[en] Bee pollen is the second most important product obtained from honeybee hives, and it is also a bioactive resource of excellent nutritional value, with a growing demand in today's society, which seeks to consume natural products. Although there is currently an upward trend in human consumption of bee pollen in developed countries, either as a food supplement or as food in accordance with the legislation of each country, at the moment there is no common criterion in the European Union (EU) for its commercialisation, and in many of the countries that make up the Union, not even a quality standard has been established, leaving a legal vacuum related to the microbiological safety of the product. This situation affects pollen-producing countries such as Spain and Greece, which supply the needs of importing countries such as France, Germany and other northern European countries. Pollen is generally marketed and consumed after undergoing a drying process, with freezing and freeze-drying also being acceptable techniques for preservation. The drying process leads to a depreciation of the organoleptic characteristics compared to fresh pollen, which may even lead to rejection by the consumer. For this reason, there is a growing trend towards marketing as fresh frozen pollen. The problem is that bee pollen for fresh consumption has a high microbiological load, which may include some genera pathogenic to human health. Therefore, if marketing as fresh frozen pollen is proposed, there is a need for treatments and preservation methods to reduce the microbiological load to acceptable levels. Thus, one of the objectives of this thesis is to obtain data to facilitate the establishment of legal criteria for certain microorganisms (mainly aerobic mesophiles, enterobacteria, coliforms, toxigenic staphylococci, moulds and yeasts) to remedy the current situation of legal vacuum and absence of a hygienic standard for bee pollen. In the present work we have approached the problem, marking an experimental route that begins with a first test aimed at determining the microbiological load of the pollen produced in a real situation, similar to what happens in a professional apiary. The data confirmed the high microbiological load of the fresh pollen produced, reaching levels of 107 Colony Forming Units per gram (CFU/g) for enterobacteria and mesophilic aerobic microorganisms and 108 CFU/g for moulds and yeasts. This high load far exceeds the values suggested by some authors as acceptable, such as those proposed by Campos et al. (2008), also confirming with different publications, the high microbiological load of fresh pollen, with the underlying risk for the consumer, even more so if care is not taken in conservation, freezing it immediately and avoiding breaking the cold chain until the moment of consumption. As a consequence of the above data, actions were introduced to reduce the microbiological load in order to guarantee the safety of fresh frozen pollen for human consumption. In this sense, in the second trial, the influence of the use of the pollen trap, which is the device used in the hive for the collection of bee pollen, was studied. Specifically, the box where the pollen released by the bees is deposited and stored until the time of collection by the beekeeper was sterilised. The sterilisation of the pollen trap box failed to reduce the microbiological load of the pollen, obtaining maximum values of 2.4x106±7.1x104 CFU/g for enterobacteria, 1.9x107±1.8x107 CFU/g for mesophilic aerobic microorganisms and 4.3x108±2.8x108 CFU/g for moulds and yeasts. This rules out this tool as the main source of pollen contamination, and assumes that the origin of the high microbiological load could be due to the botanical pollen itself, to the environment, to the bee, to the pollen remaining in the pollen trap until it is collected, or to the handling of the product until a preservation method is applied to it. The third trial addresses other factors that could influence the microbiological contamination of pollen. Specifically, different designs of the pollen traps, different residence times of the pollen in the boxes until collection, or climatic and environmental aspects were evaluated. None of these factors significantly influenced the reduction of the microbiological load. In the fourth trial, ozonisation of pollen was proposed as a shock method to reduce the microbiological load of bee pollen. For this purpose, the effectiveness of ozonisation and drying treatments, separately and at different times, as well as ozonisation combined with drying, were compared. A combined method with 30 minutes of ozonisation followed by a drying period of 15 minutes was selected. The results showed a reduction of the microbiological load of 2 logarithmic cycles for enterobacteria and mesophilic aerobes and 3 logarithmic cycles for moulds and yeasts. Therefore, through the combined method the initial microbiological load of enterobacteria was reduced from 6.0x106±1.4x107 CFU/g to 1.0x104 ±3.5x104 CFU/g, from 1.1x106 ±3.5x106 CFU/g in the initial content of mesophilic aerobic microorganisms to 1.4x104 ±2.7x104 CFU/g, and from 2.4x108 ±6.6x108 CFU/g in the initial content of moulds andyeasts at 6.5x105 ±1.2x106CFU/g. Once the optimal shock method to reduce the initial microbiological load had been defined, the possibility of keeping the pollen fresh in refrigeration (4°C) was considered, so the shelf life of pollen treated with this method and kept under refrigerated conditions was evaluated. The results showed that the microbiological values achieved after the initial treatment were maintained for up to three weeks. After this last period, the load of enterobacteria reached values of 3.6x104±6.3x104 CFU/g, for mesophilic aerobic microorganisms the values were 5.9x104±1.3x105 CFU/g, and for yeasts and moulds the microbiological load was 8.4x106± 1.9x107 CFU/g. These values increased gradually, although slowly, until the sixth week, with the final load of enterobacteria at 2.4x105±5.9x105 CFU/g, for mesophilic aerobic microorganisms at 9.6x104±1.4x105 CFU/g, and for yeasts and moulds at 1.1x107± 2.1x107 CFU/g. In this study, since ozone causes oxidation, and could affect important bioactive components of pollen, such as flavonoids (caffeic acid, chrysin, kaempferol, luteolin, naringerin, p-coumaric acid, quercetin, rutin), the possible effects of ozone treatment on this group of polyphenols present in the pollen were evaluated. The results show that the ozonisation treatment applied does not reduce the polyphenol content of fresh pollen. Finally, the results of the sensory analysis reveal, through the descriptive profile, that ozone does not influence the sensory attributes of bee pollen at the dose and exposure time used, compared to the single treatment by hot air drying at 42°C, which does have an influence by modifying these attributes as a function of exposure time. In conclusion, ozonisation combined with a drying treatment (30 minutes/15 minutes) could increase the shelf life of fresh pollen under refrigeration and reduce the microbiological load prior to frozen storage, guaranteeing the food safety of this product, maintaining its polyphenol content as bioactive components and ensuring the descriptive sensory profile of the fresh pollen.

[es] El polen apícola constituye el segundo producto en importancia obtenido de las colmenas de abejas melíferas, y además un recurso bioactivo de excelente valor nutricional, con una demanda creciente en una sociedad como la actual que busca el consumo de productos naturales. Aunque actualmente el polen de abeja tiene una tendencia alcista en su consumo humano en los países desarrollados, bien como suplemento alimenticio o bien como alimento de acuerdo con la legislación de cada país, en este momento no existe un criterio común en la Unión Europea (UE) para su comercialización, y en muchos de los países que componen la Unión, ni siquiera está establecida una norma de calidad, existiendo un vacío legal relacionado con la seguridad microbiológica del producto. Esta situación afecta a países productores de polen como España y Grecia, que abastecen las necesidades de países importadores como Francia, Alemania y otros del norte europeo. El polen generalmente se comercializa y se consume después de someterlo a un proceso de desecación, siendo también la congelación y la liofilización técnicas aceptables para su conservación. El proceso de desecación conlleva una depreciación en las características organolépticas con respecto al polen fresco, que provocan incluso un rechazo por parte del consumidor. Por ello, existe una tendencia creciente a la comercialización como polen fresco congelado. El problema radica en que el polen de abeja para su consumo en fresco posee una alta carga microbiológica, que puede incluir algunos géneros patógenos para la salud humana. Por lo que, si se propone la comercialización como polen fresco congelado, impera la necesidad de aplicar tratamientos y métodos de conservación que reduzcan la carga microbiológica hasta niveles aceptables. Así, uno de los objetivos de esta tesis es conseguir datos que faciliten el establecimiento de criterios legales para determinados microorganismos (aerobios mesófilos, enterobacterias, coliformes, estafilococos toxigénicos, mohos y levaduras, principalmente) que subsanen la situación actual de vacío legal y ausencia de una norma higiénica para el polen apícola. En el presente trabajo hemos abordado el problema, marcando una ruta experimental que comienza con un primer ensayo destinado a la determinación de la carga microbiológica del polen producido en una situación real, similar a lo que acontece en un apiario profesional. Los datos confirmaron la alta carga microbiológica del polen fresco producido, llegando a niveles de 107Unidades Formadoras de Colonias por gramo (UFC/g) para enterobacterias y microorganismos aerobios mesófilos y 108UFC/g para mohos y levaduras. Esta elevada carga supera ampliamente los valores sugeridos por algunos autores como aceptables, como por ejemplo los propuestos por Campos et al. (2008), confirmando también con distintas publicaciones, la alta carga microbiológica del polen fresco, con el subyacente riesgo para el consumidor, más aún si no se extreman los cuidados en la conservación, congelándolo inmediatamente y evitando la ruptura de la cadena de frío hasta el momento del consumo. Como consecuencia de los anteriores datos, se introdujeron actuaciones que pudieran reducir la carga microbiológica, con el fin de garantizar la inocuidad para el consumo humano del polen fresco congelado. En este sentido, en el segundo ensayo se estudió la influencia del uso de la trampa cazapolen, que es el dispositivo usado en la colmena para la recolección del polen apícola. Concretamente, se esterilizó el cajón donde se deposita y almacena el polen que se desprende de las abejas hasta el momento de la recolección por parte del apicultor. La esterilización del cajón de la trampa cazapolen no consiguió reducir la carga microbiológica del polen, obteniendo valores máximos de 2,4x106±7,1x104 UFC/g para enterobacterias 1,9x107±1,8x107 UFC/g para microorganismos aerobios mesófilos y 4,3x108±2,8x108 UFC/g para mohos y levaduras, lo que descarta este utensilio como origen principal de la contaminación del polen, y presupone que el origen de la elevada carga microbiológica podría deberse al propio polen botánico, al entorno, a la abeja, a la permanencia del polen en la trampa cazapolen hasta su recogida, o al manejo del producto hasta que se le aplica un método de conservación. En el tercer ensayo se abordan otros factores que pudieran influir sobre la contaminación microbiológica del polen. En concreto, se evaluaron distintos diseños de las trampas cazapolen, diferentes tiempos de permanencia del polen en los cajones hasta la recolección, o aspectos climatológicos y ambientales. Ninguno de estos factores influyó significativamente en la reducción de la carga microbiológica. Se propone en el cuarto ensayo la ozonización del polen como método de choque para reducir la carga microbiológica del polen apícola. Para ello se comparó la eficacia de tratamientos de ozonización y desecación, por separado y a diferentes tiempos, al igual que la ozonización combinada con el secado. De esta manera se seleccionó un método combinado con 30 minutos de ozonización, seguido de un periodo de desecación de 15 minutos. Los resultados mostraron una reducción de la carga microbiológica de 2 ciclos logarítmicos para enterobacterias y microorganismos aerobios mesófilos y 3 ciclos logarítmicos para mohos y levaduras. Por tanto, a través del método combinado se redujo la carga microbiológica inicial de enterobacterias de 6,0x106±1,4x107UFC/g a 1,0x104 ±3,5x104 UFC/g, de 1,1x106 ±3,5x106 UFC/g en el contenido inicial de microorganismos aerobios mesófilos a 1,4x104 ±2,7x104 UFC/g, y de 2,4x108 ±6,6x108 UFC/g en el contenido inicial de mohos y levaduras a 6,5x105 ±1,2x106UFC/g. Ya definido un método de choque adecuado para reducir la carga microbiológica inicial, se planteó la posibilidad de conservar el polen fresco en frigorífico (4oC), por lo que se evaluó la vida útil del polen tratado con este método y conservado en condiciones de refrigeración. Los resultados mostraron que los valores microbiológicos conseguidos tras el tratamiento inicial se mantuvieron hasta tres semanas. Trascurrido este último periodo, la carga de enterobacterias adquirió valores de 3,6x104±6,3x104UFC/g, para microorganismos aerobios mesófilos los valores se situaron en 5,9x104±1,3x105 UFC/g, y para levaduras y mohos la carga microbiológica se situó en 8,4x106±1,9x107 UFC/g. Estos valores experimentaron un incremento paulatino, aunque lento, hasta la sexta semana, situándose la carga final de enterobacterias en 2,4x105±5,9x105 UFC/g, para microorganismos aerobios mesófilos de 9,6x104± 1,4x105 UFC/g, y para levaduras y mohos de 1,1x107± 2,1x107 UFC/g. En este estudio, toda vez que el ozono provoca oxidación, y podría afectar a componentes bioactivos importantes del polen, como los flavonoides (ácido cafeico, crisina, caempferol, luteolina, naringerina, ácidp p-cumárico, quercetina, rutina) se evaluaron los posibles efectos del tratamiento con ozono sobre este grupo de polifenoles presentes en el polen. Los resultados evidencian que el tratamiento de ozonización/desecación aplicado no reduce el contenido en polifenoles del polen fresco. Finalmente, los resultados del análisis sensorial revelan, a través del perfil descriptivo, que el ozono no influye en los atributos sensoriales del polen apícola a la dosis y tiempo de exposición empleados, frente al tratamiento único por desecación por aire caliente a 42 °C, que sí influye modificando dichos atributos en función del tiempo de exposición. Como conclusión podemos decir que la ozonización combinada con un tratamiento de desecación (30minutos/15 minutos) podría aumentar la vida útil del polen fresco en refrigeración y disminuir la carga microbiológica previa a su conservación en congelación, garantizando la seguridad alimentaria de este producto, manteniendo su contenido en polifenoles como componentes bioactivos y asegurando el perfil descriptivo sensorial del polen fresco.