[ca] En la pràctica clínica actual existeix una demanda creixent d'estudis moleculars de malalties genètiques. Generalment, la detecció de mutacions patològiques en gens candidats consisteix en la seqüenciació directa dels exons i les zones intròniques flanquejants mitjançant el mètode de Sanger, el qual es basa en una electroforesi capil·lar i requereix l'amplificació prèvia de cada fragment d'ADN en una reacció de PCR individual. Així, l'anàlisi de gens formats per molts exons com BRCA1 i BRCA2, associats a càncer de mama i ovari, implica un elevat nombre de reaccions de PCR i seqüenciació, i esdevé una tasca molt costosa en termes de temps i diners. D'altra banda, l'estudi de malalties monogèniques genèticament heterogènies, com és el cas de la Retinosi Pigmentària autosòmica dominant (RPad), pot requerir l'anàlisi de més de 20 gens per tal d'identificar la causa molecular de la malaltia. Tot i així, només un 20-30% dels pacients amb RPad són diagnosticats molecularment ja molts gens i mutacions associades a la malaltia són encara desconeguts. D'aquí que l'ús de les tècniques de seqüenciació massiva d'ADN o seqüenciació de nova generació (NGS) sigui una pràctica cada vegada més habitual en els laboratoris de genètica molecular. Per a l'estudi de diversos pacients en paral·lel o per a analitzar exomes complets amb la finalitat de trobar nous gens associats a RPad, existeixen grans plataformes de seqüenciació massiva. No obstant, l'elevat cost i la gran capacitat d'aquestes plataformes es tradueix en una pèrdua de flexibilitat a l'hora de satisfer la necessitat de molts laboratoris de genètica, que sovint han d'analitzar la mostra d'un o pocs individus en un temps i amb un cost raonablement reduïts. Com a conseqüència, les empreses tecnològiques que treballen amb equips de NGS han introduït al mercat petites plataformes adaptades a l'ús clínic. Una d'aquestes plataformes, el GS Junior, ha demostrat amb èxit el seu potencial per al diagnòstic en laboratoris de genètica molecular. Amb la mateixa tecnologia bàsica que el GS 20 i GS FLX, la plataforma GS Junior utilitza les tècniques de PCR en emulsió i piroseqüenciació, però suposa una menor despesa tant de posada en marxa com de funcionament. Aquest treball de recerca té com a objectiu provar i posar a punt tecnologies de NGS per tal d'obtenir diagnòstics moleculars a uns costos assumibles. Amb aquesta finalitat i per a l'estudi dels gens BRCA1 i BRCA2, es va idear un protocol de PCR llarga associat a dos mètodes enzimàtics de fragmentació d'ADN per tal d'obtenir biblioteques d'ADN preparades per a ser analitzades amb NGS. A més, es van assajar diferents mètodes basats en PCR llarga, multiplex o en emulsió, i en captura d'ADN per a detectar mutacions causants d'RPad. A més, aprofitant la reducció del preu per megabase seqüenciada, també es va fer seqüenciació massiva de l'exoma. L'eficiència de les diferents metodologies avaluades ha permès crear nous protocols de treball que ja han estat implementats en la rutina del laboratori. Per tal de caracteritzar nous gens associats a RPad, es va utilitzar la NGS per analitzar un array de captura de 448 gens candidats en diverses famílies i l'exoma complet d'una d'elles. Es va observar que els pacients analitzats presentaven un gran nombre de variants. Per a poder establir el paper d'aquestes variants com mutacions causants de la malaltia, és imprescindible efectuar la segregació familiar; per tant, la validació dels resultats només es podia aconseguir en famílies amb almenys dos individus afectats i un membre no afectat. D'aquesta manera, en la seqüenciació de l'exoma, es van trobar més de 150 variants genètiques que podrien ser les causants de la RPad en la família.

[en] Molecular testing of genetic diseases is in increasing demand in routine clinical practice. Medical analysis of candidate genes to characterize the mutation that causes a disease currently requires amplification of the exonic and flanking sequences by PCR as a previous step to individual PCR fragment capillary electrophoresis sequencing (Sanger sequencing). BRCA1 and BRCA2, which are associated with the risk of breast cancer, are large genes with a high number of exons, and therefore involve a considerable number of individual PCRs and sequencing reactions to cover the coding and flanking sequences of both genes, which is a very costly and time consuming task. On the other hand, in genetically heterogeneous monogenic diseases such as autosomal dominant Retinitis Pigmentosa (adRP), mutation screening may be required in more than 20 genes in order to establish the molecular cause of the disease. Even so, using these expensive approaches, just 20-30% of adRP patients can be molecular diagnosed due to the fact that the mutation associated with the disease is yet unknown in more than 60% of all adRP cases Hence the use of massive DNA sequencing or next generation sequencing (NGS) technologies is a vital practice within any clinical genetic laboratory. Large next-generation platforms are indicated for this task. Likewise, for the analysis of the whole exome to characterise new genes associated with adRP and/or for extensive patient surveys, these large platforms are also required. However, the cost and extremely large capacity of these platforms results in a loss of flexibility regarding the needs of many genetics laboratories where it is sometimes necessary to analyse samples from only one or just a few individuals in a reasonably short time. In consequence, technologic firms participating in the NGS marketspace have introduced smaller NGS platforms adapted for clinical use. One such platform, the GS Junior, has successfully proven its potential for molecular diagnosis in molecular genetics laboratories. Sharing the same core technology as the GS 20 and the GS FLX, the GS Junior platform exploits similar emulsion PCR and pyrosequencing approaches, but with lower set-up and running costs. Accordingly, this research work aims for the successful management of NGS technologies in order to offer advanced molecular diagnosis services at assumable costs. As a result, a Long-Range (LR) -PCR approach associated with two distinct enzymatic DNA shearing methods was devised in order to prepare DNA libraries for NGS to achieve molecular testing of the large BRCA1 and BRCA2 genes. Furthermore, different methods based on LR, multiplex, emulsion PCR, or targeting DNA gene capture were assayed to detect mutation-causing adRP. In addition, and taking the advantage of the significant price reduction per Megabase sequenced, the whole exome analysis method was also put to the test. The efficiency of the distinct methodologies used for NGS in routine clinical practice was evaluated resulting in new diagnostic protocols based on this research work, which are already introduced at a clinical routine level. In order to characterize novel genes associated with adRP, NGS was used. 448 candidate genes array and the whole exome analysis approach were carried out. It was demonstrated that the analysed patients showed a large number of variants. To characterize these variants as a disease-causing mutation, segregation in the family is mandatory. Thus, validation of results only can be achieved in families with at least two affected and one unaffected member. In this case, more than 150 genetic variants putative causing of adRP were obtained in one family.