[en] Mutations in the gene encoding for leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) are a common cause of hereditary Parkinson´s disease (PD), and some variants also confer risk to develop sporadic PD. LRRK2 has been reported to regulate various intracellular vesicular trafficking pathways, including autophagy, retromer-mediated trafficking, synaptic vesicle dynamics and endolysosomal degradative events, although the precise molecular mechanism(s) underlying these alterations remain to be elucidated. Recent studies have revealed that a subset of Rab proteins involved in secretory and endocytic recycling are LRRK2 kinase substrates in vivo. However, the effects of LRRK2-mediated phosphorylation of these substrates on membrane trafficking remain unknown. Here, by studying the well-characterized epidermal growth factor receptor (EGFR) trafficking pathway, we report that expression of active or phospho-deficient, but not phospho-mimetic, RAB8A variants rescues the G2019S LRRK2-mediated effects on endolysosomal membrane trafficking. Similarly, upregulation of the RAB11-Rabin8-RAB8A cascade, which activates RAB8A, also reverted these trafficking deficits. Strikingly, we found that the loss of RAB8A delayed EGFR degradation and decreased RAB7A activity, mimicking the previously described effect of pathogenic LRRK2 on EGFR trafficking. Moreover, expression of pathogenic G2019S LRRK2 or loss of RAB8A resulted in mistargeting of the EGFR into a RAB4-positive endocytic compartment, which was accompanied not only by endocytic degradation defects, but also by a deficit in EGFR recycling to the plasma membrane. Both the accumulation of EGFR in the RAB4-positive compartment and the recycling deficits were rescued upon expression of active RAB7A. Finally, we showed that dominant-negative RAB7A expression resulted in similar defects in EGF degradation, accumulation in a RAB4 compartment, and deficits in EGFR recycling, which were all rescued upon expression of active RAB8A. Taken together, these findings suggest that LRRK2-mediated phosphorylation and subsequent impairment of RAB8A function may form the basis of how pathogenic LRRK2 deregulates endolysosomal transport and endocytic recycling events.

[es] Mutaciones en el gen que codifica la quinasa rica en repeticiones de leucina 2 (leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2) son una causa común de enfermedad de Parkinson (EP) hereditaria y algunas variantes también aumentan el riesgo de EP esporádica. LRRK2 participa en la regulación de una serie de rutas de tráfico intracelular de membranas, incluyendo autofagia, tráfico mediado por el retrómero, dinámica de las vesículas sinápticas y degradación endolisosomal, si bien no se conocen con exactitud los mecanismos moleculares responsables de estas alteraciones. Estudios recientes han revelado que varias proteínas Rab que participan en las rutas secretora y de reciclaje endocítico son sustratos de la actividad quinasa de LRRK2 in vivo. Sin embargo, los efectos de su fosforilación por LRRK2 sobre las rutas de tráfico intracelular de membranas permanecen desconocidos. En esta tesis, mediante el estudio de la bien caracterizada ruta del receptor del factor de crecimiento epidérmico (epidermal growth factor receptor, EGFR), observamos que la expresión de una versión catalíticamente activa o de una variante fosfodeficiente, pero no así de variantes fosfomiméticas, de RAB8A rescata las alteraciones sobre el tráfico endolisosomal mediadas por G2019S, un mutante patogénico de LRRK2. De forma similar, RAB11 y Rabin8, que forman parte de una cascada de activación de RAB8A, revierten dichas alteraciones. Además, observamos que el silenciamiento de RAB8A retrasa la degradación del EGFR y provoca una disminución de la actividad de RAB7A, al igual que se había descrito anteriormente para LRRK2 patogénica. Tanto la expresión de la variante G2019S como el silenciamiento de RAB8A resultan en la acumulación aberrante del EGFR en un compartimento endocítico positivo para RAB4, lo cual impide su eficiente degradación endolisosomal, así como su reciclaje de vuelta a la membrana plasmática. Tanto la acumulación del EGFR en el compartimento positivo para RAB4 como las alteraciones en su reciclaje son revertidas por una forma activa de RAB7A. Finalmente, mostramos que la expresión de una mutación dominante negativa de RAB7A da como resultado defectos similares en la degradación y en el reciclaje del EGFR, provocando su acumulación en el compartimento positivo para RAB4. En conjunto, nuestros descubrimientos sugieren que la fosforilación y consiguiente inactivación de RAB8A mediada por LRRK2 patogénica podría constituir la base de cómo esta proteína desregula las rutas de tráfico intracelular de membranas.