[es] Los mecanismos apoptóticos han sido estudiados en profundidad, constituyendo un papel substancial en la muerte neuronal tras diferentes tipos de daño en el SNC. No obstante, muy poco se sabe acerca de la activación de los mecanismos apoptóticos en las células gliales y su relevancia en la terminación de la respuesta glial. La caspasa-3 ha sido definida clásicamente como al principal ejecutora de la muerte celular programada, le han sido recientemente atribuidos otros papeles no-apoptóticos, participando en acontecimientos celulares, incluyendo proliferación celular, regulación del ciclo celular, y vías celulares apoptóticas y antiapoptóticas después de un daño excitotóxico en el cerebro inmaduro de rata. Para este propósito, se ha utilizado un modelo de excitotoxicidad bien caracterizado, que consiste en la inducción de un daño cerebral mediante una inyección intracortical de N-methyl-D-asparate (NMDA) en ratas postnatales en el día 9 de vida (P9). La muerte celular, las proteínas apoptóticas y antiapoptóticas fueron analizadas a distintos tiempos de supervivencia después de la lesión por ensayos enzimáticos y análisis de doble fluorescencia con microscopía confocal. Los primeros resultados como la caspasa-3 clivada se presentaba en neuronas dañadas con los núcleos TUNEL+, aunque fue observada mayoritariamente en el núcleo de astrocitos activados en el hemisferio lesionado sin asociación con fragmentación del ADN, desde tiempos tempranos las 4 horas post-lesión (hpl) hasta la formación de la cicatriz glial a los 7-14 días, sin encontrarse asociación con marcaje con TUNEL. La actividad enzimática de la caspasa-3 fue detectada a las primeras horas post-lesión y coincidiendo con los fragmentos clivados por caspasas de la proteína acídica fibrilar (CCP-GFAP) en astrocitos. Sin embargo, a largos tiempos de supervivencia, cuando surge la hipertrofia astroglial, la caspasa-3 astroglial generalmente no correlacionó con el clivage de CCP-GFAP, pero en cambio se relacionó con la expresión de novo de vimentina. Por otra parte, la caspasa-3 clivada no se ha vinculado a proliferación celular. Estes resultados iniciales mostraron la evidencia de un no-tradicional papel de las caspasas en la función astroglial, sugeriendo que su activación puede ser importante para la reestructuración del citoesqueleto después de un daño. Secundariamente, al evaluar las vías de activación de la caspasa-3 en neuronas y células gliales, la activación espacio-temporal de las vías apoptóticas intrínseca y extrínseca fueron analizadas. Se expresó principalmente en las neuronas dañadas corticales e hipocampales, una importante contribución de la vía intrínseca através de la gran proporción de caspasa-9 activa con la activación neuronal de la caspase-3 y muerte celular. Por otra banda, la caspasa-8 presentó una reducida correlación con la caspasa-3, y característicamente presentó con especificidad en las capas corticales. En las células gliales, la activación de la caspasa-9, caspasa-8, y también p53, otra molécula que activa la caspasa-3 indirectamente, fue solamente significante en la capa cortical VI y en el corpus callosum, sugeriendo que la caspasa-3 astroglial no se correlaciona generalmente con las clásicas vías de activación. La tercera parte de esta tesis se focalizó en el estudio de las moléculas antiapoptóticas, como varios inhibitores de apoptosis (IAPs) y las heat shock proteins (HSPs), conocidas como inhibidoras de la caspasa-3 clivada en otros tipos celulares. Las neuronas presentaron una apreciable expresión de HSC70/HSP70 y cIAP-2, aunque estas pobremente se correlacionan con caspasa-3 en este tipo celular. En astrocitos , la survivina y la chaperona HSP25/27 mostraron una fuerte correlación con caspasa-3 en varias regiones cerebrales y a varios tiempos de supervivencia, siendo estas proteínas destacadas candidatas para el bloqueo de la actividad enzimática de la caspasa-3, la cual podría acumularse en ausencia de muerte astroglial. En conclusión esta tesis ha destapado nuevos roles no apoptóticos de la caspasa-3 en células astrogliales, sugeriendo mecanismos de bloqueo de la caspasa-3, ayudando a la mejor comprensión de los mecanismos empleados por los astrocitos para enfrentarse al daño en el cerebro inmaduro.

[gl] Os mecanismos apoptóticos estudiáronse en profundidade, constituíndo un papel substancial na morte neuronal despois de diferentes tipos de dano no SNC. Nembergantes, moi pouco se sabe acerca da activación dos mecanismos apoptóticos nas células gliais e a sua relevancia na terminación da resposta glial. A caspasa-3 definiuse clásicamente coma principal executura da morte celular programada, fóronlle recentemente atribuídos outros papeis non-apoptóticos, participando en acontecementos celulais, incluíndo proliferación, regulación do ciclo celular, e vías apoptóticas e antiapoptóticas despois dun dano excitotóxico no cerebro inmaduro de rata. Para este propósito, utilizáronse un modelo de excitotoxicidade ben caracterizado, que consiste na inducción dun dano cerebral mediante unha inxección intracortical de N-methyl-D-asparate (NMDA) en ratas postnatais no día 9 de vida (P9). A morte celular, as proteínas apoptóticas e antiapoptóticas foron analizadas a distintos tempos de supervivencia despois da lesión por ensaios enzimáticos e análise de doble fluorescencia con microscopía confocal. Os primeiros resultados coa caspasa-3 clivada presentábanse en neuronas dañadas cos núcleos TUNEL+, aunque foi observada maioritariamente no núcleo de astrocitos activados no hemisferio lesionado sen asociación con fragmentación do ADN, dende tempos máis cedos, ás 4 horas post-lesión (hpl) ata a formación da cicatriz glial ós 7-14 días, sen encontrarse asociación co marcaxe con TUNEL. A actividade enzimática da caspasa-3 foi detectada as primeiras horas post-lesión e coincidindo cos fragmentos clivados por caspasas da proteína acídica fibrilar (CCP-GFAP) en astrocitos. Sen embargo, a tempos longos de supervivencia, cando surxe a hipertrofia astroglial, a caspasa-3 astroglial xeralmente non correlacionou co clivaxe de CCP-GFAP, pero si se relacionou coa expresión de novo de vimentina. Por outra banda, a caspasa-3 clivada non se vinculou á proliferación celular. Estes resultados iniciais mostraron a evidencia dun non-tradicional papel das caspasas na función astroglial, suxerindo que a sua activación pode ser importante para a reestructuración do citoesqueleto despois dun dano. Secundariamente, ó evaluar as vías de activación da caspasa-3 en neuronas e nas células gliais, a activación espacio-temporal das vías apoptóticas intrínseca e extrínseca foron analizadas. Expresouse principalmente nas neuronas dañadas corticais e hipocampais, unha importante contribución da vía intrínseca através da gran proporción de caspasa-9 activa coa activación neuronal da caspase-3 e morte celular. Por outra banda, a caspasa-8 presentou unha reducida correlación coa caspasa-3, e característicamente presentou especificidade nas capas corticais. Nas células gliais, a activación da caspasa-9, caspasa-8, e tamén p53, outra molécula que activa a caspasa-3 indirectamente, foi soamente significante na capa cortical VI e no corpus callosum, suxerindo que a caspasa-3 astroglial non se correlaciona xeralmente coas clásicas vías de activación. A terceira parte desta tesis focalizouse no estudio das moléculas antiapoptóticas, coma varios inhibitores de apoptosis (IAPs) e as heat shock proteins (HSPs), coñecidas coma inhibidoras da caspasa-3 clivada noutros tipos celulares. As neuronas presentaron unha importante expresión de HSC70/HSP70 e cIAP-2, anque estas pobremente correlacionábanse coa caspasa-3 neste tipo celular. En astrocitos , a survivina e a chaperona HSP25/27 mostraron unha forte correlación con caspasa-3 en varias rexións cerebrais e a varios tempos de supervivencia, sendo estas proteínas destacadas candidatas para o bloqueo da actividade enzimática da caspasa-3, a cal podría acumularse en ausencia de morte astroglial. En conclusión esta tesis destapou novos roles non apoptóticos da caspasa-3 en células astrogliais, suxerindo mecanismos de bloqueo da caspasa-3 e axudou á mellor comprensión dos mecanismos empregados polos astrocitos para enfrentarse ó dano no cerebro inmaduro.