[en] Cultivation of extremophilic microorganisms has gained interest due to their ability to accumulate and produce high value compounds, namely metabolites, enzymes, carotenoids among others. Coccomyxa onubensis is an acid-environment microalga. Coccomyxa pigments profile is rich in carotenoids, especially lutein, of which naturally accumulates around 4 to 6 g Kg1 dry weight, that is in accordance with other lutein producing species. Furthermore, C. onubensis has the practical advantage of growing well in an extremely selective culture medium at high concentrations of heavy metals, and very low pH which preserves cultures from microbial contamination. This gives the microalga attractive potential as a producer of this photosynthetic pigment This thesis was aimed at increasing biomass productivity and carotenoid content of this lutein-rich microalga, C. onubensis. Chapter II intends to show that acid-environment microalgae can be produced at similar productivities of non-extreme microalgae, with the added advantage of their highly selective culture medium. The existence of carbon concentration mechanisms and conditions that might lead to their increased activity in C onubensis was studied as a tool to increase alga productivity. C. onubensis was grown under high and low CO2 concentrations, showing external and internal carbonic anhydrase activities. Best carbon uptake capacity and growth were showed to occur at acid pH, proving acid-tolerant behavior of C. onubensis. Incubation in air followed by shift to high carbon conditions enhanced carbon use efficiency in terms of growth rate and biomass productivity, based on the activity of both carbonic anhydrases. High concnetrations of lutein was accumulated and did not depend on inorganic carbon conditions. Consequently, chapter II showed that repeated cycles of air-incubation and high CCh-incubation of C. onubensis might become a suitable tool to perform production processes of lutein-enriched biomass. In Chapter III, the influence of Cu (II) on productivity and accumulation of value carotenoids of the microalga was studied. Copper was added in range between 0.06 and 0.4 mM, and an increase in algal viability, biomass and carotenoid productivities was obtained. A copper concentration of 0.2 mM was found to be as the most appropriate one to enhance productivity and lutein accumulation and was used in semicontinuous cultures. C onubensis was found to have great potential as lutein producer when compared to known lutein accumulating microalgae. At low light intensities, most algae produce more light-harvesting pigments to improve their photosynthetic efficiency while at high light intensities, some algae produce high concentrations of "sunscreen" pigments to protect the cell from excess light. In these terms, the aim of the work described in Chapter IV was to study the effect of low to moderate light intensity shifts on lutein accumulation of Coccomyxa cultures, doubly aimed at understanding the light'dependent role of main carotenoids in acid-tolerant microalgae and at developing strategies to induce lutein accumulation with applied purposes. Coccomyxa reached its maximum growth rates and carotenoid productivities at 400 pmol photons nv2 s1 that corresponds to maximal irradiance that reaches the surface of a flat panel reactor placed vertically under summer conditions in southern Spain. Cell density was also shown to influence short-time course evolution of carotenoids, which can be used for increasing lutein content of C. onubensis in outdoor production. According to that, the aims of the Chapter V were to evaluate the feasibility of outdoor cultivation of the acid-environment alga C. onubensis and to assess its potential as alternative source of lutein. C. onubensis was cultivated in acid culture medium under springtime outdoor conditions in a pilot tubular photobio reactor in southern Spain. The results showed that C. onubensis is able to withstand high temperature levels. Maximum daily biomass productivity was obtained at maximum irradiance of 1000 {imol photons nr2 s'1, however higher irradiances were detrimental for the culture. Intracellular lutein content increased at the end of the day, probably related to light absorption functions. This thesis gives a guideline of some of the parameters that influence both biomass productivity and carotenoid enrichment of the acid-environment microalga Coccomyxa onubensis. Therefore, the obtained results should allow to design mass production strategies of a potential large-scale cultivation of acid-environment microalgae and should allow to design lutein-rich biomass production strategies of this microalga.

[es] El cultivo de microorganismos extremófilos ha ganado interés debido a su capacidad para producir y acumular compuestos de alto valor, como metabolitos, enzimas y carotenoides, entre otros, Coccomyxa onubensis es una microalga de ambiente ácido rica en carotenoides, especialmente en luteína. C. onubensis es capaz de acumular este pigmento fotosintético en alto contenido de manera natural, en torno a 4-6 g Kg1 de su peso seco, valores muy similares a los de especies consideradas productoras de luteína. Además, C, onubensis tiene la ventaja de crecer adecuadamente en medios de cultivo extremadamente selectivos, con altas concentraciones de metales pesados y muy bajo pH, previniendo de contaminación microbiana a los cultivos. Esto confiere a C. onubensis un atractivo potencial como microalga productora de luteína. Esta tesis tuvo como objetivo principal incrementar la productividad de biomasa y el contenido en carotenoides de esta microalga. El Capítulo II tuvo como propósito mostrar que las microalgas de ambiente ácido pueden generar productividades similares a las de microalgas no extremófilas, con la ventaja añadida de crecer en un medio altamente selectivo. Como herramienta para aumentar la productividad, se estudiaron la existencia de mecanismos concentradores de carbono y las condiciones que pueden provocar un incremento de su actividad. C, onubensis creció en altas y bajas concentraciones de CO2, mostrando actividad de la enzima anhidrasa carbónica, tanto interna como externa. A su vez, la microalga creció bajo distintos valores de pH, mostrando el mejor crecimiento y la mayor capacidad de captura de carbono a pH ácido, lo que proporciona a C. onubensis una conducta ácido-tolerante. Cuando los cultivos fueron incubados en condiciones de bajo carbono (solo aire), transfiriéndolos posteriormente a gaseo con alto carbono (aire enriquecido con CO2), se observó un incremento en la eficiencia de uso del carbono, Este aumento se basó en la actividad de la anhidrasa carbónica y se tradujo en un incremento de la tasa de crecimiento y de la productividad de la microalga. El capítulo Ií mostró que cultivar C. onubensis en ciclos repetitivos consistentes en incubación en aire seguida de gaseo en aire rico en CO2, puede ser una herramienta para la producción de biomasa algal rica en luteína. En el Capítulo III se estudió la influencia del Cu (II) en la productividad y la acumulación de carotenoides. El cobre fue añadido en distintas concentraciones, desde 0.06 a 0.4 raM, provocando en Coccomyxa aumentos en productividad y síntesis de carotenoides. La concentración más adecuada resultó ser 0.2 mM, en cultivos semicontinuos. Estos resultados pusieron de manifiesto que C. onubensis puede tener un gran potencial como productora de luteína, A bajas intensidades de luz, la mayoría de las algas producen una mayor cantidad de pigmentos captadores para mejorar su eficiencia fotos i nté tica, mientras que a intensidades altas producen pigmentos antioxidantes para protegerse del exceso de luz. En estos términos, en el Capítulo IV se estudió el efecto provocado por cambios de intensidad de luz sobre la acumulación de carotenoides, especialmente luteína, con el doble objetivo de comprender el papel frente a la luz de los principales carotenoides en microalgas ácido-tolerantes y el desarrollo de estrategias para inducir su acumulación, C. onubensis alcanzó su máximo crecimiento y productividades de carotenoides a 400 ^mol fotones mz s*1, que corresponde a la máxima irradiancia que alcanza la superficie vertical de un reactor panelar en verano en el sur de España. En este capítulo se mostró que la densidad celular influye en la variación del contenido en carotenoides, lo cual se puede utilizar como estrategia de cultivo exterior. En esta línea, en el Capítulo V se evaluó la viabilidad de cultivos en exterior de C. onubensis y su potencial como fuente alternativa de Iuteína. Para ello Coccomyxa creció en un reactor tubular experimental, en condiciones exteriores de primavera en el sur de España. Los resultados mostraron que C. onubensis es capaz de soportar altas temperaturas, obteniendo las máximas productividades a 1000 (jmol fotones nr2 s1. Por encima de ese valor la luz resultó perjudicial para los cultivos. El contenido en Iuteína fue máximo al final del día, probablemente debido a su función de absorción de luz. Esta tesis proporciona una guía de parámetros que influyen en la productividad de biomasa y en el enriquecimiento de carotenoides de la microalga C. onubensis. Los resultados obtenidos deben permitir el diseño de estrategias para la producción de cultivos a gran escala de microalgas de ambiente ácido y de producción de biomasa rica en Iuteína de esta microalga.