[ca] Els cromosomes han de ser manipulats amb compte per mantenir la integritat del genoma. La família de complexos proteics SMC contribueix a organitzar el genoma en llaços de cromatina, utilitzant la seva activitat d'ATPasa per associar-se i plegar els cromosomes durant transaccions crítiques com la transcripció, replicació o segregació cromosòmica. Concretament, el complex Smc5/6 juga un paper fonamental en la reparació i la disjunció de cromosomes. Amb aquesta finalitat, les subunitats principals Smc5 i Smc6 s'associen amb sis elements no SMC (subunitats NSE). Recentment, s'ha demostrat que dues d'elles, Nse5 i Nse6, regulen l'activitat ATPasa del complex. D'altra banda, les subunitats Nse1 i Nse2 contenen dominis de tipus RING amb activitat lligasa E3 d'ubiquitina i SUMO, respectivament. Tanmateix, el coneixement de com es coordinen les tres activitats del complex és limitat. Aquesta tesi aprofundeix en diversos aspectes de l'organització i les activitats bioquímiques del complex Smc5/6 de S. cerevisiae. En primer lloc, mostrem que el subcomplex Nse1/3/4 s'acobla a partir d'interaccions seqüencials i cooperatives al voltant del domini ATPasa de Smc5. Al seu torn, el subcomplex Nse1/3/4, juntament amb interaccions entre les articulacions presents als braços, ajuda a la interacció entre els dominis ATPasa de Smc5 i Smc6. Així mateix, els nostres resultats suggereixen una relació intricada entre els subcomplexes Nse1/3/4 i Nse5/6 per a la seva unió al voltant dels dominis ATPasa. En segon lloc, demostrem que la inhibició de la hidròlisi d'ATP atrapa el complex en l'ADN d'una manera independent de Nse5/6, resultant en una interacció proteïna-ADN prou forta per evitar que Smc5/6 se'n dissociï. In vivo, la inhibició de la hidròlisi d'ATP afecta negativament la viabilitat cel·lular i la segregació cromosòmica, ja que interfereix en la resolució d'estructures d'ADN. En tercer lloc, confirmem que l'activitat de lligasa E3 de SUMO prové exclusivament del domini SP-RING de Nse2, sense cap contribució de Nse5/6, i que l'ADN estimula aquesta activitat. A més, determinem llocs de SUMOïlació dins del complex Smc5/6 mitjançant proteòmica, identificant empremtes de SUMOïlació com a possibles llocs d'unió de Nse5/6, que també han estat predits amb AlphaFold Multimer. Finalment, no aportem evidències d'activitat d'ubiquitinació dependent de Nse1, tot i que mostrem que el complex Smc5/6 promou la formació de cadenes d'ubiquitina de manera independent de Nse1. En resum, la nostra recerca ofereix noves perspectives sobre l'organització del complex Smc5/6 i la regulació de les seves activitats bioquímiques, incloent-hi la unió a l'ADN dependent d'ATP i les funcions de lligasa E3 de SUMO i, potencialment, d'ubiquitina.

[es] Los cromosomas deben ser manipulados cuidadosamente para mantener la integridad del genoma. La familia de complejos proteicos SMC contribuye a estructurar el genoma en lazos de cromatina, utilizando su actividad ATPasa para asociarse y organizar los cromosomas durante transacciones críticas como la transcripción, replicación o segregación. En concreto, el complejo Smc5/6 desempeña roles cruciales en la reparación y disyunción de cromosomas. Para este fin, las subunidades centrales Smc5 y Smc6 se asocian con seis elementos no SMC (subunidades NSE). Recientemente se ha demostrado que dos de ellas, Nse5 y Nse6, regulan la actividad ATPasa del complejo. Por otro lado, las subunidades Nse1 y Nse2 contienen dominios de tipo RING con actividad ligasa E3 de ubiquitina y SUMO, respectivamente. Sin embargo, cómo se coordinan las tres actividades del complejo permanece poco comprendido. Esta tesis profundiza en varios aspectos de la organización y actividades bioquímicas del complejo Smc5/6 de S. cerevisiae. En primer lugar, mostramos que el subcomplejo Nse1/3/4 se ensambla a partir de interacciones secuenciales y cooperativas alrededor del dominio ATPasa de Smc5. A su vez, la interacción entre los dominios ATPasa de Smc5 y Smc6 se sustenta a través de Nse1/3/4 e interacciones entre las articulaciones presentes en los brazos. Además, nuestros resultados sugieren una relación intrincada entre los subcomplejos Nse1/3/4 y Nse5/6 para su ensamblaje alrededor del dominio ATPasa. En segundo lugar, demostramos que la inhibición de la hidrólisis de ATP inmoviliza el complejo en el ADN de manera independiente de Nse5/6, resultando en una fuerte interacción proteína-ADN que evita que Smc5/6 pueda separarse del ADN. In vivo, la inhibición de la hidrólisis de ATP afecta negativamente la viabilidad celular y la segregación de cromosomas al interferir con la resolución de estructuras cromosómicas. En tercer lugar, confirmamos que la actividad ligasa E3 de SUMO proviene únicamente del dominio SP-RING de Nse2, sin ninguna contribución de Nse5/6, y que el ADN estimula la actividad E3. Además, determinamos los sitios de SUMOilación en el complejo Smc5/6 mediante proteómica, identificando huellas de SUMOilación como posibles sitios de unión de Nse5/6 que también han sido predichos por AlphaFold Multimer. Por último, no encontramos evidencias de actividad de ubiquitinación dependiente de Nse1, aunque observamos que el complejo Smc5/6 promueve la formación de cadenas de ubiquitina de manera independiente de Nse1. En resumen, nuestra investigación ofrece nuevas perspectivas sobre la organización del complejo Smc5/6 y la regulación de sus diversas actividades bioquímicas, incluyendo la unión al ADN dependiente de ATP y las funciones de ligasa E3 de SUMO y, potencialmente, de ubiquitina.