[en] Human patient-derived induced pluripotent stem cells (hiPSCs) provide an unprecedented opportunity to recapitulate disease pathogenicity without the need for genetic manipulation and creation of gene targeted animal models. New technologies with hiPSCs are being developed to make human neurons and have the potential to improve our understanding underlying mechanisms of neurological diseases and development. Cerebellar atrophy is a condition associated with neurodegenerative diseases such as Charlevoix-Saguenay's Recessive Spastic Ataxia (ARSACS) and PLA2G6-Associated Neurodegeneration (PLAN). ARSACS is an early onset neurodegenerative disorder caused by mutations in the SACS gene, characterized with atrophy in superior cerebellum. PLAN, a NBIA (Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation) form due to mutations in PLA2G6, is a neuroaxonal dystrophy, which presents cerebellar ataxia. Our aim was to generate a cerebellar Purkinje cell (CPC) model that will be used as models to investigate the cerebellar neurodegeneration to achieve a rationale therapy. We have developed a differentiation protocol using fibroblasts reprogrammed using Sendai virus to hiPSCs, from ARSACS and PLAN patients. We have successfully generated a functional CPC model from hiPSCs according to the protocol described by Shahin's group [Mol Psychiatry 2018; 23: 2167-83] for each patient's line. We have characterized this new models, CPC PLAN and CPC ARSACS by investigating the expression of genes and proteins involved in iron metabolism, lipid peroxidation, ferroptosis, and autophagy in PLAN patients and cytoskeleton, proteasome, and autophagy markers in ARSACS patients. In PLAN patients the findings showed an impaired ferritinophagy due to the ferritin and NCOA alterations among other altered markers, as well as an increased of lipid peroxidation levels, and altered gene antioxidant and ferroptosis gene expression altered, so that ferroptosis, iron metabolism and autophagy may be impaired and could contribute to neuronal death. In ARSACS patients the findings showed an autophagy pathway dysfunction and regulatory assembly and disassembly gene expression altered. Moreover, in mature ARSACS and healthy carriers CPCs we observed neurofilaments accumulations genotype-dependent, as patient and animal's models showed previously as a principal characteristic of ARSACS disease. We also analyzed mitochondrial respiration and bioenergetics using a Seahorse XFe96 analyzer to confirm that the mitochondrial function was altered in both diseases. Finally, we examined the electrophysiological properties by whole cell patch clamp recordings on patients and control mature CPCs and neuronal morphology. The observed mitochondrial dysfunction and the abnormal electrophysiological properties of CPC's patients carrying PLA2G6 and SACS mutations in heterozygosis and homozygosis indicate that normal expression of PLA2G6 and SACS is important for the development and functionality of the human CPCs. These results show that the CPC PLAN and CPC ARSACS model faithfully reproduces the underlying pathophysiology and, therefore, is suitable for drug screening and the achievement of rational therapy for this disease in the near future

[es] Las células madre humanas pluripotentes inducidas derivadas de pacientes (hiPSCs) proporcionan la oportunidad de recapitular la patogenicidad de las enfermedades sin necesidad de manipulación genética y/o la creación de modelos animales genéticamente modificados. Las nuevas tecnologías con hiPSCs están siendo desarrolladas para crear neuronas humanas y tener el potencial de mejorar la comprensión de los mecanismos subyacentes de las enfermedades neurológicas, neurodegenerativas y del desarrollo. La atrofia cerebelosa es una condición asociada a enfermedades neurodegenerativas como la ataxia autosómica-recesiva de Charlevoix-Saguenay (ARSACS) (OMIM: 270550) y a la neurodegeneración asociada a PLA2G6 (PLAN) (OMIM: 610217). ARSACS es un trastorno neurodegenerativo de aparición temprana, causado por mutaciones en el gen SACS y caracterizado por presentar atrofia en el cerebelo superior. PLAN, es una enfermedad ultra rara neurodegenerativa que se engloba en el grupo de las NBIA (Neurodegeneración con acumulación de hierro, en inglés con Neurodegeneration with Brain Iron Acumulaction) y es causada por presentar mutaciones en el gen PLA2G6. Se caracteriza por presentar distrofia neuroaxonal y ataxia cerebelosa. El objetivo de esta tesis fue generar un modelo de Células de Purkinje del cerebelo (CPCs) que permitiese posteriormente estudiar la neurodegeneración cerebelosa en estos pacientes. En este trabajo se ha utilizado un protocolo de diferenciación celular utilizando fibroblastos reprogramados con Sendai virus a hiPSCs, de pacientes ARSACS y PLAN que ha permitido generar con éxito un modelo CPC funcional utilizando el protocolo descrito por el grupo del Dr. Sahin [Mol Psychiatry 2018; 23: 2167-83] para cada línea celular de cada paciente. Posteriormente se caracterizaron los nuevos modelos, CPC PLAN y CPC ARSACS, mediante el análisis de la expresión de genes y proteínas involucradas en el hierro metabolismo, peroxidación lipídica, ferroptosis y autofagia en pacientes PLAN y de citoesqueleto, proteasoma y marcadores de autofagia en pacientes en pacientes ARSACS. En pacientes PLAN, los resultados obtenidos mostraron un posible deterioro de la ferritinofagia, debido a las alteraciones en la expresión de la ferritina y NCOA4 entre otros marcadores alterados, así como un aumento de los niveles de peroxidación lipídica. También se analizaron las alteraciones en genes relacionados con la respuesta antioxidante y la expresión de genes relacionados con la ferroptosis. Los resultados obtenidos apuntaron a que los mecanismos de ferroptosis, el metabolismo del hierro y la autofagia podrían estar desregulados en pacientes PLAN, pudiendo contribuir así al desarrollo de la enfermedad y muerte neuronal. Los resultados obtenidos del modelo CPC de pacientes ARSACS indicaron una posible disfunción de la vía de autofagia y una alteración en la expresión de genes relacionados con el ensamblaje del citoesqueleto. Además, en las CPC maduras de pacientes ARSACS y en CPC de portadores sanos de la enfermedad se observaron acumulaciones de neurofilamentos genotipo-dependiente, al igual que otros modelos animales de la enfermedad de ARSACS habían reportado anteriormente, mostrándose así este suceso como característica principal de la enfermedad de ARSACS. También se analizaron parámetros relacionados con la respiración mitocondrial y bioenergética usando un analizador Seahorse XFe96 para confirmar que la función mitocondrial se encontraba alterada en ambas enfermedades. Finalmente, se examinaron las propiedades electrofisiológicas intrínsecas de las CPC maduras de ambos modelos mediante la técnica whole cell patch clapm, así como la morfología neuronal final. La disfunción mitocondrial observada y las propiedades electrofisiológicas anormales de las CPC de pacientes y portadores de mutaciones en PLA2G6 y SACS en heterocigosis y homocigosis indicaron que la expresión normal de estos genes es importante para el desarrollo y la funcionalidad de las CPC. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis doctoral mostraron que el modelo CPC PLAN y CPC ARSACS reproduce fielmente la fisiopatología subyacente y, por lo tanto, es adecuado para la detección de drogas y la obtención de terapias para estas enfermedades en un futuro próximo.