[en] Mutations in the oncogenic serine/threonine protein kinase BRAF are casually involved in the onset and progression of several cancers, including more than 50% of cases of melanoma. Malignant melanoma is the most lethal form of skin cancer, with an increasing incidence worldwide. The most common BRAF mutation is a valine-to-glutamate transition (V600E), which results in constitutive activation of the kinase activity. BRAF and MEK inhibitors (BRAF/MEKi) combination have been approved for use in different cancers with BRAF mutations. Despite BRAF/MEK inhibition have shown efficacy for metastatic disease, acquired resistance remains the main barrier to increase progression-free survival and overall survival. Connexins (Cxs) are a family of transmembrane proteins that form hemichannels and gap junctions that permit the paracrine and direct intercellular communication by allowing the diffusion of ions, small molecules and metabolites. Alterations in connexin43 (Cx43) and gap junction intercellular communication (GJIC) have been implicated in tumour development and progression. However, due to the controversial role of Cx43 in melanoma progression, the aims of this project were to investigate the role of Cx43 in tumours with BRAF mutations and the mechanisms involved in acquired drug resistance to BRAF/MEKi. The results of this study demonstrate that Cx43 is poorly expressed in human melanoma and it is mainly localized in the cytoplasm. Cx43 overexpression, using a vector or small extracellular vesicles (sEVs) containing Cx43 significantly decreases in cell growth and proliferation and increases senescence and cell death by apoptosis in in vitro assays. We find that the effects on cell growth are independent of the channel activity. Post-translational modification such as SUMOylation of Cx43 detected in all human melanoma cell lines may affect protein stability, subcellular localization or protein-protein interactions. In fact, the presence of Cx43 in sEVs including exosomes, radically changes the content of proteins and small molecules of RNA (sRNA) in these vesicles, indicating that Cx43 may participate in the recruitment of proteins and sRNA. Indeed, the presence of Cx43 changes the composition and function of the released sEVs. In addition, the restoration of Cx43 in tumour cells with a mutation in BRAF significantly increases the efficay of BRAF/MEKi, and prevents drug resistance by reinforcing cellular senescence and increasing cell death by apoptosis. Importantly, double resistant cell lines do not contain Cx43, and the transfection with a vector to overexpress Cx43 or treatment with sEVs containing Cx43, re-sensitizes resistant cells to BRAF/MEKi. In this study we have identified Cx43 as a new therapeutic target for the treatment of tumours with BRAF mutations and to overcome drug resistance to BRAF/MEKi.

[es] Mutaciones en la proteína serina/treonina quinasa BRAF se han asociado con el desarrollo y progreso de diferentes tipos de tumores. Más del 50% de casos de melanoma presentan mutaciones en el gen BRAF. El melanoma es un tipo de cáncer que se origina en los melanocitos y es el tumor de piel más letal. Mutaciones en el gen BRAF resultan en una activación constitutiva de su actividad quinasa, siendo la mutación más frecuente la transición de valina a glutamato (V600E). Los inhibidores BRAF combinados con inhibidores MEK (BRAF/MEKi) están resultando de gran utilidad en el tratamiento de tumores metastáticos. Sin embargo, un porcentaje importante de pacientes adquieren resistencia al cabo de 8-12 meses. En cáncer en general y, en melanoma en particular, la resistencia a los tratamientos, especialmente a los BRAF/MEKi, sigue siendo el principal obstáculo para aumentar la supervivencia global en cáncer. Las conexinas (Cxs) son una familia de proteínas transmembrana que forman hemicanales y uniones comunicantes que permiten la comunicación paracrina y directa entre células en contacto, mediante el intercambio de iones, metabolitos y moléculas pequeñas. Alteraciones en la conexina43 (Cx43) y en la actividad de las uniones comunicantes se han asociado tanto al desarrollo como al progreso de diferentes tipos de tumores. Hoy en día, todavía existe controversia en cuanto a la función de la Cx43 en el progreso del melanoma. Los objetivos de este proyecto se centraron en investigar la función de la Cx43 en tumores con mutaciones en BRAF y su potential implicación en mecanismos de resistencia a los BRAF/MEKi. Los resultados de este trabajo indican que los pacientes de melanoma expresan bajos niveles de Cx43 y que su localización es principalmente citoplasmática. El incremento en los niveles de la Cx43, utilizando un vector de expresion o vesículas extracelulares (sEVs) que contienen Cx43, desencadenan una disminución significativa en la proliferación celular y en la capacidad de formar colonias, así como un aumento en senescencia y muerte celular por apoptosis. La disminución en la proliferación celular resultó ser independiente de la actividad de los canales de conexina. Todas las líneas celulares de melanoma estudiadas muestran altos niveles de SUMOilación de la Cx43, que podría afectar a la estabilidad de la proteína, la localización subcelular o la interacción con otras proteínas. El análisis proteómico y de ARN-Sec demuestra que la presencia de la Cx43 en sEVs, incluidos exosomas, cambia radicalmente el contenido de proteínas y pequeñas moléculas de ARN en estas vesículas lo que indica que la Cx43 podría participar en el reclutamiento de proteínas y pequeñas moléculas de ARN. De hecho la presencia de la Cx43 en sEVs cambia significativamente la actividad de estas partículas en ensayos in vitro. La presencia de la Cx43 en tumores con mutación en BRAF aumenta significativamente la eficacia y evita la resistencia a los BRAF/MEKi cuando se restaura con un vector para sobreexpresar la proteína o las células tumorales son tratadas con sEVs positivas para la Cx43. Además, las celulas tumorales dobles resistentes (a BRAF/MEKi) pierden la expresión de Cx43, y la re-expresión de la proteína con un vector o con sEVs-Cx43 re-sensibiliza a estas células a los tratamientos con los BRAF/MEKi. En este trabajo de tesis hemos identificado a la Cx43 como una nueva diana terapéutica para el tratamiento de tumores con mutaciones BRAF y para evitar la resistencia a los BRAF/MEKi.