คำถาม: หลักการของการถ่ายภาพแบบคอลโฟคอลนั้นได้การจดสิทธิบัตรโดยใคร?

text: หลักการของการถ่ายภาพแบบคอลโฟคอลนั้นได้การจดสิทธิบัตรโดย Marvin Minsky ในปี ค.ศ. 1957 แต่การพัฒนาการของการใช้แสงเลเซอร์นั้นใช้เวลาอีก 30 ปี จึงสามารถนำมาใช้กับกล้องจุลทรรศน์แบบคอลโฟคอล จนกระทั่งในปี ค.ศ. 1980 กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนได้กลายเป็นเทคนิคอีกชนิดหนึ่งที่ได้รับความนิยม โดยในปี ค.ศ. 1978 นั้น Thomas Cremer และ Christoph Cremer ได้ออกแบบกระบวนการใช้แสงเลเซอร์ในการสแกนแบบทีละจุดโดยใช้จุดโฟกัสของลำแสงเลเซอร์เพื่อให้ได้ภาพ 3 มิติ โดยกล้องคอนโฟคอลที่ใช้แสงเลเซอร์ในการสแกนและใช้ตัวรับแสงเพื่อสร้างภาพ 3 มิติ ตัวแรกที่ถูกออกแบบนั้นได้ถูกใช้สำหรับถ่ายภาพวัตถุทางชีววิทยาซึ่งถูกเคลือบสารฟลูออเรสเซ็นต์ ในทศวรรตต่อมากล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลทำงานด้วยแสงฟลูออเรสเซ็นได้ถูกพัฒนาอย่างจริงจังโดยกลุ่มนักวิจัย University of Amsterdam และ European Molecular Biology Laboratory (EMBL) และ องกรณ์ซึ่งเป็นหุ้นส่วนทางธุรกิจ
title: กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน

text: หลักการทำงานของการถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลนั้นได้รับการจดสิทธิบัตรเมื่อปี ค.ศ. 1957 โดย มาวิน มินสกี้ (Marvin Minsky) การถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลนี้มีจุดประสงค์เพื่อแก้ไขปัญหาข้อจำกัดต่างๆของกล้องจุลทรรศน์แสงฟลูออเรสเซ็นต์แบบมุมมองกว้าง (wide-field fluorescence microscope) ซึ่งเป็นแบบดั้งเดิม โดยกล้องจุลทรรศน์แสงฟลูออเรสเซ็นต์แบบมุมมองกว้างนั้นจะใช้แสงฟลูออเรสเซ็นต์ความยาวคลื่นหนึ่งส่องไปบนทุกส่วนของชิ้นเนื้อตัวอย่าง และชิ้นเนื้อตัวอย่างนั้นจะสะท้อนแสงฟลูออเรสเซ็นอีกความยาวคลื่นหนึ่งมายังตัวรับแสง (photodetector) ดังนั้นตัวรับแสงจะรับแสงฟลูออเรสเซ็นที่สะท้อนมาทั้งหมด ซึ่งรวมถึงแสงที่ไม่ได้อยู่ที่จุดโฟกัส ในทางตรงกันข้ามกันกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลใช้แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซ็นแบบจุด (เกี่ยวข้องกับ ) และใช้เลนส์โฟกัสแสงไปบนชิ้นเนื้อตัวอย่างและรับแสงสะท้อนจากชิ้นเนื้อตัวอย่างมาผ่านรูขนาดเล็กเพื่อกำจัดแสงที่ไม่ได้อยู่บริเวณจุดโฟกัสก่อนที่แสงจะไปสู่ตัวรับแสง ดังนั้นจะมีแสงที่จุดโฟกัสเท่านั้นที่นำมาสร้างเป็นสัญญาณภาพ ด้วยเหตุนี้เองภาพที่ได้จึงมีความละเอียดสูงขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งความละเอียดของภาพทางด้านความลึก เนื่องจากแสงจากบริเวณที่ตื้นหรือลึกกว่าจุดโฟกัสจะถูกกำจัดโดยรูขนาดเล็กก่อนที่จะมาถึงตัวรับแสง แต่ถึงอย่างไรการใช้รูขนาดเล็กในการจำกัดแสงที่รับเข้ามาจะทำให้ภาพมีความเข้มของแสงลดลงตามไปด้วย ดังนั้นในการใช้กล้องคอนโฟคอลจึงจำเป็นต้องเพิ่มเวลาในการเปิดหน้ากล้องให้นานขึ้น
ความละเอียดทางด้านความลึกของจุดโฟกัสของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล หมายถึง ความหนาของบริเวณที่กล้องคอนโฟคอลยอมให้แสงผ่านเข้าไปยังตัวรับแสง ค่านี้ส่วนมากจะถูกกำหนดโดยผลลัพธ์ของความยาวคลื่นแสงหารด้วยค่าของรูรับแสงของเลนวัตถุ (Numerical Aperture, N.A.) ของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลยกกำลังสองและคุณสมบัติทางแสงของชิ้นเนื้อ จากที่กล่าวมาการจำกัดแสงสะท้อนทางด้านความลึกของชิ้นเนื้อทำให้เราสามารถสร้างภาพ 3 มิติ โดยการเลื่อนจุดโฟกัสไปยังตำแหน่งต่างๆทั้งทางด้านแนวราบและแนวดิ่งนั่นเอง
มีกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลอยู่ 3 ชนิดที่มีอยู่ในท้องตลาดปัจจุบัน
title: กล้องคอนโฟคอล

text: กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล () เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้เทคนิคทางแสงบริเวณจุดโฟกัส (focal point) ในการถ่ายภาพเพื่อเพิ่มความละเอียด (resolution) และความคมชัด (contrast) ของภาพถ่าย โดยใช้แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดและรูขนาดเล็กเพื่อกำจัดแสงบริเวณนอกจุดโฟกัส ซึ่งเทคนิคการถ่ายภาพลักษณะนี้สามารถสร้างภาพของโครงสร้างในรูปแบบสามมิติได้ โดยใช้ภาพจากระนาบโฟกัสต่างๆ มาประกอบกัน เทคนิคนี้ได้รับความนิยมในวงการวิทยาศาสตร์และอุตสาหกรรม โดยทั่วไปกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ถูกใช้งานอยู่ในวงการวิทยาศาสตร์สำหรับสิงมีชีวิต, ชีววิทยา , วิทยาศาสตร์สำหรับสารกึ่งตัวนำ, และวัสดุศาสตร์
title: กล้องคอนโฟคอล

text: จากที่กล่าวมาข้างต้นแสงที่ได้รับมาจากวัตถุนั้นเป็นแสงสะท้อนจากปริมาตรของจุดโฟกัส โดยแสงสะท้อนนั้นจะกลายเป็นพิกเซล (pixel) ในภาพที่เป็นผลลัพพ์สุดท้าย โดยความสว่างของภาพจะขึ้นอยู่กับความเข้มของสัญญาณแสงสะท้อน ดังนั้นหากเราต้องการภาพหนึ่งภาพ เราจะต้องทำการสแกนแบบจุดต่อจุดให้ทั่วทั้งบริเวณที่เราต้องการ แล้วนำสัญญาณแสงมาแปลงเป็นแต่ละพิกเซล ในการสแกนลำแสงเลเซอร์ให้ทั่วบริเวณที่เราต้องการภาพนั้น เราใช้กระจกที่สามารถปรับได้เพื่อสะท้อนลำแสงเลเซอร์ไปยังบริเวณที่ต้องการได้ ซึ่งการทำกระจกให้สามารถปรับได้นั้นอาจใช้มอเตอร์มาช่วยเพื่อควบคุมมุมของการสะท้อนของลำแสงเลเซอร์ วิธีการที่ใช้ในการสแกนลำแสงเลเซอร์โดยปกตินั้นเป็นวิธีการที่ตอบสนองช้าและสามารถปรับความเร็วได้ เนื่องจากกล้องจุลทรรศน์จะเก็บแสงเฉพาะที่ปริมาตรของจุดโฟกัสเท่านั้นทำให้ต้องใช้เวลาในการเปิดหน้ากล้องนานกว่ากล้องแบบปกติ ดังนั้นการที่สแกนช้าจะส่งผลดีต่อภาพคือทำให้อัตราส่วนระดับสัญญาณแสงสะท้อนต่อสัญญาณรบกวน (signal-to-noise ratio) สูงขึ้น ส่งผลให้ความคมชัดและความละเอียดของภาพสูงขึ้น
title: กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน

text: สถาปัตยกรรมแบบ interline ขยายแนวคิดนี้ไปหนึ่งก้าวและคลุมหน้ากากทุกคอลัมน์อื่นๆของ เซ็นเซอร์รับภาพสำหรับการจัดเก็บ ในอุปกรณ์นี้ การเขยิบเพียงหนึ่งพิกเซลเท่านี้นที่ต้องเกิดขึ้น ในการถ่ายโอนจากพื้นที่ภาพไปยังพื้นที่จัดเก็บ ดังนั้นเวลาเปิดชัตเตอร์สามารถน้อยกว่าหนึ่ง microsecond และการปนเปื้อนสามารถถูกกำจัดอย่างสำค้ญอย่างยิ่ง อย่างไรก็ตาม ข้อได้เปรียบไม่ใช่ของฟรี เพราะว่าพื้นที่การถ่ายภาพในขณะนี้ถูกปกคลุมด้วยแถบทึบแสงที่ลด fill factor ไปประมาณร้อยละ 50 และลดประสิทธิภาพควอนตัมที่มีผลกระทบตามปริมาณหนึ่งที่เทียบเท่า การออกแบบที่ทันสมัยได้แก้ปัญหาลักษณะที่เป็นอันตรายนี้โดยการเพิ่ม microlenses บนพื้นผิวของอุปกรณ์เพื่อให้แสงสว่างส่องออกไปจากภูมิภาคทึบแสงและให้ตกลงบนพื้นที่ใช้งาน microlenses สามารถนำ fill factor กลับมาได้ถึงร้อยละ 90 หรือมากกว่า ขึ้นอยู่กับขนาดของ พิกเซลและการออกแบบแสงของระบบโดยรวม
title: อุปกรณ์ถ่ายเทประจุ

text: กล้องโทรทรรศน์อวกาศฮับเบิล, โดยเฉพาะอย่างยิ่ง, ได้พัฒนาอย่างมากในชุดของขั้นตอน ("pipeline การลดข้อมูล") เพื่อแปลงข้อมูล CCD ดิบให้เป็นภาพที่มีประโยชน์
กล้อง CCD ที่ใช้ในการถ่ายภาพอวกาศ มักจะต้องการการติดตั้งที่มีความทนทานเพื่อรับมือกับ การสั่นสะเทือนจากลมและแหล่งอื่นๆ พร้อมกับน้ำหนักที่มากของแพลตฟอร์มการถ่ายภาพส่วนใหญ่ เพื่อถ่ายภาพยาวๆของกาแลคซีและเนบิวล่า นักดาราศาสตร์หลายคนใช้เทคนิคที่เรียกว่า auto-guiding ตัว autoguiders ส่วนใหญ่ใช้ชิป CCD ตัวที่สองเพื่อเฝ้าดูการเบี่ยงเบนระหว่าง การถ่ายภาพ ชิปนี้สามารถตรวจพบข้อผิดพลาดได้อย่างรวดเร็วในการติดตามและออกคำสั่งให้มอเตอร์ที่ขี่อยู่เพื่อแก้ไขให้พวกมัน
การประยุกต์ใช้ทางดาราศาสตร์ทั้ไม่ปกติที่น่าสนใจของ CCDs ทีถูกเรียกว่า drift-scanning, ใช้ CCD เพื่อทำให้กล้องเทเลสโคปทำตัวเหมือนกล้องโทรทรรศน์ตามร่องรอยและติดตามการเคลื่อนไหวของท้องฟ้า ประจุใน CCD จะถูกถ่ายโอนและอ่านในทิศทางขนานกับการเคลื่อนที่ของท้องฟ้าและที่ความเร็วเท่ากัน ด้วยวิธีนี้ กล้องเทเลสโคปสามารถสร้างภาพท้องฟ้าแสดงภูมิภาคขนาดใหญ่กว่าสาขาของมุมมองปกติ การสำรวจท้องฟ้าของ สโลน ดิจิทัล เป็นตัวอย่างที่ มีชื่อเสียงที่สุดของงานนี้ โดยการใช้เทคนิคเพื่อผลิตชุดที่แน่นอนของการสำรวจท้องฟ้าที่ใหญ่ที่สุดและก็ยังประสบความสำเร็จ
title: อุปกรณ์ถ่ายเทประจุ

text: กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลแต่ละชนิดมีข้อดีข้อเสียแตกต่างกันไป โดยที่ระบบของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลทุกชนิดพยายามปรับแต่งให้ระบบมีความเหมาะสมทั้งในด้านความเร็วในการบันทึกภาพและความละเอียดของภาพ โดยที่กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นสามารถปรับแต่งความถี่ในการเก็บสัญญาณภาพและความละเอียดในการเก็บสัญญาณภาพ ในขณะที่กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดจานหมุน (จานนิพโค) และกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดอาเรย์ที่สามารถโปรแกรมได้มีความถี่ในการเก็บสัญญาณภาพและความละเอียดในการเก็บสัญญาณภาพคงที่ แต่มีความเร็วในการเก็บสัญญาณภาพสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน ขณะนี้ในท้องตลาดนั้นกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดจานหมุน (จานนิพโค) สามารถเก็บภาพด้วยความเร็วมากกว่า 50 ภาพต่อวินาที ซึ่งความเร็วดังกล่าวเป็นที่ต้องการเมื่อต้องการจับภาพความเคลื่อนไหวของเซลล์สิ่งมีชีวิตขณะมีชีวิตอยู่
title: กล้องคอนโฟคอล

text: กล้องจุลทรรน์แบบคอนโฟคอลนี้มีความสามารถในการตัดทางแสง (optical sectioning) ซึ่งทำให้ไม่จำเป็นที่จะต้องทำลายตัวอย่างเพื่อทำการศึกษาโครงสร้างภายใน และทำให้ลดระยะและการวางแผนสำหรับการทดสอบต่างๆ รวมทั้งทำให้ภาพถ่ายมีความละเอียดเพิ่มขึ้น ชิ้นเนื้อตัวอย่างในงานชีววิทยานั้นปกติจะถูกย้อมด้วยสีย้อมของฟลูออเรสเซ็นต์ (fluorescent dye) สำหรับการสังเกตเฉพาะสิ่งที่ต้องการเท่านั้น อย่างไรก็ตามในความเป็นจริงความเข้มข้นของสีย้อมอาจถูกทำให้น้อยลงเพื่อลดการรบกวนในระบบ ดังนั้นกล้องหรือเครื่องมือวัดบางชนิดสามารถจับแสงฟลูออเรสเซ็นต์ได้เพียงโมเลกุลเดียว ดังนั้นจึงมีการใช้ transgenic techniques เพื่อที่จะสร้างโมเลกุลแบบฟลูออเรสเซ็นต์เสมือน (fluorescent chimeric molecules)ขึ้นมา เช่นการนำเอา Green Fluorescent Protein (GFP) มารวมกับโปรตีนชนิดที่เราสนใจในการสังเกตในงานชีววิทยา
title: กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน

text: กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน () เป็นกล้องจุลทรรน์แบบคอนโฟคอลที่ใช้สำหรับงานที่ต้องการภาพความละเอียดสูงและสามารถเลือกชั้นความลึกที่ต้องการเก็บภาพ ซึ่งคุณสมบัติหลักของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนคือ มันมีความสามารถที่จะเก็บภาพเฉพาะบริเวณจุดโฟกัสโดยสามารถเลือกระดับความลึกได้ ซึ่งกระบวนการนี้เรียกว่า การตัดด้วยแสง () การบันทึกภาพของกล้องชนิดนี้เป็นการเก็บสัญญาณแสงจากจุดโฟกัสทีละจุดแล้วนำสัญญาณทั้งหมดมาสร้างเป็นภาพด้วยเครื่องคอมพิวเตอร์ ด้วยกระบวนการดังกล่าวทำให้สามารถสร้างภาพ 3 มิติ ของวัตถุที่ซับซ้อนขึ้นมาได้ โดยสำหรับวัตถุทึบแสงสามารถใช้กล้องชนิดนี้ศึกษาลักษณะของพื้นผิวใด้ ในกรณีที่เป็นวัตถุโปร่งแสงเราสามารถถ่ายภาพโครงสร้างภายในของวัตถุได้โดยใช้กล้องชนิดนี้ ซึ่งภาพที่ได้จะมีคุณภาพดีกว่าใช้กล้องทั่วไป เพราะภาพที่ได้จากระดับวามลึกที่เราต้องการนั้นจะไม่ถูกซ้อนทับโดยภาพที่ระดับความลึกอื่น ในขณะที่ภาพที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดาจะเป็นภาพของแสงสะท้อนทั้งหมดจากทุกชั้นความลึกที่แสงสามารถทะลุผ่านลงไปได้
title: กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน

text: กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นใช้แหล่งกำเนิดแสงเลเซอร์แบบจุดแล้วโกัสลำแสงเลเซอร์ไปยังชิ้นเนื้อตัวอย่าง ดังนั้นปริมาตรในการสแกนและความเข้มของแสงสะท้อนในการสแกนแต่ละจุดนั้นขึ้นอยู่กับขนาดของจุดโฟกัส (spot size) ของระบบแสง เพราะว่าจุดโฟกัสที่เกิขึ้นจริงไม่ใช่จุดที่มีขนาดเล็กมากเช่นในอุดมคติ แต่มีขนาดแบบ 3 มิติในรูปแบบของการกระจายแสง ในกล้องจุลทรรศน์แบบนั้นขนาดของจุดโฟกัสขึ้นอยู่กับ Numerical Aperture (N.A.) ของเลนส์วัตถุและความยาวคลื่นของแสงเลเซอร์ที่นำมาใช้ อย่างไรกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นสามารถกำจัดรูปแบบการเบี่ยงเบนลำแสงลำดับสูงๆลำแสง (higher order of difdfraction pattern) ที่มีผลต่อภาพได้ โดยการลดขนาดของรูรับแสงลง อย่างเช่นถ้าเราลดขนาดของรูรับแสงลงเหลือ 1 Airy unit จะทำให้แสงที่ผ่านมายังตัวรับแสงเป็นรูปแบบการเบี่ยงเบนลำแสงลำดับแรก (first order of difraction pattern) เท่านั้น ทำให้ภาพมีความคมชัดสูงขึ้นโดยแลกกับแสงที่มีความเข้มลดลงเพียงเล็กน้อยเท่านั้น ในการถ่ายภาพฟลูออเรสเซ็นต์ข้อจำกัดเพียงอย่างเดียวคืออัตราส่วนระดับสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน (signal to noise ratio) เพราะว่าแสงที่ผ่านเข้ามายังตัวรับแสงน้อย แต่ก็ยังมีวิธีการแก้ไขปัญหานี้อยู่คือ ใช้ตัวรับแสงที่มีความไวสูง หรือเพิ่มความเข้มของแหล่งกำเนิดแสง แต่การเพิ่มความเข้มของแหล่งกำเนิดแสงอาจทำให้อายุของการสะท้อนแสงของสีย้อมฟลูออเรสเซ็นหมดลงเร็ว หรืออาจทำลายชิ้นเนื้อได้
title: กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน