[en] Proteins are key elements for cellular life, performing a wide variety of functions, which usually rely on keeping a defined structure. The native folded structure is in an equilibrium with an ensemble of unfolded states and, as every equilibrium, it is characterized by an equilibrium constant and a Gibbs free energy of unfolding. Characterizing these equilibria and how mutations affect them has been the main goal of the protein stability field of study, due to its huge practical implications. Not only would it be relevant in vivo, to understand the destabilization of some disease-inducing protein variants, advancing towards personalized medicine, but also ex vivo, as the wide variety of functions of proteins allow for their use in industrial processes, diagnostics, and therapeutics. A higher protein stability ex vivo would allow for more extreme operation conditions in an industrial workflow, increasing the conversion rate, or for a less demanding storage, increasing the shelf life of protein-based products. Initially, research in protein stability and mutational effects was mostly experiment-driven, with a strong focus on structural determination and thermodynamic measurements of mutants of interest. With progress in understanding this field, protein stabilization advanced in two different directions: stabilization using rational rules and random mutant generation followed by mutant selection, being the latter approach recently awarded a Nobel prize. With the improvements in computation and knowledge, computational approaches for predicting protein stability from sequence or structure are becoming increasingly common, even though their predictive performance yet needs to be improved. This thesis focuses on these computational techniques, using different approaches as suited for different applications, developing new methods of analysis and assessing their viability for real-life use. Two main groups of applications are distinguished in this thesis: those related to stabilization, and those related to destabilization. When dealing with stabilization, their application would be mostly related to industrial production or to diagnostics and therapeutics. For this purpose, the web server Protposer for predicting potentially stabilizing mutants from the structure of a protein using rational stabilization principles has been developed, showing a higher predictive power than currently used software. In the case of destabilization, its main goal is predicting pathogenicity. In this line, approaches of different degree of complexity have been developed along this thesis. The most simple one is PirePred, a web server conceived to guide variant interpretation, which contains a meta-predictor of the pathogenicity of protein variants based on a modified majority vote algorithm that outperforms similar purpose software. However, as the predictive power of current predictors is limited, more complex approaches have been developed based on Molecular Dynamics (MD). MD simulations are becoming increasingly popular, but this thesis has shown some of its main limitations. A first study on determining a partially unfolded conformation, that of the molten globule at acidic pH of the apoflavodoxin of Helicobacter pylori, showed that classical MD simulations rely heavily on the selection of force fields and water models and that even with the most realistic selection, are not in the performance level of simulation techniques that combine experimental data, such as φ values, with simulation, as in Biased Molecular Dynamics (BMD). Additionally, an estimation of the time needed to simulate all variants arising from a SNP of all proteins long enough to predict their pathogenicity showed that, using a simulation temperature of 25 oC and the computational power of the Top Ten supercomputers, the optimal time for starting those simulations is still far, in 2052. However, preliminary relaxation Molecular Dynamics simulations were performed in three real-case scenarios (protein MeCP2, causing Rett Syndrome; protein c-MyBP-C, causing hypertrophic cardiomyopathy; and protein Chk2, predisposing to different types of cancer) and showed promising results, but still need to be polished. As a whole, this thesis showed both the potentiality and the current limitations of protein stability computational predictors, while developing new powerful tools for protein engineering and stepping towards personalized medicine. The results are promising, but they are not good enough yet to be applied in clinical diagnosis. Improvements in datasets, force fields, analysis algorithms and computational power will help these methods to get there. Most importantly, this thesis highlights that there is a predictive gap for predicting pathogenicity that cannot be overcome without combining protein stability predictors with protein functionality predictors. A combination of both methods would allow for an accurate prediction that could revolutionize the concept of precision genomic personalized medicine.

[es] Las proteínas son elementos clave para la vida celular que realizan una amplia variedad de funciones, que normalmente dependen de mantener una estructura tridimensional definida. La estructura plegada nativa está en un equilibrio con un gran número de conformaciones desplegadas. Este equilibrio, como cualquier otro, se caracteriza por una constante de equilibrio y una diferencia de energía libre de Gibbs de desplegamiento. El análisis del efecto de las mutaciones sobre este equilibrio tiene enormes implicaciones prácticas y ha sido el principal objetivo del campo de la estabilidad de las proteínas. La comprensión de la estabilidad de las proteínas no solamente sería relevante in vivo para avanzar hacia la medicina personalizada, al entender la desestabilización en variantes proteicas que causan enfermedad, sino también ex vivo, ya que la gran variedad de funciones proteicas permite su uso en procesos industriales, diagnósticos y terapéuticos. Por ejemplo, el aumento de la estabilidad de las proteínas permitirá un uso industrial eficiente, aumentando las tasas de conversión, facilitando condiciones de almacenamiento menos exigentes y aumentando la vida útil de los productos basados en proteínas. Inicialmente, la investigación en la estabilidad de proteínas y los efectos de las mutaciones era mayoritariamente experimental, con especial énfasis en la determinación estructural y las medidas termodinámicas de mutantes de interés. Con el avance del entendimiento en este campo, la estabilización de proteínas avanzó en dos direcciones diferentes: estabilizar usando reglas racionales o generar mutantes al azar seguido de una selección de los mismos, siendo esta última aproximación objeto de un Premio Nobel. Con las mejoras en la computación y en el conocimiento del campo, las aproximaciones computacionales para predecir la estabilidad proteica desde la secuencia o la estructura son cada vez más comunes, aunque su capacidad predictiva aún tenga que mejorarse. Esta tesis se centra en estas técnicas computacionales, usando diferentes aproximaciones para diversas aplicaciones, desarrollando nuevos métodos de análisis y evaluando su viabilidad para el uso en la vida real. Dos grupos principales de aplicaciones se distinguen en esta tesis: los relacionados con estabilización y los relacionados con desestabilización. Al tratar la estabilización, su aplicación estaría más relacionada con la producción industrial o con el diagnóstico y tratamiento. Para este objetivo, se ha desarrollado el servidor web Protposer para predecir mutantes potencialmente estabilizantes desde la estructura de una proteína usando principios racionales de estabilización, mostrando un poder predictivo mayor que el software actualmente utilizado. En el caso de la desestabilización, su principal meta es predecir patogenicidad. En este sentido, se han desarrollado en esta tesis aproximaciones con diferente grado de complejidad. La más simple es PirePred, un servidor web pensado para guiar la interpretación de variantes que contiene un metapredictor de la patogenicidad de variantes proteicas basado en un algoritmo de voto mayoritario modificado que mejora los resultados de los programas con el mismo fin. De todas formas, como el poder predictivo de los predictores actuales es limitado, se han desarrollado aproximaciones más complejas basadas en Dinámica Molecular (MD). Las simulaciones de MD son cada vez más populares, pero esta tesis ha mostrado algunas de sus limitaciones principales. Un primer estudio tratando de determinar una conformación parcialmente desplegada, la del glóbulo fundido a pH ácido de la apoflavodoxina de Helicobacter pylori, ha mostrado que las simulaciones clásicas de MD dependen mucho en la selección de campos de fuerza y modelos de agua y que, aun con la selección más realista, no están al nivel de resultados de técnicas de simulación que combinan datos experimentales como los valores φ con las simulaciones, como en las Dinámicas Moleculares Sesgadas (BMD). Además, una estimación del tiempo necesario para simular todas las variantes que surgen de un SNP de todas las proteínas lo suficiente como para predecir su patogenicidad mostró que usando una temperatura de simulación de 25 oC y la potencia de los supercomputadores del Top Ten, el momento óptimo para comenzar estas simulaciones aún queda lejos, en 2052. Sin embargo, simulaciones de Dinámica Molecular de relajación (rMD) preliminares se han realizado en tres escenarios reales (la proteína MeCP2, causante del síndrome de Rett; la proteína c-MyBP-C, causante de la cardiomiopatía hipertrófica; y la proteína Chk2, que predispone a diferentes tipos de cancer), mostrando resultados prometedores, pero que aún necesitan ser pulidos. En general, esta tesis ha mostrado tanto la potencialidad como las limitaciones actuales de los predictores computacionales de la estabilidad de las proteínas, a la par que ha desarrollado nuevas herramientas potentes para la ingeniería de proteínas y el avance hacia la medicina personalizada. Los resultados son prometedores, pero aún no son lo suficientemente buenos como para aplicarse al diagnóstico clínico. Las mejoras en los conjuntos de datos, campos de fuerza, algoritmos de análisis y potencia de cálculo ayudarán a alcanzar ese objetivo. De manera remarcable, esta tesis señala que hay un vacío en la predicción de patogenicidad que no se puede superar sin combinar las predicciones de estabilidad de proteínas con las de función de la misma. Una combinación de ambos métodos permitiría una predicción precisa que podría revolucionar el concepto de medicina personalizada genómica de precisión.