[ca] La transtirretina (TTR) és una proteïna tetramèrica amiloidogènica (55 kDa) present al plasma humà i responsable del transport de la hormona T4 i del retinol a través de la proteïna d'unió a retinol (RBP). La proteïna TTR està associada amb diverses amiloïdosis, concretament la polineuropatia amiloide familiar (FAP), la cardiomiopatia amiloide familiar (FAC) i l'amiloïdosi senil sistèmica (SSA). La variabilitat associada a la TTR es deu tant a mutacions puntuals al gen codificant per aquesta com a modificacions post-traduccionals (PTMs) al residu Cys-10. Les PTMs més comuns associades a la Cys-10 de la TTR són la S-Sulfonació (S-Sulfo), la S-Glicinilcisteinilació (S-CysGly), la S-Cisteinilació (S-Cys) i la S-Glutationilació (S-GSH). Es creu que dites PTMs associades a la Cys-10 podrien jugar un paper biològic important en l'inici i procés patològic de les diferents amiloïdosis lligades a TTR. Hem tractat les amiloïdosis lligades a TTR des de dues perspectives diferents i) Intervencions terapèutiques i ii) Diagnòstic i monitorització de FAP. Referent a la primera part del projecte, hem portat a terme el cribratge de 41 possibles inhibidors de fibril·logènesis seleccionats mitjançant estratègies bioinformàtiques de repurposing de fàrmacs. Com a resultat de l'estudi, s'han trobat 4 nous estabilitzadors del tetràmer de TTR i, per tant, nous candidats pel tractament d'amiloïdosis lligades a TTR. Pel que fa a l'aproximació diagnòstica d'aquest treball, hem desenvolupat una metodologia per a la quantificació de PTMs en mostres de sèrum, així com per a la determinació dels nivells de TTR en aquest, tant en individus sans (wt) com en individus portadors de TTR amiloïdogènica (mutació V30M). Dita metodologia consisteix en una primera etapa d'enriquiment en TTR mitjançant immunoprecipitació, seguit de l'anàlisi de la TTR per espectrometria de masses de i) la proteïna intacta i ii) els pèptids de TTR portadors de les PTMs d'interès mitjançant l'anàlisi dirigit per LC-MS. L'anàlisi de les mostres de sèrum per la combinació d'ambdues estratègies aporta informació sobre la quantificació relativa i absoluta de les diferents PTMs presents a la TTR. Ha sigut possible mostrar que els mètodes basats en proteïna intacta es troben esbiaixats per algunes de les PTMs, donat que assumeixen un factor de resposta constant per les diferents isoformes. Contràriament, el nou mètode de LC-MS dirigit permet la quantificació absoluta de les diferents PTMs i els nivells totals de TTR (wt i mutant). La metodologia reportada ha sigut aplicada en l'anàlisi de dos grups de mostres clíniques. Com a resultat de l'estudi de mostres humanes de pacients de FAP en els diferents estadis de la malaltia, suggerim de forma preliminar les isoformes S-GSH i S-CysGly com a biomarcadors de progressió de la malaltia, permetent la diferenciació entre pacients en estadi 0 i 1 i, per tant, indicant l'aparició de la malaltia. Mitjançant l'anàlisi de mostres de pacients de FAP a diferents temps després de sotmetre's a un transplantament de fetge (LT) i de pacients receptors de transplantament de fetge dominó provinent d'individus portadors de la mutació V30M, hem caracteritzat la progressió de la relació wt:V30M, així com l'evolució dels nivells de PTMs a la Cys-10, des de la intervenció fins a 9 anys després. Addicionalment, hem observat diferències significatives en els nivells de S-GSH i S-CysGly en comparar pacients de LT i DLT, resultats anàlegs als obtinguts en la comparació d'individus wt (sans) i pacients de FAP en estadi 0.

[en] Transthyretin (TTR) is an amyloidogenic tetrameric protein (55kDa) present in human plasma, transporting T4 hormone and retinol, through the retinol binding protein (RBP). TTR is associated with several amyloidosis, namely familial amyloidotic polyneuropathy (FAP), familial amyloidotic cardiomyopathy (FAC) and senile systemic amyloidosis (SSA). Variability of TTR is not only due to point mutations in the encoding gene but also to post-translational modifications (PTMs) at Cys-10, the most common PTMs being the S-Sulfonation (S-Sulfo), S-Glycinylcysteinylation (S-CysGly), S-Cysteinylation (S-Cys) and S-Glutathionylation (S-GSH). It is thought that PTMs at Cys-10 may play an important biological role in the onset and pathological process of amyloidosis related to TTR. We have aimed TTR amyloidosis from two different perspectives i) Therapeutic interventions and ii) FAP diagnosis and monitoring. Regarding the first branch of the project, we have performed the screening of a library of 41 possible fibrillogenesis inhibitors selected by a bioinformatic repurposing workflow, finding 4 new TTR tetramer stabilizers and thus, new potential candidates for TTR amyloidosis treatment. Concerning the clinical approach of this work, we have developed a methodology for quantification of PTMs in serum samples, as well as for the determination of serum TTR levels, from healthy (wt) and TTR-amyloidotic (V30M mutation) individuals. It involves an enrichment step by immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis of (i) the intact TTR protein and (ii) targeted LC-MS analysis of peptides carrying the PTMs of interest. Analysis of serum samples by the combination of the two methods affords complementary information on the relative and absolute amounts of the selected TTR PTM forms. It is shown that methods based on intact protein are biased for specific PTMs since they assume constant response factors, whereas the novel targeted LC-MS method provides absolute quantification of PTMs and total TTR variants. The reported methodology has been applied to two different sets of clinical samples. As a result of the study of human samples of FAP patients at different disease stages, we preliminary pointed out S-GSH and S-CysGly isoforms as biomarkers of disease progression, allowing the differentiation between FAP stage 0 and 1 and therefore indicating disease onset. Through the analysis of a time series from FAP patients having undergone liver transplantation (LT) and from domino liver transplantation (DLT) recipients from V30M carriers, we have characterized the progression of the wt:V30M ratios, as well as the evolution of the Cys-10 PTMs, from transplantation and up to 9 years after. Additionally, we have observed significant differences in the levels of S-GSH and S-CysGly when comparing liver and domino liver transplanted patients, analogous to the results obtained in the comparison of wt individuals and FAP stage 0 patients.