[en] Cells have emerged as incredible builders of hierarchic supramolecular structures with ubiquitous and indispensable cell functions, being protein-based complexes the major effectors of a vast landscape of biological reactions. Scientists started to replicate these natural processes, aiming at a better understanding of proteins as biotechnological tools to resolve the current and increasing medical needs. Outsourced proteins from different origins, began to be produced and purified as recombinant entities, majorly histidine tagged, and thus becoming the focal point of a new technological revolution. The continued optimization of the protein engineering methodologies allowed to rationally design all-in-one multidomain proteins capable of dynamically adapt and efficiently respond to a fluctuant environment. The resultant products were successfully installed as human therapeutic drugs (e.g., Aflibercept, Denileukin…) with their own limitations, translated as inefficient biodistribution and low lifetime in the bloodstream. Nanobiotechnology raised as a viable complement to ensure the proper interaction of modular proteins (and other biomolecules) with the subcellular world, and guaranteeing the adequate biodistribution, and efficacy of the treatment (e.g., Abraxane). That is why, a new set of biomaterials have been explicitly developed to secure the product's efficient delivery and therapeutic abilities while minimizing the plausible deleterious effects. Two of the most representative strategies include, (a) a self-assembling principle of protein-based nanoparticles based on a cationic-histidine tag pair, and (b) the naturally occurring inclusion bodies (meaning sustained protein-releasing microparticles). Both strategies displayed promising biomedical results, but still manifested its own clinical concerns, like (1) low reproducibility between batches (meaning size control), (2) low assembling control (meaning procedure control), (3) restricted formulation versatility, (4) biocompatibility issues, (5) limited formulation in a cost-effective manner (meaning manufacturing simplicity) and (6) product homogeneity issues. Hence, this thesis has been weaved to explore a novel and simple biochemical principle to formulate versatile, non-toxic, and efficient protein-based materials to tackle the already mentioned clinical concerns. The cross-linking between divalent cations and the histidine tag has been fully demonstrated as a powerful and easy rational approach to manufacture higher-in-complexity both nano- and micro-scale protein-based materials. The resultant products remain homogeneous in composition, stable upon thermal and chemical treatment and reproducible between batches. The implemented procedure beholds high therapeutic and formulation versatility, as well as a great improvement in regard to the previous outdated assembling strategies. The design and manufacturing processes fall upon a controllable assembly, efficient delivery (targeting possibilities) and biodistribution (avoidance of renal filtration), and cost-effective formulation (simplicity) while considering biocompatibility issues. Also, the platform capacity to be successfully implemented in different biomedical fields (such as drug delivery, tissue engineering, biocatalysis and the treatment of infectious diseases) has been validated. All in all, and still considering the ongoing issues to be resolved, we have been able to develop a simple biochemical principle, based on divalent cation gluing with histidine tags, to promote the controlled self-structuring of proteins into nano- and micro-scale entities in which system's functional versatility, robustness and transversality has been repetitively and fully evidenced.

[es] Las células son entidades capaces de construir increíbles estructuras supramoleculares jerarquizadas con funciones ubicuas e imprescindibles, siendo los complejos basados en proteínas los principales efectores de un amplio abanico de reacciones biológicas. Los científicos comenzaron a replicar estos procesos naturales con el objetivo de comprender mejor cómo utilizar las proteínas a modo de herramientas biotecnológicas para solventar las crecientes necesidades médicas actuales. Proteínas de distintos orígenes se empezaron a producir y purificar como entidades recombinantes, principalmente fusionadas a colas de histidinas, convirtiéndose en el punto focal de una nueva revolución tecnológica. La constante optimización de las metodologías de ingeniería de proteínas permitió diseñar racionalmente proteínas multidominio capaces de adaptarse y responder eficazmente a un entorno cambiante. Los productos resultantes se implantaron con éxito como fármacos humanos (p. ej., Aflibercept, Denileukin...), aunque con sus propias limitaciones tales como una ineficiente biodistribución y baja vida media en el torrente sanguíneo. La nanobiotecnología surgió como una alternativa viable para garantizar la adecuada interacción de estas proteínas modulares (y otras biomoléculas) con el mundo subcelular, y asegurar así una correcta biodistribución y la consecuente eficacia del tratamiento (p. ej., Abraxane). Por este motivo, se ha desarrollado un nuevo conjunto de biomateriales con la idea de garantizar la adecuada entrega y eficacia del tratamiento, minimizando al mismo tiempo los posibles efectos adversos. Dos de las estrategias más representativas incluyen, (a) un principio de autoensamblado de nanopartículas proteicas mediante el uso de un péptido catiónico y una cola de histidinas, y (b) un principio de autoensamblado a modo de cuerpos de inclusión (es decir, micropartículas que liberan proteína de forma sostenida). Ambas estrategias han ido mostrando resultados biomédicos prometedores, aunque al mismo tiempo considerables limitaciones, como (1) baja reproducibilidad entre lotes (es decir, control del tamaño final), (2) bajo control del ensamblado (es decir, control del estado oligomérico), (3) versatilidad restringida durante la formulación, (4) problemas de biocompatibilidad, (5) complejidad en la fabricación, y (6) problemas de homogeneidad del producto. Esta tesis se ha centrado en explorar un principio bioquímico novedoso y simple para formular materiales proteicos versátiles, no tóxicos y eficientes, con la idea de solucionar las limitaciones mencionadas hasta ahora. La coordinación de cationes divalentes con las colas de histidinas ha aparecido como un método racional, eficaz y fácil para fabricar materiales proteicos que permiten crear estructuras tanto nano como micro -particuladas de mayor complejidad. Los productos resultantes permaneces homogéneos, estables (frente a temperatura y frente a diferentes agentes químicos) y su fabricación es reproducible entre lotes. El procedimiento implementado es versátil y robusto, siendo así una gran mejora con respecto a los procedimientos anteriores. El proceso de manufactura se basa en un ensamblaje controlado que permite una entrega y biodistribución eficientes del agente terapéutico (de forma dirigida y evitando el filtrado renal), y una formulación sencilla; además de considerar en todo momento los posibles problemas de biocompatibilidad. Por otro lado, esta nueva plataforma ha sido validada en diferentes campos biomédicos (tales como la entrega dirigida de fármacos, ingeniería de tejidos, biocatálisis y el tratamiento de enfermedades infecciosas). En resumen, y teniendo en cuenta las limitaciones aún presentes y por resolver, hemos logrado desarrollar un principio bioquímico simple, basado en la coordinación de cationes divalentes con colas de histidinas, que promueve el ensamblaje controlado de proteínas (tanto nano como micro -estructuradas) donde la versatilidad funcional, la robustez y la transversalidad del sistema han sido reiteradamente demostradas.