[ca] L'ús de proteïnes com a anticossos i de les citocines com a teràpia ha anat augmentant de manera constant en les últimes tres dècades. Malgrat l'èxit de les bioteràpies en el tractament de diverses malalties, aquests sovint s'associen amb efectes secundaris que en limiten la dosi. Per tant, hi ha una creixent tendència a controlar la seva activitat terapèutica mitjançant senyals interns o estímuls externs. L' activació selectiva de les teràpias permet millorar tant la seguretat com l'eficàcia del tractament i, fins i tot, pot permetre la incorporació d'antígens que d'altra manera es consideren no farmacològics. Aquesta tesi pretenia desenvolupar noves estratègies per a generar proteïnes condicionalment actives per a aplicacions terapèutiques. La tesi es divideix en dues parts, la primera es centra en el desenvolupament d'un fragment d'anticòs variable de cadena senzilla (scFv) sensible a diferents estímuls, mentre que la segona explora l'aplicació d'eines de disseny de proteïnes de novo per a dissenyar fragments que emmascaren diferents proteïnes terapèutiques. L'objectiu principal de la primera part d'aquesta tesi va ser desenvolupar un scFv sensible a estímuls i dirigit contra CD133 per a administrar càrregues terapèutiques a les cèl·lules mare del glioma. Per a això, en primer lloc, es va desenvolupar un protocol per a produir i caracteritzar aquest scFv i, seguidament, es van investigar dos enfocaments d'emmascarament diferents. Com que l'emmascarament amb un fragment d'antigen no va funcionar com s'esperava, vam imaginarne un de nou per a impedir estèricament les interaccions scFv-antigen mitjançant la conjugació específica de lloc amb un polímer flexible. Després de seleccionar vuit llocs de conjugació diferents, vam identificar una posició que maximitzava l'eficiència de l'emmascarament sense afectar l'afinitat del scFv desenmascarat pel seu objectiu. Amb aquest mutant, es va avaluar la capacitat d'emmascarament de polímers amb diferents mides i naturaleses. Finalment, es va implementar la capacitat de resposta a dos estímuls diferents i es va confirmar la recuperació de l'afinitat d'unió després del tractament amb l'estímul adequat. L'enfocament d'emmascarament ideat a la primera part d'aquesta tesi té el potencial d'aplicar-se a qualsevol format d'anticòs, amb qualsevol especificitat d'antigen i qualsevol estímul d'activació. D'altra banda, l'objectiu principal de la segona part d'aquesta tesi va ser avaluar la idoneïtat de les eines de disseny de proteïnes de novo per a la generació de bioteràpies sensibles a proteases. Per a aquest estudi es van utilitzar com a proteïnes model un minibinder hiperestable dissenyat de novo contra EGFR i imitadors de dos citocines, IL-2 i IL-21. Es van aplicar una varietat de mètodes computacionals desenvolupats recentment per a dissenyar màscares que interaccionen específicament amb la proteïna d'interès i eviten la seva unió al receptor. Vam confirmar que les màscares per al minibinder anti-EGFR i l'imitador IL-21 van permetre reduir la unió de l'antigen en diversos graus. A més, es va observar la recuperació de la capacitat d'unió després de la escissió proteolítica de la màscara. Els nostres experiments confirmen que els mètodes de disseny de proteïnes de novo són eines valuoses que poden ajudar a la generació de bioteràpies condicionalment actives. En general, hem desenvolupat noves estratègies per a fer que diferents proteïnes siguin sensible a estímuls i que es puguin utilitzar per crear teràpies potencialment més segures i eficients.

[en] The use of proteins, such as antibodies and cytokines, as therapeutics has been steadily increasing in the past three decades. Despite the success of biotherapeutics in the treatment of a variety of diseases, oftentimes they are associated with dose-limiting side effects. Therefore, there is an increasing trend aiming to control biotherapeutic activity with specific internal cues or external stimuli. Selective activation of the therapeutics enables improving both the safety and the efficacy of the treatment and may even enable engaging antigens otherwise considered undruggable. This thesis aimed to develop new strategies to generate conditionally-active proteins for therapeutic applications. The thesis is divided in two parts, the first one focusses on the development of a single-chain variable antibody fragment (scFv) responsive to different stimuli, while the second one explores the application of de novo protein design tools to design masking moieties for different therapeutic proteins. The main objective of the first part of this thesis was to develop a stimulus-responsive version of an scFv directed against CD133, to deliver therapeutic cargoes to glioma stem cells. To this end, first, a procedure to produce and characterize the target scFv was developed. Following this, two different masking approaches were investigated. Since masking with an antigen fragment did not work as expected, we envisioned a new approach to sterically hinder scFv-antigen interactions via site-specific conjugation of a flexible polymer. After screening eight different conjugation sites, we identified one position that maximised masking efficiency without affecting affinity of the unmasked scFv for the target. With this mutant, the masking capability of polymers with different sizes and natures was assessed. Finally, responsiveness to two different stimuli was implemented and rescue of the binding affinity upon treatment with the appropriate stimulus was confirmed. The masking approach devised in the first part of this thesis has the potential of being applied to any antibody format, with any antigen specificity, and any activation stimulus. In the second part of this thesis, the main objective was to evaluate the suitability of de novo protein design tools for the generation of protease-responsive biotherapeutics. A de novo designed hyper-stable binder against EGFR and two cytokine mimics, IL-2 and IL-21 mimic, were used as model proteins for this study. A variety of recently-developed computational methods were applied to design masks that interact specifically with the protein of interest and should prevent its binding to the receptor. We confirmed that the masks for the anti-EGFR minibinder and the IL-21 mimic enabled reducing antigen binding by several orders of magnitude. Moreover, rescue of the binding capability after proteolytic cleavage of the mask was observed. Our experiments confirm that de novo protein design methods are valuable tools that can aid in the generation of conditionally active biotherapeutics. Overall, we have developed several new strategies to render different proteins conditionallyactive, which can now be used to create potentially safer and more efficient therapies.