[en] ABSTRACT: Acinetobacter is a genus of Gram-negative bacteria composed by more than 50 validated species. Although most of them are environmental species, in the last years, some species have emerged as important nosocomial pathogens, causing diseases as important as pneumonia or bacteremia. Nowadays, the most important pathogen specie is A. baumannii. However, there are others such as A. pittii or A. nosocomialis that have also acquired clinical importance. The main problems when dealing with the infections caused by these microorganisms are the following. On the one hand, they have a great ability to survive in adverse environments, resisting desiccation conditions and starvation, which increases their persistence in the hospital environment. On the other hand, these bacteria have a great propensity to develop resistance to antibiotics. In fact, World Health Organization (WHO) sited A. baumannii resistant to carbapenems in the top of the list of clinical priority for searching new antibiotics, since strains resistant to all antibiotics used in the clinic have already been found. Although both antibiotic resistance and epidemiology of the A. baumannii species have been widely studied, other key aspects such as virulence factors or interaction with host cells require deeper studies in these species, and remain practically unexplored in others of clinical relevance as A. pittii. Therefore, the objective of the present work was to study the host-pathogen interaction in Acinetobacter spp. of clinical relevance, especially the interaction of these microorganisms with epithelial cells and neutrophils. Concerning epithelial cells, the human adenocarcinoma cell line A549 was used. After several microscopy assays and colony forming units (CFUs) counting studies, it was found that, under the conditions used, the strains did not show adhesion, internalization nor cytotoxicity towards this cell type. In the case of neutrophils, an active phagocytosis with death of the bacteria inside the phagocytes was observed by confocal microscopy and videomicroscopy. On the other hand, after four hours of infection, in some cases, the release of NETs by neutrophils stimulated with Acinetobacter spp. strains was observed. This phenomenon was verified by means of immunofluorescence, and both DNA and NETs proteins quantification, such as neutrophil elastase and citrullinated histone H3. In addition, analyzing the gene expression of neutrophils infected with A. baumannii for two hours, an activation of the cells was verified, since a statistically significant overexpression of several proinflammatory genes that codify proteins such as NFκB, IL-1β o IL-8 was observed. These experiments show that neutrophils are key cells in the control of Acinetobacter infection. All the results obtained in this work regarding Acinetobacter and host cells interactions have allowed to increase the knowledge about pathogenicity mechanisms of these bacteria and organism response to their infection.

[es] RESUMEN: Acinetobacter es un género compuesto por bacterias Gram-negativas del que forman parte más de 50 especies validadas. Aunque la mayoría están presentes en el ambiente, en los últimos años han emergido algunas de ellas como importantes patógenos nosocomiales, causantes de enfermedades intrahospitalarias, tan importantes como neumonías o bacteriemias. La especie patógena más importante hasta la fecha es A. baumannii. Sin embargo, existen otras, como A. pittii o A. nosocomialis, que también han adquirido importancia clínica. Existen dos principales problemas a la hora de enfrentarse a las infecciones causadas por estos microorganismos. Por un lado, tienen una gran capacidad de sobrevivir en ambientes adversos, resistiendo a condiciones de desecación y de ausencia de nutrientes, lo que aumenta su persistencia en el ambiente hospitalario. Por otro lado, estas bacterias cuentan con una gran propensión a desarrollar resistencia a antibióticos. De hecho, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha situado a A. baumannii resistente a carbapenémicos en cabeza de la lista de patógenos con prioridad crítica para la búsqueda de nuevos antibióticos, debido a que ya se han encontrado cepas resistentes a todos los antimicrobianos conocidos. Aunque la resistencia antibiótica y la epidemiología de la especie A. baumannii han sido ampliamente estudiadas, otros aspectos clave como los factores de virulencia o la interacción con células del hospedador precisan estudios más detallados en esta especie y permanecen prácticamente inexplorados en otras de relevancia clínica como A. pittii. Por ello, el objetivo del presente trabajo fue estudiar la interacción hospedador-patógeno (H-P) en especies del género Acinetobacter de relevancia clínica, en especial, la interacción de estos microorganismos con células epiteliales y con neutrófilos. En cuanto a las células epiteliales, se utilizó la línea celular de adenocarcinoma humano A549. Tras diversos ensayos de microscopía y de recuento de unidades formadoras de colonias (UFCs) se encontró que, en las condiciones utilizadas, las cepas no presentaron adherencia, internalización ni citotoxicidad hacia este tipo celular. En el caso de los neutrófilos se observó, por medio de microscopía confocal y videomicroscopía, una fagocitosis activa con muerte de las bacterias en el interior de estos fagocitos. Por otro lado, a partir de las cuatro horas de infección, se produjo, en algunos casos, la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) por parte de neutrófilos estimulados con Acinetobacter spp., fenómeno que fue comprobado mediante inmunofluorescencia, cuantificación del ADN y de proteínas propias de las NETs, como la elastasa de neutrófilos (EN) y la histona H3 citrulinada. Además, al analizar la expresión génica de los neutrófilos infectados con A. baumannii durante dos horas, se comprobó la activación de estas células, al observar una sobreexpresión estadísticamente significativa de varios genes codificantes de proteínas de naturaleza proinflamatoria, como el factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NFκB), la interleucina 1-β (IL-1β) o la interleucina-8 (IL-8). Estos resultados indican que los neutrófilos son un tipo celular clave en el control de la infección por Acinetobacter. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral respecto a la interacción de células del hospedador con Acinetobacter han permitido aumentar el conocimiento acerca de los mecanismos de patogenicidad de estas bacterias y la respuesta del organismo a su infección.