[en] Nanopharmaceuticals can overcome the limitations of conventional drugs, offering enhanced clinical and socio-economic benefits. Nanopharmaceuticals can be of two types: i) those where the therapeutic molecules are themselves the drug; ii) those where the therapeutic molecules are directly coupled to a nanocarrier. Nanocarriers as drug delivery systems offer many advantages thanks to their size and tuneability; these can be designed to modify the half-life of compounds, alter their biodistribution and control the drug release profile, eventually providing an overall clinical benefit to patients. However, the translation of nanopharmaceuticals from lab bench to an advanced stage of pharmaceutical development faces significant challenges. Among others, the high-quality that these novel nanoformulations must meet for the preclinical (and further clinical) testing is a major challenge due to their complex multicomponent nature. Herein, an advanced characterization effort was carried out to guarantee and control the quality of a novel, under development, nanoliposomal formulation for Fabry disease treatment. Fabry disease is an X-linked rare disease belonging to the lysosomal storage disorders group in which the lack/deficiency of [Alfa]-galactosidase (GLA) enzyme causes the lysosomal accumulation of neutral glycosphingolipids, resulting in a multisystemic pathology and the premature death. Enzyme replacement therapy (ERT) through the intravenous administration of the missing enzyme is the main treatment option for Fabry patients. However, ERT shows potential limitations such as poor biodistribution, poor capacity to cross biological membranes, high immunogenicity, and limited efficacy. The use of nanocarriers capable to encapsulate proteins is currently being explored and exploited as an alternative strategy to overcome the handicaps of the traditional ERTs. RGD-targeted nanoliposomes entrapping the GLA enzyme and prepared by the green-scalable DELOS-susp methodology yielded a patented product more effective at preclinical level than traditional marketed ERTs. This significant benefit was recognized by the EMA by means of the Orphan Drug Designation. In order to support the development of this nanoformulation to become a potential intravenous drug product candidate, further understanding and control of the molecular and supramolecular interaction between the liposomal nanocarrier and the GLA enzyme is required. Four recombinant GLA enzymes differing in purification tags and expression systems were explored in this thesis, using human embryonic kidney (HEK) or Chinese hamster ovary (CHO) mammalian expression systems, in order to investigate which GLA properties are the most favorable to generate stable, efficient and robust liposome-based nanoconjugates for Fabry therapy. The use of GLA protein without purification tags and expressed in CHO cells demonstrated to be the most promising drug substance candidate to obtain GLA-loaded liposomes with higher protein entrapment efficiency and increased enzymatic activity. Moreover, due to the complexity of these nanoliposomes, small changes in their composition, media, concentration or pharmaceutical form can severely impact on their in vivo performance, safety and efficiency profile. A suitable characterization and control of the critical quality attributes (CQAs) to ensure the desired product quality is crucial prior the cGMP production batch to entry the clinical phase. To address this issue, in this thesis advanced methodologies were developed, optimized and/or validated to characterize and/or control the following CQAs, taking into account the regulatory compliance requirements: i) the chemical membrane composition of the nanoliposomal formulations; ii) the microbiological contamination and bacteria endotoxin content; iii) the GLA release kinetics profile and the GLA leakage rate from the nanoliposomes throughout shelf-life; iv) the potential degradation products from nanoliposomal components; and v) the targeting ligand integration in the nanoliposomal membrane. In summary, the results achieved in this thesis are an important contribution to advance in the CMC development of the GLA-loaded nanoliposomal formulation for Fabry disease treatment.

[es] Los nanofármacos pueden superar las limitaciones de los fármacos convencionales, ofreciendo mejores beneficios clínicos y socio-económicos. Pueden ser de dos tipos: i) aquellos en los que las propias moléculas terapéuticas actúan como fármaco; ii) aquellos en los que las moléculas terapéuticas están directamente acopladas a nanoestructuras. Utilizar nanoestructuras como sistemas de liberación de fármacos ofrece una serie de ventajas gracias a su tamaño y tuneabilidad, ya que se pueden diseñar para modificar la semivida de los activos, alterar su biodistribución y controlar el perfil de liberación de los mismos, traduciéndose en un beneficio global para el paciente. Sin embargo, la traslación de nanofármacos hacia fases avanzadas de desarrollo farmacéutico enfrenta grandes desafíos, como la alta calidad requerida de estos para ser evaluados en pruebas preclínicas (y clínicas posteriormente) teniendo en cuenta su compleja naturaleza multicomponente. En este trabajo se ha realizado una caracterización avanzada para controlar la calidad de una nueva formulación nanoliposomal en desarrollo para el tratamiento de la enfermedad de Fabry. Fabry es una enfermedad rara perteneciente al grupo de trastornos de almacenamiento lisosomal donde la falta/deficiencia de la enzima [Alfa]-galactosidasa (GLA) provoca la acumulación lisosomal de glicoesfingolípidos, ocasionando una patología multisistémica y la muerte prematura. La terapia de reemplazo enzimático (TRE) mediante la administración intravenosa de GLA es la principal opción de tratamiento para los enfermos de Fabry. No obstante, la TRE muestra una serie de limitaciones: mala biodistribución, alta inmunogenicidad y eficacia limitada. Actualmente se está explorando el uso de nanotranspotadores capaces de encapsular proteínas como estrategia alternativa para superar dichas limitaciones. Nanoliposomas funcionalizados con RGD, cargados con GLA y preparados mediante la metodología verde y escalable DELOS-susp han dado lugar a un producto patentado más eficaz a nivel preclínico que las tradicionales TRE comercializadas. Dicho beneficio ha sido reconocido por la EMA mediante la designación de medicamento huérfano. Sin embargo, para convertir esta nanoformulación en un potencial candidato a producto farmacéutico, se necesita una mayor comprensión y control sobre la interacción molecular y supramolecular del liposoma (nanoestructura) y la GLA (biomolécula). En esta tesis se han explorado cuatro enzimas GLA recombinantes, que difieren en la expresión de etiquetas de purificación y en los sistemas de expresión empleados para su producción (células de mamíferos de riñón embrionario humano (HEK) o de ovario de hámster chino (CHO)), para investigar qué propiedades son más favorables para generar nanoconjugados GLA-liposoma estables y eficientes como terapia de Fabry. La enzima GLA expresada en células CHO y sin etiquetas de purificación demostró ser el candidato más prometedor como molécula terapéutica para obtener nanoconjugados GLA-liposoma con mayor eficiencia de encapsulación de la enzima y actividad enzimática. Por otro lado, la complejidad de estos nanoliposomas comporta que pequeños cambios en su composición, medio, concentración o forma farmacéutica puedan afectar severamente a su rendimiento, seguridad y eficiencia in vivo. Por ello, es crucial conseguir un adecuado control de los atributos críticos de calidad (ACC) para garantizar la calidad deseada del producto. Para abordar este objetivo, en esta tesis se han desarrollado, optimizado y/o validado diversas metodologías para controlar los siguientes ACC, teniendo en cuenta los requerimientos regulatorios: i) la composición química de la membrana liposomal, ii) la calidad microbiológica y el contenido de endotoxinas, iii) el perfil cinético de liberación de la GLA y la tasa de pérdida de la enzima encapsulada durante el almacenaje, iv) los productos de degradación de los componentes nanoliposomales, y v) la presencia de RGD en la membrana de los nanoliposomas. En resumen, los resultados alcanzados en esta tesis representan una contribución importante para avanzar en el desarrollo preclínico de esta nanoformulación para el tratamiento de Fabry.