[en] Atherosclerosis is a multifactorial disease characterised by a slow and silent progression. In the last stages, lesions reach high grade of severity and induce ischemic events. Thrombosis plays a central role in ischemic pathology evolution and contributes to plaque growth and to vessel occlusion caused by rupture of unstable plaque (atherothrombosis). Because of complexity and high number of process which take part in this pathology, several pharmacological lines have been developed for it treatment. The objective of this Ph.D. has been the study of defined pharmacology strategies for the treatment of the atherothrombotic pathology (Tissue factor (TF) inhibition, cyclooxygenase (Cox) inhibition and HMG CoA reductase inhibition), to clarify through which mechanisms they produce clinical benefits. Vascular wall triggered thrombosis was studied under flow conditions using an ex vivo experimental model, after administration of either a TF inhibitor (FFR-rFVIIa), Cox inhibitors (aspirin and triflusal), and HMG CoA reductase inhibitors (pravastatin and simvastatin). Previously validated Badimon perfusion chamber was used. Pig and rabbit were used as experimental animal model. Animals were anesthetized, heparinized, catheterized and the perfusion chamber containing the thrombogenic substrate was placed in an extracorporeal shunt (carotid artery-jugular vein). Firstly, the effect of intravenous (0.5, 1 and 4 mg/kg/i.v.) and local treatment with FFR-rFVIIa on thrombosis triggered by severely injured healthy and atherosclerotic vessels was evaluated. Platelet and fibrin deposition on severely injured vessels was significantly inhibited by intravenous administration of FFR-rFVIIa. However, platelet deposition was not modified when severely damaged normal vessels were locally treated with FFR-rFVIIa and perfused with untreated blood. Coagulation studies showed that prothrombin time (PT) was prolonged by FFR-rFVIIa and PT values were positively correlated with FFR-rFVIIa plasma levels (ELISA), indicating a dose-dependent effect. TF immunohistochemistry showed no presence of TF in healthy vascular wall structures exposed to blood. However, there was an marked TF labelling in thrombi, which colocalized with fibrin. Whole blood TF procoagulant activity (PCA) determination revealed the presence of TF induced PCA in blood which was inhibited by FFR-rFVIIa. In the second part of this study, the effect of acute (intravenous) and chronic (8 days/oral) administration of aspirin and triflusal on thrombosis triggered by residual thrombus (secondary thrombosis) was evaluated. In addition, Cox-1 and Cox-2 expression in vascular wall (aorta) was determined by Western blot and RT-PCR in chronically treated animals. Acute treatment with aspirin (5 mg/kg i.v.), triflusal (10 mg/kg/i.v.) and its metabolite, HTB (10 mg/kg/i.v.), inhibited secondary thrombosis with comparable efficacy. Similar results were obtained after the chronic administration of aspirin (30 mg/kg/día/p.o.) or trifusal (40 mg/kg/día/p.o.) for a 8 days. Cox-1 expression (mRNA) was not affected by the treatment with aspirin or triflusal. However, Cox-2 mRNA and protein levels were significantly inhibited by both drugs, although there was a trend to a lesser inhibition of Cox-2 protein expression by triflusal. A third part of the study was aimed to investigate the effect of orally administration of pravastatin (5 mg/kg/día) and simvastatin (5 mg/kg/día) (for 50 days) in dislipemic animals (feed with hyperlipemic diet for 100 days), on thrombosis triggered by severely and mildly injured vessels. Pravastatin and simvastatin inhibited platelet deposition triggered by mildly and severely injured vessels with 60-70% vascular stenosis flow conditions. However, only pravastatin showed significantly differences in all conditions. Axial platelet deposition was also evaluated. Hyperlipemia induced an increase in platelet deposition in the most stenosed segments respect to no-estenosed segments, that was inhibited by both statins. Total cholesterol, HDL cholesterol and LDL cholesterol were periodically determined in plasma and they were incremented in animals feed with hyperlipemic diet. Treatment did not modified plasmatic cholesterol levels and there was no correlation between them and platelet deposition. Activated Rho A expression in platelets was evaluated by Western blot, and a significantly reduction was observed in both pravastatin and simvastatin treated groups. Finally, the size and composition of atherosclerotic lesions were evaluated in abdominal aorta and in left anterior descending (LAD) coronary using histological techniques. Hyperlipemia induced formation of moderate lesions in both arteries, which were composed of lipid, fibrinogen, smooth muscle cells, TF, and macrophages. However, the percent of vascular stenosis, intima thickening, and lesion composition were not modified by treatment. In addition, correlation analysis between plasmatic lipids and lesion parameters showed a positive and significant correlation or a trend in almost all cases. So that, it can be concluded that, firstly, systemic administration of FFR-rFVIIa reduces platelet and fibrin deposition on severely injured vascular wall (healthy and atherosclerotic) through TF pathway blocking and consequently inhibition of thrombin formation; this antithrombotic effect is the result of inhibiting blood-borne and atherosclerotic lesion TF. Secondly, triflusal, its metabolite HTB and aspirin (i.v. and p.o.) reduce secondary thrombosis with similar efficacy; indicating that in thrombin-depending conditions the inhibition of TXA2 synthesis is effective in platelet inhibition; at antithrombotic doses, both triflusal and aspirin (p.o.), reduce vascular Cox-2 expression without afecting Cox-1; Cox-2 relevance in vascular PGI2 synthesis suggest that the antithrombotic effect is the result of platelet TXA2 and vascular PGI2 inhibition. Thirdly, both pravastatin and simvastatin inhibit platelet deposition triggered by injured vessels (mildly and severely) under 60-70% vascular stenosis flow conditions, this effect is independent of plasmatic lipids suggesting a direct effect on platelet, which is dependent of Rho A and platelet-vascular wall interaction; atherosclerotic lesion size and composition in dislipemic conditions are dependent of plasmatic levels, and are not modified by pravastatin or simvastatin treatment for 50 days.

[es] La aterosclerosis es una patología multifactorial que se caracteriza por tener una progresión lenta y silenciosa, hasta alcanzar tal grado de severidad que desencadena un evento isquémico. El fenómeno trombótico es clave en la evolución de la patología isquémica y contribuye tanto al crecimiento de la placa como a la oclusión definitiva del vaso cuando una placa inestable se fisura (aterotrombosis). Debido a la complejidad y a los numerosos procesos que intervienen en esta patología, actualmente existen diversas líneas farmacológicas destinadas a su tratamiento. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha consistido en estudiar determinadas estrategias farmacológicas destinadas al tratamiento de la patología aterotrombótica (la inhibición del factor tisular, la inhibición de la ciclooxigenasa y la inhibición de la HMG CoA reductasa), con la finalidad de esclarecer la manera por la cual son capaces de aportar beneficios apreciables desde el punto de vista clínico. Para ello, se llevó a cabo el estudio de la trombosis desencadenada por substratos vasculares lesionados en condiciones de flujo controladas, en un modelo experimental de trombosis ex vivo, tras el tratamiento con un inhibidor del factor tisular (FFR-rFVIIa), dos inhibidores de la ciclooxigenasa (aspirina y triflusal) y dos inhibidores de la HMG CoA reductasa (pravastatina y simvastatina), utilizando la cámara de perfusión Badimon, previamente validada. Como modelo animal experimental se utilizó el cerdo y el conejo; los animales fueron anestesiados, heparinizados, cateterizados y se montó un circuito extracorpóreo (arteria carótida-vena yugular) en el que se incorporó la cámara de perfusión que contenía el substrato trombogénico. En primer lugar, se evaluó el efecto del FFR-rFVIIa mediante tratamiento sistémico (0,5, 1 y 4 mg/kg/i.v.) y local (pared vascular) sobre la trombosis desecandenada por pared vascular lesionada sana y aterosclerótica (lesión severa). La deposición plaquetaria sobre lesión severa fue inhibida significativamente tras el tratamiento sistémico con FFR-rFVIIa. Además, el estudio inmunohistoquímico del trombo, reveló una menor deposición de fibrina. El tratamiento local de la pared vascular con FFR-rFVIIa, sin embargo, no fue capaz de inhibir la deposición plaquetaria. El FFR-rFVIIa alargó significativamente el tiempo de protrombina (PT) correlacionándose los valores de éste positiva y significativamente con los niveles plasmáticos del fármaco (ELISA), indicando una dependencia de la dosis. El análisis inmunohistoquímico demostró que el TF no se localiza en las estructuras de la pared vascular sana expuestas a la sangre. Sin embargo, se observó una presencia muy significativa de TF en el trombo que colocalizó con la fibrina. El estudio de la actividad procoagulante del TF en sangre total, indicó la presencia de actividad de TF en sangre y su inhibición por el FFR-rFVIIa. En segundo lugar, se evaluó el efecto de la aspirina y del triflusal, administrados de manera aguda (i.v.) y crónica (8 días/p.o.) en el desarrollo de la trombosis desencadenada por un trombo residual (trombosis secundaria). El tratamiento agudo con aspirina (5 mg/kg i.v.), triflusal (10 mg/kg/i.v.) y su metabolito, el HTB (10 mg/kg/i.v.), así como el tratamiento crónico durante 8 días con aspirina (30 mg/kg/día/p.o.) y triflusal (40 mg/kg/día/p.o.) inhibieron la trombosis secundaria con una eficacia similar. Como análisis complementario, se determinó la expresión de ciclooxigenasa-1 (Cox-1) y 2 (Cox-2), mediante RT-PCR y Western Blot, en pared vascular (aorta) de los animales tratados crónicamente. La expresión de Cox-1 (mRNA) no se modificó por el tratamiento con aspirina y triflusal. Sin embargo, tanto los niveles de mRNA como de proteína de Cox-2 fueron inhibidos significativamente por aspirina y triflusal, aunque éste última demostró menor efecto inhibidor en la expresión proteica de Cox-2. En tercer lugar, se evaluó el efecto de la pravastatina (5 mg/kg/día) y simvastatina (5 mg/kg/día,) administrados durante 50 días en un modelo hiperlipémico (administración de dieta hiperlipémica durante 100 días), sobre la trombosis desencadenada por pared vascular lesionada ligera y severamente. La pravastatina y la simvastatina inhibieron la deposición plaquetaria sobre lesión ligera y severa en condiciones de estenosis vascular del 60-70%, aunque sólo la pravastatina lo hizo de manera significativa en todas las condiciones. El análisis de la deposición axial mostró que la hiperlipemia induce un incremento significativo de la deposición plaquetaria en el segmento de máxima estenosis, respecto a los segmentos no estenosados, y que dicha deposición fue inhibida por ambas estatinas. Los niveles de colesterol total, colesterol HDL y colesterol LDL, determinados a diferentes tiempos a lo largo del periodo de dieta y tratamiento, se incrementaron significativamente por la dieta hiperlipémica y no se modificaron con el tratamiento. Además, no se halló ninguna correlación entre los lípidos y la deposición plaquetaria. La expresión de Rho A activado en plaquetas se evaluó mediante Western Blot, observándose una reducción significativa en los grupos tratados con pravastatina y simvastatina. Finalmente, se analizó el tamaño y la composición de las lesiones ateroscleróticas en la aorta abdominal y en la coronaria izquierda descendente (LAD) mediante histología. En ambas arterias, la hiperlipemia indujo la formación de lesiones moderadas con un contenido en lipído, fibrinógeno, células musculares lisas, TF y macrófagos. Sin embargo, ni el porcentaje de estenosis vascular, ni el engrosamiento de la íntima, así como tampoco el contenido en los diferentes marcadores, se modificaron con el tratamiento. Además, el análisis de correlación entre parámetros de la lesión y los lípidos circulantes mostró una correlación positiva y significativa o con tendencia, prácticamente en todos los casos. Por tanto, se puede concluir que, en primer lugar, el FFR-rFVIIa, administrado sistémicamente, disminuye la deposición de fibrina y de plaquetas sobre pared vascular severamente lesionada (sana y aterosclerótica) a través del bloqueo de la formación de trombina por la vía del TF; este efecto antitrombótico lo ejerce a través de la inhibición del TF proveniente de la circulación sanguínea así como del presente en la lesión aterosclerótica. En segundo lugar, los inhibidores de la Cox, el triflusal, su metabolito HTB, y la aspirina (i.v. y p.o.), reducen el trombo secundario con una eficacia similar, indicando que en condiciones dependientes de trombina la inhibición de la formación de TXA2 es efectiva en la inhibición plaquetaria; el triflusal y la aspirina (p.o.), a dosis antitrombóticas, reducen la expresión de Cox-2 vascular, sin afectar los niveles de Cox-1; la participación de la Cox-2 en la síntesis de PGI2 vascular, sugiere que el efecto antitrombótico obtenido es el resultado del equilibrio entre la inhibición del TXA2 plaquetar y de la PGI2 vascular. Y en tercer lugar, la pravastatina y la simvastatina inhiben la deposición plaquetaria sobre pared vascular lesionada (ligera y severamente) en condiciones de estenosis vascular, de manera independiente de los lípidos plasmáticos, lo que sugiere un efecto directo sobre la plaqueta, que es dependiente de Rho A y de la interacción plaqueta-pared vascular; el tamaño y la composición de la lesión aterosclerótica en condiciones de dislipemia son dependientes de los lípidos plasmáticos, y no se modifican al tratar con pravastatina y simvastatina durante 50 días.