[en] In female mammals, one of the X chromosomes is epigenetically inactivated through X chromosome Inactivation (XCI) during the epiblast differentiation. However, XCI is later specifically reversed in female germ cells by reactivation of the inactive X chromosome (XCR) via diffusible signaling molecules produced by female gonadal cells. The mechanistic study of XCR is however impeded by the low cell numbers present in vivo and the need for scalable readouts of X chromosome activity at allelic and single-cell resolution. We characterized XCI and XCR kinetics of a new cell differentiation protocol that differentiates embryonic stem cells (ESCs) into X-inactive epiblast-like cells (Epi-LCs), from which in vitro germ cell (PGC-LCs) differentiation is stimulated through a set of cytokines. The goal was to obtain a source of X-inactive PGC-LCs that could be characterized while exposed to XCR-inducing cues, conforming an In vitro model for germline XCR. Contarily to what was believed in the field, PGC-LCs could undergo XCR mediated by the cytokines present in the PGC-LC differentiation media without exposure to female gonadal cells. We also tested several oligo-FISH methodologies based on oligonucleotide labeling and hairpin chain reaction, discovering that combining hairpin chain reaction with the split-paired probe design of V3.0 smHCR provided a scalable platform to monitor the X activity at allelic resolution. This thesis allowed the implementation of an in vitro model for XCR characterization in the germline and a foundation for a scalable readouts of the X activity at allelic and single-cell resolution.

[es] En mamíferos, la diferencia de dosis génica entre sexos es epigenéticamente compensada en hembras por inactivación de uno de los cromosomas X (XCI) durante la diferenciación del epiblasto. No obstante, en las células germinales de las hembras, el cromosoma X es específicamente reactivado (XCR) en respuesta a la difusión de moléculas de señalización generadas por las células de la gónada femenina.El estudio de la XCI se ve obstaculizado, no obstante, por el escaso número de células en el embrión, así como la escasez de técnicas escalables para estudiar la actividad del cromosoma X con resolución alélica y a escala de célula única. Carcaterizamos las cinéticas de XCI y XCR de un nuevo protocolo de diferenciación celular que diferencia células pluripotentes embrionarias (ESCs) en epiblast-like cells con el cromosoma X inactivo (Epi-LCs), a partir de las cuales se estimula la diferenciación in vitro de células germinales (PGC-LCs) mediante un conjunto de citoquinas. El objetivo era obtener una fuente de PGC-LCs con un cromosoma X inactivo para caracterizar el fenómeno de XCR tras su exposición controlada a efectores de la XCR, como moléculas de señalización gonadales. Contrariamente a las expectativas del campo, las citoquinas presentes en el medio de diferenciación de PGC-LCs eran capaces de inducir XCR sin precisar exposición directa a células de la gónada femenina, También probamos varias técnicas de oligo-FISH basadas en el marcaje fluorescente de oligonucleótidos y la hairpin chain reaction, descubriendo que combinar la intensidad de señal de la hairpin chain reaction con el diseño bipartito de sondas de la V3.0 smHCR proveía una plataforma escalable para el análisis de la actividad del X con resolución alélica. Esta tesis permitió implementar un modelo in vitro para el estudio de la XCR en la línea germinal femenina y una base conceptual para un análisis escalable de la actividad del X con resolución alélica a nivel de una única célula.