[en] MNGIE (Mitochondrial NeuroGastroIntestinal Encephalomyopathy) is a rare autosomal recessive disease characterized by muscular, neuronal and gastrointestinal symptoms. The average life-span of MNGIE patients is 37 years. The disease is caused by mutations in the nuclear gene TYMP, which encodes thymidine phosphorylase (TP). TP catalyzes the first step of thymidine (dThd) and deoxyuridine (dUrd) catabolism. In MNGIE patients, TP dysfunction results in systemic nucleoside accumulation and disturb mitochondrial deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) pools. Concretely, nucleoside overload leads to mitochondrial deoxythymidine triphosphate (dTTP) increase and deoxycytidine triphosphate (dCTP) decrease. This imbalance interferes with correct mitochondrial DNA replication thus producing depletion, multiple deletions and somatic point mutations and resulting in mitochondrial dysfunction. Despite the development of multiple therapeutic strategies based on the clearance of the toxic metabolites or in enzyme replacement with the aim of achieving systemic nucleoside clearance, only allogeneic hematopoietic stem cells transplantation and orthotopic liver transplantation have been effective in long-term biochemical correction. Nevertheless, both procedures are associated with non-negligible mortality rates as well as adverse complications that are compounded in MNGIE patients because of their poor medical condition at the time of treatment. Furthermore, compatible donors are required. In recent years, gene therapy has emerged as an alternative therapeutic approach for the treatment of MNGIE. Previous preclinical studies carried out in lymphoblastoid cell lines obtained from MNGIE patients and in the murine model of the disease, demonstrated that the use of lentiviral vectors targeted to hematopoietic stem cells is effective in the restoration of TP activity. However, due to the risk of oncogenic transactivation associated to integrative vectors, we later developed an alternative strategy based on adeno-associated (AAV) vectors transcriptionally targeted to the liver. In this work, we have studied the effect of some AAV2/8 vectors differing on the promoter (TBG, PGK, HLP and AAT) and the DNA configuration (single stranded, ssDNA, or self-complementary, scAAV) on the function of the TYMP transgene in the murine model of the disease. Specifically, we have treated double KO Tymp-/-Upp1-/- male mice with a single tail vein injection of the different vectors at different doses. Thirty-four weeks after treatment we have assessed TP activity, nucleoside concentration, TYMP copy number and mitochondrial dNTP content in different tissues. Despite the results show that all vectors provide TP activity to the liver, reduce systemic nucleoside overload and modulate mitochondrial dNTP concentration, the use of liver specific promoters (TBG, HLP and AAT) has been more effective than the use of the constitutive promoter PGK. The self-complementary configuration has not provided any significant improvements. We have not observed adverse side effects or signs of hepatocellular toxicity associated with the use of AAV vectors. The best results correspond to that obtained with the use of the TBG and AAT promoters (which are both ssDNA vectors). However, at the lowest tested dose (which is 5·1010 genome copies/kg), only the AAT vector has been effective in all mice. Based on this, our data suggest that the AAT vector should be chosen for the clinical use if AAV-based gene therapy is implemented for MNGIE.

[es] El MNGIE (encefalomiopatía neurogastrointestinal mitocondrial) es una enfermedad rara de herencia autosómica recesiva que provoca afectación de la función muscular, neuronal y gastrointestinal y cuya esperanza de vida se sitúa en torno a los 37 años. Está causada por mutaciones en el gen nuclear TYMP, que codifica la timidina fosforilasa (TP). La TP cataliza el primer paso del catabolismo de los nucleósidos timidina (dThd) y desoxiuridina (dUrd), por lo que disfunciones en esta enzima provocan la acumulación sistémica de estos nucleósidos. La sobrecarga de dThd y dUrd da lugar a un exceso de dTTP y una disminución de dCTP mitocondrial. Consecuentemente, se produce un desequilibrio del pool de los desoxiribonucleósidos trifosfato (dNTPs) mitocondriales que interfiere con la correcta replicación del ADN mitocondrial y provoca depleción, deleciones múltiples y mutaciones puntuales somáticas que conducen a disfunción mitocondrial. Pese a que se han propuesto varias aproximaciones terapéuticas basadas tanto en la eliminación de los metabolitos tóxicos como en el reemplazo enzimático con el fin de lograr un aclaramiento sistémico de la concentración de nucleósidos, sólo el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y el trasplante ortotópico de hígado han resultado ser efectivos en la corrección bioquímica a largo plazo. No obstante, ambas estrategias son agresivas, invasivas y están limitadas por la posibilidad de encontrar donantes compatibles. Además, presentan riesgos no desdeñables para la vida de los pacientes que se ven incrementados en los afectos de MNGIE debido al deteriorado estado de salud que éstos presentan en el momento del tratamiento. El uso de la terapia génica puede suponer una alternativa para el tratamiento de esta enfermedad. El desarrollo de una estrategia basada en vectores lentivirales de tercera generación dirigidos al tejido hematopoyético demostró la prueba de concepto de la efectividad de la terapia génica en células linfoblastoides de pacientes y en el modelo murino de MNGIE. No obstante, debido al riesgo de transactivación oncogénica asociado al uso de vectores integrativos, desarrollamos una segunda aproximación basada en vectores adeno-asociados (17V) transcripcionalmente dirigidos al hígado. En este trabajo se ha estudiado el efecto del uso de diferentes promotores (TBG, PGK, HLP y 17T) y configuraciones genómicas (ADN de cadena sencilla, ssADN, o autocomplementario, sc17V) en la expresión del gen TYMP tras ser introducido en 17Vs de serotipo 2/8. Para ello se han tratado ratones macho doble KO Tymp-/-Upp1-/- (modelo bioquímico de la enfermedad) mediante una única inyección intravenosa por vena caudal de las diferentes construcciones a diferentes dosis. Treinta y cuatro semanas después del tratamiento se ha evaluado la actividad TP, la concentración de nucleósidos, el número de copias de TYMP y el pool de dNTPs en diferentes tejidos. Aunque los resultados muestran que todos los vectores son capaces de restituir la actividad enzimática en hígado, reducir la concentración sistémica de nucleósidos y modular el pool de dNTPs mitocondriales en hígado, el uso de promotores específicos de hepatocitos (TBG, HLP y 17T) ha resultado ser más eficiente que el uso del promotor constitutivo PGK. Por el contrario, no se ha observado una mayor respuesta terapéutica al usar vectores con conformación sc17V. Tampoco se han detectado efectos adversos o signos evidentes de toxicidad hepatocelular asociados al uso de 17Vs. Los mejores resultados se han obtenido con los vectores TBG y 17T (ambos con configuración de ssADN). No obstante, a la dosis más baja testada (correspondiente a 5·1010 genomas víricos/kg) sólo el vector 17T ha resultado ser efectivo en el 100% de los casos, lo que sugiere que ésta debería ser la construcción elegida en posteriores ensayos clínicos en humanos en caso de implementación de la terapia génica basada en 17Vs para el tratamiento del MNGIE.