[ca] La present tesi doctoral es centra en la caracterització de sistemes d'expressió utilitzats per a la producció de proteïnes recombinants (RPP) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris. Al llarg de tot aquest treball s'integren els resultats de diferents camps -enginyeria de bioprocessos i regulació génica- per tal d'ampliar la informació sobre els sistemes d'expressió analitzats i, així, reduir la incertesa a l'dissenyar un bioprocés RPP. En el primer capítol de la tesi, s'estudia el sistema clàssic d'expressió basat en el PAOX1. En un primer pas, es van cultivar en quimiòstat dos clons productors de la Lipasa 1 de Candida rugosa (Cr1l) amb diferent dosi gènica. D'aquesta manera, es va determinar la interrelació de tres factors importants en els bioprocessos RPP com ara la velocitat específica de creixement (μ), els nivells d'expressió relativa de el gen heteròleg (RTL) i la velocitat específica de generació de producte (qp) . A més, també es va monitoritzar l'expressió d'un factor de transcripció important per a la via d'utilització de metanol (MIT1). Un cop establertes les condicions òptimes d'operació en continu, es van dur a terme cultius en fed-batch per validar i comparar el comportament dels clons productors observat, tant des del punt de vista del seu estat fisiològic com de la cinètica de producció de Crl1 . Els inconvenients de l'ús de el potent sistema d'expressió basat en PAOX1-principalment derivat de l'ús de l'metanol com a font de carboni, font d'electrons i inductor de RPP- han portat a la comunitat de Pichia a investigar i desenvolupar sistemes d'expressió alternatius que no depenguin de l'addició de metanol. A causa d'això, en el segon capítol de la tesi, es van caracteritzar dos nous sistemes d'expressió, basats en el PPDF i PUPP, per determinar si poden competir amb l'àmpliament utilitzat PGAP en la producció de la Lipasa B de Candida antarctica (Calb) . El comportament dels tres sistemes d'expressió es va comparar, en primer lloc, en quimiòstat. Això va permetre obtenir informació sobre la influència de la μ i l'expressió de Calb en la cinètica de producció de la proteïna. A més, els clons productors de la proteïna recombinant sota els nous sistemes d'expressió es van cultivar a fed-batch, en les condicions òptimes observades prèviament, per tal de provar la potencial escalabilitat del bioprocés. En l'últim capítol de la tesi es va optimitzar, utilitzant cèl·lules senceres de P. pastoris (whole cells), la producció del citrocromo P450 2C9 humà (CYP2C9). La coexpressió d'aquest enzim d'interès industrial al costat del domini donador d'electrons (cytochrome P450 reductase, CPR) es va realitzar mitjançant un nou sistema de promotors bidireccionals. Després d'una fase de screening en la qual es van provar fins a 8 promotors per a la producció de CYP2C9 / CPR, es va seleccionar la combinació que va proporcionar la major activitat oxidasa, i es van realitzar una sèrie de cultius per optimitzar el bioprocés. D'aquesta manera, es va determinar la influència de paràmetres importants de l'bioprocés -μ, pH i estratègia d'addició de metanol en la producció de biocatalizador. Finalment, l'eficiència de l'biocatalizador obtingut es va testar en la reacció de hidroxilació de l'ibuprofèn.

[es] La presente tesis doctoral se centra en la caracterización de sistemas de expresión utilizados para la producción de proteínas recombinantes (RPP) en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. A lo largo de todo este trabajo se integran los resultados de diferentes campos -ingeniería de bioprocesos y regulación génica- con el fin de ampliar la información sobre los sistemas de expresión analizados y, así, reducir la incertidumbre al diseñar un bioproceso RPP. En el primer capítulo de la tesis, se estudia el sistema clásico de expresión basado en el PAOX1. En un primer paso, se cultivaron en quimiostato dos clones productores de la Lipasa 1 de Candida rugosa (Cr1l) con diferente dosis génica. De esta manera, se determinó la interrelación de tres factores importantes en los bioprocesos de RPP tales como la velocidad específica de crecimiento (µ), los niveles de expresión relativa del gen heterólogo (RTL) y la velocidad específica de generación de producto (qp). Además, también se monitorizó la expresión de un factor de transcripción importante para la vía de utilización del metanol (MIT1). Una vez establecidas las condiciones óptimas de operación en continuo, se llevaron a cabo cultivos en fed-batch para validar y comparar el comportamiento de los clones productores observado, tanto desde el punto de vista de su estado fisiológico como de la cinética de producción de Crl1. Los inconvenientes del uso del potente sistema de expresión basado en PAOX1-principalmente derivado del uso del metanol como fuente de carbono, fuente de electrones e inductor de RPP- han llevado a la comunidad de Pichia a investigar y desarrollar sistemas de expresión alternativos que no dependan de la adición de metanol. Debido a ello, en el segundo capítulo de la tesis, se caracterizaron dos nuevos sistemas de expresión, basados en el PPDF y PUPP, para determinar si pueden competir con el ampliamente utilizado PGAP en la producción de la Lipasa B de Candida antarctica (CalB). El comportamiento de los tres sistemas de expresión se comparó, en primer lugar, en quimiostato. Esto permitió obtener información sobre la influencia de la µ y la expresión de CALB en la cinética de producción de la proteína. Además, los clones productores de la proteína recombinante bajo los nuevos sistemas de expresión se cultivaron en fed-batch, en las condiciones óptimas observadas previamente, con el fin de probar la potencial escalabilidad del bioproceso. En el último capítulo de la tesis se optimizó, utilizando células enteras de P. pastoris (whole cells), la producción del citrocromo P450 2C9 humano (CYP2C9). La coexpresión de esta enzima de interés industrial junto al dominio donador de electrones (cytochrome P450 reductase, CPR) se realizó mediante un novedoso sistema de promotores bidireccionales. Después de una fase de screening en la que se probaron hasta 8 promotores para la producción de CYP2C9/CPR, se seleccionó la combinación que proporcionó la mayor actividad oxidasa, y se realizaron una serie de cultivos para optimizar el bioproceso. De este modo, se determinó la influencia de parámetros importantes del bioproceso -µ, pH y estrategia de adición de metanol- en la producción de biocatalizador. Finalmente, la eficiencia del biocatalizador obtenido se testó en la reacción de hidroxilación del ibuprofeno.