[en] Alcoholic fermentation of grape must is mainly carried out by the yeast Saccharomyces cerevisiae. This thesis deals with the analysis of nutrient signalling pathways of Saccharomyces cerevisiae wine strains in winemaking conditions to understand their response to low conditions of nitrogen and carbon availability of sources in the must. Grape must is characterized by high sugar content and limited nitrogen sources, which could explain the greater tolerance of wine strains, compared to laboratory strains, against rapamycin (inhibitor of the TORC1 complex) and non-metabolizable structural analogues of glucose, suggesting a differential organization of metabolic fluxes. Two experiments of directed evolution have been carried out, one against rapamycin ( an inhibitor of TOR activity) and the other against 2-deoxyglucose (a structural analogue of glucose), which have allowed us to obtain strains more tolerant to those compounds however none of them displayed improved phenotypes for winemaking. The activation state of nutrient signalling pathways has also been analysed through the study of the phosphorylation state of their target proteins, and it has been found that both the TORC1 and SNF1 pathways are only active during the first hours of vinification, while the RAS/cAMP/PKA pathway remains active throughout the entire process, suggesting that this is the main regulatory pathway in these conditions. Since grape must has a nitrogen deficit concentration, other pathways that also respond to nitrogen availability, such as the general amino acid control (GAAC) and nitrogen catabolite repression (NCR), were studied in addition to TORC1. Sch9p protein kinase and the transcriptional factor Gcn4p deeply impact cell physiology, metabolism and chronological longevity. Deletion of SCH9 and overexpression of GCN4 similarly alter central carbon metabolism and glycerol production in winemaking but they have different impact on the rest of metabolic pathways. A global phenomic analysis of deletion mutants in genes coding for target proteins from the nutrient signalling pathways was also performed. The results showed the significance of Ras2p and Bcy1p proteins, emphasizing the importance of the Ras/cAMP/PKA pathway in winemaking, as well as the relationship between Snf1p and Gln3p. They also showed that the MKS1 gene, a negative regulator of the retrograde pathway, is a good target for the improvement of strains for industrial winemaking. The main general conclusion from the obtained results is that no division exists between signalling of carbon and nitrogen sources in vinification conditions, but a properly regulated crosstalk between all nutrient signalling pathways that allows cellular metabolism to adapt to the singular environmental conditions during winemaking.

[es] La fermentación alcohólica del mosto de uva es llevada a cabo principalmente por la levadura Saccharomyces cerevisiae. Esta tesis aborda el análisis de las rutas de señalización de nutrientes de cepas vínicas de S. cerevisiae en condiciones de vinificación para comprender su respuesta frente a las condiciones adversas de disponibilidad de fuentes de nitrógeno y carbono en el mosto. El mosto de uva se caracteriza por un elevado contenido en azúcares y una limitación de fuente de nitrógeno, lo que podría explicar la mayor tolerancia de las cepas vínicas, respecto a las de laboratorio, frente a rapamicina (inhibidor del complejo TORC1) y a análogos estructurales no metabolizables de la glucosa, sugiriendo una organización diferencial de flujos metabólicos. Se han realizado dos experimentos de evolución dirigida, frente a rapamicina y frente a un análogo estructural de la glucosa (2-desoxiglucosa), que han permitido obtener cepas más tolerantes a dichos compuestos, pero sin fenotipos con aplicabilidad industrial. También se ha analizado el estado de activación de las rutas de señalización de nutrientes a través del estudio del estado de fosforilación de proteínas diana de las mismas, y se ha encontrado que las rutas TORC1 y Snf1 solo están activas en las primeras horas de vinificación, mientras que la ruta RAS/cAMP/PKA se mantiene activa a lo largo de todo el proceso, sugiriendo que ésta es la ruta reguladora principal en esas condiciones. Dado que el mosto de uva presenta una concentración deficitaria de nitrógeno, se estudiaron, además de TORC1, otras rutas que también responden a disponibilidad de nitrógeno, como el control general de aminoácidos (GAAC) y la represión por catabolito de nitrógeno (NCR), encontrándose que la proteinquinasa Sch9p y el factor transcripcional Gcn4p influyen profundamente en la fisiología celular, en el metabolismo y en la longevidad cronológica. Mutaciones en los genes codificantes de estas proteínas alteran, de manera similar, el metabolismo central del carbono y la producción de glicerol en vinificación y, sin embargo, tienen diferente impacto sobre el resto del metabolismo. Se realizó también un análisis fenómico global de las cepas y mutantes de deleción en genes de proteínas diana de las rutas de señalización de nutrientes. Los resultados mostraron la importancia de las proteínas Ras2p y Bcy1p, recalcando la importancia de la ruta Ras/cAMP/PKA en vinificación, así como la relación entre Snf1p y Gln3p. También mostraron que el gen MKS1, regulador negativo de la ruta retrógrada, es una buena diana para la obtención de cepas mejoradas de aplicabilidad industrial en vinificación. El conjunto de resultados obtenidos demuestra que no existe división entre la señalización de fuentes de carbono y de nitrógeno en vinificación, sino una comunicación cruzada adecuadamente regulada entre todas las rutas de señalización de nutrientes que permite que el metabolismo celular se adecúe a las condiciones ambientales.