR y RNA-seq; 2) proporcionar un perfil integrado y una caracterización funcional de los mRNAs y lncRNAs espermáticos mediante RNA-seq; y 3) establecer nuevos biomarcadores de fertilidad a partir de la carga transcriptómica del espermatozoide. Con este propósito, se adaptaron tanto el protocolo experimental como el análisis de datos a las limitaciones propias del RNA espermático y a la tecnología transcriptómica usada. Por tanto, se implementaron métodos de eliminación de células no espermáticas de las muestras seminales, así como controles de calidad para asegurar la ausencia de DNA y RNA no espermático. Además, se usó un método basado en solventes orgánicos para los estudios qRT-PCR, y kits de solventes no orgánicos para RNA-seq. Los datos obtenidos se normalizaron usando métodos específicos de la técnica empleada. En concreto, para la normalización de los datos de expresión de miRNAs espermáticos en estudios singleplex qRT-PCR era necesario establecer miRNAs normalizadores. Esto se consiguió comparando los resultados derivados de unos datos que se normalizaron mediante: i) el método Mean-Centering Restricted (MCR); y ii) el nivel de expresión de diferentes miRNAs. Los miRNAs hsa-miR-100-5p y hsa-miR-30a-5p mostraron una expresión estable y ubicua, y su uso derivó en resultados con una calidad semejante a los conseguidos mediante la normalización por MCR. Por tanto, se sugirió esta combinación de miRNAs como la mejor opción para la normalización de futuros estudios singleplex qRT-PCR de miRNAs espermáticos. Por otro lado, se empleó RNA-seq, para caracterizar el transcriptoma espermático de individuos fértiles. Los resultados revelaron una red de mRNAs y lncRNAs en alto estado de fragmentación, pero que contenían un grupo de transcritos ubicuos. Los análisis de Ontología Génica de todos los mRNAs expresados mostraron una implicación en procesos de espermatogénesis y reproducción, la cual era más significativa en los análisis de los mRNAs altamente expresados, ubicuos y altamente estables. Aparte, los potenciales genes dianas en cis de los lncRNAs mostraron relación con procesos de desarrollo embrionario y adhesión celular, la cual prevalecía en los genes dianas que no estaban expresados en espermatozoides. Finalmente, el hecho de hallar transcritos ubicuos y de expresión correlacionada indicó un posible uso de estas moléculas como biomarcadores de fertilidad. Por tanto, se evaluó y se validó la presencia de pares de miRNAs espermáticos con una expresión correlacionada en individuos fértiles y no correlacionada en pacientes infértiles de diferentes etiologías (astenozoospermia, teratozoospermia, oligozoospermia e infertilidad inexplicable [UMI]). El par hsa-miR-942-5p/hsa-miR-1208 permitió clasificar correctamente el 85.71% de los casos de infertilidad, alcanzando el mayor potencial de diagnóstico de pacientes con alteraciones seminales. El par hsa-miR-34b-3p/hsa-miR-93-3p destacó por su potencial para discernir pacientes UMI. Aparte, varios pares de mRNAs y lncRNAs también mostraron expresiones correlacionadas en individuos fértiles, constituyendo unos candidatos potenciales para futuros estudios.