[ca] Introducció: La senyalització oncogènica de KIT/PDGFRA és fonamental per a la biologia del GIST, una neoplàsia mesenquimal maligna humana que presenta diferenciació miogènica. Tot i que la inhibició selectiva d'aquests receptors proporciona un important benefici clínic, les cèl·lules de GIST s'adapten a la supressió de KIT/PDGFRA i acaben desenvolupant resistències, que solen produir-se a causa de l'expansió policlonal de subpoblacions tumorals portadores de mutacions secundàries a KIT/PDGFRA. Cal destacar que el mecanisme molecular subjacent a la resistència adaptativa a GIST segueix sense estar clar. És important assenyalar que la senyalització oncogènica de KIT es canalitza en gran mesura per les vies PI3K/mTOR i RAS/MAPK, independentment del tipus de mutació primària o secundària a KIT. Hipòtesi: L'estudi de les vies activades per KIT permetrà identificar elements crítics implicats en el procés d'adaptació al tractament, emergint així com potencials dianes terapèutiques per potenciar l'acció antitumoral dels inhibidors de KIT/PDGFRA. Mètodes: Al llarg de tot projecte es van utilitzar models cel·lulars in vitro i in vivo de GIST clínicament representatius. Es van caracteritzar les vies de senyalització de KIT mitjançant estudis farmacològics. Els estudis de seqüenciació d'ARN van identificar Atrogin-1 com un gen crític corregulat per les vies de KIT. Es van fer estudis funcionals en models de sobreexpressió i silenciament de gens mitjançant vectors virals per dilucidar la regulació d'Atrogin-1 i el seu paper a GIST. Es van fer estudis de prova de concepte per avaluar l'impacte preclínic d'inhibició conjunta de KIT i de la cascada ubiquitinització (CU) a GIST. Resultats: Estudis in vitro i in vivo van revelar que PI3K/mTOR i MEK1/2 són els mediadors més essencials de les vies activades per KIT. La seqüenciació de l'ARN va posar de manifest que Atrogin-1 (també conegut com a FBXO32, una SCF ubiquitina-lligasa E3, i el principal efector de l'atròfia muscular a la caquèxia) és el gen més expressat de forma diferencial d'entre tots els corregulats per les vies PI3K/mTOR i RAS/MAPK, cosa que resulta en un augment de l'expressió després de la inhibició de KIT o de les vies activades per KIT. Estudis funcionals van demostrar que KIT i/o les vies activades per KIT regulen l'expressió d'Atrogin-1 mitjançant FOXO3a. Atrogin-1 va demostrar tenir un paper pro-supervivència al GIST ja que ajuda les cèl·lules de GIST a evitar l'apoptosi, permetent l'adaptació al tractament després de la inhibició de KIT o les seves vies, tot això a través de la inducció de la quiescència cel·lular. Aquesta funció d'Atrogin-1 està restringida al llinatge cel·lular del GIST, ja que no es va observar en altres tumors amb alteracions a KIT o altres receptors tirosina quinasa. A més, es va demostrar, mitjançant immunohistoquímica i dades de microarray d'expressió, un augment significatiu de l'expressió d'Atrogin-1 en mostres tumorals de GIST després del tractament amb imatinib en comparació amb les mostres prèvies al tractament. Finalment, la inhibició combinada de KIT i la CU usant imatinib i TAK-243 (un inhibidor específic d'UAE), respectivament, va mostrar una major activitat antitumoral en comparació amb el tractament únicament amb imatinib. Conclusions: Atrogin-1 és un factor pro-supervivència crucial, dependent de KIT i específic de llinatge cel·lular de GIST, que participa en l'adaptació a la inhibició dirigida de KIT a través de la inducció de la quiescència cel·lular. Atrogin-1 subratlla la rellevància del sistema d'ubiquitin-proteosoma com a potencial diana terapèutica. Així, la inhibició combinada de KIT i la CU és una nova estratègia terapèutica per revertir l'adaptació de les cèl·lules tumorals al tractament als pacients de GIST.

[en] Introduction: The oncogenic signaling of KIT/PDGFRA is pivotal to the biology of GIST, a human malignant mesenchymal neoplasm that features myogenic differentiation. Despite targeted inhibition of these receptors provides a major clinical benefit, GIST cells adapt to KIT/PDGFRA driver suppression and eventually develop resistance, which usually occurs due to the polyclonal expansion of tumor subpopulations bearing KIT/PDGFRA secondary mutations. Remarkably, the molecular mechanisms underlying adaptive resistance in GIST remain unclear. Interestingly, KIT oncogenic signaling is largely driven by PI3K/mTOR and RAS/MAPK pathways regardless of KIT primary or secondary mutations. Hypothesis: The dissection of KIT-downstream pathways will allow the identification of critical elements involved in the process of the adaptation to treatment, thus emerging as potential therapeutic targets to enhance the clinical efficacy of KIT/PDGFRA inhibitors. Methods: Clinically representative GIST cell models were used, in vitro and in vivo, throughout. KIT-downstream pathways were characterized through pharmacological screenings. RNA sequencing studies identified Atrogin-1 as a critical gene co-regulated by KIT-downstream pathways. Functional studies were performed on viral gene overexpression and knock-down models to elucidate Atrogin-1 regulation and role in GIST. Proof-of-concept studies evaluated the preclinical impact of co-targeting KIT and the ubiquitin-pathway (UP) in GIST. Results: In vitro and in vivo studies revealed PI3K/mTOR and MEK1/2 as the most essential KIT-downstream mediators. RNA sequencing underscored Atrogin-1 (aka FBXO32, a SCF E3 ubiquitin-ligase and the main effector of muscular atrophy in cachexia) as the most differentially expressed gene co-regulated by PI3K/mTOR and MEK1/2, resulting in increased expression upon inhibition of KIT, or KIT-downstream pathways. Functional studies and ChIP demonstrated that KIT and/or KIT-downstream signaling regulates Atrogin-1 expression through FOXO3a. Atrogin-1 proved to have a pro-survival role in GIST leading to apoptosis evasion and treatment adaptation upon KIT or KIT-downstream pathways inhibition through induction of cell quiescence. Atrogin-1 function was restricted to GIST cell lineage, being absent in other KIT- and kinase-driven neoplasms. Moreover, a significant increase in Atrogin-1 expression was shown in post-imatinib (IM) GIST tumor samples compared to pre-IM and also by IHC in a tissue microarray from pre- and post-IM GIST samples. Finally, combined inhibition of KIT and the UP with imatinib and TAK-243 (an UAE specific inhibitor), respectively, showed enhanced anti-tumor activity compared to single-agent IM. Conclusions: Atrogin-1 emerges as a crucial KIT-dependent and GIST cell lineage-specific pro-survival factor, which drives adaptation to KIT targeted inhibition through induction of cell quiescence. Atrogin-1 highlights the ubiquitin proteome system as a therapeutic vulnerability. Accordingly, combined KIT and UP inhibition results in a novel therapeutic strategy to overcome tumor cell adaptation in the treatment of GIST patients.