[ca] Els resultats presentats en aquesta tesi estan dividits en dos capítols en funció dels enzims estudiats: quitina desacetilases i glicosintases. Les de-N-acetilases de quitina (CDAs) són un grup d'enzims que catalitzen la hidròlisi dels grups acetamido dels residus GlcNAc de quitina, quitosà i oligosacàrids de quitina (COS). Les CDAs pertanyen a la família 4 de les esterases de carbohidrats (CE4), la qual també inclou esterases de acetilxilà i desacetilases de petidoglucà. Els quitosans són una família de polisacàrids de N-acetil-glucosamina i glucosamina. Els COS i derivats parcialment desacetilats (paCOS) han demostrat ser molècules bioactives en un ampli rang d'aplicacions com poden ser antimicrobians, immunoestimulants, nano formulacions per drug o gene delivery, promotors de creixement vegetal, promotors de la cicatrització de ferides, etc. La majoria de les activitats biològiques associades als paCOS semblan dependre no només del grau de polimerització (DP) i de acetilació (DA), sinó també del patró de acetilació (PA). Aquesta relació estructura funció remarca el paper crucial de les CDAs. Els objectius d'aquesta tesi comprenen els estudis de la relació estructura funció dins el marc del Subsite capping Model. La presència de diversos loops envoltant el centre actiu, els quals varien en mida i estructura en funció de la CDA, defineixen els subllocs accessibles en el solc catalític i, a la vegada, també són responsables de definir el patró de desacetilació. En aquesta tesi es reporta la validació d'una metodologia analítica HPLC-MS per a la monitorització de l'activitat de las CDAs, la demostració experimental del Subsite Capping Model usant la desacetilasa de quitooligosacàrids de Vibrio cholerae i els resultats del disseny racional dels loops per a la modulació de l'especificitat de substrat. Diverses generacions de mutants van ser estudiades obtenint com a resultat un enzim altament optimitzat. L'altre capítol inclou el treball realitzat en el camp de les glicosintases. Aquests enzims s'han convertit en unes eficients eines per a la síntesi d'oligosacàrids, glicoconjugats i polisacàrids. Es deriven de glicosidases amb retenció de conformació anomérica en què l'activitat hidrolítica ha estat abolida per la mutació del nucleòfil catalític però que catalitzen eficientment reaccions de transglicosilació quan es proporcionen donadors activats amb fluorur amb la configuració anomérica oposada a la del substrat del enzim hidrolític parental. Millorar el rendiment de les glicosintases actuals (i futures) i l'enginyeria de l'especificitat per substrats artificials estan sent afrontades per metodologies d'evolució dirigida. Aquestes aproximacions depenen en gran mesura en mètodes d'alta eficiència de cribratge. En aquest treball es presenta un mètode de cribratge independent de l'especificitat del enzim per al cribratge de biblioteques de glicosintases basat en un sensor químic fluorescent de fluorur capaç de traduir l'activitat glicosintasa a fluorescència. Es descriu el desenvolupament i validació de l'assaig així com la seva aplicació a una biblioteca de saturació del residu nucleòfil a la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis. A més, es troba un nou i sorprenent mutant que és posteriorment caracteritzat, el mutant E134D. Aquesta nova glicosintasa proporciona coneixement sobre el papel dels residus adjacents en la reacció catalítica de les glicosintases.

[en] The results presented in this thesis are divided in two chapters depending on the enzymes studied: chitin deacetylases and glycosynthases. Chitin de-N-acetylases (CDAs) are a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of the acetamido groups of GlcNAc residues of chitin, chitosan, and chitin oligosaccharides (COS). CDAs belong to the family 4 of carbohydrate esterases (CE4), which also includes acetylxylan esterases and peptidoglycan deacetylases. Chitosans are a family of polysaccharides of N-acetyl-glucosamine and glucosamine. COS and their partially deacetylated derivatives (paCOS) have proven to be bioactive molecules in a broad variety of applications such as antimicrobials, immunostimulants, nanoformulations for drug and gene delivery, plant growth promoters, wound healing activity, etc. Most of the biological activities associated with paCOS seem to be largely dependent not only on the degree of polymerization (DP) and degree of acetylation (DA), but also on the specific acetylation pattern (PA). This structure-function relationship highlights the key role of the CDAS. The objectives of this thesis comprises the studies of structure-function relationships in the frame of the Subsite Capping Model. The presence of several loops surrounding the active site, which vary in size and structure depending on the CDA, define the accessible binding subsites of the catalytic cleft and seem to be responsible of defining the deacetylation pattern. In this thesis it is reported the validation of an analytical HPLC-MS methodology for CDA activity monitoring, the experimental demonstration of the Subsite Capping Model using the Vibrio cholerae chitin oligosaccharide deacetylase as reference and the results of the rational engineering of loops for the modulation of substrate specificity. Several generations of mutants were studied resulting in a greatly optimized enzyme. The other chapter is the work developed with glycosynthases, these enzymes have become efficient tools for the enzymatic synthesis of oligosaccharides, glycoconjugates and polysaccharides. They derive from retaining glycosidases in which the hydrolase activity has been abolished by mutation of the catalytic nucleophile but efficiently catalyse transglycosylation reactions when using activated glycosyl fluoride donors with the opposite anomeric configuration than the substrate in the parental hydrolase enzyme. Improving the performance of current (and new to come) glycosynthases and engineering specificity for non-natural substrates is being addressed by enzyme directed evolution. These approaches largely depend on efficient high throughput screening methods. In this work it is presented a general screening assay independent of the enzyme specificity for the screening of glycosynthase libraries based on a fluoride fluorescent chemosensor that transduces glycosynthase activity into fluorescence. This work describes the development and validation of the assay and its application to a nucleophile saturation mutant library of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase, In addition, a new and surprising mutant was found and furtherly characterized, the E134D mutant. This new glycosynthase provides mechanistic insights on the role of neighbouring residues in the glycosynthase catalytic reaction.