[en] Sandhoff and Tay-Sachs diseases are autosomal recessive lysosomal storage diseases caused by the deficiency in β-hexosaminidase A (HEXA), an enzyme required to catabolize GM2 ganglioside. HEXA is composed of α and β subunits, encoded by HEXA and HEXB genes, respectively. Mutations in HEXA gene lead to Tay-Sachs disease, while mutations in HEXB gene lead to Sandhoff disease. Patients affected by Sandhoff or Tay-Sachs diseases show severe, progressive neurodegeneration with clinically indistinguishable devastating pathology To date, there is no cure for these diseases. Thus, an in vivo gene therapy with adeno-associated viral (AAV) vectors for the treatment of Tay-Sachs and Sandhoff disease offers the possibility of lifetime treatment. Therefore, the present doctoral thesis was focused on the development of a novel gene therapy approach based on a single intra-cerebrospinal fluid (CSF) administration of new dual AAV9 vectors encoding simultaneously for both HexA and HexB genes fused with a short flexible linker. The first part of this work consisted in a brief characterization of pathophysiological alterations in Tay-Sachs and Sandhoff mouse models. Afterwards, this new gene therapy strategy was tested in Sandhoff and Tay-Sachs mouse models. After treatment, Tay-Sachs and Sandhoff mice correctly expressed HEXA enzyme in the whole central nervous system (CNS). Moreover, AAV-treated Sandhoff mice showed reversion of primary GM2 and secondary (GAG and cholesterol) storage and normalization of lysosomal pathology in CNS, leading to correction of myelinization, autophagy and neuroinflammation. After AAV delivery, liver was efficiently transduced and allowed to secrete HEXA into circulation and correct peripheral GAG and cholesterol storage and lysosomal pathology of Sandhoff disease. This was paralleled to normalization of behavioral deficits, such as locomotor alterations, coordination, and mobility. Furthermore, this treatment markedly extended lifespan (about two years), much longer than the co-administration of two single vectors (AAV9-HexA and AAV9-HexB) (about 10 months of age). Altogether, our results demonstrated that intra-CSF administration of AAV9-HexA-HexB dual vectors led to whole-body correction of both CNS and peripheral Sandhoff disease, laying the foundation for the clinical translation to treat human patients.

[es] Las enfermedades de Sandhoff y Tay-Sachs son unas enfermedades de acúmulo lisosomal de herencia autosómica recesiva, causada por la deficiencia de la β-hexosaminidasa A (HEXA), una enzima necesaria para la degradación del gangliósido GM2. HEXA está formada por las subunidades α y β, codificadas por los genes HEXA y HEXB, respectivamente. Mutaciones en el gen HEXA dan lugar a la enfermedad de Tay-Sachs, mientras que mutaciones en el gen HEXB provocan la enfermedad de Sandhoff. Los pacientes afectados por las enfermedades de Sandhoff y Tay-Sachs presentan una neurodegeneración severa y progresiva con una patología devastadora clínicamente indistinguible entre ambas. Actualmente, no existe ningún tratamiento eficaz para estas enfermedades. Así pues, una terapia génica in vivo con vectores virales adenoasociados (AAV) para el tratamiento de las enfermedades de Sandhoff y Tay-Sachs ofrece la posibilidad de un tratamiento a largo plazo. Por lo tanto, la presente tesis doctoral se centró en el desarrollo de una nueva aproximación de terapia génica basada en una única administración directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de unos nuevos vectores AAV9 duales que codificaban simultáneamente por los genes HexA y HexB unidos con un linker pequeño y flexible. La primera parte de este trabajo consistió en una breve caracterización de las principales alteraciones fisiopatológicas en los modelos de ratón de Sandhoff y Tay-Sachs, en los cuales, posteriormente, se testó nuestra nueva estrategia de terapia génica. Tras el tratamiento, los ratones Tay-Sachs y Sandhoff expresaban correctamente la enzima HEXA en todo el sistema nervioso central (SNC). Además, los ratones Sandhoff tratados con los vectores AAV9 duales mostraron la reversión de la acumulación primaria de GM2 y secundaria (GAG y colesterol) y la normalización de la patología lisosomal en el SNC, dando lugar a la corrección de la mielinización, la autofagia y la neuroinflamación. Después de la administración de los vectores AAV, el hígado se transdujo eficientemente y permitió la secreción d'HEXA en la circulación y la corrección de la acumulación periférica de GAG y colesterol y la patología lisosomal de la enfermedad de Sandhoff. El tratamiento también condujo a una normalización de las alteraciones del comportamiento, como por ejemplo las alteraciones locomotoras, de coordinación y movilidad. Además, este tratamiento prolongó significativamente la esperanza de vida (alrededor de dos años), que fue mucho más que la supervivencia conseguida tras la co-administración de los vectores simples AAV9-HexA y AAV9-HexB (alrededor de 10 meses). En conjunto, nuestros resultados demostraron que la administración intra-LCR de los vectores duales AAV9-HexA-linker-HexB resultó en una completa corrección de la patología del SNC y periférica de la enfermedad de Sandhoff, siendo la base para la translación clínica para el tratamiento de pacientes humanos.