[en] Dopamine signalling regulates a variety of complex behaviours and defects in dopaminergic neuron function or survival result in severe human pathologies such as Parkinson´s disease. All dopaminergic neurons are characterized by the expression of a battery of genes that code for a set of proteins required for the synthesis, release and re-uptake of dopamine and all together are called the DA pathway genes. Therefore, understanding how this set of genes are transcriptionally activated in a coordinated manner is the first step to discover the clues of dopaminergic terminal differentiation. The dopamine pathway genes are highly conserved throughout evolution. Studies in the nematode C.elegans have shown that three transcription factors, CEH-20 (PBX transcription factor family), AST-1 (ETS transcription factor family) and CEH-43 (Homeodomain transcription factor family) are necessary for the terminal differentiation of DA neurons. These factors act in a coordinated manner to bind the regulatory regions and activate the expression not only of the DA pathway but of most of the mature dopaminergic neuron transcriptome. The dopaminergic system in mammals is distributed in nuclei of the mesencephalon, diencephalon and olfactory bulb. However, in this project we have focused on the olfactory bulb dopaminergic neurons since it is the most ancestral population and also because it requires AST-1 and CEH -43 orthologs (ER81 and DLX2 respectively) for their correct differentiation. Our main interest in this PhD project has therefore been to study whether homologues of CEH-20, the third known factor in the worm, directly participates in the dopaminergic specification of the bulb in higher organisms such as the mouse. In mammals, there are four members in the PBX family: PBX1, PBX2, PBX3 and PBX4. The study of its expression in the bulb, by double immunostaining against tyrosine hydroxylase (DA marker) and PBX factors, determined that both PBX1 (isoform 1a but not 1b) and PBX2 are expressed in neonatal and adult olfactory bulb DA neurons. The same study also revealed that the expression of PBX1a and PBX2 is not exclusive to dopaminergic neurons and other cells of the periglomerular layer as well as in the granular layer (the most internal layer) of the olfactory bulb and other neurons of the brain also express them. Expression analysis of Tyrosine hydroxylase, the rate limiting enzyme for dopamine synthesis, in Pbx1 specific conditional mutants of the dopaminergic lineage, null mutants for Pbx2 and double mutants demonstrate that Pbx1 but not Pbx2 is necessary for the differentiation to dopaminergic neuron of the bulb, both those generated at embryonic stages as well as at adult stages. Studies of cell lineage tracing in which the neurons of the dopaminergic lineage are permanently marked with green fluorescent protein demonstrate that, in Pbx1 mutants, the neurons are present but they are unable to differentiate into DA neurons. On the other hand, it was also observed that a small percentage of the DA lineage neurons in mutants for Pbx1 ectopically express Calretinin and / or Calbindin suggesting a change in their cell fate from DA to other lineages. In addition, experiments indicated that PBX1 regulates the expression of other transcription factors required for dopaminergic differentiation such as MEIS2 and COUP-TF1. Moreover, in vivo electroporation experiments in neonatal mice confirm that the phenotype observed in the olfactory bulb is not an indirect effect derived from possible defects in proliferation of progenitors but is due to terminal differentiation defects and that it can be rescued specifically by the Pbx1a isoform but not by Pbx1b. Furthermore, overexpression experiments show that Pbx1a and to a lesser extent Pbx1b increase the dopaminergic differentiation in electroporated cells. Finally, we have detected that PBX1 directly binds to the cis regulatory sequences of the Th gene supporting a direct effect of this factor on its expression. In this way we propose PBX1a as functional homolog of CEH-20 thus reinforcing the hypothesis of a possible evolutionary conservation in the differentiation to dopaminergic neuron between nematodes and mammals.

[es] Las neuronas dopaminérgicas (DA) regulan una amplia variedad de comportamientos; defectos en la función o supervivencia de estas neuronas dan lugar a patologías tan importantes como el Parkinson. Todas las neuronas dopaminérgicas se caracterizan por la expresión de una batería de genes que codifican para un grupo de proteínas implicadas en la síntesis, transporte y recaptación de la dopamina y que en su conjunto denominamos genes de la vía de la dopamina. Por tanto, conocer los factores de transcripción que activan de forma directa la transcripción de estos genes es el primer paso para descubrir las claves de la diferenciación terminal de las neuronas dopaminérgicas. Los genes de la vía de la dopamina están altamente conservados a lo largo de la evolución. Estudios en el nematodo C.elegans han demostrado que tres factores de transcripción, CEH-20 (factor de la familia PBX), AST-1( factor de la familia ETS) y CEH-43 (factor de la familia Homeodominio) son necesarios para la diferenciación terminal de las neuronas DA. Estos factores actúan de forma coordinada uniéndose a las regiones reguladoras y activando la expresión, no sólo de los genes de la vía de la DA, sino de la mayor parte del transcriptoma de la neurona dopaminérgica madura. El sistema dopaminérgico en mamíferos se distribuye en núcleos del mesencéfalo, diencéfalo y bulbo olfatorio. Sin embargo, en este proyecto nos hemos centrado en el estudio de las neuronas dopaminérgicas del bulbo olfatorio ya que se trata de la población más ancestral en evolución y además porque las neuronas DA del bulbo requieren para su correcta diferenciación los ortólogos para AST-1 y CEH-43 (ER81 y DLX2 respectivamente). Nuestro principal interés en esta tesis por tanto, ha sido estudiar si homólogos de CEH-20, el tercer factor conocido en el gusano, participan de manera directa en la especificación dopaminérgica del bulbo en organismos superiores como el ratón. En mamíferos, existen cuatro miembros en la familia PBX: PBX1, PBX2, PBX3 Y PBX4. El estudio de su expresión en el bulbo olfatorio, mediante inmunotinción doble con tyrosina hidroxilasa (marcador DA) y los factores PBX, determinó que tanto PBX1 (isoforma 1a pero no 1b) como PBX2 se expresan en las neuronas DA del bulbo olfatorio de neonatos y adultos. El mismo estudio también reveló que la expresión de PBX1a y PBX2 no es exclusiva de las neuronas DA sino que también se expresan en otras células de la capa periglomerular así como en la capa granular (capa más interna) del bulbo olfatorio y otras neuronas del cerebro. Análisis de expresión de la tyrosina hidroxilasa en mutantes condicionales para Pbx1 específicos del linaje dopaminérgico, mutantes nulos para Pbx2 y dobles mutantes, demuestran que Pbx1 pero no Pbx2 es necesario para la diferenciación de las neuronas DA del bulbo, tanto las generadas durante el desarrollo embrionario como en el adulto. Estudios de linaje celular, en el que las neuronas del linaje dopaminérgico quedan permanentemente marcadas con la proteína verde fluorescente demuestran que, en los mutantes para Pbx1, las neuronas están presentes pero no llevan a cabo su correcta diferenciación DA. Por otra parte, también se observó que un pequeño porcentaje de las neuronas del linaje DA en mutantes para Pbx1 expresa ectópicamente Calretinina y/o Calbindina, dos marcadores de otras subpoblaciones de interneuronas del bulbo olfatorio, sugiriendo un cambio de destino celular de DA a otros linajes. Además, hemos determinado que Pbx1 regula la expresión de otros factores de transcripción necesarios para la diferenciación dopaminérgica como MEIS2 y COUP-TF1. Asimismo, los experimentos de electroporación in vivo en ratones neonatos confirman que el fenotipo observado en el bulbo olfatorio no es un efecto secundario derivado de posibles defectos de proliferación sino que es un fenotipo de diferenciación terminal y que puede ser rescatado de forma específica por la isoforma Pbx1a pero no por Pbx1b. Experimentos de sobreexpresión muestran que Pbx1a y en menor medida Pbx1b incrementan la diferenciación a neurona dopaminérgica en las células electroporadas, sugiriendo que en algunos contextos Pbx1 es suficiente para inducir diferenciación DA. Finalmente, hemos detectado que PBX1 se une directamente a las secuencias cis reguladoras del gen Th apoyando un efecto directo de este factor sobre su expresión. De esta forma proponemos a PBX1a como homologo funcional de CEH-20 reforzando así la hipótesis de una posible conservación evolutiva en la diferenciación a neurona dopaminérgica entre nematodos y mamíferos.