[ca] S'han estudiat en profunditat els mecanismes apoptòtics, constituint un factor substancial en la mort neuronal després de diferents tipus de danys en el SNC. No obstant això, molt poc es sap sobre l'activació dels mecanismes apoptòtics en les cèl·lules glials i la seva rellevància en la terminació de la resposta glial. La caspasa-3 ha estat definida clàssicament com la principal executora de la mort cel·lular programada i li han estat atribuïts recentment altres papers no apoptòtics de participació en esdeveniments cel·lulars, incloent-hi la proliferació cel·lular, la regulació del cicle cel·lular, i la participació en vies cel·lulars apoptòtiques i antiapoptòtiques després d'un dany excito-tòxic en el cervell immadur de rata. Per aquest propòsit, s'ha utilitzat un model de excitotoxicitat ben caracteritzat, que ha consistit en la inducció d'un dany cerebral mitjançant una injecció intracortical de N-methyl-D-asparate (NMDA) en rates postnatals en el 9è dia de vida (P9). La mort cel·lular, les proteïnes apoptòtiques i antiapoptòtiques van ser analitzades a diferents terminis de supervivència després de la lesió per assaigs enzimàtics i anàlisis de doble fluorescència amb microscopia confocal. Els primers resultats com la caspase-3 clivada es presentava en neurones danyades amb els nuclis TUNEL+, encara que va ser observada majoritàriament en el nucli d'astròcits activats en l'hemisferi lesionat sense associació amb fragmentació del ADN, des de les 4 hores post-lesió (hpl) fins a la formació de la cicatriu glial als 7-14 dies, sense trobar-se associació amb marcatge amb TUNEL. L'activitat enzimàtica de la caspasa-3 va ser detectada a les primeres hores post-lesió i coincidint amb els fragments clivados per caspasas de la proteïna acídica fibrilar (CCP-GFAP) en astrocitos. No obstant això, sobre llargs terminis de supervivència, quan sorgia la hipertròfia astroglial, la caspasa-3 astroglial generalment no es va correlacionar amb el clivage de CCP-GFAP, però en canvi es va relacionar amb l'expressió de novo de vimentina. Per altra banda, la caspasa-3 clivada no s'ha vinculat a proliferació cel·lular. Aquests resultats inicials van mostrar l'evidència d'un paper gens tradicional de les caspases en la funció astroglial, suggerint que la seva activació pot ser important per a la reestructuració del citoesquelet després d'un dany. Secundàriament, al avaluar les vies d'activació de la caspasa-3 en neurones i cèl·lules glials, l'activació espai-temporal de les vies apoptòtiques intrínseca i extrínseca va ser analitzada. Es va expressar principalment en les neurones danyades corticals i hipocampals, una important contribució de la via intrínseca a través de la gran proporció de caspasa-9 activa amb l'activació neuronal de la caspase-3 i mort cel·lular. Per altra banda, la caspasa-8 va presentar una reduïda correlació amb la caspasa-3, i característicament es va presentar amb especificitat en les capes corticals. En les cèl·lules glials, l'activació de la caspasa-9, caspasa-8, i també p53, altra molècula que activa la caspasa-3 indirectament, va ser significant tant sols en la capa cortical VI i en el corpus callosum, suggerint que la caspasa-3 astroglial no es correlaciona generalment amb les clàssiques vies d'activació. La tercera part d'aquesta tesi es va focalitzar en l'estudi de les molècules antiapoptòtiques, com diversos inhibidors de l'apoptosis (IAPs) i les proteïnes heat shock (HSPs), conegudes com inhibidors de la caspasa-3 clivada en altres tipus cel·lulars. Les neurones van presentar una apreciable expressió de HSC70/HSP70 i cIAP-2, encara que aquestes es correlacionaven pobrament amb caspasa-3 en aquest tipus cel·lular. En astròcits , la survivina i la chaperona HSP25/27 van mostrar una forta correlació amb caspasa-3 en diverses regions cerebrals i a diversos terminis de supervivència, sent aquestes proteïnes destacades candidates per al bloqueig de l'activitat enzimàtica de la caspasa-3, la qual podria acumular-se en absència de mort astroglial. En conclusió, aquesta tesi ha descobert nous rols no apoptòtics de la caspasa-3 en cèl·lules astroglials i suggereix mecanismes de bloqueig de la caspasa-3, ajudant al coneixement dels mecanismes emprats pels astròcits per enfrontar-se al dany en el cervell immadur.

[es] Los mecanismos apoptóticos han sido estudiados en profundidad, constituyendo un papel substancial en la muerte neuronal tras diferentes tipos de daño en el SNC. No obstante, muy poco se sabe acerca de la activación de los mecanismos apoptóticos en las células gliales y su relevancia en la terminación de la respuesta glial. La caspasa-3 ha sido definida clásicamente como al principal ejecutora de la muerte celular programada, le han sido recientemente atribuidos otros papeles no-apoptóticos, participando en acontecimientos celulares, incluyendo proliferación celular, regulación del ciclo celular, y vías celulares apoptóticas y antiapoptóticas después de un daño excitotóxico en el cerebro inmaduro de rata. Para este propósito, se ha utilizado un modelo de excitotoxicidad bien caracterizado, que consiste en la inducción de un daño cerebral mediante una inyección intracortical de N-methyl-D-asparate (NMDA) en ratas postnatales en el día 9 de vida (P9). La muerte celular, las proteínas apoptóticas y antiapoptóticas fueron analizadas a distintos tiempos de supervivencia después de la lesión por ensayos enzimáticos y análisis de doble fluorescencia con microscopía confocal. Los primeros resultados como la caspasa-3 clivada se presentaba en neuronas dañadas con los núcleos TUNEL+, aunque fue observada mayoritariamente en el núcleo de astrocitos activados en el hemisferio lesionado sin asociación con fragmentación del ADN, desde tiempos tempranos las 4 horas post-lesión (hpl) hasta la formación de la cicatriz glial a los 7-14 días, sin encontrarse asociación con marcaje con TUNEL. La actividad enzimática de la caspasa-3 fue detectada a las primeras horas post-lesión y coincidiendo con los fragmentos clivados por caspasas de la proteína acídica fibrilar (CCP-GFAP) en astrocitos. Sin embargo, a largos tiempos de supervivencia, cuando surge la hipertrofia astroglial, la caspasa-3 astroglial generalmente no correlacionó con el clivage de CCP-GFAP, pero en cambio se relacionó con la expresión de novo de vimentina. Por otra parte, la caspasa-3 clivada no se ha vinculado a proliferación celular. Estes resultados iniciales mostraron la evidencia de un no-tradicional papel de las caspasas en la función astroglial, sugeriendo que su activación puede ser importante para la reestructuración del citoesqueleto después de un daño. Secundariamente, al evaluar las vías de activación de la caspasa-3 en neuronas y células gliales, la activación espacio-temporal de las vías apoptóticas intrínseca y extrínseca fueron analizadas. Se expresó principalmente en las neuronas dañadas corticales e hipocampales, una importante contribución de la vía intrínseca através de la gran proporción de caspasa-9 activa con la activación neuronal de la caspase-3 y muerte celular. Por otra banda, la caspasa-8 presentó una reducida correlación con la caspasa-3, y característicamente presentó con especificidad en las capas corticales. En las células gliales, la activación de la caspasa-9, caspasa-8, y también p53, otra molécula que activa la caspasa-3 indirectamente, fue solamente significante en la capa cortical VI y en el corpus callosum, sugeriendo que la caspasa-3 astroglial no se correlaciona generalmente con las clásicas vías de activación. La tercera parte de esta tesis se focalizó en el estudio de las moléculas antiapoptóticas, como varios inhibitores de apoptosis (IAPs) y las heat shock proteins (HSPs), conocidas como inhibidoras de la caspasa-3 clivada en otros tipos celulares. Las neuronas presentaron una apreciable expresión de HSC70/HSP70 y cIAP-2, aunque estas pobremente se correlacionan con caspasa-3 en este tipo celular. En astrocitos , la survivina y la chaperona HSP25/27 mostraron una fuerte correlación con caspasa-3 en varias regiones cerebrales y a varios tiempos de supervivencia, siendo estas proteínas destacadas candidatas para el bloqueo de la actividad enzimática de la caspasa-3, la cual podría acumularse en ausencia de muerte astroglial. En conclusión esta tesis ha destapado nuevos roles no apoptóticos de la caspasa-3 en células astrogliales, sugeriendo mecanismos de bloqueo de la caspasa-3, ayudando a la mejor comprensión de los mecanismos empleados por los astrocitos para enfrentarse al daño en el cerebro inmaduro.