[en] In the last few years, numerous studies are speedily expanding in search of various biochemical markers found in circulation. Strictly speaking, biomarkers are molecules that detect or confirm the presence of a pathophysiologic condition aiding to establish a diagnosis, refining the prognosis and modifying the treatment. The ideal biomarker exhibits high sensitivity and specificity and should be minimally-invasive. Micro-Ribonucleic Acids (miRNAs) have been proposed as a new class of biomarkers for multiple human diseases. miRNAs are small non-coding RNAs of 19–24 nucleotides in length that play a major role in fine-tuning the expression of protein-coding genes within the human organism as well as they perform a crucial role in the development and maintenance of numerous pathological processes. A substantial number of miRNAs are present outside the cells, circulating in blood and other body fluids. Recently, there has been a significant interest within the research community to discover and validate circulating miRNAs as clinical biomarkers. However, conventional techniques are not particularly suitable to interrogate small RNA species, such as miRNAs. Outside of these conventional tools, a unique PCR-free method for the direct detection of nucleic acids (NAs) based on dynamic chemistry, the so-called dynamic chemical labelling (DCL), has been recently proposed. The approach combines the specific labelling of an immobilized abasic peptide nucleic acid (PNA) capture probe with a biotinylated reactive nucleobase, through the templating action of target NA molecules, allowing NA reading with single base resolution. The DCL method harnesses Watson– Crick base pairing to template a dynamic reductive amination reaction on a strand of an abasic PNA, reaction which is thermodynamically controlled. Complementary NA strands also act as catalysts to accelerate the rate of reductive amination. Therefore, when there are not complementary NA strands, reactions do not happen within the assay timeframe. The aim of this project was to develop, optimise and implement the DCL method into different commercial reading platforms, some of them IVD (in-vitro diagnostic) certified, to reach an assay which allow interrogating patient's biological fluids for obtaining clinical decisions. a) miR-451a, an erythroid cell-specific miRNA associated with human erythroid maturation. b) miR-122, a well-known specific miRNA of liver cells which is an early and more sensitive indicator of drug-induced liver injury (DILI) than other currently used biomarkers such as ALT or AST. c) Simultaneous detection of proteins and miRNAs in a single sample, which we have coined seqCOMBO assay. The DCL method was integrated into two different platforms: a) FLUOstar OMEGA, a conventional multi-mode fluorescent micro-plate reader for a bead-based in order to develop a novel cost-effective manner for profiling miRNAs. b) Luminex MAGPIX system, a bead-based fluorescent assay with multiplexing capabilities. Combining the DCL method with different platforms, direct quantification of miRNAs from biological fluids can be achieved. When used with clinical samples, the developed assay presented an AUC value of 0.94 in distinguishing pathological vs. nonpathological conditions, with no false-positive detected. In this Doctoral Thesis and for the first time, a multiplex assay of molecules from different natures (miRNAs and proteins) has been presented, leaving open a new door for the development of new diagnostic opportunities both in the R&D and IVD markets.

[es] En los últimos años, son numerosos los estudios que se han expandido rápidamente en búsqueda de varios marcadores bioquímicos. Los biomarcadores se definen como moléculas que detectan o confirman la presencia de una condición fisiopatológica, permitiendo así establecer un diagnóstico, un mejor pronóstico, e incluso modificar un tratamiento. Un biomarcador ideal debe ser altamente sensible y específico, además de ser poco invasivo. Los ácidos micro-ribonucleicos (miARNs) se han propuesto como una nueva clase de biomarcadores para múltiples enfermedades humanas. Los miARNs son moléculas pequeñas de ARN, de 19-24 nucleótidos de longitud, que juegan un papel esencial en la modificación de la expresión de genes que codifican para proteínas en el organismo humano, al mismo tiempo que están involucrados en el desarrollo y mantenimiento de numerosos procesos patológicos. Por otro lado, una enorme cantidad de miARNs está presente fuera de las células, circulando en sangre y otros fluidos biológicos. Recientemente se ha despertado un enorme interés dentro de la comunidad científica para descubrir y validar miARNs circulantes como biomarcadores clínicos. Sin embargo, las técnicas convencionales existentes a día de hoy no son totalmente adecuadas para interrogar moléculas pequeñas de ARN, como los miARNs. Dentro de estas herramientas convencionales disponibles, recientemente se ha propuesto un método único, libre de PCR y basado en química dinámica, para la detección directa de ácidos nucleicos: el método dynamic chemical labelling (DCL). Este método combina el marcado específico con un nucleótido reactivo biotinilado sobre una sonda de captura de ácido peptidonucleico (APN) inmovilizada y que contiene una posición abásica, a través de la acción complementaria de la molécula de ARN diana, permitiendo la lectura de ácidos nucleicos con resolución de una sola base. El método DCL está basado en el apareamiento de bases descrito por Watson- Crick, consiguiendo así llevar a cabo una aminación reductiva dinámica sobre una cadena abásica de APN, una reacción termodinámicamente controlada. Además, el ácido nucleico complementario a la cadena abásica de APN actúa como catalizador para acelerar la reacción de aminación reductiva. Así, cuando no existe una cadena de ácido nucleico complementaria, la reacción no tiene lugar dentro del marco de tiempo del ensayo. El objetivo de este proyecto ha sido desarrollar, optimizar e implementar el método DCL en diferentes plataformas, algunas de ellas con certificado IVD (diagnóstico invitro, IVD por sus siglas en inglés), para conseguir un ensayo libre de error que permita interrogar fluidos biológicos de pacientes para tomar decisiones clínicas. Se estudiaron diferentes dianas: a) miARN-451a, un miARN específico de eritrocitos asociado a la maduración eritrocitaria en humanos. b) miARN-122, un miARN específico de células hepáticas y bien conocido por ser un indicador de enfermedad hepática inducida por fármacos (DILI), siendo más sensible que otros de los biomarcadores actualmente en uso como ALT o AST. c) Un múltiplex de moléculas de distinta naturaleza, en un mismo ensayo y desde una misma muestra, el cual hemos llamado ensayo COMBO, para la detección de miARNs y proteínas. El método DCL se integró en dos plataformas distintas: a) FLUOstar OMEGA, un lector de placas convencional que, aplicado a ensayos basados en micropartículas, permite desarrollar un ensayo económico para la cuantificación de miARNs. b) El sistema Luminex® MAGPIX® para el desarrollo de un ensayo basado en la fluorescencia de micropartículas magnéticas con capacidades multiplexing. Mediante la combinación del método DCL con las diferentes plataformas se ha conseguido la cuantificación directa de miARNs en fluidos biológicos. En su aplicación a muestras clínicas, se ha demostrado un ensayo libre de errores en la distinción entre condición patológica y no patológica, dejando a un lado la posibilidad de falsos positivos debido al trasfondo químico de la metodología. En esta Tesis Doctoral se ha conseguido por primera vez en el mundo un múltiplex de moléculas de distinta naturaleza (miARNs y proteínas), dejando una puerta abierta para el desarrollo de prometedoras oportunidades de diagnóstico.