[en] Aquaculture is probably the fastest growing sector in the food industry, producing almost 50 percent of the fish destined for human food worldwide. However, to supply this high demand, fish are farmed in intensive systems, where they are exposed to stress conditions. These factors promote the appearance of diseases, which are manifested mainly on the skin. Thus, this Doctoral Thesis, divided in two parts, aimed to study the skin from fish of interest in aquaculture (Part 1, with four Chapters) and apply imaging techniques to fish study (Part 2, with three Chapters). In Part 1, the effect of different external factors on the skin and its mucus in some fish species was studied. First, different immune parameters were analysed in the skin mucus of gilthead seabream (Sparus aurata) and European sea bass (Dicentrarchus labrax) exposed to a constant light–dark (L:D) photoperiod. Results showed that the IgM levels and the activity of different enzymes (protease, antiprotease, peroxidase and lysozyme) as well as the bactericidal activity remarkably varied during the daily L:D cycle in those fish. Since fish skin is a primary target organ for entry and colonization of several common pathogens, normally found in the aquatic environment, skin integrity is necessary for fish health. Therefore, we studied the effect of dietary supplementation of guava leaf (Psidium guajava L.) at different percentages (1.5% and 3%) on skin mucus of hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. mossambicus). Immune parameters analysed increased significantly in the skin mucus of fish supplemented with the lowest percentage of guava leaf compared to no supplemented fish (control). In addition, guava leaf supplementation in experimental diets significantly reduced the bacterial load on fish skin after Vibrio harveyi infection, possibly due to the bactericidal properties of this plant. Because skin damage facilitates pathogen entry, we considered analysing the physical and the immune response in the skin of gilthead seabream after experimental wounds (above or below the lateral line) or ulcers in two different trials. Our results showed that the healing process was faster below the lateral line than above it. Furthermore, immune parameters analysed in the skin mucus and serum showed variations depending on the wound site. Gene expression of several immune-relevant genes (il1b, il6, tgfb, ight, grhl, krt1) was also evaluated, showing variations depending on the location of the wound. Regarding experimental ulcers, the abundance of terminal carbohydrates and some Abstract-Doctoral Thesis Diana C. Ceballos Francisco 2 immune parameters evaluated in skin mucus showed variations in the ulcerated skin compared to the non-ulcerated. Concomitantly, the analysis of the skin microbiota was performed and demonstrated that skin ulcers provide microenvironments that disturb the mucus composition and the microbial biodiversity of the skin. In another experiment, the fluorescein test was used as an easy and inexpensive tool to detect incipient skin lesions on experimentally damaged skin of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and zebrafish (Danio rerio). In Part 2, the application of real-time ultrasonography and X-ray micro computed tomography (micro-CT) to study gilthead seabream and European sea bass demonstrated that the skin thickness varied depending on the body region. Furthermore, a complete segmentation of gilthead seabream body was carried out by micro-CT showing density values for the whole fish in the range of -1,000 to +2,500 HU (Hounsfield Units), while values for skin and subcutaneous fat were between -400 and -50 HU. In addition, fat density range was stablished between -115 to +50 HU allowing us to identify segmented areas, which topographically coincided with fat depots in gilthead seabream. In conclusion, our study demonstrates that the skin and its mucus may be affected by several external factors present in everyday aquaculture practices. On the other hand, the predisposition of skin for colonization by pathogens, the effect of the diet on the enhancement of the immune response and the influence of physical damage on the skin and its mucus was demonstrated. Hence, it is necessary to improve husbandry conditions, as well as the implementation of preventive tools to ensure and assess an adequate health status in the farmed fish. Finally, the application of imaging techniques to study fish morphometry, provided novel results that allow us to evaluate body changes in situ providing valuable information to be used for the in vivo experimentation, thus seeking to apply the principle of the 3Rs on animal ethics

[es] La acuicultura es probablemente el sector de más rápido crecimiento en la industria alimentaria, produciendo casi el 50 por ciento del pescado destinado a la alimentación humana en todo el mundo. Sin embargo, para satisfacer esta demanda, los peces son criados en sistemas intensivos, donde están expuestos a situaciones de estrés, favoreciendo la aparición de enfermedades que se manifiestan principalmente en la piel. Por esta razón, en la presente Tesis Doctoral se ha estudiado la piel de varias especies de peces de interés en acuicultura (Parte 1 que consta de cuatro Capítulos) y se han aplicado técnicas de diagnóstico por imagen para el estudio de los peces (Parte 2 que posee tres Capítulos). En la Parte 1 se estudió el efecto de diferentes factores externos sobre la piel y el moco asociado a ella en varias especies de peces. En primer lugar, se analizaron diferentes parámetros inmunitarios en el moco de la piel de la dorada (Sparus aurata) y la lubina (Dicentrarchus labrax) bajo un fotoperiodo constante de luz-oscuridad (L:O). En este ensayo, se observó quelos niveles de IgM y la actividad de diferentes enzimas (proteasa, antiproteasa, peroxidasa y lisozima), así como la actividad bactericida, variaban notablemente durante el ciclo diario de L:O. Dado que la protección de la piel es necesaria para la salud de los peces, estudiamos el efecto de la suplementación dietética con hoja de guayaba (Psidium guajava L.) a diferentes porcentajes (1,5 % y 3 %) en el moco de la piel de la tilapia híbrida (Oreochromis niloticus × O. mossambicus). Los parámetros inmunitarios analizados aumentaron significativamente en el moco cutáneo de los peces alimentados con el menor porcentaje de la hoja de guayaba, en comparación con los peces alimentados con dieta control. Además, la suplementación de hoja de guayaba en las dietas experimentales redujo significativamente la carga bacteriana en la piel después de una infección con Vibrio harveyi, posiblemente debido a las propiedades bactericidas de la hoja de guayaba. Debido a que cualquier daño en la piel facilita la entrada de patógenos, nos planteamos analizar la respuesta física e inmunitaria en la piel de la dorada después de realizar heridas (por encima o por debajo de la línea lateral) o úlceras experimentales. Nuestros resultados demostraron que el proceso de curación fue más rápido por debajo de la línea lateral que por encima de ella. Además, los parámetros inmunitarios analizados en el moco de la piel y en el suero mostraron variaciones dependiendo del sitio de la herida. Así mismo, se Resumen-Tesis Doctoral Diana C. Ceballos Francisco 2 evaluó la expresión de varios genes relevantes para el sistema inmunitario (il1b, il6, tgfb, ight, grhl, krt1) mostrando destacadas variaciones en función de la localización de las heridas. En cuanto a las úlceras experimentales, la abundancia de carbohidratos terminales y algunos parámetros inmunitarios evaluados en el moco de la piel mostraron variaciones en la piel ulcerada en comparación con la piel no ulcerada. Además, se realizó el análisis de la microbiota de la piel y se observó que las úlceras cutáneas proporcionan microambientes que alteran la composición del moco y la biodiversidad microbiana de la piel. En otro ensayo, se utilizó la prueba de fluoresceína como una herramienta fácil y económica para detectar lesiones cutáneas iniciales en la piel dañada experimentalmente en trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) y pez cebra (Danio rerio). En la Parte 2 de esta Tesis Doctoral se aplicó la ultrasonografía y la microtomografía computarizada de rayos X (micro-TC) para el estudio de la dorada y la lubina demostrando que el grosor de la piel varía en función de la zona del cuerpo. Además, se realizó una segmentación completa de la dorada mediante micro-TC obteniéndose valores de densidad de todo el pez en el rango de -1000 a +2500 UH (unidades Hounsfield), mientras que los valores para la piel y la grasa subcutánea se situaron entre -400 y -50 UH. Así mismo, el rango de densidad de la grasa se estableció entre -115 a +50 UH lo que permitió identificar áreas segmentadas que coincidían topográficamente con los depósitos de grasa presentes en la dorada. En conclusión, nuestro estudio demuestra que la piel y la capa de moco asociada a ella pueden verse afectadas por varios factores externos relacionados con las actuales prácticas acuícolas. Por otro lado, hemos demostrado la predisposición de la piel a la colonización por patógenos, el efecto de la dieta en la mejora de la respuesta inmunitaria y la influencia del daño físico sobre la piel y su moco. Por todo ello, pensamos que es necesario mejorar las condiciones de cría y manejo, así como la implantación de herramientas preventivas para asegurar y evaluar el estado de bienestar de los peces de acuicultura. Finalmente, la aplicación de técnicas de diagnóstico por imagen en el estudio de la morfometría de los peces nos proporcionó resultados novedosos que nos permiten evaluar cambios corporales in situ, aportando información valiosa que puede ser usada para futuras investigaciones in vivo, buscando así aplicar el principio de las 3Rs sobre ética animal.