[ca] La microscòpia de fluorescència ha evolucionat enormement en l'última dècada. L'arribada de les tècniques de super-resolució ha portat als investigadors a explorar àrees de la biologia que eren inabastables anteriorment. Aquestes tècniques han permès no només millorar la resolució espacial en imatges sinó també la possibilitat de realitzar mesures quantitatives al nivell d'una sola molècula. L'interès en aquest camp ha anat creixent al llarg dels anys i s'han desenvolupat noves tècniques, cada cop més sofisticades. La neurociència ha sigut un camp tradicionalment dirigit per les noves tecnologies, amb mètodes com la tècnica de la fixació de membranes i la microscòpia d'excitació de dos fotons que han revolucionat la nostra manera d'entendre el funcionament de les cèl·lules del cervell. Per això, no es sorprenent que la neurociència hagi sigut un dels primers camps en adaptar-se i beneficiar-se de la microscòpia de super-resolució. Aquestes tècniques han obert una nova finestra d'oportunitats per a revelar l'organització espacial al citoesquelet neuronal i l'organització molecular i dinàmica de la sinapsi. Totes dues estructures estan per sota del límit de resolució espacial de la microscòpia de llum convencional. L'organització de les proteïnes i la seva estequiometria son clau per a la transmissió sinàptica en neurones. El coneixement dels nombres absoluts de proteïnes que juguen un paper crucial en malalties pot tenir un interès enorme per a entendre els mecanismes que porten a disfuncions neurològiques. En aquesta tesi hem explotat les tècniques de super-resolució per a desenvolupar un mètode pioner per a mesures quantitatives d'una sola molècula i per a revelar l'organització d'un complex de proteïnes sinàptiques que no s'havia visualitzat fins llavors amb resolució espacial a nanoescala. El capítol 1 posa en context el camp de la neurociència al nivell nanomètric. S'introdueixen les parts principals de les neurones i s'explica la importància de conèixer l'estequiometria molecular en complexes proteínics sinàptics. Al capítol 2 es descriuen les tècniques de microscòpia de fluorescència en super-resolució, emfatitzant les seves característiques més rellevants. Addicionalment, s'expliquen diferents exemples d'aquestes tècniques implementades en neurones. Adaptacions d'aquests exemples són alguns dels mètodes emprats en aquesta tesi. El capítol 3 mostra un mètode nou que hem desenvolupat per a quantificar l'eficiència de fotoactivació de diferents proteïnes fluorescents fotocommutables, utilitzades de forma habitual als experiments de super-resolució com PALM. Vam utilitzar el receptor de glicina com a model per la seva estequiometria ja coneguda. Aprofitant aquest model, vam etiquetar vuit proteïnes fluorescents fotocommutables (mEos2, 3.1 i 3.2, mclavGR2, mMaple, PA-GFP i PA-mCherry) a les subunitats α i β del receptor de glicina i les vam transfectar a oòcits de Xenopus. El fet que les proteïnes fluorescents estiguin codificades genèticament les fa especialment adequades per a quantificar proteïnes individualment. L'eficiència de fotoactivació, és a dir, el percentatge que una proteïna fluorescent es fotoactivi a una forma fluorescent detectable, juga un paper crucial per a la correcta interpretació de mesures quantitatives. El capítol 4 està centrat en l'obtenció d'imatges en super-resolució d'un complex proteínic sinàptic, anomenat complex de LGI1. Aquest conjunt de proteïnes és un dels actors principals involucrats en certs trastorns neuronals. Leucine rich glioma activated 1 (LGI1) és una proteïna neuronal que forma un pont trans-sinàptic unint proteïnes de membrana pre- i post-sinàptiques (ADAM22 i ADAM23) i ajuda en l'organització d'un complex multimèric en la sinapsi que inclou receptors AMPA i canals de potassi dependents del voltatge (VGKC). L'encefalitis autoimmune de LGI1 es un trastorn neuropsiquiàtric sever re relacionat amb epilèpsia en que els pacients produeixen anticossos contra LGI1, alterant la plasticitat sinàptica. Tanmateix, els mecanismes moleculars que desemboquen als problemes observats en pacients encara són bastant desconeguts. Fent servir marcadors sinàptics que han estat altament caracteritzats (Homer i Bassoon) com estàndards moleculars, hem determinat la posició de LGI1 i les altres proteïnes relacionades a l'espai sinàptic en resolució a nanoescala gràcies a la tècnica de STORM en multi-color. A més, la comparació d'aquesta arquitectura molecular en neurones sanes i neurones tractades amb anticossos de pacients amb encefalitis autoimmune de LGI1 va mostrar que aquests anticossos causen un impacte en l'organització de les proteïnes presinàptiques. Aquests resultats suggereixen una pèrdua de la interacció de LGI1 amb proteïnes presinàptiques a causa dels anticossos enllaçats i donen una visió més clara en els primers canvis en la patologia. El capítol 5 resumeix tots els resultats assolits en aquesta tesi i mostra una visió de les direccions futures possibles per a complementar els resultats aconseguits o proporcionar idees noves per a resoldre les noves qüestions derivades dels resultats.

[en] The arrival of super-resolution techniques has driven researchers to explore biological areas that were unreachable before. Such techniques not only allowed the improvement of spatial resolution in images but also the possibility to perform quantitative measurements at the single-molecule level. The interest in that particular field has been growing over the years and new and more sophisticated tools have been developed. Neuroscience has been one of the first fields to adapt and benefit from super-resolution microscopy. These techniques opened a new window of opportunity to reveal spatial organization of the neuronal cytoskeleton and the molecular organization and dynamics of the synapse, structures below the spatial resolution limit of conventional light microscopy. Protein organization and stoichiometry is central for synaptic transmission in neurons. Knowing the absolute numbers of proteins playing a key role in diseases can be of extreme interest in order to understand the mechanisms that lead to such neurological disorders. In this thesis we exploited the super-resolution techniques to develop a pioneering method for quantitative single-molecule measurements and to unravel the organization of a synaptic protein complex that was never visualized before with nanoscale spatial resolution. We developed a novel method in order to quantify the photoactivation efficiency of eight different photoswitchable fluorescent proteins commonly used in super-resolution experiments. We used the glycine receptor as a template because of its well-known stoichiometry and tagged eight different photoswitchable fluorescent proteins to the a- and ß-subunits of this receptor and transiently transfected them to Xenopus oocytes. The fact that the fluorescent proteins are genetically encoded make them highly suitable for quantitative single-molecule counting. The photoactivation efficiency, which is the percentage of a fluorescent protein that photoactivates into a fluorescently detectable form, plays a critical role in properly interpreting quantitative measurements. Moreover, we also focused our studies on super-resolution imaging of a synaptic protein complex, called LGI1 complex. This ensemble of proteins is one of the main key players involved in different neurological disorders. Leucine rich glioma activated 1 (LGI1) is a neuronal protein that forms a trans-synaptic bridge linking pre- and postsynaptic transmembrane proteins (ADAM22 and ADAM23) and helps to organize a multimeric complex at the synapse including AMPA receptors and voltage-gated potassium channels (VGKC). LGI1 autoimmune encephalitis is a severe neuropsychiatric disorder related to epilepsy where the patients produce autoantibodies against LGI1, which alter synaptic plasticity. However, the molecular mechanisms that lead to the observed problems in patients still remain largely unknown. Using well-characterized synaptic markers as molecular standards, we determined the positioning of LGI1 and the other related proteins within the synaptic space at nanoscale resolution by means of multi-color STORM. Further, the comparison of this molecular architecture in healthy neurons versus neurons treated with antibodies from patients suffering from LGI1 autoimmune encephalitis showed that these antibodies impact the nanoscale organization of pre-synaptic proteins. These results suggested a loss of LGI1 interaction with pre-synaptic proteins upon antibody binding and gave further insight into early changes in pathology.