[en] The arrival of super-resolution techniques has driven researchers to explore biological areas that were unreachable before. Such techniques not only allowed the improvement of spatial resolution in images but also the possibility to perform quantitative measurements at the single-molecule level. The interest in that particular field has been growing over the years and new and more sophisticated tools have been developed. Neuroscience has been one of the first fields to adapt and benefit from super-resolution microscopy. These techniques opened a new window of opportunity to reveal spatial organization of the neuronal cytoskeleton and the molecular organization and dynamics of the synapse, structures below the spatial resolution limit of conventional light microscopy. Protein organization and stoichiometry is central for synaptic transmission in neurons. Knowing the absolute numbers of proteins playing a key role in diseases can be of extreme interest in order to understand the mechanisms that lead to such neurological disorders. In this thesis we exploited the super-resolution techniques to develop a pioneering method for quantitative single-molecule measurements and to unravel the organization of a synaptic protein complex that was never visualized before with nanoscale spatial resolution. We developed a novel method in order to quantify the photoactivation efficiency of eight different photoswitchable fluorescent proteins commonly used in super-resolution experiments. We used the glycine receptor as a template because of its well-known stoichiometry and tagged eight different photoswitchable fluorescent proteins to the a- and ß-subunits of this receptor and transiently transfected them to Xenopus oocytes. The fact that the fluorescent proteins are genetically encoded make them highly suitable for quantitative single-molecule counting. The photoactivation efficiency, which is the percentage of a fluorescent protein that photoactivates into a fluorescently detectable form, plays a critical role in properly interpreting quantitative measurements. Moreover, we also focused our studies on super-resolution imaging of a synaptic protein complex, called LGI1 complex. This ensemble of proteins is one of the main key players involved in different neurological disorders. Leucine rich glioma activated 1 (LGI1) is a neuronal protein that forms a trans-synaptic bridge linking pre- and postsynaptic transmembrane proteins (ADAM22 and ADAM23) and helps to organize a multimeric complex at the synapse including AMPA receptors and voltage-gated potassium channels (VGKC). LGI1 autoimmune encephalitis is a severe neuropsychiatric disorder related to epilepsy where the patients produce autoantibodies against LGI1, which alter synaptic plasticity. However, the molecular mechanisms that lead to the observed problems in patients still remain largely unknown. Using well-characterized synaptic markers as molecular standards, we determined the positioning of LGI1 and the other related proteins within the synaptic space at nanoscale resolution by means of multi-color STORM. Further, the comparison of this molecular architecture in healthy neurons versus neurons treated with antibodies from patients suffering from LGI1 autoimmune encephalitis showed that these antibodies impact the nanoscale organization of pre-synaptic proteins. These results suggested a loss of LGI1 interaction with pre-synaptic proteins upon antibody binding and gave further insight into early changes in pathology.

[es] La microscopía de fluorescencia ha evolucionado enormemente en la última década. La llegada de las técnicas de super-resolución ha llevado a los investigadores a explorar áreas de biología, anteriormente inalcanzables. Estas técnicas han permitido no solo mejorar la resolución espacial en imágenes sino que también la posibilidad de realizar medidas cuantitativas al nivel de una sola molécula. El interés en este campo ha ido creciendo a lo largo de los años y se han desarrollado nuevas técnicas, cada vez más sofisticadas. La neurociencia ha sido un campo tradicionalmente dirigido por las nuevas tecnologías, con métodos como técnica de fijación de membranas y la microscopía de excitación de dos fotones que han revolucionado nuestro entendimiento de cómo funcionan las células del cerebro. Por ello, no es sorprendente que la neurociencia haya sido uno de los primeros campos en adaptarse y beneficiarse de la microscopía de super-resolución. Estas técnicas han abierto una nueva ventana de oportunidades para revelar la organización espacial en el cito esqueleto neuronal y la organización molecular y dinámica de la sinapsis, ambas estructuras por debajo del límite de resolución espacial de la microscopía de luz convencional. La organización de las proteínas y su estequiometria es clave para la transmisión sináptica en neuronas. El conocimiento de los números absolutos de proteínas que juegan un papel crucial en enfermedades puede ser de enorme interés para entender los mecanismos que llevan a tales disfunciones neurológicas. En esta tesis hemos explotado las técnicas de super-resolución para desarrollar un método pionero para medidas cuantitativas de una sola molécula y para desvelar la organización de un complejo de proteínas sinápticas que no se había visualizado hasta la fecha con resolución espacial a nanoescala. El capítulo 1 pone en contexto el campo de la neurociencia al nivel nanométrico. Se introducen las partes principales de las neuronas y se explica la importancia de conocer la estequiometría molecular en complejos proteínicos sinápticos. En el capítulo 2 se describen las técnicas de microscopía de fluorescencia en super-resolución, enfatizando sus características más relevantes. Adicionalmente, se explican diferentes ejemplos de estas técnicas implementadas en neuronas. Adaptaciones de estos ejemplos son algunos de los métodos usados en esta tesis. El capítulo 3 muestra un método novedoso que hemos desarrollado para cuantificar la eficiencia de fotoactivación de diferentes proteínas fluorescentes fotoconmutables, usadas de manera común en los experimentos de super-resolución como PALM. Usamos el receptor de glicina como modelo por su conocida estequiometria. Aprovechando este modelo, etiquetamos ocho proteínas fluorescentes fotoconmutables (mEos2, 3.1 y 3.2, Dendra2, mClavGR2, mMaple, PA-GFP y PA-mCherry) a las subunidades α y β del receptor de glicina y las transfectamos a ovocitos de Xenopus. El hecho que las proteínas fluorescentes están codificadas genéticamente las hace especialmente adecuadas para cuantificar proteínas individualmente. La eficiencia de fotoactivación, es decir, el porcentaje de una proteína fluorescente que se fotoactiva a una forma fluorescente detectable juega un papel crucial para una correcta interpretación de medidas cuantitativas. El capítulo 4 está centrado en la obtención de imágenes en super-resolución de un complejo proteínico sináptico, llamado complejo de LGI1. Este conjunto de proteínas es uno de los actores principales involucrados en ciertos trastornos neuronales. Leucine rich glioma activated 1 (LGI1) es una proteína neuronal que forma un puente trans-sináptico uniendo proteínas de membrana pre- y post-sinápticas (ADAM22 y ADAM23) y ayuda en la organización de un complejo multimérico en la sinapsis que incluye receptores AMPA y canales de potasio dependientes del voltaje (VGKC). La encefalitis autoinmune de LGI1 es un severo trastorno neurosiquiátrico relacionado con epilepsia en que los pacientes producen anticuerpos contra LGI1, alterando la plasticidad sináptica. Sin embargo, los mecanismos moleculares que desembocan a los problemas observados en pacientes aún son bastante desconocidos. Usando marcadores sinápticos que han sido altamente caracterizados (Homer y Bassoon) como estándares moleculares, hemos determinado la posición de LGI1 y las otras proteínas relacionadas en el espacio sináptico en resolución a nanoescala gracias al uso de la técnica de STORM en multi-color. Además, la comparación de esta arquitectura molecular en neuronas sanas y neuronas tratadas con anticuerpos de pacientes con encefalitis autoinmune de LGI1 mostró que dichos anticuerpos causan un impacto en la organización de las proteínas pre-sinápticas. Estos resultados sugieren una pérdida de la interacción de LGI1 con proteínas pre-sinápticas a causa de los anticuerpos enlazados y dan una visión más clara en los primeros cambios en la patología. El capítulo 5 resume todos los resultados logrados en esta tesis y muestra una visión de las direcciones futuras posibles para complementar los resultados conseguidos o proporcionar ideas nuevas para resolver las nuevas cuestiones derivadas de nuestros resultado