[en] Telomerase is a ribonucleoprotein complex mainly composed of a catalytic subunit with reverse transcriptase activity (telomerase reverse transcriptase, TERT) and an RNA component (telomerase RNA component, TERC), responsible for telomere maintenance. However, several studies confirm that both components perform others functions beyond telomeric role. Specifically, our laboratory has discovered that TERC regulates myelopoiesis, both in zebrafish and in humans. The specific objectives of the present work are: 1. Molecular characterization of the TERC domains responsible of its non-canonical hematopoietic function. 2. Development of aptamers derived from TERC to treat blood diseases. 3. Identification of TERC interactome. Methodology, results and conclusions: During the development of this Doctoral Thesis, we have exploited the unquestionable advantages of the zebrafish to study the role of terc in myelopoiesis, characterizing the functional involvement of each terc domain in this process. To investigate the function of each domain, different mutations that are frequently found in patients with dyskeratosis congenita (DC) were reproduced and we observed that only the mutations affecting the CR4/CR5 domain impaired myelopoiesis. Taking advantage of the functional knowledge of the roles played by the CR4/CR5 domain of TERC in myelopoiesis, several aptamers (small synthetic oligonucleotides, capable of specifically recognizing target molecules with high affinity) were developed. Two of the aptamers, CR4CR5 and AA, were able to stimulate myelopoiesis by increasing the number of neutrophils and macrophages, without affecting the number of erythrocytes, and independently of terc expression or telomerase activity. In addition, they functioned as terc; that is, they interacted with RNA polymerase II and with the terc binding sequences present in the promoter of master myelopoiesis genes, enhancing their expression in a terc binding site-dependent manner. Importantly, aptamers harbouring CR4/CR5 mutations found in DC patients failed to perform all these functions. In addition, preclinical zebrafish models of DC (terc deficiency) and poikiloderma with neutropenia (usb1 deficiency) diseases demonstrated the therapeutic potential of the developed aptamers to treat neutropenia. Finally, the corresponding human aptamers also increased myeloid gene expression promoting myelopoiesis in human induced pluripotent stem cells. Therefore, two potential therapeutic agents for DC and other neutropenic diseases have been developed in this study. Although we delved into TERC structural and functional characteristics during this thesis, we decided that it was still possible to explore its potential beyond its role in telomeric biology and its non-canonical role in myelopoiesis. For this reason, a proteomic approach was developed to fully exploit the potential of TERC. By this way, it has been discovered that TERC potentially interacts with a multitude of proteins, involved in several cellular processes, such as protein folding, degradation (ubiquitination) and translation, carbon and lipid metabolism, nonsense-mediated mRNA decay, mitochondrial biogenesis and cell cycle. Notably, terc harbouring the mutation of the CR4/CR5 domain found in DC patients showed a similar interactome as wild type terc, despite these mutations impair both telomerase activity and TERC-dependent regulation of myelopoiesis. This study paves the way for future functional studies aimed at the characterization of the non-canonical roles of terc that could help in improving diagnosis and treatment of patients with TERC mutations.

[es] La telomerasa es un complejo ribonucleoproteico compuesto principalmente por una subunidad catalítica con actividad retrotranscriptasa (telomerase reverse transcriptase, TERT) y un componente de RNA (telomerase RNA component, TERC), encargado del mantenimiento de los telómeros. Sin embargo, diversos estudios sostienen que ambos componentes realizan diversas funciones más allá del mantenimiento telomérico. En concreto, nuestro laboratorio ha descubierto que TERC regula la mielopoyesis, tanto en pez cebra como en humano. Los objetivos de este trabajo son: 1. Caracterización molecular de los dominios TERC responsables de su función hematopoyética. 2. Desarrollo de aptámeros derivados de TERC para tratar enfermedades hematológicas. 3. Identificación del interactoma de TERC. Metodología, resultados y conclusiones: Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se han aprovechado las incuestionables ventajas del pez cebra para estudiar el papel de terc en la mielopoyesis, caracterizando la implicación funcional de cada uno de sus dominios en este proceso. Para investigar la función de cada dominio, se reprodujeron diferentes mutaciones que se encuentran con frecuencia en pacientes con disqueratosis congénita (DC) y se observó que solo las mutaciones que afectan al dominio CR4/CR5 alteran la mielopoyesis. Aprovechando el conocimiento funcional del dominio CR4/CR5 de TERC en la mielopoyesis, se desarrollaron varios aptámeros (pequeños oligonucleótidos sintéticos, capaces de reconocer específicamente y con gran afinidad moléculas diana). Dos de los aptámeros, CR4CR5 y AA, fueron capaces de estimular la mielopoyesis aumentando el número de neutrófilos y macrófagos, sin afectar el número de eritrocitos, e independientemente de la expresión de terc o la actividad de la telomerasa. Además, funcionaban como terc; es decir, interactuaron con la RNA polimerasa II y con las secuencias de unión a terc presentes en el promotor de los genes clave en la mielopoyesis, mejorando su expresión de manera dependiente del sitio de unión de terc. Es importante destacar que los aptámeros que albergan mutaciones en CR4/CR5, que se encuentran en pacientes con DC, no lograron realizar todas estas funciones. Además, los modelos preclínicos de pez cebra de DC (deficiencia de terc) y poiquilodermia con neutropenia (deficiencia de usb1) demostraron el potencial terapéutico de los aptámeros desarrollados para tratar la neutropenia. Finalmente, los aptámeros humanos correspondientes también aumentaron la expresión del gen mieloide promoviendo la mielopoyesis en células madre pluripotentes inducidas de humano. Por lo tanto, en este estudio se han desarrollado dos agentes terapéuticos potenciales para DC y otras enfermedades neutropénicas. Aunque profundizamos en las características estructurales y funcionales de TERC durante esta tesis, decidimos que aún era posible explorar su potencial más allá de su papel en la biología telomérica y su papel no canónico en la mielopoyesis. Por esta razón, se desarrolló un enfoque proteómico para aprovechar al máximo el potencial de TERC. De esta manera, se ha descubierto que TERC interactúa potencialmente con una multitud de proteínas, involucradas en varios procesos celulares, como el plegamiento, degradación (ubiquitinación) y traducción de proteínas, metabolismo de carbono y lípidos, desintegración de RNAm mediada por mutaciones de pérdida de sentido, biogénesis mitocondrial y ciclo celular. Por otro lado, terc con las mutaciones en el dominio CR4/CR5 encontradas en pacientes con DC mostró un interactoma similar a terc control, a pesar de que estas mutaciones alteran tanto la actividad de la telomerasa, como la regulación de la mielopoyesis dependiente de TERC. Este estudio es el primer paso hacia futuros estudios funcionales destinados a la caracterización de las funciones no canónicas de terc, que podrían ayudar a mejorar el diagnóstico y el tratamiento de pacientes con mutaciones TERC.