[en] Bisphenol-A (BPA) is the main component of the polycarbonate plastics, and it is also used as an additive in the manufacture of many others types of plastics and epoxy resins. BPA is extensively present in daily consumer goods in close contact with food and beverages, and it is detected in the urine of 93% of USA citizens. BPA has been classified as an endocrine disruptor chemical (EDC), which acts like a xenoestrogen by binding to estrogen receptors ERα and ERβ. Epidemiological studies show that BPA exposure is linked to the development of some diseases, including metabolic disorders like diabetes mellitus and obesity. In the last decade, several works suggest that BPA could be involved in the etiology of type-2 diabetes, because it elicits insulin resistance and alters pancreatic β-cell function in BPA-treated mice. Previous works of our group have demonstrated that BPA increases the expression levels of the insulin gene, and that BPA-induced insulinotropic effects depends on rapid KATP inhibition. These mechanisms are mediated by ERα and ERβ extranuclear-initiated cascades respectively. The main goal of this project is to characterize how BPA chronic exposure could directly modulate the function of pancreatic β-cells and islets of Langerhans. To address this aim, we have established an in vitro long-lasting exposure model using dispersed β-cells and isolated islets of Langerhans, both maintained during 48 hours with BPA always present in the culture medium. We have used a multidisciplinary approach combining several experimental techniques: electrophysiological measurements (electrical activity, global currents and changes in membrane capacity), intracellular calcium recordings using fluorescent dyes, insulin secretion and mRNA expression levels using qPCR. Our results demonstrate that BPA causes significant alterations in β-cell function. BPA at a dose as low as 1 nM promotes changes in the shape of glucose-induced action potentials, decreasing its amplitude and increasing its width. Likewise, 1 nM BPA reduces calcium entry triggered by membrane depolarizations, both in response to glucose or non-metabolic stimuli. Nevertheless, a higher dose, 100 nM BPA, has no effect on our endpoint. Accordingly, we conclude that the relationship between BPA and its effects on calcium entry is non-monotonic. Nonmonotonicity is a common phenomenon in the field of EDCs. The exposure to 1 nM BPA alters in the same extent the exocytotic capacity and insulin secretion of pancreatic β-cells. Pharmacological dissection of macroscopic calcium current suggests that BPA-induced decrease on calcium influx is a consequence of R-type calcium current reduction. Using qPCR, we found that BPA reduces mRNA expression levels of R-type pore-forming subunit, and this transcriptional effect is produced by BPA at any tested doses, revealing a monotonic relationship at this regulation level. The effect of BPA on calcium entry is mimicked using a specific ERβ agonist (DPN), and abolished in β-cells from ERβ knockout mice. These findings suggest that the functional alterations promoted by low doses of BPA are mediated predominantly by ERβ. Disagreement between BPA-induced effects on calcium entry and transcriptional regulation of R-type calcium channel suggests the participation of a counteracting mechanism regulated by higher BPA doses. We found that high BPA doses (≥ 100 nM) potentiate voltage-gated calcium entry in pancreatic β-cells through extranuclear ERα-mediated PI3K-dependent mechanism. We conclude that the NMDR relationship between BPA exposure and calcium entry seems to be the outcome of the opposite effects mediated by ERβ and ERα on the processes regulating voltage-operated calcium currents in pancreatic β-cells.

[es] El bisfenol-A (BPA) es el componente principal de los plásticos de policarbonato, se usa también como aditivo en la fabricación de muchos otros tipos de plásticos y para la producción de resinas epoxi. La presencia de BPA es generalizada en multitud de productos de consumo, en contacto directo con alimentos y bebidas. El BPA ha sido detectado en la orina del 93% de los ciudadanos estadounidenses. El BPA se ha clasificado como un disruptor endocrino, que actúa como un estrógeno exógeno mediante su unión con los receptores de estrógenos ERα y ERβ. Diversos estudios epidemiológicos han relacionado la exposición a BPA con el desarrollo de ciertas patologías, incluyendo desórdenes metabólicos como la diabetes mellitus y la obesidad. Trabajos realizados durante la última década sugieren que el BPA podría contribuir en la etiología de la diabetes tipo-2, ya que el BPA causa resistencia a la insulina y altera la función de la célula β pancreática en ratones expuestos.Trabajos previos de nuestro grupo han demostrado que el BPA incrementa la expresión del gen de la insulina y que tiene un efecto insulinotrópico rápido al promover la inhibición de la actividad del canal KATP. Ambas respuestas implican la transducción de señales a través de ERα o ERβ, respectivamente, localizados fuera del núcleo. En el presente estudio, hemos estudiado cómo la exposición persistente a BPA puede modular directamente y a largo plazo la función de la célula β pancreática y el islote de Langerhans. Para ello hemos establecido un modelo de exposición in vitro utilizando islotes de Langerhans aislados o células β disgregadas que se han mantenido en presencia de BPA durante 48 horas. La caracterización de las posibles alteraciones debidas al BPA se ha realizado mediante un abordaje multidisciplinar, combinando técnicas electrofisiológicas (actividad eléctrica, corrientes macroscópicas y medidas de la capacidad de membrana), microscopía de fluorescencia con sondas sensibles a calcio, medida de la secreción de insulina y estudio de los cambios en la expresión de ARNm mediante PCR a tiempo real. Los resultados que hemos obtenido muestran que la exposición a BPA provoca cambios muy significativos en el funcionamiento de la célula β pancreática. A una dosis tan baja como 1 nM, el BPA altera la forma del potencial de acción de las células β en respuesta a glucosa, disminuyendo su amplitud y haciéndolo más ancho. A esta dosis de exposición, hallamos que la entrada de calcio, en respuesta a glucosa o estímulos despolarizantes no-metabólicos, estaba disminuida en células β expuestas. Sin embargo, al incrementar la dosis de exposición a 100 nM BPA, los cambios en la entrada de calcio no se detectaron, por lo que la relación entre la dosis de BPA y el efecto que describimos se produce de un modo no monotónico. El fenómeno de la nomonotonicidad aparece frecuentemente en la literatura en relación a los efectos provocados por la exposición a EDCs. Así mismo, la exposición a 1 nM BPA altera muy significativamente la capacidad exocitótica de las células β y su secreción deinsulina. La disección farmacológica de la corriente macroscópica de calcio revela que la reducción particular de la corriente tipo-R era la responsable de este cambio. Empleando PCR a tiempo real, hallamos que la transcripción del canal Cv2.3, que conduce la corriente R, estaba reducida en las células cultivadas en presencia de BPA. Este efecto transcripcional se produjo por igual con independencia de la dosis de BPA empleada, lo que indica una relación monotónica entre la dosis de BPA y su efecto sobre la expresión del canal, a pesar de no observarse un efecto de BPA sobre la entrada de calcio a las dosis más altas que utilizamos. El efecto de una dosis baja de BPA sobre la entrada de calcio en la célula β se reprodujo al emplear un agonista específico de ERβ (DPN), mientras que fueron inexistentes en células β provenientes de ratones ERβ-knockout. Estos resultados parecen indicar que ERβ está implicado en la mediación de las respuestas a dosis bajas de BPA (1 nM). Sin embargo, la discrepancia entre la nomonotonicidad en la entrada de calcio y la monotonicidad en el efecto sobre la expresión del canal tipo-R, sugiere la existencia de otro mecanismo modulado por dosis más altas de BPA que actúa regulando la entrada de calcio de forma opuesta. Nuestros resultados sugieren que la activación de ERα a dosis altas (100 nM y 1 μM) provoca la potenciación de la corriente macroscópica de calcio, y que este mecanismo es dependiente de la activación de la vía de PI3K. El solapamiento de estos efectos opuestos a través de ERβ y ERα tendría como consecuencia la aparición de la nomonotonicidad.