[ca] Els biosensors microbians són dispositius analítics que utilitzen microorganismes com elements de reconeixement. Els microorganismes s'immobilitzen a la superfície del transductor de manera que la interacció microorganisme-analit genera una senyal (electroquímica, òptica, entre altres) que pot ser quantificada. Els biosensors microbians es poden fer servir en diferents àmbits d'aplicació com al diagnòstic clínic, la indústria alimentària o la monitorització mediambiental amb l'avantatge de ser portables, simples, barats, i per tant bones alternatives als mètodes de laboratori. Desafortunadament, el desenvolupament de biosensors microbians es veu obstaculitzat per: (i) la baixa reproductibilitat que presenten els protocols d'immobilització de les cèl·lules, (ii) la seva poca sensibilitat, deguda a la dificultat d'immobilitzar elevades concentracions de microorganismes, i (iii) la curta vida útil dels mateixos, deguda a la mort cel·lular durant el procés d'immobilització o emmagatzematge. Aquesta tesi descriu el desenvolupament de dues estratègies d'immobilització que permeten el confinament reproduïble de microorganismes a la superfície d'un elèctrode, amb elevades densitats i de manera reproduïble, i al mateix temps proporciona un entorn fisiològic que permet una adequada difusió dels nutrients, garantint la funcionalitat i la viabilitat dels microorganismes atrapats. En la primera estratègia, les cèl·lules microbianes romanen atrapades en una matriu polimèrica d'alginat-grafit electrodepositada a la superfície de l&#8216;elèctrode mitjançant condicions molt suaus i fisiològiques (temperatura ambient, medi aquós, pH neutre…) de polimerització. Els elèctrodes recoberts d'alginat conductor s'obtenen després de l'electrodeposició potenciostàtica de mostres d'alginat dopades amb grafit (fins al 4% de grafit). La presència de grafit redueix la passivació de l'elèctrode i millora la resposta electroquímica dels sensors recoberts d'alginat. L'atrapament de microorganismes és molt eficient (4.4x107 cèl·lules per elèctrode) i reproduïble (CV <0.5%), sense comprometre la integritat ni l'activitat microbiana. En la segona estratègia, els microorganismes romanen atrapats en la matriu de polietersulfona, un material soluble en solvents orgànics que precipita en contacte amb medis aquosos en un procés anomenat inversió de fase. Hem demostrat que els microorganismes poden incorporar-se durant la formació de la membrana mantenint certa viabilitat. Amb aquest mètode, s'obtenen de manera reproduïble membranes de 300 µm amb 2.6x106 cèl·lules en el seu interior, que mantenen nivells acceptables d'integritat i viabilitat cel·lular. Tots dos sistemes s'han utilitzat per immobilitzar E. coli a la superfície d'elèctrodes serigrafiats per desenvolupar biosensors, en els quals, els microorganismes actuen com a elements de reconeixement. La biodetecció s'ha realitzat electroquímicament mitjançant la respirometria de ferricianur, de manera que els microorganismes atrapats dins de la matriu poden reduir el ferricianur en presència de glucosa i convertir-lo en ferrocianur. S'ha avaluat el rendiment analític dels dos biosensors microbians amperomètrics portant a terme un assaig de toxicitat utilitzant 3,5-diclorofenol (DCP) com a compost tòxic model. En tots dos casos, els biosensors van proporcionar una resposta depenent de la concentració de DCP, amb una dosi efectiva (EC50) de 3.5 ppm (alginat) i 9.2 ppm (polietersulfona), d'acord amb els valors reportats. Aquestes metodologies d'atrapament són susceptibles de producció en massa perquè permeten una producció fàcil i repetitiva de biosensors microbians robusts amb una bona sensibilitat.

[es] Los biosensores microbianos son dispositivos analíticos que utilizan microorganismos como elementos de reconocimiento. Los microorganismos están inmovilizados en la superficie del transductor de manera que la interacción microorganismo-analito genera una señal (electroquímica, óptica, entre otras) que puede ser cuantificada. Los biosensores microbianos se pueden aplicar en diferentes campos como el diagnóstico clínico, la industria alimentaria o la monitorización medioambiental, con la ventaja de ser portables, simples, baratos, así como una buena alternativa a los métodos de laboratorio. Desafortunadamente, la implementación de los biosensores microbianos se ha visto obstaculizada por: (i) su pobre reproducibilidad, debido a la poca reproducibilidad de los protocolos de inmovilización de las células, (ii) su poca sensibilidad, por la dificultad de inmovilizar elevadas concentraciones de microorganismos, y (iii) su corta vida útil, debido a la muerte celular durante el proceso de inmovilización o almacenamiento. Esta tesis describe el desarrollo de dos estrategias de inmovilización que permiten el confinamiento reproducible de microorganismos en la superficie del electrodo, con altas densidades y de manera reproducible, al tiempo que proporcionan un entorno fisiológico que permite una adecuada difusión de nutrientes, asegurando la funcionalidad y viabilidad de los microorganismos atrapados. En uno de los sistemas, las células microbianas se atrapan en una matriz polimérica de alginato-grafito electrodepositada en la superficie del electrodo utilizando condiciones muy suaves y fisiológicas (temperatura ambiente, medio acuoso, pH neutro…). Los electrodos recubiertos de alginato conductor se obtienen después de la electrodeposición potenciostática de muestras de alginato dopadas con grafito (hasta el 4% de grafito). La presencia de grafito reduce la pasivación del electrodo y mejora la respuesta electroquímica de los sensores recubiertos de alginato. El atrapamiento de microorganismos es altamente eficiente (4.4x107 células por electrodo) y reproducible (CV <0.5%) sin comprometer la integridad o actividad microbiana. En la segunda estrategia, los microorganismos quedan atrapados en una matriz de polietersulfona, un material soluble en solventes orgánicos y que sólo precipita en contacto con medio acuoso en un proceso llamado de inversión de fase. Hemos demostrado que los microorganismos pueden incorporarse durante la formación de la membrana manteniendo cierta viabilidad. Con este método, se obtuvieron de manera reproducible membranas de 300 µm, con 2.6x106 células en su interior, que mantienen niveles aceptables de integridad y viabilidad celular. Ambos sistemas se han utilizado para inmovilizar E.coli en la superficie de electrodos serigrafiados para desarrollar biosensores en los que los microorganismos actúan como elementos de reconocimiento. La biodetección se ha realizado electroquímicamente mediante respirometría de ferricianuro, de manera que los microorganismos atrapados dentro de la matriz pueden reducir el ferricianuro en presencia de glucosa y convertirlo en ferrocianuro. Se ha evaluado el rendimiento analítico de los dos biosensores microbianos amperométricos llevando a cabo un ensayo de toxicidad utilizando 3,5-diclorofenol (DCP) como compuesto tóxico modelo. En ambos casos, los biosensores proporcionaron una respuesta dependiente de la concentración de DCP con una dosis efectiva (EC50) de 3.5 ppm (alginato) y 9.2 ppm (polietersulfona), de acuerdo con los valores reportados. Esta metodología de atrapamiento es susceptible a la producción en masa porque permite una producción fácil y repetitiva de biosensores microbianos robustos con buena sensibilidad.