[en] This Doctoral Thesis entitled "INVESTIGACIÓN DE BIOCOMPUESTOS POLIFENÓLICOS CON POTENCIAL ANTIMICROBIANO PARA EL DISEÑO Y DESARROLLO DE PRODUCTOS DE APLICACIÓN EN BIOMEDICINA" digs into the antimicrobial capacity of propolis and rosemary extract (carnosic acid) against different bacteria and fungi. The investigation ranges from the elementary research to the industrial application and the main objectives are listed below: • Evaluation of the antifungal effect of propolis (P3) and carnosic acid (CA) against different bacteria and fungi (Candida y Cryptococcus) for comparative purposes related to their efficacy, in order to know the breadth of its action spectrum. • Isolate and identify the main compounds present in propolis responsible for its antifungal properties. • Propose possible mechanisms involved in the antifungal capacity of both natural extracts. • Study the potential use of these compounds at an industrial level, formulating a commercial product of wide use such as a dental gel. Moreover, using this dental gel to carry out the relevant in vitro tests and accomplish a biomedical intervention trial in humans to study its efficacy in vivo. The experimentation performed has consisted of different complementary methods, such as determination of cell viability in liquid medium, formation of macroscopic colonies in solid YPD medium or MICs calculation (minimum antifungal concentration necessary to inhibit the proliferation of an inoculum standardized). Additionally, studies on cell morphology have been carried out. In later stages, HPLC and LC / MS analysis have been necessary to determine and isolate the active P3 biocompounds, a key aspect to formulate hypotheses of the action mechanisms. Finally, and due to the industrial nature of this Doctoral Thesis, a dental gel has been manufactured as a prototype for the actual application of the active ingredients (CA and P3) that has undergone in vitro tests to verify its efficacy and stability. Afterwards, a biomedical intervention trial in humans was conducted. The main results obtained can be summarized in the following conclusions: • Propolis has a limited antifungal activity against different fungi, being in general, that of higher carnosic acid. • The combination of certain propolis with a chromatographic profile similar to that of P3 with CA is synergistic, and has antifungal activity against different strains of different Candida albicans, Candida glabrata, as well as Cryptococcus neoformans. • The identification of the P3 active compounds begins with the determination of its most antifungal fraction and ends with Z as the potential active compound. • The results obtained exhibit the existence of a synergistic fungicidal action induced by the combination of CA and P3. Furthermore, this breakthrough supports the continuous search for more natural bioactive molecules, for the purpose of their application in clinical therapies against C. albicans and possibly against other pathogenic fungi. This strategy would avoid the undesirable harmful side effects caused by some conventional antifungals. • Different hypotheses are formulated on the mechanisms of action of CA + P3 but none are conclusive, so future research is necessary. Nevertheless, one of the possible mechanisms based on the pro-oxidant capacity of some polyphenols, which can cause toxic effects, seems plausible. • Conveying CA + P3 in a widely used product such as dental gel, is totally satisfactory, both for its in vitro efficacy and for its stability. This dental gel was undergoing an in vivo trial on patients subject to antitumor treatments and with evidence of oral candidiasis. The results was quite successful considering that 85% of the patients experienced some clinical improvement. At the molecular level 60% of them had a positive response. Furthermore, 82% of participants stated that they would use the gel outside of the study.

[es] La presente Tesis Doctoral titulada "INVESTIGACIÓN DE BIOCOMPUESTOS POLIFENÓLICOS CON POTENCIAL ANTIMICROBIANO PARA EL DISEÑO Y DESARROLLO DE PRODUCTOS DE APLICACIÓN EN BIOMEDICINA" investiga desde niveles muy básicos, la capacidad antimicrobiana del propóleo y del extracto de romero (ácido carnósico) sobre diferentes bacterias y hongos. Los principales objetivos del proyecto son los siguientes: • Evaluación del efecto antifúngico del propóleo (P3) y del ácido carnósico (CA) frente a diferentes bacterias y hongos (Candida y Cryptococcus) con fines de eficacia comparativa para conocer la amplitud de su espectro de acción. • Aislar e identificar los principales compuestos presentes en el propóleo responsables de sus propiedades antifúngicas. • Proponer posibles mecanismos implicados en la capacidad antifúngica de ambos extractos naturales. • Estudiar el potencial uso de estos compuestos a nivel industrial, formulando para ello un producto comercial de amplio uso como un gel dental. Llevar a cabo los ensayos in vitro pertinentes y realizar un ensayo de intervención biomédica en humanos con el que estudiar su eficacia in vivo. La experimentación llevada a cabo ha consistido en distintos métodos complementarios como la determinación de la viabilidad celular en medio líquido, la formación de colonias macroscópicas en medio YPD sólido o el cálculo de las MICs (concentración de antifúngico mínima necesaria para inhibir la proliferación de un inóculo estandarizado). Adicionalmente, se han realizado estudios sobre la morfología celular. En etapas posteriores, ha sido necesario el análisis HPLC y LC/MS para determinar y aislar los biocompuestos activos del P3, aspecto clave para formular hipótesis de los mecanismos de actuación. Por último y dado el carácter industrial de la presente Tesis Doctoral, se ha fabricado un gel dental como prototipo de aplicación real de los ingredientes activos (CA y P3), que ha sido objeto de ensayos in vitro para comprobar su eficacia y su estabilidad, previamente a la realización de un ensayo de intervención biomédica en humanos. Los principales resultados obtenidos se pueden resumir en las siguientes conclusiones: 1. El propóleo posee una actividad antifúngica limitada frente a diferentes hongos, siendo, en general, la del ácido carnósico superior. 2. La combinación de ciertos propóleos con un perfil cromatográfico similar al del P3 con CA es sinérgica y posee actividad antifúngica frente a cepas de diferente procedencia de Candida albicans, Candida glabrata, así como de Cryptococcus neoformans. 3. La identificación de los compuestos del P3 se inicia con la determinación de la fracción con mayor poder antifúngico y finaliza con Z como el potencial compuesto activo. 4. Los resultados obtenidos evidencian la existencia de una acción fungicida sinérgica inducida por la combinación de CA y P3. Además, respaldan la búsqueda continua de moléculas bioactivas más naturales, con el propósito de su aplicación en terapias clínicas contra C. albicans y posiblemente, contra otros hongos patógenos. Esta estrategia permitiría evitar los indeseables efectos secundarios nocivos provocados por algunos antifúngicos convencionales. 5. Se formulan diferentes hipótesis sobre los mecanismos de actuación de CA+P3 pero ninguna es concluyente, por lo que son necesarias futuras investigaciones. Uno de los posibles mecanismos se basa en la capacidad pro-oxidante del algunos polifenoles, pudiendo provocar efectos tóxicos. 6. La vehiculación de CA+P3 en un producto de amplio uso como es el gel dental, es totalmente satisfactoria, tanto por su eficacia in vitro como por su estabilidad. En un ensayo de intervención en humanos sometidos a tratamientos antitumorales y con evidencias de candidiasis bucal, se utilizó dicho gel dental. Los resultados indicaron que el 85% de los pacientes experimentaron alguna mejoría clínica, y a nivel molecular el 60% tuvo una respuesta positiva. Por último, indicar que el 82% afirmó que utilizaría el gel fuera del estudio.