[en] This Doctoral Thesis studies different fast folding proteins through diverse thermodynamic techniques and structural methods, to obtain cooperativity and behaviour information. Among the thermodynamic techniques are different equilibrium spectrometry techniques as far-UV Circular Dichroism, Fluorescence, Fourier Transform Infra-Red, as well as Differential Scanning Calorimetry. The protein candidates are expected to have fast folding, with folding under the microseconds timescale. Until mid 1990s fast folding proteins were out of the available techniques until the breakthrough of different techniques that allowed working with faster timescales. Fast folding proteins proteins expand the knowledge of the folding and might cover the gap between experimental and computational methods, since traditionally the last ones have been able to explore only processes on the sub-millisecond timescale. The experimental identification of the different folding scenarios predicted by the folding funnel hypothesis of the energy landscape theory by Bryngelson et al. [1] is a fundamental step. In 1999 V. Muñoz and W.A. Eaton [2,3] proposed the selection of some candidates to search for downhill folding scenarios versus the classical two-state folding mechanism. Fast folding proteins frequently show downhill folding since a small or inexistent energy barrier speeds up the folding process, and they may function as molecular rheostats [4-6], with different functions depending on the conformation. For this Thesis project we focus on possible candidates of the downhill folding mechanism since the shallow energy barrier allows to study the barrier top populations [7]. Therefore, initially two relatively small proteins with different secondary structure content were selected to study the folding patterns related to these structures: a WW domain (the third domain from mouse Ubiquitin-protein ligase Nedd4-2), with all beta-sheets; and a R3H domain (from the human sperm-associated antigen 7), with beta-sheet and alpha-helix secondary structure. These domains showed different thermodynamic behaviour related to their secondary structure content and hydrophobic forces among others. The thermodynamic study of the WW domain shows features typical of the downhill-like scenario, with structural flexibility in the native state and broad unfolding transitions and melting temperatures dispersion. However, the R3H domain has a cooperative unfolding despite the slight loss of structure in the pre-transition region by the fraying of the alpha-helices. Furthermore, two interesting proteins from a folding point of view are also studied with different techniques in the field of the Nuclear Magnetic Resonance (NMR), the HP35 subdomain from Villin protein, and gpW protein. The HP35 subdomain has been frequently used for molecular simulation studies, and we will focus on the atomic unfolding of some residues with NMR taking as reference the atom-by-atom NMR study by Sadqi et al. [8] on the one-state downhill folder BBL domain (from the E2 subunit of the 2-oxoglutarate-dehydrogenase enzyme from Escherichia coli). This subdomain presented less heterogeneity than would be expected for a fast-folding protein (which folding would be initially predicted towards the downhill regime), and becomes the fastest protein with two-state folding. A similar study was performed by Sborgi et al. [9] on gpW protein, for which the atom-by-atom shows the behaviour of different NMR probes (amide 15N and 1HN, 13Cα and 13Cβ), which can be complex if the process is progressive like for downhill proteins [8] or more homogeneous like for two-state proteins [10] (even different tendencies may appear along the temperature range). Hence, the thermal unfolding of gpW protein has been thermodynamically studied [11], along with analysis of the process at atomic level by NMR [9]. However, its native state may be a non-static structure since proteins change upon variations in their environment. To be able to deepen our understanding of the native state of gpW protein there was a barrier to overcome, since it has a folding rate too fast for the timescale affordable by Relaxation Dispersion NMR. This technique distinguishes meta-stable conformations at levels almost undetectable with regular techniques, that usually average structures, making impossible to discern this very low populated states. Our detailed analysis provides information on the exchange between the native and the low populated, "invisible", state, reflecting the non-static protein structure, in which this last state has almost intact alpha-helices while the beta-hairpin is unfolded, even at low temperature, and appears as a productive intermediate at the end of the kinetic folding pathway. This low stability region of the beta-hairpin was observed in other systems, and has been proposed to play a possible role as conformational switch [12].

[es] En esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo un estudio termodinámico y estructural detallado de diferentes proteínas de plegamiento rápido con objeto de caracterizar su cooperatividad. Entre las técnicas empleadas para obtener información termodinámica se encuentran distintas espectrometrías en equilibrio como dicroísmo circular de ultravioleta lejano, fluorescencia, infrarrojos con transformada de Fourier, así como calorimetría diferencial de barrido. Las proteínas seleccionadas se espera que tengan un plegamiento rápido, con tiempos de microsegundos o inferiores. Hasta mediados de los años 90, las proteínas de plegado rápido habían quedado fuera de las técnicas instrumentales disponibles, hasta el gran avance en las técnicas capaces de trabajar en esas escalas de tiempo. Las proteínas de plegamiento rápido amplían el conocimiento del plegamiento proteico y cubren la brecha que separa los métodos experimentales y los computacionales, ya que tradicionalmente estos últimos tan solo han sido capaces de investigar procesos por debajo de la escala de milisegundos. La identificación experimental de los distintos escenarios de plegamiento predichos por la hipótesis de Bryngelson et al. [1] del paisaje de energía con forma de embudo que determina el plegamiento proteico es una tarea primordial. En 1999 V. Muñoz y W. A. Eaton [2,3] propusieron la selección de proteínas candidatas para la búsqueda de escenarios de plegamiento downhill frente al clásico mecanismo de dos estados. Las proteínas de plegado rápido con frecuencia presentan un plegamiento downhill ya que su pequeña o nula barrera energética acelera el plegamiento, y parece que pueden tener posibles funciones como interruptores o reóstatos moleculares [4-6], debido a que dependiendo de la conformación adoptada su función podría variar. Para esta Tesis nos centramos en proteínas candidatas a un posible plegamiento tipo downhill, ya que la pequeña barrera energética de estas proteínas permitiría el estudio de las poblaciones en lo alto de la barrera [7]. Por tanto, inicialmente se seleccionaron dos proteínas relativamente pequeñas con distinto contenido de estructura secundaria para estudiar los patrones de comportamiento relacionados con la estructura: un dominio WW (el tercer dominio WW de la ligasa de ubiquitina de ratón Nedd4-2), formado por láminas beta; y un dominio R3H (perteneciente al antígeno 7 asociado a esperma humano), tanto con láminas beta como con hélices alfa. Estos dominios muestran distinto comportamiento termodinámico que se relaciona, entre otras características, con su contenido de estructura secundaria, así como con las fuerzas hidrófobicas internas. En el dominio WW el estudio termodinámico ofrece características del plegamiento tipo downhill con su flexibilidad estructural típica en el estado plegado, y con un desplegado progresivo con dispersión de las temperaturas de transición entre ambos estados. Sin embargo, el dominio R3H presenta un plegamiento más cooperativo a pesar de una pérdida de estructura de las hélices alfa previo al desplegado. Además, otras dos proteínas interesantes desde el punto de vista de su plegamiento se han estudiado por distintas técnicas de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), el dominio HP35 de la proteína Vilina, y la proteína gpW. El subdominio HP35 se ha usado con frecuencia en estudios de simulación molecular, y en él nos centramos en el desplegado de algunos de sus residuos seguido a nivel atómico por RMN, tomando como referencia el estudio "atom-by-atom" realizado por Sadqi et al.8 sobre el dominio downhill de un estado BBL (procedente de la unidad E2 de la enzima 2-oxoglutarato-deshidrogenasa de Escherichia coli). El subdominio HP35 mostró menos variación a la esperada de una proteína de plegamiento rápido con tendencia, en principio, hacia un escenario tipo downhill, convirtiéndola en la proteína más rápida con plegamiento de dos estados. Un estudio parecido se había llevado a cabo por Sborgi et al. [9] en la proteína gpW, para la cual el estudio atom-by-atom muestra el comportamiento de distintas sondas de RMN (15N y 1HN amídicos, 13Cα and 13Cβ), que puede ser complejo para procesos de plegamiento gradual como el caso de las proteínas tipo downhill [8] o más homogéneo para proteínas de dos estados [10] (a pesar de que pueden aparecer distintas tendencias a lo largo de rango de temperaturas). Por tanto, el desplegamiento térmico de la proteína gpW ha sido estudiada por técnicas termodinámicas [11], así como seguida a nivel atómico por RMN [9]. Sin embargo, su estado nativo puede ser una estructura no estática, ya que las proteínas cambian por alteraciones en su ambiente. Para ser capaces de profundizar en nuestro conocimiento del estado nativo de gpW hay que superar un obstáculo debido a la velocidad de plegado de esta proteína, muy rápida para las escalas de tiempo que abarca la Relajación Dispersiva (RD) por RMN. Esta técnica de RD por NMR permite detectar conformaciones metaestables en equilibrio con el estado nativo, que son casi imperceptibles por técnicas habituales, que normalmente promedian todas las estructuras, imposibilitando la distinción de estados poco poblados. Este detallado análisis ha permitido obtener información sobre la interconversión del estado nativo de la proteína con un estado "invisible", poco poblado, que refleja la estructura no estática de la proteína. Este estado "invisible" tiene una estructura con las hélices alfa prácticamente intactas y la región de las hebras beta desestructuradas, incluso a bajas temperaturas, y aparece como un estado productivo intermedio al final del plegamiento. La región que se pierde su estructura al desplegarse puede contribuir a funciones de la proteína como interruptor conformacional (que se esperaría en una proteína con plegamiento downhill), anteriormente propuesto en otros sistemas con baja estabilidad en las láminas beta [12].