[en] Cancer is a complex disease caused by genetic alterations in proto-oncogenes and/or tumor suppressors. The proto-oncogene PI3K is altered in many cancers. Class I PI3K kinases are formed by both a catalytic (p110) and a regulatory subunit (p85), that catalyze the conversion of PtdIns(4,5)P2 into PtdIns-3,4,5P3 at the plasma membrane. The latter is a second messenger that recruits the Ser/Thr protein kinase AKT, which activates a large number of downstream effectors and triggers cell survival and cell proliferation. Mutations that cause hyperactivation of this route lead to transformation of normal cells into tumor cells. The negative regulator of this pathway, the phosphatase PTEN, dephosphorylates PtdIns(3,4,5P)3 giving rise to PtdIns-4,5P2, counteracting PI3K effects. We have generated a humanized yeast system by expressing the main elements of this pathway in the model organism Saccharomyces cerevisiae, which naturally lacks signaling through PtdIns (3,4,5) P3. In the present study we have determined that, among all p110 isoforms, only artificially plasma membrane-directed forms, p110α-CAAX and p110β-CAAX, lead to the inhibition of yeast growth due to the depletion of essential pools of PtdIns-4,5P2. In this model, we demonstrated that the ABD domain (binding domain for the regulatory subunit) of p110α and p110β, is dispensable for its lipid kinase activity in vivo, while the integrity of the C2 domain (membrane-binding domain) is necessary. This heterologous system is also useful for study the regulation exerted by the regulatory subunits of PI3K on the catalytic subunits. Our work showed a moderate activating effect of truncated versions of p85α and p85β regulatory subunits (p65α and p65β) on the p110β-CAAX catalytic subunit. Besides, we observed a p85α inhibitory activity over N-myristoylated p110α version, Myr-p110α. Expression of p85α-CAAX inhibits Myr-p110 and p110β-CAAX activity, but it does not affect hyperactive versions, like the oncogenic mutant p110α H1047R or a plasma membrane directed form, p110α-CAAX. Instead, p65α-CAAX exerts an activator effect on p110α, p110β and p110δ, but not p110γ. This positive effect requires interaction with ABD domain of p110 but is independent of the presence of oncogenic mutations in the helical and kinase domains of p110. The activator effect of p65α-CAAX on p110 is due to PI3K kinase activity, as evidenced by the fact that PTEN reverses its toxic effect in yeast. Furthermore, expression of a series of mutations in p85α found in tumors, in the yeast model proved useful to elucidate the mechanism involved in hyperactivation of the catalytic subunit, providing a platform for functional analyses of mutations found in the clinics. Finally, in mammalian cells, we found that over-expression of p65α differs from p85α and the rest of regulatory subunits with respect to their subcellular localization: p65α accumulates in the periphery of abnormally large cytoplasmic membranous compartments that display markers of early endosomes. This suggests that the C-terminal region absent in p65α, is important for the proper control exerted by p85α over vesicular trafficking processes in the cell.

[es] El cáncer es una enfermedad compleja originada por alteraciones genéticas en proto-oncogenes y/o supresores tumorales. El proto-oncogén PI3K se encuentra alterado en numerosos cánceres. La PI3K de clase I son quinasas, formadas por una subunidad catalítica (p110) y una reguladora (p85), que catalizan la conversión de PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(3,4,5)P3 en las membranas celulares. Este último es un segundo mensajero que recluta a la quinasa de Ser/Thr AKT, la cual activa a numerosos efectores y desencadena una respuesta proliferativa y de supervivencia celular, por lo que mutaciones que causen la hiperactivación de esta ruta conllevan la transformación de células normales en células tumorales. El supresor tumoral PTEN es el regulador negativo de esta ruta ya que desfosforila el PtdIns(3,4,5)P3 a PtdIns(4,5)P2, contrarrestando la acción de la PI3K. Hemos generado un modelo heterólogo de la levadura Saccharomyces cerevisiae que expresa los principales elementos de la ruta PI3K/AKT de mamíferos, ya que este organismo carece de la señalización a través de PtdIns(3,4,5)P3. En el presente estudio hemos determinado que, entre las diversas isoformas de la subunidad catalítica de PI3K, solo p110α y p110β son lo suficientemente activas per se para eliminar el PtdIns(4,5)P2, que es esencial para la viabilidad de la levadura, cuando son artificialmente dirigidas a la membrana plasmática mediante prenilación (p110α-CAAX y p110β-CAAX). En este modelo, demostramos que el dominio ABD (dominio de unión a la subunidad reguladora) de ambas p110 es prescindible para su actividad quinasa de lípidos, mientras que la integridad del dominio C2 (dominio de unión a membranas) es necesaria. Este sistema heterólogo también nos permite estudiar la regulación que ejercen las subunidades reguladoras de la PI3K sobre las catalíticas. Así, hemos observado el efecto activador que las versiones truncadas de las subunidades reguladoras p85α y p85β (p65α y p65β) ejercen sobre la subunidad catalítica p110β-CAAX, así como la función inhibidora de p85α sobre p110α, lo que se observa sobre una versión miristoilada de esta última. La expresión de p85α-CAAX inhibe la actividad de p110β-CAAX y p110α miristoilado, pero no contrarresta el efecto activador por reclutamiento a la membrana de p110α prenilado, ni de la mutación oncogénica H1047R en p110α. Al contrario, p65α-CAAX ejerce un efecto activador sobre p110α, p110β y p110δ, pero no sobre p110γ. Este efecto activador requiere de la interacción de p65α con el domino ABD de p110α mientras que es independiente de la presencia de mutaciones oncogénicas en los dominios helical y quinasa en la misma p110. Además, el efecto activador producido por p65α-CAAX sobre p110α es debido a la actividad quinasa de la PI3K, ya que PTEN revierte su efecto tóxico en la levadura. Por otra parte, la expresión de una serie de mutaciones en p85α, encontradas en tumores, en el modelo de levadura resulta útil para elucidar si el mecanismo por el cual causan la hiperactivación de la subunidad catalítica es análogo al de p65α o divergente, ofreciendo una plataforma para el análisis funcional de mutaciones halladas en la clínica. Por último, en células de mamífero, hemos observado que la sobre-expresión de p65α difiere de la de p85α y de la del resto de subunidades reguladoras en lo referente a su localización subcelular: p65α se acumula en la periferia de endosomas tempranos anormalmente grandes. Esto sugiere que las regiones ausentes en el extremo C-terminal de esta versión truncada son importantes para el control ejercido por p85α sobre procesos de tráfico vesicular.