[en] Increasing evidence suggests that circulating tumor cells (CTCs) in the peripheral blood are associated with reduced progression-free survival and overall survival in non-metastatic breast cancer patients. Whereas the detection of CTCs before the start of a new treatment has been associated with poor prognosis, the enumeration of CTCs shortly after the initiation of therapy provides additional information regarding clinical outcomes. Current therapy decision-making is based on the analysis of the primary tumor, although restaging of metastatic lesions that occur many years after the diagnosis of the primary tumor has started to become more acceptable. However, biopsies of metastatic lesions are invasive procedures and, therefore, the analysis of CTCs as representatives of metastatic lesions (liquid biopsy) might be a good alternative that also allows for an assessment of resistance to therapy in real-time. In the case of non-metastatic disease, the assessment of CTCs would allow the study of the minimal residual disease which is the target of systemic treatments. Mutations in therapeutic targets or proteins downstream of the target can affect the efficacy of drugs against these targets. For example, alterations in the HER2 oncogene, which is amplified in approximately 20% of primary breast cancers and has become a key target for therapies with antibodies and tyrosine kinase inhibitors. Another important biological target in breast cancer is the estrogen receptor (ER). Interestingly, only 1% of tumor cells need express ER to be considered ER+. Thus, it is conceivable that ER+ tumors shed ER− CTCs, which are the source of ER− metastases that may arise after years of ER-targeting therapies. The aim of the first part of this thesis was to analyze a set of 5 markers in CTCs of patients with non-metastatic breast cancer. These markers included expression of ER, progesterone receptor and EGFR and amplification of HER2 and Topoisomerase 2α (TOP2A). We collected 30 ml of blood at baseline and after a systemic chemotherapy. Heterogeneity was found in the expression of these markers in samples from the same patients. In addition, discordances between the status of these markers in CTCs and corresponding primary tumors were found. Less than 35% of the patients switched their CTC status after receiving chemotherapy. Interestingly, EGFR+ CTCs were significantly associated with Luminal tumors- characterized by ER and/or PR positive expression and HER2-negative. Our study suggests that CTC biomarkers profiles might be useful as a surrogate marker for therapeutic selection and monitoring since heterogeneity of the biomarker distribution in CTCs and the lack of correlation with the primary tumor biomarker status were found. The second aim of this Thesis was to characterize CD133 expression in CTCs in the same patient population. CD133 positive CTCs were identified in 65% of patients at baseline and 47.8% after systemic therapy. Those patients HER2 wild type and with low KI67 index were positively correlated with presence of CD133 positive CTCs. Before any treatment, CD133 positive CTCs were more frequently isolated in patients with luminal BC subtype. No statistically significant differences were found between proportion of CD133 positive CTCs and breast cancer subtypes after systemic therapy, implying a relative enrichment of CD133 positive CTCs in triple negative and HER2-amplified tumors. While CTCs decreases after chemotherapy when analyzing the whole population, CD133 positive CTCs were enriched in post-treatment samples in nonluminal BC subtypes. These findings suggest the potential roleof CD133 as a promising marker of chemoresistance in nonluminal BC patients.

[es] Existe evidencia creciente de que las células tumorales circulantes en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama no-metastático se asocian a peor supervivencia libre de progresión y supervivencia global. Mientras que la detección de CTCs antes del inicio de un tratamiento sistémico se ha asociado a un peor pronóstico, la enumeración de CTCs después del inicio de un tratamiento también aporta información adicional con respecto a los resultados clínicos. Las decisiones terapéuticas en la actualidad se basan en el análisis del tumor primario, aunque el re- estadiage de lesiones metastáticas que pueden ocurrir muchos años después del diagnóstico primario, han empezado a ser más aceptables. Sin embargo, biopsiar lesiones metastáticas en general es un procedimiento invasivo y por lo tanto, el análisis de CTCs (biopsia liquida) podría ser una buena alternativa que además permitiría la evaluación de resistencia a los tratamientos en tiempo real. En el caso de la enfermedad no metastática nos permitiría el estudio de la enfermedad mínima residual a la que van dirigidos los tratamientos adyuvantes. Mutaciones o alteraciones en dianas terapéuticas o proteínas en la vía de señalización pueden influir la eficacia de las frogas que van contra estos agentes. Por ejemplo, la alteración del oncogene HER2, el cual esta amplificado en un 20% de los canceres de mama y es una diana para tratamientos con anticuerpos e inhibidores de la tirosina quinasa. Otra importante diana biológica es el receptor de estrógeno (RE). Solamente 1 % de las células tumorales en el tumor primario necesitan expresar RE para que este tumor se considere RE+. Por lo tanto, es esperable que los tumores RE+ siembren células RE-, las cuales serían la fuente de metástasis que pueden formarse después de años de tratamiento endocrino. El objetivo de la primera parte de la tesis fue analizar un grupo de 5 marcadores en CTCs de pacientes con cáncer de mama no metastática. Estos marcadores incluyeron la expresión del RE, receptor de progesterona (RP) y la amplificación del den HER2 y la Topoisomerasa 2α (TOP2A). Recogimos 30 mililitors de sangre baseles y después del tratamiento sistémico. Observamos heterogeneidad en la expresión de estos marcadores en CTCs en muestras de un mismo paciente. Además, se observó discordancia entre el estado de la expresión de estos marcadores en las CTCs y sus correspondientes tumores primarios de origen. Menos del 35% de pacientes cambiaros el estado de las CTCs después de recibir un tratamiento sistémico. Curiosamente, aquellas CTCs con expresión positiva para el EGFR se asociaron de forma significativa a los tumores luminales - caracterizados por el RE y/o RP positivos y HER2-negativo. Nuestro estudio sugiere que el perfil de biomarcadores en CTCs podría ser útil como marcador surrogado para la selección y monitorización- dado la heterogeneidad de la distribución de marcadores en CTCs y la falta de correlación con el estado de estos biomarcadores en el tumor primario. EL segundo objetivo de la Tesis fue caracterizar la expresión de CD133 en CTC en la misma población de pacientes. Las CTc CD133 positivas fueron identificadas en el 65% de las pacientes en las muestras basales y en el 47.8% después de un tratamiento sistémico. Aquellas pacientes HER2-normal y con bajo índice Ki67 se correlacionaron positivamente con la presencia de CTCs positivas para CD133. Antes de ningún tratamiento, Las CTCS CD133 positivas fueron más frecuentemente aisladas en pacientes con cáncer de mama subtipo luminal. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre la proporción de CTCS CD133 positivas y los subtipos de cáncer de mama después del tratamiento sistémico, lo que sugiere un enriquecimiento de CTCS CD133 positivas en pacientes con tumores triple negativos y HER2-amplificados. Mientras que las CTCs disminuyeron después de quimioterapia cuando se analizó la población completa, CTCS CD133 positivas fueron más abundantes en muestras post-tratamiento en aquellas pacientes con tumores no luminales. Estos hallazgos sugieren que CD133 podria tener un papel importante como marcador de quimioresistencia en pacientes con tumores no-luminales.