[en] Foods contain components with beneficial effects on health, with the intestine being the first target of their action. Among the components of foods with biological activity, proteins and peptides, especially those from milk, have attracted great scientific interest, mainly due to their potential use as ingredients, since they are able to improve both the nutritional and functional value of foods, providing beneficial health effects. More specifically, in recent years, studies have focused on the use of milk components against a broad range of viruses. Among them, rotavirus is the leading cause of acute gastroenteritis in neonates and children under five years, as well as an important animal pathogen. Despite the introduction of rotaviral vaccines, challenges related to affordability and accessibility underline the need for alternative strategies to fight rotavirus infection. The present Doctoral Thesis has explored the potential of several milk components and dairy byproducts to inhibit rotavirus infection, as well as the effect of the application of some technological treatments on their bioactivity. In order to carry out this objective, several dairy fractions, such as whey and buttermilk, milk proteins, such as lactoferrin and immunoglobulins, milk peptides like the component 3 of proteose peptone and also milk extracellular vesicles, were obtained from milk of different species. The different dairy samples were isolated by means of precipitation procedures, chromatographic techniques, and technological processes. Different treatments were applied either before or after the isolation of these fractions and compounds, and included both thermal processing, such as pasteurization and UHT sterilization, and non-thermal processing, such as high hydrostatic pressure and ultra-high pressure homogenization. In continuation, the antirotaviral capacity of the dairy samples was studied in vitro through an assay of infection of two different cell lines by rotavirus. The first cell line was Caco-2, a human colon carcinoma cell line which were cultured for several days in order to reach the differentiated state. Caco-2, although being colonic epithelial cells, they acquire the characteristics of the mature enterocytes when differentiated, thus serving as a model of the human small intestinal epithelium. The second cell line that was used was MA104, the African green monkey kidney epithelial cell line. This is a well characterized cell line that has been traditionally used in rotavirus studies due to its particularly high sensitivity to this virus; however, it is considered a less physiologically relevant model since these cells do not express the morphological and functional characteristics of the intestinal cells. Overall, three types of infection assays were performed to assess the mechanism of action against rotavirus: (i) rotavirus neutralization, (ii) cell receptor blocking and (iii) post-binding activity. The results included in the articles of the chapters 1 and 3 of this compendium, showed that milk, regardless of the origin, is a valuable source of bioactive compounds with activity against rotaviruses, being the whey, immunoglobulins and lactoferrin, those presenting the greatest capacity against bovine rotavirus WC3 strain. The antirotaviral mechanism employed by these samples was more related to the virus neutralization (virucidal effect) at an early step of infection and less to the interaction of the dairy samples with the cell receptors or the virus in a post-infection stage (protective effect). In addition, the enrichment of dairy fractions with active immunoglobulin fractions boosted their antirotaviral capacity. Furthermore, the use of several technological processes of the dairy industry impact on the antirotaviral activity of the milk constituents to a greater or lesser extent, as demonstrated in the articles of chapters 3 and 4. Specifically, the application of high temperature-short time pasteurization (75 °C for 15 s), and treatment using high hydrostatic pressures (500 MPa for 10 min or 600 MPa for 5 min), to whey and buttermilk samples did not lead to a significant loss of their antirotaviral activity. At the same time, the bovine whey subjected to ultra-high pressure homogenization at 100 and 200 MPa maintained its high rotavirus neutralization capacity. However, homogenization at 250 MPa resulted in loss of such bioactivity. At the same time, the antirotaviral activity of the residual fat present in the whey was unaffected by those ultra-high pressure treatments, regarding its rotavirus neutralizing activity. Additionally, it was demonstrated that the extracellular vesicles isolated from bovine, human and caprine milk sources also possess antirotaviral activity. Extracellular vesicles induced an endogenous effect in Caco-2 cells, resulting in a significant reduction of infection induced by the human Wa and the bovine WC3 rotavirus strains. The antiviral properties of the milk extracellular vesicles were found to be associated with synergistic interactions at pre- and post-attachment stages of the viral infection. When the effect of milk processing on bovine milk extracellular vesicles efficacy was assessed, it was found that after high-temperature short-time pasteurization extracellular vesicles retained their activity, while the application of homogenization resulted in no antiviral effect at all. These observations have been published in the article included in the chapter 5 of this compendium. Finally, a part of the present thesis was dedicated to exploring the bioactivity of food components other than those of milk, using the same rotavirus neutralization model. Thus, different samples of the brown algae Fucus vesiculosus were obtained by the means of extraction and were tested in vitro against the bovine rotavirus WC3 strain. It was revealed that whole algae extracts and crude fucoidan precipitates neutralized rotavirus in a dose-response manner and that molecular weight fractionation significantly affects this bioactivity. At the same time, one of these high molecular weight extracts was found to hold important antibacterial activity as it inhibited the growth of several foodborne bacteria, such as Campylobacter jejuni, Salmonella Typhimurium, and Listeria monocytogenes. These results have been published in the article included in the chapter 7 of this compendium. Overall, the evidence provided by this study, as regards the antirotaviral capacity of several fractions and proteins from milk, colostrum and also from algae, may contribute to revalorizing the products from which they are obtained, as potential sources of ingredients for functional foods.

[es] Los alimentos contienen componentes con efectos beneficiosos para la salud, siendo el intestino el primer objetivo de su acción. Entre los componentes de los alimentos con actividad biológica, las proteínas y péptidos, especialmente los procedentes de la leche, han despertado un gran interés científico, principalmente por su potencial uso como ingredientes, ya que son capaces de mejorar tanto el valor nutricional como funcional de los alimentos, aportando beneficiosos efectos en la salud. Más concretamente, en los últimos años los estudios se han centrado en el uso de componentes de la leche frente a una amplia gama de virus. Entre ellos, el rotavirus es la principal causa de gastroenteritis aguda en recién nacidos y niños menores de cinco años, así como un importante patógeno animal. A pesar de la introducción de las vacunas frente a los rotavirus, los desafíos relacionados con la asequibilidad y la accesibilidad subrayan la necesidad de estrategias alternativas para combatir la infección por rotavirus. La presente Tesis Doctoral ha explorado el potencial de varios componentes y subproductos lácteos para inhibir la infección por rotavirus, así como el efecto de la aplicación de algunos tratamientos tecnológicos sobre su bioactividad. Para llevar a cabo este objetivo, diversas fracciones lácteas, como proteínas del lactosuero y mazada, como la lactoferrina y las inmunoglobulinas, péptidos de la leche como el componente 3 de la proteosa peptona y también vesículas extracelulares, se obtuvieron a partir de leche de diferentes especies Las muestras lácteas se aislaron mediante procedimientos de precipitación, técnicas cromatográficas y procesos tecnológicos. Se aplicaron diferentes tratamientos antes o después del aislamiento de estas fracciones y compuestos, e incluyeron tanto procesamiento térmico, como pasteurización y esterilización UHT; como procesamiento no térmico, como alta presión hidrostática y homogeneización a ultra-alta presión. A continuación, se estudió la capacidad antirrotaviral de las muestras lácteas mediante un ensayo de infección in vitro de dos líneas celulares diferentes por rotavirus. La primera línea celular fue Caco-2, una línea celular de carcinoma de colon humano que se cultivó durante varios días para alcanzar el estado diferenciado. Caco-2, aunque son células epiteliales del colon, al diferenciarse adquieren las características de los enterocitos maduros, sirviendo, así como modelo del epitelio del intestino delgado humano. La segunda línea celular que se utilizó fue MA104, la línea celular epitelial del riñón del mono verde africano. Se trata de una línea celular bien caracterizada que se ha utilizado tradicionalmente en estudios de rotavirus debido a su sensibilidad particularmente alta a este virus; sin embargo, se considera un modelo fisiológicamente menos relevante ya que estas células no expresan las características morfológicas y funcionales de las células intestinales. En conjunto, se realizaron tres tipos de ensayos de infección para evaluar el mecanismo de acción contra el rotavirus: (i) neutralización del rotavirus, (ii) bloqueo del receptor celular y (iii) actividad posterior a la unión. Los resultados incluidos en los artículos de los capítulos 1 y 3 de este compendio, mostraron que la leche, independientemente de su origen, es una fuente valiosa de compuestos bioactivos con actividad contra rotavirus, siendo el suero, las inmunoglobulinas y la lactoferrina, los que presentan mayor capacidad frente a la cepa WC3 de rotavirus bovino. El mecanismo antirrotaviral empleado por estas muestras estuvo más relacionado con la neutralización del virus (efecto virucida) en una etapa temprana de la infección y menos con la interacción de las muestras lácteas con los receptores celulares o el virus en una etapa post-infección (efecto protector). Además, el enriquecimiento de las fracciones lácteas con fracciones de inmunoglobulinas activas impulsó su capacidad antirrotaviral. Por otra parte, se ha demostrado que el uso de determinados procesos tecnológicos de la industria láctea impacta en mayor o menor medida en la actividad antirrotaviral de los constituyentes de la leche, como se demuestra en los artículos incluidos en los capítulos 3 y 4. En concreto, la aplicación de la pasteurización a alta temperatura y corto tiempo (75 °C durante 15 s), y el tratamiento con altas presiones hidrostáticas (500 MPa durante 10 min o 600 MPa durante 5 min), a muestras de lactosuero y mazada no condujeron a una pérdida significativa de su actividad antirrotaviral. Al mismo tiempo, el lactosuero bovino sometido a homogeneización a ultra-alta presión a 100 y 200 MPa mantuvo su alta capacidad de neutralización de rotavirus. Sin embargo, la homogeneización a 250 MPa dio como resultado la pérdida de dicha bioactividad. Al mismo tiempo, la actividad antirrotaviral de la grasa residual presente en el lactosuero no se vio afectada por esos tratamientos de homogeneización a ultra-alta presión, en cuanto a su actividad neutralizante de rotavirus. Además, se demostró que las vesículas extracelulares aisladas de leche bovina, humana y caprina también poseen actividad antirrotaviral. Las vesículas extracelulares indujeron un efecto endógeno en las células Caco-2, lo que resultó en una reducción significativa de la infección inducida por las cepas de rotavirus Wa humana y WC3 bovina. Se descubrió que las propiedades antivirales de las vesículas extracelulares de la leche estaban asociadas con interacciones sinérgicas en las etapas previas y posteriores a la unión de la infección viral. Cuando se evaluó el efecto del procesamiento de la leche sobre la eficacia de las vesículas extracelulares de leche bovina, se descubrió que después de la pasteurización a alta temperatura y corto tiempo, las vesículas extracelulares mantenían su actividad, mientras que tras la aplicación de la homogeneización no se observó efecto antiviral. Estas observaciones han sido publicadas en el artículo incluido en el capítulo 5 de este compendio. Finalmente, una parte de la presente tesis se dedicó a explorar la bioactividad de algunos componentes naturales de un origen no lácteo, utilizando el mismo modelo de neutralización de rotavirus. Así, mediante extracción se obtuvieron diferentes muestras del alga parda Fucus vesiculosus y se ensayaron in vitro frente a la cepa de rotavirus bovino WC3. Se reveló que los extractos completos y el precipitado de fucoidan crudo del alga habían neutralizado el rotavirus en una forma dosis-respuesta y que el fraccionamiento por peso molecular afecta significativamente a esta bioactividad. Al mismo tiempo, se descubrió que uno de estos extractos de alto peso molecular tenía una importante actividad antibacteriana, ya que inhibía el crecimiento de varias bacterias transmitidas por los alimentos, como Campylobacter jejuni, Salmonella Typhimurium y Listeria monocytogenes. Estos resultados han sido publicados en el artículo incluido en el capítulo 7 de este compendio. En general, las evidencias aportadas por este estudio, en cuanto a la capacidad antirrotaviral de varias fracciones y proteínas de la leche, del calostro y también de las algas, pueden contribuir a revalorizar los productos de los que se obtienen, como fuentes potenciales de ingredientes para alimentos funcionales.