原创 Carlos 图灵基因 2023-05-21 17:32 发表于江苏
撰文：Carlos
1、作者使用异种移植脑类器官作为研究人类小胶质细胞（hMG）的活体平台；
2、该研究使用hMG获得人类特异性转录组特征和类似体内的特征；
3、作者发现hMG参与监测人类大脑环境并对扰动做出反应；
4、作者使用一个患者衍生的模型揭示了自闭症患者大脑环境诱导的免疫反应。
美国索尔克生物研究所遗传学实验室的Simon T. Schafer教授课题组在国际知名期刊Cell在线发表了题为“An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes”的论文。小胶质细胞是一种特殊的驻留在脑内的巨噬细胞，在脑发育、内稳态和疾病中发挥着关键作用。作者开发了一种活体异种移植方法，使人们能够研究在生理相关的、血管化的免疫活性人脑有机体(iHBO)模型中运行的功能成熟的人类小胶质细胞(hMG)。
数据显示，驻留在有机体中的hMG获得与其活体部分非常相似的人类特有的转录特征。在活体双光子成像中，hMG积极参与监测人类大脑环境，对局部损伤做出反应，并对全身炎症信号做出反应。最后作者证明开发的移植iHBO为研究健康和疾病中人类小胶质细胞的功能表型提供了前所未有的机会，并为脑环境诱导的免疫反应在患有巨头畸形的自闭症患者特有的模型中提供了实验证据。
一、EMP有效地填充发育中的皮质类器官
作者想要建立一种新的大脑类器官模型，通过EMP来重现发育中的人脑的定殖。与前脑特异性皮质类器官共同培养的tdT+EMP的实时成像显示，EMP在12小时内高效入侵。随后的组织清除证实了侵入皮质类器官组织的tdT+EMP的存在，与之前的研究一致，这些研究表明了将诱导的小胶质细胞样细胞并入类器官的可行性。
作者首先评估了类器官的发育心理阶段是否会影响EMP的定植。在前脑类器官发育的第35天和第42天之间，观察到EMPs的定殖显著增强，在神经发生开始前和更晚期的发育阶段，EMPs的整合效率较低，这表明微神经胶质祖细胞径向进入的最佳窗口。共培养4天后，侵入性EMPsex压迫CD43，这是造血规范的标志物，并且当每个类器官使用至少100000个细胞时，在整合后8天（dpi）评估，它们显示出最一致的类皮质定殖。在大脑发育的早期阶段，生发层和中间带中没有微胶质细胞。
图1. 通过红髓系祖细胞(EMPs)对前脑有机体定殖的优化
二、体外培养6周后，EMP呈现原始分枝状形态
作者发现，与在单层条件下生长的hPSC衍生的小胶质细胞样细胞相比，类器官定殖EMP衍生的细胞更频繁地处于基本的分枝样状态。虽然这些细胞中有很大一部分在整合后6周表达髓系标志物IBA1，但在体外6周时未检测到稳态小胶质细胞的标志物特征。
为了评估这些细胞的转录组学特征，作者在6wpi下使用荧光激活细胞分选（FACS）对tdT+细胞进行单细胞RNA测序（scRNAseq），并分析了来自3个独立批次或类似物的4422个细胞。在使用统一流形近似和投影（UMAP）将数据集嵌入最近邻空间后，作者检测到10种分子上不同类型的细胞。基于人类胎儿数据集的细胞类型预测显示，与神经元和其他脑细胞类型相比，与人类胎儿小胶质细胞的相似性更高。
与小胶质细胞发育过程中观察到的异质性水平相反，从类器官中分离出来的tdT+细胞似乎更均匀地聚集在一起。这些细胞中的大多数表达髓系标记rAIF1，簇5对应于小胶质细胞样细胞的高增殖群体，如细胞周期特异性基因集的表达所示。然而，大多数细胞中几乎完全没有P2RY12mRNA的表达，并且TMEM119和SALL1转录物未被检测到。这些成熟小胶质细胞特异性基因的特异性缺失表明，环境特异性信号的获取不足或向成熟稳态的不完全转变。
图2. 电磁脉冲来源的小胶质细胞体外特性的研究
接下来，作者对玻璃体内培养条件的纵向评估显示，tdT+细胞的逐渐丧失，使最初在2wpi时扩大的tdT+群体减少到13wpi时的5%以下。碎裂的dT+颗粒逐渐存在于类器官的中心，而在类器官的套区附近只发现了少数tdT+细胞。这些少数存活细胞的主要表现为圆形、活化的形态，并且不表达TMEM119或P2RY12，这表明正在进行的细胞活化和不利的环境阻碍了体外的长期共培养。
图3. 体外长期共培养的特性
三、移植允许在体内发育稳定的人类小胶质细胞
作者在体外整合EMP 10天后，将含有EMP的皮质类器官移植到免疫功能受损的NOD/SCID小鼠的脾后皮质中，导致移植物的有效血管化。几乎所有的tdT+细胞在移植后8周（wpt）都显示出高表达的IBA1。此外，tdT+细胞在人移植物中共表达髓系转录因子PU.1和人特异性TMEM119。
tdT+细胞显示出特征性的成熟小胶质细胞形态，超过99%的tdT+电池呈现分枝状态。深度形态计量分析揭示了具有大量高阶过程的高度复杂的分支模式。重要的是，将iHBO抗性hMGs与来自人脑组织的IBA1+小胶质细胞进行比较，发现了相似的形态学外观。总之，该研究的嵌合平台为hMGs提供了一个允许的生存环境，并使其成熟为脑内免疫细胞，这些细胞在原位表现出与hMGs高度的形态相似性。
图4. 移植使人小胶质细胞在人脑有机体中成熟并长期存活
作者使用FACS从3个独立的iPSC衍生的iHBO模型中提取了tdT+/hCD45+hMGs，并进行了scRNAseq。以11wpt分析来自3个独立iPSC系的总共1027个tdT+细胞，并使用UMAP将其嵌入最近邻空间。作者使用Louvain聚类检测到6种不同分子的小胶质细胞状态。几乎所有聚类中分离的hMG都表达经典的小胶质瘤标记AIF1、CX3CR1、CSF1R和CST3。
聚类5中的细胞表达高水平的参与细胞周期进程的基因，包括MKI67和RRM2；这一发现表明存在增殖性小胶质细胞亚群，与在人类胎儿大脑中观察到的增殖性群体一致。此外，包括0、1、2、3、4和5在内的大量细胞显示出成熟静止小胶质细胞标记P2RY12、TMEM119和SALL1的高表达，在所有描述的细胞系中一致。
为了在蛋白质水平上验证scRNAseq数据，作者在同一时间点对hMGs进行了免疫组织化学分析。根据转录组学数据，免疫组织化学显示，在11wpt时，大量hMGs释放P2RY12和hTMEM119，证实了体内成熟的稳态hMGs的出现。
图5. hMG在体内同一性的转录组学表征
四、移植可防止hMGs的非生理性激活
作者对在缺乏hMGs的情况下产生的GFP+脑类器官进行批量RNA测序，观察到4到24wpt之间的逐渐成熟转变，这对人类大脑发育从胎儿早期到产前晚期/产后早期的过渡反应良好。与这一发现一致，每层递增的标记物，如SATB2，以及指示成熟星形胶质细胞存在的标记物在体内时间逐渐增加。
正如预期的那样，移植后在类器官中检测到高水平的IL34和CSF1基因表达，而在体外年龄匹配的脑类器官中无法检测到IL34。这些观察结果证实，移植的脑类器官提供了一个完整的生存环境来支持hMG的发育。
作者分析了来自每种条件下的2个不同批次的类器官的总共1866个tdT+细胞，并将组合的数据集集成到最近邻空间中。我们使用Louvain聚类检测了12种分子上可区分的细胞状态。几乎所有的前归档细胞都显示出典型骨髓样标记IF1的高表达。在检测到的12个聚类中，聚类0似乎仅限于玻璃体条件下，因为聚类10的存在似乎是由活体环境内驱动的。
图6. 移植类器官支持hMG的发展
差异表达分析显示，0簇中MIF、CD52、PLIN2和BCL2A1等基因显著上调。该簇中上调的基因在控制免疫细胞激活、凋亡和细胞应激反应的过程中显示出显著富集。仅限于活体环境中的簇10显示出特定的稳态小胶质细胞基因如P2RY12、CSF3R、CSF1R、ITGAV和SELPLG的显著上调。
作者使用IHC发现，虽然iHBO驻留的MGs在体内11wpt时显示出显著的过程复杂性增加，但类器官中的小胶质细胞样细胞在相应的时间点发生了明显的形态转变。此外，P2RY12和TMEM119在体内11wp时分别由超过75%和70%的hMGs表达，在体外相应的时间点在tdT+细胞中未检测到。再加上移植后CSF-1R配体的上调，这些发现证实了人类大脑在活体环境中的相似性足以支持hMG的发展。
图7. 移植类器官支持体内稳态小胶质细胞的发育
五、hMGs遵循既定的发展轨迹，并获得人脑环境特异性特征
作者使用UMAP分析了来自7只动物和3个时间点的4322个细胞，并将其嵌入最近邻空间。体外隔离程序12产生了表达IBA1的小胶质细胞，其几乎不表达急性促炎细胞因子TNForIL6和抗炎细胞因子IL10，这两种细胞因子在任何评估的时间点都与更持久的炎症反应有关。
作者使用Louvain聚类检测了11种分子上不同类型的细胞。目标干扰分析揭示了不同的发育目标，细胞的伪时间顺序与UMAP图中所示的分离hMGs的发育年龄很好地一致。将伪时间特征中出现的变化映射到各种小鼠小胶质细胞状态显示，轨迹3与小胶质细胞的前期和早期状态有很强的对应性，而轨迹1和2明显向成年小胶质细胞态转移。
为了进一步评估hMG与人类小胶质细胞发育的关系，作者将scRNAseq数据与最近发表的参考数据集进行了比对，该数据集描述了妊娠9至18周的hMG发育。作者在人类数据集中观察到的向成人样稳态和免疫感应小胶质细胞状态发展的心理转变特征在该研究的hMG中得到了高度保存。与此相一致，3个发育时间点之间的差异基因表达分析显示，稳态和小胶质细胞特异性感觉体基因以及TLR4高度显著且持续上调。在蛋白质水平上也观察到P2Y12、TMEM119和SALL1的特异性上调。
图8. hMGs遵循既定的发育轨迹，并在体内获得人脑环境依赖性特征
作者将异种移植到小鼠脑（xMGs）后从hPSC衍生的小胶质细胞获得的单细胞转录组谱与在24wpt时从血管化的人脑或类似物移植物中的hMG获得的转录组谱进行对比。在2个数据集上进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），并确定了共表达基因的5个主要模块。
分析显示有些基因被大量的HMG高度表达，但在24wpt时仅被少数xMG高度表达。另一方面，在xMG相关模块MEblue中预先发送的小鼠特异性小胶质细胞基因，如LY6和TPI1，被xMG高度表达，但几乎不存在于hMGs中。这些观察结果表明，获得的人类特异性小胶质细胞特征很可能是hMGs和人类大脑之间相互作用的结果，就像在活体环境中一样。
六、hMGs表现出动态监视特性，并对局部和系统扰动作出反应
作者利用光子显微镜在体内观察了人脑类器官中的tdT+hMGs。hMGs在12wpt时的延时成像显示，高度分化的人类细胞具有显著运动的突起，并通过分支突起的连续延伸和牵引来调查周围的人类类器官环境。这一观察结果与小胶质细胞在静息状态下感知微环境的功能一致。
作者在12wpt和24wpt时间点之间，没有观察到基线运动性的显著差异。此外，还观察到小胶质细胞总密度从6 wpt显著增加到24 wpt，而在24 wpt时没有迁移细胞。作者接下来开始在2光子诱导的局灶性激光损伤后立即表征小胶质细胞的行为。人类类器官细胞中激光诱导的损伤在12wpt时在相邻的tdT+hMGs中引发即时反应，如过程向损伤部位的平行和定向延伸所示，这与先前描述的小鼠小胶质细胞的行为一致。
鉴于小胶质细胞特异性感觉基因如TLR4在hMGs中的表达，作者假设这些细胞能够以剂量依赖的方式对系统给药的LPS做出反应。为了验证这一假设，作者使用腹膜内注射LPS来引发体内12 wp的快速先天免疫反应。
作者观察到高剂量LPS注射后24 h hMG形态发生变化，表现为圆形形态、缺乏特征性初级过程以及大量丝状足类从其胞体延伸。正如预期的那样，LPS的降低引起了不那么深刻的形态学变化。根据转录组分析，这些实验证实了人类稳态和免疫感应小胶质细胞的存在，该小胶质细胞实现了特征性的监测功能，并对环境诱导的扰动和系统炎症线索做出反应。
图9. hMGs表现出独特的免疫感应特性，并在体内对局部和全身扰动做出反应
该研究的模型使人们能够获得在类人脑环境中运行的功能性hMGs，从而使人们能够在体内研究生理和病理条件下的人类特异性小胶质细胞功能。
七、一个患者特异性模型揭示了ASD中大脑环境诱导的免疫反应
作者通过对患有ASD和大小头症的受试者进行临床分层队列研究，最近发现，大脑皮层发育的改变出现在产前同等时期。为了建立患者特异性iHBO模型，作者首先从3名ASD受试者和3名neu非典型对照中产生了表达GFP和tdT的同源性iPSC，以分别标记受试者来源的皮质类器官（GFP）和hMGs（tdT）。
然后，作者从这些iPSC系中产生GFP+皮质类器官和tdT+EMP，并在整合后将iHBO模型移植到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠的脾后皮质。在体内12周后，从3个独立的、ASD子对象衍生的iPSC系产生的移植iHBO显示出hMGs的显著增加，细胞体中出现丝状伪足的无统计学意义，与神经典型对照相比，这是以牺牲特征静息状态为代价的。
形态学评估显示，ASD受试者衍生的hMG导致胞体大小显著增加，初级突厚度显著增加，突中出现的丝状足数量显著增加。这些形态学变化与启动型和反应型小胶质细胞表型有关。5，7，37来源于3个独立对照iPSC系的iHBO模型中没有反应型小神经细胞表型。
为了评估在ASD受试者衍生的iHBO中观察到的hMG表型是否确实是由改变的神经元环境而不是由固有的小胶质细胞遗传易感性诱导的，作者从所有携带来源于无感染对照iPSC系的神经典型hMG的受试者中生成了ASD和对照受试者特异性iHBO模型。
使用这种方法表明，神经典型hMG对ASD相关的脑环境有反应，但对任何对照脑环境都没有反应，这表明在ASD小胶质细胞中观察到的形态学变化确实是由发育中的人脑环境的变化驱动的。
图10. 人类患者特异性模型的产生揭示了患有小头症的ASD的脑环境诱导的免疫反应
总之，该研究的iHBO模型使人们能够研究人类疾病相关的小胶质细胞表型，并为脑环境诱导的小头症自闭症免疫反应提供了第一个实验证据。
Simon T. Schafer博士是美国加利福尼亚州索尔克生物研究所人类遗传学实验室的前博士后研究员，同时在德国慕尼黑工业大学医学院精神病学与心理治疗学系任职。Simon T. Schafer博士从事神经系统，尤其是精神疾病的相关研究，在Nature、Cell等国际顶级期刊发表多篇文章，所取得的成果收到学界广泛认可和关注。
Simon T. Schafer, Abed AlFatah Mansour, Johannes C.M. Schlachetzki, et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes.Cell. 2023; https://doi.org/ 10.1016/j.cell.2023.04.022