[en] INTRODUCTION Antithrombin is a natural anticoagulant that plays a crucial role in hemostasis. The wide range of target procoagulant proteases and the potent inhibitory mechanism of this serpin explain that even moderate reductions of antithrombin significantly increase the risk of venous thrombosis. Thus, antithrombin deficiency is the first and the strongest thrombophilia that has been widely studied during more than 50 years. However, there are still some challenges concerning this anticoagulant, such as the factors involved in the clinical heterogeneity, to do a better characterization of structural variants involved in antithrombin deficiency, and to describe the molecular base of up to 25% of cases with no genetic defect. In this thesis we have tried to correlate genetic and clinical data in a large cohort of patients with antithrombin deficiency. OBJECTIVE The objective of this thesis is to supply new and original information of this rare disorder. Specifically, we aimed to describe the clinical impact of antithrombin deficiency. Moreover, we also want to deeply characterize structural variants involved in antithrombin deficiency, and to identify new molecular defects involved in this disorder. METHODS We have studied one of the largest cohorts of patients with this rare disorder, recruited during more than 20 years. For all patients, a complete set of functional, biochemical and molecular studies have been done and clinical data has been collected. Specific studies included recombinant expression and a novel approach for haplotype analysis. New molecular technologies, including third generation sequencing and long range PCR, have been used for characterization of molecular defects in SERPINC1. RESULTS Antithrombin deficiency causes very high risk of pediatric thrombosis (300-fold compared with the general population). In contrast, we have characterized a mild antithrombin deficiency of difficult functional diagnosis caused by p.Thr147Ala, a mutation with founder effect in African population. The study by different methods, including whole genome sequencing with nanopore technology, of the largest cohort of structural variants causing antithrombin deficiency showed that they are heterogeneous in size and type, and identified for the first time a complex structural variant and an insertion of a new SVA element. We described a detailed map of structural variants with intra and intergenic hotspots, and we found a common mechanism for formation of structural variants causing antithrombin deficiency that involved repetitive elements. CONCLUSIONS Our study supplies new and original information on the strongest thrombophilia. The high risk of pediatric thrombosis supports the screening of certain types of antithrombin deficiency in children of affected families to benefit from preventive strategies. In contrast, founder mutations expanded in different populations like the first one described by our study in African population will probably cause a mild deficiency of difficult functional diagnosis. We identified and characterized a new mechanism causing antithrombin deficiency: the insertion of a retrotransposon in an intron. Moreover, we dissected the structural variants involved in antithrombin deficiency. Our study also reveals that the combination of different methods is useful for the characterization of these gross gene defects, but nanopore sequencing is the most suitable method to fully characterize them.

[es] INTRODUCCIÓN La antitrombina es un anticoagulante natural que juega un papel crucial en la hemostasia. Las diferentes proteasas procoagulantes diana y el potente mecanismo inhibidor de esta serpina explican que incluso reducciones moderadas de antitrombina aumenten significativamente el riesgo de trombosis venosa. Así, la deficiencia de antitrombina es la primera y más grave trombofilia, estudiada ampliamente durante más de 50 años. Sin embargo, aún existen retos en torno a este anticoagulante, como conocer los factores implicados en la heterogeneidad clínica, caracterizar las variantes estructurales implicadas y describir la base molecular del 25% de casos sin defecto genético conocido. En esta tesis hemos intentado correlacionar datos genéticos y clínicos en una gran cohorte de pacientes con deficiencia de antitrombina. OBJETIVO El objetivo de esta tesis es aportar información nueva y original sobre este trastorno. Específicamente, pretendíamos describir el impacto clínico de la deficiencia de antitrombina. Además, quisimos caracterizar en profundidad las variantes estructurales implicadas en la deficiencia de antitrombina, e identificar nuevos defectos moleculares responsables de este trastorno. MÉTODOS Hemos estudiado una de las mayores cohortes de pacientes con esta enfermedad rara reclutada durante más de 20 años. En todos los pacientes, se ha realizado estudios funcionales, bioquímicos y moleculares y se han recopilado datos clínicos. Para estudios específicos se empleó expresión recombinante y una novedosa técnica para el análisis de haplotipos. Además, se han utilizado diferentes tecnologías para la caracterización de los defectos moleculares en SERPINC1, incluyendo la secuenciación de tercera generación y la PCR larga. RESULTADOS La deficiencia de antitrombina incrementa notablemente el riesgo de trombosis pediátrica (300 veces mayor que el de la población general). Por el contrario, hemos caracterizado una deficiencia leve de antitrombina de difícil diagnóstico funcional causada por p.Thr147Ala, una mutación con efecto fundador en la población africana. El estudio de la mayor cohorte de variantes estructurales que causan deficiencia de antitrombina empleando diferentes métodos, incluido la secuenciación del genoma completo con tecnología de nanoporos, mostró que son heterogéneas en tamaño y tipo e identificó por primera vez una variante estructural compleja y la inserción de un nuevo retrotransposon. Describimos un mapa detallado de variantes estructurales con zonas calientes intra e intergénicas, y encontramos un mecanismo común que involucra elementos repetitivos, para la formación de variantes estructurales causantes de este desorden. CONCLUSIONES Nuestro estudio proporciona información nueva y original sobre la trombofilia más grave. El alto riesgo de trombosis pediátrica apoya el cribado de ciertos tipos de deficiencia de antitrombina en niños de familias afectadas para beneficiarse de estrategias preventivas. Las mutaciones fundadoras expandidas en diferentes poblaciones, como la descrita en nuestro estudio en población africana, causan deficiencias leves de difícil diagnóstico funcional. Identificamos y caracterizamos un nuevo mecanismo que causa deficiencia de antitrombina: la inserción de un retrotransposón en un intrón. Además, diseccionamos las variantes estructurales implicadas en deficiencia de antitrombina. Nuestro estudio revela que la combinación de diferentes métodos es útil para la caracterización de estos grandes defectos genéticos, pero la secuenciación de nanoporos es el método más adecuado para su completa caracterización.