[en] In the last years, host-derived defense peptides (HDPs) are emerging as promising candidates for new antimicrobial agents. In our laboratory, we have been working with eosinophil granules derived RNases, eosinophil-derived neurotoxin (EDN/RNase 2) and eosinophil cationic protein (ECP/RNase 3), proteins from the innate immune system that have been proven to show broad antimicrobial activities. After several optimization steps of the N-terminal fragment of RNase 3, which retains most of the antimicrobial activity of the protein, ECPep-D and ECP-2D-Orn peptides have been proven to be the most effective against bacteria in vitro. Afterwards, a murine systemic infection model induced by A. baumannii was used here to further explore the efficacy of these peptides in vivo. We have first demonstrated that the toxicity of both peptides is within the normal range in comparison to that of other AMPs. Results also highlight that mice treated with ECPep-D have reached a 70% of survival rate and the release of TNF-α is reduced in the treatment group. Recently, we have designed in our lab a protein chimera named RNase 3/1 with the goal to keep the enzymatic ability of RNase 1 and the high antibacterial activity of RNase 3. When combined with colistin, RNase 3/1 can significantly hinder the resistance acquisition of A. baumannii to colistin. Interestingly, when a non-catalytic mutant of RNase 3/1 was combined with colistin, there was no delay of the bacterial resistance acquisition. Overall, the results highlight that this mechanism relies on the ribonuclease activity of RNase 3/1 and the membrane disrupting ability of colistin, which provides a new strategy to fight against bacterial resistance. In case of RNase 2, its catalytic activity has also been reported to be crucial for its antiviral activity. Here we have exposed respiratory syncytial virus (RSV) to THP1-induced macrophages to explore how RNase 2 affects the virus-exposed cells. We have found that RSV can activate the expression of RNase 2 in macrophages and that its presence can reduce the viral load. We also compared the ncRNA populations in wild-type and EDN-knock-out cells, finding significant differences in several tRNAs. In addition, we have confirmed in an ex vivo model that RNase 2 prefers pyrimidines at the base site B1 and adenine at B2. To sum up, in this work we have determined the ECPep-D in vivo antibacterial activity, which appears to be comparable to other reported AMPs. We also have elucidated the RNase 3/1 ability to reduce the resistance acquisition of A. baumannii to colistin, which would be dependent on its catalytic activity. Finally, we have shed light on the tRNA cleavage pattern by RNase 2. All these results will help advancing on the characterization of antimicrobial RNases.

[es] En los últimos años, los péptidos de defensa derivades del huésped están destacando como candidatos prometedores para convertirse en nuevos agentes antimicrobianos. En nuestro laboratorio, hemos estado trabajando con las RNasas derivadas de los gránulos del eosinófilo; la neurotoxina derivada del eosinófilo (EDN/RNasa 2) y la proteína catiónica del eosinófilo (ECP/RNasa 3), unas proteínas del sistema inmune innato que han demostrado tener una actividad antimicrobiana de amplio espectro. Después de varias etapas de optimización del fragmento N-terminal de la RNasa 3, que retiene la mayor parte de la actividad antimicrobiana de la proteína, los péptidos ECPep-D y ECP-2D-Orn han demostrado ser los más efectivos contra bacterias in vitro. En base a estos péptidos, establecimos un modelo de infección sistémica en ratones inducido por A. baumannii para explorar su eficacia in vivo. Primero demostramos que la toxicidad de ambos péptidos estaba dentro del rango normal en comparación con otros péptidos antimicrobianos. Los resultados también demostraron que los ratones tratados con ECPep-D llegaron a un 70% de ratio de supervivencia y que la liberación de TNF-α se reduce en el grupo tratado. Recientemente hemos diseñado en nuestro laboratorio una proteína quimérica a la que hemos nombrado RNasa 3/1 con el objetivo de mantener la elevada actividad catalítica de la RNasa 1 i la alta actividad antibacteriana de la RNasa 3. Cuando se combina con colistina, la RNasa 3/1 puede inhibir significativamente la adquisición de resistencia de A. baumannii a la colistina. Como hecho destacable, vemos que los mutantes no catalíticos de la RNasa 3/1 no tienen la capacidad de inhibir la adquisición de resistencia en combinación con la colistina. Estos resultados demuestran que el mecanismo de inhibición de la resistencia dependería de la actividad ribonucleasa de la RNasa 3/1 combinada con la capacidad de disrupción de la membrana de la colistina, lo cual se convierte en una nueva estrategia para luchar contra la resistencia bacteriana a los antibióticos. Referente a la RNasa 2, se ha reportado que la actividad catalítica es clave para su actividad antivírica. En esta tesis hemos expuesto a macrófagos THP-1 al virus respiratorio sincitial (VRS) para explorar como la RNasa 2 afecta las células expuestas al virus. Hemos descubierto que el VRS puede activar la expresión de la RNasa 2 en macrófagos y que su presencia reduce la carga viral. También hemos descubierto diferencias significativas en diversos tRNAs en comparar las poblaciones de ncRNA en células de tipo salvaje y con un knock-out de la EDN. Finalmente, hemos confirmado en un modelo ex vivo que la RNasa 2 prefiere pirimidinas en el sitio de unión de bases B1 y adenina en B2. Como conclusión, en esta tesis hemos determinado la actividad antibacteriana in vivo del péptido ECPep-D, comparable con la de otros péptidos antimicrobianos. También hemos elucidado la capacidad de la RNasa 3/1 de reducir la adquisición de resistencia de A. baumannii a la colistina, la cual sería dependiente de su actividad catalítica. Finalmente, hemos contribuido a definir el patrón de corte de la RNasa 2 en tRNA. Todos estos resultados ayudarán a avanzar en la caracterización de las RNasas antimicrobianas.