[en] In the Central Nervis System (CNS ) astrocytes are communicated through gap junctions , forming a cooperative network that maintains ionic , metabolic and functional homeostasis. Intercellular communication is essential for controlling , among other processes such as proliferation , differentiation of the cells and the passage of molecules such as glucose. Previous work in our laboratory showed that inhibition of gap junctions of astrocytes in culture caused an increase in proliferation and glucose uptake. Therefore, the overall objective of the thesis project , to study the possible clinical relevance of the relationship of connexin -43 and c- Src.

[es] En el Sistema Nerviso Central (SNC) los astrocitos se encuentran comunicados a trav?s de las uniones comunicantes, formando una red cooperativa que mantiene la homeostasis i?nica, metab?lica y funcional. La comunicaci?n intercelular es fundamental para controlar, entre otros, procesos como la proliferaci?n, la diferenciaci?n de las c?lulas y el paso de mol?culas como la glucosa. Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio mostraron que la inhibici?n de las uniones comunicantes de los astrocitos en cultivo provocaba un aumento de la proliferaci?n y de la captaci?n de glucosa. Por otro lado, se ha observado en los gliomas, los tumores m?s frecuentes del SNC derivados de astrocitos, que los niveles de comunicaci?n intercelular y la expresi?n de la conexina-43 (Cx43), la prote?na que forma las uniones comunicantes en los astrocitos, son muy bajos y se correlacionan inversamente con el grado de malignidad. Asimismo, se ha observado en c?lulas altamente proliferativas que, tanto la introducci?n directa del gen de la Cx43, como la estimulaci?n farmacol?gica de la permeabilidad de las uniones comunicantes reducen la proliferaci?n. Por todo ello, se considera a la Cx43 una prote?na supresora de tumores. En nuestro laboratorio se ha propuesto que c-Src, una tirosina kinasa que interacciona con la Cx43, participa en el aumento de la captaci?n de glucosa y de la proliferaci?n en astrocitos. Por otro lado, esta tirosina kinasa presenta una actividad muy elevada en gliomas , que se reduce con la restauraci?n de la Cx43, al menos en las c?lulas C6 de glioma de rata . Adem?s, estudios muy recientes muestran que los niveles de expresi?n de la Cx43 en las c?lulas madre de glioma (GSC) son muy bajos y la restauraci?n de Cx43 revierte el fenotipo tumoral de estas c?lulas. A pesar de la importancia terap?utica de este efecto, los mecanismos moleculares que relacionan la Cx43 con la proliferaci?n en las GSC no est?n todav?a claros. Por todo ello, el objetivo general del proyecto de Tesis Doctoral, estudiar la posible relevancia cl?nica de la relaci?n de la conexina-43 y c-Src. Para ello se plantearon diferentes objetivos, los cuales se detallan a continuaci?n. 1- Estudio de la relaci?n de la Cx43 con c-Src en astrocitos in vivo. Para realizar este objetivo realice una estancia predoctoral en el Coll?ge de France, Paris (Francia). Mediante un modelo de lesi?n neuronal por excitotoxicidad observamos que los astrocitos reactivos se produce una bajada de Cx43 y un aumento en la actividad de c-Src. 2- Estudio de la relaci?n de la conexina-43 con c-Src en c?lulas de glioma humano, incluyendo las c?lulas madre de glioma. Se analizaron tanto muestras de gliomas humanos concretamente las l?neas celulares: HTB 138 (glioma humano, grado II), HTB12 (astrocitoma, grado III), T98G (glioblastoma multiforme, grado IV), U373 (astrocitoma-glioblastoma, grado III). Tambi?n se analizaron c?lulas madre de tumores de pacientes OB1 y TG10. En estas muestras se encontraron unos bajos niveles de Cx43 y una alta actividad de onocg?n c-Src. 3- Estudio del efecto de la Cx43 en la modulaci?n de la actividad de c-Src y la proliferaci?n en c?lulas madre de glioma. Para realizar este objetivo se puso a punto tanto el silenciamiento mediante siRNAs como la electroporaci?n en GSC. Se utilizaron c?lulas denominadas G166, G179, GliNS2 y G144. Para realizar este objetivo se utlizaron dos estrateg?as: - P?rdida de funci?n. Silenciamiento de la Cx43 mediante siRNA en la l?nea de GSC G166. Cuando se silencia la Cx43 aumenta la actividad de c-Src y aumenta la proliferaci?n en estas c?lulas. - Ganancia de funci?n. Restauraci?n de los niveles de Cx43 en la l?nea de GSC GliNS2. Se realiz? mediante la t?cnica de electroporaci?n, t?cnica que pusimos a punto durante este trabajo. Cuando se restauran los niveles de Cx43 disminuye la actividad de oncog?n c-Src y disminuye la proliferaci?n de est?s c?lulas. 4- Estudio de los cambios en el fenotipo de c?lula madre de glioma tras la restauraci?n de la conexina-43. Como hemos mencionado los gliomas est?n compuestos de una poblaci?n heterog?nea de c?lulas. Algunas de ellas con caracter?sticas de c?lulas madre. Muchos autores sugieren que este fenotipo de c?lula madre es reversible, siendo un punto cr?tico para la b?squeda de una nueva estrategia terap?utica. Investigamos en este objetivo la posible participaci?n de la Cx43 en la reversi?n del fenotipo de c?lula madre. La restauraci?n de Cx43 en GSC, provoca una disminuci?n de Sox2, es un factor de trasncripci?n relacionado con la autorrenovaci?n de las c?lulas madre. Al restaurar la Cx43 se produce un cambio de cadherinas, hay una ganacia de E-cadherina y una p?rdida de N-cadherina. Por lo tanto las c?lulas con Cx43 disminuye la autorrenovaci?n y pierden marcadores met?staticos. Adem?s al restaurar la Cx43 tambi?n disminuye Id1, un inhibidor de la diferenciaci?n que juga un papel cr?tico, modulando la invasividad en c?lulas de glioma. 5-Estudio de la participaci?n de c-Src en el efecto de la Cx43 en la reversi?n del fenotipo de c?lula madre de glioma. Id1 esta regulado por la actividad de c-Src en diferentes tipos de tumores. La inhibici?n de la actividad de c-Src disminuye la expresi?n de Id1, Sox2 y se produce el cambio de cadherinas. Una vez conocido el efecto de la inhibici?n de c-Src sobre el fenotipo de las GSC, quismos confimar la particpaci?n de c-Src en el efecto de la Cx43 sobre el cambio de fenotipo de c?lula madre. Para ello, dise?amos un p?ptido penetrante incluye la secuencia del carboxilo terminal de la Cx43, que contiene el dominio de uni?n a c-Src y las dos tironsa que fosforila esta kinasa. Nuestros resultados muestran que este p?ptido entra en las GSC y disminuye la expresi?n de Id1, N-cadherina y Sox2 mientras que aumenta la expresi?n de E-cadherina. Como conclusi?n final de este trabajo podemos resumir que: La conexina-43 es una prote?na especializada en la comunicaci?n intercelular que, adem?s de formar canales intercelulares, posee un extremo carboxilo terminal con el que interacciona con diversas prote?nas se?alizadoras. En este sentido, nuestros resultados confirman la relevancia de la relaci?n del extremo carboxilo terminal de la Cx43 con la tirosina kinasa c-Src en astrocitos y c?lulas de glioma, incluidas las c?lulas madre de glioma. As?, c-Src es responsable de la reversi?n del fenotipo de c?lula madre de glioma que ocasiona la restauraci?n de la Cx43 en estas c?lulas. La determinaci?n de este mecanismo nos ha permitido dise?ar un p?ptido penetrante con capacidad de revertir el fenotipo tumorig?nico de las c?lulas madre de glioma humano. Puesto que la reversi?n del fenotipo de c?lula madre se propone como una prometedora estrategia para el tratamiento de estos devastadores tumores, pensamos que este p?ptido penetrante tiene un importante potencial terap?utico.