[en] Next-generation sequencing (NGS) has completely changed the way the microbial world is studied. Illumina platforms have been the most widely used DNA sequencers during the last 8-10 years. However, Nanopore sequencing, a third-generation sequencing method powered by Oxford Nanopore Technologies (ONT), is becoming increasingly popular due to its multiple advantages over NGS, including portability and the ability to read long DNA molecules in real time. Despite these improvements, the adoption of ONT platforms has been hampered by the higher error rate of this technology compared to Illumina. This thesis aimed at optimizing Nanopore sequencing to analyze microbial communities of industrial and/or biotechnological interest. Specifically, this sequencing technique was evaluated for its use in three different applications: industrial monitoring, microbial bioprospecting and metagenome assembly. In the first case, metataxonomic sequencing was applied to characterize the archaeal and bacterial communities involved in the production of biogas, which is an industrially relevant biofuel obtained by anaerobic digestion (AD). This work enabled to measure the effect of different operating parameters on the AD microbiome and to detect microbial markers associated with an improved production of biogas. Secondly, in situ Nanopore sequencing was used to study several samples during a bioprospecting expedition to the Tabernas Desert (Almeria, Spain). Microbiome analyses were focused on the detection of radiation- and desiccation-resistant bacteria, which were the target of the bioprospecting activities. Nanopore data was consistent with the results obtained by culture methods, thus demonstrating that portable sequencing can be used to predict the biotechnological potential of the samples in situ. Finally, the impact of Nanopore sequencing on metagenome assembly was investigated by using data generated from mock communities with different levels of complexity. After benchmarking various assembly tools, metaFlye showed the best overall performance, retrieving highly contiguous genomes directly from metagenomic data. Altogether, this thesis proves that ONT platforms can be efficiently applied to characterize biotechnologically-relevant ecosystems. Moreover, future directions of Nanopore sequencing are critically discussed considering all the advantages and limitations of this technology.

[es] La secuenciación de siguiente generación (NGS) ha cambiado completamente la manera en la que estudiamos el mundo microbiano. A lo largo de los últimos años, las plataformas Illumina han sido las más usadas para secuenciar ADN. No obstante, la secuenciación por nanoporos, un nuevo método impulsado por Oxford Nanopore Technologies (ONT), está incrementando gradualmente su popularidad dadas sus múltiples ventajas sobre las plataformas NGS. Estas ventajas incluyen la portabilidad y la capacidad para generar secuencias largas en tiempo real. A pesar de estos avances, la adopción de la secuenciación ONT se ha visto limitada por la elevada tasa de error asociada a esta tecnología en comparación con Illumina. El objetivo de la presente tesis fue optimizar la secuenciación por nanoporos para analizar comunidades microbianas de interés industrial y/o biotecnológico. Específicamente, se evaluó el uso de esta técnica de secuenciación para tres aplicaciones diferentes: la monitorización industrial, la bioprospección microbiana y el ensamblaje metagenómico. En el primer caso, se estudiaron las comunidades microbianas implicadas en la producción de biogás, un combustible obtenido por digestión anaerobia (DA), mediante secuenciación metataxonómica. Este trabajo permitió medir el efecto de diferentes parámetros sobre los microbiomas responsables de la DA y detectar marcadores microbianos relacionados con una producción optimizada de biogás. En segundo lugar, se usó la secuenciación ONT in situ para caracterizar distintas muestras durante una expedición de bioprospección al Desierto de Tabernas (Almería, España). Los análisis bioinformáticos se centraron en detectar bacterias resistentes a la radiación y a la desecación, que eran el objetivo de la bioprospección. Los datos obtenidos mediante secuenciación fueron consistentes con los resultados de las técnicas de cultivo, demostrando que la secuenciación portátil puede ser usada para predecir el potencial biotecnológico de las muestras in situ. Finalmente, se investigó el impacto de la secuenciación ONT en el ensamblaje metagenómico usando datos generados a partir de comunidades microbianas artificiales. Después de evaluar varias herramientas de ensamblaje, metaFlye mostró el mejor rendimiento, permitiendo recuperar varios genomas extremadamente contiguos directamente desde el metagenoma. En términos generales, esta tesis evidencia que las plataformas ONT pueden ser aplicadas con éxito para caracterizar microbiomas de relevancia biotecnológica y analiza críticamente las direcciones futuras de la secuenciación por nanoporos, teniendo en cuenta las limitaciones y ventajas de esta tecnología.