[en] Over the last 20 years, the number of assisted reproduction procedures has drastically increased, and this trend is expected to continue as parenthood is postponed. In Europe, more than half a million in vitro fertilization (IVF) cycles are performed annually, resulting in 100,000 newborns. With the increased use of assisted reproduction, a concomitant increase in success rates would also be expected. However, the pregnancy rate per cycle has remained constant over the same 10-year range, despite important progress in the field. The majority of women using assisted reproduction are over 35 years old, and this needs to be taken into consideration since the rate of chromosomal abnormalities in the oocytes increases with age. As a consequence, advanced maternal age may result in an increase in the number of aneuploid embryos, which would be translated into high miscarriage rates and low live-birth rates. Since we are not able to modify the IVF population or to change embryo quality, our goal should be to focus on improving IVF techniques. Such improvement necessitates a better understanding of the etiology of embryo aneuploidies. Recent advances in imaging and molecular and genetic analyses are postulated as promising strategies to unveil the mechanisms involved in aneuploidy generation. Thus, our goal was to analyse, simultaneously in the same human embryo, morphology, kinetics, transcriptomics and genetics to find a correlation between these parameters in the origin of aneuploidies. Here we combine time-lapse, complete chromosomal assessment and single-cell real-time quantitative PCR to simultaneously obtain information from all cells that compose a human embryo until the approximately eight-cell stage. Our data indicate that the chromosomal status of aneuploid embryos correlates with significant differences in the kinetic pattern when compared with euploid embryos, especially in the duration of the first mitotic phase. We also demonstrate that embryo kinetics is affected by the existence of irregular divisions during development, and this should be taken into consideration for future studies. Gene expression analyses reveal that embryonic genome activation starts as early as the zygote stage. Moreover, gene expression profiling suggests that a subset of genes is differentially expressed in aneuploid embryos during the first 30 hours of development. Thus, we propose that the chromosomal fate of an embryo is likely determined as early as the pronuclear stage and may be predicted by a 12-gene transcriptomic signature. Finally, the atlas generated from the data obtained in this study shows the high variability underlying human embryo development. While euploid embryos seem to follow a uniform development without high variability for morphokinetics, aneuploid embryos may follow different pathways, overlapping with and mimicking euploid embryos in some cases, making them hard to differentiate.

[es] INTRODUCCIÓN Durante los últimos veinte años, el número de procedimientos de reproducción asistida ha aumentado drásticamente e, igualmente, se espera que continúe aumentando debido al retraso existente en la maternidad. En Europa se realizan más de medio millón de ciclos de fecundación in vitro (FIV) cada año, dando lugar a aproximadamente 100.000 recién nacidos, lo cual equivale al 1.5% de niños nacidos en Europa. Junto con la expansión en el campo de la reproducción asistida, el número de avances, tanto técnicos como científicos, también ha ido en aumento. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos, las tasas de embarazo por ciclo han permanecido constantes durante los últimos diez años. Las características de la población que hace uso de estos tratamientos, cuya edad sobrepasa los 35 años en más del 70% de los casos, puede estar correlacionada con la existencia de este techo de cristal, ya que se ha descrito que la tasa de anomalías cromosómicas aumenta significativamente con la edad materna. Como consecuencia, los embriones fecundados in vitro a partir de ovocitos de mujeres de edad materna avanzada tienen una mayor probabilidad de ser cromosómicamente anormales, lo cual tiene como consecuencia un aumento en las tasas de aborto y una disminución en las de recién nacido vivo. Puesto que no existe la posibilidad de modificar las características de la población que requiere tratamientos de FIV, al menos desde un punto de vista clínico, ni tampoco la de modificar la calidad embrionaria a nivel genético, el objetivo actual debería estar dirigido a mejorar las técnicas empleadas durante los tratamientos de FIV para minimizar el posible efecto sobre la calidad embrionaria. Para el desarrollo de nuevas herramientas de cultivo y selección embrionaria es necesario un mejor conocimiento de la biología de los embriones humanos. Sin embargo, debido al uso limitado de estos para fines científicos, el número de estudios en embriones completos y de buena calidad es muy limitado. Y esto, junto a la naturaleza multifactorial de las anomalías cromosómicas, ha hecho aún más complejo encontrar los mecanismos relacionados con las causas y consecuencias de la existencia de aneuploidías durante el desarrollo embrionario. Los avances tecnológicos más recientes en análisis de imagen, análisis molecular y genético se presentan como una prometedora estrategia para desvelar la maquinaria implicada en la generación de aneuploidías. Así, nuestra hipótesis es que tanto la morfología, la cinética, como la transcriptómica del embrión están relacionados con la existencia de aneuploidías, ya sea como causa o como efecto, y un estudio simultáneo de todos estos parámetros en un mismo embrión podría permitir entender mejor la biología del desarrollo OBJETIVOS El objetivo general de este estudio fue investigar en detalle el origen y las consecuencias de la aparición de aneuploidías durante el desarrollo preimplantacional del embrión humano. Para ello, se llevaron a cabo los siguientes objetivos específicos: O1. Realización de un análisis descriptivo del embrión humano a cuatros niveles diferentes: morfología, cinética, transcriptómica y tasa de aneuploidías. O2. Estudio de las posibles relaciones entre morfología, patrones cinéticos, expresión génica y existencia de aneuploidías. O3. Desarrollo de un modelo de predicción de aneuploidías basado en las diferencias más significativas encontradas entre embriones aneuploides y euploides. O4. Integración de los datos sobre morfocinética, transcriptómica y aneuploidías para crear un atlas único sobre el desarrollo preimplantacional humano. MÉTODOS Se descongelaron ciento diecisiete (117) cigotos humanos donados a investigación provenientes de 19 parejas con una edad media materna de 33.7 ± 4.3 años. De ellos, sobrevivieron Ochenta y cinco cigotos, los cuales fueron cultivados usando la tecnología de time-lapse, que permite crear una película del desarrollo embrionario a partir de fotografías tomadas cada 5 minutos. Los embriones fueron cultivados durante diferentes tiempos incluyendo el estadio pronuclear y las siete primeras divisiones mitóticas. Tras el cultivo, cada embrión se desagregó en células individuales, incluyendo los corpúsculos polares en aquellos en estadio de cigoto. La mitad de las células de cada embrión se amplificaron usando la técnica de WGA (Whole Genome Amplification), que permite la amplificación de ADN a nivel de célula única, para ser analizadas posteriormente mediante arrays de CGH (Comparative genomic hybridization) y determinar así su dotación cromosómica. Por otro lado, la otra mitad de las células de cada embrión se analizaron mediante PCR cuantitativa mediante un sistema de microfluidos que permitía el análisis a nivel de célula única. Así, se estudió la expresión de 86 genes relacionados con la existencia de aneuploidías en la bibliografía previa para determinar el perfil transcriptómico de los embriones. Finalmente, se correlacionaron los parámetros morfocinéticos, obtenidos en las películas de time-lapse, el estadio cromosómico y los niveles de expresión génicos para cada embrión. CONCLUSIONES C1. Los parámetros morfológicos pueden tener un comportamiento dinámico durante el desarrollo embrionario. En concreto, los fragmentos celulares, los cuales aparecen mayoritariamente durante la primera división mitótica del embrión pueden dividirse, fusionarse a otros fragmentos o ser reabsorbidos por blastómeras. C2. Los parámetros cinéticos se ven alterados por la existencia de divisiones irregulares durante el desarrollo embrionario, por lo cual estos deben calcularse de manera independiente según el tipo de división para evitar conclusiones confusas. C3. Más de la mitad de los embriones humanos en este estudio, provenientes de pacientes de técnicas de reproducción asistida fueron aneuploides. Además, según los resultados, la incidencia de aneuploidías está correlacionada con la existencia de multinucleación, aunque no con la existencia de fragmentación o vacuolas en el embrión. C4. Durante el desarrollo embrionario, encontramos grupos de genes con diferentes patrones de expresión según su origen de transcripción: materno, embrionario o ambos. Además, se observó que la activación embrionaria ocurre desde el estadio más temprano del embrión humano, el cigoto. C5. La cinética de los embriones aneuploides está alterada en comparación con los euploides. En concreto, el tiempo entre la desaparición pronuclear y el comienzo de la primera citocinesis fue más largo en los embriones aneuploides. Además, el tiempo entre los estadios de tres y cuatro células fue también más largo en los embriones aneuploides, aunque esta diferencia se debió a la mayor proporción de embriones aneuploides con divisiones irregulares, las cuales alteran el patrón cinético embrionario. C6. El perfil transcriptómico de los embriones aneuploides mostró diferencias estadísticamente significativas durante las primeras 30 horas de desarrollo frente al de los embriones euploides. Gracias a estas diferencias, se comprobó que la existencia de aneuploidías en los embriones en estadio de células se puede predecir haciendo uso de una firma transcriptómica basada en 12 genes. C7. El atlas del embrión humano generado con los datos de este estudio muestra una alta variabilidad durante el desarrollo preimplantacional embrionario. Mientras que los embriones euploides parecen seguir una única ruta para desarrollarse satisfactoriamente sin mucha variabilidad en su morfocinética, los embriones aneuploides siguen múltiples rutas, solapándose y camuflándose en ocasiones con el comportamiento de los embriones euploides, dificultando así su diferenciación mediante técnicas no-invasivas.