[en] Visceral leishmaniosis is a severe parasitic disease that is usually fatal if left untreated, which has an incidence of more than 500 000 new human cases each year. In zoonotic visceral leishmaniasis (ZVL) caused by Leishmania infantum, dogs are the main domestic reservoirs of the parasite. Identification of the antigens and components involved in Lesihmania-specific immune responses to improve diagnosis and vaccination is a research priority. Our objective has been to evaluate the utility of four evolutionarily conserved antigens of L. infantum KMPII, TRYP, LACK and papLe22 in ZVL control by using them in diagnostic and vaccine strategies. We used baculovirus-infected Trichoplusia ni larvae to obtain the raw protein extracts containing the recombinant Leishmania proteins. This is a eukaryotic system and generally allows the production of high quality proteins processed with most of the post-translational modifications. Recombinant KMPII was the most recognized antigen by dogs with clinical signs of leishmaniosis (CanL), with a 75% of seroprevalence. Seroprevalence against rTRYP and rLACK in dogs with CanL, was of 51% and 42%, respectively. The results demonstrate that KMPII, TRYP, and rLACK antigens are B-cell immunogens during CanL. When the three recombinant antigen-based ELISA techniques were evaluated in parallel, almost perfect agreement with CTLA-based ELISA was observed, with a specificity of 97% and a sensitivity of 93% in relation to CTLA-based ELISA, offering a sensitive, specific, reproducible and inexpensive diagnostic tool. rTRYP induced the highest number of positive DTH responses (50%) in infected dogs from an endemic area, suggesting its role as a T-cell immunogen during natural infection. In contrast, rKMPII (27%), rLACK (18%), and rpapLe22 (18%) induced a lower number of reactions, thus proving to be weak T-cell immunogens. When TRYP-DTH and KMPII-DTH tests were evaluated in parallel, 78% of LST-positive dogs were detected, not differing significantly from LST sensitivity. Our results suggest that TRYP antigen could be a promising vaccine candidate against CanL, and that both rTRYP and rKMPII could be considered as components of a standardized DTH immunodiagnostic tool for infected dogs without clinical signs. DNA-Protein vaccination in hamsters carrying the four antigens stimulated significant production of NO by macrophages before challenge and showed a decrease in the specific humoral response against the parasite upon in vivo challenge. A significant reduction in parasite loads was observed at 20 weeks post-infection, both in spleen (86 %) and in blood (99 %) when compared with controls. Moreover, this vaccine prevented certain histopathological alterations that have been related to disease. DNA-Protein vaccination enhanced the immunogenicity and protection achieved by the DNA vaccine, which could neither stimulate NO production nor reduce parasitaemia. Recombinant protein vaccine was not protective. The results suggest that a prime-boost strategy with DNA and T. ni-derived rKMPII, rTRYP, rLACK, and rpapLe22 proteins from L. infantum could be a safe, effective and low-cost measure for the control of ZVL, better than strategies based on DNA or protein alone with the same antigens.

[es] La leishmaniosis visceral es una enfermedad parasitaria grave y a menudo mortal con una incidencia de unos 500 000 casos anuales. En la forma zoonótica (ZVL) causada por L. infantum, el perro es el principal reservorio doméstico del parásito. La identificación de los antígenos involucrados en la respuesta inmunitaria específica es necesaria para desarrollar nuevas estrategias diagnósticas y vacunales. El objetivo de esta tesis ha sido evaluar la utilidad de cuatro antígenos recombinantes de L. infantum rKMPII, rTRYP, rLACK y rpapLe22 en el control de la ZVL mediante su utilización en técnicas de diagnóstico y vacunación. Para ello, empleamos extractos crudos de larvas de Trichoplusia ni infectadas con baculovirus conteniendo las proteínas recombinantes sin purificar. Este sistema permite la obtención de grandes cantidades de proteína con la mayoría de modificaciones postraduccionales de los eucariotas y a bajo coste. El análisis de la respuesta humoral específica mostró que el 75% de los perros enfermos presentaba anticuerpos contra rKMPII, el 50% contra rTRYP y el 42% contra rLACK. Estos resultados demuestran que los tres antígenos, pero especialmente KMPII, son inmunógenos de las células B durante la CanL. La combinación de los ELISA de rKMPII, rTRYP y rLACK en paralelo para el diagnóstico de la CanL tuvo una sensibilidad del 93% y una especificidad del 97% no diferentes de las obtenidas con CTLA, demostrando así que los tres antígenos producidos en T. ni pueden ser utilizados para obtener una técnica sensible, específica, reproducible y de bajo coste para el diagnóstico de la CanL. La evaluación de la respuesta celular in vivo mediante DTH en una población de perros residentes en zona endémica mostró que el 27 % de los perros infectados presentaba una reacción DTH positiva contra rKMPII, el 50 % contra rTRYP, el 18 % contra rLACK y el 18 % contra rpapLe22. Estos resultados demuestran que los cuatro antígenos, pero especialmente TRYP, son capaces de estimular las células T durante la infección por L. infantum. La combinación de los resultados de las pruebas de DTH empleando rTRYP y rKMPII en paralelo consiguió un 78% tanto de sensibilidad como de especificidad, no diferente de la obtenida con LST, sugiriendo que ambos antígenos pueden ser componentes de una técnica de DTH para el diagnóstico de los perros infectados. La estrategia de vacunación DNA-proteína conteniendo los cuatro antígenos en hámsters indujo un aumento significativo en la producción de NO en los macrófagos infectados in vitro, así como una disminución de los niveles de anticuerpos contra el parásito post-infección. Asimismo, indujo una disminución significativa de la carga parasitaria en bazo (86%) y sangre (99%). Esta estrategia también redujo significativamente la aparición de ciertas alteraciones histopatológicas relacionadas con la enfermedad. La vacuna DNA-proteína fue capaz de incrementar la inmunogenicidad de la vacuna de DNA desnudo, que no consiguió inducir la producción de NO ni disminuir la parasitemia. La vacuna basada en proteínas recombinantes no fue protectora. Los resultados demuestran que la estrategia prime-boost con DNA desnudo y las proteínas recombinantes KMPII, TRYP, LACK y papLe22 producidas en T. ni puede ser una estrategia segura, efectiva y de bajo coste contra la ZVL, con una eficacia superior a la obtenida con proteínas recombinantes o con DNA desnudo utilizando los mismos antígenos.