[es] La microscopía de súper resolución ha aportado una mejora significativa en la imagen, a escala nanométrica, de ensambles moleculares en medios biológicos. Sin embargo, su extensión, mediante la utilización de la anisotropía de fluorescencia para la obtención de imágenes de orientación molecular, aún no ha sido explorada a fondo. El proporcionar información sobre la orientación molecular a escala nanométrica es de gran interés para la comprensión de las funciones biológicas. Esta información está intrínsecamente relacionada con la estructura de los ensamblajes de proteínas en las membranas celulares, la polimerización y la agregación supra molecular, entre otros. En esta tesis, proponemos una técnica de microscopía de luz polarizada de súper resolución, la cual permite visualizar el comportamiento de la orientación molecular en ambientes dinámicos y estáticos. El objetivo final es el de poder reportar información estructural a nivel de molécula única y escala espacial nanométrica. Utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica (dSTORM) en combinación con detección polarizada, las imágenes de anisotropía de fluorescencia son reconstruidas con una resolución espacial de varias decenas de nanómetros. Además, el principio del método ha sido validado numéricamente en combinación con modelos de mecanismos de orientación molecular y delimitando las condiciones en que esta información se puede obtener con una precisión alta en muestras biológicas, principalmente en estructuras fibrilares. Así también, se propone una técnica alternativa basada en la emisión de fluctuaciones estocásticas de moléculas individuales: imagen de polarización con súper resolución de fluctuaciones (polar-SOFI). Además comparamos esta técnica con la anterior, en términos de la información obtenida y la resolución espacial. Finalmente, ilustramos ambas técnicas para la obtención de imágenes del orden molecular de fibras de estrés de actina y tubulina en células fijas, fibras de ADN y fibrillas de insulina amiloide.

[fr] Alors que la microscopie super-résolue a apporté une amélioration considérable en imagerie des assemblages moléculaires dans les milieux biologiques à l'échelle nanométrique, son extension à l'imagerie de l'orientation moléculaire, utilisant l'anisotropie de fluorescence, n'a pas encore été complètement explorée. Apporter une information sur l'orientation moléculaire à l'échelle nanométrique aurait un intérêt considérable pour la compréhension des functions biologiques, puisque celles-ci sont fortement reliée à la structure des assemblages de prot éines dans les membranes cellulaires, la polymérisation ou l'aggrégation supramol éculaire par exemple. Dans cette thèse, nous proposons une technique de microscopie super-résolution résolue en polarisation, capable d'imager les comportements d'orientation moléculaire dans des environnements statiques et dynamiques, dans le but de rapporter une information structurale à l'échelle de la molécule unique et à des échelles spatiales nanométriques. En utilisant la microscopie par reconstruction stochastique (dSTORM) en combinaison avec une détection polarisée, des images d'anisotropie de fluorescence sont reconstruites avec une résolution spatiale de quelques dizaines de nanomètres. Nous analysons numériquement le principe de la méthode en combinaison avec des modèles des mécanismes d'orientation moléculaire, et donnons les conditions auxquelles cette information peut être obtenue avec une grande précision dans des échantillons biologiques basés sur des structures fibrillaires. Enfin, nous proposons une technique alternative basée sur l'émission de molécules uniques en fluctuations stochastiques: l'imagerie super-résolue polarisée par fluctuations (polar-SOFI), et comparons cette approche avec la précédente en terme d'information gagnée et de résolution spatiale. Nous illustrons les deux techniques pour l'imagerie de l'ordre moléculaire dans des fibres de stress d'actin et de tubuline dans des cellules fixées, des fibres d'ADN et des fibrilles d'amyloid à base d'insuline.