[ca] La MNGIE és una malaltia metabòlica rara causada per mutacions recessives en el gen TYMP, el qual codifica per l'enzim TP. Això causa una acumulació sistèmica de nucleòsids que provoca toxicitat mitocondrial, i normalment acaba sent letal durant les primeres dècades de vida. L'objectiu d'aquest treball era aconseguir una integració eficaç de l'ADNc humà de TYMP dins d'un intró dels gens Tymp i Alb en hepatòcits per l'acció coordinada de dos elements: la CRISPR/Cas9 i els templates amb l'ADNc de TYMP. Aquests templates van ser dissenyats per a ser integrats en una regió subseqüent a un promotor genòmic, de manera que l'expressió de l'ADNc de TYMP estaria sota el seu control. En el cas del locus Alb, l'edició gènica correcta produiria una proteïna híbrida Alb-hTP que tindria capacitat secretora. Amb aquesta aproximació, els hepatòcits serien editats permanentment i l'ADNc de TYMP seria expressat a llarg termini, de manera que es resoldria el problema de pèrdua d'expressió del transgèn sovint detectada en teràpies gèniques convencionals. Es van provar dues estratègies diferents. En la primera, els ARNs de la CRISPR/Cas9 varen ser introduïts per nanopartícules (NPs). Això va permetre una expressió elevada però transitòria. Es van provar dues NPs diferents: les NPs polimèriques (PNPs) de GEMAT-IQS, i les NPs lipídiques (NPLs) d'Acuitas Therapeutics®. En la segona estratègia, el sistema CRISPR/Cas9 va ser lliurat com a ADN dins de vectors AAV. Els resultats in vitro i in vivo van corroborar que l'ADNc de TYMP podia ser inserit amb èxit en els dos loci. També vam corroborar la presència d'ARNm de TYMP i de proteïna TP funcional dins les cèl·lules editades. L'experimentació in vivo es va fer amb el model de ratolí de MNGIE. Els nivells plasmàtics de Thd i dUrd dels animals tractats van ser monitorats per valorar l'eficiència de les diferents estratègies d'edició gènica. Els millors resultats es van obtenir en els animals tractats amb les NPLs que portaven els ARNs de la CRISPR/Cas9 i els vectors rAAV2/8 que portaven els templates d'ADN. Aquests ratolins van presentar una correcció bioquímica estable i consistent que es va correlacionar amb la presència d'ARNm TYMP i d'enzim TP funcional en les cèl·lules del fetge. A més, els ratolins editats en el locus Alb van presentar una activitat TP significativa en plasma, el qual confirma que l'enzim híbrid pot ser secretat amb èxit tot mantenint la seva activitat en plasma. Tanmateix, la reducció de nivells plasmàtics de nucleòsids no va ser suficient per assolir els nivells detectats en els ratolins WT, de manera que hi ha espai per a l'optimització. Sorprenentment, en alguns casos l'edició gènica es va produir en absència de la CRISPR/Cas9, el qual suggereix que els templates d'ADN sols podrien provocar la inserció correcta a través de recombinació homòloga. Tots aquests resultats confirmen que la nostra estratègia d'edició gènica és viable, tot i que necessitem augmentar l'eficiència global del procediment per aconseguir una correcció bioquímica total en el model de MNGIE.

[es] El MNGIE es una enfermedad metabólica rara causada por mutaciones recesivas en el gen TYMP, el cual codifica la enzima TP. Esto causa una acumulación sistémica de nucleósidos que provoca toxicidad mitocondrial, y normalmente acaba siendo letal durante las primeras décadas de vida. El objetivo de este trabajo era conseguir una integración eficaz del ADNc humano de TYMP dentro de un intrón de los genes Tymp y Alb en hepatocitos por la acción coordinada de dos elementos: la CRISPR/Cas9 y los templates con el ADNc de TYMP. Estos templates fueron diseñados para ser integrados en una región subsecuente a un promotor genómico, de forma que la expresión del ADNc de TYMP estaría bajo su control. En el caso del locus Alb, la edición génica correcta produciría una proteína híbrida Alb-hTP que tendría capacidad secretora. Con esta aproximación, los hepatocitos serían editados permanentemente y el ADNc de TYMP sería expresado a largo plazo, de forma que se resolvería el problema de pérdida de expresión del transgén a menudo detectada en terapias génicas convencionales. Se probaron dos estrategias diferentes. En la primera, los ARNs de la CRISPR/Cas9 fueron introducidos por nanopartículas (NPs). Esto permitió una expresión elevada pero transitoria. Se probaron dos NPs diferentes: las NPs poliméricas (PNPs) de GEMAT-IQS, y las NPs lipídicas (NPLs) de Acuitas Therapeutics®. En la segunda estrategia, el sistema CRISPR/Cas9 fue librado como ADN dentro de vectores AAV. Los resultados in vitro e in vivo corroboraron que el ADNc de TYMP podía ser insertado con éxito en los dos loci. También corroboramos la presencia de ARNm de TYMP y de proteína TP funcional dentro de las células editadas. La experimentación in vivo se hizo con el modelo de ratones de MNGIE. Los niveles plasmáticos de Thd y dUrd de los animales tratados fueron monitorizados para valorar la eficiencia de las diferentes estrategias de edición génica. Los mejores resultados se obtuvieron en los animales tratados con las NPLs que llevaban los ARNs de la CRISPR/Cas9 y los vectores rAAV2/8 que llevaban los templates de ADN. Estos ratones presentaron una corrección bioquímica estable y consistente que se correlacionó con la presencia de ARNm TYMP y de enzima TP funcional en las células del hígado. Además, los ratones editados en el locus Alb presentaron una actividad TP significativa plasma, lo cual confirma que la enzima híbrida puede ser secretada con éxito manteniendo su actividad en plasma. Aun así, la reducción de niveles plasmáticos de nucleósidos no fue suficiente para lograr los niveles detectados en los ratones WT, de forma que hay espacio para la optimización. Sorprendentemente, en algunos casos la edición génica se produjo en ausencia de la CRISPR/Cas9, lo cual sugiere que los templates de ADN solos podrían provocar la inserción correcta a través de recombinación homóloga. Todos estos resultados confirman que nuestra estrategia de edición génica es viable, a pesar de que necesitamos aumentar la eficiencia global del procedimiento para conseguir una corrección bioquímica total en el modelo de MNGIE.