[en] TITLE Role of activating and inhibitory receptors in the formation of NK cells and their relationship with the progression and survival of patients with solid cancers (Melanoma, Bladder and Ovarian) INTRODUCTION Survival of cancer patients has progressively improved in recent decades as new, increasingly effective treatments have become available. Chemotherapy has shown good results in early stages of cancer. However, a significant number of tumors are resistant to known drugs, this has let to various biologic drugs that attempt to boost the patient's immune system to attack the tumor. Some drugs only manage to extend survival by a few months, and others, at very high prices and for very specific types of cancer, have managed to cure patients who did not respond to other treatments. Among these treatments, NK cell-based therapies offer hopeful results in patients with solid tumors. The adequate selection of donors, the optimization of the methods to expand NKs in vitro and the education of these cells aim to improve their interactions with the neoplastic cells of patients, increasing their life expectancy. The evaluation and study of receptor genes and KIR ligands and the expression levels of different membrane proteins will help us to know the relationship at the molecular level that determine the interaction of NK cells with tumor cells, thus allowing us to select more effective cells. MATERIALS AND METHODS The studies included 621 healthy Caucasian volunteers (control group) and 249 Caucasian patients with melanoma (n=80), bladder (n=80), and ovarian (n=89) tumors. In the bladder cancer study, a second group of patients (n=84) was included in a retrospective analysis to reach a total of 164 patients with bladder tumors. Peripheral blood was obtained in EDTA tubes from all patients (n=249) and from 42 healthy controls between 2014 and 2016 at the Virgen de la Arrixaca University Clinical Hospital and the Santa Lucia General University Hospital (Murcia, Spain). For in vivo assays, proliferation of T lymphocytes and expression of surface markers, peripheral blood anticoagulated with sodium heparin was obtained. HLA class-I (KIR ligands) and KIR genotyping was performed on all samples in the series. Further, the expression of CD3, CD4, CD8, CD16, CD226 and inhibitory and activating KIR receptors and NKG2A on T and NK cells was analyzed by flow cytometry. Patients were followed up until July 2017 to estimate progression-free survival (PFS) and overall survival (OS), in relation to KIR/ligand interactions and CD226 expression. RESULTS The interaction of the inhibitory molecules with their ligands produces an overexpression of the CD226 costimulatory molecule and a reduction in the expression of the inhibitory receptor interaction. It has been possible to verify how patients with higher CD226 expression or higher CD226/inhibitor ratios have longer survival. In the other hand, it was possible to demonstrate that the interaction of the KIR activators is associated with a decrease in the expression of CD226 in the educated NK cells, without the alteration of the expression of CD226 in the uneducated ones. Finally, a possible KIR2DL5/HLA-C*16 interaction was identified, other combinations of KIR receptors with their ligands, allowing to differentiate 3 groups of risk of progression (low, medium and high) and overall survival in patients affected by bladder cancer. CONCLUSIONS Unfortunately, therapies are currently personalized based on clinicopathological criteria and, therefore, patients with a poor prognosis can undergo, for example, removal of the urinary vesicle and have survival rates of more than 10 years or, conservative therapies in patients with a good prognosis who subsequently have an aggressive course of the disease and might have benefited from early removal of the bladder. Therefore, there must be additional factors that determine the survival of these patients, and one of the main factors is the diversity of the immune system, which after the cytoreduction to which the patient is subjected in the early stages of treatment, can favor more antitumor responses effective against residual tumor tissue in some patients than in others. Although NK cells are known to be one of the major cell populations of the immune system involved in the antitumor response and in immunosurveillance against tumors, the role played by the interactions of inhibitory and activating molecules that guide their formation and functional activity It has been little explored, in general and, in particular, in solid tumors. In this thesis study, in a large number of patients with solid tumors (melanoma, ovary and bladder), it is shown that in NK cells the interaction of inhibitory receptors with their corresponding ligands has a notable effect on the expression of their receptors activators and inhibitors and therefore the activator/inhibitor ratio.

[es] TITULO Papel de receptores activadores e inhibidores en la educación de células NK y su relación con la progresión y supervivencia de pacientes con cánceres sólidos (Melanoma, Vejiga y Ovario) INTRODUCCION La supervivencia de los pacientes con cáncer ha mejorado progresivamente en las últimas décadas a medida que nuevos tratamientos, cada vez más eficaces han ido estando disponibles. La quimioterapia ha demostrado buenos resultados en estadíos tempranos del cáncer. Sin embargo, terapias basadas en células NK ofrecen resultados prometedores en pacientes con tumores sólidos. La selección adecuada de donantes, la optimización de los métodos para expandir NKs in vitro y la educación de estas células pretenden mejorar las interacciones de estas con las células neoplásicas de pacientes, aumentando su esperanza de vida. La evaluación y estudio de genes de receptores y ligandos KIR y los niveles de expresión de distintas proteínas de membrana nos ayudaran a conocer la relación a nivel molecular que determinan la interacción de las células NK con las células tumorales, permitiéndonos así seleccionar células que actúen de manera más eficaz. MATERIAL Y METODOS Los estudios incluyeron a 621 voluntarios sanos caucásicos (grupo control) y 249 pacientes caucásicos con melanoma (n=80), tumores de vejiga (n=80) y ovario (n=89). En el trabajo del cáncer de vejiga se incorporó un segundo grupo de pacientes (n=84) en un análisis retrospectivo para llegar a un total de 164 pacientes con tumor vesical. Se obtuvo sangre periférica en tubos EDTA de todos los pacientes (n=249) y de 42 controles sanos entre los años 2014 y 2016 en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca y el Hospital General Universitario Santa Lucia (Murcia, España). Para los ensayos funcionales in vivo, proliferación de linfocitos T y expresión de marcadores en superficie, se obtuvo sangre periférica anticoagulada con Heparina de sodio. En todas las muestras de la serie se realizó genotipado de HLA clase-I (ligandos KIR) y KIR. Además, se analizó la expresión de CD3, CD4, CD8, CD16, CD226 y receptores KIR inhibidores y activadores y NKG2A en células T y NK mediante citometría de flujo multiparamétrica. Se realizó un seguimiento a los pacientes hasta julio de 2017 para estimar la supervivencia libre de progresión (PFS) y supervivencia global (SG), en relación a las interacciones KIR/ligando y a la expresión de CD226. RESULTADOS La interacción de las moléculas inhibidoras con sus ligandos, lleva a una sobreexpresión de la molécula coestimuladora CD226 y a una reducción en la expresión del propio receptor inhibidor involucrado en dicha interacción. Se ha podido comprobar como los pacientes que presentan mayor expresión de CD226 o mayores cocientes CD226/inhibidor presentaban supervivencias más prolongadas. Por otro lado, se pudo demostrar que la interacción de los KIR activadores se asocia con una disminución en la expresión de CD226 en las células NK educadas, sin alterar la expresión de CD226 en las no educadas. Por último, se identificó una posible interacción KIR2DL5/HLA-C*16, otras combinaciones de receptores KIR con sus ligandos, permitiendo diferenciar 3 grupos de riesgo de progresión (bajo, medio y alto) y supervivencia global en pacientes afectados por cáncer de vejiga. CONCLUSIONES Desafortunadamente, en la actualidad las terapias se personalizan en base a criterios clínico-patológicos y, por tanto, pacientes con mal pronóstico pueden ser sometidos, por ejemplo, a extirpación de la vesícula urinaria y tener supervivencias de más de 10 años o, por el contrario, terapias conservadoras en pacientes de buen pronóstico que posteriormente tienen un curso agresivo de la enfermedad y podrían haberse beneficiado de una extirpación temprana de la vejiga. Por tanto, deben existir factores adicionales que condicionan la supervivencia de estos pacientes, y uno de los principales factores es la diversidad del SI, que tras la citorreducción a la que es sometido el paciente en las primeras etapas del tratamiento, puede favorecer respuestas antitumorales más eficaces contra el tejido tumoral residual en unos pacientes que en otros. Aunque las células NK se sabe que son una de las principales poblaciones celulares del sistema inmunitario implicadas en la respuesta antitumoral y en la inmunovigilancia frente a los tumores, el papel que juegan las interacciones de las moléculas inhibidoras y activadoras que guían su educación y actividad funcional ha sido escasamente explorado, en general y, en particular, en tumores sólidos. En este estudio de tesis se pone de manifiesto en un número amplio de pacientes con tumores sólidos (melanoma, ovario y vejiga), que en células NK la interacción de receptores inhibidores con sus ligandos correspondientes, tiene un efecto notable en la expresión de sus receptores activadores e inhibidores y por tanto del cociente activador/inhibidor.