[en] Food contamination by spoilage or pathogenic microorganisms results in organoleptic alterations, food waste, economic losses, and serious public health concerns. Poultry meat is a highly perishable food product susceptible to microbial growth, which can originate from both the raw materials and the processing environment. On the other hand, the extensive use of antibiotics in primary production has contributed to the emergence of antimicrobial resistance bacteria and, consequently, to human infections difficult to treat. Although there are multiple pathways of antimicrobial resistance dissemination, the transmission of antimicrobial resistance bacteria via the food chain is often underrestimated and warrants significant attention. Therefore, determining the microbiome and resistome of food and food processing environments along the food chain is very useful to identify the sources of contamination and, consequently, to design measures to prevent the presence and growth of microorganisms. Traditional monitoring surveillance programs have employed culture-dependent techniques to identify and quantify specific microbial groups or genes throughout the food chain, culture-independent techniques are increasingly utilized for providing a greater understanding of the microbial communities and their antimicrobial resistance genes. Nevertheless, most culture-independent studies in the poultry sector have focused on farms and slaughterhouses, with less attention given to food processing plants. In this sense, the first objective of this PhD thesis was the integration of culture-dependent and culture-independent techniques to explore the insights each approach provides in studying the microbiome and resistome of a poultry burger processing line. This was accomplished through two studies: the first integrating culturing techniques with metabarcoding, and the second combining culturing techniques with metagenomics. Culturing techniques enabled the absolute quantification of the main microbial groups in poultry meat, providing crucial information for identifying the microorganisms responsible for limiting shelf life and for assessing both the hygienic conditions of the processing line and the effectiveness of the cleaning and disinfection protocols. Additionally, these techniques facilitated the isolation of Pseudomonas spp. colonies for evaluating their biofilm-forming ability and resistance to cleaning and disinfection agents. In contrast, culture-independent techniques offered a more comprehensive understanding of the composition and diversity of the entire microbial community. These techniques not only allowed for the identification of specific genera (through metabarcoding and metagenomics) and species (through metagenomics), but also for the assessment of the influence of specific factors on the microbiome. Furthermore, metagenomics allowed for the identification of antimicrobial resistance genes throughout the processing line, highlighting the role of the food industry in the dissemination of antimicrobial resistance. Notably, genes conferring resistance to biocides were the most abundant, raising concerns about the proper application of cleaning and disinfection protocols and revealing the presence of bacteria resistant to these agents. Cleaning and disinfection protocols are one of the most effective control measures to prevent the presence and spread of spoilage and pathogenic microorganisms. However, they often encounter significant challenges, such as the presence of bacteria with resistance to them or the formation of biofilms, which can compromise their efficacy. Considering the role of biofilms as reservoirs for potentially problematic microorganisms, significant research efforts are being dedicated to improving existing methods and strategies for their removal. In this context, the second objective of this PhD thesis was the implementation of different cleaning and disinfection procedures against biofilms formed by isolates from a poultry burger processing line. A Pseudomonas fluorescens strain isolated from poultry thighs demonstrated a strong capacity to form biofilms at the liquid-air interface, characterized by a high cell concentration, high biomass production, and an advanced degree of maturity, making it an ideal model for evaluating the efficacy of various cleaning and disinfection protocols. Different detergents (alkaline and enzymatic), disinfectants (peracetic acid and hydrogen peroxide) and detergent-disinfectants (sodium hypochlorite and tertiary alkylamines) provided by OX-CTA S.L. were tested against mature biofilms formed by a Pseudomonas fluorescens strain isolated from poultry thighs. Cleaning and disinfection procedures that involved the sequential application of a detergent followed by a disinfectant, with an intermediate rinsing step, were the only ones that completely eradicated the biofilm, demonstrating the need for a detergency step before disinfection to degrade the exopolysaccharide matrix, allowing the disinfectant to reach and inactivate the embedded sessile cells. Notably, cleaning and disinfection procedures incorporating new approaches in the biofilm control, such as enzymes, natural antimicrobials and aerosolization, were also effective in removing P. fluorescens biofilm, presenting themselves as viable alternatives. A complementary objective was the evaluation of the risks associated with the appearance of antimicrobial resistances as a consequence of the use of natural antimicrobials as food preservatives or cleaning and disinfection agents. In this context, the mutagenic rate and the emergence of resistant variants were assessed after the prolonged exposure to subinhibitory concentrations of two commercial products based on various individual constituents of essential oils (primarily (E)-cinnamaldehyde, eugenol, thymol, and carvacrol) provided by Phytosynthèse. Evolution assays resulted in the emergence of resistant genetic variants in Escherichia coli MG1655, but not in Salmonella Typhimurium LT2. However, the development of these resistant variants was not due to an increase in mutagenic frequency following the use of essential oils, but rather to the selective pressure exerted on the bacterial populations, which favored the selection of variants with greater resistance. Genotypic characterization of resistant variants identified mutation in genes related to oxidative stress and motility, functional categories also affected in other resistant variants isolated with other antimicrobial compounds. This uniformity could be explained by the tendency of mutations to arise in the most transcriptionally active genes during the cellular response to treatments. Overall, this PhD thesis highlights the importance of integrating culture-dependent and culture-independent techniques to comprehensively characterize the microbiome and resistome in food processing environments, as well as the need to improve cleaning and disinfection protocols to address the challenges posed by biofilms and antimicrobial-resistant bacteria. The main results of this work have been compiled into a book chapter published by Springer, four scientific articles - three of which have been published in Pharmaceuticals, Food Control, and Food Research International, and one currently under review at LWT - and a review article to be submitted to a JCR-indexed review journal.

[es] La contaminación de alimentos por microorganismos alterantes o patógenos puede dar lugar a alteraciones organolépticas, desperdicio alimentario, pérdidas económicas y serios problemas de salud pública. La carne de pollo es un alimento altamente perecedero, susceptible al crecimiento de microorganismos, los cuales pueden proceder tanto de las materias primas como del ambiente de procesado. Por otro lado, el uso intensivo de antibióticos en producción primaria ha favorecido la aparición de bacterias resistentes a antimicrobianos, lo que puede dar lugar a infecciones humanas difíciles de tratar. Aunque existen múltiples vías de diseminación de la resistencia antimicrobiana, la transmisión de bacterias resistentes a través de la cadena alimentaria requiere mayor atención ya que a menudo se subestima. Por lo tanto, el estudio del microbioma y del resistoma de los alimentos y los ambientes de procesado a lo largo de la cadena alimentaria es crucial para identificar las fuentes de contaminación y, consecuentemente, diseñar medidas para prevenir la presencia y la proliferación de microorganismos. Aunque tradicionalmente se han empleado las técnicas dependientes de cultivo para identificar y cuantificar grupos microbianos o genes específicos a lo largo de la cadena alimentaria, las técnicas independientes de cultivo cada vez se utilizan más para proporcionar una caracterización más detallada de las comunidades microbianas y de sus genes de resistencia a antimicrobianos. Sin embargo, la mayoría de los estudios que aplican técnicas independientes de cultivo en el sector del pollo se centran en granjas y mataderos, prestando menos atención a las plantas de procesado de alimentos. En este sentido, el primer objetivo de esta tesis doctoral fue la integración de técnicas dependientes e independientes de cultivo para explorar la información proporcionada por cada enfoque en el estudio del microbioma y resistoma de una línea de procesado de hamburguesas de pollo. Esto se logró a través de dos estudios: el primero integró técnicas de cultivo con metataxonómica, y el segundo combinó técnicas de cultivo con metagenómica. Las técnicas dependientes de cultivo permitieron cuantificar la abundancia absoluta de los grupos microbianos de interés en la línea de procesado de hamburguesas de pollo, proporcionando información crucial para identificar el grupo responsable de limitar la vida útil del producto, y para evaluar tanto las condiciones higiénicas de la línea de procesado como la eficacia de los protocolos de limpieza y desinfección. Además, estas técnicas facilitaron el aislamiento de colonias de Pseudomonas spp. para evaluar su capacidad de formación de biopelículas y su resistencia a los agentes de limpieza y desinfección. Por otro lado, las técnicas independientes de cultivo proporcionaron una caracterización más detallada tanto de la composición como de la diversidad de la comunidad microbiana en su totalidad. A diferencia de las técnicas de cultivo, estas técnicas permitieron la identificación de géneros (metataxonómica y metagenómica) e incluso de especies bacterianas (metagenómica) presentes, y la evaluación de la influencia de diferentes factores en el microbioma de la línea de procesado. Además, la metagenómica permitió la identificación de genes de resistencia a antimicrobianos a lo largo de la línea de procesado, destacando el papel de la industria alimentaria en la diseminación de la resistencia a antimicrobianos. Cabe destacar que los genes más abundantes fueron aquellos que confieren resistencia a biocidas, lo que demuestra la presencia de bacterias resistentes a estos agentes, y cuestiona la correcta aplicación de los protocolos de limpieza y desinfección. Los protocolos de limpieza y desinfección se consideran una de las medidas de control más efectivas para prevenir la presencia y propagación de microorganismos. No obstante, la eficacia de estos protocolos puede verse comprometida por la presencia de bacterias resistentes a los mismos o por la formación de biopelículas. Teniendo en cuenta el papel de las biopelículas como reservorios de microorganismos potencialmente problemáticos, se están realizando grandes esfuerzos en investigación para mejorar los métodos y estrategias existentes para su eliminación. En este contexto, el segundo objetivo de esta tesis doctoral fue la implementación de diferentes procedimientos de limpieza y desinfección contra las biopelículas formadas por aislados de una línea de procesado de hamburguesas de pollo. Una cepa de Pseudomonas fluorescens aislada de contramuslos de pollo demostró una gran capacidad para formar biopelículas en la interfaz líquido-aire, caracterizadas por una alta concentración celular, una gran producción de biomasa y un avanzado grado de madurez, siendo un modelo ideal para evaluar la eficacia de diversos protocolos de limpieza y desinfección. En este marco, se ensayaron diferentes detergentes, desinfectantes y detergentes-desinfectantes contra estas biopelículas. Los procedimientos de limpieza y desinfección que involucraron la aplicación secuencial de un detergente seguido de un desinfectante, con un paso intermedio de aclarado, fueron los únicos que erradicaron por completo la biopelícula, demostrando la necesidad de aplicar una fase de detergencia previa a la de desinfección para degradar la matriz de exopolisacáridos y permitir así que el desinfectante alcance e inactive las células sésiles del interior. Cabe destacar que los procedimientos de limpieza y desinfección que incorporaron nuevos enfoques en el control de biopelículas, como el uso de enzimas, antimicrobianos naturales y aerosolización, también fueron efectivos en la eliminación de las biopelículas de P. fluorescens, pudiendo considerarse alternativas viables. Un objetivo complementario fue la evaluación de los riesgos asociados a la aparición de resistencias a antimicrobianos como consecuencia del uso de antimicrobianos naturales como conservantes alimentarios o agentes de limpieza y desinfección. En este contexto, se evaluó la tasa mutagénica y la aparición de variantes resistentes tras la exposición prolongada a concentraciones subinhibitorias de dos productos comerciales formulados con aceites esenciales. Los ensayos de evolución dieron lugar a la aparición de variantes genéticas resistentes en Escherichia coli MG1655, pero no en Salmonella Typhimurium LT2. Sin embargo, la aparición de variantes genéticas resistentes no sucedió como consecuencia de un aumento de la frecuencia mutagénica tras la aplicación de los aceites esenciales, sino a la presión selectiva ejercida sobre las poblaciones bacterianas, que favoreció la selección de variantes con mayor resistencia. La caracterización genotípica de las variantes resistentes identificó mutaciones en genes relacionados con el estrés oxidativo y la motilidad, categorías funcionales que también se han visto afectadas en otras variantes resistentes aisladas con otros compuestos antimicrobianos. Esto podría explicarse por la tendencia de las mutaciones a surgir en los genes que están más activos transcripcionalmente durante la respuesta celular a los tratamientos. En resumen, esta tesis doctoral resalta la importancia de integrar técnicas dependientes e independientes de cultivo para caracterizar de manera detallada el microbioma y el resistoma en los entornos de procesado de alimentos, así como la necesidad de mejorar los protocolos de limpieza y desinfección para abordar los desafíos planteados por las biopelículas y las bacterias resistentes a antimicrobianos.