[en] RhoA is a small GTPase with an important role in key cellular processes. RhoA expression levels and/or activity are altered in multiple cancers, but interestingly, recurrent and tissue-specific hotspot mutations have been recently identified in diffuse gastric cancer (DGC), head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), Burkitt lymphoma, adult T-cell leukemia/lymphoma and angioimmunoblastic T-cell lymphoma, suggesting a distinctive and tumor-dependent role of each mutant protein. In this work, seven recurrent RHOA mutations have been functionally characterized. Our results indicate that some RhoA mutants display lower protein stability and a predominant nuclear localization compared to the wild-type (wt) RhoA. Moreover, the evaluation of the effects of mutant RhoA overexpression on the cytoskeleton organization showed a general reduction in the formation of actin filaments, and a higher cell adhesion capacity. Finally, we observed a reduced NFkB and serum response factor signaling in most of the hotspot RhoA mutants studied. To dissect the molecular mechanisms deregulated due to RhoA mutations, we investigated the protein interactome. Binding of the different RhoA mutants to Rhotekin effector protein trough a pull-down assay was dependent on RhoA protein levels. A yeast-two-hybrid system approach between RhoA forms and the most common RhoA effector proteins, evidenced that all the studied DGC mutants were unable to bind to PKN1; whereas, the HNSCC hotspot mutant RhoA E40Q failed to bind to NET1 and kinectin. HNSCC is a very heterogeneous group of cancers. The lack of survival improvement and personalized treatments has promoted an active research into the molecular mechanisms of HNSCC. RHOA is mutated only in around of 1.5% of the HNSCC cases, but interestingly, more than 60% of these mutations occur in E40Q, suggesting a possible active role in the tumorigenic process. Immunohistochemical analysis of RhoA expression in HNSCC tissue microarray indicated that RHOA expression is associated with shorter survival outcomes in patients with larynx tumors. To study the role of wt RhoA in HNSCC, we engineered isogenic cell line systems downregulated for RHOA through the directed targeting of RHOA by shRNA (RHOA KD) and by CRISPR/Cas9 technology (RHOA KO). Results showed an impairment of cell growth in vitro and in vivo, as well as a decrease of the migration potential in vitro, both in tongue and larynx-derived tumor cell lines. These results confirm that RHOA acts as an oncogene in HNSCC. Next, the role of E40Q hotspot mutation was evaluated in doxycycline-inducible RhoA overexpressing cell systems. Surprisingly, RhoA wt or E40Q overexpression in pharynx cells reduced cell growth in vitro. Hence, we decided to re-introduce RhoA wt or E40Q in tongue and larynx cell lines RHOA KD and RHOA KO cell systems. Intriguingly, the reintroduction of RhoA wt and E40Q did not affect cell growth and migration capabilities of the cells. Altogether, the unprecedented tumor-type-dependent complexity in the mutational landscape of RhoA and our results indicate that the different RhoA hotspot mutations exhibit different oncogenic roles. Furthermore, specifically in HNSCC we demonstrate that RhoA provides a growth advantage for the cancer cells supporting a possible oncogenic role of RhoA in this tumor type.

[es] RhoA es una proteína GTPasa con un papel relevante en importantes procesos celulares. Los niveles de expresión de RhoA y/o su actividad se encuentran alterados en muchos tipos de cáncer, pero curiosamente, se han encontrado mutaciones recurrentes y específicas de tumor en cáncer gástrico de tipo difuso (CGD), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), linfoma de Burkitt, leucemia/linfoma T del adulto y linfoma T angioinmunoblástico, sugiriendo un papel distinto y dependiente de tumor para cada proteína mutante. En este trabajo hemos caracterizado a nivel funcional siete de las mutaciones recurrentes en RHOA. Nuestros resultados indican que, algunos de los mutantes exhiben una disminución en la estabilidad de la proteína y una localización predominante en el núcleo en comparación con la proteína RhoA nativa. Además, la evaluación de los efectos de la sobreexpresión de las formas de RhoA mutadas en la organización del citoesqueleto mostró una reducción general en la formación de filamentos de actina, y una mayor capacidad de adhesión a sustrato. Finalmente, la mayoría de los mutantes estudiados mostraron una señalización dependiente de las vías NFkB y del factor de respuesta sérica reducida. Para conocer los mecanismos moleculares desregulados por las mutaciones de RhoA, se evaluó su interactoma. La capacidad de unión de las diferentes proteínas mutantes de RhoA a Rhotekina resultó ser dependiente de su estabilidad proteica. Además, la evaluación de a interacción entre las diferentes proteína RhoA y sus efectores más comunes mediante un sistema de doble híbrido en levadura, demostró la incapacidad de todos los mutantes de DGC estudiados de unir a PKN1. Sin embargo, el mutante de CCECC RhoA E40Q resultó deficiente en la unión a NET1 y kinectina. El CCECC es un grupo muy heterogéneo de cánceres. Las carencias en la mejora de la supervivencia y en los tratamientos personalizados han promovido la investigación activa de los mecanismos moleculares asociados su desarrollo. Aunque RHOA está mutado sólo en el 1,5% de los pacientes de CCECC, más del 60% de estas mutaciones ocurren en E40Q, lo que sugiere un papel determinante en el proceso de carcinogénesis. La evaluación inmunohistoquímica de los niveles de RhoA en muestras de tejido de CCECC indicó que la expresión de RhoA se asocia con una peor supervivencia en pacientes con tumores de laringe específicamente. Para estudiar el papel de RhoA nativa en CCECC, se generaron líneas celulares isogénicas deplecionadas de RHOA mediante ARN de interferencia (RHOA KD) e inactivación genética mediante la tecnología CRISPR/Cas9 (RHOA KO). Los resultados mostraron una ralentización del crecimiento celular in vitro e in vivo, así como una disminución del potencial de migración in vitro en líneas celulares tumorales derivadas de lengua y laringe. Estos resultados confirman que RHOA actúa como un oncogén en CCECC. Seguidamente, se evaluó el papel de la mutación E40Q en sistemas celulares de sobreexpresión de RhoA de manera inducible con doxiciclina. Sorprendentemente, la sobreexpresión de RhoA nativa o E40Q en células de faringe redujo el crecimiento celular in vitro. Por consiguiente, decidimos reintroducir RhoA nativa o E40Q en los sistemas celulares de lengua y laringe RHOA KD y RHOA KO generados previamente. Curiosamente, la reintroducción de RhoA nativa y E40Q no afectó el crecimiento celular ni las capacidades de migración de las células. En conjunto, la complejidad del patrón mutacional de RHOA sin precedentes, específico del tipo de tumor, y nuestros resultados muestran que los distintos mutantes de RhoA presentan diferentes papeles oncogénicos. Además, demostramos que RhoA en CCECC proporciona una ventaja de crecimiento para las células tumorales que apoyan el posible papel oncogénico en este tipo tumoral.