# Histopatoloji
Histopatoloji ya da patolojik histoloji, hastalıklı dokunun histolojik incelenmesinde uzmanlaşan patoloji dalıdır. Anatomik patoloji açısından önemli bir araç olan histopatoloji, aynı zamanda kanser ve diğer hastalıkların doğru ve kesin teşhisi için kullanılır ve bu açıdan çok önemlidir.
Histoloji yunancada zar ya da doku anlamına gelen "histos" ve bilim anlamına gelen "logos" kelimelerinin birleşmesi ile dilimize doku bilimi olarak çevrilir. Histoloji canlıya ait yapıların özelliklerini, yapılarla fonksiyonların ilişkilerini mikroskobik olarak inceleyen bilim dalıdır.
Histoloji genel histoloji ve özel histoloji olarak ikiye ayrılır. Genel histoloji temel dokulara ait özellikleri incelerken özel histoloji ise organlar ve sistemlere ait mikroskobik özellikleri araştırır. Özel histoloji aslında bir nevi mikroskopik anatomidir.
Histopatoloji organ, doku ve hücrelerde oluşan değişikliklerin çeşitli yöntemler kullanılarak mikroskopta incelenmesidir. İncelenecek dokular öncelikle mikrotom adı verilen mikro kesicide incelenmeye uygun kalınlıklarda kesilir. Bundan sonraki işlemler ise tespit aşamasıdır. İnceleme sonucunda hastalıkların teşhisi konulur. Bazı histopatolojik çalışmalarda elektron mikroskopisi kullanılır. Bu yönteme ise ultrastrüktürel inceleme denir.
Histopatoloji alanındaki çalışmalarla elde edilen bilgiler dokuların mikroskopik yapısına ışık tutar. Çeşitli hastalıkların dokularda oluşturduğu farklı patolojik özelliklerden yararlanılarak tanı konulmasında yararlanılır.


## Histopatolojinin tarihçesi.
Histopatoloji, Cerrahi Patoloji ve Onkolojik Patoloji bilim dallarının temel dayanağıdır. Histopatolojinin ilk uygulaması "Rudolf Virchow" (1821–1902) tarafından yapılmıştır: Prens Frederick'e yapılan larinks biyopsisinin "Johannes Purkinje" (1787-1869) tarafından düzenlenen mikrotom ilk kez kullanılarak hazırlanan kesitlerinin mikroskopla incelenmesi cerrahi patolojinin ilk uygulamasıdır. Kesitler "Virchow" tarafından incelenerek rapor edilmiştir (1887). Ayrıca bakınız Patoloji.
"Rudolf Virchow" 'un “"Omnis cellula e cellula"” tüm hücrelerin anası hücrelerdir (kök hücreler ve kanser hücrelerinin kökeni konusunda çok büyük bir aşamadır) kuramı ile patolojide büyük bir adım atıldığı yıllarda morfolojik bilimlerde devrim yapacak bir buluş gerçekleşmişti: mikroskop. Mikroskopun rutin çalışmalara ve araştırmalara girmesiyle birlikte histopatolojide büyük ataklar başladı. Mikroskopun bulunmasındaki ilk adımlar insanların küçük cisimleri büyüterek inceleme merakından gelir. Prehistorik dönemlerde, içi suyla dolu bir borunun ucuna yerleştirdikleri mercekle yazıları ve cisimleri büyütmeye çalışan Çinlilerden önce Mısır'da suyun büyütme ve ışığı kırma niteliklerini bilen bilginler bunu işgalci Romalılara öğretmişlerdi. Optik fizikteki ilk adımları eski Mısır, eski Yunan ve eski Orta-Güney Amerika uygarlıklarının attıkları konusunda farklı görüşlerin varlığına karşın ilk yazılı belge "Euclid’"e (İ.Ö.300ler) aittir. Ataları Romalıların İskenderiye'den (Mısır) topladıkları bilgileri değerlendiren "Salvino D'Armate (1258-1317)" 1284 yılında merceklerden yararlanarak ilk gözlükleri üretti. "Johannes Kepler (1571-1630)" görme fizyolojisini ve görme kusurlarının merceklerle düzeltilmesinin ilkelerini yayınladı. "Galileo Galilei (1564-1642)" ilkel teleskopun geliştirilmesinde büyük bir çaba gösterdi. Hollandalı gözlükçü "Zacharias Janssen" ile ailesi "(1590)": ilk mikroskop taslağı (gözlükçü "Janssen"’ler – Çinliler gibi- bir boru içine ve uçlarına mercekler yerleştirerek mikroskopta ilk adımını attılar. 1609’da "Galileo Galilei" mikroskop taslağında konkav ve konveks mercekler kullandı. 1674’te -yine bir Hollandalı- "Leeuwenhoek" tarafından gerçek mikroskop düzeneği; üniversite eğitimi olmayan "Antonie Philips van Leeuwenhoek (1632-1723)" oluşturduğu boru-mercek düzeneği ile bakterileri bile görülebilecek kadar büyütebilen sistemi geliştirip dünyaya duyurduğunda 42 yaşındaydı.
"Johannes Purkinje" (1787-1869)’nin "mikrotom" işlevi gören araçları kullanıma sunmasıyla birlikte hücreler, dokular ve organlar ile ilgili bilgiler sel gibi akmaya başladı: göz sinirleri ve gözdeki Schlemm kanalı ("Friedrich Schlemm"); kemiklerdeki Volkmann kanalları ve sempatik sinir sistemi ("Alfred Wilhelm Volkmann"); sinir sistemi ve duyular, kadın genital sistemindeki Müller kanalı, endokrin sistem ("Johannes Peter Müller"); kemiklerdeki Sharpey lifleri ve epitel hücrelerinin siliaları ("William Sharpey"); lenfatik sistem, kıllar, mukus, irin, epitel türleri, böbrekteki Henle kulpu ("Friederich G. J. Henle"); hücre/doku ilişkisi, Schwann hücreleri ("Theodore Schwann"); derideki Vater-Pacini cisimcikleri, Vibrio cholera ("Filippo Pacini"); böbrekte glomerüllerin Bowman membranı, gözde korneanın Bowman membranı, burun mukozasındaki Bowman bezleri ("Sir William Bowman"); timustaki Hassall cisimcikleri, gözde Hassall-Henle cisimcikleri ("Arthur Hill Hassall"); retinadaki nöroglial Müller lifleri, corpus ciliare ("Heinrich Müller") başlıca örnekler olarak verilebilir.


## Histokimyasal teknikler.
Mikroskop büyük aşamalar gösterirken 1825’te "François-Vincent Raspail" ile başlayan histokimya "Virchow’"un 1856’da Berlin Üniversitesi Patoloji Enstitüsü’nde çalışmaya başladığı yıllarda büyük ataklar yapmıştı. 20. yüzyıla gelindiğinde konuyla ilgili çok sayıda yayın vardı. Mikroskop karşısına geçen morfologlar çok renkli bir dünyada gezinirken her ay yeni bir yöntemle yeni hücreler ve ürünleri tanımlanıyordu. Moleküler biyolojinin gelişmesiyle birlikte, immunohistokimya ve moleküler patoloji çalışmaları ile hastalıkların tanısı ve tedavisi için önemli buluşlara ulaşıldı.
Deneysel araştırmalar, hücreleri ve dokuların ürettiği kimyasal maddeler ile bunların birbirleri üzerindeki etkileri moleküler biyolojinin ve moleküler patolojinin doğmasına yol açtı. Temel Bilimler’in önemli bir dalı olan Moleküler Biyoloji geliştikçe Moleküler Patoloji’nin de adımları hızlanıyordu. İlk hedef antikorların işaretlenmesi oldu. Bir Patolog ve İmmunolog olan "Albert Hewett Coons (1912-1978)" immunohistokimyanın üç temel bilgiyi içerdiğini gördü: immunoloji, histoloji, kimya. Kimyadaki en basit ilke immunohistokimyanın da temel ilkesiydi: antijen + antikor = antijen-antikor kompleksi (immun kompleks). Bu süreci iyi kavrayan Dr. "Coons" benzer bir mantıkla Pnömokoklara karşı oluşmuş antikorları floresan veren bir madde olan "anthracene isocyanat"e ile işaretleyerek bakterilerin özel mikroskopla görülebilmesini sağladı. Bu ilke günümüzde de immunofloresan mikroskopinin temel ilkesiydi. İmmunofloresans tekniğinin dondurulmuş taze dokulardan elde edilen kesitlere uygulanabilmesi immunohistokimya çalışmalarının en önemli engeliydi. Bu engeli aşmaya yönelik çabalar 1966 yılında dünyanın iki farklı yöresinden geldi; "Avrameas" ve "Uriel" ile "Nakane" ve "Pierce" antijen-antikor komplekslerinin başka yöntemlerle de görülebileceğini kanıtladılar. Çok geçmeden peroksidaze-antiperoksidaze (PAP) tekniklerinin ilk filizleri belirdi; önce "Nakane", bir yıl sonra da "Mason" ve ark. "Sternberger" ve ark. "Mason" ve "Sammons". Birkaç yıl sonra da “alkalin fosfataze ve monoklonal anti-alkalin fosfataze (APAAP)” gibi gelişmiş teknikler sunuldu. Enzimlerden yararlanarak östrojen reseptörlerini belirleyebilen "Aasmundstad" ve ark immunohistokimyada yeni kapılar açtılar. İmmunohistokimya yöntemleri geliştikçe istenilen yapıları uygun antikorlarla görebilmenin niteliği de artmaktaydı.  Bu dönemde Avidin-Biotin uygulamalarının sağanağı başladı.
Nitelik geliştirme çabaları arasında frozen kesitlerine dönme çabaları ve fiksasyonlarla ilgili kuşkular öne çıktı, yeni teknikler önerildi.  Ancak nitelik uzun süre yetersiz kaldı. Çok nitelikli renk dağılımı saptanan kesitlerde pozitif ya da negatif boyanmaların niceliklerini de bilmek gerekiyordu.  Araştırmacıların bir bölümü niceliksel ölçütlerin belirlenmesi ve standardizasyonu, belirlenen ilkelere uygun bilgisayar desteğinin geliştirilmesi ve görüntü analizi programlarının oluşturulması çabalarına giriştiler.
Standardizasyonu etkileyen bir başka etken “teknik personel” ile ilgiliydi. Tekniker kusurlarını ortadan kaldırmaya yönelik uğraşlar (robotik laboratuvar önerileri ve çalışmaları) immunohistokimya laboratuvar tekniklerinin büyük bir gelişme gösterdiği 1980-1990 arasında yoğunlaştı.  Günümüzde immunohistokimya laboratuvarlarının yaygın olarak kullanıldığı robotik sistemleri üreten firmalar arasındaki kıyasıya savaş ve rekabet giderek artmaktadır. İmmunohistokimyada ilk girişimler infeksiyon hastalıklarının etkenlerini belirlemek amacına yönelikti. Günümüzdeki immunohistokimya yöntemleriyle çok sayıda araştırma ve inceleme yapılabilmektedir.


### Konvansiyonal histokimya.
Dokuların mikroskopi incelemelerinde rutin olarak kullanılan uygulamalardır; Hematoksilin-Eozin yöntemi (H&E) olmazsa olmaz boyama yöntemidir. Hematoksilin, çekirdekleri ve bazı maddeleri mavi tonlarına, eozin ise sitoplazmaları ve çoğu protein içeren bazı maddeleri pembe tonlarına boyar. H&E yönteminin yeterli olmadığı incelemelerde çeşitli hücreleri ve dokuları özgün renklere boyayan boyama teknikleri vardır. Örnekler:
  - Golgi boyası: Nöronal liflerin gösterilmesi
  - Toluidine Blue: Canlı etkenler
  - Kluver-Barrera boyası: Lipofuscin
  - Periyodik asit-Schiff (PAS): Glikojen, müsin, bazal membranlar
  - Mucicarmine: Müsin boyası
  - Gümüş boyaları (gümüş nitrat içeren boyalar  Gomori retikulin ve Grocott-Gomori yöntemleri): Akciğerin ve bağırsakların argentaffin hücreleri, bağ dokusu retikulin lifleri, melanin, kalsiyum
  - Romanowsky yöntemi–Giemsa boyası: Parazit ve bakteri
  - Gram boyası: Bakteriler
  - Trikrom boyaları (Masson trikrom boyası, Ehrlich yöntemi): Bağ dokusu komponentlerinin ayırıcı tanısı, endokrin bezler
  - Prusya mavisi: Hemosiderin belirteci
  - Cresyl violet, Crystal violet, riboflavin T: Amiloid maddesi
  - Mayer musikarmin boyası: Müsin salgılayan bezler ve müsin
  - Verhoeff elastika boyası: Elastik lifler
  - Fosfotungustikasit-hematoksilin: Nöroglia hücreleri, miyelin, glomerül bazal membranı
  - Papanicolaou boyası (PAP): sitoloji (jinekolojik smear, serebrospinal sıvı, balgam, oral smear, seröz boşlukların sıvıları, idrar)


### İmmunohistokimya.
İmmun sistemin tepkileri sonucunda ortaya çıkan ürünleri inceler. İmmun sistem tepkilerinin en önemlisi antijenlere karşı antikor üretmektir. Organizmada yabancı olarak algılanan antijenlerin dokulardaki yerleşimi, bu antijenlere bağlanan antikorların yardımıyla saptanır. Önceden -çoğunlukla- floresan veren boyama teknikleriyle işaretlenmiş olan antikorlar antijenlere bağlandıklarında immun kompleksler oluştururlar. İmmun kompleksler özel mikroskoplarla (immunofloresan mikroskopu) incelenir.
Sonraki gelişmeler "peroksidaze" ilkeleri üzerine kuruldu; örnekler,
  - Peroksidaze-antiperoksidaze (PAP) 
  - Alkalin fosfataze ve monoklonal anti-alkalin fosfataze (APAAP)
  - Avidin-Biotin uygulamalarının sağanağı başladı


### Moleküler patoloji teknikleri.
Etkenlerin, etkilenen hücrelerin ve dokuların ürettiği kimyasal maddeler ile bunların birbirleri üzerindeki etkileri, DNA'daki değişimler, çoğu genetik kökenli markerler (belirteçler) moleküler patolojinin önemli çalışma alanlarıdır. Bı çalışmaların başlıca örnekleri şunlardır:
  - Canlı etkenlerin belirlenmesi: "H.pylori, T.pallidum, H.capsulatum", virüsler (HHV1, HHV2, CVM, HHV8),  parazitler ("T.gondii", P. "jiroveci") ile bazı mikobakteriler
  - Nöropatoloji: dejeneratif beyin hastalıkları ile distrofik kas hastalıklarının tanısı ve izlenmesi
  - Sitolojik materyallerin incelenmesi
  - Deneysel araştırmalar
  - Yangı (inflamasyon): yangı hücreleri, medyatörler, vb
  - Reseptörler: östrojen, androjen, vd
  - Hücre siklusu: apoptozis, vb
  - Tümör markerleri (tümörlerin tanısı ve izlenmesi): 
   - Genomik markerlar: DNA'daki, kromozomlardaki, onkogenlerdeki ve tümör süpressör genlerindeki değişikliklerin saptanmasında kullanılırlar (p53, p63)
   - Diferansiyasyon markerleri (ABO): yüzey antijenleri, sitokeratinler
   - Proliferasyon markerleri: Kİ67
   - Progresyon markerleri: Tumor growth factor (TGF), CD44v9, MUC1, chemokine ligand-13(CXCL13 )


## İşlenmiş Histoloji Kesitlerinin Boyanması.
Boyama işlemi, kimyasal fiksasyon uygulanmış veya dondurulmuş kesitler üzerinde gerçekleştirilebilir. Dokunun mikroskop altında incelenebilmesi için kesitler bir veya daha fazla pigment ile boyanır. Boyamanın amacı hücresel bileşenleri görünür hale getirmektir; karşıt boyalar ise kontrast sağlamak amacıyla kullanılır.
Histolojide en yaygın kullanılan boyama yöntemi, hematoksilin ve eozin kombinasyonudur (genellikle H&E olarak kısaltılır). Hematoksilin, hücre çekirdeklerini mavi renge boyarken, eozin sitoplazmayı ve çoğu hücrenin ekstraselüler bağ doku matriksini pembe renge boyar. Hücreleri seçici olarak boyamak için kullanılan yüzlerce farklı teknik mevcuttur. Doku kesitlerini renklendirmek amacıyla kullanılan diğer bileşikler arasında safranin, Oil Red O, kongo kırmızısı, gümüş tuzları ve sentetik boyalar yer almaktadır. Histokimya, laboratuvar kimyasalları ile doku bileşenleri arasındaki kimyasal reaksiyonları inceleyen bilim dalıdır. Yaygın olarak uygulanan histokimyasal tekniklerden biri, Hemokromatoz gibi hastalıklarda demir birikimini göstermek için kullanılan Perls' Prusya mavisi reaksiyonudur.
Son yıllarda belirli proteinler, lipitler ve karbonhidratları boyamak amacıyla antikorlar kullanılmaktadır. İmmünohistokimya olarak adlandırılan bu teknik, mikroskop altında hücre kategorilerinin spesifik olarak tanımlanmasını önemli ölçüde artırmıştır. DNA veya RNA moleküllerini belirlemek için kullanılan ileri tekniklerden biri de in situ hibridizasyondur. Bu antikor boyama yöntemleri genellikle dondurulmuş kesit histolojisini gerektirmektedir. Yukarıda belirtilen işlemler, eğitimli bir tıbbi laboratuvar uzmanı (histobilimci) tarafından laboratuvar ortamında titizlikle ve hassasiyetle yürütülmektedir. Dijital kameralar, histopatolojik görüntüleri kaydetmek amacıyla giderek daha fazla kullanılmaktadır.


## Kesitlerin Değerlendirilmesi.
Histolojik kesitler, tanınmış bir eğitim programını tamamlamış tıbbi yeterliliğe sahip bir uzman olan patolog tarafından mikroskop altında incelenir. Bu tıbbi değerlendirme, histolojik bulguları ve patologun yorumunu içeren bir patoloji raporu şeklinde sunulur. Kanser vakalarında, bu rapor çoğu tedavi protokolü için gerekli olan doku tanısını sağlar.
Kanserin cerrahi olarak çıkarılması durumunda, patolog cerrahi sınırın temiz olup olmadığını veya rezidüel kanser dokusunun kalıp kalmadığını belirler. Bu işlem, "bread loafing" veya CCPDMA yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilir. Mikroskobik görüntüleme sırasında oluşabilecek artefaktlar, örneklerin yanlış teşhis edilmesine neden olabilir. Kesitlerin dijital olarak taranması, yapay zeka ile yorumlama da dahil olmak üzere çeşitli dijital patoloji yöntemlerinin uygulanmasına olanak tanır.


## Konuyla ilgili yayınlar.
  - Tahsinoğlu M, Çöloğlu AS, Erseven G. Dişhekimleri için Genel Patoloji, Altın Matbaacılık, İstanbul, 1981
  - Cattoretti G, Becker MH, Key G, et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol, 168: 357-363, 1992
  - Taylor CR. An exaltation of experts: concerted efforts in the standardization of immunohistochemistry. Hum Pathol, 25: 2-11, 1994
  - Swanson PE. HIERanarchy: the state of the art in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol, 107: 139-140, 1997
  - Taylor CR. The total test approach to standardization of immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med, 124: 945-951, 2000
  - Demir R, Yılmazer S, Öztürk M ve ark. Histolojik Boyama Teknikleri, Palme Yayıncılık, Ankara, 2001
  - Teruya-Feldstein J. The immunohistochemistry laboratory: looking at molecules and preparing for tomorrow. Arch Pathol Lab Med, 134: 1659-1665, 2010
  - Kubbutat MH, Key G, Duchrow M, et al. Epitope analysis of antibodies recognising the cell proliferation associated nuclear antigen previously defined by the antibody Ki-67 (Ki-67 protein). J Clin Pathol, 47: 524-528, 1994
  - Brey EM, Lalani Z, Johnston C, Wong M, McIntire LV, Duke PJ, Patrick CW Jr. Automated selection of DAB-labeled tissue for immunohistochemical quantification. J Histochem Cytochem, 51: 575-584, 2003
  - Taylor CR, Levenson RM. Quantification of immunohistochemistry—issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology, 49: 411-424, 2006
  - Yaziji H, Barry T. Diagnostic immunohistochemistry: what can go wrong? Adv Anat Pathol, 13: 238-246, 2006
  - Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry: Theranostic and Genomic Applications. 3rd ed. New York, Saunders, 2010
  - Kumar GL, Rudbeck L. Education Guide-Immunohistochemical (IHC) Staininig Methods, 5th ed. DAKO North America, Carpinteria CA, 2009
  - Richard J Cole, Clive R. Taylor. Immunohistochemistry and related marking techniques, Chapter 8. In “Ivan Damjanov James Linder(ed). Anderson’s Pathology Volume I, 10th edition” pp 136–175St. Louis Mosby-Elsevier, 2009.
  - Suvarna K, Layton C, Bancroft J. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Edition, Elsevier, 2013
  - Jackson P, Blythe D. Immunohistochemical techniques Chapter no 21. In “John D Bancroft, Marilyn Gamble (ed). Theory and practice of Histological techniques, 6th edition” pp 433–472, Churchill Livingstone, Elsevier, 2008
  - Coleman WB, Tsongalis GJ. Molecular Pathology: The Molecular Basis of Human Disease. Academic Press, San Diego-Oxford, 2009
  - Lindblom A, Liljegren A. Tumor markers in malignancies. Br Med J, 320: 424-427, 2000
  - Guerry M, Vabre L, Talbot M, et al. Prognostic value of histological and biological markers in pharyngeal squamous cell carcinoma: a case-control study. Br J Cancer, 77(11): 1932–1936, 1998
  - Bodey B. The significance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy of neoplasms. Expert Opin Biol Ther, 2: 371-393, 2002
  - Coindre JM. Immunohistochemistry in the diagnosis of soft tissue tumours. Histopathology, 43: 1-16, 2003
  - Travis WD, Brambilla E, Müller-Hermelink HK, Harris CC. Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus, and Heart, IARC Press, Lyon, 2004
  - Sharma S. Tumor markers in clinical practice: General principles and guidelines. Indian J Med Paediatr Oncol, 30: 1-8, 2009
  - Kimura S, Naganuma S, Susuki D, Hirono Y, Yamaguchi A, Fujieda S, Sano K, Itoh H. Expression of microRNAs in squamous cell carcinoma of human head and neck and the esophagus: miR-205 and miR-21 are specific markers for HNSCC and ESCC. Oncol Rep, 23: 1625-1633, 2010
  - Watanabe S, Kato M, Kotani I, Ryoke K, Hayashi K. Lymphatic vessel density and Vascular Endothelial Growth Factor expression in squamous cell carcinomas of lip and oral cavity: A clinicopathological analysis with immunohistochemistry using antibodies to D2-40, VEGF-C and VEGF-D.Yonago Acta Med, 56: 29-37, 2013
  - Kumar V, Abbas AK, Aster JC. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. 9th edt., Elsevier Saunders, Philadelphia, 2015
  - Goljan EF. Rapid Review Pathology. 5th edt., Elsevier, Philadelphia, 2019