[en] Glioblastoma multiforme (GBM) presents activation of neuroinflammatory markers, which promotes local glial cell activation and monocyte and lymphocyte infiltration. This inflammatory activation and local angiogenesis are thought together to promote tumor growth, and this angiogenesis appears critical to tumor survival and propagation. Blood vessel networks are believed to act as paths for alternatively activated M2 macrophages and tumorigenic cells to enter naïve brain areas. GBM blood vessels show important morphological alterations yet the significance of these changes is poorly understood. As such, revisiting the basic microarchitecture of glioma vasculature is opportune. Here, we analyze the microvasculature three-dimensionally (3D) in 60-µm thick, free-floating human biopsy tissue blocks, visualizing basement membrane and endothelial cell components and examining several tumor microenvironment (TME) populations. After immunohistochemical detection, samples were imaged in 3D with a laser scanning confocal microscope and the resulting 3D image stacks were analyzed with specialized software (Imaris and Fiji) to quantify relevant morpho- and topological parameters which were compared with normal tissue and correlated with tumor severity. Our analysis shows evidence of profound basement membrane disruption, i.e. altered collagen IV deposition and consequent vessel wall discontinuity and CD31/collagen IV disassociation, resulting in blood vessels apparently without intact endothelial cell lining. Vessels seem clearly aberrant with larger, more variable diameters, uneven, irregular collagen IV distribution and vessel wall fenestration. We identified primary tumor vascularization patterns (cooption, looping, intussusception and silent corollary vessels) and predominant branching strategies. Our data confirms that the human glioma environment utilizes multiple vasculogenesis strategies and many tumor vasculature alterations correlate positively with increased tumor severity. We established that T cells increase in GBM conditions and may enter more deeply into the tumor with increasing severity, increased penetration correlating positively with vessel wall discontinuity. TAMMs increase with tumorigenicity; MHCII+ and GFAP+ cells occupy distinct TME niches. We have developed a reliable and replicable sample immunostaining technique that preserves structural relationships, allowing us to study the glioma vasculature and MET cell populations and collect relevant data on spatial relationships. Such a deep analysis of human tissue is essential to understand brain diseases in their natural environment and to look beyond experimental models.

[es] El glioblastoma multiforme (GBM) presenta activación de marcadores neuroinflamatorios, que promueven la activación de las células gliales locales y la infiltración de monocitos y linfocitos. Esta activación inflamatoria y la angiogénesis local se considera que pueden promover el crecimiento del tumor conjuntamente, y la angiogénesis parece ser crítica para la supervivencia y propagación del tumor. Se cree que las redes de vasos sanguíneos actúan como vías para que los macrófagos M2 activados alternativamente y las células tumorigénicas entren en áreas cerebrales sanas. Los vasos sanguíneos en el GBM muestran notables alteraciones morfológicas, aunque la importancia de estos cambios aún no se comprende bien. Como tal, es oportuno revisar la microarquitectura básica de la vasculatura del glioma. Aquí, analizamos la microvasculatura tridimensional (3D) en bloques de tejido de biopsias humanas de 60 µm de espesor y flotantes. Mediante inmunofluorescencia, visualizamos los componentes de la membrana basal y de las células endoteliales, examinando varias poblaciones del microambiente tumoral (MET). Después de la detección inmunohistoquímica, las muestras se visualizaron con un microscopio confocal de barrido láser y las imágenes 3D resultantes se analizaron con software especializado (Imaris y Fiji) para cuantificar los parámetros morfo- y topológicos relevantes. Posteriormente, estos parámetros se compararon con el tejido normal y se correlacionaron con la severidad del tumor. Nuestro análisis muestra evidencia de una profunda alteración de la membrana basal, probablemente por una deposición alterada de colágeno IV y consecuentemente vemos discontinuidad de la pared del vaso y disociación de CD31/colágeno IV, resultando en vasos sanguíneos aparentemente sin revestimiento de células endoteliales. Los vasos tienen apariencia aberrante, con diámetros más grandes y variables, distribución desigual e irregular del colágeno IV y fenestración de la pared del vaso. Se identificaron patrones de vascularización tumoral primaria (cooptación, looping, intususcepción y vasos corolarios silenciosos) y estrategias de ramificación predominantes. Nuestros datos confirman que el glioma humano utiliza múltiples estrategias de vasculogénesis, y muchas alteraciones de la vasculatura tumoral se correlacionan positivamente con la gravedad del tumor. Se estableció que las células T aumentan en el GBM y pueden entrar más profundamente en los tumores de mayor severidad. Además, una mayor penetración se correlaciona positivamente con una mayor discontinuidad de las paredes de los vasos sanguíneos. Los macrófagos y microglia también aumentan con la tumorigenicidad; y las células MHCII+ y GFAP+ ocupan nichos tumorales distintos. Hemos desarrollado una técnica de inmunotinción de muestras fiable y replicable que preserva las relaciones estructurales, lo que nos permite estudiar la vasculatura del glioma y las poblaciones de células del MET y recopilar datos relevantes sobre las relaciones intercelulares en el espacio. Un análisis tan profundo del tejido humano es esencial para comprender las enfermedades cerebrales en su entorno natural y mirar más allá de los modelos experimentales.