[en] Canine leishmaniosis (CanL) is a zoonotic disease caused by the protozoan Leishmania infantum, of worldwide distribution and highly endemic in the Mediterranean basin. This parasite is transmitted by the bite of sandfly females. The dog is the main host and reservoir. The clinical manifestations of L. infantum infection in the dog are very variable and range from a chronic subclinical infection to a very severe disease, which can be fatal. Due to its wide pathogenesis, the innate and adaptive immune responses play a role in this canine infection. However, there is much more information on the adaptive immune response than on the innate one. Toll-like receptors (TLR) are essential in the machinery of the immune system that facilitates the early arrest of several infections as well as the activation of the inflammatory cascade. However, the role of these receptors in L. infantum infection in dogs is not well known and the information is very limited. The hypothesis of this doctoral thesis is that TLRs have an important role in L. infantum infection in dogs because they stimulate the inflammatory cascade. The general objective of this doctoral thesis was to investigate the expression of TLRs in the CanL and compare with parasitological, clinical, biochemical and immunological parameters as well as to evaluate the possible use of TLR agonists in the treatment of this disease. The specific objectives have been developed in five studies and are described below. The first specific objective is described in chapter 3. 1. and consisted in evaluating the expression of Toll-like receptors 2 (TLR2) and 4 (TLR4) in unstimulated blood of dogs with moderate clinical leishmaniosis at the time of diagnosis and during one year of treatment as well as correlating clinical, biochemical and parasitological parameters. In chapter 3. 2. , we described the second experiment where the relative quantification of TLR2 and TLR4 was evaluated in dogs infected by L. infantum in different stages of the disease according to the LeishVet classification at the time of diagnosis. This study also investigated the antibodies and the production of interferon gamma (IFN-γ) specific to the parasite as well as the parasitemia in clinical stage I (dogs with papular dermatitis) and in clinical stages II-III (dogs with exfoliative dermatitis or ulcerative lesions). The specific objective of the third study (Chapter 3. 3. ) was to determine the transcription of the TLR2, TLR4 and programmed death ligand 1 (PD-L1) genes in blood stimulated with L. infantum soluble antigen (LSA) and the mitogen Concanavalin A (Con A) in sick dogs IFN-γ producers and non-IFN-γ producers and healthy dogs. The purpose of the study described in chapter 3. 4. was to determine the production of the cytokines TNF-α and IL-6 in blood stimulated with LSA or TLRs agonists (TLR3, TLR4 and TLR7) alone or combined in dogs naturally infected by Leishmania. Finally, an in vitro experiment (Chapter 3. 5. ) was carried out where the parasites' susceptibility to different conventional anti-Leishmania drugs (allopurinol, miltefosine or meglumine antimoniate) was evaluated in promastigote and amastigote assays in a canine macrophage cell line as well as the effect of TLRs agonists 2, 3, 4 and 7 alone or in combination with conventional drugs. Descriptive studies of this thesis have confirmed that TLRs seem to have a role in the disease. Sick dogs infected with Leishmania present different expression of TLRs compared to healthy individuals, also directly depending on the immunological profile of the animal as well as the clinical stage. Thus, in this doctoral thesis, overexpression of TLR2 was obtained in unstimulated blood at the time of diagnosis in dogs with moderate disease (stage II-III) when compared with healthy dogs. However, expression of TLR2 in unstimulated blood was the same for dogs with mild disease (stage I) and healthy dogs. In addition, there was a decrease in the expression of TLR2 during one year of treatment and clinical improvement in dogs with moderate disease. However, no changes were observed in TLR4 expression at diagnosis or during treatment in any of the dogs studied. It is also important to highlight that the expression of TLR2 was correlated with clinical, parasitological and immunological parameters associated with moderate to severe disease. In addition, dogs with mild stage I and papular dermatitis had a predominantly Th1 immunological profile whereas animals classified in more severe stages had a predominantly Th2 profile. The results obtained in blood stimulated with LSA were very interesting and correlated with the findings obtained in unstimulated blood. A reduction in gene expression of the TLR2 and TLR4 genes in blood stimulated with LSA was observed in sick dogs that were IFN-γ producers compared to healthy dogs and a high expression of PD-L1 in all the groups studied for both LSA and Con A. The blood stimulated with TLRs agonists (TLRsa) and LSA of sick dogs showed a high production of the cytokines IFN-γ, TNF-α and IL-6, compared with the medium alone. The combinations that gave the highest production of Th1-profile cytokines were the agonists TLR4 and TLR7 each combined with LSA. In vitro studies demonstrated the susceptibility of the parasite to conventional drugs, with miltefosine being the most effective drug. In addition, it was shown that TLRsa agonists alone reduced infection, and a synergistic effect was also observed in the reduction of infection with allopurinol and agonists for TLR4. However, the production of TNF-α or NO was not detected in the supernatants collected after 72 hours, although the transcription of TLR2, TLR4 and TLR7 was detected in all conditions studied. In general, a decrease in the transcription of TLR2 was demonstrated or no changes in the expression of TLR4 and TLR7 with infection. However, the expression of TLRs after treatment with conventional anti-Leishmania drugs alone or TLR agonists alone or in combination was more variable. In conclusion, this doctoral thesis has shown that the expression of TLR2 in blood is a marker of moderate to severe disease. However, TLR4 does not appear to be a good marker for CanL in unstimulated blood. In addition, the reduced expression of TLR2 and TLR4 in blood stimulated with LSA was associated with sick dogs responding to IFN-γ, which have a more protective profile than dogs not responding to IFN-γ. The in vitro study revealed that drugs combined with TLRsa or even TLRsa alone can reduce infection. For this reason, the findings in this thesis suggest that TLRs can be used as immunotherapy or as adjuvants in future vaccines.

[es] La leishmaniosis canina (CanL) es una enfermedad zoonótica causada por el protozoo Leishmania infantum, de distribución mundial y altamente endémica en la cuenca mediterránea. Este parásito se transmite por la picadura de las hembras de flebótomo. El perro es el principal huésped y reservorio. Las manifestaciones clínicas de la infección por L. infantum en el perro son muy variables y oscilan desde una infección crónica subclínica hasta una enfermedad muy grave, que puede ser fatal. Debido a su amplia patogénesis, la respuesta inmunitaria innata y adaptativa desempeñan un papel en esta infección canina. Sin embargo, existe mucha más información sobre la respuesta adaptativa que sobre la innata. Los receptores tipo Toll (TLR) son esenciales en la maquinaria del sistema inmunitario que facilita el arresto temprano de varias infecciones, así como la activación de la cascada inflamatoria. No obstante, el papel de estos receptores en la infección por L. infantum en perros no se conoce bien y la información es muy limitada. La hipótesis de esta tesis doctoral es que los TLR tienen un papel importante en la infección por L. infantum en perros porque estimulan la cascada inflamatoria. El objetivo general de esta tesis doctoral fue investigar la expresión de los TLR en la CanL y compararla con parámetros parasitológicos, clínicos, bioquímicos e inmunológicos, así como evaluar el posible uso de agonistas de TLR en el tratamiento de esta enfermedad. Los objetivos específicos se han desarrollado en cinco estudios y se describen a continuación. El primer objetivo específico, descrito en el capítulo 3. 1, consistió en evaluar la expresión de los receptores tipo Toll 2 (TLR2) y 4 (TLR4) en sangre no estimulada de perros con leishmaniosis clínica moderada en el momento del diagnóstico y durante un año de tratamiento, correlacionando parámetros clínicos, bioquímicos y parasitológicos. En el capítulo 3. 2 describimos el segundo experimento, donde se evaluó la cuantificación relativa de TLR2 y TLR4 en perros infectados por L. infantum en diferentes estadios de la enfermedad según la clasificación LeishVet en el momento del diagnóstico. Este estudio también investigó los anticuerpos y la producción de interferón gamma (IFN-γ) específicos del parásito, así como la parasitemia en el estadio clínico I (perros con dermatitis papular) y en los estadios clínicos II-III (perros con dermatitis exfoliativa o ulcerativa). El tercer objetivo (capítulo 3. 3) fue determinar la transcripción de los genes TLR2, TLR4 y ligando de muerte programada 1 (PD-L1) en sangre estimulada con antígeno soluble de L. infantum (LSA) y el mitógeno Concanavalina A (Con A) en perros enfermos productores y no productores de IFN-γ, y en perros sanos. El propósito del estudio descrito en el capítulo 3. 4 fue determinar la producción de las citocinas TNF-α e IL-6 en sangre estimulada con LSA o con agonistas de TLR (TLR3, TLR4 y TLR7) solos o combinados en perros infectados de forma natural por Leishmania. Finalmente, en el capítulo 3. 5 se llevó a cabo un experimento in vitro para evaluar la susceptibilidad de los parásitos a diferentes fármacos anti-Leishmania convencionales (alopurinol, miltefosina o antimonato de meglumina) en ensayos de promastigotes y amastigotes en una línea celular de macrófagos caninos, así como el efecto de los agonistas de TLR2, TLR3, TLR4 y TLR7 solos o en combinación con los fármacos convencionales. Los estudios descriptivos de esta tesis han confirmado que los TLR parecen tener un papel en la enfermedad. Los perros enfermos infectados presentan una expresión diferente de TLR respecto a los individuos sanos, dependiendo directamente del perfil inmunológico del animal y del estadio clínico. Así, en esta tesis doctoral se observó una sobreexpresión de TLR2 en sangre no estimulada en el momento del diagnóstico en perros con enfermedad moderada (estadio II-III) en comparación con perros sanos. Sin embargo, la expresión de TLR2 en perros con enfermedad leve (estadio I) fue similar a la de los sanos. Además, se detectó una disminución en la expresión de TLR2 durante un año de tratamiento y mejora clínica en perros con enfermedad moderada. No se observaron cambios en la expresión de TLR4 al diagnóstico ni durante el tratamiento en ninguno de los perros estudiados. También es importante destacar que la expresión de TLR2 se correlacionó con parámetros clínicos, parasitológicos e inmunológicos asociados a enfermedad moderada a grave. Además, los perros con estadio leve I y dermatitis papular presentaron un perfil inmunológico predominantemente Th1, mientras que los animales en estadios más severos mostraron un perfil Th2 predominante. Los resultados obtenidos en sangre estimulada con LSA fueron muy interesantes y se correlacionaron con los hallazgos en sangre no estimulada: se observó una reducción en la expresión génica de TLR2 y TLR4 en perros enfermos productores de IFN-γ respecto a los sanos, así como una elevada expresión de PD-L1 en todos los grupos estudiados tanto con LSA como con Con A. La sangre estimulada con agonistas de TLR y LSA de perros enfermos mostró una alta producción de IFN-γ, TNF-α e IL-6 en comparación con el medio solo. Las combinaciones que dieron mayor producción de citocinas de perfil Th1 fueron los agonistas de TLR4 y TLR7, cada uno combinado con LSA. Los estudios in vitro demostraron la susceptibilidad del parásito a los fármacos convencionales, siendo la miltefosina el más eficaz. Asimismo, se observó que los agonistas de TLR redujeron la infección por sí mismos, y un efecto sinérgico con alopurinol y agonistas de TLR4. No se detectó producción de TNF-α ni de NO en los sobrenadantes tras 72 horas, aunque sí se detectó la transcripción de TLR2, TLR4 y TLR7 en todas las condiciones estudiadas. En general, se demostró una disminución de la transcripción de TLR2 o ausencia de cambios en la expresión de TLR4 y TLR7 con la infección. Sin embargo, la expresión de TLR tras el tratamiento con fármacos convencionales o con agonistas de TLR, solos o combinados, fue más variable. En conclusión, esta tesis doctoral ha demostrado que la expresión de TLR2 en sangre es un marcador de enfermedad moderada a grave. Sin embargo, TLR4 no parece un buen marcador para CanL en sangre no estimulada. Además, la reducción de la expresión de TLR2 y TLR4 en sangre estimulada con LSA se asoció a perros enfermos respondedores a IFN-γ, con un perfil más protector que los no respondedores. El estudio in vitro reveló que los fármacos combinados con agonistas de TLR, o incluso solo los agonistas, pueden reducir la infección. Por ello, los hallazgos de esta tesis sugieren que los TLR podrían utilizarse como inmunoterapia o como adyuvantes en futuras vacunas.